Kromatografija visokih performansi. Visokokvalitetna tečna hromatografija prirodnih zagađivača i otpadnih voda

24.11.202227.05.2017

(uglavnom intermolekularne) na sučelju. Kao metoda analize, HPLC je deo grupe metoda, koja zbog složenosti objekata koji se proučava uključuje prethodno razdvajanje početne složene smeše na relativno jednostavne. Dobijene jednostavne smjese se zatim analiziraju konvencionalnim fizičko-hemijskim metodama ili posebnim metodama razvijenim za hromatografiju.

HPLC metoda se široko koristi u oblastima kao što su hemija, petrohemija, biologija, biotehnologija, medicina, prerada hrane, zaštita životne sredine, proizvodnja lekova i mnogim drugim.

Prema mehanizmu razdvajanja analiziranih ili izdvojenih supstanci, HPLC se deli na adsorpcionu, distribucionu, jono-izmjenjivačku, ekskluzijsku, ligand-izmjenjivačku i druge.

Treba imati na umu da se u praktičnom radu razdvajanje često odvija ne jednim, već nekoliko mehanizama istovremeno. Dakle, odvajanje isključenja može biti komplikovano efektima adsorpcije, adsorpcije – distribucije i obrnuto. Istovremeno, što je veća razlika u supstancama u uzorku u pogledu stepena jonizacije, bazičnosti ili kiselosti, u smislu molekulske mase, polarizabilnosti i drugih parametara, veća je verovatnoća da će se pojaviti drugačiji mehanizam razdvajanja. za takve supstance.

HPLC normalne faze

Stacionarna faza je polarnija od mobilne faze, tako da u sastavu eluenta prevladava nepolarno otapalo:

Heksan:izopropanol = 95:5 (za niskopolarne supstance)
Hloroform:metanol = 95:5 (za srednje polarne supstance)
Hloroform:metanol = 80:20 (za visoko polarne supstance)

HPLC reverzne faze

Stacionarna faza je manje polarna od mobilne faze, tako da je voda gotovo uvijek prisutna u eluentu. U ovom slučaju, uvijek je moguće osigurati potpuno otapanje BAS-a u mobilnoj fazi, gotovo uvijek je moguće koristiti UV detekciju, gotovo sve mobilne faze se međusobno miješaju, može se koristiti gradijent elucije, kolona se može brzo vratiti -uravnotežen, kolona se može regenerisati.

Uobičajeni eluenti za HPLC reverzne faze su:

Acetonitril: voda
metanol: voda
Izopropanol: voda

Matrice za HPLC

Matrice koje se koriste u HPLC-u su neorganska jedinjenja kao što su silika (silika gel) ili glinica, ili organski polimeri kao što je polistiren (poprečno povezan sa divinilbenzenom) ili polimetakrilat. Silika gel je, naravno, sada opšteprihvaćen.

Glavne karakteristike matrice:

Veličina čestica (µm);
Veličina unutrašnjih pora (Å, nm).

Dobijanje silika gela za HPLC:

Formiranje mikrosfera polisilicijske kiseline;
Sušenje čestica silika gela;
Odvajanje vazduha.

Sorbentne čestice:

Regularni (sferični): veća otpornost na pritisak, veća cijena;
Nesferični: niža otpornost na pritisak.

Veličina pora u HPLC je jedan od najvažnijih parametara. Što je veličina pora manja, to je lošija njihova propusnost za molekule eluiranih tvari. I shodno tome, lošiji je sorpcijski kapacitet sorbenata. Što su pore veće, to je, prvo, manja mehanička stabilnost čestica sorbenta, a drugo, manja je površina sorpcije, pa je i efikasnost lošija.

Graftovi stacionarne faze

HPLC normalne faze:

Stacionarna faza cijepljena propilnitrilom (nitrilom);
Stacionarna faza sa kalemljenjem propilamina (amina).

HPLC reverzne faze:

Stacionarna faza sa alkil graftom;
Stacionarna faza sa alkilsilil graftom.

End-capping - zaštita necijepljenih područja sorbenta dodatnim cijepljenjem sa "malim" molekulima. Hidrofobno zatvaranje na kraju (C1, C2): veća selektivnost, lošija sposobnost vlaženja; hidrofilno zatvaranje (diol): niža selektivnost, veća sposobnost vlaženja.

HPLC detektori

UV
diodni niz
Fluorescentno
Elektrohemijski
Refraktometrijski
masovno selektivno

Linkovi

Wikimedia fondacija. 2010 .

Pogledajte šta je "tečna hromatografija visokih performansi" u drugim rječnicima:

tečna hromatografija visokih performansi- - [A.S. Goldberg. Engleski ruski energetski rječnik. 2006] Teme energija općenito EN tečna hromatografija visokih performansiHPLC … Priručnik tehničkog prevodioca

Termin tečna hromatografija visokih performansi Engleski termin tečna hromatografija visokih performansi Sinonimi Skraćenice HPLC, HPLC Povezani pojmovi adsorpcija, oligopeptid, proteomika, sorbent, fuleren, endoedra, hromatografija… …

Tekućom hromatografijom, u cilju povećanja efikasnosti odvajanja, rastvarač (eluent) pod pritiskom (više od 3x107 Pa) se pumpa kroz kolone ispunjene sorbentom sa česticama malog prečnika (do 1 μm) i perfuzijom... ...

Vrsta hromatografije u kojoj tečnost (eluent) služi kao mobilna faza, a ona je stacionarna faza. sorbent, tv. nosač sa tečnošću ili gelom koji se nanosi na njegovu površinu. Izvodi se u koloni ispunjenoj sorbentom (kolona hromatografija), na ravnom ... ... Prirodna nauka. enciklopedijski rječnik

- [κρώμα (υroma) boja] proces koji se zasniva na nejednakoj sposobnosti pojedinačnih komponenti smeše (tečnih ili gasovitih) da ostanu na površini adsorbenta i kada se apsorbuju iz struje nosača i kada ... ... Geološka enciklopedija

- (sa drugog grčkog ... Wikipedije

Pojam hromatografija Engleski termin hromatografija Sinonimi Skraćenice Povezani pojmovi tečna hromatografija visokih performansi, klatrat, laboratorija na čipu, porozimetrija, proteom, proteomika, sorbent, enzim, fuleren, endoedar… … Enciklopedijski rečnik nanotehnologije

Tečna hromatografija zasnovana na dekomp. sposobnost odvojenih jona da razmjenjuju jone sa fiksiranim. joni sorbenta koji nastaju kao rezultat disocijacije ionogenih grupa potonjih. Kationski izmjenjivači se koriste za odvajanje katjona, za ... ... Chemical Encyclopedia

HPLC- tečna hromatografija visokih performansi... Rečnik skraćenica ruskog jezika

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je jedna od efikasnih metoda za odvajanje složenih smeša supstanci, koja se široko koristi kako u analitičkoj hemiji tako i u hemijskoj tehnologiji. Osnova hromatografskog razdvajanja je učešće ... Wikipedia

Knjige

Praktična tečna hromatografija visokih performansi, Veronica R. Mayer. Čitaocu predstavljamo 5. izdanje knjige, koje je prošireno savremenim metodama i opremom. U knjizi je mnogo toga poboljšano i dodat je veliki broj referenci. Mesta u tekstu na kojima...

Tečna hromatografija Ovo je metoda za odvajanje i analizu složenih mješavina supstanci u kojima je tekućina mobilna faza. Primjenjiv je za odvajanje šireg spektra supstanci od metode plinske hromatografije. To je zbog činjenice da većina tvari nije hlapljiva, mnoge od njih su nestabilne na visokim temperaturama (posebno visokomolekularna jedinjenja) i raspadaju se kada se pretvore u plinovito stanje. Odvajanje supstanci tečnom hromatografijom najčešće se vrši na sobnoj temperaturi.

Karakteristike svih vrsta tečne kromatografije su zbog činjenice da je mobilna faza u njoj tekućina, a sorpcija komponenti iz plinovitog i tekućeg eluenta se odvija različito. Ako u plinskoj hromatografiji plin nosilac obavlja samo transportnu funkciju i ne sorbira ga stacionarna faza, tada je tekuća mobilna faza u tečnoj hromatografiji aktivni eluent, njeni molekuli mogu biti sorbirani stacionarnom fazom. Prilikom prolaska kroz kolonu, molekuli komponenti analizirane smjese koje se nalaze u eluentu moraju istisnuti molekule eluenta iz površinskog sloja sorbenta, što dovodi do smanjenja energije interakcije između molekula eluenta. analiziranu supstancu i površinu sorbenta. Dakle, vrijednosti zadržanih volumena V R, proporcionalan promjeni slobodne energije sistema, manji je u tečnoj hromatografiji nego u gasnoj hromatografiji, a opseg linearnosti sorpcione izoterme u tečnoj hromatografiji je širi.

Korišćenjem različitih eluensa mogu se promeniti retencioni parametri i selektivnost hromatografskog sistema. Selektivnost u tečnoj hromatografiji, za razliku od plinske, nije određena jednim, već dva faktora - prirodom pokretne (eluentne) i stacionarne faze.

Tekuća mobilna faza ima veću gustinu i viskoznost od gasovite faze, koeficijenti difuzije D i 3-4 reda veličine niže nego u gasu. To dovodi do usporavanja prijenosa mase u tečnoj hromatografiji u odnosu na plinsku hromatografiju. Van Deemterova jednadžba zbog činjenice da je termin IN ne igra ulogu u tečnoj hromatografiji ( D i  D G), mijenja se i grafička zavisnost efikasnosti H na linearnoj brzini toka mobilne faze ima oblik prikazan na sl. 1.9.

U klasičnoj verziji kolonske tečne hromatografije u staklenu kolonu visine 1–2 m, ispunjenu sorbentom veličine čestica 100 μm i eluentom, ubrizgava se analizirani uzorak rastvoren u eluentu, a eluent se propušta kroz , uzimajući dijelove eluata na izlazu iz kolone. Ova varijanta tečne hromatografije još uvek se koristi u laboratorijskoj praksi, ali pošto je brzina protoka eluenta pod dejstvom gravitacije mala, analiza je dugotrajna.

Moderna verzija tečne hromatografije, takozvana tečna hromatografija visokih performansi HPLC, koristi volumetrijske i površinski porozne sorbente veličine čestica od 5-10 µm, pumpe pod pritiskom koje obezbeđuju pritisak u sistemu do 400 atm, i visoko osetljivi detektori. Brz prijenos mase i visoka efikasnost odvajanja omogućavaju korištenje HPLC-a za razdvajanje molekula (tečno-adsorpciona i tečno-tečno particiona hromatografija), za odvajanje jona (jonska izmjenjivačka, jonska, jonsko-parna hromatografija), za odvajanje makromolekula (hromatografija sa isključenjem veličine).

1.3. ZADRŽAVANJE I ČVRSTOĆA RASTAPA

Da bi se analiti razdvojili na koloni, kao što je gore navedeno, faktor kapaciteta k" mora biti veći od 0, tj. tvari moraju biti zadržane stacionarnom fazom, sorbentom. Međutim, faktor kapaciteta ne bi trebao biti prevelik velika da bi se dobilo prihvatljivo vreme eluiranja.Ako se za datu mešavinu supstanci odabere stacionarna faza koja ih drži, onda se dalji rad na razvoju postupka analize sastoji u izboru rastvarača koji bi u idealnom slučaju obezbedio različite za sve komponente, ali prihvatljivo ne baš veliko k. Ovo se postiže promjenom jačine eluiranja rastvarača.

U slučaju adsorpcione kromatografije na silika gelu ili glinici, u pravilu se jačina dvokomponentnog otapala (na primjer, heksana s dodatkom izopropanola) povećava povećanjem sadržaja polarne komponente (izopropanola) u njemu. , ili smanjeni smanjenjem sadržaja izopropanola. Ako sadržaj polarne komponente postane prenizak (manje od 0,1%), treba je zamijeniti slabijom snagom eluiranja. Isto se radi, zamjenjujući ili polarnu ili nepolarnu komponentu drugim, čak i ako ovaj sistem ne pruža željenu selektivnost u odnosu na komponente mješavine od interesa. Prilikom odabira sistema rastvarača uzimaju se u obzir i rastvorljivosti komponenti smeše i eluotropni niz rastvarača koje su sastavili različiti autori.

Približno na isti način se odabire jačina otapala u slučaju korištenja cijepljenih polarnih faza (nitril, amino, diol, nitro, itd.), uzimajući u obzir moguće kemijske reakcije i isključujući otapala opasna za fazu (npr. , aldehidi i ketoni za amino fazu).

U slučaju hromatografije reverzne faze, jačina rastvarača se povećava povećanjem sadržaja organske komponente (metanol, acetonitril ili THF) u eluentu i smanjuje dodavanjem više vode. Ako se ne može postići željena selektivnost, koristi se druga organska komponenta ili se pokušava promijeniti uz pomoć raznih aditiva (kiseline, reagensi jonski par, itd.).

Kod odvajanja jono-izmjenjivačkom hromatografijom, jačina otapala se mijenja povećanjem ili smanjenjem koncentracije puferske otopine ili promjenom pH, u nekim slučajevima se koristi modifikacija organskim tvarima.

Međutim, posebno u slučaju složenih prirodnih i bioloških mješavina, često nije moguće odabrati jačinu rastvarača na način da se sve komponente uzorka eluiraju u prihvatljivom vremenu. Tada se mora pribjeći gradijentnom eluiranju, tj. koristiti rastvarač čija se jačina eluiranja tokom analize mijenja tako da se stalno povećava prema unaprijed određenom programu. Ovom tehnikom moguće je postići eluiranje svih komponenti složenih smjesa u relativno kratkom vremenskom periodu i njihovo razdvajanje na komponente u obliku uskih pikova.

1.6.1. Adsorpciona tečna hromatografija. Adsorpciona tečna hromatografija, u zavisnosti od polariteta stacionarne i mobilne faze, deli se na normalnu fazu (NPC) i hromatografiju reverzne faze (RPC). U NPC se koriste polarni adsorbent i nepolarne mobilne faze, u OFC-u se koriste nepolarni adsorbent i polarne mobilne faze, ali je u oba slučaja izbor mobilne faze često važniji od izbora stacionarni. Stacionarna faza mora zadržati supstance koje treba odvojiti. Mobilna faza, odnosno rastvarač, mora obezbijediti različite kapacitete kolona i efikasne separacije u razumnom vremenu.

Kao stacionarna faza u adsorpcionoj tečnoj hromatografiji koriste se polarni i nepolarni fino dispergovani porozni materijali sa specifičnom površinom većom od 50 m 2 /g. Polarni adsorbenti (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil itd.) imaju na površini slabo kisele grupe, sposobne da zadržavaju supstance sa bazičnim svojstvima. Ovi adsorbenti se uglavnom koriste za odvajanje nepolarnih i srednje polarnih spojeva. Njihov nedostatak je visoka osjetljivost na sadržaj vode u korištenim eluentima. Da bi se otklonio ovaj nedostatak, polarni sorbenti se tretiraju aminima, diolima i drugim reagensima, što rezultira površinskim presađivanjem ovih reagensa, modifikacijom površine i promjenom selektivnosti u odnosu na analite.

Nepolarni adsorbenti (grafitizirana čađ, dijatomit, kizelgur) nisu selektivni za polarne molekule. Da bi se dobili nepolarni adsorbenti, nepolarne grupe se često cijepe na površinu, na primjer, silika gela, na primjer, alkilsilil - SiR 3, gdje su R - alkil grupe C 2 - C 22.

Mobilna faza treba da potpuno rastvori analizirani uzorak, da ima nisku viskoznost (tako da su koeficijenti difuzije dovoljno veliki), poželjno je da je moguće odvojiti odvojene komponente iz njega. Mora biti inertan na materijale svih dijelova hromatografa, siguran, jeftin, pogodan za detektor.

Mobilne faze koje se koriste u tečnoj hromatografiji razlikuju se po svojoj snazi eluiranja. Moć eluiranja rastvarača pokazuje koliko je puta energija sorpcije danog eluenta na datom adsorbentu veća od energije sorpcije eluenta odabranog kao standarda, na primjer, n-heptana. Slabi rastvarači se slabo adsorbuju stacionarnom fazom, pa su koeficijenti distribucije sorbovanih supstanci (sorbata) visoki. Suprotno tome, jaki rastvarači se dobro adsorbuju, tako da su koeficijenti raspodjele sorbata niski. Što je rastvarač jači, veća je rastvorljivost analiziranog uzorka u njemu, to je jača interakcija rastvarač-sorbat.

Da bi se osigurala visoka efikasnost separacije na koloni, potrebno je odabrati mobilnu fazu koja ima optimalni polaritet za smjesu koja se odvaja pod odabranim uvjetima separacije. Obično se prva bira stacionarna faza, koja ima polaritet blizak polaritetu komponenti koje treba odvojiti. Zatim se bira mobilna faza, osiguravajući koeficijent kapacitivnosti k" bio u rasponu od 2 do 5. Ako je polaritet mobilne faze preblizak polarnosti stacionarne faze, vrijeme zadržavanja komponenti će biti prekratko, a ako se polaritet mobilne i stacionarne faze jako razlikuju. mnogo, vrijeme zadržavanja postaje predugo.

Prilikom odabira mobilnih faza, one se rukovode takozvanim eluotropnim nizom, baziranim na korištenju indeksa polariteta. Snajder R", koji sve rastvarače dijeli na jake (polarne) i slabe (slabo polarne i nepolarne). Skala polariteta se zasniva na rastvorljivosti supstanci koje se koriste kao mobilne faze u dioksanu, nitrometanu i etanolu.

U tabeli 1.2 prikazane su vrijednosti indeksa polariteta i jačine eluiranja (u odnosu na SiO 2 ) brojnih rastvarača koji se najčešće koriste u tečnoj hromatografiji kao mobilne faze. Granice kratkotalasne prozirnosti ovih rastvarača takođe su naznačene ovde, što olakšava izbor uslova za detekciju komponenti smeše.

Tabela 1.2

Karakteristike rastvarača koji se koriste u tečnoj hromatografiji

Solvent	Indeks polariteta	Moć eluiranja (SiO 2)	Kratkotalasna granica transparentnosti
Fluoralkane
Cikloheksan
n-Heksan
Tetrahlorid ugljenika
Diizopropil eter

dietil eter
dihlormetan
Tetrahidrofuran
Hloroform

Sirćetna kiselina


Acetonitril
Nitrometan

Tekuća hromatografija često ne koristi pojedinačna otapala, već njihove mješavine. Često, manji dodaci drugog rastvarača, posebno vode, uvelike povećavaju eluirajuću snagu eluenta.

Prilikom odvajanja višekomponentnih mješavina, jedna mobilna faza kao eluent možda neće odvojiti sve komponente uzorka u razumnom vremenu. U ovom slučaju se koristi postupna ili gradijentna metoda eluiranja, u kojoj se tokom hromatografije uzastopno koriste sve jači eluenti, što omogućava eluiranje visoko zadržanih supstanci za kraće vrijeme.

U tečnoj hromatografiji ih ima empirijski pravila koja su vrlo korisna pri odabiru eluenta:

 sorpcija jedinjenja, po pravilu, raste sa povećanjem broja dvostrukih veza i OH grupa u njemu;

 smanjuje se sorpcija u nizu organskih jedinjenja: kiselinealkoholialdehidiketoniestrinezasićeni ugljovodonicizasićeni ugljovodonici;

 za odvajanje supstanci različitog polariteta i odvojenih supstanci različitih klasa koristi se hromatografija normalne faze: analizirani uzorak se otapa i eluira nepolarnim eluentom, jedinjenja različitih klasa napuštaju kolonu sa polarnim adsorbentom različito vreme, dok se vrijeme retencije spojeva s različitim funkcionalnim grupama povećava prijelaskom iz nepolarnih spojeva u slabo polarne. Za vrlo polarne molekule, vrijeme zadržavanja je toliko dugo da analiza nije moguća kada se koristi nepolarni eluent. Da bi se smanjilo vrijeme zadržavanja polarnih komponenti, prelazi se na polarne eluente;

 u varijanti obrnute faze, stacionarna faza (nepolarni adsorbent) jače adsorbuje nepolarnu komponentu iz polarnih eluensa, na primer iz vode;

 Smanjenjem polariteta eluenta dodavanjem manje polarnog rastvarača, zadržavanje komponenti se može smanjiti.

1.6.2. Particiona tečna hromatografija. U particionoj ili tečno-tečnoj hromatografiji, razdvajanje komponenti analiziranog uzorka nastaje zbog razlika u koeficijentima njihove distribucije između dve tečne faze koje se ne mešaju jedna s drugom, od kojih je jedna stacionarna i nalazi se na površini. ili u porama čvrstog nepokretnog nosača, a drugi je pokretljiv.

U smislu prirode interakcijskih sila koje određuju različitu raspodjelu između dvije faze tvari koje se razlikuju po svojoj hemijskoj strukturi, distribucijska hromatografija je slična adsorpcionoj hromatografiji, tj. i ovdje se razdvajanje zasniva na razlici u silama intermolekularna interakcija između komponenti analiziranog uzorka sa stacionarnom i pokretnom tečnom fazom.

U zavisnosti od tehnike izvođenja, particiona hromatografija, kao i adsorpciona hromatografija, može biti kolonska ili planarna (papirna ili tankoslojna).

Kao čvrsti nosači koriste se supstance koje su indiferentne prema pokretnom otapalu i komponentama analiziranog uzorka, ali sposobne da zadrže stacionarnu fazu na površini i u porama. Najčešće se kao nosači koriste polarne tvari (celuloza, silika gel, škrob). Primjenjuju se na stacionarnu fazu - polarno otapalo, najčešće vodu ili alkohol. U ovom slučaju kao mobilne faze koriste se manje polarne ili nepolarne supstance (alkoholi, amini, ketoni, ugljovodonici itd.). Ova vrsta particione hromatografije se zove normalna faza. Koristi se za odvajanje polarnih supstanci.

Druga verzija particione hromatografije razlikuje se po tome što se kao stacionarna čvrsta faza koriste nepolarni nosači (guma, fluoroplast, hidrofobirani silika gel), nepolarni rastvarači (ugljovodonici) kao stacionarna tečna faza i polarni rastvarači (alkoholi, aldehidi). ) kao pokretna tečna faza., ketoni, itd., često voda). Ova varijanta particione hromatografije se zove obrnuta faza i koristi se za odvajanje nepolarnih supstanci.

Da bi se postiglo optimalno razdvajanje komponenti analiziranog uzorka, odabir mobilne faze je veoma važan. Otapala (pokretne i stacionarne tečne faze) treba odabrati tako da se koeficijenti raspodjele komponenti smjese značajno razlikuju. Tečne faze podliježu sljedećem zahtjevi:

1) korišćeni rastvarači treba da dobro rastvore supstance koje se odvajaju, a njihova rastvorljivost u stacionarnoj fazi treba da bude veća nego u mobilnoj;

2) rastvarači koji se koriste kao pokretna i stacionarna faza moraju biti međusobno zasićeni, odnosno sastav rastvarača mora biti konstantan tokom prolaska kroz kolonu;

3) interakcija rastvarača koji se koriste kao mobilna faza sa stacionarnom fazom treba da bude minimalna.

Najčešće se u particionoj tečnoj hromatografiji ne koriste pojedinačne supstance kao pokretne tečne faze, već njihove mešavine u različitim omjerima. Ovo vam omogućava da kontrolišete polaritet mobilne faze, promenite odnos polariteta mobilne i stacionarne faze i postignete optimalne uslove za odvajanje komponenti određene mešavine koja se analizira.

Značajan nedostatak ove hromatografske metode je prilično brzo ispiranje taložene stacionarne tečne faze sa nosača. Da bi se to eliminisalo, rastvarač koji se koristi kao mobilna faza je zasićen supstancom koja se koristi kao stacionarna tečna faza, ili se stacionarna tečna faza stabilizuje cijepljenjem na nosač.

Varijacija particione tečne hromatografije je široko korišćena HPLC metoda.

Najčešći hromatografski sistemi su sistemi koji imaju modularni princip sklapanja. Pumpe, degazatori, detektori, autosampleri, kolonske peći, kolektori frakcija, kontrole hromatografskog sistema i rekorderi dostupni su kao zasebni moduli. Širok raspon modula omogućava vam fleksibilno rješavanje različitih analitičkih problema, brzu promjenu konfiguracije sistema ako je potrebno, uz minimalne troškove. Istovremeno se proizvode i monomodularni (integrirani) LC, čija je glavna prednost minijaturizacija pojedinačnih blokova i kompaktnost uređaja.

Ovisno o načinu eluiranja, tekući hromatografi se dijele na izokratske i gradijentne.

Dijagram izokratskog hromatografa

Mobilna faza iz posude (1) kroz ulazni filter (9) se pomoću precizne pumpe visokog pritiska (2) dovodi do sistema za unos uzorka (3) - ručnog injektora ili autosamplera, gde se uzorak takođe ubrizgava. . Dalje, kroz in-line filter (8), uzorak sa strujom mobilne faze ulazi u separacioni element (elemente) (4) - kroz predkolonu u kolonu za odvajanje. Zatim, eluat ulazi u detektor (5) i uklanja se u drenažni rezervoar (7). Kada eluat protiče kroz mjerno kolo detektora, hromatogram se registruje i podaci se prenose u analogni snimač (rekorder) (6) ili drugi sistem za prikupljanje i obradu hromatografskih podataka (integrator ili kompjuter). U zavisnosti od dizajna funkcionalnih modula, sistemom se može upravljati sa tastature kontrolnog modula (obično pumpe ili sistemskog kontrolera), sa tastature svakog od sistemskih modula ili pomoću upravljačkog programa sa personalnog računara.

U slučaju gradijentnog eluiranja, koriste se dva fundamentalno različita tipa tečnih hromatografa. Razlikuju se u tački formiranja gradijenta sastava mobilne faze.

Shema gradijentnog hromatografa sa formiranjem gradijenta sastava mobilne faze na liniji niskog pritiska.

Mobilnu fazu iz rezervoara (1) preko ulaznih filtera (9) i programatora gradijenta (10) napaja precizna pumpa visokog pritiska (2) do sistema za ubrizgavanje uzorka (3) - ručnog injektora ili autosamplera. , gdje se uzorak također ubrizgava. Rad ventila programatora gradijenta kontroliše ili upravljački modul sistema (pumpa ili kontroler) ili PC upravljački program. Sistemi ovog tipa formiraju binarni, trodimenzionalni i četverodimenzionalni gradijent. Oblik funkcije obrade gradijenta ovisi o konkretnom upravljačkom modulu ili upravljačkom programu, kao io funkcionalnosti kontroliranog i upravljačkog modula. Dalje, kroz in-line filter (8), uzorak sa strujom mobilne faze ulazi u separacioni element (elemente) (4) - kroz predkolonu u kolonu za odvajanje. Zatim, eluat ulazi u detektor (5) i uklanja se u drenažni rezervoar (7). Kada eluat protiče kroz mjerno kolo detektora, hromatogram se registruje i podaci se prenose u analogni snimač (rekorder) (6) ili drugi sistem za prikupljanje i obradu hromatografskih podataka (integrator ili kompjuter). U zavisnosti od dizajna funkcionalnih modula, sistemom se može upravljati sa tastature kontrolnog modula (obično pumpe ili sistemskog kontrolera) ili upravljačkim programom sa personalnog računara. U slučaju upravljanja upravljačkim modulom, moguće je samostalno upravljati detektorom sa sopstvene tastature.

Uprkos očiglednoj atraktivnosti ovakvih sistema (koriste samo jednu preciznu pumpu visokog pritiska), ovi sistemi imaju niz nedostataka, među kojima je možda glavni, ozbiljna potreba za temeljnim otplinjavanjem komponenti mobilne faze čak i pre mikser niskog pritiska (komora gradijentnog programatora). Izvodi se uz pomoć posebnih protočnih degazatora. Zbog ove činjenice njihova cijena postaje uporediva sa drugom vrstom gradijentnih sistema - sistemima sa formiranjem gradijentnog sastava mobilne faze na liniji visokog pritiska.

Osnovna razlika između sistema sa formiranjem gradijentne kompozicije mobilne faze u liniji visokog pritiska je mešanje komponenti u liniji visokog pritiska, prirodno je da se ovim pristupom broj preciznih pumpi određuje brojem rezervoara za mešanje. mobilnu fazu. Ovim pristupom značajno su smanjeni zahtjevi za temeljitost otplinjavanja komponenti.

Shema gradijentnog hromatografa sa formiranjem gradijenta sastava mobilne faze na liniji visokog pritiska.

Mobilnu fazu iz rezervoara (1) kroz ulazne filtere (9) napajaju precizne pumpe visokog pritiska (2 i 11) kroz statički ili dinamički protočni mikser (10) do sistema za ubrizgavanje uzorka (3) - ručni injektor ili autosampler, gdje se uzorak također ubrizgava. Rad kontrolisanih pumpi se kontroliše ili preko upravljačkog modula sistema (glavna pumpa ili kontroler) ili pomoću PC upravljačkog programa. U tom slučaju se kontrolišu sve pumpe. Sistemi ovog tipa formiraju binarni ili trodimenzionalni gradijent. Oblik funkcije obrade gradijenta ovisi o konkretnom upravljačkom modulu ili upravljačkom programu, kao io funkcionalnosti kontroliranog i upravljačkog modula. Dalje, kroz in-line filter (8), uzorak sa strujom mobilne faze ulazi u separacioni element (elemente) (4) - kroz predkolonu u kolonu za odvajanje. Zatim eluat ulazi u detektor (5) i uklanja se u drenažni rezervoar (7). Kada eluat protiče kroz mjerno kolo detektora, hromatogram se registruje i podaci se prenose u analogni snimač (rekorder) (6) ili drugi sistem za prikupljanje i obradu hromatografskih podataka (integrator ili kompjuter). U zavisnosti od dizajna funkcionalnih modula, sistemom se može upravljati sa tastature kontrolnog modula (obično pumpe ili sistemskog kontrolera) ili upravljačkim programom sa personalnog računara. U slučaju upravljanja upravljačkim modulom, moguće je samostalno upravljati detektorom sa sopstvene tastature.

Predložene šeme su prilično pojednostavljene. Sistemi mogu uključivati dodatne uređaje - termostat na koloni, sisteme za derivaciju nakon kolone, sisteme za pripremu uzoraka i koncentriranja, recikler rastvarača, membranske sisteme za suzbijanje pozadinske električne provodljivosti (za ionsku hromatografiju), dodatne zaštitne sisteme (filteri, kolone) itd. . Na dijagramima, manometrijski moduli također nisu posebno prikazani. Po pravilu, ovi uređaji su ugrađeni u pumpne jedinice. Ove jedinice mogu kombinovati više pumpi, pumpu sa programatorom gradijenta i zajednički kontroler sistema. Struktura sistema zavisi od njegove konfiguracije i svakog konkretnog proizvođača.

Ovako radikalna komplikacija tehničke podrške hromatografskog procesa dovodi do pojave niza zahtjeva za svojstva pokretne faze, kojih nema u klasičnoj kolonskoj i planarnoj hromatografiji. Tekuća faza mora biti prikladna za detekciju (biti prozirna u datom području spektra ili imati nizak indeks loma, određenu električnu provodljivost ili permitivnost, itd.), inertna na materijale dijelova kromatografskog trakta, ne formirati mjehurići plina u ventilima pumpe i detektorskoj ćeliji, nemaju mehaničke nečistoće.

U tečnoj hromatografiji koriste se mnoge vrste pumpi. LC niskog pritiska često koristi peristaltičke pumpe (slika 1).

Slika 1 MasterFlex programabilna peristaltička pumpa.

U HPLC-u se koriste pumpe visokog pritiska da bi se obezbedio protok mobilne faze kroz kolonu sa navedenim parametrima.

Najvažnije tehničke karakteristike HPLC pumpi su: opseg protoka; maksimalni radni pritisak; ponovljivost protoka; opseg pulsiranja dovoda rastvarača.

Po prirodi opskrbe rastvaračem, pumpe mogu biti konstantnog napajanja (protoka) i konstantnog pritiska. U osnovi, u analitičkom radu koristi se režim konstantnog protoka, pri punjenju kolona koristi se režim konstantnog pritiska.

Prema principu rada, HPLC pumpe se dijele na špric i dalje klip recipročan .

Pumpe sa špricama

Glavna odlika ovih pumpi je njihov ciklički rad, pa se stoga hromatografi u kojima se koriste ove pumpe razlikuju i po cikličnom radu.

Rice. 2. Osnovni raspored špric pumpe za HPLC.

Rice. 2A. Pumpa za špricu.

Upravljačka jedinica BU dovodi napon na motor D, koji određuje brzinu i smjer njegove rotacije. Rotacija motora uz pomoć mjenjača P pretvara se u kretanje klipa P unutar cilindra D. Pumpa radi u 2 ciklusa. U ciklusu punjenja ventil K2 je zatvoren, K1 otvoren, rastvarač teče iz rezervoara u cilindar C. U režimu napajanja ventil K1 je zatvoren, a preko ventila K2 mobilna faza ulazi u dozirni uređaj.

Pumpe ovog tipa karakterizira gotovo potpuno odsustvo pulsiranja u protoku mobilne faze tokom rada.

Nedostaci pumpe:

a) velika potrošnja vremena i rastvarača za pranje pri promeni rastvarača;

b) zapreminu PF ograničenu zapreminom šprica, a time i ograničeno vreme odvajanja;

c) suspenzija odvajanja tokom punjenja pumpe;

d) velike dimenzije i težina uz visok protok i pritisak (potreban vam je snažan motor i velika sila klipa sa svojom velikom površinom).

Klipne klipne pumpe.

Rice. 3. Glavni uređaj klipne pumpe.

Princip rada.

Motor D kroz mjenjač R vraća klip P, krećući se u radnoj glavi pumpe. Ventili K1 i K2 se otvaraju kada je pumpa u fazi usisavanja i isporuke. Količina volumetrijske hrane određena je trima parametrima: promjerom klipa (obično 3,13; 5,0; 7,0 mm), njegovom amplitudom (12-18 mm) i frekvencijom (koja ovisi o brzini rotacije motora i mjenjača).

Pumpe ovog tipa osiguravaju konstantan volumetrijski protok mobilne faze dugo vremena. Maksimalni radni pritisak 300-500 atm, brzina protoka 0,01-10 ml/min. Ponovljivost protoka -0,5%. Glavni nedostatak je što se rastvarač uvodi u sistem u obliku niza uzastopnih impulsa, pa dolazi do pulsiranja pritiska i protoka (slika 4). To je glavni razlog povećane buke i desenzibilizacije gotovo svih detektora koji se koriste u LC, posebno elektrohemijskih.

Fig.4. Pulsacija klipne pumpe.

Načini rješavanja pulsacija.

1. Primjena prigušnih uređaja.

To su spiralne cijevi specijalnog profila od nehrđajućeg čelika, uključene serijski ili paralelno u sistem između pumpe i dozatora.

Rice. 5. Spiralni amortizer.

Zaklopka se odvrće s povećanjem pritiska u njemu (ubrzanje pumpe). Kada padne pritisak, on se uvija, smanjuje mu se volumen, istiskuje dio rastvarača, održavajući konstantan protok i smanjujući pulsacije. Takav amortizer dobro radi pri pritisku od 50 atm i više.

Pri pritisku od 5-30 atm bolje izglađuje pulsacije vazdušna zaklopka, napravljen od stuba (sl. 6.). Vazduh u začepljenom stubu (6x200 mm) se komprimira i pulsacije se gase. Vazduh u njemu se rastvara za 24 sata.

Rice. 6. Zračna klapna.

2. Upotreba elektronskih uređaja.

Kada koristite elektronski pretvarač tlaka, očitanja sa sonde mogu se koristiti za kontrolu rada pumpe. Kada tlak padne, brzina motora se povećava i kompenzira smanjenje tlaka. Također je moguće nadoknaditi curenje u ventilima i djelomično u manžetnama. Upotreba elektronskog prigušivača (BPZh-80, KhPZh-1, itd.) Omogućuje smanjenje pulsiranja pritiska na 1 atm pri pritisku od 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Jonska izmjena, jonska, jonska parna hromatografija. Metode jonske izmjene, jonske i ion-parne hromatografije zasnivaju se na dinamičkom procesu zamjene jona povezanih sa stacionarnom fazom eluentnim jonima koji ulaze u kolonu. Glavni cilj hromatografskog procesa je odvajanje anorganskih ili organskih jona istog znaka. Zadržavanje u ovim vrstama hromatografije određeno je promjenom slobodne energije reakcije ionske izmjene. Odnos koncentracija izmjenjivačkih jona u otopini i u fazi sorbenta karakterizira ravnoteža ionske izmjene. Jonska izmjena se sastoji u tome što neke tvari (jonski izmjenjivači), kada su uronjeni u otopinu elektrolita, apsorbiraju katione ili anione iz njega, oslobađajući u otopinu ekvivalentnu količinu drugih jona sa nabojem istog predznaka. Između kationskog izmenjivača i rastvora dolazi do razmene kationa, između anjonskog izmenjivača i rastvora dolazi do razmene anjona.

Kationski izmenjivači su najčešće posebno sintetizovane nerastvorljive polimerne supstance koje u svojoj strukturi sadrže kisele jonogene grupe: -SO 3 H; –COOH; -OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Hemijske formule kationskih izmjenjivača mogu se shematski prikazati kao R-SO 3 H; R-SO 3 Na. U prvom slučaju kationski izmjenjivač je u H-obliku, u drugom u Na-obliku. R je polimerna matrica.

Reakcije kationske izmjene zapisuju se kao obične heterogene kemijske reakcije:

RN + Na + RNa + H +

Anjonski izmjenjivači u svojoj strukturi sadrže osnovne ionogene grupe: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + itd. Njihove hemijske formule mogu biti predstavljene kao RNH 3 OH i RNH 3 Cl ili ROH, RCl. U prvom slučaju anjonski izmjenjivač je u OH obliku, u drugom u Cl obliku. Reakcija anjonske izmjene može se zapisati na sljedeći način:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Poznati su amfoterni ionski izmjenjivači koji u svojoj strukturi sadrže i kisele i bazične grupe. Jonski izmjenjivači koji u svom sastavu imaju istu vrstu (na primjer, SO 3 H) kisele (bazne) grupe nazivaju se monofunkcionalnimi; jonski izmjenjivači koji sadrže heterogene (na primjer, - SO 3 H, - OH) kisele (bazne) grupe - polifunkcionalne.

Monofunkcionalni jonski izmjenjivači dobivaju se reakcijom polimerizacije. Reakcija polikondenzacije omogućava dobivanje polifunkcionalnih ionskih izmjenjivača. Da bi dobijeni jonski izmenjivači imali dovoljno visoke performanse, oni moraju biti nerastvorljivi, ali bubri u odgovarajućem rastvaraču i imati dovoljno veliki broj ionogenih grupa koje mogu da se razmenjuju sa ionogenim grupama analiziranog uzorka. Ovo se može postići ako su rezultujući polimerni lanci dovoljno razgranati i međusobno povezani "mostovima za umrežavanje". Na primjer, u pripremi kationskih izmjenjivača polimerizacijskog tipa na bazi stirena, kao sredstvo za umrežavanje najčešće se koristi divinilbenzen, čijim se uvođenjem u količini do 16% osigurava proizvodnja jonskih izmjenjivača različitih stupnjeva bubrenja i, stoga omogućava kontrolu poroznosti jonskog izmjenjivača. Stepen bubrenja jonskog izmjenjivača, izražen u mililitrima/gramu, je zapremina 1 g vazdušno suvog jonskog izmenjivača upakovanog u kolonu.

Jonski izmjenjivač apsorbira, po pravilu, jedan od protujona - jona u mobilnoj fazi, odnosno pokazuje određenu selektivnost. Eksperimentalno je utvrđen niz afiniteta, odnosno selektivnosti jona u odnosu na ionske izmjenjivače različitih tipova. Na primjer, pri niskim koncentracijama otopine na jako kiselim kationskim izmjenjivačima, ioni s istim nabojem se sorbiraju u sljedećem redoslijedu:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Za jone s različitim nabojem, sposobnost sorbiranja raste s povećanjem naboja:

Na+Ca2+

Međutim, promjena uslova za izvođenje reakcije ionske izmjene može dovesti do serijske inverzije. Afinitetne serije su takođe uspostavljene za anjonske izmenjivače. Na primjer, sorbabilnost aniona na jako bazičnim anionskim izmjenjivačima raste u nizu:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 - .

Jonski izmjenjivači koji u svojoj strukturi sadrže jako kisele ili jako bazične grupe ulaze u reakcije ionske izmjene sa bilo kojim ionom u otopini koji ima naboje istog predznaka kao i predznak protujona. Takvi jonski izmjenjivači nazivaju se univerzalni.

Proces jonske izmjene između analita i ionskog izmjenjivača može se izvesti na jedan od tri načina: statički, dinamički (metoda jonske izmjene) i hromatografski.

Statička metoda Izmjena jona je da se uzorak jonskog izmjenjivača dovede u kontakt sa određenom zapreminom otopine i miješa ili mućka određeno vrijeme dok se ne uspostavi ravnoteža. Ovo je brza i jednostavna metoda jonske izmjene, koja se koristi za koncentriranje jona iz razrijeđenih otopina, uklanjanje neželjenih nečistoća, ali ne obezbjeđuje potpunu apsorpciju jona, budući da je jonska izmjena neravnotežan proces, pa stoga ne garantuje potpuno odvajanje jona.

Prilikom obavljanja jonske izmjene na dinamičan način rastvor se propušta kroz kolonu sa jonskim izmenjivačem, koji, kako se kreće duž kolone, dolazi u kontakt sa novim granulama jonskog izmenjivača. Ovaj proces pruža potpuniju razmjenu od statičke metode, budući da se produkti razmjene uklanjaju protokom otopine. Oni mogu koncentrirati ione iz razrijeđenih otopina i odvojiti ione koji se jako razlikuju po svojstvima, na primjer, različito nabijene ione (odvojiti katione od aniona), ali je odvajanje jona istog znaka naboja gotovo nemoguće. Kvantitativno odvajanje takvih jona moguće je samo uz višekratno ponavljanje elementarnih radnji sorpcije-desorpcije u dinamičkim uslovima, tj. hromatografska metoda . Prilikom rada ovom metodom koriste se visoki slojevi ionskog izmjenjivača, a smjesa koja se odvaja se unosi u ovaj sloj u količini znatno manjoj od kapaciteta kolone, zbog čega je osigurano ponavljanje elementarnih radnji ionske izmjene. .

Prema tehnici analize, jono-izmjenjivačka hromatografija je slična molekularnoj hromatografiji i može se izvesti prema opcijama eluenta (razvijanja), frontalnog i pomjeranja. Razlika između molekularne i jono-izmjenjivačke hromatografije je u tome što se u molekularnoj hromatografiji odvojene komponente smjese eluiraju iz kolone čistim eluentom, dok se u hromatografiji s ionskom izmjenom kao eluent koristi otopina elektrolita. U ovom slučaju, izmijenjeni ion eluenta treba da se sorbira manje selektivno nego bilo koji od jona mješavine koja se odvaja.

Prilikom izvođenja hromatografije koja se najčešće koristi, kolona ispunjena ionskim izmjenjivačem se prvo ispere otopinom elektrolita dok ionski izmjenjivač potpuno ne zamijeni sve svoje ione ionima sadržanim u eluentu. Zatim se u kolonu unosi mala zapremina rastvora analita, koja sadrži odvojive jone u količini od oko 1% kapaciteta jonskog izmenjivača. Zatim se kolona ispere rastvorom eluenta, uzimajući frakcije eluata i analizirajući ih.

Smjesa Cl - , Br - , J - jona može se odvojiti na visokobaznoj smoli za anjonsku izmjenu (poprečno vezani polistiren koji sadrži grupe kvaternarnih amonijum baza N (CH 3) 3 +), na primjer, AB-17, koji ima raspon selektivnosti (selektivnosti): NO 3 - Cl – Br – J – . Kao rezultat, rastvor NaNO 3 se koristi kao eluent. Prvo se ova otopina propušta kroz jonski izmjenjivač dok se potpuno ne zasiti NO 3 - jonima. Kada se smeša koja se odvaja unese u kolonu, joni Cl – , Br – , J – apsorbuju anjonski izmenjivač, istiskujući NO 3 – jone. Prilikom naknadnog ispiranja kolone rastvorom NaNO 3, joni Cl – , Br – , J – u gornjim slojevima anjonskog izmenjivača postepeno se ponovo zamenjuju jonima NO 3 – . Cl - joni će se istisnuti najbrže od svih, J - joni će se najduže zadržati u koloni. Razlika u selektivnosti ionskog izmjenjivača prema jonima mješavine dovodi do toga da se u koloni formiraju odvojene zone adsorbiranih jona Cl – , Br – i J – koji se kreću kroz kolonu različitim brzinama. Kako se krećete duž kolone, rastojanje između zona se povećava. U svakoj zoni postoji samo jedan od anjona mešavine koja se odvaja i anjona eluenta, u intervalu između zona nalazi se samo anjon eluenta. Tako će se frakcije koje sadrže pojedinačne komponente mješavine koje treba odvojiti pojaviti u eluentu na izlazu iz kolone.

Za rješavanje praktičnih problema, uvjeti za odvajanje jona se mijenjaju odabirom odgovarajuće mobilne faze (sastav, koncentracija, pH, jonska snaga) ili promjenom poroznosti polimerne matrice jonskog izmjenjivača, odnosno broja međulančanih veza u matriksa, i stvaranje sita za jonsku izmjenu koja su propusna za neke jone i sposobna za njihovu razmjenu i neprobojna za druge. Moguća je i promjena prirode i međusobnog rasporeda ionogenih grupa, kao i dobivanje sorbenata sposobnih za selektivne kemijske reakcije uslijed formiranja kompleksa. Visoku selektivnost posjeduju, na primjer, kompleksirajući jonski izmjenjivači koji u svojoj strukturi sadrže helirajuće grupe organskih reagensa dimetilglioksim, ditizon, 8-hidroksihinolin, itd., kao i kraun etre.

Najveća primjena u jonskoj, jonskoj i jonoparnoj hromatografiji nalazi se u sintetičkim makro- i mikromrežnim organskim ionizmjenjivačima velikog kapaciteta izmjene (3-7 mmol/g), kao i neorganskim materijalima za izmjenu jona. Mikromrežasti jonski izmjenjivači su sposobni za razmjenu jona samo u nabubrenom stanju, dok su makromrežasti joni u stanju razmjenjivati jone u nabubrenom i nenabubrenom stanju. Drugi strukturni tip ionskih izmjenjivača su površinski filmski ionski izmjenjivači, čije je čvrsto jezgro napravljeno od neporoznog kopolimera stirena i divinilbenzena, stakla ili silika gela i okruženo je tankim filmom ionskog izmjenjivača. Ukupni promjer takve čestice je oko 40 µm, a debljina filma ionskog izmjenjivača je 1 µm. Nedostatak ovakvih ionskih izmjenjivača je relativno veliki promjer čestica i nizak kapacitet izmjene zbog male specifične površine, zbog čega je potrebno raditi s malim uzorcima i, shodno tome, koristiti visokoosjetljive detektore. Osim toga, takvi ionski izmjenjivači se brzo truju i nisu sposobni za regeneraciju.

U ionskoj i jonskoj hromatografiji visokih performansi, prostorno poroznim polistirenskim ionizmjenjivačima, volumno poroznim silicijumima s prečnikom granula od oko 10 μm i praktično nebubrećim površinski poroznim i površinski modificiranim kopolimerima stirena i divinilbenzena sa koriste se jonogene sulfo i amino grupe.

U ion-parnoj hromatografiji koriste se sorbenti "četkice" - silika gelovi sa cijepljenim obrnutim fazama C 2, C 8, C 18, koji se lako pretvaraju u kationski izmjenjivač apsorpcijom ionskih surfaktanata iz mobilne faze, na primjer, alkil sulfati ili soli kvaternarnih amonijum baza.

Prilikom kromatografskog odvajanja pomoću ionskih izmjenjivača, kao mobilna faza najčešće se koriste vodene otopine soli. To je zbog činjenice da voda ima izvrsna svojstva otapanja i joniziranja, zbog čega se molekuli analiziranog uzorka trenutno disociraju na ione, ionske izmjenjivačke grupe ionskog izmjenjivača hidratiziraju i također prelaze u potpuno ili djelomično disocirani oblik. Ovo osigurava brzu razmjenu protujona. Na jačinu eluiranja mobilne faze uglavnom utiču pH, jonska snaga, priroda puferske otopine, sadržaj organskog otapala ili surfaktanta (jonska parna hromatografija).

pH vrijednost se bira ovisno o prirodi ionogenih grupa, jonima koji se odvajaju i matriksu. Moguć je rad sa jako kiselim i jako baznim izmenjivačima jona pri pH = 2–12, sa slabo kiselim pri pH = 5–12 i sa slabo baznim pri pH = 2–6. Sorbenti na bazi silicijum-dioksida ne mogu se koristiti pri pH 9. Jonska snaga mobilne faze utiče na kapacitet jonskog izmjenjivača. Sa povećanjem jonske snage, sorpcija jona obično se smanjuje, jer se povećava snaga eluiranja mobilne faze. Stoga, na početku odvajanja, mobilna faza treba da ima nisku jonsku snagu (0,05–0,1), a konačna vrednost ove karakteristike ne bi trebalo da prelazi 2. U gradijentnom eluiranju često se koriste puferi sa povećanjem jonske snage.

Za selektivno eluiranje jona koje apsorbuje jonski izmenjivač, voda, puferski rastvori (fosfat, acetat, borat, hidrokarbonat itd.) sa određenom pH vrednošću i jonskom snagom, rastvori minerala (hlorovodonična, azotna, sumporna, fosforna) i organske (fenol, limunska, mliječna, vinska, oksalna, EDTA) kiseline. Izbor eluensa je olakšan činjenicom da su granični koeficijenti raspodjele većine elemenata između vodenih (vodo-organskih) otopina mnogih kompleksanata i jonskih izmjenjivača standardnog tipa određeni i prikazani u tabelama.

1.6.4. Kromatografija isključivanja veličine. Kromatografija bez veličine je vrsta tečne hromatografije u kojoj se razdvajanje komponenti zasniva na raspodjeli molekula prema njihovoj veličini između otapala u porama sorbenta i rastvarača koji teče između njegovih čestica. Prilikom razdvajanja, mali molekuli ulaze u polimernu mrežu, u čijim porama otapalo služi kao stacionarna faza, i tu se zadržavaju. Veliki molekuli ne mogu prodrijeti u polimernu mrežu i mobilna faza ih ispiru iz kolone. Najprije se eluiraju najveći molekuli, zatim srednji i na kraju mali.

Kromatografija isključivanja veličine podijeljena je na gel permeaciju i gel filtraciju. U gel permeacijskoj hromatografiji dolazi do razdvajanja na polimerima koji bubre u organskim rastvaračima. Verzija gel filtracije hromatografije isključivanja veličine uključuje upotrebu polimera koji bubri u vodi kao stacionarne faze.

Trajanje zadržavanja komponenti analiziranog uzorka u koloni za isključenje veličine zavisi od veličine njihovih molekula i difuzije u pore sorbenta, kao i od veličine pora stacionarne faze.

Kod ove vrste tečne hromatografije, koeficijent raspodjele D za najmanje molekule analiziranog uzorka, koji se kreću u hromatografskoj koloni najmanjom brzinom, prodirući u mrežu stacionarne faze, ona je jednaka 1, jer mobilna faza i rastvarač u porama stacionarne faze imaju istu kompoziciju. U ovom slučaju, glavna jednačina kolonske hromatografije ima oblik

Veliki molekuli koji ne ulaze u pore stacionarne faze eluiraju se iz kolone zajedno s mobilnom fazom. Za njih D= 0, a V R =V m. Takav raspon vrijednosti koeficijenta distribucije (od 0 do 1) tipičan je samo za hromatografiju isključivanja veličine.

Sve molekule analizirane višekomponentne supstance treba isprati iz kolone propuštanjem male zapremine rastvarača iz V m prije V m +V s a razdvajanje je završeno prije nego što vrh rastvarača izađe. Stoga je u ovoj vrsti hromatografije potrebno koristiti dovoljno dugačke kolone sa velikim slobodnim volumenom. V m i veliki broj pora u sorbentu.

Rezolucija hromatografskih pikova u odvajanju isključenja po veličini može se poboljšati korištenjem gradijentnog eluiranja s miješanim rastvaračima.

Svaki sorbent koji se koristi u hromatografiji bez veličine karakterizira određeni volumen pora i stoga ima određenu površinu odvojivih molekulskih težina i određenu kalibracijsku krivulju. U ovom slučaju, kalibracijska kriva koja karakterizira ovisnost zadržanog volumena o molekulskoj težini ili veličini molekula, u pravilu ima složen oblik.

Stacionarne faze u hromatografiji isključene veličine se biraju na osnovu specifičnih analitičkih zadataka. U početku se utvrđuje koji sistem rastvarača se može koristiti za analizu (vodeni ili vodeno-organski). Ovisno o tome, određuje se vrsta sorbenta. Ako se uzorci rastvorljivi u vodi treba odvojiti, na primjer, kao stacionarne faze koriste se umreženi dekstrani koji bubre u vodi (Sephadex) ili poliakrilamidi (Biogel P). Odvajanje supstanci rastvorljivih u organskim rastvaračima može se vršiti na polistirenima sa različitim stepenom umrežavanja, koji bubre u organskim rastvaračima (stirogel, poragel, biobid C). Takvi nabrekli gelovi generalno nisu stabilni na pritisak i dozvoljavaju vrlo niske brzine protoka mobilne faze, što produžava vrijeme analize. Da bi se implementirala visokoefikasna verzija hromatografije s isključenjem veličine, potrebno je koristiti stacionarne faze sa krutim matricama - silika gelovima, čiji se nedostatak - visoka adsorpciona aktivnost - eliminiše površinskom silanizacijom ili odabirom eluenta odgovarajućeg polariteta. .

Supstance koje se mogu koristiti kao mobilne faze u hromatografiji isključenja veličine su:

 potpuno rastvoriti analizirani uzorak;

 dobro navlažiti sorbent;

 suprotstaviti adsorpciju komponenti uzorka na sorbentu;

 imaju nisku viskoznost i toksičnost.

1.6.5. Planarna hromatografija. Planarna hromatografija uključuje tankoslojnu i papirnu hromatografiju. Ove vrste tečne hromatografije su jednostavne tehnike, ekspresne, ne zahtevaju skupu opremu, što je njihova neosporna prednost.

Razdvajanje mješavine supstanci ovim metodama može se izvesti pomoću različitih hromatografskih sistema. Stoga se razlikuju adsorpcija, distribucija, normalna i obrnuta faza, ionska izmjena itd., papirna i tankoslojna hromatografija. Trenutno je tankoslojna hromatografija najrasprostranjenija.

Papirna i tankoslojna hromatografija su slične u tehnici. Celulozno papirno vlakno se koristi kao stacionarna faza u papirnoj hromatografiji, a različiti sorbenti (Al 2 O 3 , silika gel i dr.) se nanose u jednoličnom tankom (100-300 μm) sloju na staklenu, metalnu ili plastičnu podlogu (nosač). ) u tankoslojnoj hromatografiji. Sloj adsorbenta na nosaču može, ali i ne mora biti fiksiran.

Kromatografsko razdvajanje u planarnim metodama, kao i na koloni, nastaje zbog prijenosa komponenti analita mobilnom fazom duž sloja stacionarne faze različitim brzinama u skladu s koeficijentima raspodjele tvari koje se odvajaju. . U oba slučaja koriste se hromatografski sistemi tečnost-čvrsti sorbent (adsorpcioni separacioni mehanizam), tečno-tečno-čvrsti nosač (distributivni, jono-izmjenjivački i drugi mehanizmi).

Kao mobilne faze koriste se različita otapala ili njihove mješavine, organske ili neorganske kiseline.

Praktično dobijanje planarnih hromatograma sastoji se u sledećem.

Na traci hromatografskog papira ili na tankom sloju sorbenta olovkom se označava početna linija na udaljenosti od 1 cm od donjeg ruba trake ili ploče. Mikropipeta se koristi za nanošenje uzorka na startnu liniju u obliku mrlje prečnika ne većeg od 2-3 mm. Zatim se rub trake ili ploče spušta u posudu s mobilnom fazom, smještenu u zatvorenoj komori. Kako se mobilna faza uzdiže duž trake ili ploče i dolazi do višestrukih elementarnih radnji sorpcije-desorpcije, distribucije između dvije tekuće faze, jonske izmjene itd., koje su uobičajene u hromatografiji, komponente analizirane smjese se odvajaju. Proces se obično nastavlja sve dok rastvarač ne pređe sa startne linije 10 cm.Nakon toga se traka ili ploča uklanja iz komore i suši. Ako su komponente analita obojene, one daju odgovarajuće mrlje boje na hromatogramu. Da bi se otkrile neobojene komponente analita, mora se razviti kromatogram. Izrada hromatograma i detekcija komponenti uzorka može se vršiti različitim metodama i zavisi od sastava analiziranih smeša. Manifestacija se može izvesti:

- Korišćenjem UV svetla. Metoda je primenljiva za detekciju supstanci koje mogu da emituju sopstveno zračenje (luminescenciju) u vidljivom opsegu talasnih dužina pod dejstvom UV zračenja;

 pomoću reagenasa-razvijača. Na primjer, prisustvo aminokiselina u analiziranoj smjesi može se otkriti korištenjem ninhidrina. Osušeni hromatogram se uroni u 0,2% rastvor ninhidrina u acetonu, a zatim osuši. Mrlje koje odgovaraju različitim komponentama smeše dobijaju vizuelnu i, po pravilu, specifičnu boju za svaku supstancu;

- korišćenjem joda. U tom slučaju detektovani kromatogram se unosi u posudu na čijem se dnu nalaze kristali joda. Pare joda se jače adsorbiraju na mrlje, zbog čega se mrlje vizualiziraju. Jod je nespecifičan reagens za razvijanje. Koristeći specifične reagense, moguće je ne samo odrediti broj komponenti mješavine, već i identificirati odvojene tvari po boji mrlja.

Papirna i tankoslojna hromatografija najčešće se izvodi u gore opisanoj takozvanoj uzlaznoj varijanti. Često je za poboljšanje kvalitete kromatograma potrebno koristiti složenije varijante planarne kromatografije, na primjer, odozgo prema dolje, kružne, dvodimenzionalne. U papirnoj ili tankoslojnoj hromatografiji, analit se nanosi na početnu liniju ploče ili papirne trake na vrhu, a eluent se dovodi odozgo umjesto odozdo. Pozitivan efekat poboljšanog odvajanja je posledica doprinosa sila gravitacije komponenti procesu separacije.

I uzvodna i nizvodna hromatografija se može izvoditi u jednodimenzionalnoj i dvodimenzionalnoj verziji. Za razliku od prethodno opisanog jednodimenzionalnog procesa separacije ravnog sloja, kod dvodimenzionalne hromatografske separacije prvo se odvajanje analiziranog uzorka vrši u jednom rastvaraču, a zatim se separacija vrši u smjeru okomitom na prvi, koristeći drugog rastvarača, rotirajući prvi kromatogram za 90 °C.

U kružnoj hromatografiji, analit se nanosi kao kap u sredini ploče ili lista hromatografskog papira. Ovdje se također kap po kap dodaje jedno ili više rastvarača. To dovodi do činjenice da je rezultirajući kromatogram skup radijalnih mrlja.

Položaj tačaka (zona) koje formiraju odvojene komponente analita na ravnom kromatogramu karakteriziraju vrijednosti relativne brzine kretanja komponenti u tankom sloju R fi. Eksperimentalna vrijednost R fi definisan kao omjer udaljenosti L i, položio i-ta komponenta, do udaljenosti L prođe rastvaračem od startne do prednje linije (slika 1.10):

Vrijednost R fi zavisi od prirode relevantne komponente analiziranog uzorka, prirode stacionarne faze, njene debljine, prirode i kvaliteta mobilne faze, načina primene uzorka i drugih faktora, ali uvek R fi 1.

Vrijednost R fi je zapravo identično vremenu zadržavanja supstance ili njenom retencionom volumenu, koji karakteriše brzinu prolaska supstance kroz hromatografsku kolonu, i može se koristiti za kvalitativnu identifikaciju komponenti analiziranog uzorka, a prečnik tačke je identičan do visine ili površine kromatografskog vrha i stoga u određenoj mjeri odražava kvantitativni sadržaj tvari.

Kvantitativno određivanje sastava analiziranog uzorka u najjednostavnijem slučaju može se vizualno procijeniti intenzitetom intrinzične boje mrlja ili intenzitetom fluorescentnog sjaja nastalih mrlja tokom UV detekcije. U ove svrhe široko se koristi eluiranje hromatografskih mrlja. U tom slučaju se tačka dobijena na hromatogramu pažljivo izreže ili ostruže, tretira odgovarajućim rastvaračem, a dobijeni rastvor se ispituje odgovarajućom fizičko-hemijskom metodom. Možete koristiti i gravimetrijsku metodu, u kojoj se odgovarajuća tačka izrezuje iz kromatograma i važe. Količina supstance određena je razlikom u težini čistog papira iste površine i papira sa supstancom.

Papir (BH ) I tankoslojnom hromatografijom (TLC ) prema mehanizmu razdvajanja pripadaju particiona hromatografija . U HD metodi, nosač je poseban hromatografski papir sa određenim svojstvima. Stacionarna faza je voda adsorbovana na površini i porama papira (do 20%), pokretno - organski rastvarač, koji se može mešati ili se ne meša sa vodom, vodom ili rastvorima elektrolita.

Mehanizam prilično komplikovano na papiru. U stacionarnoj fazi, tvar se može zadržati ne samo zbog rastvaranja u vodi koju adsorbira papir, već i biti adsorbovan celuloza direktno. Nacrtano na papiru zajedničke komponente prelaze u mobilnu fazu i kreću se kroz kapilare papira različitim brzinama u skladu sa koeficijent međufazne distribucije svaki od njih. Kao prvo hromatografija dio tvari iz papira prelazi u mobilna faza i kreni dalje. Kada organsko otapalo dospije na područje papira koje ne sadrži otopljenu supstancu, preraspodjela : iz organske faze supstanca prelazi u vodenu fazu, sorpirana na papiru. Pošto se komponente razlikuju afinitet prema sorbentu , kada se eluent kreće, dolazi do razdvajanja: neke supstance se odlažu na početku puta, druge se kreću dalje. Ovdje su kombinovani termodinamički (uspostavljanje ravnotežne distribucije supstanci između faza) i kinetički (kretanje komponenti različitim brzinama) aspekti razdvajanja. Kao rezultat, svaka komponenta je koncentrirana na određeno područje papirnog lista: zone pojedinih komponenti on hromatogram . Upotreba hromatografije na papiru ima niz značajnih nedostataka: proces separacije zavisi od sastava i svojstava papira, promene sadržaja vode u porama papira sa promenama uslova skladištenja, veoma niska brzina hromatografije ( do nekoliko dana) i niska ponovljivost rezultata. Ovi nedostaci ozbiljno utiču na širenje papirne hromatografije kao hromatografske metode.

IN TLC metoda proces odvajanja mješavine tvari provodi se u tankom sloju sorbent nanesena na inertnu čvrstu podlogu i osigurana kretanjem mobilna faza (rastvarač) kroz sorbent pod dejstvom kapilarne sile . Bymehanizam razdvajanja razlikovati particiona, adsorpciona i jonoizmenjivačka hromatografija . Do razdvajanja komponenti dolazi u ovim slučajevima ili kao rezultat njihovog različitog koeficijenta raspodjele između dvije tekuće faze ( particiona hromatografija ), ili zbog različite adsorpcije spojeva od strane sorbenta ( adsorpciona hromatografija ). Metoda adsorpcije zasniva se na različitim stepenima sorpcije-desorpcije odvojenih komponenti na stacionarnoj fazi. Adsorpcija izvršeno o trošku van der Waalsove snage , što je osnova fizička adsorpcija , polimolekularno (formiranje nekoliko slojeva adsorbata na površini adsorbenta) i hemisorpcija (hemijska interakcija adsorbenta i adsorbata).

U slučaju upotrebe takvih sorbenata za TLC kao glinice ili silika gel igraju ulogu u razdvajanju distribucija , i adsorpcija na razvijenoj aktivnoj površini sorbenta (150–750 m2/g). Distribucija komponente mješavine se javljaju između vode na površini nosača (npr adsorbensi , Kako glinice , skrob , celuloza , dijatomejska zemlja - I vode formu stacionarna faza ), i rastvarač koji se kreće kroz ovu stacionarnu fazu ( mobilna faza ). Komponenta smjese koja je lakše rastvorljiva u vodi kreće se sporije od one koja je lakše rastvorljiva u mobilnoj fazi.

Adsorpcija manifestuje se u činjenici da između nosilac , na primjer, aluminijum oksid, a komponente smjese su postavljene adsorpcione ravnoteže - za svaku komponentu svoju, čiji je rezultat različite brzine putovanja komponente mešavine. Mogu se razlikovati dva ekstremna slučaja:

a) koncentracija supstance na adsorbentu je nula. Tvar se potpuno otapa u mobilnoj fazi i odnese se njome (kreće se zajedno sa rastvarač front ).

b) tvar je potpuno adsorbirana, ne stupa u interakciju s rastvaračem i ostaje na početku.

U praksi, uz vješti izbor rastvarača i adsorbensa distribucija spojevi se nalaze između ovih ekstremnih slučajeva, a supstanca postepeno preneseno sa jednog sloja sorbenta na drugi zbog procesa koji se istovremeno odvijaju sorpcija I desorpcija .

Rastvarač koji prolazi kroz sorbent naziva se eluent , proces kretanja supstance zajedno sa eluentom  elucija . Kako se tečnost kreće po ploči, mešavina supstanci se odvaja usled dejstva sila adsorpcija , distribucija , jonska izmjena ili kombinacija svih ovih faktora. Kao rezultat, odvojite hromatografske zone komponente mješavine, tj. ispostavilo se hromatogram .

Ispravan izbor sorbent I eluent određuje efikasnost odvajanja smeše. Pokretljivost ispitivane supstance zavisi od njenog afiniteta za sorbent i eluirajuća sila (polaritet) eluenta. Kako se polaritet spoja povećava, tako se povećava i njegov afinitet prema polarnom sorbentu. Povećanjem stepena adsorpcije silika gel organska jedinjenja su raspoređena u nizu: ugljovodonici<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь za silika gel eluenti mogu biti raspoređeni u rastućem redoslijedu "polariteta" ( eluirajuća moć ) i formiraju niz rastvarača ( eluotropne serije ) prema eksperimentalnim podacima: alkani> benzen> hloroform> dietil eter> etil acetat> alkoholi S 2 -S 4> voda> aceton> sirćetna kiselina> metanol. Dakle, polarno jedinjenje, alkohol, se prilično snažno adsorbuje na silika gelu i stoga se slabo kreće pod dejstvom takvog nepolarnog rastvarača kao što je heksan, i ostaje blizu početne linije. Zauzvrat, nepolarni aromatični ugljikovodik bifenil je primjetno pokretljiviji u heksanu, ali čak i ovdje, za postizanje R f oko 0,5, potreban je polarniji aprotični eluent, metilen hlorid. jačina eluenta regulirati korištenjem mješavina rastvarača - susjedi u eluotropne serije sa različitim polaritetom.

Trenutno TLC uglavnom koristi sljedeće sorbenti : za razdvajanje lipofilne supstance  silika gel , glinice , acetilirana celuloza , poliamidi ; razdvojiti hidrofilne supstance  celuloza , izmjenjivači jona celuloze , dijatomejska zemlja , poliamidi . Najvažnija karakteristika sorbenta je njegova aktivnost , tj. sposobnost apsorbirati (držati) komponente smjese koje treba odvojiti. U inostranstvu proizvode brojne firme silika gel , dijatomejska zemlja I glinice sa dodatkom 5% gipsa koji se koristi za fiksiranje sloja sorbenta u samoproizvodnji ploča.

Najčešći sorbent je silika gel - hidratizirana silicijumska kiselina, nastala djelovanjem mineralnih kiselina na Na 2 SiO 3 i sušenjem nastalog sola. Nakon mljevenja sola koristi se frakcija određene veličine zrna (označena na ploči, obično 5-20 mikrona). silika gel je polarni sorbent sa OH grupama kao aktivnim mestima. Lako upija vodu na površini i stvara vodonične veze.

Alumina je slabo bazni adsorbens i koristi se uglavnom za odvajanje slabo bazičnih i neutralnih spojeva. Nedostatak ploča na aluminij oksidu je obavezno aktiviranje površine prije upotrebe u sušioniku na visokoj temperaturi (100-150 o C) i nizak kapacitet adsorpcije sloja u odnosu na silika gel.

dijatomejska zemlja - adsorbens dobijen od prirodnih minerala - dijatomejske zemlje. Sorbent ima hidrofilna svojstva i manji kapacitet adsorpcije sloja u odnosu na silika gel.

celuloza: Tankoslojne ploče obložene celulozom su vrlo efikasne u odvajanju složenih organskih molekula. Adsorbent su uglavnom kuglice od celuloze promjera do 50 mikrona, pričvršćene na nosač škrobom. Kao i kod papirne hromatografije, porast fronta rastvarača je veoma spor.

Kromatografska analiza izvodi se na industrijskim pločama češke proizvodnje " Silufol » (« Silufol "") od aluminijske folije, ponekad ojačane kartonom, i " Siluplast » od plastike presvučene slojem sorbenata - silika gela LS 5-40 sa skrobom ili gipsom kao vezivom (do 10%), ili aluminijum oksida sa ili bez fluorescentnih indikatora. rekordi " Silufol » imaju visoku stopu eluiranja, međutim, karakteriše ih niska moć razdvajanja i niska osjetljivost. Tokom skladištenja su osetljivi na uslove (vlažnost, temperaturu, agresivne medije itd.). Pojedinačne firme snabdevaju hromatografske ploče sa slojem sorbenta različite (obično do 0,25 mm), ali strogo konstantne debljine (silika gel, celuloza, jonoizmenjivačka smola), na staklu i podlogama od aluminijske folije, plastike, impregniranog fiberglasa.

tanjiri « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) se proizvode u Rusiji na polimernoj bazi (polietilen tereftalat, razred P) ili aluminijumskoj podlozi (grade AF) sa nanesenim radnim slojem mikrofrakcionisani silika gel sorbent razreda STX-1A i STX-1VE (proizvedeni u SSSR-u kao frakcionirani silika gel KSKG) debljine 90-120 mikrona (do 200 mikrona), fiksirani posebnim vezivom - silikasol . Kada se kao vezivo koristi sol silicijske kiseline (silikazola), koji se nakon zagrijavanja pretvara u silika gel, dobivene TLC ploče se sastoje od dvije komponente: sloja silika gela i supstrata. Ujednačenost debljine sloja sorbenta na jednoj ploči je ±5 µm. Primer oznake: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UF (10x10)" - TLC ploče visokih performansi na aluminijumskoj podlozi, sa fosforom, 10x10 cm.

Ako se koristi staklena podloga (grad C), tada su takve ploče za višekratnu upotrebu i hemijski otporne. Njihova hemijska otpornost određena je hemijskom otpornošću silika gela. Kao rezultat toga, TLC ploče se mogu više puta tretirati agresivnim reagensima, na primjer, vrućom smjesom hroma, što uklanja ograničenja u korištenju korelacijskih reagensa za detekciju mrlja i modifikaciju sorbenta i omogućava višestruko (do 30 puta ili više) regeneracija ploča sa smjesom hroma. Staklene ploče se mogu rezati na željenu veličinu. Mehanička čvrstoća sloja sorbenta može se kontrolisati, obezbeđujući, s jedne strane, transport i višestruku obradu ploča, as druge strane mogućnost ekstrakcije slojeva adsorbenta sa odvojenim supstancama za naknadno ispiranje pojedinačnih jedinjenja iz sorbenta i njihovo dalje proučavanje instrumentalnim metodama (IR i UV spektrometrija), metode difrakcije rendgenskih zraka, NMR i dr.).

Ploče se razlikuju po veličini frakcija (raspodjela čestica) silika gela koji čini sloj. Na analitičkim pločama (grad A) frakcija je 5-17 mikrona, na visoko efikasnim (grade B) - 8-12 mikrona. Uža distribucija povećava efikasnost ploča, tj. tačke supstanci koje se odvajaju postaju kompaktnije (manje veličine) i stoga se bolje odvajaju kada front eluenta prođe kraću udaljenost. Na ruskim oblatnama, analitički slojevi i slojevi visokih performansi se ne razlikuju mnogo, za razliku od vafla iz Merck-a (Njemačka). Ploče visokih performansi treba koristiti ako se supstance ne mogu odvojiti na analitičkim pločama. Ploče svih modifikacija se proizvode sa fosforom (UV grade) sa ekscitacijom od 254 nm. Rok trajanja nije ograničen, ploče " Sorbfil » široko testiran u analizi derivata aminokiselina, pesticida, lipida, antibiotika.

Provodi se TLC metoda kvalitativna identifikacija komponente. kvantitacija za TLC je takođe moguć, to zahteva nanošenje tačne količine supstance i dodatne denzitometrijske studije uz jasnu fiksaciju intenziteta mrlja. Najčešći je semikvantitativna metoda . Zasnovan je na vizuelno poređenje veličina i intenzitet mrlje komponente sa odgovarajućim karakteristikama serije mrlja iste supstance različitih koncentracija ( standardna referentna rješenja ). Kada se koristi uzorak u količini od 1-5 μg, tako jednostavna metoda omogućava preciznost određivanja sadržaja komponente od oko 5-10%. Često je, da bi se odredile komponente u uzorku, potrebno izvršiti pripremu uzorka kako bi se dobila mješavina koja sadrži analizirana jedinjenja. Priprema uzorka se zasniva na ekstrakciji lekova iz uzorka organskim rastvaračima ( n-heksan, petrolej eter, dietil eter, hloroform), prečišćavanje ekstrakta i naknadna hromatografija u tankom sloju aluminijuma ili silika gela.

Postoji nekoliko varijanti TLC i BC, koje se razlikuju po načinu snabdevanje rastvaračem . Ovisno o smjeru kretanja mobilne faze, razlikuju se:

A)uzlaznom hromatografijom  mobilna faza se sipa na dno separacione komore, papir (ploča) se postavlja vertikalno;

b)silazna hromatografija  mobilna faza se dovodi odozgo i kreće se dole duž sloja sorbenta ploče ili papira;

V)radijalna hromatografija  horizontalno napredovanje fronta rastvarača: mobilna faza se dovodi do centra papirnog diska (ploče), gde se odlaže smeša koja se odvaja.

Najčešći je elucija naviše (hromatografija). Front eluent dok se kreće odozdo prema gore. Izbor rastvarača (mobilna faza) određen je prirodom sorbenta i svojstvima supstanci koje se odvajaju.

Kromatografsko odvajanje BC i TLC metode se provode u komora za odvajanje sa zavrnutim poklopcem. Kvantitativna mjera brzine prijenosa tvari pomoću specifičnog adsorbenta i rastvarača je R vrijednost f (sa engleskog. zadržavanje faktor – koeficijent kašnjenja, ovaj parametar je analogan vremenu zadržavanja). Pozicija zone hromatografirane komponente podešen na veličinu koeficijent R f jednak omjeru brzine njegove zone i brzine fronta rastvarača. Vrijednost R f je uvijek manji od jedinice i ne zavisi od dužine hromatograma. Po iznosu R f pod uticajem raznih faktora. Dakle, na niskim temperaturama tvari se kreću sporije; kontaminacija rastvaračem, nehomogenost adsorbenta, strani joni u analiziranom rastvoru mogu promeniti vrednost R f do 10%. U odabranom sistemu, analiti moraju imati različite vrijednosti R f i raspoređeni po cijeloj dužini hromatograma. Poželjno je da vrijednosti R f ležao u rasponu od 0,05-0,85.

U praksi, vrijednost R f izračunato kao omjer udaljenosti l putuje supstancom na daljinu L prođe rastvaračem:

R f = ll (6.1 )

Obično za izračun odaberite spot centar (Sl. 1). Vrijednost R f zavisi od mnogih faktora kao npr hromatografski papir (njegova poroznost, gustina, debljina, stepen hidratacije) i sorbent (veličina zrna, priroda grupa na površini, debljina sloja, njegova vlažnost, priroda supstance, sastav mobilne faze), eksperimentalni uslovi (temperatura, vreme hromatografije, itd.). Uz konstantnost svih parametara hromatografije, vrijednost R f određena samo individualnim svojstvima svake komponente.

Rice. 1. Određivanje vrijednosti na hromatogramu RF za komponente A I IN,

njihov stepen odvojenosti Rs i broj teoretskih ploča N .

Efikasnost BC i TLC takođe zavisi od selektivnost i osjetljivost reakcije koje se koriste za otkrivanje komponenti analizirane smjese. Obično se koriste reagensi koji formiraju obojene spojeve sa komponentama koje treba odrediti - razvijačima. Za pouzdanije identifikacija zajedničkih komponenti primijeniti " svjedoci » -rješenja standardne supstance (u istom rastvaraču kao i uzorak) za koje se očekuje da će biti prisutni u uzorku. Standardna supstanca naneti na startnu liniju pored analiziranog uzorka i hromatografisati pod istim uslovima. U praksi se često koristi relativna vrijednost:

R f rel = R f x / R f stand (6.2)

Gdje R f stand takođe izračunato po formuli (6.1). Efikasnost hromatografsko odvajanje karakterizirati broj ekvivalentnih teorijskih ploča i njih visok . Dakle, u TLC metodi, broj ekvivalentnih teorijskih ploča N A za komponentu A smjesa koju treba odvojiti izračunava se po formuli:

N A = 16 (l OA / a (A )) 2 (6.3)

Vrijednosti l OA I A (A ) određeno kao što je prikazano na sl. 6.1. Zatim visina ekvivalentne teorijske ploče H A je:

H A = l OA /N = a (A ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Razdvajanje je praktično moguće ako R f (A)  R f (IN)  0,1 .

Okarakterizirati razdvajanje dvije komponente A I IN koristiti stepen (kriterijum) podjele Rs :

Rs =  l / (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (A) + a (B)) (6.5)

Gdje  l  udaljenost između centara tačaka komponenti A I IN;

A (A) I A (IN)  prečnici tačaka A I IN na hromatogramu (slika 6.1). Više Rs , što su jasnije razdvojene tačke komponenti A I IN na hromatogramu. Uslovi hromatografija biraju se tako da vrijednost Rs različita od nule i jedan, optimalna vrijednost Rs je 0,3  0.7. Za stopu selektivnost razdvajanja dvije komponente A I IN koristiti faktor razdvajanja α :

α = l B / l A (6.6)

Ako je α = 1, tada su komponente A I IN nisu odvojeni.

HPLC metoda se široko koristi u oblastima kao što su hemija, petrohemija, biologija, biotehnologija, medicina, prerada hrane, zaštita životne sredine, proizvodnja lekova i mnogim drugim.

Prema mehanizmu razdvajanja analiziranih ili izdvojenih supstanci, HPLC se deli na adsorpcionu, distribucionu, jono-izmjenjivačku, ekskluzijsku, ligand-izmjenjivačku i druge.

HPLC normalne faze

Stacionarna faza je polarnija od mobilne faze, tako da u sastavu eluenta prevladava nepolarno otapalo:

Heksan:izopropanol = 95:5 (za niskopolarne supstance)
Hloroform:metanol = 95:5 (za srednje polarne supstance)
Hloroform:metanol = 80:20 (za visoko polarne supstance)

HPLC reverzne faze

Uobičajeni eluenti za HPLC reverzne faze su:

Acetonitril: voda
metanol: voda
Izopropanol: voda

Matrice za HPLC

Glavne karakteristike matrice:

Veličina čestica (µm);
Veličina unutrašnjih pora (Å, nm).

Dobijanje silika gela za HPLC:

Formiranje mikrosfera polisilicijske kiseline;
Sušenje čestica silika gela;
Odvajanje vazduha.

Sorbentne čestice:

Regularni (sferični): veća otpornost na pritisak, veća cijena;
Nesferični: niža otpornost na pritisak.

Graftovi stacionarne faze

HPLC normalne faze:

Stacionarna faza cijepljena propilnitrilom (nitrilom);
Stacionarna faza sa kalemljenjem propilamina (amina).

HPLC reverzne faze:

Stacionarna faza sa alkil graftom;
Stacionarna faza sa alkilsilil graftom.

HPLC detektori

UV
diodni niz
Fluorescentno
Elektrohemijski
Refraktometrijski
masovno selektivno

Linkovi

Wikimedia fondacija. 2010 .

hromatografija
Particiona hromatografija

Pogledajte šta je "" u drugim rječnicima:

tečna hromatografija visokih performansi- Termin tečna hromatografija visokih performansi Engleski termin tečna hromatografija visokih performansi Sinonimi Skraćenice HPLC, HPLC Povezani termini adsorpcija, oligopeptid, proteomika, sorbent, fuleren, endoedra, hromatografija… …

TEČNA HROMATOGRAFIJA VISOKE PERFORMANSE- tečnom hromatografijom, u cilju povećanja efikasnosti separacije, rastvarač (eluent) pod pritiskom (više od 3x107 Pa) se pumpa kroz kolone napunjene sorbentom sa česticama malog prečnika (do 1 mikrona) i perfuzijom.. ...

TEČNA HROMATOGRAFIJA- vrsta hromatografije, u kojoj tečnost (eluent) služi kao mobilna faza, a ona je stacionarna faza. sorbent, tv. nosač sa tečnošću ili gelom koji se nanosi na njegovu površinu. Izvodi se u koloni ispunjenoj sorbentom (kolona hromatografija), na ravnom ... ... Prirodna nauka. enciklopedijski rječnik

hromatografija- [κρώμα (υroma) boja] proces koji se zasniva na nejednakoj sposobnosti pojedinačnih komponenti smeše (tečnih ili gasovitih) da ostanu na površini adsorbenta i kada se apsorbuju iz struje nosača i kada ... ... Geološka enciklopedija

hromatografija- (sa drugog grčkog ... Wikipedije

hromatografija- Termin hromatografija Engleski termin hromatografija Sinonimi Skraćenice Povezani pojmovi tečna hromatografija visokih performansi, klatrat, laboratorija na čipu, porozimetrija, proteom, proteomika, sorbent, enzim, fuleren, endoedar… … Enciklopedijski rečnik nanotehnologije

HROMATOGRAFIJA IONSKIH IZMJENA- tečna hromatografija na bazi razg. sposobnost odvojenih jona da razmjenjuju jone sa fiksiranim. joni sorbenta koji nastaju kao rezultat disocijacije ionogenih grupa potonjih. Kationski izmjenjivači se koriste za odvajanje katjona, za ... ... Chemical Encyclopedia

HPLC- tečna hromatografija visokih performansi... Rečnik skraćenica ruskog jezika

HPLC- Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je jedna od efikasnih metoda za odvajanje složenih smeša supstanci, koja se široko koristi kako u analitičkoj hemiji tako i u hemijskoj tehnologiji. Osnova hromatografskog razdvajanja je učešće ... Wikipedia

Knjige

Praktična tečna hromatografija visokih performansi, Veronica R. Mayer. Čitaocu predstavljamo 5. izdanje knjige, koje je prošireno savremenim metodama i opremom. U knjizi je mnogo toga poboljšano i dodat je veliki broj referenci. Mesta u tekstu na kojima...

U tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC), priroda procesa koji se dešavaju u hromatografskoj koloni generalno je identična procesima u gasnoj hromatografiji. Razlika je samo u upotrebi tečnosti kao stacionarne faze. Zbog velike gustine tečnih mobilnih faza i visokog otpora kolona, plinska i tečna hromatografija se uvelike razlikuju u instrumentaciji.

U HPLC, čisti rastvarači ili njihove mješavine se obično koriste kao mobilne faze.

Za stvaranje struje čistog rastvarača (ili mješavine rastvarača), koji se u tečnoj hromatografiji naziva eluent, koriste se pumpe koje su dio hidrauličkog sistema hromatografa.

Adsorpcijska kromatografija se izvodi kao rezultat interakcije tvari s adsorbensima, poput silika gela ili aluminijevog oksida, koji imaju aktivne centre na površini. Razlika u sposobnosti interakcije sa adsorpcijskim centrima različitih molekula uzoraka dovodi do njihovog razdvajanja u zone u procesu kretanja sa mobilnom fazom kroz kolonu. Podjela komponentnih zona koja se postiže u ovom slučaju ovisi o interakciji i sa rastvaračem i sa adsorbentom.

Silika gel adsorbenti različitih zapremina, površina i prečnika pora nalaze najveću primenu u HPLC. Aluminij oksid i drugi adsorbenti se koriste mnogo rjeđe. Glavni razlog za to:

Nedovoljna mehanička čvrstoća, koja ne dozvoljava pakovanje i upotrebu na povišenim pritiscima tipičnim za HPLC;

silika gel u odnosu na aluminijum oksid ima širi raspon poroznosti, površine i prečnika pora; značajno veća katalitička aktivnost aluminijum oksida dovodi do izobličenja rezultata analize usled razgradnje komponenti uzorka ili njihove ireverzibilne hemisorpcije.

HPLC detektori

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) se koristi za detekciju polarnih neisparljivih supstanci, koje se iz nekog razloga ne mogu pretvoriti u oblik pogodan za gasnu hromatografiju, čak ni u obliku derivata. Takve supstance, posebno, uključuju sulfonske kiseline, boje rastvorljive u vodi i neke pesticide, kao što su derivati fenil-uree.

detektori:

UV - diodni niz detektora. "Matrica" fotodioda (ima ih više od dvije stotine) konstantno registruje signale u UV i vidljivom području spektra, čime se osigurava snimanje UV-B spektra u režimu skeniranja. Ovo omogućava kontinuirano snimanje, uz visoku osjetljivost, neiskrivljenih spektra komponenti koje brzo prolaze kroz posebnu ćeliju.

U poređenju sa detekcijom na jednoj talasnoj dužini, koja ne daje informacije o "čistoći" pika, mogućnost upoređivanja punih spektra niza dioda daje rezultat identifikacije sa mnogo većim stepenom sigurnosti.

Fluorescentni detektor. Velika popularnost fluorescentnih detektora je zbog vrlo visoke selektivnosti i osjetljivosti, te činjenice da mnogi zagađivači okoliša fluoresciraju (na primjer, poliaromatični ugljovodonici).

Elektrohemijski detektor se koristi za detekciju supstanci koje se lako oksidiraju ili redukuju: fenoli, merkaptani, amini, aromatični nitro i halogeni derivati, aldehidi, ketoni, benzidini.

Kromatografsko odvajanje smjese na koloni zbog sporog napredovanja PF traje dugo. Kako bi se ubrzao proces, hromatografija se provodi pod pritiskom. Ova metoda se naziva tečna hromatografija visokih performansi (HPLC).

Modernizacija opreme koja se koristi u klasičnoj tečnoj kolonskoj hromatografiji učinila ju je jednom od perspektivnih i modernih metoda analize. Tečna hromatografija visokih performansi je pogodna metoda za odvajanje, preparativno izolovanje i izvođenje kvalitativne i kvantitativne analize nehlapljivih termolabilnih jedinjenja niske i visoke molekularne težine.

Ovisno o vrsti sorbenta koji se koristi u ovoj metodi, koriste se 2 varijante hromatografije: na polarnom sorbentu koji koristi nepolarni eluent (opcija direktne faze) i na nepolarnom sorbentu pomoću polarnog eluenta - tzv. -fazna tečna hromatografija visokih performansi (RPHLC).

Kada eluent pređe u eluent, ravnoteža u RPHLC uslovima se uspostavlja mnogo puta brže nego u uslovima polarnih sorbenata i nevodenih PF. Kao rezultat ovoga, kao i pogodnosti rada sa vodom i vodeno-alkoholnim eluentima, RPHLC je sada stekao veliku popularnost. Većina HPLC analiza se izvodi ovom metodom.

Detektori. Registracija izlaza iz kolone posebne komponente vrši se pomoću detektora. Za registraciju možete koristiti promjenu bilo kojeg analitičkog signala koji dolazi iz mobilne faze i koji se odnosi na prirodu i količinu komponente mješavine. Tekuća hromatografija koristi analitičke signale kao što su apsorpcija svjetlosti ili emisija svjetlosti izlazne otopine (fotometrijski i fluorimetrijski detektori), indeks loma (refraktometrijski detektori), potencijal i električna provodljivost (elektrohemijski detektori) itd.

Kontinuirano detektovani signal snima diktafon. Kromatogram je slijed detektorskih signala snimljenih na vrpci snimača, generiranih kada pojedine komponente smjese izađu iz kolone. U slučaju razdvajanja smjese, pojedinačni pikovi su vidljivi na vanjskom hromatogramu. Položaj vrha na kromatogramu koristi se u svrhu identifikacije tvari, visina ili površina pika - u svrhu kvantitativnog određivanja.

Aplikacija

HPLC nalazi najširu primenu u sledećim oblastima hemijske analize (izdvajaju se objekti analize gde HPLC praktično nema konkurenciju):

· Kontrola kvaliteta hrane - tonik i aditivi za ukus, aldehidi, ketoni, vitamini, šećeri, boje, konzervansi, hormoni, antibiotici, triazin, karbamat i drugi pesticidi, mikotoksini, nitrozoamini, policiklični aromatični ugljovodonici itd.

· Zaštita životne sredine - fenoli, organska nitro jedinjenja, mono- i policiklični aromatični ugljovodonici, veliki broj pesticida, glavnih anjona i katjona.

· Kriminalistika - droge, organski eksplozivi i boje, moćni farmaceutski proizvodi.

· Farmaceutska industrija - steroidni hormoni, praktično svi proizvodi organske sinteze, antibiotici, polimerni preparati, vitamini, proteinski preparati.

Medicina - navedene biohemijske i lekovite supstance i njihovi metaboliti u biološkim tečnostima (aminokiseline, purini i pirimidini, steroidni hormoni, lipidi) u dijagnostici bolesti, određivanju brzine izlučivanja lekova iz organizma u svrhu njihovog individualnog doziranja. .

· Poljoprivreda - određivanje nitrata i fosfata u zemljištu radi određivanja potrebne količine đubriva, određivanje nutritivne vrijednosti hrane za životinje (aminokiseline i vitamini), analiza pesticida u zemljištu, vodi i poljoprivrednim proizvodima.

Biohemija, bioorganska hemija, genetski inženjering, biotehnologija - šećeri, lipidi, steroidi, proteini, aminokiseline, nukleozidi i njihovi derivati, vitamini, peptidi, oligonukleotidi, porfirini itd.

· Organska hemija - svi stabilni proizvodi organske sinteze, boje, termolabilna jedinjenja, neisparljiva jedinjenja; neorganska hemija (praktično sva rastvorljiva jedinjenja u obliku jona i kompleksnih jedinjenja).

· Kontrola kvaliteta i ispravnosti prehrambenih proizvoda, alkoholnih i bezalkoholnih pića, vode za piće, kućne hemije, parfema u svim fazama njihove proizvodnje;

utvrđivanje prirode zagađenja na mjestu katastrofe ili vanredne situacije koju je izazvao čovjek;

otkrivanje i analiza narkotičnih, potentnih, otrovnih i eksplozivnih supstanci;

utvrđivanje prisustva štetnih materija (policikličnih i drugih aromatičnih ugljovodonika, fenola, pesticida, organskih boja, jona teških, alkalnih i zemnoalkalnih metala) u tečnim efluentima, emisijama u vazduh i čvrstom otpadu iz preduzeća iu živim organizmima;

· praćenje procesa organske sinteze, prerade nafte i uglja, biohemijske i mikrobiološke proizvodnje;

analiza kvaliteta zemljišta za đubrenje, prisustva pesticida i herbicida u zemljištu, vodi i proizvodima, kao i nutritivne vrednosti stočne hrane; složeni istraživački analitički zadaci; dobijanje mikro količine ultračiste supstance.

Tečna hromatografija

Tečna hromatografija je vrsta hromatografije u kojoj mobilna faza, nazvan eluent, je tečnost. Stacionarna faza Možda čvrsti sorbent, čvrsti nosač sa tečnošću taloženom na njegovoj površini ili gel.

Razlikovati columnar I tanki sloj tečna hromatografija. U verziji kolone, dio mješavine supstanci koje treba odvojiti prolazi kroz kolonu ispunjenu stacionarnom fazom u struji eluenta koji se kreće pod pritiskom ili pod dejstvom gravitacije. U tankoslojnoj hromatografiji, eluent se kreće pod djelovanjem kapilarnih sila duž ravnog sloja sorbenta nanesenog na staklenu ploču ili metalnu foliju, duž poroznog polimernog filma ili duž trake specijalnog kromatografskog papira. Takođe je razvijena metoda tankoslojne tečne hromatografije pod pritiskom, kada se eluent pumpa kroz sloj sorbenta koji je u sendviču između ploča.

Postoji nekoliko vrsta tečne hromatografije, kao npr analitički(za analizu mješavina supstanci) i preparativno(za izolaciju čistih komponenti).

Razlikovati tečna hromatografija (LC) u svojoj klasičnoj verziji, izvedeno na atmosferski pritisak, And velika brzina) izvršeno u visok krvni pritisak. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) koristi kolone prečnika do 5 mm, gusto napunjene sorbentom sa malim česticama (3-10 µm). Za pumpanje eluenta kroz kolonu koristi se pritisak do 3,107 Pa. Ova vrsta hromatografije se zove hromatografija visokog pritiska. Propuštanje eluenta kroz kolonu pod visokim pritiskom omogućava naglo povećanje brzine analize i značajno povećanje efikasnosti odvajanja zbog upotrebe fino dispergovanog sorbenta.

HPLC opcije su mikrokolona hromatografija na kolonama malog prečnika punjenim sorbentom i kapilarna hromatografija na šupljim kapilarnim kolonama punjenim sorbentom. HPLC metoda trenutno omogućava da se izoluju, kvantitativno i kvalitativno analiziraju složene mešavine organskih jedinjenja.

Tekuća hromatografija je najvažnija metoda fizičko-hemijskog istraživanja u hemiji, biologiji, biohemiji, medicini i biotehnologiji. Koristi se za:

proučavanje metaboličkih procesa u živim organizmima lijekova;

dijagnostika u medicini;

· analiza proizvoda hemijske i petrohemijske sinteze, poluproizvoda, boja, goriva, maziva, ulja, kanalizacije;

· proučavanje izotermi sorpcije iz rastvora, kinetike i selektivnosti hemijskih procesa;

izbor

analiza i odvajanje smjesa, njihovo prečišćavanje i izolacija mnogih bioloških supstanci, kao što su aminokiseline, proteini, enzimi, virusi, nukleinske kiseline, ugljikohidrati, lipidi, hormoni.

U hemiji makromolekularnih jedinjenja i u proizvodnji polimera, tečna hromatografija se koristi za analizu kvaliteta monomera, proučavanje distribucije molekulske mase i raspodele po tipu funkcionalnosti oligomera i polimera, što je neophodno za kontrolu proizvoda.

Tečna hromatografija se takođe koristi u parfimeriji, prehrambenoj industriji, za analizu zagađenja životne sredine i u forenzici.

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) razvijena je i uvedena sredinom 1970-ih. Tada su se pojavili prvi tečni hromatografi.

Tečna hromatografija je optimalna metoda za analizu hemijski i termički nestabilnih molekula, makromolekularnih supstanci smanjene isparljivosti. Ovo se može objasniti posebnom ulogom mobilne faze u LC, za razliku od plinske hromatografije: eluent obavlja ne samo transportnu funkciju.

2. Osnovni pojmovi i klasifikacija metoda tečne hromatografije.

By mehanizam zadržavanja odvojenih supstanci stacionarnom fazom LC razlikovati:

sedimentna hromatografija

· adsorpciona hromatografija , kod kojih se razdvajanje vrši kao rezultat interakcije odvojene supstance sa adsorbent kao što je aluminijum oksid ili silika gel, imajući na površini aktivni polarni centri. Solvent(eluent) - nepolarna tečnost.

Rice. Shema za odvajanje mješavine tvari adsorpcionom hromatografijom

http://www. xumuk. en/biologhim/bio/img014.jpg

Mehanizam sorpcije se sastoji u specifičnoj interakciji između polarne površine sorbenta i polarnih (ili sposobnih za polarizaciju) područja molekula analizirane komponente (Sl.). Interakcija nastaje zbog interakcije donor-akceptor ili formiranja vodikovih veza.

Rice. Šema adsorpcione tečne hromatografije

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Rice. . Razdjelna hromatografija sa vezanom fazom (varijanta normalne faze).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

At normalno-faza U varijanti particione tečne hromatografije, supstituisani alkilhlorosilani koji sadrže polarne grupe, kao što su nitril, amino, itd., koriste se kao modifikatori površine silika gela (vezane faze) (Sl.). Upotreba vezanih faza omogućava finu kontrolu sorpcionih svojstava površine stacionarne faze i postizanje visoke efikasnosti odvajanja.

obrnuta faza tečna hromatografija zasniva se na raspodjeli komponenti mješavine između polarnog eluenta i nepolarnih grupa (dugi alkilni lanci) cijepljenih na površinu sorbenta (Sl.). Varijanta tečne hromatografije podržane faze se koristi rjeđe, kada se tečna stacionarna faza nanosi na stacionarni nosač.

Rice. . Particiona hromatografija sa vezanom fazom (verzija sa obrnutom fazom). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Particiona tečna hromatografija uključuje tečnost za ekstrakciju hromatografija, u kojem je stacionarna faza organski ekstraktant nanijet na čvrsti nosač, a mobilna faza je vodeni rastvor jedinjenja koje treba odvojiti. Prikladni ekstraktanti su, na primjer, fenoli, trialkil fosfati, amini, kvarterne amonijum baze i organofosforna jedinjenja koja sadrže sumpor. Ekstrakciona tečna hromatografija koristi se za odvajanje i koncentriranje anorganskih jedinjenja, kao što su joni alkalnih metala, aktinidi i drugi slični elementi u preradi istrošenog nuklearnog goriva.

jonoizmenjivačka hromatografija,

jonski izmjenjivači.

katjonski izmjenjivači

anjonski izmjenjivači.

amfoterni jonski izmjenjivači

amfoliti

Jonit

kationski izmjenjivač

anjonski izmjenjivači

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (katjonska izmjena)

R-OH + Na+ + Sl - → R-Sl + Na+ + OH - (anionska izmjena)

Jonski izmjenjivači moraju ispunjavati sljedeće zahtjeve: da budu hemijski stabilni u različitim sredinama, mehanički jaki u suvom i posebno u nabubrenom stanju, imaju visok kapacitet apsorpcije i sposobnost dobre regeneracije.

U jono-izmjenjivačkoj (jonskoj) hromatografiji, odvojeni anioni (kationi) se detektuju kao kiseline (odgovarajuće baze) pomoću visoko osjetljivog konduktometrijskog detektora, gdje se kolone visokih performansi pune površinski aktivnim ionskim izmjenjivačem malog kapaciteta.

jonska parna hromatografija

hromatografija izmene liganda

različita sposobnost odvojenih jedinjenja da formiraju komplekse sa katjonima prelaznih metala

hromatografija isključivanja veličine

razlike u veličini molekula

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Rice. Šema gel permeacijske hromatografije

afinitetna hromatografija

Rice. Shema afinitetne hromatografije

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Zatim se uklanja iz polimera propuštanjem otopine spoja koji ima još veći afinitet za makromolekulu. Takva hromatografija je posebno efikasna u biotehnologiji i biomedicini za izolaciju enzima, proteina i hormona.

zavisno na način kretanja supstance Postoje sljedeće vrste tečne hromatografije: otkrivajući, frontalni I raseljavanje.
Najčešće se koristi demonstrativna varijanta u kojoj se dio smjese koja se odvaja uvodi u kolonu u toku eluenta. Izlaz komponenti mješavine iz kolone je zabilježen na hromatogramu kao pikovi. (pirinač.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Rice. Šema razvojne varijante hromatografije

Visina ili vršna oblast karakteriše koncentracija komponenti, A drzati tomovi – kvalitetan sastav smjese. Identifikacija komponenti se obično vrši podudaranjem vremena zadržavanja sa standardnim supstancama, a koriste se i hemijske ili fizičko-hemijske metode.

At frontalni varijanta (sl.), mješavina supstanci koje se odvajaju kontinuirano se propušta kroz kolonu, koja igra ulogu mobilne faze. Kao rezultat, samo supstanca koja je najmanje adsorbovana u koloni može se dobiti u čistom obliku.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Rice. Šema prednje varijante hromatografije

Kromatogram je u ovom slučaju korak, čije su visine proporcionalne koncentracijama komponenti; zapremine zadržavanja određuju se iz vremena zadržavanja komponenti. Prilikom razlikovanja takvog hromatograma dobija se slika slična onoj koja je dobijena u varijanti u razvoju.

IN pomak varijanta, komponente smeše unete u kolonu se istiskuju eluentom, koji se adsorbuje jače od bilo koje komponente. Kao rezultat dobijaju se frakcije odvojenih supstanci koje graniče jedna s drugom Redoslijed oslobađanja komponenti određen je silom njihove interakcije s površinom sorbenta (Sl.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Rice. Shema displacement hromatografije

3. Osnovne hromatografske veličine i njihovo određivanje.

Prilikom odvajanja supstanci tečnom hromatografijom, kao što je gore spomenuto, mogu se koristiti opcije razvijanja, frontalnog i pomicanja. Najčešće se koristi razvojna varijanta, u kojoj se dio smjese koja se odvaja uvodi u kolonu u toku eluenta. Izlaz komponenti mješavine iz kolone je zabilježen na hromatogramu kao pikovi. Iz hromatograma (sl.) odredite:

vremena zadržavanja nesorbirajućih (t0), odvojenih komponenti (tR1, tR2, tR3, itd.); širina baze vrha (tw1, tw2, itd.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) korigovani volumen zadržavanja komponenti ,

Gdje t "R- korigirano vrijeme zadržavanja komponente;

c) omjer kapacitivnosti kolone u odnosu na datu komponentu ;

d) efikasnost kolone okarakterisan broj ekvivalentnih teorijskih ploča

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) dozvolu https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

faktor kapaciteta k" ima značajan uticaj na vrednost R S: prilikom promjene k"od 0 do 10 (optimalne granice) R S se jako povećava. Značenje k" određena je dvostrukom površinom sorbenta i njegovom količinom u koloni, kao i konstantom ravnoteže adsorpcije (Henryjeva konstanta).

Faktor selektivnosti α je određena razlikom u konstantama adsorpcione ravnoteže dvije odvojene komponente. Kako α raste (od 1 do ~5) R S naglo raste, sa daljim povećanjem α - malo se mijenja. Selektivnost kolone zavisi od faktora kao što su hemijska struktura površine sorbenta, sastav eluenta, temperatura kolone i struktura jedinjenja koja se odvajaju. Budući da je sorpcija hromatografiranih supstanci u tečnoj hromatografiji određena parom interakcije tri glavne komponente sistema - sorbenta, supstanci koje treba odvojiti i eluenta, promena sastava eluenta je pogodan način da se optimizuje proces razdvajanja.

Efikasnost kolone zavisi od veličine čestica i strukture pora adsorbenta, od uniformnosti pakovanja kolone, viskoznosti eluenta i brzine prenosa mase. Izduženje kolone ne dovodi uvijek do poboljšanja odvajanja, budući da raste otpor kolone, povećava se tlak eluenta na ulazu i vrijeme eksperimenta, smanjuje se osjetljivost i tačnost analize zbog širenja vrha analiziranu komponentu. Ako je , tada su vrhovi dvije supstance na kromatogramu gotovo potpuno odvojeni. Sa rastom R S povećava vrijeme razdvajanja. At R S < 1 - nezadovoljavajuće razdvajanje. U preparativnoj hromatografiji, zbog unošenja relativno velikih količina odvojivih supstanci, kolona radi sa preopterećenjem. U ovom slučaju se smanjuje koeficijent kapacitivnosti, povećava se visina ekvivalentna teorijskoj anteni, što dovodi do smanjenja rezolucije.

4. Adsorbenti

Kromatografsko odvajanje smjese će biti efikasno ako su adsorbens i rastvarač (eluent) pravilno odabrani.

Adsorbens ne sme hemijski da interaguje sa komponentama koje se odvajaju, niti da ispoljava katalitičko dejstvo na rastvarač. Takođe je neophodno da adsorbens ima selektivnost u odnosu na komponente smeše. Pravilno odabran adsorbens treba da ima maksimalan kapacitet apsorpcije.

Razlikovati polarni (hidrofilni) I nepolarni (hidrofobni) adsorbenti. Treba imati na umu da je adsorpcijski afinitet polarnih tvari za polarne sorbente mnogo veći nego kod nepolarnih.

Kao adsorbenti koriste se aluminijum oksid, aktivni ugljen, silika gel, zeoliti, celuloza i neki minerali.

Aluminijum oksidAl2O3 – amfoterni adsorbent.(sl.) Na njemu smjese se mogu razdvojiti supstance u polarnim, i u nepolarnim rastvaračima. Neutralna glinica se obično koristi za hromatografiju iz nevodenih rastvora zasićenih ugljovodonika, aldehida, alkohola, fenola, ketona i etera.

Rice. Aluminijum oksid za hromatografiju

http://images. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktivnost Al2O3 zavisi od sadržaja vlage u njemu. Bezvodna glinica ima najveću aktivnost. Uslovno se uzima kao jedinica. Po potrebi možete pripremiti glinicu različitog sadržaja vlage miješanjem svježe pripremljene glinice s vodom (Brockmannova skala).

Ovisnost aktivnosti aluminijevog oksida o sadržaju vlage

Na primjer, Al2O3 sa aktivnošću od 1,5-2 koristi se za odvajanje ugljovodonika; za odvajanje alkohola i ketona - 2-3,5.

Specifična površina aluminijum oksida je 230-380 m2/g.

silika gel(hidroksiliran ili hemijski modifikovan) je sušeni želatinozni silicijum dioksid, koji se dobija iz prezasićenih rastvora silicijumske kiseline ( n SiO2 m H2O) pri pH > 5-6. (Sl.) Čvrsti hidrofilni sorbent.

Rice. silika gel

http://www. silikagel. /

http://silika gel. ru/images/askg. gif

Veličina čestica silika gela u analitičkim kolonama je 3-10 µm, u preparativnim kolonama 20-70 µm. Mala veličina čestica povećava brzinu prijenosa mase i poboljšava efikasnost kolone. Moderne analitičke kolone su dugačke 10-25 cm. Ispunjeni su silika gelom veličine čestica od 5 mikrona i omogućavaju odvajanje složenih mješavina od 20-30 komponenti. Kada se veličina čestica smanji na 3-5 µm, efikasnost kolone se povećava, ali se povećava i njen otpor. Dakle, da bi se postigao protok eluenta od 0,5-2,0 ml/min, potreban je pritisak od (1-3)·107Pa. Silika gel podnosi takav pad pritiska, dok su granule polimernog sorbenta elastičnije i deformiraju se. Nedavno su razvijeni mehanički jaki polimerni sorbenti makroporozne strukture sa gustom mrežom, koji su po svojoj efikasnosti bliski silika gelovima. Oblik čestica sorbenta od 10 µm i više nema mnogo uticaja na efikasnost kolone, međutim, preferiraju se sorbenti sfernog oblika koji daju propusnije pakovanje.(Sl.)

Rice. Sferični silika gel

http://images. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Unutrašnja struktura čestice silika gela je sistem komunikacionih kanala. Za tečnu hromatografiju koriste se sorbenti s promjerom pora od 6-25 nm. Razdvajanje tečnom hromatografijom vrši se uglavnom na silika gelovima modifikovanim reakcijom alkil- i arilhlorosilana ili alkiletoksisilana sa silanolnim površinskim grupama. Uz pomoć ovakvih reakcija kalemljuju se C8H17-, C18H37- ili C6H5- grupe (za dobijanje sorbenata sa hidrofobiziranom površinom), nitrilne, hidroksilne grupe itd. (Sl.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Rice. Struktura modificiranog silika gela

silika gelovi koristi se u hromatografiji za odvajanje mješavina naftnih derivata, viši masne kiseline, njihovi estri, aromatični amini, nitro derivati organska jedinjenja. silika gel – hidrofilni sorbent, lako se navlaži vodom. Stoga se ne može koristiti za sorpciju iz vodenih otopina. Aktivnost silika gela zavisi od sadržaja vode u njemu: što manje vode sadrži, to je veća aktivnost (Brockmannova skala).

Ovisnost aktivnosti silika gela o sadržaju vlage

Specifična površina silika gela je 500-600 m2/g.

aktivni ugalj su oblik ugljika koji postaje izuzetno porozan tokom obrade i ima veoma veliku površinu na raspolaganju za adsorpciju ili hemijske reakcije.(Sl.) Imaju specifičnu površinu od 1300-1700 m2/g.

Rice. Aktivni ugljen

http://e-katalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Glavni utjecaj na strukturu pora aktivnih ugljika imaju polazni materijali za njihovu proizvodnju. Aktivni ugalj na bazi kokosovih ljuski karakteriše veći udio mikropora (do 2 nm), na bazi uglja – veći udio mezopora (2-50 nm). Veliki udio makropora je tipičan za aktivni ugljen na bazi drveta (više od 50 nm). Mikropore su posebno pogodne za adsorpciju malih molekula, a mezopore za adsorpciju većih organskih molekula.

Zeoliti (molekularna sita)– porozni kristalni aluminosilikati zemnoalkalnih i zemnoalkalnih metala prirodnog i sintetičkog porijekla. (pirinač.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Rice. Zeoliti

http://www. zeolita. spb. en/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. en/thumb. php? file=/uploads/products/6.jpg&x_width=250

Postoje četiri tipa zeolita (A, X, Y, M) sa različitim kristalnim strukturama. U zavisnosti od kationa, zeoliti se označavaju na sledeći način: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Karakteristike zeolita je li to pore kristala imaju dimenzije reda 0,4-1 nm, srazmjerne veličini molekula mnoge tečne ili gasovite supstance. Ako molekuli tvari mogu prodrijeti u ove pore, tada dolazi do adsorpcije u porama kristala zeolita. Veći molekuli supstance se ne adsorbuju. Odabirom zeolita s različitim veličinama pora, mješavine različitih tvari mogu se jasno razdvojiti.

Specifična površina zeolita je 750-800 m2/g.

Prilikom odabira adsorbensa potrebno je uzeti u obzir strukturu tvari i njihovu topljivost. Na primjer, zasićeni ugljikovodici se slabo adsorbiraju, dok su nezasićeni ugljovodonici (imaju dvostruke veze) bolji. Funkcionalne grupe povećavaju sposobnost supstance da se adsorbuje.

5. Eluenti

Prilikom odabira rastvarača (eluensa) mora se uzeti u obzir priroda adsorbenta i svojstva tvari u smjesi koja se odvaja. Eluenti treba da dobro rastvore sve komponente hromatografirane smeše, da imaju nisku viskoznost, da obezbede potrebnu razinu selektivnosti, da budu jeftini, netoksični, inertni, kompatibilni sa metodama detekcije (na primer, benzen se ne može koristiti kao eluent sa UV detektorom).

Kromatografija normalne faze obično koristi ugljovodonike (heksan, heptan, izooktan, cikloheksan) uz dodatak malih količina CHCl3 hloroforma, izo-C3H7OH izo-propanola, diizopropil etera; u reverznoj hromatografiji - mješavina vode sa acetonitrilom CH3CN, metanolom CH3OH, etanolom C2H5OH, dioksanom, tetrahidrofuranom, dimetilformamidom. Da bi se izolovale pojedinačne komponente mešavine odvojene tokom hromatografije, često se ispiru uzastopno (eluiranje). U tu svrhu koriste se otapala različitog kapaciteta desorpcije. Rastvarači su raspoređeni u opadajućem redosledu kapaciteta desorpcije u polarnim adsorbentima - Trappeova eluotropna serija. Ako komponente smjese koja se odvaja imaju bliske vrijednosti k" ( koeficijent kapaciteta kolone u odnosu na ovu komponentu), zatim hromatografirati sa jednim eluentom. Ako pojedinačne komponente smjese snažno zadržava sorbent, koristite niz eluensa sve jačine.

Eluotropni raspon rastvarača

6. Oprema za tečnu hromatografiju

U modernoj tečnoj hromatografiji koriste se instrumenti različitog stepena složenosti - od najjednostavnijih sistema do vrhunskih hromatografa.
Savremeni tečni hromatograf obuhvata: posude za eluente, pumpe visokog pritiska, dozator, hromatografsku kolonu, detektor, uređaj za snimanje, kontrolni sistem i matematičku obradu rezultata.

Na sl. predstavljen je blok dijagram tečnog hromatografa, koji sadrži minimalno potreban skup komponenti, u ovom ili onom obliku, prisutnih u bilo kom hromatografskom sistemu.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Rice. Šema tečnog hromatografa: 1 - rezervoar za mobilnu fazu, 2 - pumpa, 3 - injektor, 4 - kolona, 5 - termostat, 6 - detektori, 7 - sistem za snimanje, 8 - kompjuter.

Rezervoar za skladištenje za mobilnu fazu, mora imati dovoljan kapacitet za analizu i uređaj za otplinjavanje otapala kako bi se spriječilo stvaranje mjehurića plinova otopljenih u eluentu u koloni i detektoru.

Pumpa namjeravao za stvaranje konstantnog protoka rastvarača. Njegov dizajn je prvenstveno određen radnim pritiskom u sistemu. Za rad u rasponu od 10-500 MPa koriste se pumpe tipa klipa (šprica). Njihov nedostatak je potreba za periodičnim zaustavljanjem radi punjenja eluentom. Za jednostavne sisteme sa niskim radnim pritiscima od 1-5 MPa koriste se jeftine peristaltičke pumpe. Eluenti ulaze u pumpu kroz filter koji zadržava čestice prašine (veće od 0,2 µm). Ponekad se mala struja helijuma propušta kroz eluente kako bi se uklonio otopljeni zrak i spriječilo stvaranje mjehurića u detektoru (posebno u slučaju vodenih i polarnih eluensa). U analitičkim hromatografima, eluent se u kolonu dovodi klipnim pumpama sa povratnim sistemom, koje omogućavaju ujednačavanje pulsiranja protoka unutar 1-2% i obezbeđuju zapreminske brzine od 0,1 do 25 ml/min pri pritiscima do ~3,107 Pa. U mikrokolumnoj hromatografiji, zapreminske brzine protoka eluensa su mnogo niže - 10-1000 µl/min. U slučaju gradijentnog eluiranja, koristi se nekoliko pumpi koje kontroliše programator i unose 2-3 komponente eluenta u komoru za mešanje, ostavljajući ukupan protok konstantnim. Za uvođenje uzorka u kolonu pod visokim pritiskom, bez zaustavljanja protoka, koriste se posebni ventili za mikrodoziranje, spojeni na petlju poznate zapremine za uzorak ispitnog rastvora. Sistemi za doziranje su razvijeni sa automatskim uzorkovanjem i ubrizgavanjem uzoraka pomoću mikrodozirajućih slavina ili špriceva.

Injektor pruža ubrizgavanje uzorka mješavine odvojive komponente u kolonu sa dovoljno visokom ponovljivošću. Jednostavni sistemi za ubrizgavanje uzoraka "stop-flow" zahtijevaju zaustavljanje pumpe i stoga su manje zgodni od Reodyne-ovih petljastih pipeta.

zvučnici za HPLC se najčešće izrađuju od polirane cevi od nerđajućeg čelika dužine 10–25 cm i unutrašnjeg prečnika 3–5 mm.

Rice. Kromatografske kolone za tečnu hromatografiju

Također se koristi stakleni stubovi smešten u metalno kućište; u mikrokolonskoj hromatografiji - štampani metalni stubovi sa unutrašnjim prečnikom od 1,0-1,5 mm, pakovane staklene mikrokolone prečnika 70-150 mikrona i šuplje kapilarne kolone prečnik 10-100 mikrona; u preparativnoj hromatografiji - kolone prečnika od 2 do 10 cm ili više. Za jednolično i gusto punjenje kolona sorbentom koristi se metoda pakiranja suspenzije. Suspenzija se priprema od sorbenta i odgovarajuće organske tečnosti, koja se pod pritiskom do 5 107 Pa dovodi u kolonu. Odrediti odvojene komponente koje napuštaju kolonu koristiti detektori. postojanost temperature osigurano termostat.

Detektori za tečnu hromatografiju imaju protočnu ćeliju u kojoj postoji kontinuirano mjerenje bilo kojeg svojstva tekućeg eluenta. Mora da su veoma osetljivi. Da bi se povećala osjetljivost detektora, ponekad se koristi derivatizacija komponenti smjese nakon kolone. Da bi se to postiglo, takvi reagensi se uvode sa protokom eluenta, koji u interakciji sa odvojenim supstancama formiraju derivate sa izraženijim svojstvima, na primjer, jače apsorbiraju u UV ili vidljivom području spektra ili imaju veću fluorescentnu sposobnost . Ponekad se derivatizacija provodi prije hromatografske analize i odvajaju se derivati, a ne polazni materijali. Najpopularnije vrste detektori opšte namene su refraktometri, mjerenje indeks prelamanja, And spektrofotometrijski detektori definisanje optička gustina rastvarača na fiksnoj talasnoj dužini (obično u ultraljubičastom području). TO prednosti refraktometara(I nedostaci spektrofotometara) treba pripisati niska osjetljivost na vrstu veze, koji mogu, ali i ne moraju sadržavati hromoforne grupe. S druge strane, upotreba refraktometara je ograničena na izokratske sisteme (sa konstantnim sastavom eluenta), pa upotreba gradijenta rastvarača u ovom slučaju nije moguća.

Diferencijalno" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">diferencijalno pojacalo i diktafon. Poželjno je imati i integrator, što omogućava izračunavanje relativnih površina dobijenih pikova. U složenim hromatografskim sistemima, blok interfejsa, povezujući hromatograf sa PC, koji vrši ne samo prikupljanje i obradu informacija, već i kontrolira uređaj, izračunava kvantitativne karakteristike i, u nekim slučajevima, kvalitativni sastav mješavina. Mikroprocesor pruža automatsko ubrizgavanje uzorka, promijeniti po dati program sastava eluenta sa gradijentom eluiranja, održavanje temperatura kolone.

Bruker". Rice. tečni hromatograf Jasco

Pitanja za samoispitivanje

Šta je tečna hromatografija? Navedite njegove vrste, područja primjene. List about Osnovne hromatografske veličine i njihova definicija Koje vrste tečne hromatografije postoje u zavisnosti od mehanizma zadržavanja izdvojenih supstanci stacionarnom fazom LC? Koje vrste hromatografije postoje u zavisnosti od načina kretanja supstance? Koje supstance se koriste kao adsorbenti? Koja je razlika? Šta je tečna mobilna faza - eluent? zahtevi za rastvarače. Koja je razlika između particione hromatografije i adsorpcione hromatografije? Navedite glavne dijelove kola tečnog hromatografa, njihovu svrhu.

Spisak korišćene literature

1 "Tečna hromatografija u medicini"

http://journal. issep. rssi. en/articles/pdf/0011_035.pdf

2 "Uvod u tečnu hromatografiju visokih performansi"

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 "Tečna hromatografija"

http://e-science. en/index/?id=1540

4 "Hromatografija"

http://belchem. ljudi. en/chromatography1.html

HPLC normalne faze

HPLC reverzne faze

Matrice za HPLC

Graftovi stacionarne faze

HPLC detektori

Linkovi

Pogledajte šta je "tečna hromatografija visokih performansi" u drugim rječnicima:

Knjige

HPLC normalne faze

HPLC reverzne faze

Matrice za HPLC

Graftovi stacionarne faze

HPLC detektori

Linkovi

Pogledajte šta je "" u drugim rječnicima:

Knjige

Pristupanje Krima Rusiji

Pesma "Blago ogorčenom pesniku" Polonski Jakov Petrovič Polonski Blagosloven je ogorčeni pesnik

Vasilij Filipovič Margelov