Майже всі біохімічні реакції є ферментативними. Ферменти(біокаталізатори) – це речовини білкової природи, активовані катіонами металів. Відомо близько 2000 різних ферментів, а приблизно 150 з них виділено, причому деякі використовуються як лікарські препарати. Трипсин та хімотрипсин застосовуються для лікування бронхітів та пневмонії; пепсин – для лікування гастриту; плазмін – для лікування інфаркту; панкреатин – для лікування підшлункової залози. Ферменти відрізняються від звичайних каталізаторів: а) більш високою каталітичною активністю; (б) високою специфічністю, тобто. вибірковістю дії.
Механізм односубстратної ферментативної реакції можна представити схемою:
де Е - фермент,
S - субстрат,
ЕS - фермент-субстратний комплекс,
Р – продукт реакції.
Характеристика першої стадії ферментативної реакції є константа Міхаеліса (К М). К М є величиною, оберненою до константи рівноваги:
Константа Міхаеліса (К М) характеризує стійкість фермент-субстратного комплексу (ES). Чим менше константа Міхаеліса (К М), тим стійкіший комплекс.
Швидкість ферментативної реакції дорівнює швидкості її лімітуючої стадії:
де k 2 - Константа швидкості, звана числом оборотівабо молекулярну активність ферменту.
молекулярна активність ферменту(k 2) дорівнює числу молекул субстрату, що зазнають перетворення під впливом однієї молекули ферменту за 1 хвилину при 25 0 С. Ця константа набуває значення в діапазоні: 1·10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .
Для уреази, що прискорює гідроліз сечовини, k 2 = 1,85 10 6 хв 1 ; для аденозинтрифосфатази, що прискорює гідроліз АТФ, k 2 = 6,24∙10 6 хв 1 ; для каталази, що прискорює розкладання Н 2 О 2 , k 2 = 5 10 6 хв 1 .
Однак кінетичне рівняння ферментативної реакції в тій формі, в якій воно наведено вище, практично неможливо використовувати через неможливість експериментального визначення концентрації фермент-субстратного комплексу (). Виразивши через інші величини, що легко визначаються експериментальним шляхом, отримуємо кінетичне рівняння ферментативних реакцій,зване рівнянням Міхаеліса-Ментен (1913):
,
де добуток k 2 [E] заг є постійною величиною, яку позначають (максимальна швидкість).
Відповідно: 
Розглянемо окремі випадки рівняння Міхаеліса-Ментен.
1) При низькій концентрації субстрату K M >> [S], тому
що відповідає кінетичному рівнянню реакції першого порядку.
2) При високій концентрації субстрату К м<< [S], поэтому
що відповідає кінетичному рівнянню реакції нульового порядку.
Таким чином, при низькій концентрації субстрату швидкість ферментативної реакції зростає зі збільшенням вмісту субстрату в системі, а за його високої концентрації – кінетична крива виходить на плато (швидкість реакції не залежить від концентрації субстрату) (рис. 30).
Рисунок 30. - Кінетична крива ферментативної реакції
Якщо [S] = К М, то
що дозволяє графічно визначати константу Міхаеліса К м (рис. 31).
Малюнок 31. - Графічне визначення константи Міхаеліса
На активність ферментів впливають: (а) температура, (б) кислотність середовища, (в) наявність інгібіторів. Вплив температури на швидкість ферментативної реакції розглянуто у розділі 9.3.
Вплив кислотності середовища на швидкість ферментативної реакції представлено малюнку 32. Максимальна активність ферменту відповідає оптимальному значенню водневого показника (рН опт).
Рисунок 32. - Вплив кислотності розчинів на активність ферментів
Більшість ферментів оптимальні значення рН збігаються з фізіологічними значеннями (7,3 - 7,4). Однак існують ферменти, для нормального функціонування яких потрібна сильнокисла (пепсин – 1,5 – 2,5) або досить лужне середовище (аргіназа – 9,5 – 9,9).
Інгібітори ферментів- Це речовини, що займають частину активних центрів молекул ферменту, внаслідок чого швидкість ферментативної реакції зменшується. У ролі інгібіторів виступають катіони важких металів, органічні кислоти та інші сполуки.
Лекція 11
Будова атома
Існують два визначення поняття «атом». атом- це дрібна частка хімічного елемента, що зберігає його хімічні властивості.
атом- це електронейтральна мікросистема, що складається з позитивно зарядженого ядра та негативно зарядженої електронної оболонки.
Вчення про атом пройшло тривалий шлях розвитку. До основних етапів розвитку атомістики відносять:
1) натурфілософський етап - період формування концепції про атомну будову матерії, не підтверджену експериментом (V століття до н.е. - 16 століття н.е.);
2) етап формування гіпотези про атом як найдрібнішу частинку хімічного елемента (XVIII-XIX ст.);
3) етап створення фізичних моделей, що відображають складність будови атома та дозволяють описати його властивості (початок XX ст.)
4) сучасний етап атомістики називається квантово-механічним. Квантова механіка- Це розділ фізики, що вивчає рух елементарних частинок.
ПЛАН
11.1. Будова ядра. Ізотопи.
11.2. Квантова-механічна модель електронної оболонки атома.
11.3. Фізико-хімічні властивості атомів.
Будова ядра. Ізотопи
Ядро атома- це позитивно заряджена частка, що складається з протонів, нейтронів та деяких інших елементарних частинок.
Вважають, що основними елементарними частинками ядра є протони і нейтрони. Протон (p) -це елементарна частка, відносна атомна маса якої дорівнює 1 а.е.м, а відносний заряд становить + 1. Нейтрон (n) –це елементарна частка, яка не має електричного заряду, маса якої дорівнює масі протона.
У ядрі зосереджено 99,95% маси атома. Між елементарними частинками діють спеціальні ядерні сили протягу, що значно перевищують сили електростатичного відштовхування.
Фундаментальною характеристикою атома є зарядйого ядра, що дорівнює числу протонів і збігається з порядковим номером елемента в періодичній системі хімічних елементів. Сукупність (вигляд) атомів з однаковим зарядом ядра називається хімічним елементом. У природі знайдено елементи із номерами від 1 до 92.
Ізотопи- це атоми одного хімічного елемента, що містять однакову кількість протонів та різну кількість нейтронів в ядрі.
де масове число (А) – це маса ядра, z – заряд ядра.
Кожен хімічний елемент є сумішшю ізотопів. Як правило, назва ізотопів збігається із назвою хімічного елемента. Однак для ізотопів водню введено особливі назви. Хімічний елемент водень представлений трьома ізотопами:
Число р Число n
Протий Н 1 0
Дейтерій Д 1 1
Тритій Т 1 2
Ізотопи хімічного елемента можуть бути стабільними, так і радіоактивними. Радіоактивні ізотопи містять ядра, які мимоволі руйнуються з виділенням частинок і енергії. Стабільність ядра визначається його нейтронно-протонним ставленням.
Потрапляючи в організм, радіонукліди порушують перебіг найважливіших біохімічних процесів, знижують імунітет, прирікають організм на хвороби. Організм захищає себе від впливу радіації, вибірково поглинаючи елементи із довкілля. Стабільні ізотопи мають пріоритет перед радіоактивними ізотопами. Іншими словами, стабільні ізотопи блокують накопичення радіоактивних ізотопів у живих організмах (табл. 8).
У книзі С.Шеннон «Живлення в атомному столітті» наводяться такі дані. Якщо блокуючу дозу стабільного ізотопу йоду, що дорівнює ~100 мг, прийняти не пізніше ніж через 2 години після потрапляння I-131в організм, то поглинання радіойоду в щитовидній залозі знизиться на 90%.
Радіоізотопи застосовуються в медицині
· Для діагностики деяких захворювань,
· для лікування всіх форм онкологічних захворювань,
· Для патофізіологічних досліджень.
Таблиця 8 – Блокуюча дія стабільних ізотопів
Ферментативна кінетика вивчає швидкість реакцій, що каталізуються ферментами залежно від різних умов (концентрації, температури, рН та ін.) їх взаємодії з субстратом.
Однак ферменти – це білки, чутливі до впливу різних зовнішніх впливів. Тому щодо швидкості ферментативних реакцій враховують, головним чином, концентрації реагуючих речовин, а вплив температури, pH середовища, активаторів, інгібіторів та інших чинників намагаються звести до мінімуму і створюють стандартні умови. По-перше, це оптимальне для цього ферменту значення pH середовища. По-друге, рекомендується дотримуватись температури 25°С, у тих випадках, де це можливо. По-третє, досягають повного насичення ферменту субстратом. Цей момент особливо важливий, оскільки при низькій концентрації субстрату не всі молекули ферменту беруть участь у реакції (рис. 6.5, а), отже, і результат буде далекий від максимально можливого. Найбільша потужність каталізованої реакції, за інших рівних умов, досягається, якщо кожна молекула ферменту бере участь у перетворенні, тобто. при високій концентрації фермент-субстратного комплексу (рис. 6.5, в).Якщо концентрація субстрату не забезпечує повного насичення ферменту (рис. 6.5, б), то швидкість реакції не досягає максимального значення.
Мал. 65.
а -при низькій концентрації субстрату; 6 - при недостатній концентрації субстрату; в -при повному насиченні ферменту субстратом
Швидкість ферментативної реакції, виміряної при дотриманні перерахованих умов, та повне насичення ферменту субстратом називають максимальною швидкістю ферментативної реакції (V).
Швидкість ферментативної реакції, яка визначається при неповному насиченні ферменту субстратом, позначається v.
Ферментативний каталіз спрощено можна описати схемою
де F – фермент; S – субстрат; FS – фермент-субстратний комплекс.
Кожна стадія цього процесу характеризується певною швидкістю. Одиницею вимірювання швидкості ферментативної реакції служить кількість молей субстрату, що перетворюється на одиницю часу(як і швидкість нормальної реакції).
Взаємодія ферменту із субстратом призводить до утворення фермент-субстратного комплексу, але цей процес оборотний. Швидкості прямої та зворотної реакцій залежать від концентрацій реагуючих речовин та описуються відповідними рівняннями:
У стані рівноваги справедливе рівняння (6.3), оскільки швидкості прямої та зворотної реакції рівні.
Підставивши значення швидкості прямої (6.1) та зворотної (6.2) реакції в рівняння (6.3), отримаємо рівність:
Стан рівноваги характеризується відповідною константою рівноваги До р,рівною відношенню констант прямої та зворотної реакцій (6.5). Величина, зворотна константі рівноваги, називається субстратною константою K s ,або константою дисоціації фермент-субстратного комплексу:
З рівняння (6.6) ясно, що субстратна константа зменшується за високої концентрації фермент-субстратного комплексу, тобто. при великій його стійкості. Отже, субстратна константа характеризує спорідненість ферменту та субстрату та співвідношення констант швидкостей освіти та дисоціації фермент-субстратного комплексу.
Явище насичення ферменту субстратом вивчали Леонор Міхаеліс та Мод Мептен. На основі математичної обробки результатів ними було виведено рівняння (6.7), яке отримало їх імена, з якого ясно, що при високій концентрації субстрату та низькому значенні субстратної константи швидкість ферментативної реакції прагне максимальної. Однак це рівняння має обмежений характер, оскільки враховує не всі параметри:
Фермент-субстратний комплекс у процесі реакції може піддаватися перетворенням у різних напрямках:
- дисоціювати на вихідні речовини;
- перетворюватися на продукт, від якого відділяється фермент у незмінному вигляді.
Тому для опису сумарної дії ферментативного процесу введено поняття константи Міхаеліса К т,яка висловлює взаємозв'язок констант швидкостей всіх трьох реакцій ферментативного каталізу (6.8). Якщо обидва доданки розділити на константу швидкості реакції утворення фермент-субстратного комплексу, то вийде вираз (6.9):
З рівняння (6.9) випливає важливий наслідок: константа Міхаеліса завжди більше субстратної константи на величину k 2 /k v
Чисельно До тдорівнює такій концентрації субстрату, при якій швидкість реакції становить половину максимально можливої швидкості і відповідає такому насиченню ферменту субстратом, як на рис. 6.5, б.Оскільки на практиці не завжди вдається досягти повного насичення ферменту субстратом, то саме До твикористовується для порівняльної характеристики кінетичних характеристик ферментів.
Швидкість ферментативної реакції при неповному насиченні ферменту субстратом (6.10) залежить від концентрації фермент-субстратного комплексу. Коефіцієнтом пропорційності служить константа реакції звільнення ферменту та продукту, оскільки при цьому змінюється концентрація фермент-субстратного комплексу:
Після перетворень, з урахуванням поданих вище залежностей, швидкість ферментативної реакції при неповному насиченні ферменту субстратом описується рівнянням (6.11), тобто. залежить від концентрацій ферменту, субстрату та їх спорідненості K s:
Графічна залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату не є лінійною. Як очевидно з рис. 6.6 зі збільшенням концентрації субстрату спостерігається зростання активності ферменту. Однак при досягненні максимального насичення ферменту субстратом швидкість ферментативної реакції стає максимальною. Отже, фактором, що обмежує швидкість реакції, є утворення фермент-субстратного комплексу.
Практика показала, що концентрації субстратів, як правило, виражаються значеннями набагато менше одиниці (10 6 -10 3 моль). Оперувати такими величинами у розрахунках досить складно. Тому Г. Лайнуівер і Д. Берк запропонували висловлювати графічну залежність швидкості ферментативної реакції над прямих координатах, а зворотних. Вони виходили з припущення, що для рівних величин рівні і обернені їм значення:
Мал. 6.6.
Після перетворення виразу (6.13) виходить вираз, званий рівнянням Лайнуівера - Берка (6.14):
Графічна залежність рівняння Лайнуівера-Берка носить лінійний характер (рис. 6.7). Кінетичні характеристики ферменту визначаються так:
- відрізок, що відсікається на осі ординат, дорівнює 1/V;
- відрізок, що відсікається на осі абсцис, дорівнює -1 /До т.п.
Мал. 6.7.
Вважається, що метод Лайнуівера – Берка дозволяє точніше, ніж у прямих координатах, визначити максимальну швидкість реакції. З цього графіка можна також отримати цінну інформацію щодо інгібування ферменту.
Існують і інші способи перетворення рівняння Міхаеліса-Ментен. Графічні залежності використовують щодо впливу різних зовнішніх впливів на ферментативний процес.
Цей розділ ензимології вивчає вплив різних чинників на швидкість ферментативної реакції. Враховуючи загальне рівняння ферментативного каталізу оборотної реакції перетворення одного субстрату на один продукт (1),
слід назвати головні чинники впливу швидкість ферментативної реакції: концентрація субстрату [S], концентрація ферменту [E] і концентрація продукту реакції [P].
Взаємодія деяких ферментів зі своїм субстратом можна описати гіперболічної кривої залежності швидкості ферментативної реакції V від концентрації субстрату [S] (рис.19):
Рис.19.Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату.
На цій кривій можна виділити три ділянки, які можна пояснити за положеннями механізму взаємодії ферменту з субстратом: ОА – ділянка прямо пропорційної залежності V від [S] відбувається поступове заповнення активних центрів ферменту молекулами субстрату з утворенням нестійкого комплексу ES; ділянка АВ – криволінійна залежність V від [S], повне насичення активних центрів ферменту молекулами субстрату ще не досягнуто. Комплекс ES до досягнення перехідного стану нестабільний, ймовірність зворотної дисоціації до E і S ще велика; ділянка ВС - залежність описується рівнянням нульового порядку, ділянка паралельна осі [S], досягнуто повне насичення активних ферментів молекулами субстрату, V = V max .
Характерна форма кривої описується математично рівнянням Бріггса-Холдейна:
V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),
де Кm - константа Міхаеліса-Ментен, чисельно дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість ферментативної реакції дорівнює половині V max .
Чим менше K m ферменту, тим вище спорідненість ферменту до субстрату, тим швидше досягається перехідний стан субстрату, і він перетворюється на продукт реакції. Пошук значень Km для кожного субстрату ферменту з груповою специфічністю важливий при визначенні біологічної ролі цього ферменту в клітині.
Більшість ферментів неможливо побудувати гиперболическую криву (рис.19), у разі використовується метод подвійних зворотних величин (Лайнуивера-Берка), тобто. будується графічна залежність 1/[V] від 1/[S] (рис.20). Метод побудови таких кривих в експерименті дуже зручний щодо впливу різних типів інгібіторів на активність ферментів (див. по тексту далі).
Рис.20. Графік залежності 1/[V] від 1/[S] (метод Лайнуівера-Берка),
де y-відсікається ділянка - , а x - ділянка, що відсікається - 
тангенс кута α - .
Залежність швидкості ферментативної реакції V концентрації ферменту [E].
Дана графічна залежність (рис.21) розглядається при оптимальних температурі та рН навколишнього середовища, при концентраціях субстрату, що значно перевищують концентрацію насичення активних центрів ферменту.
Мал. 21. Вплив концентрації ферменту на швидкість ферментативної реакції.
Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації кофактора чи коферменту.Для складних ферментів слід враховувати, що дефіцит коферментних форм вітамінів при гіповітамінозах, порушення надходження в організм іонів металів обов'язково призводять до зменшення концентрації відповідних ферментів, необхідних для перебігу процесів обміну речовин. Тому слід зробити висновок про пряму залежність активності ферменту від концентрації кофактора чи коферменту.
Вплив концентрації продуктів на швидкість ферментативної реакції.Для оборотних реакцій, які відбуваються в організмі людини, необхідно враховувати, що продукти прямої реакції можуть бути використані ферментом як субстрати зворотної реакції. Тому напрямок перебігу та момент досягнення V max є залежними від співвідношення концентрацій вихідних субстратів та продуктів реакції. Так, наприклад, активність аланінамінотрасферази, що каталізує перетворення:
Аланін + Альфа-кетоглутарат ↔ Піруват + Глутамат
залежить у клітині від співвідношення концентрацій:
[Аланін + альфа-кетоглутарат] / [Піруват + глутамат].
МЕХАНІЗМ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ. ТЕОРІЇ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛІЗУ
Ферменти, як і небілкові каталізатори, збільшують швидкість хімічної реакції через здатність знижувати енергію активації цієї реакції. Енергія активації ферментативної реакції розраховується як різницю між значенням енергії в системі протікаючої реакції досягла перехідного стану та енергією, що визначається на початку реакції (див. графічну залежність рис. 22).
Мал. 22. Графічна залежність енергетичного стану хімічної реакції без ферменту (1) та у присутності ферменту (2) від часу перебігу реакції.
Роботи В. Генрі і, особливо, Л. Міхаеліса, М. Ментен з вивчення механізму моносубстратних оборотних ферментативних реакцій дозволили постулювати, що фермент Е спочатку оборотно і відносно швидко з'єднується зі своїм субстратом S з утворенням фермент-субстратного комплексу (ЕS):
E+S<=>ES (1)
Освіта ЕS відбувається за рахунок водневих зв'язків, електростатичних, гідрофобних взаємодій, у деяких випадках ковалентних, координаційних зв'язків між бічними радикалами амінокислотних залишків активного центру та функціональними групами субстрату. У складних ферментів функцію контакту із субстратом може виконати і небілкова частина структури.
Фермент-субстратний комплекс потім розпадається в другій повільнішій оборотній реакції з утворенням продукту реакції Р і вільного ферменту Е:
ES<=>ЕР<=>E + P (2)
В даний час завдяки роботам вище названих учених, а також Кейліна Д., Чанса Б., Кошленда Д. (теорія «індукованої відповідності»), існують теоретичні положення про чотири основні моменти в механізмі дії ферменту на субстрат, що визначають здатність ферментів прискорювати хімічні реакції:
1. Орієнтація та зближення . Фермент здатний зв'язувати молекулу субстрату таким чином, що атакований ферментом зв'язок виявляється не тільки розташованим у безпосередній близькості від каталітичної групи, але і правильно орієнтованою по відношенню до неї. Імовірність того, що комплекс ES досягне перехідного стану за рахунок орієнтації та зближення, сильно збільшується.
2. Напруга та деформація : індуковане відповідність. Приєднання субстрату може викликати конформаційні зміни в молекулі ферменту, які призводять до напруги структури активного центру, а також деформують деформують пов'язаний субстрат, полегшуючи тим самим досягнення комплексом ES перехідного стану. Виникає так звана індукована відповідність між молекулами E та S.
КІНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ
Vфр визначається кількістю речовини, яка перетворюється на одиницю часу. V цих реакцій залежить від впливу зовнішніх факторів (температура, рН, вплив природних та чужорідних сполук тощо).
Vфр є мірою каталітичної активності та позначається просто як активність ферментів.
Виміряти активність ферментів можна лише побічно:
1) за кількістю перетворюваного S;
2) наростання концентрації Р в одиницю часу.
Для вираження концентрації ферменту користуються:
а) одиниця виміру ферментів – це кількість ферменту, яке каталізує перетворення 1 мкмоля S на хв. [мкмоль/хв];
б) 1 катал (кат) - кількість ферментів, здатне викликати перетворення 1 молячи S в Р в 1 сек. [моль/с].
1 кат = 6×107Е; 1Е = 16,67 (н кат)
Для вираження активності ферментів користуються:
а) питома активність ферментів – це кількість ферментів на 1 мг чи число кат. на 1 кг білка;
б) молекулярна активність або число обертів - це число молекул S, що піддаються перетворенню однією молекулою Е в 1 хв.
Одна молекула каталази еритроцитів розщеплює 1 хв 5×10 6 молекул Н2О2.
Специфіка дії ферментів
Поняття Е S комплексу та АЦФ тісно взаємопов'язані з особливою властивістю ферментів – їхньою специфічністю. За ступенем специфічності (у порядку її зниження) розрізняють:
I. Стереохімічну субстратну специфічність – у разі ферменти каталізують лише 1 форму S (1 ізомер). Наприклад, фумаратгідратаза каталізує тільки перетворення фумарової кислоти, але не каталізує перетворення її ізомеру - малеїнову кислоту.
ІІ. Абсолютну субстратну специфічність – Е перетворює лише 1S. Наприклад, уреаза перетворює лише сечовину.
ІІІ. Абсолютна групова S-на специфічність. Ферменти діють групу подібних S-в. Наприклад, алкоголь ДГ перетворює не лише етанол, а й інші аліфатичні спирти.
IV. Відносну групову S-ну специфічність. Фермент впливає не так на групу молекул S, але в певні зв'язку певних груп S-в. Наприклад, пепсин і трипсин специфічні по відношенню до пептидних зв'язків у різних білках.
V. Відносну S-ну специфічність. Фермент каталізує, перетворюючись на S-в, що належать до різних груп хімічних сполук. Наприклад, фермент цитохром-450 каталізує реакції гідроксилювання до 7000 різних S-в. Це найменш специфічна ферментна система.
Існує дві теорії пояснення специфічності ферментів.
Гіпотеза Е. Фішера - гіпотеза "ключа і замку" або гіпотеза "шаблону". За Фішером, фермент - це жорстка структура, АЦФ якого - точний «зліпок» S-та. Якщо S підходить до Е як ключ до замка, реакція відбудеться. Якщо ж S трохи змінено («ключ»), він не відповідає АЦФ («замку»), і реакція стає неможливою. Незважаючи на логічність такого пояснення, гіпотеза Фішера не пояснює, на чому засновані абсолютна і відносна групова специфічність. Наприклад, цитохром-450 з'єднується з такою великою кількістю S-в, різних за будовою.
Ці зовнішні протиріччя пояснює гіпотеза Кошленду, або гіпотеза вимушеної відповідності. На думку Кошленда, молекула ферменту не «жорстка», а гнучка структура та конфігурація ферменту та його АЦФ починають змінюватися в момент приєднання ферменту до S або інших лігандів. При освіті Е-S комплексу крім геометричної комплементарності має місце і електростатична, яка здійснюється завдяки спаренню протилежно заряджених молекул Е і S. Насправді, мабуть, мають місце обидва варіанти приєднання.
Гіпотеза Кошленд дозволяє пояснити, чому відбувається перетворення близьких аналогів S-в. Якщо «хибний» субстрат (квазі-S) відрізняється від природного та АЦФ приймає конформацію близьку до справжнього субстрату, то розстановка каталітичних груп у такому Е-S комплексі дозволить здійснити реакцію. Цей «обман» фермент хіба що помічає, хоча реакція йде й негаразд швидко, як із справжнім субстратом. Якщо конфігурація квазі субстрату не дозволяє правильно розташуватись каталітичній групі, то в цьому випадку реакція не піде. Тобто. якщо діапазон конформаційних перебудов обмежений однієї єдино можливої, то фермент високоспецифічний, і якщо можливості перебудови АЦФ великі, то фермент спрацьовує і квазі субстрати.
Залежність Vфр від рН-середовища
До кожного ферменту є свій оптимум рН, у якому Vфр максимальна. Відхилення рН у той чи інший бік веде до зниження активності ферменту. Більшість ферментів має рН~7,0 тобто він збігається з фізіологічними значеннями рН.
При оптимальному значенні рН функціональні групи АЦФ і сам S знаходяться у найкращій для зв'язку формі. Деякі ферменти мають оптимальну рН, різко від фізіологічних значень, пепсин на 100% активний при рН = 1,5-2,5; аргіназ - при рН = 10.
Залежність Vфр від температури
З підвищенням температури середовища Vфр збільшується, досягає оптимальних величин ~ 20-40 С для більшості ферментів.
Термолабильність ферментів пов'язана з їхньою білковою будовою: при підвищенні температури до 40-50ºС і вище відбувається їх денатурація.
Для деяких ферментів денатурації настає за 0ºС.
Для будь-яких хімічних реакцій у разі підвищення температури кожні 10ºС V реакції збільшується у 2-3 разу, для ферментативних реакцій цей коефіцієнт нижче – 2 і навіть менше. Виняток: термостабільний фермент аденіматциклаза витримує температуру 100 С, а фермент каталаза активний при 0 С.
Залежність Vфр від конц. S.
Механізм дії ферментів описується рівнянням Міхаеліса-Ментен. Встановити залежність Vфр від [S] можна графічно.
а) по кривій Міхаеліса: чим менше Km, тим більше Vm і тим вище спорідненість E до S.
Vmax відповідає стану повного насичення ферменту S-том.
у розчині надлишок Е (3 мол S, 5 мол Е) це ділянка насичення ферменту S-том.
б) методом зворотних величин Лайнцивера-Берка, де залежність Vфр від [S] розраховують у зворотних величинах.
Регулювання активності ферментів.
Ферменти є каталізаторами з регульованою активністю, тому ферменти можна контролювати Vфр. Регуляція активності може здійснюватися шляхом взаємодії ферментів з різними біологічними компонентами або чужорідними сполуками (ліками, отрутами), які називаються модифікаторами. Якщо у присутності модифікатора Vфр зростає, такі модифікатори називають активаторами, і якщо падає інгібіторами.
Активування ферментів.
Існує кілька видів активації ферментів.
1. Активування шляхом на субодиниці молекул ферменту. Деякі ферменти мають НС у вигляді 2-х субодиниць: каталітичної та регуляторної. За збереження НС АЦФ прихований.
Наприклад, багато ферментів в організмі виробляються у вигляді проферментів або зимогенів, тобто в неактивному стані. При необхідності певна кількість активується. Наприклад, неактивний трипсиноген під дією ферменту ентерокінази перетворюється на активний трипсин.
2. На активування ферментів впливають іони:
а) катіони – їх вплив специфічніше, ніж аніонів. Катіони можуть самі виступати у вигляді простетичних груп ферментів (Fe в цитохромі) або своєю присутністю впливати на фермент, активуючи його. Наприклад, вугільна ангідраза активується у присутності Zn+2.
б) аніони – діють менш специфічно і зазвичай виляють на 2-й етап ф. - Розпад ES-комплексу. Однак іноді аніони є безпосередніми активаторами ферментів. Наприклад, Cl-активує неактивний пепсиноген і перетворює його на активний пепсин.
3. Активація шляхом захисту ферментів від інактивуючого впливу різноманітних впливів. Забезпечується специфічними речовинами, що запобігають негативному впливу на ферменти.
Інгібування ферментів.
Речовини, що викликають часткове або повне гальмування ферментів, називаються інгібіторами (I). Інгібітори мають властивість міцно зв'язуватися з ферментом. За цією ознакою розрізняють інгібування: оборотне та необоротне.
При оборотному інгібуванні I та Е вступають у взаємодію. Якщо інгібітор якимось чином нейтралізувати (наприклад, діалізом), то активність Е відновлюється. Якщо цього не вдається досягти, то йдеться про незворотне інгібування.
Оборотне інгібування
конкурентне неконкурентне
Конкурентне інгібування може бути викликане речовинами зі структурою, подібною до структури істинного S.
I і S конкурують за АЦФ, комплекс із ферментом утворює ту сполуку, молекул якої більше. З ферментом зв'язується або I, або S, для такого пригнічення справедливе рівняння: .
НІКОЛИ при конкурентному інгібуванні не утворюється потрійний комплекс E S I, ніж цей вид інгібування відрізняється від інших.
Наприклад, сукцинат ДГ входить до складу ферм. системи ЦТК Його природний S – сукцинат. Інгібіторами можуть бути оксалоацетат, малонат (квазі-субстрати).
При надлишку інгібітор зв'язується з поляризованими групами з АЦФ сукцинат ДГ.
При конкурентному пригніченні Vmax ніколи не змінюється, але змінюється Km. Нахил кривих у присутності I збільшується, в результаті Km збільшується
За результатами експерименту з кривої Міхаеліса-Ментен можна встановити конкурентну природу I (щодо збільшення Km та стабільності Vmax). Характер цієї кривої свідчить і оборотності процесу, тобто збільшуючи [S], можна скоротити час досягнення Vmax.
Метод конкурентного інгібування знайшов широке застосування у медичній практиці.
Пара-амінобензойна кислота та сульфаніламід мають подібну структуру. п-АБК-ту бактеріальна клітина використовує для синтезу фолієвої кислоти, що є складовою частиною ферментів бактерій. С/а блокує дію ферментів, які синтезують фолієву кислоту, в результаті зростання бактерій зупиняється.
Неконкурентне інгібування - це оборотне гальмування, коли I взаємодіє не з АЦФ, а з іншими функціональними групами ферментів, тобто в даному випадку I не має структурної подібності до S. Приєднання такого інгібітора знижує активність ферменту, а не його спорідненість до S, тобто інгібітор не змінює Km, а знижує макс. Vфр.
При цьому виді інгібування утворюється неактивні малодисоціюючі комплекси E I або E I S. Наприклад, дія HCN, інших хімічних сполук, що зв'язують іони Me або інших функціональних груп у молекулі ферменту.
Змішане пригнічення (або частково неконкурентний тип) - зниження Vmax поєднується зі збільшенням Km.
При цьому утворюється Е I S-комплекс, а S у ньому піддається повільному каталітичному перетворенню.
Субстратне пригнічення - це зниження Vфр при значному підвищенні [S]. Спочатку зі збільшенням [S] Vфр росте, досягаючи свого максимуму, але при подальшому збільшенні [S] Vфр починає падати.
Механізм інгібуючої дії надлишку S різноманітний. Найчастіше це взаємодія проміжних сполук E S з ще однією іди кількома молекулами S, внаслідок чого утворюється неактивне з'єднання, то
є комплекс, який дає продуктів реакції.
Методи регулювання активності ферментів
У живому організмі одночасно відбуваються реакції синтезу, розпаду та взаємоперетворень тисяч різноманітних речовин. Всі ці множини реакцій регулюються в організмі за допомогою різних механізмів, найбільш важливими з яких є:
а) регуляція на кшталт зворотний зв'язок; характерна зазвичай реакцій синтезу. Накопичення продуктів реакції понад допустимий рівень має сильну інгібуючу дію на першу стадію процесу:
б) алостерична регуляція активності ферментів – характерна лише особливої групи ферментів з НС, мають регуляторні центри зв'язування алостерических эффекторов. Негативні ефектори гальмують перетворення S і виступають у ролі алостеричних інгібіторів. Позитивні ефектори, навпаки, прискорюють Vфр, тому їх відносять до алостеричних активаторів.
Механізм дії алостеричних інгібіторів на фермент полягає у зміні АЦФ цього ферменту. Зменшення Vфр є або наслідком збільшення Km, або результатом зменшення Vmax, при тих же насичувальних концентраціях S. Алостеричні активатори полегшують перетворення S в АЦФ, що супроводжується або зменшенням Km, або збільшенням Vmax.
Компартменталізація – явище, у якому з допомогою мембран просторово роз'єднується
а) фермент від своїх S (наприклад, лізомальні ферменти від речовин, на які діють у цитоплазмі);
б) взаємно несумісні одночасно процеси. Синтез РК відбувається у розчинній частині цитоплазми, а розпад РК – у мітохондріях.
Кінетика ферментативних реакцій Цей розділ ензимології вивчає вплив хімічних та фізичних факторів на швидкість ферментативної реакції. У 1913 р. Міхаеліс і Ментен створили теорію ферментативної кінетики, виходячи з того, що фермент (Е) вступає у взаємодію з субстратом (S) з утворенням проміжного ферменту субстратного комплексу (ЕS), який далі розпадається на фермент і продукт реакції за рівнянням:
Кожен етап взаємодії субстрату з ферментом характеризується своїми константами швидкості. Відношення суми констант швидкості розпаду ферменту субстратного комплексу до константи швидкості утворення фермент субстратного комплексу називається константою Міхаеліса (Кm). Вона визначать спорідненість ферменту до субстрату. Чим нижче константа Міхаеліса, тим вище спорідненість ферменту до субстрату, тим вище швидкість ка- талізованої їм реакції. За величиною Кm каталітичні реакції можна розділити на швидкі (Кm 106 моль/л і менше) та повільні (Кm 102 до 106).
Швидкість ферментативної реакції залежить від температури, реакції середовища, концентрації реагуючих речовин, кількості ферменту та інших факторів.
1. Розглянемо залежність швидкості реакції від кількості ферменту. За умови надлишку субстрату швидкість реакції пропорційна кількості ферменту, але при надмірній кількості ферменту приріст швидкості реакції буде знижуватися, оскільки вже не вистачатиме субстрату.
2. Швидкість хімічних реакцій пропорційна концентрації реагуючих речовин (закон діючих мас). Цей закон можна застосувати і для ферментативних реакцій, але з певними обмеженнями. При постій
них кількостях ферменту швидкість реакції дійсно пропорційна концентрації субстрату, але, тільки в області низьких концентрацій. При високих концентраціях субстрату настає насичення ферменту субстратом, тобто настає такий момент, коли вже всі молекули ферменту задіяні в каталітичному процесі і приросту швидкості реакції не буде. Швидкість реакції виходить на максимальний рівень (Vmax) і далі вже не залежить від концентрації субстрату. Залежність швидкості реакції від концентрації субстрату слід визначати в тій частині кривої, яка нижче Vmax. Технічно легше визначити не максимальну швидкість, а ½ Vmax. Цей параметр є головною характеристикою ферментативної реакції і дозволяє визначити константу Міхаеліса (Кm).
Кm (константа Міхаеліса) – це така концентрація субстрату, при якій швидкість ферментативної реакції дорівнює по ловині максимальної. Звідси виводиться рівняння Міхаеліса-Ментена швидкості ферментативної реакції.
