Սպիտակուցների և ամինաթթուների տարանջատման մեթոդներ. Սպիտակուցների տարանջատում (ֆրակցիոն) Սպիտակուցների տարանջատման մեթոդներ

Սպիտակուցների բաժանումը ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտից

Մեմբրանային մաղի մեթոդ (դիալիզ)

Օգտագործվում է դիալիզի թաղանթ, որը պոլիմեր է և ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Փոքր մոլեկուլները (ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտը) անցնում են թաղանթի ծակոտիներով, մինչդեռ մեծ մոլեկուլները (սպիտակուցները) պահպանվում են: Այսպիսով, սպիտակուցները լվանում են կեղտից:

Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային քաշով

Գելային քրոմատոգրաֆիա

Քրոմատոգրաֆիկ սյունակը լցված է գելային հատիկներով (Sephadex), որն ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Սյունակում ավելացվում է սպիտակուցների խառնուրդ։ Սպիտակուցները, որոնց չափերը ավելի փոքր են, քան Sephadex-ի ծակոտիները, պահպանվում են սյունակում, քանի որ դրանք «խրվում են» ծակոտիների մեջ, իսկ մնացածն ազատորեն դուրս է գալիս սյունակից։ Սպիտակուցի չափը կախված է նրա մոլեկուլային քաշից։

Ուլտրակենտրոնիֆուգացիա

Այս մեթոդը հիմնված է տարբեր խտության գրադիենտներով լուծույթներում (սախարոզա բուֆեր կամ ցեզիումի քլորիդ) սպիտակուցի մոլեկուլների նստեցման (տեղացումների) տարբեր արագությունների վրա։

էլեկտրոֆորեզ

Այս մեթոդը հիմնված է էլեկտրական դաշտում սպիտակուցների և պեպտիդների միգրացիայի տարբեր տեմպերի վրա՝ կախված լիցքից:

Գելերը, ցելյուլոզայի ացետատը, ագարը կարող են ծառայել որպես էլեկտրոֆորեզի կրիչներ։ Առանձնացվելիք մոլեկուլները շարժվում են գելի մեջ՝ կախված իրենց չափսերից. նրանք, որոնք մեծ են, հետ կպահվեն, երբ անցնում են գելի ծակոտիներով: Փոքր մոլեկուլները կհանդիպեն ավելի քիչ դիմադրության և, հետևաբար, ավելի արագ կշարժվեն: Արդյունքում, էլեկտրոֆորեզից հետո խոշոր մոլեկուլները ավելի մոտ կլինեն սկզբին, քան փոքրերը:

Սպիտակուցները կարելի է բաժանել մոլեկուլային քաշով, օգտագործելով էլեկտրոֆորեզ: Դրա համար օգտագործվում է էլեկտրոֆորեզ PAAG-ում նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի (DDS-Na) առկայությամբ:

SDS-Na-ն ամֆիֆիլ նյութ է և պարունակում է լիցքավորված և հիդրոֆոբ խումբ։ Սպիտակուցները միանում են SDS-Na-ին իրենց հիդրոֆոբ ռադիկալներով և գործընթացի ընթացքում դեֆորմացվում են: Այսպիսով, սպիտակուցները հավասարեցված են ձևի և լիցքի վրա: Դրանից հետո էլեկտրոֆորեզի ժամանակ սպիտակուցի շարժունակությունը կախված է միայն նրա մոլեկուլային քաշից։

աղակալումտեղումներ ալկալիների, հողալկալիական մետաղների աղերով (նատրիումի քլորիդ, մագնեզիումի սուլֆատ), ամոնիումի սուլֆատ; միևնույն ժամանակ, սպիտակուցի առաջնային կառուցվածքը չի խախտվում.

տեղումներՋրազրկող նյութերի օգտագործումը՝ սպիրտ կամ ացետոն ցածր ջերմաստիճանում (մոտ -20°C):

Այս մեթոդների կիրառման ժամանակ սպիտակուցները կորցնում են իրենց խոնավեցնող շերտը և նստում են լուծույթում:

Դենատուրացիա- սպիտակուցների տարածական կառուցվածքի խախտում (մոլեկուլի առաջնային կառուցվածքը պահպանվում է): Այն կարող է լինել շրջելի (սպիտակուցի կառուցվածքը վերականգնվում է դենատուրացնող նյութի հեռացումից հետո) կամ անշրջելի (մոլեկուլի տարածական կառուցվածքը չի վերականգնվում, օրինակ, երբ սպիտակուցները նստում են խտացված հանքային թթուներով, ծանր մետաղների աղերով):

Սպիտակուցների տարանջատման մեթոդներ Սպիտակուցների բաժանում ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտերից

Դիալիզ

Օգտագործվում է հատուկ պոլիմերային թաղանթ, որն ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Փոքր մոլեկուլները (ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտը) անցնում են թաղանթի ծակոտիներով, մինչդեռ մեծ մոլեկուլները (սպիտակուցները) պահպանվում են: Այսպիսով, սպիտակուցները լվանում են կեղտից:

Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային քաշով

Գելային քրոմատոգրաֆիա

Քրոմատոգրաֆիկ սյունակը լցված է գելային հատիկներով (Sephadex), որն ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Սյունակում ավելացվում է սպիտակուցների խառնուրդ։ Սպիտակուցները, որոնց չափերը ավելի փոքր են, քան Sephadex ծակոտիները, պահվում են սյունակում, քանի որ դրանք «խրվում են» ծակոտիների մեջ, իսկ մնացածը ազատորեն դուրս է գալիս սյունից (նկ. 2.1): Սպիտակուցի չափը կախված է նրա մոլեկուլային քաշից։

Բրինձ. 2.1.Սպիտակուցների բաժանում գել ֆիլտրման միջոցով

Ուլտրակենտրոնիֆուգացիա

Այս մեթոդը հիմնված է տարբեր խտության գրադիենտներով լուծույթներում (սախարոզա բուֆեր կամ ցեզիումի քլորիդ) սպիտակուցի մոլեկուլների նստվածքի (տեղացումների) տարբեր արագությունների վրա (նկ. 2.2):

Բրինձ. 2.2.Սպիտակուցների բաժանում ուլտրակենտրոնացման միջոցով

էլեկտրոֆորեզ

Այս մեթոդը հիմնված է էլեկտրական դաշտում սպիտակուցների և պեպտիդների միգրացիայի տարբեր տեմպերի վրա՝ կախված լիցքից:

Գելերը, ցելյուլոզայի ացետատը, ագարը կարող են ծառայել որպես էլեկտրոֆորեզի կրիչներ։ Առանձնացվելիք մոլեկուլները շարժվում են գելի մեջ՝ կախված իրենց չափսերից. նրանք, որոնք ավելի մեծ են, հետ կպահվեն, երբ անցնում են գելի ծակոտիներով: Փոքր մոլեկուլները կհանդիպեն ավելի քիչ դիմադրության և, հետևաբար, ավելի արագ կշարժվեն: Արդյունքում, էլեկտրոֆորեզից հետո ավելի մեծ մոլեկուլները կմոտենան սկզբին, քան փոքրերը (նկ. 2.3):

Բրինձ. 2.3. Սպիտակուցների բաժանում գելային էլեկտրոֆորեզով

Սպիտակուցները կարելի է բաժանել նաև էլեկտրոֆորեզի միջոցով՝ ըստ մոլեկուլային քաշի։Այս օգտագործման համար էլեկտրոֆորեզ PAAG-ում նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի առկայությամբ (SDS-Na).

Առանձին սպիտակուցների մեկուսացում

Affinity քրոմատոգրաֆիա

Մեթոդը հիմնված է ոչ կովալենտային կապերի միջոցով տարբեր մոլեկուլների հետ տարբեր մոլեկուլների հետ կապված սպիտակուցների ունակության վրա։ Օգտագործվում է ֆերմենտների, իմունոգոլոբուլինների, ընկալիչների սպիտակուցների մեկուսացման և մաքրման համար։

Նյութերի մոլեկուլները (լիգանդներ), որոնց հետ որոշակի սպիտակուցներ հատուկ կապվում են, կովալենտորեն միացվում են իներտ նյութի մասնիկների հետ։ Սյունակում ավելացվում է սպիտակուցների խառնուրդ, իսկ ցանկալի սպիտակուցը ամուր կցվում է լիգանդին։ Մնացած սպիտակուցները ազատորեն դուրս են գալիս սյունակից: Այնուհետև պահպանված սպիտակուցը կարող է լվանալ սյունակից ազատ լիգանդ պարունակող բուֆերով: Այս խիստ զգայուն մեթոդը թույլ է տալիս շատ փոքր քանակությամբ մաքուր սպիտակուց մեկուսացնել հարյուրավոր այլ սպիտակուցներ պարունակող բջջային էքստրակտից:

Իզոէլեկտրական կենտրոնացում

Մեթոդը հիմնված է սպիտակուցների տարբեր IEP արժեքների վրա: Սպիտակուցները բաժանվում են էլեկտրոֆորեզով ամֆոլինով ափսեի վրա (սա մի նյութ է, որն ունի նախապես ձևավորված pH գրադիենտ 3-ից 10-ի սահմաններում): Էլեկտրաֆորեզի ժամանակ սպիտակուցներն առանձնացվում են ըստ իրենց IEP-ի արժեքի (IEP-ում սպիտակուցի լիցքը զրո կլինի, իսկ էլեկտրական դաշտում այն ​​չի շարժվի)։

2D էլեկտրոֆորեզ

Այն իզոէլեկտրական ֆոկուսավորման և էլեկտրոֆորեզի համադրություն է SDS-Na-ի հետ: Նախ, էլեկտրոֆորեզն իրականացվում է ամֆոլինով ափսեի վրա հորիզոնական ուղղությամբ: Սպիտակուցները բաժանվում են՝ կախված լիցքից (CEP): Այնուհետև ափսեը մշակվում է SDS-Na լուծույթով և ուղղահայաց ուղղությամբ կատարվում է էլեկտրոֆորեզ։ Սպիտակուցները դասակարգվում են՝ ելնելով մոլեկուլային քաշից:

Իմունոէլեկտրոֆորեզ (Western blot)

Անալիտիկ մեթոդ, որն օգտագործվում է նմուշում հատուկ սպիտակուցներ որոշելու համար (Նկար 2.4):

Սպիտակուցների մեկուսացում կենսաբանական նյութերից:

Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային քաշով էլեկտրոֆորեզով PAAG-ում SDS-Na-ով:

Գելից սպիտակուցների տեղափոխում պոլիմերային ափսե՝ հետագա աշխատանքը հեշտացնելու համար:

Ափսեի մշակում ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցային լուծույթով՝ մնացած ծակոտիները լրացնելու համար։

Այսպիսով, այս փուլից հետո ստացվել է ափսե, որի ծակոտիները պարունակում են առանձնացված սպիտակուցներ, և նրանց միջև տարածությունը լցված է ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցով։ Այժմ մենք պետք է պարզենք, թե արդյոք այն սպիտակուցների շարքում, որոնք մենք փնտրում ենք, պատասխանատու են ինչ-որ հիվանդության համար: Բացահայտման համար օգտագործվում է հակամարմինների բուժում: Տակ առաջնային հակամարմինները հասկանալ հակամարմինները ցանկալի սպիտակուցին: Երկրորդական հակամարմիններ ասելով նշանակում է հակամարմիններ առաջնային հակամարմիններին: Լրացուցիչ հատուկ պիտակ (այսպես կոչված մոլեկուլային զոնդ) ավելացվում է երկրորդական հակամարմինների բաղադրությանը, որպեսզի հետագայում արդյունքները տեսանելի լինեն: Ռադիոակտիվ ֆոսֆատը կամ երկրորդական հակամարմինին սերտորեն կապված ֆերմենտը օգտագործվում է որպես պիտակ: Նախ՝ առաջնային, իսկ հետո երկրորդական հակամարմիններին կապելը երկու նպատակ ունի՝ ստանդարտացնել մեթոդը և բարելավել արդյունքները:

Առաջնային հակամարմինների լուծույթով մշակումը  կապը տեղի է ունենում ափսեի տեղում, որտեղ կա հակագեն (ցանկալի սպիտակուց):

Չկապված հակամարմինների հեռացում (լվացում):

Բուժում պիտակավորված երկրորդական հակամարմինների լուծույթով հետագա զարգացման համար:

Չկապված երկրորդական հակամարմինների հեռացում (լվացում):

Բրինձ. 2.4. Իմունոէլեկտրոֆորեզ (Western blot)

Կենսաբանական նյութում ցանկալի սպիտակուցի առկայության դեպքում ափսեի վրա հայտնվում է ժապավեն, որը ցույց է տալիս այս սպիտակուցի կապը համապատասխան հակամարմիններին։

Ֆիզիկաքիմիական հատկությունների, քիմիական կազմի և կառուցվածքի ուսումնասիրությունը հնարավոր է միայն մաքրված սպիտակուցային պատրաստուկի ուսումնասիրության ժամանակ: Առանձին սպիտակուցների մեկուսացման և մասնատման համար օգտագործվում են աղակալում, օրգանական լուծիչներով նստեցում, գելային ֆիլտրում, էլեկտրոֆորեզ, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա և հարաբերական քրոմատոգրաֆիա։

Սպիտակուցների աղակալումհիմնված է սպիտակուցի լուծելիության կախվածության վրա՝ միջավայրի հատկություններից։ Թորած ջրի մեջ սպիտակուցներն ավելի վատ են լուծվում, քան թույլ աղի լուծույթներում, քանի որ իոնների ցածր կոնցենտրացիաները պահպանում են իրենց խոնավացման պատյանները: Բայց աղի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում սպիտակուցի մոլեկուլները կորցնում են իրենց խոնավացման պատյանները, ագրեգատները և նստվածք ձևավորվում: Աղը հեռացնելուց հետո սպիտակուցները կրկին անցնում են լուծույթի մեջ՝ պահպանելով իրենց բնածին հատկությունները և կառուցվածքը։

Տարբեր աղի կոնցենտրացիաներում և միջին pH-ում լուծելիության փոփոխություններն օգտագործվում են առանձին սպիտակուցների մեկուսացման համար: Ամենից հաճախ, տարբեր կոնցենտրացիաների ամոնիումի սուլֆատի լուծույթները օգտագործվում են սպիտակուցների աղի համար:

Սպիտակուցների նստեցումը լուծույթից՝ առանց դրանց denaturation-ի, իրականացվում է ջրազրկող նյութերի օգտագործմամբ՝ օրգանական լուծիչներ (էթանոլ, ացետոն):

Գելի ֆիլտրումԱյն հիմնված է սպիտակուցների բաժանման վրա՝ ըստ մոլեկուլի չափի և ձևի։ Տարանջատումն իրականացվում է ծակոտկեն գելային հատիկներով (Sephadex, agarose) լցված քրոմատոգրաֆիկ սյունակներում՝ որոշակի pH արժեք ունեցող բուֆերային լուծույթում։ Գելի հատիկները սպիտակուցների համար թափանցելի են որոշակի միջին տրամագծով ներքին ալիքների (ծակոտիների) շնորհիվ, որոնց չափը կախված է գելի տեսակից (Sephadex G-25, G-200 և այլն): Սպիտակուցների խառնուրդը ներմուծվում է սյունակի մեջ, այնուհետև լվանում (ջրվում է) որոշակի pH արժեքով բուֆերային լուծույթով: Սպիտակուցի մեծ մոլեկուլները չեն թափանցում գելի ծակոտիները և լուծիչի հետ միասին շարժվում են մեծ արագությամբ։ Ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտոտության (աղի) կամ այլ սպիտակուցի փոքր մոլեկուլները պահվում են գելի հատիկներով և ավելի դանդաղ են լվանում սյունակից (նկ. 1.29): Սյունակի ելքի մոտ լուծույթը (էլյուտը) հավաքվում է առանձին ֆրակցիաների տեսքով։

Բրինձ. 1.29. Սպիտակուցների բաժանում գել ֆիլտրման միջոցով

էլեկտրոֆորեզհիմնված է լիցքավորված սպիտակուցի մոլեկուլների հատկության վրա՝ շարժվել էլեկտրական դաշտում իրենց ընդհանուր լիցքին համաչափ արագությամբ։ Սպիտակուցները, որոնք ունեն ընդհանուր բացասական լիցք տվյալ pH-ում, շարժվում են դեպի անոդ, իսկ դրականը՝ դեպի կաթոդ: Էլեկտրաֆորեզն իրականացվում է տարբեր կրիչներով՝ թուղթ, օսլա գել, պոլիակրիլամիդ գել և այլն։ Շարժման արագությունը կախված է սպիտակուցի մոլեկուլների լիցքից, զանգվածից և ձևից։ Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո կրիչի վրա սպիտակուցային գոտիները ներկվում են հատուկ ներկանյութերով (նկ. 1.30, Ա):

Գելում էլեկտրոֆորեզի թույլտվությունը ավելի բարձր է, քան թղթի վրա, ուստի արյան շիճուկի սպիտակուցների էլեկտրոֆորեզի ժամանակ թղթի վրա առանձնացվում են 5 ֆրակցիաներ (ալբումիններ, α 1 -, α 2 -, β-, γ-գլոբուլիններ), իսկ մինչև 18: ֆրակցիաներ պոլիակրիլամիդ գելի մեջ (նկ. 1.30, B):

Բրինձ. 1.30 Առողջ մարդու արյան շիճուկի սպիտակուցների էլեկտրաֆերոգրամ

Ա- արյան շիճուկի սպիտակուցների էլեկտրոֆերոգրամա թղթի վրա;

Բ- տարբեր ֆրակցիաների պլազմայի սպիտակուցների քանակը.

I - γ-գլոբուլիններ; II - β-գլոբուլիններ; III - a 2 -globulins;

IV - a 1 -globulins; V - ալբումիններ

Իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիահիմնված սպիտակուցների տարանջատման վրա, որոնք տարբերվում են ընդհանուր լիցքով: Որոշակի pH արժեք ունեցող սպիտակուցային լուծույթն անցնում է քրոմատոգրաֆիկ սյունակով, որը լցված է պինդ ծակոտկեն սորբենտով, մինչդեռ սպիտակուցների մի մասը պահպանվում է էլեկտրաստատիկ փոխազդեցության արդյունքում։ Որպես սորբենտ օգտագործվում են իոնափոխանակիչներ. կատիոնափոխանակիչներ (պարունակող անիոնային խմբեր) հիմնական սպիտակուցները մեկուսացնելու համար։

Երբ սպիտակուցն անցնում է սյունակի միջով, նրա կապակցման ուժը իոնափոխանակիչին կախված է սորբենտի լիցքի մեծությունից։ Իոնափոխանակման սորբենտի վրա ներծծված սպիտակուցները զտվում են աղի տարբեր կոնցենտրացիաներով և pH բուֆերային լուծույթներով՝ ստանալով տարբեր սպիտակուցային ֆրակցիաներ։

Affinity քրոմատոգրաֆիահիմնված է սպիտակուցի յուրահատկության վրա, որը կապված է պինդ հենակետին կցված լիգանդի հետ: Որպես լիգանդներ օգտագործվում են ֆերմենտային սուբստրատներ, հոլոպրոտեինների պրոթեզային խմբեր, անտիգեններ և այլն։ Երբ սպիտակուցների խառնուրդն անցնում է սյունակի միջով, լիգանդին կցվում է միայն լրացուցիչ սպիտակուց (նկ. 1.31, Ա), մնացած բոլորը դուրս են գալիս լուծույթով։ Կլանված սպիտակուցը զտվում է pH-ի տարբեր արժեք ունեցող լուծույթով (նկ. 1.31, Բ): Այս մեթոդը խիստ սպեցիֆիկ է և հնարավորություն է տալիս ստանալ բարձր մաքրված սպիտակուցային պատրաստուկներ:

Սպիտակուցի մեկուսացումն ու մաքրումը սովորաբար տեղի է ունենում մի քանի փուլով՝ տարբեր մեթոդների կիրառմամբ։ Քայլերի հաջորդականությունը ընտրվում է էմպիրիկ եղանակով և կարող է տարբերվել տարբեր սպիտակուցների համար: Սպիտակուցների մաքրման բարձր աստիճանը շատ կարևոր է ինչպես դրանք որպես դեղամիջոց օգտագործելիս (ինսուլին հորմոն և այլն), այնպես էլ տարբեր հիվանդություններ ախտորոշելիս՝ փոխելով հյուսվածքների, արյան, թքի սպիտակուցի բաղադրությունը և այլն:

Հասուն մարդու տարբեր օրգանների բջիջներում սպիտակուցների հավաքածուն անհատական ​​է և պահպանվում է համեմատաբար անփոփոխ ողջ կյանքի ընթացքում։ Մասնագիտացված հյուսվածքները կարող են պարունակել հատուկ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են հեմոգլոբինը արյան կարմիր բջիջներում, ակտինը և միոզինը մկաններում, ռոդոպսինը ցանցաթաղանթում և տարբեր տեսակի կոլագեն ոսկրային և շարակցական հյուսվածքներում: Որոշ սպիտակուցներ հայտնաբերված են շատ հյուսվածքներում, բայց տարբեր քանակությամբ: Ընտրված կազմը փոխվում է

Բրինձ. 1.31. Սպիտակուցների բաժանումը մերձավորության քրոմատոգրաֆիայի միջոցով

Ա- սեկրեցված սպիտակուցի կապը չեզոք կրիչին կցված հատուկ լիգանդի հետ. Բ- առանձին սպիտակուցի լուծույթ ստանալը

Հյուսվածքների և արյան սպիտակուցները հնարավոր են և կապված են հիմնականում սննդակարգի, սննդի կազմի և մարդու ֆիզիկական ակտիվության հետ:

Հիվանդությունների դեպքում արյան և հյուսվածքային բջիջների սպիտակուցային կազմը կարող է զգալիորեն փոխվել, հաճախ զարգանում է սպիտակուցի անբավարարություն կամ դրա ակտիվության նվազում. պրոտեինոպաթիա.Ուստի արյան և հյուսվածքների սպիտակուցային կազմի ընդգծված փոփոխությունների որոշումը կիրառվում է կլինիկական փորձարկումներում տարբեր հիվանդությունների ախտորոշման համար։

Սպիտակուցի խառնուրդը կենսաբանական նյութից արդյունահանվելուց հետո այն բաժանվում է առանձին սպիտակուցային ֆրակցիաների: Սպիտակուցների ֆրակցիոնացման մի քանի մեթոդներ են մշակվել՝ հիմնվելով սպիտակուցների տարբեր ֆիզիկաքիմիական հատկությունների վրա:

– սպիտակուցների տեղումներ իզոէլեկտրական կետում - մեթոդը հիմնված է սպիտակուցների հատկության վրա, որպեսզի նստեցվեն իզոէլեկտրական կետում՝ սպիտակուցի մոլեկուլի լիցքի չեզոքացման պատճառով: Յուրաքանչյուր սպիտակուցի համար իզոէլեկտրական կետի արժեքը խիստ անհատական ​​է, հետևաբար այս մեթոդը կարող է առանձնացնել առանձին սպիտակուցներ (մեթոդի մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս «Կենսաքիմիա» դասընթացի թիվ 3 լաբորատոր աշխատանքը):

– սպիտակուցի մասնատում աղի միջոցով - հիմնվելով չեզոք աղերի խտացված լուծույթներում սպիտակուցների տարբեր լուծելիության վրա՝ կախված մոլեկուլային քաշից (մեթոդի մասին ավելի մանրամասն տե՛ս «Կենսաքիմիա» դասընթացի թիվ 3 լաբորատոր աշխատանքը):

– էլեկտրոֆորետիկ տարանջատման մեթոդ սպիտակուցները ֆրակցիաների մեջ - նկարագրված է սպիտակուցների ֆիզիկաքիմիական հատկությունների բաժնում:

Բացի սպիտակուցները ֆրակցիաների բաժանելու վերը նշված մեթոդներից, դրանք լայնորեն կիրառվում են։ քրոմատոգրաֆիկ մեթոդներ . Ամենից հաճախ օգտագործվում է սյունակի քրոմատոգրաֆիան:

Այս մեթոդի առանձնահատկությունն այն է, որ տարբեր սպիտակուցների և պեպտիդների մոլեկուլների խառնուրդն անցնում է պինդ ծակոտկեն նյութ (մատրիցա) պարունակող սյունակի միջով: Մատրիցի հետ փոխազդեցության արդյունքում տարբեր սպիտակուցներ տարբեր արագությամբ անցնում են սյունակով։ Այն բանից հետո, երբ սպիտակուցները որոշակի հաջորդականությամբ հասնում են սյունակի հատակին, դրանք հավաքվում են առանձին ֆրակցիաներով փորձանոթներում։

Հատկացնել երեք հիմնական տեսակսյունակի քրոմատագրություն.

– իոնների փոխանակում - սպիտակուցային քրոմատոգրաֆիայի համար օգտագործվում են ցելյուլոզայի կամ այլ հիդրոֆիլ պոլիմերների վրա հիմնված իոնափոխանակիչներ, օրինակ՝ դիէթիլամինոէթիլցելյուլոզա (DEAE-ցելյուլոզա), որը պարունակում է կատիոնային խմբեր (բացասական լիցք) կամ պարունակող կարբոքսիմեթիլցելյուլոզա (CM-ցելյուլոզա), որը պարունակում է ամին խմբեր (դրական լիցք).

DEAE-ցելյուլոզայի հետ սպիտակուցի կապի ուժը որքան բարձր է, այնքան ավելի շատ կարբոքսիլ խմբեր սպիտակուցի մոլեկուլում: DEAE-ցելյուլոզայի վրա ներծծված սպիտակուցները կարող են լվացվել (էլյուլացիա) սյունակից նատրիումի քլորիդի աճող կոնցենտրացիայով լուծույթներով: Նախ, թույլ կապակցված սպիտակուցները զտվում են, և քանի որ աղի կոնցենտրացիան մեծանում է, այլ սպիտակուցներ են զտվում՝ DEAE-ցելյուլոզայի նկատմամբ նրանց մերձեցումը մեծացնելու նպատակով:

Նմանապես օգտագործվում է KM-ցելյուլոզը, սակայն դրա նկատմամբ սպիտակուցների հարաբերակցությունը ուղիղ համեմատական ​​է սպիտակուցի մոլեկուլում ամինային խմբերի թվին:

Կապված սպիտակուցը հեռացնելու համար փոխվում է նաև էլուենտի pH-ը։

– գելային քրոմատոգրաֆիա - ունի երկրորդ անունը «մոլեկուլային մաղի մեթոդ»: Սեֆադեքսը (էպիքլորհիդրինով մշակված դեքստրան պոլիսախարիդ) օգտագործվում է որպես մաղ: Սեֆադեքսի հատիկներն ուռչում են ջրի մեջ և ձևավորում գել։ ուռած հատիկներն ունեն որոշակի տրամագծի ծակոտիներ։

Տարանջատումը հիմնված է այն փաստի վրա, որ Sephadex հատիկները (հատիկների ծակոտիները) անթափանց կամ սահմանափակ թափանցելի են մեծ մոլեկուլային քաշ ունեցող նյութերի նկատմամբ, իսկ փոքր մոլեկուլները ազատորեն ցրվում են (թափանցում) հատիկների ծակոտիների մեջ։

Այտուցված Sephadex-ի գելանման զանգվածը տեղադրվում է ապակե սյունակի (խողովակի) մեջ, գելի մակերեսին քսում են սպիտակուցային լուծույթի շերտ (նկ. 12, ա) և այնուհետև անցնում բուֆերային լուծույթ (լվացող հեղուկ): սյունակի միջոցով: Սպիտակուցները հատիկների միջև սյունակի երկայնքով անցնում են ավելի դանդաղ, այնքան ցածր է նրանց մոլեկուլային քաշը, քանի որ նույնիսկ ավելի ցածր մոլեկուլային քաշ ունեցող սպիտակուցի մոլեկուլները ավելի հեշտությամբ ցրվում են հատիկների մեջ (ծակոտիների մեջ) (նկ. 12):

Բրինձ. 12. Սպիտակուցի ֆրակցիան գել ֆիլտրման միջոցով

Սպիտակուցները լվանում են (ջնջվում) սյունակից մոլեկուլային քաշի նվազման կարգով: Հետևաբար, նախ ցրվում են մեծ սպիտակուցի մոլեկուլները (նկ. 12բ), որոնք չեն ցրվում հատիկների, այնուհետև փոքր մոլեկուլների և վերջում՝ ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտերի մեջ:

Այս մեթոդը օգտագործվում է ոչ միայն սպիտակուցները մոլեկուլային քաշով մասնատելու, այլև դրանք ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտերից մաքրելու համար:

– մերձավորության քրոմատոգրաֆիա կամ մերձավորության քրոմատոգրաֆիա: Մեթոդի սկզբունքն այն է, որ առկա է սպիտակուցների ընտրովի փոխազդեցություն հատուկ նյութերի՝ կրիչների վրա ամրացված լիգանդների հետ (նկ. 13):

Որպես կրող օգտագործվում է ցիանոգենի բրոմիդով ակտիվացված սեֆարոզը։ Սեֆարոզին կցվում են տարբեր ծագման լիգանդներ՝ սուբստրատ, կամ անտիգեն կամ ընկալիչ, որը կապակցում է խառնուրդից միայն մեկ սպիտակուց.

– սուբստրատ → ֆերմենտ;

– հակագեն → հակամարմին;

– հորմոն → այս հորմոնի ընկալիչ:

Մյուս սպիտակուցները, որոնք կապված չեն լիգանդի հետ, հեռացվում են սյունը լվանալու միջոցով:

Բրինձ. 13. Մերձավորության քրոմատոգրաֆիայի մեխանիզմ

Սյունակից ֆիքսված սպիտակուցի հեռացումն իրականացվում է բուֆերային լուծույթի (էլյուենտի) միջոցով: Բուֆերի մեջ մտցվում է լվացող միջոց, որը թուլացնում է սպիտակուցի և լիգանդի միջև կապը, կամ սյունակի միջով անցնում է ազատ լիգանդի բարձր կոնցենտրացիայով լուծույթ։ Այս դեպքում սպիտակուցը ավելի հեշտ է կապվում ազատ լիգանդի հետ և լվանում (էլյութվում) սյունակից։

Լաբորատորիա թիվ 8

ՍՊԻՏԱԿՈՒՆՆԵՐԻ ԷԼԵԿՏՐՈՖՈՐԵՏԻԿ ԲԱԺԱՆԱՑՈՒՄ

Մեթոդը հիմնված է այն փաստի վրա, որ սպիտակուցի մոլեկուլներն ունեն էլեկտրական լիցք, որի մեծությունն ու նշանը որոշվում են սպիտակուցի ամինաթթուների կազմով, pH-ով և շրջակա միջավայրի իոնային ուժով։ Արտաքին էլեկտրական դաշտի ազդեցության տակ լիցքավորված մոլեկուլները լուծույթով շարժվում են դեպի հակառակ լիցքավորված բևեռ: Սպիտակուցի մասնիկների շարժման արագությունը համամասնական է դրանց լիցքի մեծությանը և հակադարձ համեմատական ​​մասնիկների չափերին և դրանց խոնավացման աստիճանին։

Այժմ լայնորեն կիրառվում է այսպես կոչված «զոնալ էլեկտրոֆորեզը»՝ էլեկտրոֆորեզ պինդ կրիչի վրա (թղթե շերտերի, ագարի, օսլայի, ակրիլամիդի վրա)՝ ներծծված ցանկալի pH արժեքով բուֆերային լուծույթով։ Սպիտակուցների դիրքը թղթի կամ գելի վրա որոշվում է՝ ամրացնելով և այնուհետև ներկելով դրանք այս կամ այն ​​ներկով (սովորաբար բրոմֆենոլ կապույտ, ամիդ սև կամ Coomassie կապույտ): Յուրաքանչյուր ֆրակցիայի մեջ սպիտակուցի քանակը կարող է մոտավորապես որոշվել կապված ներկանյութի գույնի ինտենսիվությամբ: Նման սահմանումը սպիտակուցային ֆրակցիաների խիստ քանակական հարաբերակցություն չի տալիս, քանի որ տարբեր սպիտակուցներով կապված ներկանյութի քանակը նույնը չէ։

ԷԼԵԿՏՐՈՖՈՐԵԶ ՀԱ ԹՈՒՂԹ

Վերլուծված խառնուրդի տարանջատումը տեղի է ունենում էլեկտրոֆորեզի սարքերում բուֆերային լուծույթով ներծծված որոշակի տեսակի քրոմատոգրաֆիկ թղթի վրա: Սպիտակուցները բաժանվում են մինչև 500 Վ լարման դեպքում։

Էլեկտրաֆորեզի խցիկը բաղկացած է պլեքսիգլասից լոգանքից և դրա վրա տեղադրված կափարիչից: (1). Լոգարանն ունի 2 էլեկտրոդային խցիկ (2), որոնցից յուրաքանչյուրը բաժանված է երկայնական միջնորմով։ (3) երկու բաժանմունքի մեջ, որոնք շփվում են միմյանց հետ: Bo խցիկների ներքին խցիկները իջեցնում են էլեկտրոդները, իսկ թղթի ծայրերը գծվում են արտաքինի մեջ։ (4), որի հիմնական մասը դրված է խցիկի կենտրոնական մասում գտնվող հասկերով (5) հորիզոնական ափսեի վրա։ Հորիզոնական ափսեի և էլեկտրոդների խցիկների արտաքին հատվածի միջև կան ձողիկներ (6),

Նկ.2. Սարքի սխեման ցածր լարման էլեկտրոֆորեզի համար

որոնց միջով նետվում են թղթե շերտերը և որոնք ծառայում են դրանք ամրացնելուն։ Խցիկի վերին ծածկույթի տակ դրված է պլեքսիգլասից պատրաստված ափսե՝ մեծ կլոր անցքերով (7), որի վրա դրված են թորած ջրով թաթախված 4-5 անգամ ծալված ֆիլտր թղթի թերթիկներ։ Այս թիթեղները նպաստում են խցիկի խստության բարձրացմանը և, որպես հետևանք, էլեկտրոֆորեզի ընթացքում էլեկտրոֆորեգրամներից հեղուկի գոլորշիացման նվազմանը:

Թղթի վրա էլեկտրոֆորեզի միջոցով ուսանողներին հրավիրվում են արյան շիճուկի սպիտակուցների տարանջատում: Այս մեթոդով արյան շիճուկը կարելի է բաժանել 5-9 ֆրակցիայի և կարելի է որոշել դրանցից յուրաքանչյուրում սպիտակուցի հարաբերական պարունակությունը։ Տարանջատումն իրականացվում է բուֆերային լուծույթում (pH 8.6 - 8.9) 3 - 5 Վ/սմ պոտենցիալ գրադիենտով (120 - 350 Վ 40 - 45 սմ երկարությամբ շերտերի համար) սենյակային ջերմաստիճանում: Ընթացիկ ուժը չպետք է գերազանցի թղթի շերտի խաչմերուկի մեկ սանտիմետրը 0,1 - 0,3 մԱ: Ընթացիկ ուժի ավելացումը 2 անգամից ավելի անընդունելի է, քանի որ դա առաջացնում է չափազանց տաքացում, գոլորշիացման զգալի աճ և Վվերջնական արդյունք - թղթի այրում

Ռեակտիվներ:

1. Բուֆերային լուծույթ. Կարող է օգտագործվել:

ա) վերոնալ-մեդինալ բուֆեր (pH 8,6). լուծել 10,32 գմեդինալ (վերոնալ նատրիումի աղ) 300 մլ թորած ջրի մեջ, ավելացնել 1,84 գվերոնալ, խառնել ջրային բաղնիքում մինչև լուծվելը և ջրով նոսրացնել մինչև 1 լ.

բ) վերոնալ ացետատի բուֆեր (pH 8.6). 4.3 գվերոնալ, 0.95 նատրիումի հիդրօքսիդ և 3.24 նատրիումի հիդրօքսիդ լուծվում են 300 մլ թորած ջրի մեջ։ Լուծույթին ավելացնել 30 մլ 0,1 Մ HCl լուծույթ և նոսրացնել մինչև 1 լիտր ջրով;

գ) Տրիս բուֆեր (pH 8,9). 60,5 գ տրիս, 6 գ էթիլենդիամինտետրաքացախաթթու և 4,6 գ բորային թթու լուծվում են 1 լ թորած ջրի մեջ:

2. Էլեկտրաֆորոգրամների ներկման լուծումներ.

ա) թթու կապույտ-սև ներկ (նման ամիդային սև 10 B) -0,2 գ խառնուրդում` քացախաթթու (սառցադաշտային) - 100 մլ + մեթիլ սպիրտ - 900 մլ;

բ) բրոմֆենոլ կապույտ - 0,5 գ, սուբլիմատ - 10 գ, քացախաթթու (սառցադաշտային) - 20 մլ, թորած ջուր - 980 մլ;

գ) բրոմֆենոլ կապույտ - 0,1 գ, ZnSO 4 7H 2 O -50 գ, քացախաթթու (սառցադաշտային) 50 մլ, թորած ջուր - 900 մլ:

3. Էլեկտրաֆորոգրամները սպիտակուցին չկապված ներկից լվանալու և ներկանյութը սպիտակուցի վրա ամրացնելու համար.

ա) քացախաթթու - 2% լուծույթ;

բ) նատրիումի ացետատ՝ 2% լուծույթ՝ պատրաստված 10% քացախաթթվի լուծույթով.

4. Էլեկտրոֆերոգրամներից գունավոր արտադրանքի էլյուացիայի լուծույթներ.

ա) բրոմֆենոլ կապույտի արդյունահանման համար՝ 0,01 Մ NaOH լուծույթ;

բ) թթվային կապույտ-սև ներկը հանելու համար՝ 0,1 Մ NaOH լուծույթ.

Սարքավորումներ: փորձարկման խողովակներ; կուվետներ, սպեկտրոֆոտոմետր, էլեկտրոֆորեզի սարք, քրոմատոգրաֆիկ թուղթ՝ FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM և այլն։

Արյան շիճուկ ստանալը. 2 - 3 մլ արյունը լցնում են չոր ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և թողնում 1/2 - 1 ժամ: Խողովակի պատերի շուրջը խնամքով պտտվում է բարակ ապակե ձող՝ թրոմբը դրանցից առանձնացնելու համար, ցենտրիֆուգվում և շիճուկը լցնում են մեջը: մաքուր խողովակ:

Տեսախցիկի պատրաստում.Էլեկտրոդների խցիկները լցված են բուֆերային լուծույթով մինչև նույն մակարդակը (բուֆերային արտահոսքից խուսափելու համար), մոտավորապես 800 մլ յուրաքանչյուր խցիկում: Bo էլեկտրոդների խցիկների ներքին մասերը ընկղմում են էլեկտրոդները: Քրոմատոգրաֆիկ թղթի թերթիկի վրա (18x45 սմ) (բարակ թղթեր օգտագործելիս ավելի լավ է նմուշները դնել 4-5 սմ լայնությամբ առանձին շերտերի վրա) դրա նեղ կողմերից մեկից 15 սմ հեռավորության վրա պարզ փափուկ մատիտով: (գրաֆիտը կանխում է հեղուկի տարածումը) ուրվագծեք նմուշների կիրառման վայրերը: Դրանք ուղղանկյուններ են (2 x 0,3 սմ), որոնց մեծ կողմերը ուղղահայաց են թղթե շերտի երկարությանը։ Մեկնարկային գոտիների և էլեկտրոֆերոգրամի եզրերի միջև հեռավորությունը -2 սմ է, էլեկտրաֆերոգրամը ներծծված է բուֆերով, որում տեղի կունենա էլեկտրոֆորեզ: Դա անելու համար այն քաշվում է բուֆերային լուծույթով կուվետի միջով: Թղթե շերտերի ծայրերը (6-8 սմ) չեն թրջվում։ Բուֆերի ավելցուկը հեռացվում է ֆիլտրի թղթի երկու կամ երեք թերթերի միջև ընկած շերտերը մաքրելու միջոցով: Խոնավ էլեկտրոֆերոգրամը տեղադրվում է կենտրոնական հորիզոնական ափսեի խցիկում (5), իսկ ծայրերը իջեցվում են էլեկտրոդների խցիկների արտաքին խցիկներում: Սարքը սերտորեն փակված է կափարիչով, որի տակ կան ջրով թրջված ֆիլտրի թղթեր: .

Էլեկտրաֆորեզի իրականացում.Թղթե շերտերը բուֆերային լուծույթով ամբողջությամբ հագեցվելուց հետո նմուշները կիրառվում են նշված հատվածների վրա՝ օգտագործելով 0,1 մլ պիպետտ՝ 0,01 - 0,02 մլ (1 - 2 մգ սպիտակուց) շիճուկ: Խցիկը փակված է կափարիչով, և հոսանքը միացված է: Էլեկտրոֆորեզի տևողությունը 22-24 ժամ է 200-300 Վ լարման դեպքում:

Էլեկտրաֆորոգրամների ամրագրում և ներկում:Էլեկտրոֆորեզի վերջում անջատեք հոսանքը և անմիջապես հեռացրեք էլեկտրոֆերոգրամները սարքից։ Դրանք տեղադրվում են հատուկ տակդիրի վրա և չորացնում օդի մեջ, այնուհետև 20 րոպե 105ºC ջեռոցում՝ սպիտակուցները թղթի վրա ամրացնելու համար, որից հետո դրանք դնում են էմալապատ կյուվետի մեջ, լցնում ներկով և թողնում 2–3 ժամ։ կամ ավելի. Ներկանյութը ցամաքեցնում են և էլեկտրոֆորեգրամները լվանում դրա ավելցուկից՝ 3-4 անգամ ողողելով քացախաթթվի 2%-անոց լուծույթով, ամեն անգամ 5-10 րոպե։ Թղթի այն հատվածները, որոնք չեն պարունակում սպիտակուցներ, պետք է լիովին զերծ լինեն ներկանյութից: Էլեկտրաֆորոգրամի գունավոր արտադրանքները ամրացնելու համար դրանք 2 րոպե լցնում են նատրիումի ացետատի 2%-անոց լուծույթով և չորացնում օդում ցամաքեցնելու տակ։

Առանձին սպիտակուցային ֆրակցիաների հարաբերակցության որոշում. 8.6 pH-ի դեպքում շիճուկի սպիտակուցները բացասական լիցքավորված են և էլեկտրական դաշտում շարժվում են դեպի անոդ: Դեպի անոդ ամենաարագ շարժվող մասնաբաժինը ալբումինն է, որին հաջորդում են α 1 -, α 2 -, β- և γ-գլոբուլինները (տես նկ. 3): . Թղթե ժապավենների այն հատվածները, որոնց վրա հայտնվում են սպիտակուցային բծեր, լայնակի գծերով բաժանվում են պարզ մատիտով 3-5 մմ լայնությամբ շերտերի և կտրվում այս գծերի երկայնքով: Յուրաքանչյուր շերտը մանրացվում է և տեղադրվում առանձին համարակալված փորձանոթի մեջ, լցնում 3 մլ 0,01 M NaOH լուծույթի մեջ, թողնում մեկ ժամ ներկը թղթից հանելու համար, այնուհետև ֆոտոգունաչափի վրա (սպեկտրոֆոտոմետր) յուրաքանչյուր լուծույթի համար գտնում են օպտիկական խտության արժեքը։ ) 612 նմ.

Բրինձ. 3. Մարդու արյան շիճուկի էլեկտրաֆերոգրամ և սպիտակուցային ֆրակցիաների բաշխման կոր

Միաժամանակ մշակվում է հսկիչ նմուշ: Դրա համար էլեկտրոֆերոգրամայի չբիծված հատվածներից շերտ է կտրվում։

Ստացված տվյալների հիման վրա էլեկտրոֆորեգրամի վրա կառուցվում է գունավոր արտադրանքների բաշխման կոր, աբսցիսային առանցքները նշում են փորձանոթների թիվը, օրդինատների առանցքները ցույց են տալիս համապատասխան օպտիկական խտության արժեքը (տես նկ. 3): . Հաշվեք արյան շիճուկում սպիտակուցային ֆրակցիաների տոկոսը: Դրա համար գծված կորը մինիմումներով բաժանվում է առանձին կոտորակներին համապատասխանող մի շարք հատվածների։ Յուրաքանչյուր հատվածի տարածքի չափը համաչափ է ներկի քանակին, որը համակցվել է այս ֆրակցիայի սպիտակուցի հետ: Այս տարածքների միջև հարաբերակցությունը հաշվարկվում է կշռով (թղթի հատվածների քաշը համաչափ է դրանց մակերեսին), ամբողջ տարածքը վերցվում է 100%: Դենսիտոմետրի առկայության դեպքում արյան շիճուկում սպիտակուցային ֆրակցիաների հարաբերակցությունը կարելի է որոշել դենսիտոգրամից։

Նախապես որոշելով սպիտակուցի պարունակությունը շիճուկում, հաշվարկեք դրա քանակը յուրաքանչյուր ֆրակցիայի համար: