Högpresterande kromatografi. Högpresterande vätskekromatografi av naturliga föroreningar och avloppsvatten

24.11.202227.05.2017

(huvudsakligen intermolekylär) vid fasgränsytan. Som analysmetod ingår HPLC i en grupp metoder som, på grund av komplexiteten hos de föremål som studeras, inkluderar den preliminära separeringen av den ursprungliga komplexblandningen till relativt enkla. De resulterande enkla blandningarna analyseras sedan med konventionella fysikalisk-kemiska metoder eller speciella metoder utvecklade för kromatografi.

HPLC-metoden används ofta inom områden som kemi, petrokemi, biologi, bioteknik, medicin, livsmedelsindustri, miljöskydd, läkemedelsproduktion och många andra.

Enligt mekanismen för separation av de analyserade eller separerade substanserna är HPLC uppdelad i adsorption, distribution, jonbyte, uteslutning, ligandutbyte och andra.

Man bör komma ihåg att i praktiskt arbete sker separation ofta inte genom en, utan genom flera mekanismer samtidigt. Exklusionsseparation kan således kompliceras av adsorptionseffekter, adsorptionsseparation genom distributionseffekter och vice versa. Ju större skillnaden är mellan ämnen i ett prov i termer av joniseringsgrad, basicitet eller surhet, molekylvikt, polariserbarhet och andra parametrar, desto större är sannolikheten för en annan separationsmekanism för sådana ämnen.

Normalfas HPLC

Den stationära fasen är mer polär än den mobila fasen, därför dominerar det opolära lösningsmedlet i eluenten:

Hexan:isopropanol = 95:5 (för ämnen med låg polaritet)
Kloroform:metanol = 95:5 (för medelpolära ämnen)
Kloroform:metanol = 80:20 (för högpolära ämnen)

Omvänd fas HPLC

Den stationära fasen är mindre polär än den mobila fasen, så eluenten innehåller nästan alltid vatten. I detta fall är det alltid möjligt att säkerställa fullständig upplösning av BAS i den mobila fasen, det är nästan alltid möjligt att använda UV-detektion, nästan alla mobila faser är ömsesidigt blandbara, gradienteluering kan användas, kolonnen kan snabbt återställas -jämviktad, kan kolonnen regenereras.

Vanliga eluenter för omvänd fas HPLC är:

Acetonitril: vatten
Metanol:vatten
Isopropanol: vatten

Matriser för HPLC

HPLC använder oorganiska föreningar som matriser, såsom kiseloxid (kiselgel) eller aluminiumoxid, eller organiska polymerer, såsom polystyren (tvärbunden med divinylbensen) eller polymetakrylat. Kiselgel är naturligtvis nu allmänt accepterad.

Huvudegenskaper hos matrisen:

Partikelstorlek (µm);
Inre porstorlek (Å, nm).

Beredning av silikagel för HPLC:

Gjutning av polykiselsyramikrosfärer;
Torkning av kiselgelpartiklar;
Luftseparering.

Sorbentpartiklar:

Vanlig (sfärisk): högre tryckmotstånd, högre kostnad;
Icke-sfärisk: lägre tryckmotstånd.

Porstorleken i HPLC är en av de viktigaste parametrarna. Ju mindre porstorlek, desto sämre är deras permeabilitet för molekyler av eluerade ämnen. Och därför, desto sämre är sorptionskapaciteten hos sorbenter. Ju större porer, desto mindre, för det första, är den mekaniska stabiliteten hos sorbentpartiklarna, och för det andra, ju mindre sorptionsyta, desto sämre effektivitet.

Vaccinationer i stationär fas

Normalfas HPLC:

Stationär fas med propylnitril ympning (nitril);
Stationär fas med propylaminympning (amin).

Omvänd fas HPLC:

Stationär fas med alkylympning;
Stationär fas med alkylsilylympning.

End-capping är skyddet av opympade områden av sorbenten genom ytterligare ympning med "små" molekyler. Hydrofob ändkapsling (C1, C2): högre selektivitet, sämre vätbarhet; hydrofil ändkapsling (diol): lägre selektivitet, högre vätbarhet.

Detektorer för HPLC

UV
Diodmatris
Fluorescerande
Elektrokemisk
Refraktometrisk
Massselektiv

Länkar

Wikimedia Foundation. 2010.

Se vad "High Performance Liquid Chromatography" är i andra ordböcker:

högpresterande vätskekromatografi- - [A.S. Goldberg. Engelsk-rysk energiordbok. 2006] Ämnen: energi i allmänhet EN högpresterande vätskekromatografi HPLC ... Teknisk översättarguide

Termen högpresterande vätskekromatografi Termen på engelska högpresterande vätskekromatografi Synonymer Förkortningar HPLC, HPLC Relaterade termer adsorption, oligopeptid, proteomics, sorbent, fulleren, endohedral, chromatography... ...

Vätskekromatografi, där lösningsmedlet (elueringsmedlet) under tryck (mer än 3x107 Pa) pumpas genom kolonner fyllda med sorbent med partiklar med liten diameter (upp till 1 μm), för att öka separationseffektiviteten, och perfusionsfilter är också Begagnade... ...

En typ av kromatografi där vätskan (eluenten) fungerar som den mobila fasen och den stationära. sorbent, TV en bärare med en vätska eller gel applicerad på dess yta. Utför i en kolonn fylld med sorbent (kolonnkromatografi) på en plan... ... Naturvetenskap. encyklopedisk ordbok

- [κρώμα (υrum) färg] en process baserad på den ojämlika förmågan hos enskilda komponenter i blandningen (flytande eller gasformiga) att stanna kvar på ytan av adsorbenten både när de absorberas från bärarflödet och när ... ... Geologisk uppslagsverk

- (från annan grekisk ... Wikipedia

Termen kromatografi Termen på engelska kromatografi Synonymer Förkortningar Relaterade termer högpresterande vätskekromatografi, klatrat, laboratorium på ett chip, porometri, proteom, proteomik, sorbent, enzym, fulleren, endohedral... ... Encyclopedic Dictionary of Nanotechnology

Vätskekromatografi baserad på sönderdelning. separerade joners förmåga att jonbyte med fasta. sorbentjoner bildade som ett resultat av dissociation av de senares jonogena grupper. Katjonbytare används för att separera katjoner, för... ... Kemiskt uppslagsverk

HPLC- högpresterande vätskekromatografi... Ordbok för ryska förkortningar

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en av de effektiva metoderna för att separera komplexa blandningar av ämnen, flitigt använt både inom analytisk kemi och kemisk teknik. Grunden för kromatografisk separation är deltagandet ... Wikipedia

Böcker

Praktisk högpresterande vätskekromatografi, Veronica R. Mayer. Vi presenterar för läsaren den 5:e upplagan av boken, som har utökats med moderna metoder och utrustning. Mycket har förbättrats i boken och ett stort antal referenser har tillkommit. De ställen i texten där...

Vätskekromatografi är en metod för att separera och analysera komplexa blandningar av ämnen där en vätska fungerar som den mobila fasen. Den är tillämpbar för separation av ett bredare spektrum av ämnen än gaskromatografi. Detta beror på det faktum att de flesta ämnen inte är flyktiga, många av dem är instabila vid höga temperaturer (särskilt högmolekylära föreningar) och sönderdelas när de omvandlas till ett gasformigt tillstånd. Separationen av ämnen genom vätskekromatografi utförs oftast vid rumstemperatur.

Egenskaperna hos alla typer av vätskekromatografi beror på det faktum att den mobila fasen i den är flytande, och sorptionen av komponenter från gasformigt och flytande elueringsmedel fortskrider annorlunda. Om vid gaskromatografi bärgasen endast utför en transportfunktion och inte sorberas av den stationära fasen, så är den flytande mobila fasen i vätskekromatografi ett aktivt elueringsmedel; dess molekyler kan sorberas av den stationära fasen. När de passerar genom kolonnen måste molekylerna av komponenterna i den analyserade blandningen som finns i eluenten förskjuta eluentens molekyler från sorbentens ytskikt, vilket leder till en minskning av interaktionsenergin mellan analytens molekyler. med ytan av sorbenten. Därför värdena för behållna volymer V R, proportionell mot förändringen i systemets fria energi, är mindre vid vätskekromatografi än vid gaskromatografi, och linjäritetsintervallet för sorptionsisotermen vid vätskekromatografi är bredare.

Genom att använda olika elueringsmedel kan retentionsparametrarna och selektiviteten för det kromatografiska systemet ändras. Selektivitet i vätskekromatografi, till skillnad från gaskromatografi, bestäms inte av en, utan av två faktorer - arten av den mobila (eluenten) och stationära faser.

Den flytande mobila fasen har en högre densitet och viskositet än gasfasen, diffusionskoefficienter D och 3–4 storleksordningar lägre än i gas. Detta leder till långsammare massöverföring vid vätskekromatografi jämfört med gaskromatografi. Van Deemters ekvation på grund av det faktum att termen I spelar ingen roll vid vätskekromatografi ( D och  D G), förändras också effektivitetens grafiska beroende N från den linjära flödeshastigheten för den mobila fasen har den form som visas i fig. 1.9.

I den klassiska versionen av kolonnvätskekromatografi införs det analyserade provet löst i eluenten i en glaskolonn 1–2 m hög, fylld med en sorbent med en partikelstorlek på 100 μm och en eluent, och eluenten passeras genom välja delar av eluatet vid utgången från kolonnen. Denna version av vätskekromatografi används fortfarande i laboratoriepraxis, men eftersom passagehastigheten för eluenten under påverkan av gravitationen är låg, är analysen lång.

Den moderna versionen av vätskekromatografi, den så kallade högpresterande vätskekromatografin HPLC, använder volymetriska och ytporösa sorbenter med en partikelstorlek på 5–10 mikron, injektionspumpar som ger systemtryck upp till 400 atm och mycket känsliga detektorer. Snabb massöverföring och hög separationseffektivitet gör det möjligt att använda HPLC för separation av molekyler (vätskeadsorption och vätske-vätskefördelningskromatografi), för separation av joner (jonbytes-, jon-, jonparkromatografi), för separation av makromolekyler (storleksexklusionskromatografi).

1.3. LÖSNINGSMEDDELAREBEHÅLLNING OCH STYRKA

För att de analyserade ämnena ska separeras på kolonnen måste, som nämnts ovan, kapacitetskoefficienten k" vara större än 0, d.v.s. ämnena måste hållas kvar av den stationära fasen, sorbenten. Kapacitetskoefficienten bör dock inte vara för stor för att erhålla en acceptabel elueringstid Om för en given blandning av ämnen väljs en stationär fas som behåller dem, så består det fortsatta arbetet med utvecklingen av en analysteknik i att välja ett lösningsmedel som helst skulle ge olika men acceptabelt inte särskilt stort k". Detta uppnås genom att ändra lösningsmedlets elueringsstyrka.

Vid adsorptionskromatografi på silikagel eller aluminiumoxid ökar som regel styrkan hos ett tvåkomponentlösningsmedel (till exempel hexan med tillsats av isopropanol) genom att öka halten av den polära komponenten (isopropanol), eller minskas genom att minska isopropanolhalten. Om halten av den polära komponenten blir för låg (mindre än 0,1%) bör den ersättas med en svagare elueringskraft. Detsamma görs genom att ersätta antingen en polär eller en icke-polär komponent med andra, även om detta system inte ger den önskade selektiviteten med avseende på komponenterna av intresse i blandningen. Vid val av lösningsmedelssystem beaktas både lösligheten av blandningskomponenterna och den eluotropa serie av lösningsmedel som sammanställts av olika författare.

Lösningsmedlets styrka väljs på ungefär samma sätt när man använder ympade polära faser (nitril, amino, diol, nitro, etc.), med hänsyn tagen till möjliga kemiska reaktioner och utesluter lösningsmedel som är farliga för fasen (till exempel aldehyder och ketoner). för aminofasen).

Vid omvänd faskromatografi ökas lösningsmedelsstyrkan genom att öka halten av den organiska komponenten i eluenten (metanol, acetonitril eller THF) och minskas genom att tillsätta mer vatten. Om det inte är möjligt att uppnå önskad selektivitet använder de en annan organisk komponent eller försöker ändra den med olika tillsatser (syror, jonparreagens etc.).

Vid separationer med jonbyteskromatografi ändras lösningsmedlets styrka genom att öka eller minska koncentrationen av buffertlösningen eller ändra pH, i vissa fall används modifiering med organiska ämnen.

Men speciellt i fallet med komplexa naturliga och biologiska blandningar är det ofta inte möjligt att välja lösningsmedelsstyrkan så att alla provkomponenter eluerar inom en acceptabel tidsram. Då måste man ta till gradienteluering, d.v.s. använd ett lösningsmedel vars elueringsstyrka ändras under analysprocessen så att den hela tiden ökar enligt ett förutbestämt program. Denna teknik gör det möjligt att uppnå eluering av alla komponenter i komplexa blandningar på relativt kort tid och deras separation i komponenter i form av smala toppar.

1.6.1. Adsorptionsvätskekromatografi. Adsorptionsvätskekromatografi, beroende på polariteten hos de stationära och mobila faserna, delas in i normalfas (NPC) och omvänd fas (RPC) kromatografi. I NPC används en polär adsorbent och opolära mobila faser; i OPC används en opolär adsorbent och polära mobila faser, men i båda alternativen är valet av den mobila fasen ofta viktigare än valet av stationär fas. Den stationära fasen måste hålla kvar de ämnen som separeras. Den mobila fasen, dvs lösningsmedlet, måste tillhandahålla varierande kolonnkapacitet och effektiv separation inom en acceptabel tid.

Polära och opolära finfördelade porösa material med en specifik yta på mer än 50 m 2 /g används som en stationär fas i adsorptionsvätskekromatografi. Polära adsorbenter (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil etc.) har svaga syragrupper på ytan som kan behålla ämnen med grundläggande egenskaper. Dessa adsorbenter används huvudsakligen för separation av opolära och måttligt polära föreningar. Deras nackdel är deras höga känslighet för vattenhalten i de använda elueringsmedlen. För att eliminera denna nackdel behandlas polära sorbenter med aminer, dioler och andra reagens, vilket resulterar i ytympning av dessa reagens, ytmodifiering och en förändring i selektivitet med avseende på analyterna.

Icke-polära adsorbenter (grafiterad kimrök, kiselgur, kiselgur) är icke-selektiva mot polära molekyler. För att erhålla opolära adsorbenter ympas ofta icke-polära grupper på ytan av exempelvis silikagel, till exempel alkylsilyl-SiR3, där R-alkylgrupper är C2-C22.

Den mobila fasen måste helt lösa provet som analyseras, ha låg viskositet (så att diffusionskoefficienterna är tillräckligt stora), och det är önskvärt att det är möjligt att isolera de separerade komponenterna från den. Den måste vara inert med avseende på materialen i alla delar av kromatografen, säker, billig och lämplig för detektorn.

Mobila faser som används vid vätskekromatografi varierar i sin elueringsstyrka. Elueringskraften för ett lösningsmedel visar hur många gånger sorptionsenergin för en given eluent på en given adsorbent är större än sorptionsenergin för eluenten som valts som standard, till exempel n-heptan. Svaga lösningsmedel adsorberas dåligt av den stationära fasen, därför är fördelningskoefficienterna för sorberade ämnen (sorbat) höga. Tvärtom, starka lösningsmedel adsorberas väl, så sorbatfördelningskoefficienterna är låga. Ju starkare lösningsmedlet är, desto högre löslighet har det analyserade provet i det, och desto starkare är lösningsmedel-sorbatinteraktionen.

För att säkerställa hög separationseffektivitet på en kolonn är det nödvändigt att välja en mobil fas som har en polaritet som är optimal för blandningen som ska separeras under de valda separationsförhållandena. Typiskt väljs först en stationär fas som har en polaritet nära den för komponenterna som separeras. Sedan väljs den mobila fasen, vilket säkerställer att kapacitetskoefficienten k" visade sig vara i intervallet från 2 till 5. Om polariteten för den mobila fasen är för nära polariteten för den stationära fasen, kommer retentionstiden för komponenterna att vara för kort, och om polariteterna för den mobila och stationära fasen faserna är mycket olika, retentionstiden blir för lång.

Vid val av mobila faser styrs de av den så kallade eluotropiska serien, baserad på användningen av polaritetsindex Snyder R", som delar upp alla lösningsmedel i starka (polära) och svaga (svagt polära och opolära). Polaritetsskalan är baserad på lösligheten av de ämnen som används som mobila faser i dioxan, nitrometan och etanol.

Tabell 1.2 visar värdena för polaritetsindex och elueringskraft (relativt SiO 2) för ett antal lösningsmedel som oftast används i vätskekromatografi som mobila faser. De korta våglängdsgränserna för transparens för dessa lösningsmedel anges också här, vilket underlättar valet av villkor för att detektera komponenterna i blandningen.

Tabell 1.2

Egenskaper för lösningsmedel som används vid vätskekromatografi

Lösningsmedel	Polaritetsindex	Elueringskraft (SiO 2)	Transparensgräns för kort våglängd
Fluoroalkan
Cyklohexan
n- Hexan
Koltetraklorid
Diisopropyleter

Dietyleter
Diklorometan
Tetrahydrofuran
Kloroform

Ättiksyra


Acetonitril
Nitrometan

Vid vätskekromatografi används ofta blandningar av dem snarare än individuella lösningsmedel. Ofta kommer mindre tillsatser av ett annat lösningsmedel, speciellt vatten, att avsevärt öka elueringsmedlets styrka.

Vid separering av flerkomponentblandningar kan det hända att en enda mobil fas som elueringsmedel inte separerar alla provkomponenter inom en acceptabel tid. I detta fall används en stegvis eller gradient elueringsmetod, där allt starkare eluenter används sekventiellt under kromatografiprocessen, vilket gör det möjligt att eluera mycket kvarhållna ämnen på kortare tid.

I vätskekromatografi finns det några empirisk regler som är mycket användbara när du väljer en eluent:

- sorption av en förening ökar som regel med en ökning av antalet dubbelbindningar och OH-grupper i den;

 sorptionen minskar i ett antal organiska föreningar: syror alkoholeraldehyderketonerestraromättade kolvätenmättade kolväten;

 för att separera ämnen med olika polaritet och separata ämnen av olika klasser används normalfaskromatografi: det analyserade provet löses upp och elueras med ett opolärt elueringsmedel, föreningar av olika klasser lämnar kolonnen med en polär adsorbent vid olika tidpunkter, medan retentionstiden för föreningar med olika funktionella grupper ökar under övergången från opolära föreningar till svagt polära. För mycket polära molekyler är retentionstiderna så långa att analys inte är möjlig med en opolär eluent. För att minska retentionstiden för polära komponenter, byt till polära eluenter;

 i versionen med omvänd fas adsorberar den stationära fasen (opolär adsorbent) den opolära komponenten starkare från polära elueringsmedel, till exempel från vatten;

- Genom att reducera elueringsmedlets polaritet genom att tillsätta ett mindre polärt lösningsmedel kan retentionen av komponenter minskas.

1.6.2. Fördelningsvätskekromatografi. Vid partitions- eller vätske-vätskekromatografi beror separationen av komponenterna i det analyserade provet på skillnader i koefficienterna för deras fördelning mellan två oblandbara vätskefaser, varav den ena är stationär och belägen på ytan eller i porerna i ett fast ämne. stationär bärare, och den andra är mobil.

När det gäller arten av de växelverkanskrafter som bestämmer den olika fördelningen mellan de två faserna av ämnen som skiljer sig åt i sin kemiska struktur, liknar fördelningskromatografi adsorptionskromatografi, dvs. även här är separationen baserad på skillnaden i krafterna hos intermolekylär interaktion mellan komponenterna i det analyserade provet och de stationära och mobila vätskefasen.

Beroende på tekniken kan partitionskromatografi, som adsorptionskromatografi, vara kolonn eller plan (papper eller tunt skikt).

Ämnen som är likgiltiga för det mobila lösningsmedlet och komponenterna i det analyserade provet, men som kan behålla den stationära fasen på ytan och i porerna, används som fasta bärare. Oftast används polära ämnen (cellulosa, kiselgel, stärkelse) som bärare. En stationär fas - ett polärt lösningsmedel, oftast vatten eller alkohol - appliceras på dem. I detta fall används mindre polära eller opolära ämnen (alkoholer, aminer, ketoner, kolväten, etc.) som mobila faser. Denna typ av partitionskromatografi kallas normalfas. Det används för att separera polära ämnen.

Den andra versionen av partitionskromatografi skiljer sig genom att icke-polära bärare (gummi, fluorplast, hydrofobiserad kiselgel) används som en stationär fast fas, opolära lösningsmedel (kolväten) används som en stationär flytande fas och polära lösningsmedel (alkoholer) , aldehyder) används som en mobil flytande fas, ketoner, etc., ofta vatten). Denna version av partitionskromatografi kallas omvänd fas och används för att separera opolära ämnen.

För att uppnå optimal separation av komponenterna i det analyserade provet är valet av den mobila fasen mycket viktigt. Lösningsmedel (mobila och stationära flytande faser) måste väljas så att fördelningskoefficienterna för blandningskomponenterna skiljer sig ganska signifikant. Följande krav gäller för flytande faser: krav:

1) de använda lösningsmedlen måste lösa de ämnen som separeras väl, och deras löslighet i den stationära fasen måste vara större än i den mobila fasen;

2) lösningsmedel som används som mobila och stationära faser måste vara ömsesidigt mättade, dvs lösningsmedlets sammansättning måste vara konstant under passage genom kolonnen;

3) interaktionen mellan lösningsmedel som används som en mobil fas med den stationära fasen bör vara minimal.

Oftast, i partitionsvätskekromatografi, används inte enskilda ämnen, utan deras blandningar i olika förhållanden som mobila vätskefaser. Detta gör det möjligt att reglera polariteten för den mobila fasen, ändra förhållandet mellan polariteterna för de mobila och stationära fasen och uppnå optimala förhållanden för separationen av komponenterna i en viss blandning som analyseras.

En betydande nackdel med denna kromatografiska metod är att den applicerade stationära vätskefasen snabbt tvättas bort från bäraren. För att eliminera det mättas lösningsmedlet som används som den mobila fasen med en substans som används som den stationära vätskefasen, eller så stabiliseras den stationära vätskefasen genom att ympa den på bäraren.

En variant av fördelningsvätskekromatografi är den allmänt använda HPLC-metoden.

De vanligaste kromatografisystemen är system som har en modulär monteringsprincip. Pumpar, avgasningsanordningar, detektorer, dispensrar (autosamplare), kolonntermostater, fraktionssamlare, kromatografiska systemkontrollenheter och registreringsanordningar finns som separata moduler. Ett brett urval av moduler gör att du flexibelt kan lösa olika analytiska problem och snabbt ändra systemkonfigurationen vid behov med minimala kostnader. Samtidigt produceras också monomodulära (integrerade) LC, vars största fördel är miniatyriseringen av enskilda enheter och enhetens kompakthet.

Beroende på elueringsmetoden delas vätskekromatografer in i isokratiska och gradienter.

Schematisk av en isokratisk kromatograf

Den mobila fasen från behållaren (1) genom inloppsfiltret (9) tillförs av en precisions högtryckspump (2) till provinsprutningssystemet (3) - en manuell injektor eller autosampler, och provet införs också där . Därefter, genom ett in-line-filter (8), kommer provet med en ström av den mobila fasen in i separationselementet (elementen) (4) - genom förkolonnen in i separationskolonnen. Sedan kommer eluatet in i detektorn (5) och tas bort i avloppsbehållaren (7). När eluatet strömmar genom detektorns mätkrets, registreras kromatogrammet och data överförs till en analog brännare (recorder) (6) eller annat system för insamling och bearbetning av kromatografiska data (integrator eller dator). Beroende på utformningen av funktionsmodulerna kan systemet styras från kontrollmodulens tangentbord (vanligtvis en pump eller systemstyrenhet), från tangentborden på var och en av systemmodulerna eller av ett styrprogram från en persondator.

Vid gradienteluering används två fundamentalt olika typer av vätskekromatografer. De skiljer sig åt i den punkt vid vilken gradienten av mobilfaskompositionen bildas.

Schema för en gradientkromatograf med bildandet av en gradient av sammansättningen av den mobila fasen på en lågtrycksledning.

Den mobila fasen från behållare (1) genom ingångsfilter (9) och en gradientprogrammerare (10) tillförs av en precisions högtryckspump (2) till provinsprutningssystemet (3) - en manuell injektor eller autosampler, och prov införs också där. Funktionen av styrs antingen av systemkontrollmodulen (pump eller styrenhet) eller av ett PC-styrprogram. System av denna typ bildar en binär, tredimensionell och fyrdimensionell gradient. Gradientbearbetningsfunktionens form beror på den specifika styrmodulen eller styrprogrammet, såväl som funktionaliteten hos styr- och styrmodulerna. Därefter, genom ett in-line-filter (8), kommer provet med en ström av den mobila fasen in i separationselementet (elementen) (4) - genom förkolonnen in i separationskolonnen. Sedan kommer eluatet in i detektorn (5) och tas bort i avloppsbehållaren (7). När eluatet strömmar genom detektorns mätkrets, registreras kromatogrammet och data överförs till en analog brännare (recorder) (6) eller annat system för insamling och bearbetning av kromatografiska data (integrator eller dator). Beroende på utformningen av funktionsmodulerna kan systemet styras från kontrollmodulens tangentbord (vanligtvis en pump eller systemstyrenhet), eller utföras av ett styrprogram från en persondator. Vid styrning av en styrmodul är det möjligt att självständigt styra detektorn från sitt eget tangentbord.

Trots den uppenbara attraktiviteten hos sådana system (de använder bara en precisions högtryckspump) har dessa system ett antal nackdelar, bland vilka den främsta kanske är det strikta behovet av noggrann avgasning av de mobila faskomponenterna redan innan lågtrycksblandare (gradientprogrammeringskammare). Det utförs med hjälp av speciella genomströmningsavgasare. På grund av detta faktum blir deras kostnad jämförbar med en annan typ av gradientsystem - system med bildandet av en mobil fasgradientkomposition på en högtrycksledning.

Den grundläggande skillnaden mellan system med bildandet av en mobil fasgradientsammansättning på en högtrycksledning är blandningen av komponenter i högtrycksledningen; naturligtvis, med detta tillvägagångssätt, bestäms antalet precisionspumpar av antalet tankar för att blanda den mobila fasen. Med detta tillvägagångssätt reduceras kraven på grundlig avgasning av komponenter avsevärt.

Schema för en gradientkromatograf med bildandet av en gradient av sammansättningen av den mobila fasen på en högtrycksledning.

Den mobila fasen från behållare (1) genom ingångsfilter (9) tillförs av precisions högtryckspumpar (2 och 11) genom en statisk eller dynamisk flödesblandare (10) in i provinmatningssystemet (3) - en manuell injektor eller autosampler, och provet introduceras också där. Driften av styrda pumpar styrs antingen av systemstyrmodulen (huvudpump eller styrenhet) eller av ett PC-styrprogram. I detta fall är alla pumpar styrbara. System av denna typ bildar en binär eller tredimensionell gradient. Gradientbearbetningsfunktionens form beror på den specifika styrmodulen eller styrprogrammet, såväl som funktionaliteten hos styr- och styrmodulerna. Därefter, genom ett in-line-filter (8), kommer provet med en ström av den mobila fasen in i separationselementet (elementen) (4) - genom förkolonnen in i separationskolonnen. Eluatet kommer sedan in i detektorn (5) och tas ut i avloppsbehållaren (7). När eluatet strömmar genom detektorns mätkrets, registreras kromatogrammet och data överförs till en analog brännare (recorder) (6) eller annat system för insamling och bearbetning av kromatografiska data (integrator eller dator). Beroende på utformningen av funktionsmodulerna kan systemet styras från kontrollmodulens tangentbord (vanligtvis en pump eller systemstyrenhet), eller utföras av ett styrprogram från en persondator. Vid styrning av en styrmodul är det möjligt att självständigt styra detektorn från sitt eget tangentbord.

De föreslagna systemen är ganska förenklade. Systemen kan inkludera ytterligare anordningar - en kolonntermostat, system för derivatisering efter kolumn, provberedning och provkoncentrationssystem, en återvinning av lösningsmedel, membransystem för att undertrycka elektrisk bakgrundsledningsförmåga (för jonkromatografi), ytterligare skyddssystem (filter, kolonner), etc. Diagrammen visar inte heller manometriska moduler separat. Som regel är dessa enheter inbyggda i pumpenheter. Dessa enheter kan kombinera flera pumpar, en pump med en gradientprogrammerare och en gemensam systemkontroller. Systemets struktur beror på dess konfiguration och varje specifik tillverkare.

En sådan radikal komplikation av det tekniska stödet för den kromatografiska processen leder till uppkomsten av ett antal krav på egenskaperna hos den mobila fasen som är frånvarande i klassisk kolonn- och plankromatografi. Vätskefasen måste vara lämplig för detektering (vara transparent i ett givet område av spektrumet eller ha ett lågt brytningsindex, en viss elektrisk ledningsförmåga eller dielektricitetskonstant, etc.), inert mot materialen i de kromatografiska delarna av kanalen, inte bilda gas bubblor i pumpventilerna och detektorcellen, inte har mekaniska föroreningar.

I vätskekromatografi Många typer av pumpar används. För lågtrycks-LC används ofta peristaltiska pumpar (Fig. 1).

Fig. 1 MasterFlex programmerbar peristaltisk pump.

I HPLC används högtryckspumpar för att säkerställa flödet av den mobila fasen genom kolonnen med de angivna parametrarna.

De viktigaste tekniska egenskaperna hos HPLC-pumpar inkluderar: flödesområde; maximalt arbetstryck; flödesreproducerbarhet; pulsationsintervall för lösningsmedelstillförsel.

Beroende på typen av lösningsmedelstillförsel kan pumpar ha konstant tillförsel (flöde) och konstant tryck. I grund och botten, under analytiskt arbete, används ett läge med konstant flödeshastighet, och vid fyllning av kolonner används ett läge med konstant tryck.

Baserat på deras funktionsprincip är HPLC-pumpar indelade i: spruta och igen kolven fram- och återgående .

Sprutpumpar

Det huvudsakliga utmärkande kännetecknet för dessa pumpar är den cykliska karaktären av deras drift, och därför utmärker sig kromatograferna i vilka dessa pumpar används också genom deras cykliska drift.

Ris. 2. Grundläggande design av en sprutpump för HPLC.

Ris. 2A. Sprutpump.

Styrenheten BU matar spänning till motor D, som bestämmer hastigheten och rotationsriktningen. Motorns rotation med hjälp av växellådan P omvandlas till rörelsen av kolven P inuti cylindern D. Pumpen arbetar i 2 cykler. Under påfyllningscykeln är ventil K2 stängd, K1 är öppen, lösningsmedlet strömmar från behållaren in i cylinder C. I tillförselläge är ventil K1 stängd, och genom ventil K2 går den mobila fasen in i doseringsanordningen.

Pumpar av denna typ kännetecknas av en nästan fullständig frånvaro av pulsationer i flödet av den mobila fasen under drift.

Nackdelar med pumpen:

a) hög förbrukning av tid och lösningsmedel för tvätt vid byte av lösningsmedel;

b) volymen PF begränsas av sprutans volym, och därför är separationstiden begränsad;

c) suspension av separation medan pumpen fylls;

d) stora dimensioner och vikt samtidigt som högt flöde och tryck säkerställs (en kraftfull motor och en stor kolvkraft med sin stora yta behövs).

Fram- och återgående kolvpumpar.

Ris. 3. Grundläggande design av en kolvpump.

Funktionsprincip.

Motor D, genom växellådan P, sätter kolven P i fram- och återgående rörelse och rör sig i pumpens arbetshuvud. Ventilerna K1 och K2 öppnar när pumpen är i sug- respektive leveransfas. Mängden volymetrisk matning bestäms av tre parametrar: kolvens diameter (vanligtvis 3,13; 5,0; 7,0 mm), dess amplitud (12-18 mm) och frekvens (som beror på motorns och växellådans rotationshastighet).

Pumpar av denna typ ger en konstant volymetrisk tillförsel av den mobila fasen under lång tid. Max drifttryck 300-500 atm, flödeshastighet 0,01-10 ml/min. Volumetrisk matningsrepeterbarhet -0,5 %. Den största nackdelen är att lösningsmedlet tillförs systemet i form av en serie på varandra följande pulser, så det finns tryck- och flödespulseringar (fig. 4). Detta är huvudorsaken till det ökade bruset och minskade känsligheten hos nästan alla detektorer som används i LC, särskilt elektrokemiska.

Fig.4. Pulsering av kolvpumpen.

Sätt att hantera pulsationer.

1. Applicering av dämpningsanordningar.

Dessa är spiralrör av en speciell profil av rostfritt stål, anslutna i serie eller parallellt med systemet mellan pumpen och dispensern.

Ris. 5. Spiraldämpare.

Spjället lindas av när trycket i det ökar (pumpacceleration). När trycket sjunker, krullar det, dess volym minskar, det pressar ut en del av lösningsmedlet, upprätthåller en konstant flödeshastighet och minskar pulseringar. Detta spjäll fungerar bra vid tryck på 50 atm och över.

Vid ett tryck på 5-30 atm jämnar den ut pulsationer bättre luftspjäll, gjord av en kolonn (fig. 6.). Luften i den dämpade kolonnen (6x200 mm) komprimeras och pulsationerna dämpas. Luften löser sig i den inom 24 timmar.

Ris. 6. Luftspjäll.

2. Tillämpning av elektroniska apparater.

När du använder en elektronisk trycksensor kan du använda sensoravläsningarna för att styra pumpens drift. När trycket sjunker ökar motorvarvtalet och kompenserar för tryckminskningen. Det går även att kompensera för läckor i ventiler och delvis i manschetter. Användningen av en elektronisk dämpare (BPZh-80, KhPZh-1, etc.) gör att du kan minska tryckpulseringar till 1 atm vid ett tryck på 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Jonbyte, jon, jonparkromatografi. Metoderna för jonbyte, jon- och jonparkromatografi är baserade på den dynamiska processen att ersätta joner associerade med den stationära fasen med eluentjoner som kommer in i kolonnen. Huvudmålet med den kromatografiska processen är separationen av oorganiska eller organiska joner av samma tecken. Retention i dessa typer av kromatografi bestäms av förändringen i den fria energin av jonbytesreaktionen. Förhållandet mellan koncentrationer av utbytta joner i lösning och i sorbentfasen kännetecknas av jonbytesjämvikt. Jonbyte är att vissa ämnen (jonbytare), när de är nedsänkta i en elektrolytlösning, absorberar katjoner eller anjoner från den, och frigör i lösningen en motsvarande mängd andra joner med en laddning av samma tecken. Ett utbyte av katjoner sker mellan katjonbytaren och lösningen, och ett utbyte av anjoner sker mellan anjonbytaren och lösningen.

Katjonbytare är oftast speciellt syntetiserade olösliga polymerämnen som i sin struktur innehåller jonogena grupper av sur natur: –SO 3 H; –COOH; -ÅH; -PO3H2; –AsO3H2.

De kemiska formlerna för katjonbytare kan schematiskt avbildas som R-SO3H; R-SO3Na. I det första fallet är katjonbytaren i H-form, i det andra i Na-form. R – polymermatris.

Katjonbytesreaktioner skrivs som vanliga heterogena kemiska reaktioner:

RNA +Na + RNA+H+

Anjonbytare innehåller i sin struktur grundläggande jonogena grupper: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + etc. Deras kemiska formler kan avbildas som RNH 3 OH och RNH 3 Cl eller ROH, RCl. I det första fallet är anjonbytaren i OH-form, i det andra fallet i Cl-form. Anjonbytesreaktionen kan skrivas på följande sätt:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Amfotära jonbytare är kända som innehåller både sura och basiska grupper i sin struktur. Jonbytare som innehåller samma typ (till exempel SO 3 H) sura (basiska) grupper kallas monofunktionella; jonbytare som innehåller olika typer (till exempel SO 3H, OH) sura (basiska) grupper är polyfunktionella.

Monofunktionella jonbytare erhålls genom polymerisationsreaktion. Polykondensationsreaktionen gör det möjligt att erhålla multifunktionella jonbytare. För att de resulterande jonbytarna ska ha tillräckligt höga prestandaegenskaper måste de vara olösliga, men svälla i det lämpliga lösningsmedlet och ha ett tillräckligt stort antal jonogena grupper som kan utbyta med jonogena grupper i det analyserade provet. Detta kan uppnås om de resulterande polymerkedjorna är tillräckligt grenade och sammanlänkade med varandra genom tvärbindande bryggor. Till exempel, vid framställning av katjonbytare av polymerisationstyp baserade på styren, används oftast divinylbensen som tvärbindningsmedel, vars införande i en mängd på upp till 16 % säkerställer produktionen av jonbytare med varierande grad av svällning och gör det därför möjligt att reglera porositeten hos jonbytaren. Graden av svällning av jonbytaren, uttryckt i milliliter/gram, är volymen av 1 g lufttorr jonbytare packad i en kolonn.

Jonbytaren absorberar som regel en av motjonerna - joner som finns i den mobila fasen, dvs den uppvisar en viss selektivitet. Affinitetsserien, eller selektiviteten, för joner med avseende på olika typer av jonbytare har experimentellt fastställts. Till exempel, vid låga lösningskoncentrationer på starkt sura katjonbytare, sorberas joner med samma laddning i följande sekvens:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

För joner med olika laddningar ökar sorptionen med ökande laddning:

Na+ Ca 2+

Ändring av förhållandena för jonbytesreaktionen kan emellertid leda till att serien vänds. Affinitetsserier har även etablerats för anjonbytare. Till exempel ökar sorberbarheten för anjoner på starka grundläggande anjonbytare i följande ordning:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Jonbytare som innehåller starkt sura eller starkt basiska grupper i sin struktur inleder jonbytesreaktioner med alla joner i lösning med laddningar av samma tecken som motjonens tecken. Sådana jonbytare kallas universella.

Processen för jonbyte mellan analyten och jonbytaren kan utföras på ett av tre sätt: statisk, dynamisk (jonbytesfiltermetod) och kromatografisk.

Statisk metod jonbyte är att ett prov av jonbytaren bringas i kontakt med en viss volym lösning och blandas eller skakas under en viss tid tills jämvikt har upprättats. Detta är en snabb och enkel metod för jonbyte, som används för att koncentrera joner från utspädda lösningar, ta bort onödiga föroreningar, men den säkerställer inte fullständig absorption av joner, eftersom jonbyte är en icke-jämviktsprocess och som ett resultat inte garanterar fullständig separation av joner.

När man utför jonbyte på ett dynamiskt sätt en lösning förs genom kolonnen med jonbytaren, som när den rör sig längs kolonnen kommer i kontakt med nya jonbytargranulat. Denna process ger ett mer fullständigt utbyte än den statiska metoden, eftersom utbytesprodukterna avlägsnas genom flödet av lösning. De kan koncentrera joner från utspädda lösningar och separera joner som skiljer sig mycket i egenskaper, till exempel joner med olika laddningar (separera katjoner från anjoner), men att separera joner med samma laddningstecken är nästan omöjligt. Kvantitativ separation av sådana joner är möjlig endast med upprepad upprepning av sorptions-desorptionselementära handlingar under dynamiska förhållanden, dvs. kromatografisk metod . När man arbetar med denna metod används höga skikt av jonbytare och blandningen som ska separeras införs i detta skikt i en mängd som är betydligt mindre än kolonnens kapacitet, på grund av vilken multipla upprepningar av elementära jonbyteshandlingar säkerställs.

När det gäller analystekniken liknar jonbyteskromatografi molekylär kromatografi och kan utföras med elueringsmedel (framkallande), frontal- och förskjutningsalternativ. Skillnaden mellan molekylär och jonbyteskromatografi är att vid molekylär kromatografi elueras de separerade komponenterna i blandningen från kolonnen med ett rent elueringsmedel, medan vid jonbyteskromatografi används en elektrolytlösning som elueringsmedel. I detta fall bör den utbytta jonen i eluenten sorberas mindre selektivt än någon av jonerna i blandningen som separeras.

Vid utförande av jonbytarkromatografi för utveckling, som används oftast, tvättas först en kolonn fylld med en jonbytare med en elektrolytlösning tills alla dess joner är helt ersatta i jonbytaren av jonerna som finns i eluenten. Därefter införs en liten volym av en lösning av analyten, innehållande de separerade jonerna i en mängd av cirka 1 % av jonbytarkapaciteten, i kolonnen. Därefter tvättas kolonnen med eluentlösningen, välj eluatfraktioner och analysera dem.

En blandning av Cl – , Br – , J – joner kan separeras på en mycket basisk anjonbytare (tvärbunden polystyren innehållande grupper av kvartära ammoniumbaser – N (CH 3) 3 +), till exempel AB-17, som har en serie av selektivitet (selektivitet): NO 3 – Cl – Br – J – . Som ett resultat används en NaNO3-lösning som elueringsmedel. Först leds denna lösning genom jonbytaren tills den är helt mättad med NO 3 – joner. När blandningen som ska separeras införs i kolonnen, absorberas Cl – , Br – , J – jonerna av anjonbytaren och ersätter NO 3 – joner. När kolonnen därefter tvättas med en NaNO 3 -lösning ersätts Cl – , Br – , J – jonerna i de övre skikten av anjonbytaren gradvis igen med NO 3 – joner. Cl – joner kommer att förskjutas snabbast, och J – joner kommer att stanna kvar i kolumnen längst. Skillnaden i jonbytarens selektivitet till blandningens joner leder till bildandet av separata zoner av sorberade Cl – , Br – och J – joner i kolonnen, som rör sig längs kolonnen med olika hastigheter. När du rör dig längs kolumnen ökar avståndet mellan zonerna. I varje zon finns endast en av anjonerna i blandningen som separeras och elueringsanjonen, i intervallet mellan zonerna finns endast elueringsanjonen. Således kommer fraktioner att uppträda i eluenten vid utloppet av kolonnen, vilka innehåller individuella komponenter av blandningen som separeras.

För att lösa praktiska problem varieras villkoren för jonseparation genom att välja en lämplig mobil fas (sammansättning, koncentration, pH, jonstyrka) eller ändra porositeten hos polymermatrisen i jonbytaren, dvs antalet mellankedjebindningar i matris, och skapa jonbytessiktar som är permeabla för vissa joner och kapabla att byta ut dem och ogenomträngliga för andra. Det är också möjligt att ändra arten och det relativa arrangemanget av jonogena grupper, samt erhålla sorbenter som kan selektiva kemiska reaktioner på grund av komplexbildning. Till exempel har komplexbildande jonbytare innehållande i sin struktur kelatbildande grupper av organiska reagens dimetylglyoxim, ditizon, 8-hydroxikinolin, etc., såväl som kronetrar, hög selektivitet.

Den största användningen inom jonbytes-, jon- och jonparkromatografi finns i syntetiska makro- och mikromesh organiska jonbytare med stor utbyteskapacitet (3–7 mmol/g), samt oorganiska jonbytarmaterial. Micromesh-jonbytare kan byta joner endast i svällt tillstånd, medan makromesh-jonbytare endast kan byta joner i svällt och osvällt tillstånd. En annan strukturell typ av jonbytare är jonbytare med ytfilm, vars fasta kärna är gjord av en icke-porös sampolymer av styren och divinylbensen, glas eller kiselgel och är omgiven av en tunn film av jonbytare. Den totala diametern för en sådan partikel är cirka 40 µm, tjockleken på jonbytarfilmen är 1 µm. Nackdelen med sådana jonbytare är den relativt stora partikeldiametern och den låga utbyteskapaciteten på grund av den låga specifika ytan, som ett resultat av vilket det är nödvändigt att arbeta med små prover och följaktligen använda mycket känsliga detektorer. Dessutom förgiftas sådana jonbytare snabbt och kan inte regenereras.

Vid högpresterande jonbyte och jonkromatografi, volumetriska porösa polystyrenjonbytare, volumetriska porösa kiseldioxider med en granuldiameter på cirka 10 mikron, samt praktiskt taget icke-svällande ytporösa och ytmodifierade sampolymerer av styren och divinylbensen med jonogen sulfo - och aminogrupper används.

Vid jonparkromatografi används "borste"-sorbenter - kiselgeler med ympade omvända faser C 2, C 8, C 18, som lätt omvandlas till en katjonbytare vid absorption av joniska ytaktiva ämnen från den mobila fasen, till exempel alkylsulfater eller salter av kvartära ammoniumbaser.

Vid utförande av kromatografisk separation med jonbytare används oftast vattenhaltiga lösningar av salter som den mobila fasen. Detta beror på det faktum att vatten har utmärkta lösande och joniserande egenskaper, på grund av vilka molekylerna i det analyserade provet omedelbart dissocierar till joner, jonbytargrupperna i jonbytaren hydratiseras och omvandlas också till en helt eller delvis dissocierad form. Detta säkerställer ett snabbt utbyte av motjoner. Elueringsstyrkan för den mobila fasen påverkas huvudsakligen av pH, jonstyrka, buffertlösningens natur och innehållet av organiskt lösningsmedel eller ytaktivt ämne (jonparkromatografi).

pH-värdet väljs beroende på arten av de jonogena grupperna, de separerade jonerna och matrisen. Man kan arbeta med starkt sura och starkt basiska jonbytare vid pH = 2–12, med svagt sura vid pH = 5–12, med svagt basiska vid pH = 2–6. Kiseldioxidbaserade sorbenter kan inte användas vid pH 9. Den mobila fasens jonstyrka påverkar jonbytarens kapacitet. När jonstyrkan ökar, minskar vanligtvis sorptionen av joner, eftersom elueringskraften för den mobila fasen ökar. Därför bör den mobila fasen i början av separationen ha en låg jonstyrka (0,05–0,1), och slutvärdet för denna egenskap bör inte överstiga 2. Vid gradienteluering används ofta buffertar med ökande jonstyrka.

För selektiv eluering av joner som absorberas av en jonbytare kan man använda vatten, buffertlösningar (fosfat, acetat, borat, hydrokarbonat, etc.) med ett visst pH-värde och jonstyrka, minerallösningar (salt, kväve, svavel, fosfor) och organiska (fenol, citronsyra, mjölksyra, vinsyra, oxalsyra, EDTA) syror. Valet av elueringsmedel underlättas av det faktum att de begränsande fördelningskoefficienterna för de flesta grundämnen mellan vattenhaltiga (vattenhaltiga-organiska) lösningar av många komplexmedel och jonbytare av standardtyp bestäms och presenteras i tabeller.

1.6.4. Storleksuteslutningskromatografi. Storleksexklusionskromatografi är en typ av vätskekromatografi där separationen av komponenter baseras på fördelningen av molekyler enligt deras storlek mellan lösningsmedlet som finns i sorbentens porer och lösningsmedlet som strömmar mellan dess partiklar. Under separationsprocessen kommer små molekyler in i polymernätverket, i vars porer lösningsmedlet fungerar som en stationär fas, och hålls kvar där. Stora molekyler kan inte penetrera polymernätverket och tvättas ut ur kolonnen av den mobila fasen. De största molekylerna elueras först, sedan de medelstora och slutligen de små.

Storleksexklusionskromatografi är uppdelad i gelpermeation och gelfiltrering. Vid gelpermeationskromatografi sker separation på polymerer som sväller i organiska lösningsmedel. Gelfiltreringsversion av storleksexklusionskromatografi involverar användning av polymerer som sväller i vatten som stationära faser.

Varaktigheten av retentionen av komponenterna i det analyserade provet i storleksexklusionskolonnen beror på storleken på deras molekyler och diffusion in i sorbentens porer, såväl som på den stationära fasens porstorlek.

I denna typ av vätskekromatografi, fördelningskoefficienten D för de minsta molekylerna i det analyserade provet, som rör sig i den kromatografiska kolonnen med lägsta hastighet och tränger in i det stationära fasnätverket, är det lika med 1, eftersom den mobila fasen och lösningsmedlet i den stationära fasens porer har samma sammansättning. I detta fall tar den grundläggande ekvationen för kolonnkromatografi formen

Stora molekyler som inte passar in i den stationära fasens porer eluerar från kolonnen tillsammans med den mobila fasen. För dem D= 0,a V R =V m. Detta intervall av värden för distributionskoefficient (från 0 till 1) är typiskt endast för.

Alla molekyler av flerkomponentämnet som analyseras bör tvättas ut ur kolonnen genom att en liten volym lösningsmedel passerar från V m innan V m +V s och separationen slutar innan lösningsmedelstoppen frigörs. Därför är det i denna typ av kromatografi nödvändigt att använda ganska långa kolonner med en stor fri volym V m och ett stort antal porer i sorbenten.

Upplösningen av kromatografiska toppar i storleksexklusionsseparationer kan förbättras genom att använda gradienteluering med blandade lösningsmedel.

Varje sorbent som används vid storleksexklusionskromatografi kännetecknas av en viss porvolym och har därför ett visst område med separerbara molekylvikter och en viss kalibreringskurva. I detta fall har kalibreringsdiagrammet som kännetecknar beroendet av den kvarhållna volymen på molekylvikten eller molekylstorleken som regel ett komplext utseende.

Stationära faser i storleksexklusionskromatografi väljs baserat på specifika analytiska uppgifter. Inledningsvis fastställs vilket lösningsmedelssystem som kan användas för analys (vattenhaltigt eller vattenhaltigt-organiskt). Beroende på detta bestäms typen av sorbent. Om det är nödvändigt att separera vattenlösliga prover används till exempel vattensvällbara tvärbundna dextraner (Sephadex) eller polyakrylamider (Biogel R) som stationära faser. Separationen av ämnen som är lösliga i organiska lösningsmedel kan utföras på polystyrener med varierande grad av tvärbindning, svällning i organiska lösningsmedel (styrogel, poragel, biobid C). Sådana svällda geler är typiskt tryckinstabila och tillåter mycket låga flödeshastigheter för mobil fas, vilket ökar analystiden. För att utföra en mycket effektiv version av storleksexklusionskromatografi är det nödvändigt att använda stationära faser med styva matriser - silikageler, vars nackdel - hög adsorptionsaktivitet - elimineras genom silanisering av ytan eller val av en eluent som matchar polaritet.

Ämnen som kan användas som mobila faser i är:

- lös upp det analyserade provet fullständigt;

 blöt sorbenten väl;

- motverka adsorptionen av provkomponenter på sorbenten;

 har låg viskositet och toxicitet.

1.6.5. Plankromatografi. Plankromatografi inkluderar tunnskiktskromatografi och papperskromatografi. Dessa typer av vätskekromatografi är enkla i tekniken, snabba och kräver ingen dyr utrustning, vilket är deras obestridliga fördel.

Separationen av en blandning av substanser med dessa metoder kan utföras med användning av olika kromatografiska system. Därför särskiljs adsorption, distribution, normal- och omvänd fas, jonbyte, etc. pappers- och tunnskiktskromatografi. För närvarande används tunnskiktskromatografi mest.

Pappers- och tunnskiktskromatografi liknar tekniken. Cellulosafiber av papper används som en stationär fas i papperskromatografi, vid tunnskiktskromatografi appliceras olika sorbenter (Al 2 O 3, silikagel, etc.) i ett enhetligt tunt (100–300 μm) skikt på ett glas, metall eller plastsubstrat (bärare) . Det adsorberande skiktet på bäraren kan vara fäst eller inte.

Kromatografisk separation i plana metoder, såväl som på en kolonn, beror på överföringen av komponenterna i analyten av den mobila fasen längs det stationära fasskiktet med olika hastigheter i enlighet med fördelningskoefficienterna för de ämnen som separeras. I båda fallen används kromatografiska system: flytande - fast sorbent (adsorptionsseparationsmekanism), flytande - flytande - fast bärare (distribution, jonbyte och andra mekanismer).

Olika lösningsmedel eller blandningar därav, organiska eller oorganiska syror används som mobila faser.

Den praktiska framställningen av plana kromatogram är som följer.

På en remsa av kromatografiskt papper eller på ett tunt lager av sorbent, markera en startlinje med en penna på ett avstånd av 1 cm från den nedre kanten av remsan eller plattan. Använd en mikropipett och applicera provet på startlinjen i form av en fläck med en diameter på högst 2–3 mm. Kanten på remsan eller plattan sänks sedan ner i ett kärl innehållande den mobila fasen placerad i en förseglad kammare. När den mobila fasen stiger längs remsan eller plattan och multipla elementära handlingar av sorption-desorption, fördelning mellan två vätskefaser, jonbyte etc., som är vanliga vid kromatografi, inträffar, separeras komponenterna i den analyserade blandningen. Processen fortsätter vanligtvis tills lösningsmedlet passerar från startlinjen 10 cm.. Därefter avlägsnas remsan eller plattan från kammaren och torkas. Om komponenterna i analyten är färgade ger de motsvarande färgade fläckar på kromatogrammet. För att detektera ofärgade komponenter i analyten måste kromatogrammet utvecklas. Utvecklingen av ett kromatogram och detekteringen av provkomponenter kan utföras med olika metoder och beror på sammansättningen av de analyserade blandningarna. Manifestation kan utföras:

- med UV-belysning. Metoden är tillämpbar för detektering av ämnen som kan avge sin egen strålning (luminescera) i det synliga våglängdsområdet under påverkan av UV-strålning;

- genom att utveckla reagenser. Till exempel kan närvaron av aminosyror i den analyserade blandningen detekteras med användning av ninhydrin. Det torkade kromatogrammet nedsänks i en 0,2% lösning av ninhydrin i aceton och torkas sedan. Fläckar som motsvarar olika komponenter i blandningen får en visuell och, som regel, färg specifik för varje ämne;

- använder jod. I detta fall införs det detekterade kromatogrammet i ett kärl på botten av vilket det finns jodkristaller. Jodånga absorberas starkare på fläckarna, vilket gör fläckarna synliga. Jod är ett ospecifikt framkallareagens. Med hjälp av specifika reagens är det möjligt att inte bara bestämma antalet komponenter i blandningen, utan också att identifiera de separerade ämnena med färgen på fläckarna.

Pappers- och tunnskiktskromatografi utförs oftast i den så kallade stigande versionen som beskrivs ovan. Ganska ofta, för att förbättra kvaliteten på kromatogram, är det nödvändigt att använda mer komplexa varianter av plan kromatografi, till exempel fallande, cirkulär, tvådimensionell. När du utför fallande pappers- eller tunnskiktskromatografi appliceras analyten på startlinjen på en platta eller pappersremsa som är placerad på toppen, och eluenten tillförs inte underifrån utan ovanifrån. Den positiva effekten av att förbättra separationen beror på komponenternas tyngdkraftsbidrag till separationsprocessen.

Både stigande och fallande kromatografi kan utföras i en- och tvådimensionella versioner. I motsats till den endimensionella flatbäddsseparationsprocessen som beskrivs ovan separeras vid tvådimensionell kromatografisk separation provet som ska analyseras först i ett lösningsmedel, separeras sedan i en riktning vinkelrät mot det första med ett annat lösningsmedel, varvid det första kromatogrammet roteras vid 90 oC.

När man utför cirkulär kromatografi appliceras analyten som en droppe i mitten av en platta eller ett ark kromatografipapper. Ett eller flera lösningsmedel tillsätts också droppvis här. Detta resulterar i att det resulterande kromatogrammet är en uppsättning radiella fläckar.

Placeringen av fläckarna (zonerna) som bildar de separerade komponenterna i analyten på ett platt kromatogram kännetecknas av den relativa rörelsehastigheten för komponenterna i ett tunt lager R fi. Experimentellt värdet R fi definieras som förhållandet mellan avståndet L i passerade i-te komponenten, till avståndet L som passeras av lösningsmedlet från startlinjen till frontlinjen (Fig. 1.10):

Magnitud R fi beror på arten av motsvarande komponent i det analyserade provet, arten av den stationära fasen, dess tjocklek, arten och kvaliteten på den mobila fasen, metoden för att applicera provet och andra faktorer, men alltid R fi 1.

Magnitud R fiär faktiskt identisk med retentionstiden för ett ämne eller dess retentionsvolym, vilket kännetecknar hastigheten för ett ämnes passage genom en kromatografisk kolonn, och kan användas för kvalitativ identifiering av komponenterna i det analyserade provet och fläckens diameter är identisk med höjden eller arean av den kromatografiska toppen och återspeglar därför i viss mån det kvantitativa innehållet i ämnet.

I det enklaste fallet kan den kvantitativa bestämningen av sammansättningen av det analyserade provet bedömas visuellt genom intensiteten av fläckarnas egen färg eller intensiteten av den fluorescerande glöden hos de resulterande fläckarna under UV-detektion. För dessa ändamål används eluering av kromatografiska fläckar i stor utsträckning. I detta fall skärs den fläck som erhållits på kromatogrammet försiktigt ut eller skrapas bort, behandlas med ett lämpligt lösningsmedel och den resulterande lösningen undersöks med lämplig fysikalisk-kemisk metod. Du kan också använda viktmetoden, där motsvarande fläck skärs ut från kromatogrammet och vägs. Mängden av ett ämne bestäms av skillnaden i vikten av rent papper med samma yta och papper med ämnet.

Papper (BH ) Och tunnskiktskromatografi (TLC ) enligt separationsmekanismen tillhör partitionskromatografi . I BH-metoden är bäraren en speciell kromatografipapper med vissa egenskaper. Stationär fas vatten adsorberas på papperets yta och porer (upp till 20%), mobil är ett organiskt lösningsmedel, blandbart eller oblandbart med vatten, vatten eller elektrolytlösningar.

Mekanism På pappret är det ganska komplicerat. I den stationära fasen kan ett ämne kvarhållas inte bara på grund av upplösning i vatten adsorberat av papper, utan också adsorbera direkt från cellulosa. Tryckt på papper delade komponenter passera in i den mobila fasen och röra sig genom papperets kapillärer med olika hastigheter i enlighet med gränssnittsfördelningskoefficient varje. I början kromatografi en del av substansen från papperet går in i mobil fas och gå vidare. När det organiska lösningsmedlet når en del av papperet som inte innehåller det lösta ämnet, inträffar det igen. omfördelning : från den organiska fasen går ämnet över i vattenfasen, sorberat på papper. Eftersom komponenterna har olika affinitet för sorbenten , när eluenten rör sig sker separation: vissa ämnen behålls i början av banan, andra rör sig längre. Här kombineras de termodynamisk (etablerar en jämviktsfördelning av ämnen mellan faser) och kinetisk (förflyttning av komponenter i olika hastigheter) aspekter av separation. Som ett resultat är varje komponent koncentrerad till ett specifikt område av pappersarket: zoner av enskilda komponenter på kromatogram . Användningen av kromatografi på papper har ett antal betydande nackdelar: separationsprocessens beroende av papperets sammansättning och egenskaper, förändringar i vattenhalten i papperets porer när lagringsförhållandena ändras, en mycket låg kromatografihastighet ( upp till flera dagar) och låg reproducerbarhet av resultaten. Dessa brister påverkar allvarligt spridningen av papperskromatografi som kromatografisk metod.

I TLC-metod processen att separera en blandning av ämnen utförs i ett tunt skikt sorbent avsatt på ett inert fast substrat, och tillhandahålls genom rörelse mobil fas (lösningsmedel) genom sorbenten under påverkan kapillärkrafter . Förbiseparationsmekanism skilja fördelnings-, adsorptions- och jonbyteskromatografi . Separationen av komponenter sker i dessa fall antingen som ett resultat av deras olika fördelningskoefficient mellan de två vätskefaserna ( partitionskromatografi ), eller på grund av olika adsorberbarhet av föreningar av sorbenten ( adsorptionskromatografi ). Adsorptionsmetoden bygger på varierande grader av sorption-desorption av de separerade komponenterna på den stationära fasen. Adsorption utförs på bekostnad av van der Waals styrkor , som är grunden fysisk adsorption , polymolekylär (bildning av flera lager av adsorbat på ytan av adsorbenten) och kemisorption (kemisk interaktion mellan adsorbent och adsorbat).

I fallet med användning av sådana sorbenter för TLC som aluminiumoxid eller silikagel spela en roll i separationen distribution , alltså adsorption på den utvecklade aktiva ytan av sorbenten (150–750 m 2 /g). Distribution komponenter i blandningen förekommer mellan vatten på ytan av bäraren (t.ex adsorbenter , Hur aluminiumoxid , stärkelse , cellulosa , kiselgur - Och vatten form stationär fas ), och lösningsmedlet som rör sig genom denna stationära fas ( mobil fas ). Den komponent i blandningen som är mer löslig i vatten rör sig långsammare än den som är mer löslig i den mobila fasen.

Adsorption yttrar sig i att mellan bärare t.ex. aluminiumoxid, och komponenterna i blandningen etableras adsorptionsjämvikter – varje komponent har sin egen, resultatet av detta är olika rörelsehastigheter komponenter i blandningen. Två extremfall kan särskiljas:

a) koncentrationen av ämnet på adsorbenten är noll. Ämnet löses helt upp i den mobila fasen och förs bort av det (rör sig med lösningsmedelsfront ).

b) ämnet är fullständigt adsorberat, interagerar inte med lösningsmedlet och förblir i början.

I praktiken med skickligt urval av lösningsmedel och adsorbent distribution föreningar finns mellan dessa extrema fall och ämnet gradvis överförd från ett sorbentskikt till ett annat på grund av samtidigt förekommande processer sorption Och desorption .

Lösningsmedlet som passerar genom sorbenten kallas elueringsmedel , processen att flytta ett ämne tillsammans med eluenten  eluering . När vätskan rör sig längs plattan separeras blandningen av ämnen på grund av krafternas inverkan adsorption , distribution , jonbytare eller kombinationen av alla dessa faktorer. Som ett resultat, separera kromatografiska zoner komponenter i blandningen, dvs. det visar sig kromatogram .

Rätt val sorbent Och elueringsmedel bestämmer effektiviteten av blandningsseparationen. Testämnets rörlighet beror på dess affinitet för sorbenten och elueringskraft (polaritet) hos elueringsmedlet. När polariteten hos en förening ökar, ökar också dess affinitet för den polära sorbenten. Genom att öka graden av adsorption silikagel organiska föreningar är ordnade i en rad: kolväten<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь för silikagel eluenter kan ordnas i ordning med ökande "polaritet" ( elueringskapacitet ) och bildar en serie lösningsmedel ( eluotropisk serie ) i enlighet med experimentella data: alkaner>bensen>kloroform>dietyleter>etylacetat>C2-C4-alkoholer>vatten>aceton>ättiksyra>metanol. Således är den polära föreningen, alkohol, ganska starkt adsorberad på silikagel och rör sig därför svagt under inverkan av ett opolärt lösningsmedel såsom hexan, och förblir nära startlinjen. I sin tur är det opolära aromatiska kolvätet bifenyl märkbart mer rörligt i hexan, men även här för att uppnå R f ca 0,5 krävs ett mer polärt aprotiskt elueringsmedel - metylenklorid. Eluentstyrka reglera med hjälp av blandningar av lösningsmedel som är angränsande eluotropisk serie med olika polaritet.

För närvarande används följande huvudsakligen i TLC: sorbenter : för division lipofila ämnen  silikagel , aluminiumoxid , acetylerad cellulosa , polyamider ; för separation hydrofila ämnen  cellulosa , cellulosajonbytare , kiselgur , polyamider . Den viktigaste egenskapen hos sorbenten är dess aktivitet , dvs. förmåga sorb (hålla) komponenterna i blandningen som ska separeras. Utomlands producerar ett antal företag silikagel , kiselgur Och aluminiumoxid med tillsats av 5% gips, som används för att säkra det absorberande skiktet vid tillverkning av plattor självständigt.

Den vanligaste sorbenten är silikagel - hydratiserad kiselsyra, bildad genom inverkan av mineralsyror på Na 2 SiO 3 och torkning av den resulterande solen. Efter malning av solen används en bråkdel av en viss kornstorlek (anges på plattan, vanligtvis 5-20 mikron). Silikagel är polär sorbent med OH-grupper som aktiva centra. Det absorberar lätt vatten på ytan och bildar vätebindningar.

Aluminiumoxid är en svagt basisk adsorbent och används främst för separation av svagt basiska och neutrala föreningar. Nackdelen med aluminiumoxidplattor är den obligatoriska aktiveringen av ytan före användning i en ugn vid höga temperaturer (100-150 o C) och den låga adsorptionskapaciteten hos skiktet jämfört med silikagel.

Kiselgur - adsorbent erhållet från naturliga mineraler - kiselgur. Absorbenten har hydrofila egenskaper och en lägre adsorptionskapacitet hos skiktet jämfört med silikagel.

Cellulosa: tunnskiktsplattor belagda med cellulosa är mycket effektiva för att separera komplexa organiska molekyler. Adsorbenten består huvudsakligen av cellulosakulor med en diameter på upp till 50 mikron, fixerade på en bärare med stärkelse. Liksom vid papperskromatografi sker ökningen av lösningsmedelsfronten mycket långsamt.

Kromatografisk analys utförs på industriplåtar tillverkade i Tjeckien " Silufol » (« Silufol ") gjord av aluminiumfolie, ibland förstärkt med kartong, och " Siluplast » tillverkad av plast, belagd med ett skikt av sorbenter - kiselgel LS 5-40 med stärkelse eller gips som bindemedel (upp till 10%), eller aluminiumoxid med och utan tillsats av fluorescerande indikatorer. Rekord" Silufol » har en hög elueringshastighet, men kännetecknas av låg separationsförmåga och låg känslighet. Under lagring är de känsliga för förhållanden (fuktighet, temperatur, aggressiva miljöer etc.). Vissa företag levererar kromatografiplattor med ett skikt av sorbent av varierande (vanligtvis upp till 0,25 mm), men strikt konstant tjocklek (kiselgel, cellulosa, jonbytarharts), på glas och substrat gjorda av aluminiumfolie, plast, impregnerad glasfiber.

Tallrikar « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) tillverkas i Ryssland på en polymerbas (polyetentereftalat, klass P) eller ett aluminiumsubstrat (kvalitet AF) med ett applicerat arbetsskikt mikrofraktionerad silikagelsorbent kvaliteterna STX-1A och STX-1VE (tillverkade i USSR som fraktionerad kiselgel KSKG) med en tjocklek på 90-120 mikron (upp till 200 mikron), fixerad med ett speciellt bindemedel - silikasol . När man använder kiselsyrasol (silica sol) som bindemedel, som efter uppvärmning förvandlas till kiselgel, består de resulterande TLC-plattorna av två komponenter: ett kiselgelskikt och ett substrat. Jämnheten för tjockleken av det absorberande skiktet på en platta är ±5 µm. Exempel på beteckning: "Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)" - högpresterande TLC-plattor på ett aluminiumsubstrat, med en fosfor, 10x10 cm.

Om du använder ett glassubstrat (grad C) är sådana plattor återanvändbara och kemiskt resistenta. Deras kemiska beständighet bestäms av kiselgelens kemiska beständighet. Som ett resultat kan TLC-plattor behandlas upprepade gånger med aggressiva reagens, till exempel en het kromblandning, vilket tar bort restriktioner för användningen av korrelerande reagenser för att detektera fläckar och modifiera sorbenten, och tillåter upprepade (upp till 30 gånger eller mer) ) regenerering av plattorna med en kromblandning. Glasskivor kan skäras till önskade storlekar. Den mekaniska hållfastheten hos det absorberande skiktet kan justeras, vilket ger å ena sidan transport och upprepad bearbetning av plattorna och, å andra sidan, möjligheten att extrahera adsorbentskikt med separerade ämnen för efterföljande urlakning av enskilda föreningar från sorbent och deras vidare studier med instrumentella metoder (IR- och UV-spektrometri, röntgenstrukturmetoder, NMR, etc.).

Plattorna skiljer sig åt i storleken på fraktionerna (partikelfördelningen) av silikagelen som utgör lagret. På analytiska plattor (grad A) är fraktionen 5-17 mikron, på högpresterande plattor (grad B) - 8-12 mikron. En smalare fördelning ökar effektiviteten på plattorna, d.v.s. fläckarna av de separerade ämnena blir mer kompakta (mindre i storlek) och separeras därför bättre när elueringsfronten passerar en kortare sträcka. På ryska wafers skiljer sig inte de analytiska och högpresterande lagren särskilt mycket, till skillnad från wafers från Merck (Tyskland). Högeffektiva plattor bör användas om ämnen inte kan separeras på analysplattorna. Plattor av alla modifieringar produceras med fosfor (UV-kvalitet) med excitation 254 nm. Hållbarheten är obegränsad, tallrikar" Sorbfil » brett testade i analys av aminosyraderivat, bekämpningsmedel, lipider, antibiotika.

TLC-metoden utförs kvalitetsidentifiering komponenter. kvantifiering för TLC är också möjligt, detta kräver att man applicerar den exakta mängden ämne och ytterligare densitometriska studier med en tydlig registrering av fläckarnas intensitet. Det vanligaste är semikvantitativ metod . Det baseras på visuell jämförelse storleken och intensiteten av en fläck av en komponent med motsvarande egenskaper hos en serie fläckar av samma ämne i olika koncentrationer ( standardreferenslösningar ). När man använder ett prov i en mängd av 1-5 μg, säkerställer denna enkla metod en noggrannhet vid bestämning av komponentinnehållet på ca 5-10%. För att bestämma komponenterna i ett prov är det ofta nödvändigt att utföra provberedning för att erhålla en blandning som innehåller de analyserade föreningarna. Provberedningen baseras på extraktion av läkemedel från provet med organiska lösningsmedel ( n-hexan, petroleumeter, dietyleter, kloroform), rening av extraktet och efterföljande kromatografi i ett tunt skikt av aluminiumoxid eller silikagel.

Det finns flera alternativ för TLC och HD, som skiljer sig åt lösningsmedelsförsörjning . Beroende på den mobila fasens rörelseriktning finns det:

A)stigande kromatografi - den mobila fasen hälls på botten av separationskammaren, papperet (plattan) placeras vertikalt;

b)fallande kromatografi  den mobila fasen matas uppifrån och rör sig ner längs plåtens eller papperets absorberande skikt;

V)radiell kromatografi  horisontell frammatning av lösningsmedelsfronten: den mobila fasen förs till mitten av pappersskivan (plattan), där blandningen som ska separeras appliceras.

Det vanligaste är eluering uppåt (kromatografi). Främre elueringsmedel medan du rör dig från botten till toppen. Valet av lösningsmedel (mobil fas) bestäms av sorptionsmedlets beskaffenhet och egenskaperna hos de ämnen som separeras.

Kromatografisk separation med BCh och TLC-metoder utförs i separationskammare med ett överlappat lock. Ett kvantitativt mått på överföringshastigheten för ett ämne vid användning av en viss adsorbent och lösningsmedel är R-värde f (från engelska bibehållande faktor – fördröjningskoefficient, denna parameter är analog med retentionstid). Placera zoner av den kromatograferade komponenten ställs in efter storlek koefficient R f , lika med förhållandet mellan rörelsehastigheten för dess zon och rörelsehastigheten för lösningsmedelsfronten. Magnitud R f är alltid mindre än ett och beror inte på kromatogrammets längd. Med beloppet R f påverkas av olika faktorer. Sålunda, vid låga temperaturer, rör sig ämnen långsammare; lösningsmedelskontamination, inhomogenitet hos adsorbenten, främmande joner i den analyserade lösningen kan ändra värdet R f upp till 10 %. I det valda systemet måste analyterna ha olika värden R f och fördelat längs kromatogrammets hela längd. Det är önskvärt att värdena R f var i intervallet 0,05-0,85.

I praktiken värdet R f beräknas som förhållandet mellan avståndet l genomgås av ämnet till avståndet L passerade genom lösningsmedlet:

R f = l/L (6.1 )

Vanligtvis för beräkning välja spot center (Figur 1). Magnitud R f beror på många faktorer: typ kromatografipapper (dess porositet, densitet, tjocklek, hydratiseringsgrad) och sorbent (kornstorlek, beskaffenhet av grupper på ytan, skikttjocklek, dess fuktighet, ämnets beskaffenhet, den mobila fasens sammansättning), experimentella förhållanden (temperatur, kromatografitid etc.). Om alla kromatografiska parametrar är konstanta, värdet R f bestäms endast av de individuella egenskaperna för varje komponent.

Ris. 1. Bestämning av värden på kromatogrammet Rf för komponenter A Och I,

graden av deras separation Rs och antalet teoretiska plattor N .

Effektiviteten hos HD och TLC beror också på selektivitet och känslighet reaktioner som används för att detektera komponenterna i den analyserade blandningen. Vanligtvis används reagens som bildar färgade föreningar - framkallare - med komponenterna som bestäms. För mer pålitlig identifiering av delade komponenter tillämpa " vittnen » lösningar standardämnen (i samma lösningsmedel som provet), vars närvaro förväntas i provet. Standardämne appliceras på startlinjen bredvid det analyserade provet och kromatograferas under samma förhållanden. I praktiken används ofta ett relativt värde:

R f rel = R f x / R f stå (6.2)

Var R f stå beräknas också med formeln (6.1). Effektivitet kromatografisk separation karakterisera antal motsvarande teoretiska plattor och dem höjd . Således, i TLC-metoden antalet ekvivalenta teoretiska plattor N A för komponent A blandningen som ska separeras beräknas med formeln:

N A = 16 (l O.A. / a (A )) 2 (6.3)

Värderingar l O.A. Och A (A ) bestäms enligt fig. 6.1. Sedan höjden på motsvarande teoretiska plåt N A är:

H A = l O.A. /N = a (A ) 2 / 16 l O.A. . (6.4)

Separation är praktiskt möjlig om R f (A)  R f (I)  0,1 .

Att karakterisera separationen av två komponenter A Och I använda sig av grad (kriterium) av separation Rs :

Rs =  l/ (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l/ (a (A) + a (B)) (6.5)

Var  l  avstånd mellan komponentens spotcenter A Och I;

A (A) Och A (I)  punktdiametrar A Och I på kromatogrammet (fig. 6.1). Ju mer Rs , desto tydligare är komponentfläckarna separerade A Och I på kromatogrammet. Betingelser kromatografi valt så att värdet Rs skiljde sig från noll och ett, det optimala värdet Rs är 0,3  0,7. För kurs separationsselektivitet två komponenter A Och I använda sig av separationsfaktor α :

α = l B / l A (6.6)

Om α = 1, då komponenterna A Och Iär inte åtskilda.

HPLC-metoden används ofta inom områden som kemi, petrokemi, biologi, bioteknik, medicin, livsmedelsindustri, miljöskydd, läkemedelsproduktion och många andra.

Enligt mekanismen för separation av de analyserade eller separerade substanserna är HPLC uppdelad i adsorption, distribution, jonbyte, uteslutning, ligandutbyte och andra.

Normalfas HPLC

Den stationära fasen är mer polär än den mobila fasen, därför dominerar det opolära lösningsmedlet i eluenten:

Hexan:isopropanol = 95:5 (för ämnen med låg polaritet)
Kloroform:metanol = 95:5 (för medelpolära ämnen)
Kloroform:metanol = 80:20 (för högpolära ämnen)

Omvänd fas HPLC

Vanliga eluenter för omvänd fas HPLC är:

Acetonitril: vatten
Metanol:vatten
Isopropanol: vatten

Matriser för HPLC

Huvudegenskaper hos matrisen:

Partikelstorlek (µm);
Inre porstorlek (Å, nm).

Beredning av silikagel för HPLC:

Gjutning av polykiselsyramikrosfärer;
Torkning av kiselgelpartiklar;
Luftseparering.

Sorbentpartiklar:

Vanlig (sfärisk): högre tryckmotstånd, högre kostnad;
Icke-sfärisk: lägre tryckmotstånd.

Vaccinationer i stationär fas

Normalfas HPLC:

Stationär fas med propylnitril ympning (nitril);
Stationär fas med propylaminympning (amin).

Omvänd fas HPLC:

Stationär fas med alkylympning;
Stationär fas med alkylsilylympning.

Detektorer för HPLC

UV
Diodmatris
Fluorescerande
Elektrokemisk
Refraktometrisk
Massselektiv

Länkar

Wikimedia Foundation. 2010.

Kromatografi
Fördelningskromatografi

Se vad "" är i andra ordböcker:

högpresterande vätskekromatografi- - [A.S. Goldberg. Engelsk-rysk energiordbok. 2006] Ämnen: energi i allmänhet EN högpresterande vätskekromatografi HPLC ... Teknisk översättarguide

högpresterande vätskekromatografi- Termen high performance liquid chromatography Termen på engelska high performance liquid chromatography Synonymer Förkortningar HPLC, HPLC Relaterade termer adsorption, oligopeptid, proteomics, sorbent, fulleren, endohedral, chromatography... ...

HÖGPRESTANDA VÄTSKAKROMATOGRAFI- Vätskekromatografi, där lösningsmedlet (elueringsmedlet) under tryck (mer än 3x107 Pa) pumpas genom kolonner fyllda med sorbent med partiklar med liten diameter (upp till 1 μm) för att öka separationseffektiviteten, och perfusionsfilter används också... ...

VÄTSKROMATOGRAFI- en typ av kromatografi där vätskan (eluenten) fungerar som den mobila fasen och den stationära. sorbent, TV en bärare med en vätska eller gel applicerad på dess yta. Utför i en kolonn fylld med sorbent (kolonnkromatografi) på en plan... ... Naturvetenskap. encyklopedisk ordbok

Kromatografi- [κρώμα (υrum) färg] en process baserad på den ojämlika förmågan hos enskilda komponenter i blandningen (flytande eller gasformiga) att stanna kvar på ytan av adsorbenten både när de absorberas från bärarflödet och när ... ... Geologisk uppslagsverk

Kromatografi- (från annan grekisk ... Wikipedia

kromatografi- Termkromatografi Term på engelska kromatografi Synonymer Förkortningar Relaterade termer högpresterande vätskekromatografi, klatrat, laboratorium på ett chip, porometri, proteom, proteomik, sorbent, enzym, fulleren, endohedral... ... Encyclopedic Dictionary of Nanotechnology

JONBYTESKROMATOGRAFI- Vätskekromatografi baserad på sönderdelning. separerade joners förmåga att jonbyte med fasta. sorbentjoner bildade som ett resultat av dissociation av de senares jonogena grupper. Katjonbytare används för att separera katjoner, för... ... Kemiskt uppslagsverk

HPLC- högpresterande vätskekromatografi... Ordbok för ryska förkortningar

HPLC– Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en av de effektiva metoderna för att separera komplexa blandningar av ämnen, flitigt använt både inom analytisk kemi och kemisk teknik. Grunden för kromatografisk separation är deltagandet ... Wikipedia

Böcker

Praktisk högpresterande vätskekromatografi, Veronica R. Mayer. Vi presenterar för läsaren den 5:e upplagan av boken, som har utökats med moderna metoder och utrustning. Mycket har förbättrats i boken och ett stort antal referenser har tillkommit. De ställen i texten där...

Vid högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är karaktären hos de processer som sker i den kromatografiska kolonnen i allmänhet identiska med processerna vid gaskromatografi. Den enda skillnaden är i användningen av vätska som en stationär fas. På grund av den höga densiteten av flytande mobila faser och det höga motståndet hos kolonner, skiljer sig gas- och vätskekromatografi kraftigt i instrumenteringen.

I HPLC används vanligtvis rena lösningsmedel eller blandningar därav som mobila faser.

För att skapa en ström av rent lösningsmedel (eller blandningar av lösningsmedel), som kallas ett elueringsmedel i vätskekromatografi, används pumpar som ingår i kromatografens hydraulsystem.

Adsorptionskromatografi utförs som ett resultat av interaktionen av ett ämne med adsorbenter, såsom silikagel eller aluminiumoxid, som har aktiva centra på ytan. Skillnaden i förmåga att interagera med adsorptionscentra för olika provmolekyler leder till att de separeras i zoner under rörelse med den mobila fasen längs kolonnen. Den zonseparation av komponenterna som uppnås i detta fall beror på interaktionen med både lösningsmedlet och adsorbenten.

De mest använda i HPLC är silikageladsorbenter med olika volymer, ytareor och pordiametrar. Aluminiumoxid och andra adsorbenter används mycket mindre ofta. Den främsta anledningen till detta:

Otillräcklig mekanisk hållfasthet, som inte tillåter förpackning och användning vid höga tryck som är karakteristiska för HPLC;

kiselgel, jämfört med aluminiumoxid, har ett bredare intervall av porositet, ytarea och pordiameter; Den betydligt större katalytiska aktiviteten hos aluminiumoxid leder till förvrängning av analysresultaten på grund av sönderdelningen av provkomponenter eller deras irreversibla kemisorption.

Detektorer för HPLC

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) används för att detektera polära icke-flyktiga ämnen som av någon anledning inte kan omvandlas till en form som lämpar sig för gaskromatografi, inte ens i form av derivat. Sådana substanser inkluderar i synnerhet sulfonsyror, vattenlösliga färgämnen och vissa bekämpningsmedel, till exempel fenyl-ureaderivat.

Detektorer:

UV-detektor på en diodmatris. En "matris" av fotodioder (mer än tvåhundra av dem) registrerar ständigt signaler i UV och synliga områden av spektrumet, vilket ger inspelning av UV-B-spektra i skanningsläge. Detta gör att du kontinuerligt, med hög känslighet, kan spela in oförvrängda spektra av komponenter som snabbt passerar genom en speciell cell.

Jämfört med detektering av en enda våglängd, som inte ger information om topprenhet, ger möjligheten att jämföra hela spektra av en dioduppsättning en mycket högre grad av tillförlitlighet för identifieringsresultatet.

Fluorescensdetektor. Den stora populariteten för fluorescerande detektorer beror på deras mycket höga selektivitet och känslighet, och det faktum att många miljöföroreningar fluorescerar (t.ex. polyaromatiska kolväten).

En elektrokemisk detektor används för att detektera ämnen som lätt oxideras eller reduceras: fenoler, merkaptaner, aminer, aromatiska nitro- och halogenderivat, aldehyder, ketoner, bensidiner.

Kromatografisk separation av en blandning på en kolonn på grund av den långsamma utvecklingen av PF tar mycket tid. För att påskynda processen utförs kromatografi under tryck. Denna metod kallas högpresterande vätskekromatografi (HPLC)

Modernisering av utrustning som används i klassisk vätskekolonnkromatografi har gjort den till en av de mest lovande och moderna analysmetoderna. Högpresterande vätskekromatografi är en bekväm metod för separation, preparativ isolering och kvalitativ och kvantitativ analys av icke-flyktiga termolabila föreningar med både låg och hög molekylvikt.

Beroende på vilken typ av sorbent som används, använder denna metod 2 kromatografialternativ: på en polär sorbent som använder en opolär eluent (direktfasalternativ) och på en opolär sorbent som använder en polär eluent - den så kallade omvändfas höga -performance vätskekromatografi (RPHPLC).

Under övergången från elueringsmedel till elueringsmedel etableras jämvikt under HPLC-förhållanden många gånger snabbare än under förhållanden med polära sorbenter och icke-vattenhaltiga PF. Som ett resultat av detta, såväl som bekvämligheten med att arbeta med vattenhaltiga och vattenhaltiga alkohol-elueringsmedel, har OFVLC nu vunnit stor popularitet. De flesta HPLC-analyser utförs med denna metod.

Detektorer. Utsignalen från en enskild komponent från kolonnen registreras med hjälp av en detektor. För registrering kan du använda en förändring i vilken analytisk signal som helst som kommer från den mobila fasen och som är associerad med blandningskomponentens natur och kvantitet. Vätskekromatografi använder analytiska signaler som ljusabsorption eller ljusemission av utlösningen (fotometriska och fluorimetriska detektorer), brytningsindex (refraktometriska detektorer), potential och elektrisk konduktivitet (elektrokemiska detektorer) etc.

Den kontinuerligt detekterade signalen spelas in av en brännare. Ett kromatogram är en sekvens av detektorsignaler inspelade på ett inspelningsband, som genereras när enskilda komponenter i en blandning lämnar kolonnen. Om blandningen separeras är individuella toppar synliga på det yttre kromatogrammet. Toppens position i kromatogrammet används för att identifiera ämnet, toppens höjd eller area - för kvantitativ bestämning.

Ansökan

HPLC används mest inom följande områden av kemisk analys (analysobjekt där HPLC praktiskt taget inte har någon konkurrens markeras):

· Kontroll av livsmedelskvalitet - tonika och smaktillsatser, aldehyder, ketoner, vitaminer, sockerarter, färgämnen, konserveringsmedel, hormonläkemedel, antibiotika, triazin, karbamat och andra bekämpningsmedel, mykotoxiner, nitrosaminer, polycykliska aromatiska kolväten, etc.

· Miljöskydd - fenoler, organiska nitroföreningar, mono- och polycykliska aromatiska kolväten, ett antal bekämpningsmedel, huvudanjoner och katjoner.

· Forensics - droger, organiska sprängämnen och färgämnen, potenta läkemedel.

· Läkemedelsindustrin - steroidhormoner, nästan alla produkter av organisk syntes, antibiotika, polymerpreparat, vitaminer, proteinpreparat.

· Medicin - de listade biokemiska och medicinska substanserna och deras metaboliter i biologiska vätskor (aminosyror, puriner och pyrimidiner, steroidhormoner, lipider) för att diagnostisera sjukdomar, bestämma hastigheten för eliminering av läkemedel från kroppen för deras individuella dosering.

· Jordbruk - bestämning av nitrat och fosfat i jordar för att bestämma den erforderliga mängden gödselmedel som appliceras, bestämning av fodrets näringsvärde (aminosyror och vitaminer), analys av bekämpningsmedel i jord, vatten och jordbruksprodukter.

· Biokemi, bioorganisk kemi, genteknik, bioteknik - sockerarter, lipider, steroider, proteiner, aminosyror, nukleosider och deras derivat, vitaminer, peptider, oligonukleotider, porfyriner, etc.

· Organisk kemi - alla stabila produkter av organisk syntes, färgämnen, termolabila föreningar, icke-flyktiga föreningar; oorganisk kemi (nästan alla lösliga föreningar i form av joner och komplexa föreningar).

· Kontroll av kvaliteten och säkerheten för livsmedel, alkoholhaltiga och icke-alkoholhaltiga drycker, dricksvatten, hushållskemikalier, parfymer i alla stadier av produktionen.

· fastställande av arten av föroreningar på platsen för en katastrof eller nödsituation som orsakats av människor.

· upptäckt och analys av narkotiska, potenta, giftiga och explosiva ämnen;

· bestämning av förekomsten av skadliga ämnen (polycykliska och andra aromatiska kolväten, fenoler, bekämpningsmedel, organiska färgämnen, joner av tunga, alkaliska och alkaliska jordartsmetaller) i flytande avloppsvatten, luftutsläpp och fast avfall från företag och i levande organismer;

· Övervakning av processer för organisk syntes, olje- och kolraffinering, biokemisk och mikrobiologisk produktion.

analys av jordkvaliteten för gödsling, förekomsten av bekämpningsmedel och herbicider i jord, vatten och produkter, såväl som fodrets näringsvärde; komplexa forskningsanalytiska uppgifter; erhålla mikrokvantiteter av ultrarena ämnen.

Vätskekromatografi

Vätskekromatografiär en typ av kromatografi där mobil fas, kallad eluenten, är flytande. Stationär fas Kanske fast sorbent, fast bärare med vätska avsatt på dess yta eller gel.

Skilja på pelar- Och tunt lager vätskekromatografi. I kolonnversionen passerar en del av den separerade blandningen av ämnen genom en kolonn fylld med en stationär fas i en eluentström som rör sig under tryck eller under påverkan av gravitationen. Vid tunnskiktskromatografi rör sig eluenten under inverkan av kapillärkrafter längs ett plant skikt av sorbent avsatt på en glasplatta eller metallfolie, längs en porös polymerfilm eller längs en remsa av speciellt kromatografipapper. En metod för tunnskiktsvätskekromatografi under tryck har också utvecklats, där eluenten pumpas genom ett skikt av sorbent som ligger mellan plattorna.

Det finns sådana typer av vätskekromatografi som analytisk(för analys av blandningar av ämnen) och preparativ(för att isolera rena komponenter).

Skilja på vätskekromatografi (LC) i sin klassiska version, utförd med atmosfärstryck, Och hög hastighet), genomförs kl högt blodtryck. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) använder kolonner med en diameter på upp till 5 mm, tätt packade med en sorbent med små partiklar (3-10 µm). För att pumpa eluenten genom kolonnen, applicera tryck upp till 3,107 Pa. Denna typ av kromatografi kallas högtryckskromatografi. Genom att passera eluenten genom en kolonn under högt tryck kan du dramatiskt öka analyshastigheten och avsevärt öka effektiviteten av separationen på grund av användningen av fint dispergerat sorbent.

HPLC-alternativär mikrokolonnkromatografi på kolonner med liten diameter fyllda med sorbent och kapillärkromatografi på ihåliga och sorbentfyllda kapillärkolonner. HPLC-metoden tillåter för närvarande isolering, kvantitativ och kvalitativ analys av komplexa blandningar av organiska föreningar.

Vätskekromatografi är den viktigaste fysikaliska och kemiska forskningsmetoden inom kemi, biologi, biokemi, medicin och bioteknik. Det används för:

· studie av läkemedels metaboliska processer i levande organismer;

· diagnostik inom medicin;

· analys av kemiska och petrokemiska syntesprodukter, intermediärer, färgämnen, bränslen, smörjmedel, olja, avloppsvatten;

· Studie av sorptionsisotermer från lösning, kinetik och selektivitet för kemiska processer;

· urladdning

· analys och separation av blandningar, deras rening och isolering av många biologiska ämnen från dem, såsom aminosyror, proteiner, enzymer, virus, nukleinsyror, kolhydrater, lipider, hormoner.

I kemin av makromolekylära föreningar och vid produktion av polymerer används vätskekromatografi för att analysera kvaliteten på monomerer, studera molekylviktsfördelningen och fördelningen efter typ av funktionalitet hos oligomerer och polymerer, vilket är nödvändigt för produktkontroll.

Vätskekromatografi används också inom parfymer, livsmedelsindustrin, för analys av miljöföroreningar och inom kriminalteknisk vetenskap.

Metoden med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) utvecklades och introducerades i mitten av 70-talet av 1900-talet. Sedan dök de första vätskekromatograferna upp.

Vätskekromatografi är den optimala metoden för att analysera kemiskt och termiskt instabila molekyler, högmolekylära ämnen med reducerad flyktighet. Detta kan förklaras av den mobila fasens speciella roll i LC, i motsats till gaskromatografi: eluenten utför inte bara en transportfunktion.

2. Grundläggande begrepp och klassificering av vätskekromatografimetoder.

Förbi mekanism för retention av separerade ämnen av den stationära fasen LC skilja på:

sedimentkromatografi

· adsorptionskromatografi , där separation utförs som ett resultat av interaktionen av det ämne som separeras med adsorbent såsom aluminiumoxid eller kiselgel, ha på ytan aktiva polära centra. Lösningsmedel(eluent) - opolär vätska.

Ris. Schema för att separera en blandning av ämnen med hjälp av adsorptionskromatografi

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Mekanismen för sorption består av en specifik interaktion mellan den polära ytan av sorbenten och de polära (eller kapabla att polarisera) sektionerna av molekylerna i den analyserade komponenten (Fig.). Interaktionen uppstår på grund av donator-acceptor-interaktion eller bildandet av vätebindningar.

Ris. Schema för adsorptionsvätskekromatografi

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Ris. . Fördelningskromatografi med ympad fas (normalfasversion).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

På normal fas I versionen med fördelningsvätskekromatografi används substituerade alkylklorsilaner innehållande polära grupper, såsom nitril, aminogrupper, etc. som kiselgelytmodifierare (ympade faser) (fig.). Användningen av ympade faser gör det möjligt att finkontrollera sorptionsegenskaperna hos ytan av den stationära fasen och uppnå hög separationseffektivitet.

Omvänd fas vätskekromatografi är baserad på fördelningen av blandningskomponenter mellan ett polärt elueringsmedel och opolära grupper (långa alkylkedjor) ympade på ytan av sorbenten (fig.). Mindre vanligt förekommande är en variant av vätskekromatografi med avsatta faser, när en flytande stationär fas avsätts på en stationär bärare.

Ris. . Fördelningskromatografi med ympad fas (omvänd fasversion). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Fördelningsvätskekromatografi inkluderar också extraktionsvätska kromatografi i vilken den stationära fasen är ett organiskt extraktionsmedel avsatt på en fast bärare, och den mobila fasen är en vattenlösning av föreningarna som separeras. Som extraktionsmedel används till exempel fenoler, trialkylfosfater, aminer, kvaternära ammoniumbaser samt svavelhaltiga organofosforföreningar. Extraktionsvätskekromatografi används för att separera och koncentrera oorganiska föreningar, till exempel alkalimetalljoner, aktinider och andra element med liknande egenskaper, i processerna för bearbetning av använt kärnbränsle.

jonbyteskromatografi,

joniter.

katjonbytare

anjonbytare.

amfotära jonbytare

amfolyter

jonit

Kationit

Anjonbytare

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (katjonbyte)

R-OH + Na+ + Cl - → R-Cl + Na+ + OH - (anjonbyte)

Jonbytare ska uppfylla följande krav: vara kemiskt stabila i olika miljöer, mekaniskt starka i torrt och särskilt svullet tillstånd, ha hög absorptionsförmåga och förmåga att regenerera väl.

I jonbyteskromatografi (jonbyteskromatografi) detekteras de separerade anjonerna (katjonerna) som syror (motsvarande baser) av en mycket känslig konduktometrisk detektor, där högeffektiva kolonner är packade med ett ytaktivt jonharts med låg kapacitet.

jonparkromatografi

ligandbyteskromatografi

olika förmåga hos de separerade föreningarna att bilda komplex med övergångsmetallkatjoner

storleksexklusionskromatografi

skillnader i molekylstorlekar

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Ris. Schema för gelpermeationskromatografi

affinitetskromatografi

Ris. Affinitetskromatografischema

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Den avlägsnas sedan från polymeren genom att passera en lösning av en förening som har en ännu större affinitet för makromolekylen. Sådan kromatografi är särskilt effektiv inom bioteknik och biomedicin för att isolera enzymer, proteiner och hormoner.

Beroende om metoden för rörelse av materia Följande typer av vätskekromatografi särskiljs: utvecklande, frontal Och repressiva.
Används oftast manifesterande en variant i vilken en del av blandningen som ska separeras införs i kolonnen i eluentflödet. Utgången av blandningskomponenterna från kolonnen registreras på kromatogrammet i form av toppar. (ris.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Ris. Schema för att utveckla kromatografivariant

Höjd eller toppområde kännetecknar koncentration av komponenter, A hölls volymer – högkvalitativ blandningssammansättning. Identifiering av komponenter utförs vanligtvis genom att retentionstider sammanfaller med standardämnen, även kemiska eller fysikalisk-kemiska metoder används.

På frontal I varianten (fig.) leds kontinuerligt en blandning av de ämnen som ska separeras genom kolonnen, som spelar rollen som en mobil fas. Som ett resultat är det möjligt att i ren form endast erhålla det ämne som är minst sorberat i kolonnen.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Ris. Schema för alternativet för frontalkromatografi

Kromatogrammet i detta fall representerar steg, vars höjder är proportionella mot koncentrationerna av komponenterna; de kvarhållna volymerna bestäms av komponenternas retentionstid. När man differentierar ett sådant kromatogram erhålls en bild som liknar den som erhålls i framkallningsversionen.

I repressiva I detta fall ersätts komponenterna i blandningen som införs i kolonnen av eluenten, som adsorberas starkare än någon komponent. Som ett resultat erhålls fraktioner av de separerade substanserna intill varandra. Ordningen för frigöring av komponenterna bestäms av styrkan av deras interaktion med sorbentens yta (Fig.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Ris. Schema för undanträngningskromatografi

3. Grundkromatografiska mängder och deras bestämning.

Vid separering av ämnen med vätskekromatografi kan utvecklings-, frontal- och förskjutningsalternativ användas, som indikerat ovan. Oftast används ett framkallningsalternativ, där en del av blandningen som ska separeras införs i kolonnen i eluentflödet. Utgången av blandningskomponenterna från kolonnen registreras på kromatogrammet i form av toppar. Från kromatogrammet (Fig.) bestäm:

retentionstider för icke-sorberande (tO), separerade komponenter (tRl, tR2, tR3, etc.); bredd på toppbaserna (tw1, tw2, etc.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) korrigerad komponentretentionsvolym ,

Var t"R - korrigerad komponentretentionstid;

c) kolumnkapacitanskoefficient med avseende på en given komponent ;

d) kolumneffektivitet karaktäriseras antal motsvarande teoretiska plattor

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) lov https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Kapacitetsfaktor k" har en betydande inverkan på värdet R S: vid byte k" från 0 till 10 (optimala gränser) R S ökar kraftigt. Menande k" bestäms av den fördubblade ytan av sorbenten och dess mängd i kolonnen, såväl som adsorptionsjämviktskonstanten (Henrys konstant).

Selektivitetskoefficient α bestäms av skillnaden i adsorptionsjämviktskonstanter för de två separerade komponenterna. När α ökar (från 1 till ~5) R S ökar kraftigt, med ytterligare ökning av α - ändras lite. En kolonns selektivitet beror på faktorer såsom den kemiska strukturen hos sorbentytan, elueringsmedlets sammansättning, kolonnens temperatur och strukturen hos de föreningar som separeras. Eftersom sorptionen av kromatograferade ämnen i vätskekromatografi bestäms av den parvisa interaktionen mellan de tre huvudkomponenterna i systemet - sorbenten, de ämnen som separeras och eluenten, är förändring av eluentens sammansättning ett bekvämt sätt att optimera separationsprocessen .

Kolumneffektivitet beror på partikelstorleken och porstrukturen hos adsorbenten, på enhetligheten i kolonnpackningen, elueringsmedlets viskositet och massöverföringshastigheten. Att förlänga kolonnen leder inte alltid till förbättrad separation, eftersom kolonnens motstånd ökar, elueringstrycket vid inloppet och tiden för experimentet ökar, och analysens känslighet och noggrannhet minskar på grund av breddningen av toppen av den analyserade komponenten. Om , då är topparna av de två ämnena i kromatogrammet separerade nästan helt. Med tillväxt R S separationstiden ökar. På R S < 1 - separationen är otillfredsställande. Vid preparativ kromatografi, på grund av införandet av relativt stora mängder separerade ämnen, arbetar kolonnen med överbelastning. I detta fall minskar kapacitanskoefficienten, höjden som motsvarar den teoretiska plattan ökar, vilket leder till en minskning av upplösningen.

4. Adsorbenter

Kromatografisk separation av en blandning kommer att vara effektiv om adsorbenten och lösningsmedlet (eluenten) väljs korrekt.

Adsorbenten bör inte interagera kemiskt med de separerade komponenterna eller uppvisa en katalytisk effekt på lösningsmedlet. Det är också nödvändigt att adsorbenten är selektiv med avseende på komponenterna i blandningen. En korrekt vald adsorbent bör ha maximal absorptionsförmåga.

Skilja på polär (hydrofil) Och opolära (hydrofoba) adsorbenter. Man bör komma ihåg att adsorptionsaffiniteten för polära ämnen för polära sorbenter är mycket högre än för icke-polära.

Aluminiumoxid, aktivt kol, silikagel, zeoliter, cellulosa och vissa mineraler används som adsorbenter.

AluminiumoxidAl2O3 – amfotär adsorbent.(Fig.) På den blandningar kan separeras ämnen i polar, alltså i opolära lösningsmedel. Neutral aluminiumoxid används vanligtvis för kromatografi från icke-vattenhaltiga lösningar av mättade kolväten, aldehyder, alkoholer, fenoler, ketoner och etrar.

Ris. Aluminiumoxid för kromatografi

http://bilder. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktiviteten av Al2O3 beror på dess fukthalt. Vattenfri aluminiumoxid har den högsta aktiviteten. Det tas konventionellt som en. Vid behov kan aluminiumoxid med olika fukthalt framställas genom att nyberedd aluminiumoxid blandas med vatten (Brockmanskalan).

Beroende av aluminiumoxidaktivitet på fukthalten

Till exempel används Al2O3 med en aktivitet på 1,5-2 för separering av kolväten; för separation av alkoholer och ketoner – 2-3,5.

Den specifika ytan av aluminiumoxid är 230-380 m2/g.

Silikagel(hydroxylerad eller kemiskt modifierad) är en torkad gelatinös kiseldioxid, som erhålls från övermättade lösningar av kiselsyror ( n SiO2 m H2O) vid pH > 5-6. (fig.) Fast hydrofil sorbent.

Ris. Silikagel

http://www. silikagel. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Partikelstorleken för kiselgel i analytiska kolonner är 3-10 mikron, i preparativa kolonner - 20-70 mikron. Den lilla partikelstorleken ökar massöverföringshastigheten och förbättrar kolonneffektiviteten. Moderna analytiska kolonner är 10-25 cm långa. De är fyllda med silikagel med en partikelstorlek på 5 mikron och låter dig separera komplexa blandningar av 20-30 komponenter. När partikelstorleken minskar till 3-5 mikron ökar kolonnens effektivitet, men dess motstånd ökar också. Så för att uppnå en elueringshastighet på 0,5-2,0 ml/min krävs ett tryck på (1-3)·107 Pa. Kiselgel kan motstå en sådan tryckskillnad, medan granulerna av polymerabsorbenter är mer elastiska och deformerbara. På senare tid har mekaniskt starka polymersorbenter med en makroporös struktur med ett tätt nätverk utvecklats, som i sin effektivitet ligger nära kiselgeler. Formen på sorbentpartiklar med en storlek på 10 µm och däröver har ingen stor inverkan på kolonnens effektivitet, men sfäriska sorbenter är att föredra, vilket ger en mer permeabel förpackning. (Fig.)

Ris. Sfärisk silikagel

http://bilder. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Den inre strukturen hos en kiselgelpartikel är ett system av kommunicerande kanaler. För vätskekromatografi används sorbenter med en pordiameter på 6-25 nm. Vätskekromatografiseparation utförs huvudsakligen på silikageler modifierade genom reaktion av alkyl- och arylklorsilaner eller alkyletoxisilaner med silanolgrupper på ytan. Med hjälp av sådana reaktioner ympas C8H17-, C18H37- eller C6H5-grupper (för att erhålla sorbenter med en hydrofobiserad yta), nitril, hydroxylgrupper, etc. (Fig.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Ris. Struktur av modifierad kiselgel

Silikageler används vid kromatografi för separering av blandningar av petroleumprodukter, högre fettsyror, deras estrar, aromatiska aminer, nitroderivat organiska föreningar. Silikagel – hydrofilt sorbent, lätt fuktad med vatten. Därför kan den inte användas för sorption från vattenlösningar. Aktiviteten hos kiselgel beror på vattenhalten i den: ju mindre vatten den innehåller, desto större aktivitet (Brockmannskalan).

Beroende av kiselgelaktivitet på fukthalten

Den specifika ytan av silikageler är 500-600 m2/g.

Aktivt kolär en form av kol som vid bearbetning blir extremt porös och får en mycket stor yta tillgänglig för adsorption eller kemiska reaktioner (Fig.) De har en specifik yta på 1300-1700 m2/g.

Ris. Aktivt kol

http://e-katalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Det huvudsakliga inflytandet på porstrukturen hos aktivt kol utövas av utgångsmaterialen för deras produktion. Aktivt kol baserade på kokosnötskal kännetecknas av en större andel mikroporer (upp till 2 nm), medan de baserade på kol kännetecknas av en större andel mesoporer (2-50 nm). En stor andel makroporer är karakteristisk för träbaserade aktivt kol (mer än 50 nm). Mikroporer är särskilt väl lämpade för adsorption av små molekyler, medan mesoporer är särskilt väl lämpade för adsorption av större organiska molekyler.

Zeoliter (molekylsilar)– porösa kristallina aluminiumsilikater av alkali- och jordalkalimetaller av naturligt och syntetiskt ursprung. (ris.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Ris. Zeoliter

http://www. zeolit spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/tumme. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Det finns fyra kända typer av zeoliter (A, X, Y, M), med olika kristallstrukturer. Beroende på katjonen betecknas zeoliter enligt följande: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Funktion hos zeoliterär det kristallernas porer har storlekar av storleksordningen 0,4-1 nm, jämförbara med storleken på molekyler många flytande eller gasformiga ämnen. Om ett ämnes molekyler kan tränga in i dessa porer, sker adsorption i porerna hos zeolitkristaller. Större molekyler av ämnet adsorberas inte. Genom att välja zeoliter med olika porstorlekar kan blandningar av olika ämnen tydligt separeras.

Den specifika ytan av zeoliter är 750-800 m2/g.

När du väljer en adsorbent är det nödvändigt att ta hänsyn till ämnens struktur och deras löslighet. Till exempel är mättade kolväten dåligt adsorberade, medan omättade kolväten (har dubbelbindningar) adsorberas bättre. Funktionella grupper förbättrar ett ämnes adsorptionsförmåga.

5. Elueringsmedel

När du väljer ett lösningsmedel (elueringsmedel) måste du ta hänsyn till arten av adsorbenten och egenskaperna hos ämnena i blandningen som ska separeras. Elueringsmedel måste lösa upp alla komponenter i den kromatograferade blandningen väl, ha låg viskositet, ge den erforderliga selektivitetsnivån, vara billiga, giftfria, inerta och kompatibla med detektionsmetoder (till exempel kan bensen inte användas som eluent med UV detektor).

Vid normalfaskromatografi används vanligtvis kolväten (hexan, heptan, isooktan, cyklohexan) med tillsats av små mängder kloroform CHCl3, isopropanol iso-C3H7OH, diisopropyleter; i omvänd faskromatografi - en blandning av vatten med acetonitril CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxan, tetrahydrofuran, dimetylformamid. För att isolera enskilda komponenter i en blandning som separeras under kromatografi tvättas de ofta ut (elueras) successivt. För detta ändamål används lösningsmedel med olika desorptionsförmåga. Lösningsmedel är ordnade i fallande ordning efter desorberande förmåga i polära adsorbenter - eluotropisk Trappe-serie. Om komponenterna i blandningen som separeras har liknande värden k" ( kolonnkapacitetskoefficient i förhållande till en given komponent), kromatografera sedan med en eluent. Om enskilda komponenter i blandningen starkt kvarhålls av sorbenten, används en serie elueringsmedel med ökande styrka.

Eluotropisk serie av lösningsmedel

6. Utrustning för vätskekromatografi

I modern vätskekromatografi används instrument av varierande grad av komplexitet – från de enklaste systemen till högklassiga kromatografier.
En modern vätskekromatograf inkluderar: behållare för elueringsmedel, högtryckspumpar, en dispenser, en kromatografikolonn, en detektor, en registreringsenhet, ett kontrollsystem och matematisk bearbetning av resultat.

I fig. ett blockschema över en vätskekromatograf presenteras, innehållande den minsta erforderliga uppsättningen komponenter, i en eller annan form, närvarande i vilket kromatografiskt system som helst.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Ris. Diagram av en vätskekromatograf: 1 - reservoar för den mobila fasen, 2 - pump, 3 - injektor, 4 - kolumn, 5 - termostat, 6 - detektorer, 7 - inspelningssystem, 8 - dator.

Lagringstank för den mobila fasen, måste ha tillräcklig kapacitet för analys och lösningsmedelsavgasningsanordning för att förhindra bildning av bubblor av gaser lösta i eluenten i kolonnen och detektorn.

Pump avsedd för att skapa ett konstant flöde av lösningsmedel. Dess design bestäms i första hand av driftstrycket i systemet. För att arbeta i intervallet 10-500 MPa används pumpar av kolvtyp (spruta). Deras nackdel är behovet av periodiska stopp för att fylla med elueringsmedel. För enkla system med låga drifttryck på 1-5 MPa används billiga peristaltiska pumpar. Eluenter kommer in i pumpen genom ett filter som håller kvar dammpartiklar (mer än 0,2 mikron). Ibland passerar en liten heliumström genom elueringsmedlen för att avlägsna löst luft och förhindra bildning av bubblor i detektorn (särskilt i fallet med vattenhaltiga och polära eluenter). I analytiska kromatografer används kolvpumpar med återkopplingssystem för att tillföra eluenten till kolonnen, vilket gör det möjligt att jämna ut flödespulseringar inom 1-2 % och ge volymetriska flödeshastigheter från 0,1 till 25 ml/min vid tryck upp till ~~ 3,107 Pa. Vid mikrokolonnkromatografi är volymetriska flödeshastigheter för eluenten mycket lägre - 10-1000 µl/min. Vid gradienteluering används flera pumpar, som styrs av en programmerare och tillför 2-3 eluentkomponenter till blandningskammaren, vilket lämnar den totala flödeshastigheten konstant. För att införa ett prov i en kolonn under högt tryck utan att stoppa flödet, används speciella mikrodoseringskranar, anslutna till en slinga med känd volym för lösningsprovet som studeras. Doseringssystem har utvecklats med automatisk provtagning och injektion av prover med hjälp av mikrodoseringskranar eller sprutor.

Injektor tillhandahåller injektion av blandningsprovet separerade komponenter till en kolumn med ganska hög reproducerbarhet. Enkla "stop-flow" provinjektionssystem kräver att pumpen stoppas och är därför mindre bekväma än looppipetterna som utvecklats av Reodyne.

Kolumner för HPLC är de oftast gjorda av ett polerat rör av rostfritt stål 10-25 cm långt och en innerdiameter på 3-5 mm.

Ris. Kromatografikolonner för vätskekromatografi

Används också högtalare i glas, placerad i ett metallhölje; i mikrokolonnkromatografi - packade metallhögtalare med en innerdiameter på 1,0-1,5 mm, packade glasmikrospalter med en diameter på 70-150 mikron och ihåliga kapillärpelare diameter 10-100 mikron; i preparativ kromatografi - kolonner med en diameter på 2 till 10 cm eller mer. För att enhetligt och tätt fylla kolonnerna med sorbent används suspensionspackningsmetoden. En suspension framställs av en sorbent och en lämplig organisk vätska, som tillförs under tryck upp till 5,107 Pa in i kolonnen. För att bestämma de separerade komponenterna som lämnar en kolumn använda sig av detektorer. Konsistens av temperatur försedd termostat.

Detektorer för vätskekromatografi har de en flödescell i vilken en kontinuerlig mätning av någon egenskap hos det strömmande elueringsmedlet sker. De måste vara väldigt känsliga. För att öka detektorns känslighet används ibland derivatisering av komponenterna i blandningen efter kolonnen. För att göra detta införs reagens med eluentflödet som, i växelverkan med de separerade substanserna, bildar derivat med mer uttalade egenskaper, till exempel absorberar de starkare i UV-området eller det synliga området av spektrumet eller har större fluorescerande förmåga. Ibland utförs derivatisering före kromatografisk analys och derivaten separeras snarare än utgångsmaterialen. Mest populära typer detektorer allmänna syften är refraktometrar, mäta brytningsindex, Och spektrofotometriska detektorer, definierande lösningsmedels optisk densitet vid en fast våglängd (vanligtvis i det ultravioletta området). TILL fördelarna med refraktometrar(Och nackdelar med spektrofotometrar) bör tillskrivas låg känslighet för den typ som bestäms anslutningar, som kanske inte innehåller kromoforgrupper. Å andra sidan är användningen av refraktometrar begränsad till isokratiska system (med en konstant eluentsammansättning), så användningen av en lösningsmedelsgradient i detta fall är omöjlig.

Differential "href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">differentialförstärkare och brännare. Det är också önskvärt att ha integratör, vilket gör att du kan beräkna de relativa områdena för de resulterande topparna. I komplexa kromatografiska system används det gränssnittsblock, kopplar kromatografen till personlig dator, som inte bara samlar in och bearbetar information, utan också kontrollerar enheten, beräknar kvantitativa egenskaper och, i vissa fall, den kvalitativa sammansättningen av blandningar. Mikroprocessor tillhandahåller automatisk provinjektion, ändra med specificerat eluentsammansättningsprogram med gradienteluering, underhålla kolonntemperatur.

Bruker". Ris. Vätskekromatograf Jasco

Självtestfrågor

Vad är vätskekromatografi? Nämn dess typer och användningsområden. Lista om grundläggande kromatografiska kvantiteter och deras definition Vilka typer av vätskekromatografi finns beroende på mekanismen för retention av de separerade substanserna av den stationära fasen av LC? Vilka typer av kromatografi finns beroende på metoden för att flytta ämnet? Vilka ämnen används som adsorbenter? Vad är skillnaden? Vad fungerar som den flytande mobila fasen - eluenten? Krav på lösningsmedel. Vad är skillnaden mellan partitionskromatografi och adsorptionskromatografi? Lista huvuddelarna i en vätskekromatografkrets och deras syfte.

Lista över begagnad litteratur

1 "Vätskekromatografi i medicin"

http://journal. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 "Introduktion till högpresterande vätskekromatografimetoder"

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 "Vätskekromatografi"

http://e-vetenskap. ru/index/?id=1540

4 "kromatografi"

http://belchem. människor ru/chromatography1.html

Normalfas HPLC

Omvänd fas HPLC

Matriser för HPLC

Vaccinationer i stationär fas

Detektorer för HPLC

Länkar

Se vad "High Performance Liquid Chromatography" är i andra ordböcker:

Böcker

Normalfas HPLC

Omvänd fas HPLC

Matriser för HPLC

Vaccinationer i stationär fas

Detektorer för HPLC

Länkar

Se vad "" är i andra ordböcker:

Böcker

Funktioner hos cellorganeller

Algoritm för att skriva en uppsats i samhällskunskap

Tjernobyl i ögonvittnens memoarer Tjernobyl skrämmande historier