Fastfassyntes eller fastfasteknik, som ofta kallas keramik, är den vanligaste vid framställning av oorganiska material för olika grenar av vetenskap och industri. Dessa inkluderar kärnbränsle, material för rymdteknik, radioelektronik, instrumentering, katalysatorer, eldfasta material, högtemperatursupraledare, halvledare, ferro- och piezoelektrik, magneter, olika kompositer och många andra.

Fastfassyntes är baserad på kemiska reaktioner där åtminstone en av reaktanterna är i form av ett fast ämne. Sådana reaktioner kallas heterogen eller fast fas. Fastfasinteraktion, i motsats till reaktioner i ett flytande eller gasformigt medium, består av två grundläggande processer: från den kemiska reaktionen i sig och överföringen av materia till reaktionszonen.

Reaktioner i fast tillstånd som involverar kristallina komponenter kännetecknas av den begränsade rörligheten hos deras atomer eller joner och ett komplext beroende av många faktorer. Dessa inkluderar till exempel den kemiska strukturen och tillhörande reaktiviteten hos reagerande fasta ämnen, defekternas karaktär och koncentration, tillståndet på ytan och morfologin i reaktionszonen, kontaktytan för interagerande reagenser, preliminär mekanokemisk aktivering och ett antal andra. Allt ovanstående bestämmer komplexiteten hos mekanismerna för heterogena reaktioner. Studiet av heterogena reaktioner är baserat på fasta tillståndskemi, kemisk fysik och fysikalisk kemi av ytan av fasta ämnen, på termodynamikens och kinetikens lagar.

Ofta bedöms mekanismen för reaktioner i fast tillstånd endast på basis av att experimentella data om graden av interaktion som en funktion av tiden bäst beskrivs av någon specifik kinetisk modell och motsvarande kinetiska ekvation. Detta tillvägagångssätt kan leda till felaktiga slutsatser.

Processer i fasta material har ett antal viktiga skillnader från processer i vätskor eller gaser. Dessa skillnader är för det första förknippade med en betydligt (med flera storleksordningar) lägre diffusionshastighet i fasta ämnen, vilket förhindrar medelvärdesbildningen av koncentrationen av komponenter i systemet och därmed leder till rumslig lokalisering av de förekommande processerna. Rumslig lokalisering leder i sin tur till det faktum att både processens specifika hastighet (eller diffusionskoefficienten) och reaktionszonens geometri bidrar till processernas observerade kinetik. Sådana egenskaper hos fastfasprocesser som bestäms av geometriska faktorer kallas topokemiska. Dessutom, eftersom transformationerna som diskuteras är rumsligt lokaliserade, kan deras hastighet bestämmas både av själva processerna vid fasgränsen (reaktionskontroll) och av tillförselhastigheten för någon av komponenterna till detta gränssnitt eller avlägsnande av produkten ( s) (diffusionskontroll). Dessa fall för enkla system, för vilka modellens antaganden är uppfyllda, kan identifieras experimentellt genom formen av tidsberoendet av konverteringsgraden. Ett annat särdrag hos fastransformationer i fasta ämnen är relaterat till det faktum att bildandet av en ny faskärna i en fast matris orsakar uppkomsten av elastiska spänningar i den senare, vars energi i vissa fall måste beaktas när man överväger termodynamiken av dessa omvandlingar.

Ett stort antal faktorer som påverkar kinetiken för fastfasprocesser och mikrostrukturen hos de material som erhålls på detta sätt bestämmer också mångfalden av typer av klassificering av dessa processer. Sålunda, med tanke på stabiliteten hos ett system med avseende på fluktuationer av olika typer, heterogena (när det gäller system som är stabila till små fluktuationer i den upptagna volymen och instabila till stora) och homogena (när det gäller system som är instabila) till små fluktuationer) särskiljs processer. För heterogena processer kan man som exempel nämna transformationer som fortskrider enligt mekanismen för bildning och tillväxt av kärnor, för homogena processer, vissa ordningsstörningsövergångar och spinodal nedbrytning av fasta lösningar.

Det är nödvändigt att särskilja heterogen och homogen kärnbildning från heterogena och homogena processer när det gäller heterogena processer. Heterogen kärnbildning hänvisar till bildandet av kärnor på strukturella defekter (inklusive punktdefekter, dislokationer och fasgränser); homogen kärnbildning - bildandet av kärnor i en defektfri volym av den fasta fasen.

Genom att analysera produkten av en fastfastransformation skiljer man mellan enfasiga och flerfasiga kärnor. När det gäller flerfaskärnor är processens produkt en flerfaskoloni med en karakteristisk mikrostruktur som bestäms av ytenergin för gränsen för de bildade faserna; processer av denna typ kallas diskontinuerliga, i motsats till kontinuerliga processer när det gäller bildning och tillväxt av enfaskärnor.

Ett annat sätt att klassificera fastfastransformationer är baserat på en jämförelse av sammansättningen av den initiala fasen och sammansättningen av reaktionsprodukten. Om de sammanfaller talar de om diffusionsfria processer och om sammansättningen förändras talar de om diffusion. Dessutom är det användbart att skilja från icke-diffusionsprocesser samarbetsprocesser (till exempel martensitisk transformation) som sker med hjälp av en samtidig lätt förskjutning av atomer i en stor volym av den initiala fasen.

Diffusionslösa fastransformationer kan skilja sig åt i typen av deras termodynamiska egenskaper som förändras under processen.

Transformationer av det första slaget är processer där det sker en förändring i derivaten av den kemiska potentialen med avseende på temperatur eller tryck. Detta innebär en abrupt förändring under fasövergången av sådana termodynamiska parametrar som entropi, volym, entalpi och intern energi. Under transformationer av det andra slaget förändras inte de första derivaten av den kemiska potentialen med avseende på intensiva parametrar, men derivaten av högre ordningar förändras (med början från den andra). I dessa processer, med kontinuerlig entropi och volym av systemet, sker en abrupt förändring i kvantiteterna uttryckta i termer av andraderivator av Gibbs-energin: värmekapacitet, termisk expansionskoefficient, kompressibilitet, etc.

Fastfasreaktioner mellan två faser (kontakter mellan tre eller flera faser är osannolika, och motsvarande processer kan representeras som kombinationer av flera tvåfasreaktioner) är diffusionsprocesser och kan vara antingen heterogena eller homogena, med både heterogen och homogen kärnbildning . Homogena processer och processer med homogen kärnbildning i sådana reaktioner är möjliga, till exempel i fallet med bildandet av en metastabil fast lösning med dess efterföljande sönderdelning (de så kallade interna reaktionerna). Ett exempel på sådana processer kan vara intern oxidation.

Förutsättningen för termodynamisk jämvikt i en omvandling i fast tillstånd, som i all annan kemisk omvandling, är jämlikheten mellan komponenternas kemiska potential i utgångsmaterial och reaktionsprodukter. När två fasta faser interagerar kan denna jämlikhet av kemiska potentialer realiseras på olika sätt: 1) omfördelning av komponenter i de initiala faserna med bildning av fasta lösningar; 2) bildandet av nya faser med en annan kristallstruktur (som i själva verket vanligtvis kallas en fastfasreaktion), och eftersom den kemiska potentialen hos komponenten i olika faser av ett flerfassystem inte beror på mängden varje fas kan jämvikt uppnås endast med fullständig transformation av de initiala faserna. Den mest tillförlitliga informationen om mekanismen för fastfasreaktioner erhålls med komplex användning, vilket gör det möjligt att samtidigt observera flera parametrar i det reagerande systemet, inklusive fassammansättning, termiska effekter, massförändringar och mer.

Den termodynamiska teorin om fasta tillståndsreaktioner föreslogs av Wagner och vidareutvecklades av Schmalzried med hjälp av exemplet med additionsreaktioner.

Hittills finns det ingen enhetlig klassificering av en mängd olika heterogena reaktioner. Detta beror på svårigheten att välja ett kriterium som grund för en sådan universell klassificering. Enligt kemiska kriterier är reaktioner uppdelade i reaktioner av oxidation, reduktion, sönderdelning, kombination, utbyte etc. Tillsammans med det angivna kriteriet används det i stor utsträckning som huvudkriteriet för reagensernas fysiska tillstånd:

Ett karakteristiskt drag för alla heterogena reaktioner är förekomsten och lokaliseringen vid reaktionszonens fasgräns. Reaktionszonen, som regel, med liten tjocklek separerar två utrymmesområden som upptas av ämnen med olika sammansättning och med olika egenskaper. Orsakerna till bildandet av reaktionszonen delas vanligtvis in i två grupper: diffusionsprocessernas relativa långsamhet och kemiska orsaker. Den sista gruppen beror på den höga reaktiviteten hos atomer eller molekyler som finns på ytan av ett fast reagens eller på gränsytan mellan två existerande faser. Det är känt att ytan på en fast eller flytande substans har egenskaper som skiljer sig från bulkegenskaperna hos ett kompakt prov. Detta gör gränssnittsegenskaperna specifika. Det är här som en betydande omarrangering av kristallpackningen äger rum, spänningarna mellan de två kristallgittren minskar och den kemiska sammansättningen förändras.

Eftersom massöverföring utförs genom diffusion och diffusionsrörligheten för fasta partiklar beror på defekten i dess struktur, kan man förvänta sig en betydande effekt av defekter på mekanismen och kinetiken för fastfasreaktioner. Detta steg föregår det kemiska steget av omvandlingen av reaktanterna vid gränsytan. Således bestäms kinetiken för heterogena reaktioner både av arten av förloppet av själva den kemiska reaktionen och av metoden för att leverera ämnet till reaktionszonen. I enlighet med ovanstående kommer reaktionshastigheten att begränsas av det kemiska steget (kemisk kinetik) eller diffusion (diffusionskinetik). Ett sådant fenomen observeras i verkligheten.

Enligt Wagner utförs diffusion och följaktligen reaktion i fasta ämnen huvudsakligen på grund av rörligheten hos joner och elektroner, på grund av gittrets icke-jämviktstillstånd. Olika joner i gittret rör sig i det med olika hastigheter. I synnerhet är rörligheten för anjoner i de allra flesta fall försumbar jämfört med rörligheten för katjoner. Därför utförs diffusion och följaktligen reaktionen i fasta ämnen på grund av katjonernas rörelse. I detta fall kan diffusionen av olika katjoner gå i samma riktning eller mot varandra. I fallet med olika laddade katjoner bevaras systemets elektroneutralitet på grund av elektronernas rörelse. På grund av skillnaden i rörelsehastigheten för olika laddade katjoner uppstår en elektrisk potential i systemet. Som ett resultat minskar rörelsehastigheten för fler mobila joner och, omvänt, för mindre mobila? ökar. Således reglerar den resulterande elektriska potentialen jondiiffusionshastigheterna. Den senare och hastigheten som bestäms av den för hela solid-state-transformationsprocessen kan beräknas på basis av elektronisk konduktivitet och överföringsnummer. Uppenbarligen är riktad diffusion av joner endast möjlig i ett elektriskt fält eller i närvaro av en koncentrationsgradient i systemet.

Vid syntes av ämnen i fast tillstånd är det ofta nödvändigt att kontrollera inte bara den kemiska (elementära och fas) sammansättningen av den resulterande produkten, utan också dess mikrostrukturella organisation. Detta beror på det starka beroendet av både kemiska (till exempel aktivitet i fastfasreaktioner) och många fysiska (magnetiska, elektriska, optiska, etc.) egenskaper på egenskaperna hos den strukturella organisationen av ett fast ämne på olika hierarkiska nivåer. Den första av dessa nivåer inkluderar den elementära sammansättningen av ett fast ämne och metoden för ömsesidigt arrangemang av atomerna av element i rymden - kristallstrukturen (eller egenskaperna hos den närmaste koordinationsmiljön för atomer i amorfa fasta ämnen), såväl som sammansättningen och koncentration av punktdefekter. Som nästa nivå av strukturen hos en fast kropp kan vi överväga fördelningen av utökade defekter i en kristall, som bestämmer storleken på regioner där (korrigerat för förekomsten av punktdefekter) translationssymmetri i arrangemanget av atomer observeras . Sådana regioner kan betraktas som perfekta mikrokristaller och kallas regioner med koherent spridning. På tal om regionerna med koherent spridning, måste man komma ihåg att de i det allmänna fallet inte är likvärdiga med kompakta partiklar som bildar ett fastfasmaterial, som kan innehålla ett betydande antal utökade defekter, och följaktligen, regioner med koherent spridning. Sammanfallen av regioner med koherent spridning med partiklar (som i detta fall kallas singeldomän) observeras vanligtvis endast för tillräckligt små (mindre än 100 nm) storlekar av de senare. Efterföljande strukturella nivåer kan associeras med formen och storleksfördelningen av partiklarna som bildar pulvret eller det keramiska materialet, deras aggregation, aggregation av primära aggregat, etc.

Olika tillämpningar av fastfasmaterial har olika, ofta motstridiga krav på de strukturella egenskaperna som anges ovan och kräver därför olika syntetiska metoder. Därför är det mer korrekt att tala om metoderna för syntes inte av fastfasämnen, utan av fastfasmaterial och, i varje fall, välja en syntesmetod med hänsyn till området för efterföljande applicering av den resulterande produkten.

I det allmänna fallet kan metoder för syntes av fastfasmaterial klassificeras enligt deras avstånd från de termodynamiskt jämviktsförhållandena för flödet av kemiska processer som används. I enlighet med de allmänna lagarna, under förhållanden som motsvarar ett tillstånd så långt som möjligt från jämvikt, observeras ett betydande överskott av kärnbildningshastigheten jämfört med tillväxthastigheten för de bildade kärnorna, vilket uppenbarligen leder till att man erhåller den mest dispergerade produkten. Vid genomförande av processen nära termodynamisk jämvikt sker tillväxten av redan bildade kärnor snabbare än bildningen av nya, vilket i sin tur gör det möjligt att erhålla grovkorniga (i det begränsande fallet enkristall) material. Tillväxthastigheten för kristaller bestäms också till stor del av koncentrationen av förlängda (icke jämvikts) defekter i dem.

Kombinatorisk syntes kan utföras inte bara i lösning (vätskefassyntes), utan också på ytan av en fast kemiskt inert fas. I detta fall "sys" det första utgångsmaterialet kemiskt till de funktionella grupperna på ytan av polymerbäraren (oftast används en ester- eller amidbindning) och behandlas med en lösning av det andra utgångsmaterialet, som tas in i ett betydande överskott så att reaktionen går till fullbordan. Det finns en viss bekvämlighet med denna form av reaktion, eftersom tekniken för att isolera produkter underlättas: polymeren (vanligtvis i form av granulat) filtreras helt enkelt bort, tvättas noggrant från resterna av det andra reagenset, och målföreningen är kemiskt klyvd från den.

Inom organisk kemi finns det inte en enda reaktion som i praktiken ger kvantitativa utbyten av målprodukter i alla fall. Det enda undantaget är tydligen den fullständiga förbränningen av organiska ämnen i syre vid hög temperatur till CO 2 och H 2 O. Därför är rening av målprodukten alltid en oumbärlig, och ofta den svåraste och mest tidskrävande uppgiften. En särskilt svår uppgift är isoleringen av produkter från peptidsyntes, till exempel separationen av en komplex blandning av polypeptider. Därför är det inom peptidsyntesen som metoden för syntes på ett fast polymersubstrat, utvecklad i början av 1960-talet av R.B. Merifield, har blivit mest använd.

Polymerbäraren i Merrifield-metoden är en granulär tvärbunden polystyren som innehåller klormetylgrupper i bensenringar, vilka är länkar som binder stödet till den första aminosyraresten av polypeptiden. Dessa grupper omvandlar polymeren till en funktionell analog av bensylklorid och ger den förmågan att enkelt bilda esterbindningar vid reaktion med karboxylatanjoner. Kondensation av ett sådant harts med N-skyddade aminosyror leder till bildningen av motsvarande bensylestrar. Avlägsnande av N-skyddet från ger ett C-skyddat derivat av den första aminosyran som är kovalent kopplad till polymeren. Aminoacylering av den frigjorda aminogruppen med ett N-skyddat derivat av den andra aminosyran, följt av avlägsnande av N-skyddet, resulterar i att ett liknande dipeptidderivat också binds till polymeren:

En sådan tvåstegscykel (avskyddning - aminoacylering) kan i princip upprepas så många gånger som krävs för att bygga en polypeptidkedja av en given längd.

Ytterligare utveckling av Merifields idéer riktades först och främst till sökandet efter och skapandet av nya polymera material för substrat, utvecklingen av metoder för separation av produkter och skapandet av automatiserade installationer för hela cykeln av polypeptidsyntes.

Effektiviteten av Merifield-metoden har visats genom framgångsrik syntes av ett antal naturliga polypeptider, i synnerhet insulin. Speciellt tydligt har dess fördelar visats på exemplet med syntesen av enzymet ribonukleas. Så, till priset av betydande ansträngningar, utförde Hirschman och 22 anställda, till exempel, under flera år syntesen av enzymet ribonukleas (124 aminosyrarester) med hjälp av traditionella metoder i vätskefas. Nästan samtidigt erhölls samma protein genom automatiserad fastfassyntes. I det andra fallet utfördes syntesen, som omfattade totalt 11 931 olika operationer, inklusive 369 kemiska reaktioner, av två deltagare (Gatte och Merrifield) på bara några månader.

Merrifields idéer fungerade som grunden för skapandet av olika metoder för kombinatorisk syntes av bibliotek av polypeptider med olika strukturer.

Så 1982 föreslogs en originalstrategi för parallellsyntes i flera steg av peptider på den fasta fasen, känd som "splitmetoden" ( dela- klyvning, separering) eller "blandning och split"-metoden (Fig. 3). Dess väsen är som följer. Låt oss säga att från tre aminosyror (A, B och C) behöver du få alla möjliga kombinationer av tripeptider. För att göra detta delas granulerna av en fast polymerbärare (P) i tre lika stora delar och behandlas med en lösning av en av aminosyrorna. I detta fall är alla aminosyror kemiskt bundna till polymerens yta av en av deras funktionella grupper. De erhållna polymererna av tre kvaliteter blandas noggrant och blandningen delas återigen i tre delar. Därefter behandlas varje del, innehållande alla tre aminosyrorna i lika stora mängder, igen med en av samma tre aminosyror och nio dipeptider erhålls (tre blandningar med tre produkter vardera). En annan blandning, uppdelning i tre lika delar och behandling med aminosyror ger de önskade 27 tripeptiderna (tre blandningar av nio produkter) i bara nio steg, medan att erhålla dem separat skulle kräva en syntes av 27 × 3 = 81 steg.

"Biolog. tidskrift Armenia, 1 (65), 2013 SOLID-FAS SYNTES AV HJÄRTAKTIV PEPTID Isolerad FRÅN PIG ATRIUM G.S. CHAILYAN Institute of Biochemistry. Bunyatyan NAS RA..."

Experimentella och teoretiska artiklar

Experimentella och teoretiska artiklar

Biolog. tidskrift Armenien, 1 (65), 2013

SOLID-FAS SYNTES AV HJÄRTPEPTID,

ISOLERAT FRÅN GRISATRIUM

G.S. CHAILYAN

Institutet för biokemi. Bunyatyan NAS RA

[e-postskyddad]

För att fortsätta forska acad. Galoyan genomförde vi en serie experiment för att isolera, rena och bestämma den biologiska orienteringen av nyligen isolerade peptidföreningar från förmak och örondelar av grisens hjärta. För att genomföra biotester var det nödvändigt att erhålla preparativa mängder av de studerade proverna. För att göra detta använde vi metoden för fastfassyntes av peptider med dess ytterligare modifiering. Renheten och identiteten hos de syntetiserade preparaten kontrollerades med högpresterande vätskekromatografi och masspektralanalys.

Fastfassyntes - fmoc-aminosyror - HPLC - fenylisotiocyanat - masspektralanalys:

fmoc- – – För ytterligare studier etablerade av Galoyan, utfördes en serie experiment på isolering, rening och bestämning av biologisk riktning för peptider isolerade från grisförmak. För att uppfylla biotesterna krävdes den förberedande mängden prover. En modifierad metod för fastfaspeptidsyntes användes. Den syntetiserade peptidens renhet och identitet definierades genom HPLC och mass-spektral analys.

Fastfassyntes – högpresterande vätskekromatografi – masspektrometri – fmoc-aminosyror – kardiopeptider – förmak Galoyan et al studerade regleringssätten och verkningsmekanismerna för hypotalamiska neurohormoner på olika processer i kroppen.

Bekräftelse av idén om den sammankopplade, ömsesidigt beroende, integrerade funktionen hos ett sådant system som hypotalamus - hypofysen - binjurarna var en vändpunkt i endokrinologin. Påfyllning av detta koncept SOLID-FAS SYNTES AV EN HJÄRTA AKTIV PEPTID Isolerad FRÅN GRISATRIUM av den tualtriad som presenterades av Galoyan angående interaktionen mellan hypotalamus och hypofysen

– hjärta, är en enorm vetenskaplig bedrift. Därefter upptäcktes ett nytt vävnadsmål-hjärta, detta organs förmåga att kontrollera funktionen hos specifika peptider visades, liksom förekomsten av en återkopplingsmekanism mellan hypotalamus och hjärtat genom dessa peptider.

Upptäckten av kardioaktiva föreningar - neurohormonet K, C, G och ett antal andra i hypotalamus hos olika djur fungerade som början på arbetet inte bara med att studera de molekylära verkningsmekanismerna för dessa neurohormoner, utan också på sökningen för liknande föreningar i hjärtat. Grunden för en omfattande studie av de biokemiska och fysikalisk-kemiska egenskaperna hos kardioaktiva principer var data om närvaron av 2 kardioaktiva föreningar i hjärtmuskeln. Deltagandet av neurohormonet "C" i regleringen av glykolytiska processer och nivån av cykliska nukleotider etablerades genom hämning av PDE cAMP, cAMP-beroende proteinkinas, etc. Denna förening har visat sig ha låg molekylvikt och tillhör glykopeptiderna.

I Laboratoriet för analytisk kromatografi och peptidsyntes har vi utfört arbete med isolering och rening av peptidföreningar från förmaken och öronområdena i grisens hjärta. Under separationen av peptidfraktioner genom preparativ HPLC, isolerade och renade vi till ett homogent tillstånd 20 föreningar av peptidnatur. För att bestämma det biologiska fokuset testades alla preparat för förändringar i EKG-komponenter hos råttor. Resultaten av experimenten visade att 7 föreningar har mångsidiga faktorer som påverkar vissa komponenter i EKG.

Peptid nr. 7 visade den största aktiviteten för att ändra amplituden för R-komponenten, QRS-komplexets varaktighet, S-amplituden och andra parametrar.

För att studera de biologiska verkningsmekanismerna för detta läkemedel blev det nödvändigt att ha en stor mängd av testprovet. På grund av det faktum att processen för isolering och rening av biologiska produkter är extremt ineffektiv, mödosam, tidskrävande och inte kan ge god reproducerbarhet, har det blivit extremt viktigt att utföra den kemiska syntesen av detta läkemedel. Genom att analysera världslitteraturen inom området kemisk syntes av peptider kom vi till slutsatsen att den mest optimala för oss är metoden för fastfassyntes med användning av fmoc-skyddade aminosyror. Upptäckt 1984, peptidsyntes i fast fas har många fördelar jämfört med konventionell syntes när det gäller effektivitet, såväl som bekväm bearbetning och rening.

Med hjälp av flera olika metoder: hydrolys av detta läkemedel, modifiering av aminosyror med fenylisotiocyanat, fick vi aminosyrasammansättningen av peptid nr 7. Med hjälp av data från masspektral- och NMR-analyser, Edmon-nedbrytning, kunde vi erhålla inte bara aminosyrasammansättningen utan även aminosyrasekvensen för peptid nr 7.

Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro En effektiv fastfassyntesprocess beror till stor del på det korrekta valet av olika villkor för dess implementering, såsom val av harts, lösningsmedel och synteskinetik. Dessa variabler påverkar graden av svallning av hartset och dess association med aminosyror, antalet bindningsställen, vilket i slutändan påverkar syntesen av peptiden som helhet. Vi anpassade processen för fastfassyntes i förhållande till våra studerade peptider, med hänsyn till särdragen hos deras aminosyrasekvens.

G.S. CHAILYAN Material och metoder. Alla reagenser, lösningsmedel, hartser som används är från Advanced Chem Techcompany. Vi använde fmoc-grupper för att skydda N-terminalen av aminosyror under syntesen och dimetylformamid (DMF) som lösningsmedel under hela syntesen. Vi använde syralabilt 2-klorotritylharts som substrat. Avlägsnandet av de skyddande fmoc-grupperna utfördes med användning av en lösning av piperidin i DMF.

Mycket viktigt i syntesprocessen är landningen av den första aminosyran på hartset. Två gram 2Cl-Trt-harts hälldes i en 10 ml spruta. DMF drogs in i sprutan, hartset fick svälla i 15 minuter. Efter det tvättades DMF ur. Sedan drogs en lösning av den första aminosyran (fmoc-Pro) och en reaktionsaktivator (DIPEA) in i sprutan i ett förhållande av 1 RESIN/1,2 FMOC-PRO/4DIPEA. Reaktionen med att plantera den första aminosyran varade i 3 timmar. Ett mycket viktigt villkor för syntesen är frånvaron av fria länkar efter plantering av den första aminosyran, därför, efter bindning till den första aminosyran, behandlades hartset med en blandning av metylen, DIPEA (diisopropyletylamin) och DMF i förhållandet 80DMF/15MEOH/5DIPEA för att blockera eventuellt kvarvarande fria ändar. Därefter tvättades hartset med DMF 5 gånger under 5 minuter. Sedan avblockerades aminosyror med en 30% lösning av piperidin i DMF 8 gånger under 5 minuter. Därefter tvättades hartset med DMF 5 gånger under 5 minuter. Denna cykel upprepades under hela syntesen av peptiden. Efter varje aminosyratillsats och avblockeringssteg övervakades reaktionens fortskridande med Kaiser-testet, vilket är reaktionen av ninhydrin med en fri aminogrupp för att bilda en karakteristisk mörkblå färg. Tack vare detta test blev det möjligt att steg-för-steg kontrollera reaktioner av laddning och deblockering av aminosyror.

Rening och kontroll av den syntetiserade peptiden nr 7 utfördes på ett 2-komponents preparativt HPLC-system från Waters (USA). En Rheodyne-injektor med en loopvolym av 500 ul användes för att injicera provet. Detektion utfördes i intervallet 190–360 nm. Vi använde en "Symmetry Si-100 C18" (4,6x250 mm) kolonn för omvänd fas HPLC. Flödeshastigheten var 50 ml/min. Ett gradientelueringssystem H2O/ACN/TFA (98/2/0,1) / (0,100,0,1) användes. Analystid 15 min. Rekromatografi utfördes på ett Knauer HPLC-analyssystem. En XbridgeC18-kolonn (2,6x150 mm) användes. Detektion utfördes vid 214 nm.

För att bekräfta de erhållna data, utsattes det syntetiserade preparatet för masspektralanalys på CSU "Analitycal spectrometri".

Resultat och diskussion. Data erhållna på kromatogrammet tyder på att renheten för den syntetiserade peptiden nr 7 efter rening är mer än 99,6 % (Fig. 1).

–  –  –

Vi utförde en jämförande kromatografisk analys av nativ peptid nr. 7 på en X-bridgeC18-kolonn under samma betingelser som dess syntetiserade analog. Jämförelseresultaten presenteras (fig. 2).

Fastfassyntes av en kardioaktiv peptid isolerad från grisatria

–  –  –

Ris. Fig. 4. Spektrogram av syntetiserade (A) och naturliga (B) preparat.

G.S. CHAILYAN Som kan ses från jämförelsen av kromatogram är den syntetiserade analogen och den naturliga peptiden nr 7 identiska i massa och frisättningstid, vilket indikerar identiteten av deras strukturer och aminosyrasekvens. Med hjälp av metoden för fastfaspeptidsyntes och med hänsyn till de strukturella egenskaperna hos den studerade peptiden lyckades vi således erhålla en homogen och identisk med den naturliga peptiden bestående av 9 aminosyror. I framtiden, med en tillräcklig mängd av läkemedlet, planerar vi att genomföra en serie biotester för att identifiera inte bara sätten att reglera hjärtaktiviteten av denna peptid, utan också verkningsmekanismerna på andra organ och system.

LITTERATUR

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Detektering och identifiering i hjärtat av en tjur ny 1.

kardioaktiva proteiner. Fråga. honung. Chemistry, 37, 2, sid. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Isolering och karaktärisering 2.

kardioaktivt tryptiskt fragment av neurohormon C-bärarprotein. Neurochemistry, 2, 3, sid. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Separation av lågmolekylära koronaaktiva föreningar 3.

hjärtmuskeln genom en kombination av gelfiltrering och polyakrylamidgelelektrofores. Biolog. tidskrift Armenien, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Fördelning av kardioaktiva proteinkomplex i hjärtat av olika djur. Biolog. tidskrift Armenien, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biokemi av nya kardioaktiva hormoner och immunmodulatorer av det funktionella systemet Neurosekretorisk hypotalamus, endokrina hjärtat. Science Publ. sid. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, 3:e upplagan, Springer Publishers, 500 s., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 sid., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Rening av koronarodilatoriska proteiner isolerade från hypotalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, sid. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. Marchs avancerade organiska kemi. Publicerad av John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, sid. 133, 2007.

–  –  –

Liknande verk:

« COMMUNITIES PUBLISHING HOUSE "NAUKA" Moskva 1979 UDC 581.55:56.017 Handling n i k v VV Utveckling av växtsamhällenas struktur. M.: Nauka, sid. 1979, 276 På modern metall...»

”Izvestia från Museifonden. A.A. Brauner №2 Volym I 2004 Museifondens handlingar. A. A. Brauner Volym I nr 2 2004 Vetenskaplig tidskrift Grundad i december 2003 Utgiven 4 gånger per år Intyg om statlig registrering OD nr 913 daterad 13.12.2003 Grundare och utgivare ... "

Uppfinningen avser ett fastfasförfarande för syntes av en peptid med formeln H-D--Nal-Thr-NH2, som använder både Boc-skyddade och Fmoc-skyddade aminosyror och ett klormetylerat polystyrenharts. 10 z.p. flyga.

Det teknikområde som uppfinningen tillhör

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställning av en peptid innehållande tre eller flera aminosyrarester, med en N-terminal aminosyra, en näst sista aminosyra intill den N-terminala aminosyran och en C-terminal aminosyra.

Tidigare känd teknik

Fastfaspeptidsyntes introducerades 1963 för att övervinna många av problemen med mellanliggande reningssteg associerade med lösningssyntes av peptider (Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2:a upplagan, 1984). Vid fastfassyntes sätts aminosyror samman (t.ex. sammanfogade) till en peptid i vilken önskad sekvens som helst, medan ena änden av kedjan (t.ex. C-terminalen) är fäst vid en olöslig bärare. När den önskade sekvensen väl har satts samman på bäraren (bäraren), frisätts peptiden (dvs. spjälkas) från bäraren. De två standardskyddsgrupperna för a-aminogrupperna i aminosyrorna som ska länkas är Boc, som avlägsnas med en stark syra, och Fmoc, som avlägsnas med en bas. Föreliggande uppfinning avser ett lämpligt förfarande för framställning av peptider med användning av en kombination av båda dessa skydd för a-aminogrupper i en syntes på ett billigt harts från klormetylerad polystyren.

Vid utformning av fastfaspeptidsyntes med användning av något av ovanstående a-aminoskyddsscheman är det viktigt att alla reaktiva "sidogrupper" av aminosyrorna som utgör peptiden skyddas från oönskade kemiska reaktioner under kedjehopsättning. Det är också önskvärt att de kemiska grupperna som väljs för att skydda de olika sidogrupperna inte avlägsnas av de reagens som används för att avskydda P-aminogrupperna. För det tredje är det viktigt att bindningen av den växande peptidkedjan till hartspartikeln är resistent mot de reagens som används i kedjesammansättningsprocessen för att avlägsna alla typer av a-aminoskydd. I fallet med ett α-aminoskyddssystem som använder Fmoc, måste sidogruppsskyddet vara resistent mot de alkaliska reagensen som används för att avlägsna Fmoc. I praktiken avlägsnas dessa sidokedjeskyddande grupper vanligtvis med svagt sura reagens efter det att sammansättningen av peptidkedjan har fullbordats. Om ett β-aminogruppskyddssystem som använder Boc används måste sidogruppsskyddet vara resistent mot det svagt sura reagenset som används för att ta bort Boc-gruppen i varje cykel. I praktiken avlägsnas dessa sidokedjeskyddande grupper i β-aminoskyddsschemat med Boc vanligtvis med vattenfri HF efter att peptidkedjesammansättningen är fullständig. I praktiken är således de vanligen använda sidokedjeskyddsgrupperna i a-aminoskyddsschemat med Fmoc inte stabila under de betingelser som används för att avskydda a-aminogrupperna med Boc. Därför kombineras inte två typer av skyddsscheman för a-aminogrupper under sammansättningen av peptidkedjan i fastfaspeptidsyntes. Dessutom, även om det billigaste polymerharts som används vid peptidsyntes (klormetylerad polystyren eller "Maryfield-harts") används i stor utsträckning tillsammans med aminosyror som skyddas av Boc-grupper, har det i litteraturen dragits slutsatsen att det inte är tillämpligt när det gäller skydd. av a-aminogrupper med Fmoc-grupper på grund av dess instabilitet under alkaliska betingelser (se Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2:a upplagan, 1984). Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för samanvändning av vissa peptider i fastfassyntes av både Boc-skyddade och Fmoc-skyddade aminosyror på ett Merifield-harts.

Lanreotide®, som är en somatostatinanalog, är känd för att hämma frisättning av tillväxthormon och även hämma insulin, glukagon och exokrin pankreatisk sekretion.

US-patent nr 4 853 371 beskriver och gör anspråk på Lanreotide®, ett förfarande för dess framställning och ett förfarande för att hämma utsöndringen av tillväxthormon, insulin, glukagon och exokrin pankreasutsöndring.

US patent nr. 5147856 beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av restenos.

US patent nr. 5411943 beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av hepatom.

US patent nr 5073541 beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av lungcancer.

US patentansökan nr 08/089410, inlämnad 9 juli 1993, beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av melanom.

US patent nr 5 504 069 beskriver användningen av Lanreotide® för att hämma accelererad tillväxt av solida tumörer.

US patentansökan nr 08/854941, inlämnad 13 maj 1997, beskriver användningen av Lanreotide® för viktminskning.

US patentansökan nr 08/854 943, inlämnad 13 maj 1997, beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av insulinresistens och syndrom X.

US patent nr. 5688418 beskriver användningen av Lanreotide® för att förlänga livsdugligheten hos pankreatiska celler.

PCT-ansökan nr. PCT/US 97/14154 beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av fibros.

US patentansökan nr 08/855311, inlämnad 13 maj 1997, beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av hyperlipidemi.

US patentansökan nr 08/440061, inlämnad 12 maj 1995, beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av hyperamylinemi.

US patentansökan nr 08/852221, inlämnad 7 maj 1997, beskriver användningen av Lanreotide® för behandling av hyperprolaktinemi och prolaktinom.

Kärnan i uppfinningen

Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfarande för framställning av en peptid innehållande tre eller flera aminosyrarester, som har en N-terminal aminosyra, en näst sista aminosyra intill den N-terminala aminosyran och en C-terminal aminosyra, varvid nämnda förfarande innefattar följande steg:

(a) fästa den första aminosyran till det fasta stödhartset med en eterbindning för att bilda den första kopplingsprodukten, vilket inkluderar (i) att reagera en vattenhaltig lösning av cesiumkarbonat med en alkohollösning av den första aminosyran för att bilda ett cesiumsalt av den första aminosyran, (ii) erhållande av ett lösningsmedelsfritt cesiumsalt av den första aminosyran, (iii) reagerar det fasta stödhartset med cesiumsaltet av den första aminosyran i ett torrt (vattenfritt) polärt aprotiskt lösningsmedel för att bilda den första tilläggsprodukten,

där den första aminosyran motsvarar den C-terminala aminosyran i peptiden, blockeras aminogruppen i icke-sidokedjan (huvudkedjan) av den första aminosyran av Boc, och den första aminosyran har ingen funktionell grupp i sidokedjan som kräver skydd, och det fasta underlaget - harts - är ett harts av klormetylerad polystyren;

(b) avblockering (avblockering) av Boc från produkten från den första accessionen med en syra för att bilda en avblockerad produkt från den första accessionen;

(c) Eventuellt, fästa nästa aminosyra till den avblockerade första bindningsprodukten, vilket inkluderar att reagera nästa aminosyra med den avblockerade första bindningsprodukten i ett organiskt lösningsmedel innehållande ett peptidtillväxtreagens för att erhålla en blockerad (skyddad) nästa bindningsprodukt, varvid nästa aminosyra i huvudkedjan har en aminogrupp blockerad av Boc, och om nästa aminosyra har en eller flera funktionella grupper i sidokedjan, så kräver inte de funktionella grupperna i sidokedjan skydd eller de funktionella grupperna i sidokedjan har skyddsgrupper som är resistenta mot de sura eller alkaliska reagensen som används för att avlägsna skyddet, Boc respektive Fmoc;

(d) avskydda Boc från den blockerade nästa addukten, vilket inkluderar att reagera den blockerade nästa addukten med en syra för att erhålla en avskyddad nästa addukt;

(e) valfritt att upprepa steg (c) och (d), med varje cykel som genererar en frigjord produkt av den (X+1):e nästa bilagan, där X är numret för den erforderliga upprepningen av cykeln;

(f) tillsats av nästa aminosyra till den frisatta första bindningsprodukten från steg (b) eller, valfritt, till den frigjorda (X+1) nästa bindningsprodukten från steg (e), vilket involverar att reagera nästa aminosyra med nämnda första bindningsprodukt eller med den specificerade avblockerade produkten av (X+1):e nästa bindning i ett organiskt lösningsmedel innehållande ett reagens för att odla peptiden för att erhålla en blockerad (skyddad) nästa bindningsprodukt, och nästa aminosyra har en huvudkedja aminogrupp blockerad av Fmoc, förutsatt att om nästa aminosyra har en eller flera funktionella grupper i sidokedjan, så kräver inte de funktionella grupperna i sidokedjan skydd, eller så har de funktionella grupperna i sidokedjan skyddsgrupper som är resistent mot de alkaliska reagensen som används för att avskydda Fmoc;

(g) avskydda Fmoc från den blockerade nästa addukten, vilket inkluderar att reagera den blockerade nästa addukten med en primär eller sekundär amin för att erhålla en avskyddad nästa addukt;

(h) eventuellt upprepa steg (e) och (g), med varje cykel genererar en avblockerad produkt av (X+1) nästa tillägg, där X är numret på den nödvändiga upprepningen av cykeln, tills den näst sista ingår i peptiden och avblockerad aminosyra;

(i) fästa den N-terminala aminosyran till den avskyddade (X+1) nästa accessionsprodukten, vilket inkluderar att reagera den N-terminala aminosyran med den avskyddade (X+1) nästa accessionsprodukten i ett organiskt lösningsmedel innehållande en peptidtillväxtreagens, för att erhålla en blockerad slutprodukt, varvid den N-terminala aminosyran har en ryggradsaminogrupp blockerad av Boc eller Fmoc;

(j) avskydda Boc eller Fmoc från den blockerade fullbordade additionsprodukten, innefattande att reagera den blockerade fullbordade additionsprodukten med en syra i fallet med Boc eller en bas i fallet med Fmoc för att bilda den fullbordade peptidprodukten på hartset;

(j) om den färdiga peptidprodukten på hartset har sidokedjefunktionella grupper, då eventuellt avskydda sidokedjefunktionella grupper av den färdiga peptidprodukten på hartset, vilket inkluderar att reagera den färdiga peptidprodukten på hartset med lämpliga avskyddande reagenser för att erhålla den färdiga avskyddade peptidprodukten på harts; Och

(k) klyvning av peptiden från den fasta hartsbäraren av den färdiga peptidprodukten på harts eller den färdiga peptidprodukten på avskyddat harts för att erhålla en peptid, som innefattar att reagera den färdiga peptidprodukten på harts eller den färdiga peptidprodukten på avskyddat harts med ammoniak primär amin eller sekundär amin för det praktiska fullbordandet av klyvningen av peptiden från hartset;

med förbehållet att steg (e) och (g) i syntesen av peptiden måste utföras minst en gång.

Föredraget är förfarandet enligt föreliggande uppfinning, varvid ammoniak, primär amin eller sekundär amin i steg (k) är i ett lösningsmedel innehållande en alkohol och eventuellt ett aprotiskt polärt lösningsmedel,

Föredraget är förfarandet enligt föreliggande uppfinning, där steg (l) vidare innefattar följande steg:

utfällning av den kluvna peptiden från lösningsmedlet;

separering genom filtrering av den fasta hartsbäraren och den utfällda peptiden, och

extrahera peptiden med en sur lösning för att isolera peptiden.

Föredraget är förfarandet enligt föreliggande uppfinning, där den första aminosyran är Boc-L-Thr.

Föredraget är förfarandet enligt föreliggande uppfinning, varvid den första aminosyran är cesiumsaltet av Boc-L-Thr, vilket ger Boc-L-Thr-harts som den första kopplingsprodukten, och den avblockerade första kopplingsprodukten är H-L-Thr-harts .

Föredraget är förfarandet enligt föreliggande uppfinning, varvid syran som används för att avlägsna Boc-skyddsgruppen i steg/steg är trifluorättiksyra (TFA).

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående processen, är när det organiska lösningsmedlet är metylenklorid, kloroform eller dimetylformamid och peptidtillväxtreagenset är diisopropylkarbodiimid, dicyklohexylkarbodiimid eller N-etyl-N"-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid .

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, är en metod som innefattar att utföra steg (e) och (g) sex gånger efter bildningen av en avblockerad första kopplingsprodukt med formeln H-L-Thr-harts, där efterföljande aminosyror är bifogas i ordningen: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) och Fmoc-L- Cys(Acm) för att bilda produkten H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts.

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, är en metod som innefattar tillsats av Boc-D--Nal till H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm)-Tnr-harts enligt steg (c) för att erhålla Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-harts.

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, involverar samtidigt avlägsnande av Boc-gruppen som skyddar D--Nal, O-t-Bu-gruppen som skyddar Tyr och Boc-gruppen som skyddar Lys i Boc-D--Nal-Cys(Acm) )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts enligt steg (i), för att erhålla en färdig peptidprodukt på hartset med formeln H-D- - Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-harts.

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, innefattar klyvning av H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-peptiden från det fasta hartset genom att utföra reaktionen H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-harts med ammoniak i ett lösningsmedel innehållande en alkohol och eventuellt ett aprotiskt polärt lösningsmedel för att väsentligen fullständig eliminering för att ge H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Den föredragna processen, relaterad till den omedelbart föregående processen, är där alkoholen är metanol och det polära aprotiska lösningsmedlet är dimetylformamid.

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, involverar samtidigt avlägsnande av Acm-skyddande Cys-grupper och cyklisering av de resulterande avskyddade Cys-resterna i den färdiga peptidprodukten med formeln H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH2 genom att utföra reaktionen av H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 med en lösning av jod i alkohol till nästan fullständig avskyddning och cyklisering för att ge H-D--Nal--Thr-NH2.

Den föredragna metoden, relaterad till den omedelbart föregående metoden, är den metod där peptiden är H-D--Nal--Thr-NH2.

En föredragen metod, relaterad till den omedelbart föregående metoden, är en vari peptiden är en somatostatinanalog.

Termerna som används i beskrivningen av föreliggande uppfinning definieras enligt följande:

"första aminosyra": omfattar vilken aminosyra som helst i vilken aminogruppen i huvudkedjan (inte i sidokedjan) skyddas av Boc, som är en kommersiell produkt eller kan syntetiseras enligt metoder kända för en person med ordinär skicklighet inom tekniken, till exempel Boc-L-Thr;

"första fästprodukt": beskriver en produkt som är fäst vid ett fast bärarharts som är ett resultat av tillsatsen av en första aminosyra till ett fast bärarharts, t.ex. Boc-L-Thr-harts;

"avblockerad första kopplingsprodukt": beskriver produkten som är ett resultat av avlägsnandet eller avlägsnandet av Boc-gruppen från den första kopplingsprodukten - till exempel H-L-Thr-harts, där "H" är det tillgängliga vätet i aminogruppen i huvuddelen kedja, resulterande från avskyddningssteget;

"nästa aminosyra": beskriver vilken aminosyra som helst i vilken aminogruppen i huvudkedjan är skyddad av Boc eller Fmoc, som är kommersiellt tillgänglig eller kan syntetiseras enligt metoder som är kända för fackmannen på området. Eftersom steg (c) och steg (e) kan inkluderas i en upprepad cykel där steg utförs mer än en gång, varje gång steg (c) eller steg (e) utförs, kan "nästa aminosyra" väljas oberoende från en grupp känd eller sannolikt att vara syntetiserade aminosyror i vilken aminogruppen i huvudkedjan är skyddad av Boc eller Fmoc;

"blockerad produkt av (X+1)-th nästa accession": beskriver produkten fäst till det fasta stödhartset, vilket är resultatet av kopplingen av nästa aminosyra med den "avblockerade produkten av nästa accession". Eftersom steg (c) och (d) och steg (e) och (g) kan inkluderas i en upprepad cykel där följande aminosyror kan fästas, är termen "blockerad produkt av (X+1) nästa bindning" avser den produkt som erhållits som ett resultat av var och en av de tidigare anslutningscyklerna;

"avblockerad produkt från (X+1) nästa anslutning": beskriver produkten som är resultatet av borttagandet av Fmoc-gruppen från den "blockerade produkten från (X+1) nästa anslutning";

"fullbordad peptidprodukt på harts": beskriver en peptidprodukt fäst till ett fast stödharts efter att en N-terminal aminosyra har fästs till peptidkedjan och efter att aminogruppen i den N-terminala aminosyraryggraden har avskyddats eller avblockerats men som fortfarande har några skyddsgrupper på sidokedjornas funktionella grupper, inte avlägsnade genom reaktionen, som utför avlägsnandet av skyddsgruppen från huvudkedjan av den N-terminala aminosyran; Och

"fullbordad peptidprodukt på ett avskyddat harts": beskriver en peptidprodukt fäst till en fast hartsbärare där alla skyddsgrupper har avlägsnats eller avskyddats från de funktionella grupperna i aminosyrasidokedjorna.

Exempel på syror som kan användas för att avskydda Boc är trifluorättiksyra (TFA), metansulfonsyra och organiska lösningar som innehåller HCl.

Exempel på primära och sekundära aminer som kan användas för att avskydda Fmoc är 4-(aminometyl)piperidin, piperidin, dietylamin, DBU och tris(2-aminoetyl)amin.

Exempel på icke-nukleofila baser som kan användas för att neutralisera TFA-salter av frigjorda aminogrupper (RNH 3 + CF 3 COO - dessa salter måste omvandlas till "fria" aminer (NH 2) före eller under tillsatsen av nästa aminosyra annars kommer tillsatsen inte att ske) är diisopropyletylamin (DIEA) och trietylamin (TEA).

Exempel på organiska lösningsmedel som kan användas i aminosyraadditionsreaktioner är metylenklorid, kloroform, dikloretan, dimetylformamid, dietylacetamid, tetrahydrofuran, etylacetat, 1-metyl-2-pyrrolidon, acetonitril eller en kombination av dessa lösningsmedel.

Exempel på peptidförlängare inkluderar substituerade karbodiimider såsom: diisopropylkarbodiimid, dicyklohexylkarbodiimid eller N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid.

Karboxylgrupper och aminogrupper som deltar i bildandet av en peptidamidbindning hänvisas till som en "sidokedja"-karboxylgrupp respektive aminogrupp. Å andra sidan hänvisas till alla funktionella aminosyragrupper som inte deltar i bildandet av en peptidamidbindning som funktionella grupper av "sidokedjan".

Termen "basresistent grupp" avser skyddsgrupper som används för att skydda aminosyrafunktionella grupper som (1) är basresistenta, t.ex. inte kan avlägsnas av baser såsom 4-(aminoetyl)piperidin, piperidin eller tris(2) -aminoetyl)amin, vilka är baser som vanligen används för att avlägsna Fmoc-skyddsgruppen, och (2) kan avlägsnas med en syra såsom trifluorättiksyra eller genom en annan metod såsom katalytisk hydrering.

Symbolerna "Fmoc" och "Boc" används här och i den medföljande formeln för att beteckna 9-fluorenylmetoxikarbonyl respektive t-butyloxikarbonyl.

Metoden som beskrivs ovan kan användas för att framställa peptider, företrädesvis somatostatinanaloger, såsom Lanreotide® octapeptide, som har följande formel: H-D--Nal--Thr-NH2. Om H-D--Nal--Thr-NH2 ska syntetiseras kan de basresistenta skyddsgrupperna som används för att skydda de funktionella Cys-, Lys- och Tyr-sidokedjorna vara acetamidometyl (Acm), Boc respektive tert-butyl. Asm föredras framför Cys.

Med somatostatinanalog menas en peptid som uppvisar en biologisk aktivitet som liknar (dvs agonist) eller motsatt (dvs antagonist) den hos somatostatin.

I formeln H-D--Nal--Thr-NH2 hänvisar var och en av de vanliga trebokstavsaminosyrasymbolerna (t.ex. Lys) till en strukturell aminosyrarest. Till exempel representerar symbolen Lys i formeln ovan -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Symbolen D- -Nal- representerar aminosyraresten D-2-naftylalanilyl. Paranteserna betecknar en disulfidbindning som länkar samman de fria tiolerna från två Cys-rester i peptiden, vilket indikerar att aminosyrorna i peptiden inuti parentesen bildar en cykel.

Baserat på beskrivningen som ges här kommer en fackman på området att kunna använda föreliggande uppfinning till fullo.

Såvida inte annat definieras har alla tekniska och vetenskapliga termer som används häri samma betydelse som vanligen förstås av fackmannen inom det område som föreliggande uppfinning hänför sig till. Dessutom är alla publikationer, patentansökningar, patent och andra referenser som citeras här inkorporerade häri genom hänvisning till dem.

Peptiden kan framställas i enlighet med metoden enligt föreliggande uppfinning enligt följande procedur.

En lösning av 0,5 molekvivalenter cesiumkarbonat i vatten tillsätts långsamt till en lösning av 1 molekvivalenter Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) där AA 1 motsvarar den C-terminala aminosyran löst i alkohol, helst metanol. Den resulterande blandningen omrördes i ca 1 timme vid rumstemperatur, sedan avlägsnades all alkohol och allt vatten under reducerat tryck för att ge ett torrt pulver av Boc-AA 1 cesiumsalt. Merifield-harts, 1,0 ekvivalenter (klormetylerad polystyren, 200-400 mesh, kloridjoninkorporering 1,3 mekv/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky eller Polymer Laboratories, Church Stretton, England) tvättas med ett klorerat lösningsmedel, företrädesvis diklormetan (DCM) en alkohol, företrädesvis metanol, och ett polärt aprotiskt lösningsmedel, företrädesvis dimetylformamid (DMF). Cesiumsalt Boc-AA 1-pulver löses i ett vattenfritt (torrt) polärt aprotiskt lösningsmedel, företrädesvis DMF, och lösningen kombineras med det tidigare tvättade hartset. Uppslamningen omröres försiktigt vid cirka 45°-65°C, företrädesvis vid 50°-60°C, under cirka 48 till 106 timmar, företrädesvis 85 till 90 timmar, under en inert atmosfär såsom kväve. Hartset separeras genom filtrering och tvättas noggrant med ett polärt aprotiskt lösningsmedel, företrädesvis DMF, vatten och slutligen en alkohol såsom MeOH. Boc-AA 1 harts torkas under reducerat tryck.

Boc-AA 1 -harts införs i en glasreaktor med en filterbotten gjord av grovt smält glas. Hartset tvättas med ett klorerat lösningsmedel såsom DCM, avblockeras med en organisk syra, företrädesvis 25 % TFA i DCM, tvättas kort med en klorerad lösning såsom DCM och en alkohol såsom MeOH, neutraliserad med en organisk bas, företrädesvis trietylamin i DCM, och tvättades igen med DCM och ett polärt aprotiskt lösningsmedel såsom DMF för att ge ett avskyddat AAi-harts.

Varje önskat antal aminosyror fästs sedan eventuellt till det avskyddade AAi-hartset. Om nästa aminosyra har en α-aminogrupp med Fmoc-skydd (Fmoc-AA x), så kräver sidokedjegruppen antingen inget skydd (till exempel Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe eller Fmoc- Thr) eller så skyddar sidokedjan med en basresistent grupp. Ett molärt överskott av Fmoc-AA x (där x är positionsnumret för aminosyran i peptiden, räknat från C-terminalen) fästs under cirka 60 minuter till det avskyddade AA 1-hartset med ett peptidtillväxtreagens såsom diisopropylkarbodiimid (DIC), i en DCM/DMF-blandning. Tillsatshartset tvättades med DMF, alkohol och DCM för att ge ett Fmoc-AA x -AAi-harts. Fästningen kan kontrolleras med Kaiser ninhydrinmetoden. Därefter tvättas Fmoc-AA x-AAi-hartset en gång med DMF och avblockeras sedan med en lösning av en bas i ett organiskt lösningsmedel såsom piperidin i DMF för att erhålla ett AA x-AAi-harts. AA x -AAi-hartset tvättas sedan med DMF, följt av tvättning flera gånger med både en alkohol såsom MeOH och DCM. AA x-AAi-hartset tvättas sedan en gång med DMF i cirka 3 minuter, tre gånger med isopropanol, företrädesvis under cirka 2 minuter varje gång, och tre gånger med DCM, företrädesvis under cirka 2 minuter varje gång. Hartset är sedan redo för ytterligare vidhäftning av antingen en Fmoc-skyddad aminosyra som beskrivs ovan eller en Boc-skyddad aminosyra som beskrivs nedan.

På liknande sätt, om någon efterföljande aminosyra som ska fästas till det avskyddade AA 1-hartset väljs med en skyddad Boc-aminogrupp (Boc-AA x), då krävs antingen inget skydd för sidokedjegruppen (detta kan vara Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe eller Boc-Thr), eller så måste sidokedjan skyddas med en grupp som är resistent mot avlägsnande av både syra och bas, vilket kan vara Boc-Cys(Acm). Om Boc-AA x väljs fästs den med samma reagens och lösningsmedel som beskrivits ovan för Fmoc-aminosyror, och fullständigheten (fullbordad) av vidhäftningen kan kontrolleras med Kaisers ninhydrinmetoden. Därefter avskyddas Boc-AA x-AAi-hartset med en syralösning i ett organiskt lösningsmedel såsom TFA i DCM för att ge ett CF3CO-H+-AA x-AAi-harts. Detta harts tvättas sedan flera gånger med ett klorerat lösningsmedel såsom DCM, en alkohol såsom MeOH, och neutraliseras med en icke-nukleofil bas såsom trietylamin i DCM, och tvättas sedan flera gånger till med ett klorerat lösningsmedel såsom DCM för att ge AA x -AA 1 - harts. Hartset är sedan redo för ytterligare vidhäftning av den skyddade Boc- eller Fmoc-aminosyran såsom beskrivits ovan.

Beroende på den önskade sekvensen av peptiden och typen av α-aminoskyddad aminosyra som används (antingen Fmoc-skyddad eller Boc-skyddad), används en lämplig kombination av ovanstående vidhäftningsprocedurer, beroende på vilken aminosyra som ska ske i peptidsekvens - sidokedja, med en skyddande grupp som kan avlägsnas med antingen basen som är nödvändig för att avlägsna Fmoc från a-aminogruppen, eller den syra som är nödvändig för att avlägsna Boc från a-aminogruppen. En sådan skyddad aminosyra kan vara N-p-Boc-N'-p-Fmoc-lysin eller N-p-Fmoc-N'-p-Boc-lysin. Om så är fallet måste alla selekterbara skyddsgrupper för a-aminogrupperna i efterföljande aminosyror, upp till den N-terminala aminosyran, vara kompatibla med sidogruppsskyddet som valts för den positionen. Detta betyder att sidokedjeskyddsgrupperna måste vara resistenta mot avblockeringsmedlet som används för att avskydda a-aminogrupperna i efterföljande aminosyror. För den N-terminala aminosyran kan antingen Boc eller Fmoc användas som a-aminoskydd, eftersom avskyddning av den N-terminala aminosyran samtidigt kan avskydda vissa av de skyddade sidokedjorna utan att oönskat påverka peptidsyntesstrategin, eftersom ingen aminosyror är tillgängliga längre.

Den färdiga peptidkedjan, som fortfarande är fäst vid hartset, måste avskyddas och frigöras. För att avlägsna alla basresistenta skyddsgrupper och den a-aminoblockerande gruppen i den N-terminala aminosyran, om tillämpligt, behandlas peptiden på hartset med en syra i ett organiskt lösningsmedel såsom TFA i DCM. För att avlägsna eventuella syraresistenta skyddsgrupper och den a-aminoblockerande gruppen i den N-terminala aminosyran, om tillämpligt, behandlas peptiden på hartset med en organisk bas såsom piperidin i DMF. Alternativt kan de syraresistenta grupperna bibehållas tills de avlägsnas vid efterföljande klyvning av peptiden med ammoniak eller en aminbas. Peptiden på det avskyddade hartset tvättas sedan med ett klorerat lösningsmedel såsom DCM, en alkohol såsom MeOH och torkas till konstant vikt under reducerat tryck.

Peptiden klyvs från hartset och C-terminalen omvandlas till amiden genom att suspendera peptiden på hartset i 3:1 MeOH/DMF. Uppslamningen kyls till en temperatur under ca 10°C under kväveatmosfär och vattenfri ammoniakgas införs under lösningsmedlets yta tills lösningen är mättad med det, medan temperaturen hålls under ca 10°C. Uppslamningen omröres försiktigt under cirka 24 timmar medan temperaturen tillåts stiga till cirka 20°C. Graden av fullbordande av reaktionen kontrolleras genom att metylestermellanprodukten försvinner i HPLC under lämpliga betingelser beroende på typen av peptid. Reaktionsblandningen kyls och den erforderliga mängden vattenfri ammoniak tillsätts tills topparean motsvarande metylestern på HPLC är mindre än 10% av topparean för den önskade produkten. Uppslamningen kyls till under ca 10°C och omröring fortsätter över natten för att fälla ut peptiden. Fällningen och hartset separeras genom filtrering och tvättas med kall MeOH. Fällningen och hartset torkas under reducerat tryck, produkten extraheras från hartset med en vattenlösning av ättiksyra.

Om peptiden innehåller skyddade Cys-rester i sin sekvens, kan tiolgrupperna avskyddas och resterna cykliseras enligt följande procedur. Peptiden som innehåller de skyddade Asm-grupperna i Cys löses i en vattenlösning av ättiksyra under kväveatmosfär. Lösningen rörs om snabbt och en lösning av jod i alkohol tillsätts i en portion. Blandningen omrörs och kontrolleras med HPLC för fullständig avskyddning. Därefter stoppas reaktionen genom titrering med 2% natriumtiosulfatlösning tills färgen på lösningen försvinner. Den råa blandningen renades genom preparativ kromatografi på en C8-patron med en gradient av acetonitril i 0,1 ammoniumacetatbuffert, avsaltades på en C8-patron med en gradient av acetonitril i 0,25 N ättiksyra och lyofiliserades för att ge målpeptiden.

En exemplifierande utföringsform av uppfinningen

Följande exempel tillhandahålls för att illustrera förfarandet enligt föreliggande uppfinning och bör inte tolkas som att det begränsar dess omfång.

Exempel 1. H2-D--Nal--Thr-NH2

A) Boc-L-Thr-harts

En lösning av 2,58 g cesiumkarbonat i 2,5 ml vatten sattes långsamt till en lösning av 3,48 g Boc-L-treonin (Bachem California, Torrance, CA) löst i 7 ml metanol. Den resulterande blandningen omrördes i ungefär 1 timme vid rumstemperatur, sedan avlägsnades all metanol och allt vatten under reducerat tryck för att ge ett torrt pulver av Boc-L-treonin-cesiumsalt. 10 g Maryfield-harts (klormetylerad polystyren, 200-400 mesh, klorinkorporering 1,3 mekv/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) tvättades med diklormetan (DCM), metanol (MeOH) och dimetylformamid (DMF) (2 gånger 70 vardera) ml). Boc-L-treonincesiumsaltpulver löstes i 60 ml torr DMF och lösningen kombinerades med hartset som tvättades enligt ovan. Uppslamningen omrördes försiktigt vid en temperatur av cirka 50°-60°C under cirka 85 till 90 timmar under en kväveatmosfär. Hartset separerades genom filtrering och tvättades noggrant med DMF, avjoniserat vatten och slutligen med MeOH. Boc-treoninhartset torkades under reducerat tryck vid ungefär 40°C. Inneslutningen av treonin var 0,85±0,15 mekv/g torrt harts.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-harts

2,0 g av Boc-treoninhartset från steg (A) infördes i en 50 ml glasreaktor med en grovt smält glasfilterbotten (belastning 1,74 mmol). Hartset tvättades 2 gånger med DCM (20 ml), varje gång i cirka 5 minuter, avblockerades med 25 % TFA i DCM (30 ml) - första gången i cirka 2 minuter och andra gången i cirka 25 minuter, tvättades 3 gånger i ca 2 min DCM (20 ml), isopropanol (20 ml) och DCM (20 ml), neutraliserad två gånger i ca 5 min med 10 % trietylamin i DCM (20 ml), tvättad 3 gånger i ca 2 min med DCM och tvättades en gång med DMF (20 ml) i ca 5 min.

Till det avblockerade hartset sattes 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-cystein(Acm) (Bachem, CA) och 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) diisopropylkarbodiimid (DIC) i 14 ml 2:1 DCM/DMF under cirka 1 h. Efter tillsats tvättades hartset en gång i cirka 3 minuter med DMF (20 ml), 3 gånger under cirka 2 minuter med 2 min DXM (20 ml). Bindningen kontrollerades med Kaiser-nihydrinmetoden.

Efter fastsättning tvättades hartset en gång med DMF och avblockerades sedan med en lösning av piperidin i DMF. Det avblockerade hartset tvättades sedan med DMF och tvättades flera gånger samtidigt med MeOH och DCM. Kopplingshartset tvättades 1 gång under cirka 3 minuter med DMF (20 ml), 3 gånger under cirka 2 minuter med isopropanol (20 ml) och 3 gånger med DCM (20 ml) under cirka 2 minuter varje gång. Bindning testades med Kaiser-ninhydrinmetoden.

Var och en av följande skyddade aminosyror fästes till det tvättade hartset med användning av DIC i DMF/DCM och frigjordes enligt beskrivningen ovan i följande sekvens: Fmoc-L-valin, Fmoc-L-lysin(Boc), Fmoc-D-tryptofan, Fmoc-L-tyrosin (O-t-Bu) och Fmoc-L-cystein (Acm) (alla från Bachem Kalifornien), Boc-D-2-naftylalanin (Synthethech, Albany, OR).

Den färdiga peptidkedjan avblockerades och skyddades två gånger med 75:20:5 DCM/TFA/anisol (30 ml) i cirka 2 minuter och cirka 25 minuter, tvättades 3 gånger i cirka 2 minuter varje gång med DCM (20 ml), isopropanol (10 ml) och DCM (20 ml), neutraliserades 2 gånger under ca 5 min med 10 % trietylamin i DCM (20 ml) och tvättades 3 gånger under ca 2 min med DCM (20 ml) och MeOH (20 ml). Hartset torkades under reducerat tryck. Torrvikten var 3,91 g (103 % av teoretiskt utbyte).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2,93 g av det peptidladdade hartset från steg (B) (1,3 mmol-ekv.) suspenderades i 50 ml av en 3:1 MeOH/DMF-blandning. Uppslamningen kyldes till en temperatur under cirka 10°C under en kväveatmosfär och torr ammoniakgas spolades tills lösningen var mättad med den, medan temperaturen hölls under cirka 10°C. Uppslamningen omrördes försiktigt under cirka 24 timmar, vilket tillät temperaturen att stiga till cirka 20°C. Graden av fullbordande av reaktionen kontrollerades genom att metylestermellanprodukten försvann med hjälp av HPLC (VYDAC® sorbent, kornstorlek 5 μm, porstorlek 100 Å, C18, eluering under isokratiska förhållanden 26 % CH 3 CN i 0,1 % TFA, hastighet 1 ml/min, registrerande vid 220 mm; under dessa förhållanden, retardationstiden Rt ~ 14 min för metylestern och ~ 9,3 min för amidprodukten). Reaktionsblandningen kyldes och ett överskott av vattenfri ammoniak tillsattes tills topparean motsvarande metylestern på HPLC var mindre än 10 % av topparean för den önskade produkten. Uppslamningen kyldes till en temperatur under ungefär 10°C, omrörningen fortsattes över natten för att fälla ut peptiden. Fällningen och hartset separerades genom filtrering och tvättades med 15 ml kall MeOH. Fällningen och hartset torkades under reducerat tryck, produkten extraherades från hartset med 50% vattenhaltig ättiksyralösning (3 x 30 ml). HPLC-analys visade 870 mg (0,70 mmol) av titelprodukten i blandningen (96% ren i isokratiskt HPLC-system).

D) H-D--Nal--Thr-NH2

500 mg (0,40 mmol) av peptiden från steg (B) löstes i 300 ml 4% ättiksyra och upphettades till ca 55°C under kväve. Lösningen omrördes snabbt och en 2% vikt/volym lösning av jod i 7,7 ml MeOH (0,60 mmol) tillsattes i en portion. Blandningen omrördes under cirka 15 minuter, därefter stoppades reaktionen genom titrering med 2% natriumtiosulfatlösning tills färgen försvann (~2 ml). Blandningen kyldes till rumstemperatur och filtrerades. Blandningen renades genom preparativ kromatografi på en C8-kolonn (YMC, Inc., Wilmington, NC) med en gradient av acetonitril i 0,1 M ammoniumacetat, avsaltades på en C8 YMC-kolonn med en gradient av acetonitril i 0,25 N ättiksyra, och lyofiliserades för att ge 350 mg målpeptid i 99 % renhet.

Baserat på ovanstående beskrivning kan en fackman inom området lätt känna igen de väsentliga särdragen hos föreliggande uppfinning och, utan att avvika från dess anda och omfattning, göra olika ändringar och modifieringar av uppfinningen för att anpassa den till olika tillämpningar och förhållanden. Således omfattas även andra utföringsformer av uppfinningen av patentkraven.

KRAV

1. Förfarande för framställning av en peptid med formeln H-D--Nal--Thr-NH2, vilket förfarande innefattar följande steg:

(a) fästa en första aminosyra till ett fast bärarharts genom en eterbindning för att bilda en "första kopplingsprodukt", vilket inkluderar (i) att reagera en vattenhaltig lösning av cesiumkarbonat med en alkohollösning av den första aminosyran för att bilda cesiumsalt av den första aminosyran, (ii) erhållande av ett lösningsmedelsfritt cesiumsalt av den första aminosyran, (iii) reagerar det fasta stödhartset med cesiumsaltet av den första aminosyran i ett vattenfritt polärt aprotiskt lösningsmedel för att bilda ett "första tilläggsprodukt",

där den första aminosyran är Boc-L-Thr, som motsvarar den C-terminala aminosyran i denna peptid, och hartset i fast media är ett harts av klormetylerad polystyren;

(b) avskydda Boc från den första additionsprodukten med en syra för att bilda en "avskyddad första additionsprodukt";

(c) Eventuellt kan man lägga till "nästa aminosyra" till den "avblockerade första bindningsprodukten" som inkluderar reaktion av "nästa aminosyra" med den "avblockerade första bindningsprodukten" i ett organiskt lösningsmedel som innehåller peptidtillväxtreagenset för att erhålla "blockerad nästa aminosyraprodukt". addition", och "nästa aminosyra" har en aminogrupp blockerad av Boc i huvudkedjan, och om denna "nästa aminosyra" har en eller flera funktionella grupper i sidokedjan, då de funktionella grupperna i sidokedjan kräver inte skydd eller dessa funktionella grupper i sidokedjan har skyddsgrupper som är stabila mot sura eller alkaliska avskyddande medel, Boc respektive Fmoc;

(d) avskydda Boc från den "blockerade nästa produkt" vilket inkluderar att reagera den "blockerade nästa produkten" med en syra för att erhålla en "avblockerad nästa produkt";

(e) valfritt, upprepa steg (c) och (d), med varje cykel som producerar en "avblockerad produkt av (X+1) nästa fäste", där X är antalet önskade cykelrepetitioner;

(e) lägga till "nästa aminosyra" till den "avblockerade första länkprodukten" från steg (b) eller, valfritt, till den "avblockerade produkten av (X+1) nästa länk" från steg (e), vilket inkluderar att utföra reaktionen "nästa aminosyra" med den specificerade "avblockerade produkten av den första bindningen" eller med den specificerade "avblockerade produkten av (X + 1) nästa bindning" i ett organiskt lösningsmedel innehållande ett reagens för odling av peptiden för att erhålla en "blockerad nästa bindningsprodukt", och denna "nästa aminosyra "har en Fmoc-blockerad huvudkedjas aminogrupp, förutsatt att om den "nästa aminosyran" har en eller flera funktionella grupper i sidokedjan, då de funktionella grupperna i sidokedjan inte kräver skydd, eller så har de funktionella grupperna i sidokedjan skyddsgrupper som är resistenta mot alkaliska reagens som används för att avskydda Fmoc;

(g) avskydda den "blockerade nästa produkten" Fmoc, vilket inkluderar att reagera den "blockerade nästa produkten" med en primär eller sekundär amin för att erhålla en "avblockerad nästa produkt";

(h) eventuellt upprepa steg (e) och (g), med varje cykel som producerar en "avblockerad produkt av (X+1) nästa bilaga", där X är det önskade antalet cykelrepetitioner tills de ingår i peptid och den näst sista aminosyran frisätts;

(i) lägga till en N-terminal aminosyra till den "avblockerade produkten av (X+1):e nästa accession", vilket inkluderar att reagera den N-terminala aminosyran med den "avblockerade produkten av (X+1) nästa accession" i ett organiskt lösningsmedel innehållande ett reagens för att förlänga en peptid för att bilda en "blockerad fullständig vidhäftningsprodukt" varvid den "N-terminala aminosyran" har en ryggradsaminogrupp blockerad av Boc eller Fmoc;

(j) avskydda Boc eller Fmoc från den "blockerade färdiga produkten" innefattande att reagera den "blockerade färdiga produkten" med en syra i fallet med Boc eller en bas i fallet med Fmoc för att bilda den färdiga peptidprodukten på hartset;

(j) om den "hartsterminerade peptidprodukten" har sidokedjefunktionella grupper, då eventuellt avskydda de "hartsterminerade peptidproduktens" sidokedjefunktionella grupper, vilket inkluderar att reagera den "hartsterminerade peptidprodukten" med lämpliga avskyddande reagens att producera en "komplett peptidprodukt på ett avskyddat harts"; Och

(k) klyvning av peptiden från den fasta hartsbäraren av den "färdiga peptidprodukten på harts" eller "slutlig peptidprodukt på avskyddat harts" för att erhålla en peptid, som innefattar att reagera "färdig peptidprodukt på harts" eller "färdig peptidprodukt på harts" harts"; avskyddat harts" med ammoniak, en primär amin eller en sekundär amin tills klyvningen av peptiden från hartset är nästan fullständig;

förutsatt att steg (e) och (g) i syntesen av peptiden utförs sex gånger efter bildandet av den "avblockerade produkten av den första bindningen" med formeln H-L-Thr-harts, där efterföljande aminosyror är fästa i ordningen: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) och Fmoc-L-Cys( Acm) för att bilda H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att ammoniak, primär amin eller sekundär amin i steg (k) är i ett lösningsmedel innehållande en alkohol och eventuellt ett aprotiskt polärt lösningsmedel.

3. Förfarande enligt krav 1, där steg (l) vidare innefattar följande steg:

(i) utfällning av den kluvna peptiden från lösningsmedlet;

(ii) filtrering av den fasta hartsbäraren och den utfällda peptiden, och

(iii) extrahera peptiden med en sur lösning för att isolera peptiden.

4. Förfarande enligt något av kraven 1 till 3, varvid den första aminosyran är cesiumsaltet av Boc-L-Thr, vilket ger Boc-L-Thr-harts som den första kopplingsprodukten, och den "avblockerade första kopplingsprodukten " är H-L-Thr-harts.

5. Förfarande enligt krav 4, varvid syran som används för att avlägsna Boc-skyddsgruppen i steg (i) är trifluorättiksyra (TFA).

6. Förfarande enligt krav 5, varvid det organiska lösningsmedlet är metylenklorid, kloroform eller dimetylformamid och peptidtillväxtreagenset är diisopropylkarbodiimid, dicyklohexylkarbodiimid eller N-etyl-N"-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid.

7. Förfarande enligt krav 6, innefattande att fästa Boc-D--Nal till H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts enligt steg (i) för att erhålla Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts.

8. Förfarande enligt krav 7, innefattande det samtidiga avlägsnandet av Boc-gruppen som blockerar D--Nal, O-t-Bu-gruppen som skyddar Tyr och Boc-gruppen som skyddar Lys i Boc-D--Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-harts, enligt steg (d) för att erhålla en färdig peptidprodukt på hartset med formel H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-harts.

9. Förfarande enligt krav 8, innefattande klyvning av peptiden H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr från det fasta hartset genom att utföra reaktionen H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-harts med ammoniak i ett lösningsmedel innehållande en alkohol och eventuellt ett aprotiskt polärt lösningsmedel tills väsentligen fullständig eliminering för att ge H-D--Nal -Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

10. Förfarande enligt krav 9, kännetecknat av att alkoholen är metanol och det polära aprotiska lösningsmedlet är dimetylformamid.

11. Förfarande enligt krav 10, innefattande att samtidigt avlägsna Acm-grupperna som skyddar Cys och cyklisera de resulterande avskyddade Cys-resterna i den "fullständiga peptidprodukten på hartset" med formeln H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 genom att utföra reaktionen av H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 med en lösning av jod i alkohol för att väsentligen fullständig avskyddning och cyklisering för att ge H-D--Nal--Thr-NH2.

Peptidsyntes i fast fas föreslogs av R.B. Merrifield vid Rockefeller University (Nobelpriset 1984). Denna metod är baserad på sammansättning av en peptid på ett olösligt polymert underlag genom sekventiell addition av aminosyrarester med skyddade a-amino- och sidogrupper. Planen var att sätta ihop peptidkedjan i steg, där kedjan hade ena änden fäst vid ett fast underlag under syntesen. Som ett resultat reducerades isoleringen och reningen av intermediära och målpeptidderivat till en enkel filtrering och noggrann tvättning av den fasta polymeren för att avlägsna alla överskott av reagens och biprodukter som finns kvar i lösning.

Termen fast fas avser snarare de fysikaliska egenskaperna hos ämnet på bäraren, eftersom den kemiska reaktionen på polymerbäraren fortskrider i en fas - i lösning. I ett lämpligt lösningsmedel sväller polymeren och förvandlas till en lågviskös men högstrukturerad gel (tvärbundna polymerer) eller löses upp (i fallet med icke-tvärbundna polymerer), och syntesprocessen sker på en ultramikroheterogen nivå, i en praktiskt taget homogent system.

Organisk syntes i fast fas kräver en polymerbas - harts S till vilken länken är fäst L. I det första skedet en substratmolekyl är fäst vid länken A.Molekyl A immobiliserad (dvs. upphör att vara rörlig), men behåller förmågan att reagera med ett annat reagens I(steg 2).

Produkt AB kvarstår på hartset, vilket gör att det kan separeras från överskott av reagens I(och biprodukter) genom enkel tvättning. (Du kan lägga till alla nya reagenser, vilket successivt komplicerar det ursprungliga substratet A, huvudsaken är att länken förblir oförändrad i dessa reaktioner). Bifunktionell länkare L väljs så att dess förbindelse med hartset S var mer hållbar än med underlaget A. Sedan i det sista steget målföreningen AB kan separeras från hartset och förstöra dess förbindelse med länken. Det är tydligt att sambandet L-AB måste klyvas under milda förhållanden utan att skada vare sig själva föreningen (bindning A-I inte heller kontakt mellan länken och hartset (bindning L-S).

Sålunda, idealiskt, genom att tvätta hartset efter varje steg och klyva bindningen med bäraren, erhålls en ren substans. Det är naturligt att anta att användningen av ett stort överskott av reagens och efterföljande separation från hartset i många fall gör det möjligt att förskjuta den kemiska jämvikten mot bildningen av målprodukten och minska syntestiden. Nackdelarna med organisk syntes i fast fas inkluderar behovet av att använda ett tillräckligt stort överskott (2–30 ekvivalenter) av reagens, svårigheter att identifiera mellanliggande syntesprodukter och den relativt höga kostnaden för modifierade polymerbärare, som bestäms av kostnaden för länken.

Infört av Merrifield i praktiken av organisk syntes, klormetylpolystyren (tvärbunden med en liten mängd divinylbensen), det så kallade Merrifield-hartset, är den mest tillgängliga av polymerbärarna.

Metodik och huvudstadier av fastfaspeptidsyntes

Uppgiften kräver införandet av en polymerbärare med en ympad aminosyra i en reaktion med en heterocykel aktiverad för substitution. Låt oss överväga mer i detalj den metodologiska aspekten av att erhålla immobiliserade aminosyror på polymera bärare.

Skede1. Immobilisering av en N-skyddad aminosyra på en polymerbärare.

Det första steget i vårt schema är immobiliseringen av aminosyran på en polymerbärare. För att undvika sådana sidoprocesser som bildningen av oligopeptider, skyddas aminosyran preliminärt. Vanligtvis används N-skyddade aminosyror och den resulterande bindningen mellan aminosyran och bäraren är av amid- eller estertyp.

De vanligaste aminogruppsskydden vid organisk syntes i fast fas är skyddsgrupperna av karbamattyp tert-butoxikarbonyl (Boc) och 9H-fluorenylmetoxikarbonylskydd (Fmoc), X är den skyddade gruppen:

Det bör noteras att valet av skyddsgrupp bestäms av typen av polymerbärare som används. Villkoren för immobilisering av skyddade aminosyror är olika för olika typer av polymera bärare. Immobilisering av Boc-aminosyror på Merrifield-harts, som är en klormetylerad polystyren, utförs på plats som cesiumsalter med tillsats av en suspension av cesiumkarbonat i dimetylftalat (DMF) och katalytiska mängder kaliumjodid. Överskottet av reagens i förhållande till mängden bärare väljs i varje fall individuellt och uppgår till 1,5-4 ekvivalenter.

Immobiliseringen av Fmoc-aminosyror på en Wang (X=O) polymerbärare för att bilda en esterlinker av bensyltyp utförs med karbodiimidmetoden med användning av diisopropylkarbodiimid (DIC) i närvaro av 4-(dimetylamino)pyridin (DMAP) som en katalysator. Immobiliseringsreaktionen med steriskt obehindrade aminosyror fortskrider vid rumstemperatur. Immobilisering av steriskt hindrade aminosyror kräver att reaktionen utförs vid 40–60°C under 2 dagar och upprepad immobilisering (schema 1). Immobilisering av Fmoc - aminosyror på en Rink-polymerbärare (X=NH) med bildning av en amidlinker av benshydryltyp utförs i närvaro av ett Castro-reagens (1H-1,2,3-bensotriazol-1-yloxi) tris-(dimetylamino)fosfoniumhexafluorfosfat (BOP), diisopropyletylaminbas (DIEA) och 1-hydroxibensotriazol (HOBt), som katalysator. Reaktionen fortgår vid rumstemperatur under 2 timmar för steriskt obehindrade aminosyror och 4-6 timmar för steriskt hindrade aminosyror.

Steg 2Avskyddande av en skyddad aminosyra på en polymerbärare

I det andra steget planerat av oss (efter immobiliseringen av den skyddade aminosyran) krävs det att man tar bort skyddsgruppen för att aktivera aminogruppen. Metoderna för att ta bort Boc- och Fmoc-skydd är olika. Avlägsnande av Boc-skyddet av aminosyrorna på Merrifield-hartset utförs med 50% trifluorättiksyra i diklormetan under en halvtimme, under dessa förhållanden förblir Merrifield-länken intakt.

Efter avlägsnande av skyddet tvättas hartset med en lösning av trietylamin för att avlägsna trifluorättiksyra. Avlägsnande av Fmoc-skyddet av aminosyror på Wang (X=O) och Rink (X=NH) bärare utförs med en 20% lösning av piperidin i DMF i 40–50 min.

En signifikant minskning av hartsvikten efter avlägsnande av Fmoc-skyddet kan tjäna som en grund för gravimetrisk bestämning av graden av immobilisering av skyddade aminosyror i det första steget av fastfassyntes. Det rekommenderas att sekventiellt behandla hartset med en lösning av piperidin i dimetylftalat, först i 5–10 minuter, sedan 30 minuter i en färsk lösning. Efter avlägsnande av skyddet tvättas hartset minst 4 gånger med dimetylftalat för att avlägsna produkter av förstörelse av Fmoc-skyddet. Övervakning av acyleringsreaktionens fortskridande på bäraren eller avlägsnande av skyddsfunktionen från aminogruppen är möjligt med hjälp av Kaiser-testet.

Steg 3Nukleofil substitution i heterocykler som involverar en aminosyra immobiliserad på ett underlag

Nästa steg som planeras av oss för praktisk implementering är den aromatiska nukleofila substitutionsreaktionen; den ympade aminosyran fungerar som nukleofilen och den aktiverade heterocykeln är i lösning. De flesta reaktioner av nukleofil substitution i bärare skiljer sig inte i prestanda från reaktioner i vätskefasen. Det bör dock komma ihåg att processtemperaturen inte bör överstiga 120 С, över vilken polystyrenbasen på bäraren börjar bryta ner. Under betingelserna för reaktionen som utförs på bäraren måste länken också bevaras.

Vid val av lämpliga aktiverade heterocykliska substrat bör naturen av den lämnande gruppen i heterocykeln beaktas.

Steg 4Avlägsnande av målföreningen från polymera bärare

De flesta linkers i fastfas organisk syntes klyvs i en sur miljö. Länkarnas motstånd mot syra sjunker kraftigt när de går från Merrifield-hartset till Wang- och Rink-hartset. Rink-linkern klyver under mildare förhållanden (10–20 % CF3COOH) än Wang-linkern (50 % CF3COOH). Merrifield-harts är passivt under dessa förhållanden och transesterifiering i NaOMe/MeOH-lösning används för att klyva det, vilket leder till bildandet av en syraester.

Vi minns än en gång att länkens natur bestämmer typen av terminal funktion i den bildade molekylen som avlägsnas från substratet. Wangs harts låter dig få syror, och Rinks harts - amider.

Fördelarna med detta schema för peptidsyntes i fast fas:

1. Olika moderföreningar kan associeras med individuella pärlor. Dessa granuler blandas sedan och sålunda kan alla utgångsföreningar interagera med reagenset i ett experiment. Som ett resultat bildas reaktionsprodukter på separata granuler. I de flesta fall leder blandningen av råvaror i traditionell flytande kemi vanligtvis till misslyckanden - polymerisation eller gummining av produkter. Experiment på ett fast substrat utesluter dessa effekter.

2. Eftersom råmaterialen och produkterna är bundna till den fasta bäraren, kan överskott av reaktanter och icke-stödprodukter lätt tvättas bort från den polymera fasta bäraren.

3. Stora överskott av reagens kan användas för att driva reaktionen till fullbordan (mer än 99 %) eftersom dessa överskott lätt kan separeras.

4. Genom att använda låga satsvolymer (mindre än 0,8 mmol per gram bärare) kan oönskade sidoreaktioner undvikas.

5. Mellanprodukterna i reaktionsblandningen är bundna till granulerna och behöver inte renas.

6. Individuella polymerpärlor kan separeras i slutet av experimentet och på så sätt erhålls individuella produkter.

7. Polymersubstratet kan regenereras i de fall då brytningsförhållandena väljs och lämpliga förankringsgrupper - länkar väljs.

8. Automatisering av fastfassyntes är möjlig.

De nödvändiga villkoren för fastfassyntes, förutom närvaron av ett olösligt polymersubstrat som är inert under reaktionsförhållanden, är:

Närvaron av ett ankare eller länk är en kemisk funktion som säkerställer anslutningen av substratet med den applicerade föreningen. Det måste vara kovalent bundet till hartset. Ankaret måste också vara en reaktiv funktionell grupp för att substrat ska kunna interagera med det.

Bindningen som bildas mellan substratet och länken måste vara stabil under reaktionsbetingelserna.

Det måste finnas sätt att bryta kopplingen mellan produkten eller mellanprodukten med länken.