Naprawa DNA

Informacje ogólne

Środki uszkadzające DNA

Promieniowanie

1. promieniowanie jonizujące (promieniowanie gamma, promieniowanie rentgenowskie)

2. Promieniowanie ultrafioletowe (zwłaszcza ~260 nm, to w tym rejonie następuje maksymalna absorpcja DNA)

Reaktywne rodniki tlenowe powstają podczas normalnego oddychania komórkowego na różnych szlakach biochemicznych.
Chemia środowiskowa.

Wiele węglowodorów.

Substancje chemiczne stosowane w chemioterapii przeciwnowotworowej.

Rodzaje uszkodzeń DNA

1. Wszystkie cztery zasady DNA (A, T, C, G) mogą być kowalencyjnie modyfikowane w różnych pozycjach.
Najczęściej spotykana jest utrata grupy aminowej (deaminacja) – w tym przypadku C zamienia się w U.
Nieprawidłowe wbudowanie zasad następuje na skutek błędów w działaniu polimeraz DNA podczas replikacji.
Najczęstszym dodatkiem jest uracyl zamiast tyminy.
Naruszenia konstrukcji.
W DNA mogą wystąpić pęknięcia. Pęknięcia mogą być jednoniciowe lub obie nici DNA mogą zostać przerwane.

Promieniowanie jonizujące może być częstą przyczyną takich pęknięć.
Wiązanie kowalencyjne może utworzyć się pomiędzy sąsiadującymi zasadami, a wiązanie może utworzyć się pomiędzy sąsiednimi zasadami na tej samej nici lub pomiędzy dwiema niciami DNA.
rodzaje uszkodzeń DNA
zmiana jednej bazy
apurinizacja
zastępując C Y
zastąpienie A hipoksantyną
alkilowanie zasadowe
insercja lub delecja nukleotydu
osadzając podobną podstawę
zmiana dwóch baz
tworzenie dimerów tyminy
sieciowanie za pomocą dwufunkcyjnego środka alkilującego
zerwanie łańcucha
promieniowanie jonizujące
radioaktywne zniszczenie pierwiastków rdzeniowych
linki krzyżowe
pomiędzy podstawami jednego wątku lub dwóch równoległych wątków
pomiędzy cząsteczkami DNA i białek, takimi jak histony

Naprawa uszkodzonych podstaw

Uszkodzone fundamenty można naprawić na różne sposoby:
Bezpośrednia chemiczna naprawa uszkodzeń.

Naprawa wycinająca (ER), podczas której uszkodzone podłoże zostaje usunięte i zastąpione nowym. Istnieją trzy modele naprawy przez wycięcie, każdy wykorzystujący własny zestaw enzymów.
Naprawa przez wycięcie podstawy (BER).
Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER).
Naprawa niezgodności (MMR).

Bezpośrednia naprawa uszkodzeń.

Najczęstszą przyczyną mutacji punktowych u ludzi jest spontaniczne dodanie grupy metylowej, rodzaj alkilowania. Takie modyfikacje są korygowane przez enzymy zwane glikozylazami, które korygują błąd bez niszczenia nici DNA.

Niektóre leki stosowane w chemioterapii również uszkadzają DNA poprzez alkilację.
Problem z naprawą polega na tym, że przy ograniczonym zestawie enzymów i mechanizmów komórka musi radzić sobie z wieloma uszkodzeniami powodowanymi przez szeroką gamę czynników chemicznych i fizycznych.

Naprawa przez wycięcie podstawy (BER)

Główne kluczowe wydarzenia:

1. Usunięcie uszkodzonej zasady (zachodzi ~20 000 razy dziennie w każdej komórce ludzkiego ciała) DNA glikozyloaminy. Ludzie mają co najmniej 8 genów kodujących różne glikozylazy DNA, z których każdy rozpoznaje inny zestaw zmian podstawowych.
2. Usunięcie dezoksyrybofosforanu powoduje utworzenie pustej przestrzeni w DNA.
3. Zastąpienie właściwym nukleotydem. U człowieka tę funkcję pełni polimeraza DNA beta.
4. Podwiązanie zerwania łańcucha. Istnieją dwa enzymy, oba wymagają ATP.

Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)

NER różni się od BER pod kilkoma względami.
Stosowanie różnych układów enzymatycznych.
Nawet jeśli błąd dotyczy jednego nukleotydu, wiele nukleotydów w obszarze uszkodzenia jest usuwanych jednocześnie.

Główne kluczowe wydarzenia NER:
1. Uszkodzenie rozpoznaje się na podstawie jednego lub kilku czynników związanych z miejscem uszkodzenia.
2. DNA rozwija się w miejscu uszkodzenia. Proces ten polega
różne czynniki transkrypcyjne IIH, TFIIH (które działają również podczas normalnej transkrypcji).
3. DNA nacina się na końcach 3” i 5” uszkodzenia, w wyniku czego usuwa się fragment DNA zawierający uszkodzony nukleotyd.
4. Nowy łańcuch DNA jest uzupełniany przy użyciu matrycy nieuszkodzonego łańcucha DNA przez polimerazy delta lub epsilon.
5. Ligazy sieciują nowo zsyntetyzowany koniec łańcucha.

Xeroderma pigmentosum (XP)
XP to rzadka dziedziczna choroba człowieka, która objawia się uszkodzeniem skóry pod wpływem światła, co ostatecznie prowadzi do rozwoju raka skóry i śmierci pacjenta.
Choroba występuje na skutek mutacji w genach zaangażowanych w naprawę NER. Na przykład:
XPA koduje białko, które wiąże się z miejscem urazu i pomaga w tworzeniu kompleksu naprawczego.
XPB i XPD, które są częścią czynnika transkrypcyjnego TFIIH. Niektóre mutacje w XPB i XPD mogą również powodować przedwczesne starzenie się.
XPF odcina nić DNA od 5-calowego końca uszkodzenia.

XPG odcina łańcuch od 3-calowego końca.

Naprawa niezgodności (MMR)

Naprawa niedopasowania koryguje niedopasowane, nienaruszone zasady, które nie tworzą normalnej pary Watsona-Cricka (AT, C G). Błędy takie powstają podczas działania polimerazy DNA podczas replikacji.
Naprawa niedopasowań obejmuje enzymy zaangażowane zarówno w naprawę BER, jak i NER, a także enzymy wyspecjalizowane.
Syntezę DNA podczas naprawy niedopasowań przeprowadzają polimerazy DNA delta lub epsilon.
System naprawy niedopasowań bierze udział w zwiększaniu dokładności rekombinacji podczas mejozy.

Naprawa pęknięć DNA

Promieniowanie jonizujące i niektóre substancje chemiczne mogą uszkodzić jedną lub dwie nici DNA.
Przerwy jednoniciowe (SSB)
Pęknięcia w jednej z nici DNA są często naprawiane przez enzymy biorące udział w naprawie BER.
Przerwy dwuniciowe (DSB)
Istnieją dwa mechanizmy, które mogą wyeliminować pęknięcia dwuniciowego DNA:
Bezpośrednie połączenie uszkodzonych końcówek. Ten proces wymaga specjalnego
enzymy, które rozpoznają i wiążą połamane końce, a następnie łączą je ze sobą. Jeśli uszkodzony DNA ma tępe końce, a połączenie dwóch fragmentów DNA następuje losowo, wówczas naprawa ta nazywa się NHEJ. Białko Ku jest wymagane dla NHEJ. Ku jest podjednostką heterodimeryczną składającą się z dwóch białek Ku70 i Ku80.
Błędy występujące podczas bezpośredniego przyłączania mogą być przyczyną translokacji.
Ligaza polinukleotydowa- przywrócony pojedynczy obwód DNA pęka

Rekombinacja homologiczna

Rekombinacja homologiczna jest zdolna do naprawy uszkodzonych końców chromosomów przy użyciu DNA nieuszkodzonej chromatydy siostrzanej dostępnej po duplikacji chromosomu.
Geny wymagane do rekombinacji homologicznej to BRCA-1 i BRCA-2.

Konwersja genów
Nowym dawcą genu może zostać:
chromosom homologiczny (podczas mejozy)
chromatyda siostrzana (również podczas mejozy)
zduplikowany gen na tym samym chromosomie (podczas mitozy)

Korekta błędów wynikających z aktywności egzonukleazy 3'-5' polimerazy podczas replikacji (tylko u prokariotów) (mutacja E. coli mutD-zmiana mutatora - podjednostka DNA-pol.III)
Dimery tyminy, gen enzymu fotoliazy-phr (u niższych eukariontów)
Usunięcie przyłączonych grup alkilowych i metylowych - transferaza O-6-metyloguaniny (gen ada) - usuwa O-6-metyloguaninę
wycięcie r. zasady [E.coli] [człowiek | rozpoznawanie uszkodzeń Białko XPA w połączeniu z RPA | f-r transcr jest zaangażowany. TFIIH (aktywność P52, P34, P44, P62, XPB-XPD-helikaza) | ERCC1-XPF, XPG – nukleazy, przecinają DNA po obu stronach uszkodzenia. | Polimeraza DNA i środki pomocnicze. Białka RFC i PCNA wypełniają lukę]
R. Azotowa zasadowa glikozylaza usuwa zasadę.
Strona AP (apurynowa, apirymidynowa) | Endonukleaza AP rozpoznaje przerwę, nacięcie. 5'DNA
postreplikacyjny r. (PRR)
SOS-r. białka poł. z polimerazą DNA, dok. DNA jest zbudowane naprzeciwko uszkodzeń. DNA

Skróty.
BER – Naprawa poprzez wycięcie podstawy

NER – Naprawa poprzez wycinanie nukleotydów
MMR – naprawa niezgodności
NHEJ – niehomologiczne łączenie końców

Naprawa niezgodności

Podczas procesu replikacji, w wyniku błędów polimerazy, mogą zostać wstawione niekomplementarne nukleotydy, co może prowadzić do mutacji w potomnej nici DNA. Niesparowane zasady są rozpoznawane przez enzymy naprawiające niedopasowania i zastępują niedopasowane nukleotydy.

Enzymy tego układu zapewniają rekombinację homologiczną, a także zatrzymanie cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA.
System naprawy niedopasowań E. coli, wykorzystujący białka MutHLS, rozpoznaje i naprawia wszystkie niekomplementarne pary zasad z wyjątkiem C – C. Dodatkowo system ten naprawia małe wstawki w jednej z nici DNA powstałe na skutek błędów replikacji, których długość nie przekracza czterech nukleotydów.
Zazwyczaj E. coli ma metylowany DNA Dam metylaza według witryny GATC. Jednakże po zakończeniu replikacji potomna nić DNA pozostaje przez pewien czas niemetylowana.
Układ ten można odtworzyć in vitro przy użyciu
DNA z jedną nicią metylowaną jako substratem, do którego dodaje się oczyszczone białka MutH, MutL, MutS, UvrD (helikaza II), holoenzym polimerazy DNA III, ligazę DNA, białko SSB oraz jedną z egzonukleaz: ExoI, ExoVII lub RecJ. Proces naprawy inicjowany jest przez wprowadzenie jednoniciowego pęknięcia w niemetylowanej nici w pobliżu częściowo metylowanego miejsca GATC, a następnie hydrolizę nici DNA i wypełnienie powstałej jednoniciowej luki. W tym przypadku białko MutS wiąże się z nieprawidłowo sparowanymi nukleotydami. Białko MutL nie ma aktywności enzymatycznej, chociaż oddziałuje z MutS i jest niezbędne do aktywacji MutH, endonukleazy przeprowadzającej pęknięcia jednoniciowego DNA. Zatem kompleks MutS – MutL, złożony w miejscu DNA z źle sparowanym nukleotydem, stymuluje aktywność endonukleazy (nickazy) MutH. Układ bezkomórkowy nie wymaga obecności MutH w przypadku pęknięcia pojedynczej nici w podłożu DNA. System naprawy MutHLS może
użyj częściowo metylowanych sekwencji GATC znajdujących się powyżej i poniżej uszkodzonego regionu DNA. Jednocześnie w
Oprócz helikazy II w wycięciu błędnie włączonego nukleotydu bierze udział jedna z egzonukleaz: ExoI (3'-exo), ExoVII (3'- i 5'-exo) lub RecJ (5'-exo), w zależności od lokalizacja miejsca GATC w stosunku do skorygowanego nukleotydu. Po wycięciu nukleotydu powstała jednoniciowa przerwa jest wypełniana holoenzymem polimerazy DNA III w obecności białka SSB i ligazy DNA. Należy podkreślić, że wykorzystanie białka MutH i metylazy Dam do rozpoznawania nici potomnej replikowanego DNA jest unikalną właściwością bakterii Gram-ujemnych. Bakterie Gram-dodatnie nie metylują nici DNA w celu znakowania. Jeśli miejsca GATC są w pełni zmetylowane, system naprawy MutHLS E. coli modyfikuje niedopasowane nukleotydy na obu niciach DNA z równą skutecznością.
E. coli ma co najmniej dwa inne specyficzne
szlaki naprawy niedopasowanych nukleotydów. System VSP (bardzo krótka ścieżka naprawy łatek) naprawia niekomplementarne pary G – T, zastępując je G – C. Uważa się, że takie pary powstają w wyniku deaminacji 5-metylocytozyny w miejscach, w których reszty C są metylowane przez metylazę Dcm. Przy niższej wydajności ten sam system zastępuje pary G – U G – C. Inny system naprawy zależny od MutY w szczególności eliminuje konsekwencje uszkodzeń oksydacyjnych guaniny. Jeśli dGTP zostanie utleniony do 8-okso-dGTP, białko MutT rozszczepia ten ostatni, uniemożliwiając jego włączenie do DNA. Jeżeli mimo to jest ona włączona naprzeciwko reszty C, wówczas glikozylaza Fpg (MutM) usuwa tę zmodyfikowaną zasadę. W przypadku gdy 8-oxo-G pozostaje w DNA, w kolejnej rundzie replikacji łączy się z A i w efekcie może nastąpić transwersja G–C>T–A. W tym przypadku białko MutY pełni rolę glikozylazy DNA usuwając resztę A z nieprawidłowej pary oraz jako liaza AP wprowadzając jednoniciową
luka przylegająca do miejsca AP. Następnie następują procesy omówione już powyżej w związku z funkcjonowaniem systemu naprawczego BER. Sekwencja reakcji obejmujących MutY naprawia również niekomplementarne pary A – G i A – C, tworząc odpowiednio pary C – G i G – C. Naprawa niedopasowanych zasad u eukariontów następuje, gdy
udział kompleksu białek podobnego do bakteryjnego systemu MutHLS. Ludzkie białko GTBP jest homologiem bakteryjnego białka MutS, a w drożdżach odpowiednią rolę odgrywa białko Msh6. Rozpoznawanie niedopasowanych nukleotydów u ludzi odbywa się za pomocą heterodimeru MSH2 – GTBP. Homologami MutL w komórkach S. cerevisiae są białka MLH1 i PMS2, które występują również w postaci kompleksów heterodimerycznych. Mutacjom w genach kodujących te białka u człowieka towarzyszy powstawanie fenotypu mutatora i rozwój dziedzicznego raka jelita grubego niezwiązanego z polipowatością (zespół HNPCC).

Bezpośrednie zadośćuczynienie

Istnieją dwie główne ścieżki naprawy zasad alkilowych: naprawa przez wycięcie zasady (BER) i bezpośrednia naprawa uszkodzonych zasad. Podczas BER glikozylazy DNA rozszczepiają cytotoksyczne alkilowane zasady w DNA już w pierwszym etapie wraz z utworzeniem miejsca AP i jego późniejszą obróbką.W przypadku naprawy bezpośredniej stosuje się dwie metody: naprawę za pomocą transferaz alkilowych lub utlenianie grupy alkilowej, w obu przypadkach następuje regeneracja nienaruszonych zasad. Jeśli naprawa zachodzi przez alkilotransferazy (u ssaków tą drogą naprawiana jest tylko O ​​6-alkilguanina), wówczas transferaza O 6-alkilguaniny (AGT) przenosi grupę metylową lub etylową z O 6-alkiloguaniny na jedną z własnych reszt cysteinowych . Białko alkilowane w wyniku własnej aktywności jest inaktywowane, ale może służyć jako regulator aktywności własnego genu i kilku innych. W przeciwieństwie do samobójczych transferaz O 6-metyloguaniny, które demetylują wysoce mutagenne i toksyczne
Uszkodzenie O6-metyloguaniny, AlkB z E. coli i jej ludzkich odpowiedników hABH2 i hABH3 utleniają grupy metylowe 1-metyloadeniny (1-meA) i 3-metylocytozyny (3-meC) w DNA w celu regeneracji niezmodyfikowanych zasad adeniny i cytozyny.

Transferaza O 6-alkilguaninowa

Aktywność transferazy O 6-alkiloguaniny występuje w większości organizmów i zakłóca mutagenne działanie O 6 -alkiloguaniny. AGT przekształca O6-alkilguaninę w guaninę poprzez przeniesienie grupy alkilowej z DNA na reaktywną resztę cysteiny w białku w nieodwracalnej reakcji.

To kowalencyjne dodanie grupy alkilowej do reszty cysteiny inaktywuje enzym. Dlatego AGT jest enzymem samobójczym, który po jednym ulega degradacji proteolitycznej
reakcje transalkilowania. Badania strukturalne ujawniają, że aktywne centrum AGT znajduje się w większości enzymu, w pewnej odległości od miejsca wiązania DNA. Uważa się, że enzym „działa” poprzez mechanizm „odwracania nukleotydów”, aby zbliżyć zasadę substratu i nukleofilowe miejsce aktywne AGT.

Na myszach wykazano znaczenie AGT w ochronie ssaków przed toksycznym i mutagennym działaniem środków alkilujących. Myszy transgeniczne z nadekspresją AGT wykazywały znacznie niższe tempo inicjacji nowotworu w odpowiedzi na środek metylujący N-metylo-N-nitromocznik, podczas gdy myszy z niedoborem AGT były znacznie bardziej podatne na inicjację nowotworu i toksyczne działanie tego środka w porównaniu z myszami niezmutowanymi . AGT jest ważnym enzymem w terapii przeciwnowotworowej, ponieważ antagonizuje cytotoksyczne działanie leków przeciwnowotworowych z grupy chloroetylonitrozomocznika (CENU), m.in.
BCNU (N,N-bis(2-chloroetylo)N-nitrozomocznik) lub temozolomid. Wykazano, że ilość AGT w nowotworach w dużej mierze determinuje to, jak korzystny będzie wynik terapii przeciwnowotworowej z wykorzystaniem CENU. CENU początkowo reaguje z grupą O6-karbonylową guaniny, tworząc związek 4 , który następnie przekształca się w N 1 , O 6 -etanoguaninę 5 . Mieszanina 5 w ciągu kilku godzin przegrupowuje się w fizjologicznie aktywny ICL 6 . AGT zakłóca formację 6 podczas interakcji z 4 Lub 5 , odnawiając guaninę lub tworząc addukt DNA-białko 8 . Uzyskano eksperymentalne potwierdzenie powstania adduktu 8 , ale został wyizolowany w zbyt małej ilości, aby można było go szczegółowo opisać. Podczas biochemicznych badań tego problemu wprowadzono N1,O6-etanoksantynę
9 jako stabilny analog 5 w DNA. Etanoksantyna 9 reaguje z AGT, tworząc stabilny addukt DNA-białko 7 . Podejście to umożliwiło utworzenie kowalencyjnie połączonego adduktu AGT-DNA 10 w dużych ilościach, które można wykorzystać do określenia struktury AGT związanego z DNA. Interakcja AGT i terapii alkilującej doprowadziła do poszukiwań inhibitorów AGT, które można zastosować w terapii nowotworów w połączeniu z lekami alkilującymi. Do chwili obecnej stworzono inhibitory, głównie pochodne guaniny z podstawnikami w pozycji O 6. O 6-benzyloguanina 2 Stwierdzono, że jest to typowy inhibitor AGT, z którym porównuje się nowe cząsteczki. Skuteczność O 6-BzG we wzmacnianiu cytotoksyczności CENU wykazano na modelach zwierzęcych. Czynnikiem ograniczającym to podejście terapeutyczne jest toksyczność dla zdrowych narządów, częściowo dla szpiku kostnego. Niektóre
Grupa naukowców zamierza obejść ten problem poprzez wygenerowanie wariantu ATG odpornego na hamowanie O 6 -BzG, który można wykorzystać do ochrony szpiku kostnego poprzez transfer genów.

Oksydoreduktazy AlkB, hABH2 i hABH3

Innym sposobem bezpośredniej naprawy zasad alkilowych jest utlenianie grupy alkilowej z regeneracją nienaruszonej zasady azotowej. Enzym AlkB Escherichia coli i dwa ludzkie analogi, hABH2 i hABH3, demetylują 1-metyloadeninę i 3-metylocytozynę w DNA w ukierunkowany sposób. Jednak w przeciwieństwie do AGT, enzymy te mają specyficzność substratową skierowaną na powierzchnię par zasad G:C i A:T. Uszkodzenie 1-alkiladeniny
i 3-metylocytozyna powstają, gdy adenina i cytozyna tworzą strukturę jednoniciową (podczas replikacji lub transkrypcji) i są substratami dla AlkB, hABH2 i hABH3. Utleniają grupy metylowe 1-metyloadeniny (1-meA) i 3-metylocytozyny (3-meC) w DNA, regenerując zasady azotowe adeniny i cytozyny. Wykazano również, że AlkB chroni przed uszkodzeniami toksycznymi - adduktem z grupą etylową i przekształca 1-etyladeninę w adeninę w DNA, wytwarzając w wyniku reakcji aldehyd octowy. W ten sposób naprawia się uszkodzenia znanego mutagenu i substancji rakotwórczej, tlenku etylenu, który powstaje endogennie podczas metabolizmu etylenu i jest również szeroko stosowany jako fumigant do sterylizacji. Addukty hydroksyetylowe generowane przez tlenek etylenu znajdują się w DNA komórkowym. Inne małe epoksydy alkilujące są również stosowane w dużych ilościach w produkcji chemicznej. Wykazano, że AlkB zmniejsza toksyczne działanie środków uszkadzających DNA wytwarzających hydroksyetylen.
addukty propylu i hydroksypropylu. AlkB naprawia alkilowane trifosforany za pomocą 1-me-dATP aktywnie, ale nieefektywnie. Sugerowano, że zdolność ta może zmniejszać poziom włączania alkilowanych trifosforanów podczas syntezy DNA; ponadto fragment Klenowa polimerazy DNA I w E. coli może wykorzystywać 1-me-dATP jako prekursor do syntezy DNA in vitro. Ludzkie enzymy hABH2 i hABH3 również demetylowały reszty 1-metyloadeniny w poli(dA), ale były nieskuteczne w przypadku krótkich substratów. Zatem hABH3 wykazywało bardzo niską aktywność na trimerze d(Tp1-meApT), podczas gdy nie wykryto żadnej aktywności dla hABH2.

AlkB i jego ludzkie odpowiedniki należą do zależnej od β-ketoglutaranu/Fe(II) nadrodziny dioksygenaz, a proces naprawy obejmuje połączenie dekarboksylacji β-ketoglutaranu i oksydacyjnej demetylacji uszkodzonej zasady. Zmiany 1-meA i 3-meC powstają prawdopodobnie głównie w jednoniciowym DNA
występują w widełkach replikacyjnych oraz w aktywnie transkrybowanych genach, gdzie mogą blokować polimerazy DNA i RNA. W rzeczywistości AlkB, hABH2 i hABH3 naprawiają te uszkodzenia w jednoniciowym DNA, ale naprawa zachodzi również na oligonukleotydach przyłączonych do nici komplementarnej po alkilowaniu. Skuteczność naprawy 1-metyloadeniny przez AlkB nie zależy od struktury polinukleotydu, ale wymagana jest obecność nukleotydowej grupy 5"-fosforanowej. Również ludzkie enzymy hABH2 i hABH3 demetylowały reszty 1-metyloadeniny w poli(dA); były nieskuteczne na krótkich podłożach.Ponadto zmiany zawierające ładunek dodatni (rybonukleozydy 1-meA i 3-meC mają odpowiednio pKa = 9,3 i 9,6) były lepiej naprawiane niż zasady nienaładowane (1-meG i 3-meT). Skoro jednak 1-meG (oraz w mniejszym stopniu 3-meT) zostały naprawione przez AlkB, to formalny ładunek dodatni bazy nie jest warunkiem koniecznym funkcjonowania AlkB.
Nie jest jasne, czy wynik ten wynika z lepszego rozpoznawania zasad naładowanych dodatnio poprzez oddziaływania elektrostatyczne z AlkB, czy też zasady naładowane dodatnio po prostu sprawiają, że DNA jest lepszą grupą opuszczającą po hydroksylacji grupy metylowej.

Skróty:

• AGT – transferaza alkilguaninowa
• BER - naprawa przez wycięcie podstawy
• DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy
• RNA - kwas rybonukleinowy
• BCNU - N,N-bis(2-chloroetylo)N-nitromocznik
• CENU – chloroetylonitrozomocznik
• O 6-BzG - O 6-benzyloguanina
• 1-meA - 1-metyloadenina
• 1-meG - 1-metyloguanina
• 3-meC - 3-metylocytozyna
• 3-meT - 3-metylotymina

Literatura:

» Orlando D. Scharer (2003) Angew. Chem. Wewnętrzne wyd. 42, 2946-2974
» James C. Delaney i John M. Essigmann Mutageneza, genotoksyczność i naprawa 1-metyloadeniny, 3-alkilocytozyny, 1-metyloguaniny i 3-metylotyminy w alkB Escherichia coli
» Pertti Koivisto, Tod Duncan, Tomas Lindahl i Barbara Sedgwick Minimalny metylowany substrat i rozszerzony zakres substratów białka Escherichia coli AlkB, dioksygenazy 1-metyloadeniny-DNA*
» Duncan, T., Trewick, SC, Koivisto, P., Bates, P.A., Lindahl, T. i Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 99, 16660-16665. 5. Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., et glin. (2003) Naturę 421, 859-863.
» Hollis, T., Lau, A. i Ellenberger, T. (2000) Mutat. Rozdzielczość 460, 201-210
„Daniels, DS i Tainer, JA (2000) Mutat. Rozdzielczość 460, 151-163
Trewick, S. C., Henshaw, T. F., Hausinger, R. P., Lindahl, T. i Sedgwick, B. (2002) Nature 419, 174-178
» Falnes, P. O., Johansen, R. F. i Seeberg, E. (2002) Nature 419, 178-181
» Duncan, T., Trewick, SC, Koivisto, P., Bates, P.A., Lindahl, T. i Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 99, 16660-16665
» Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E. i Krokan , HE (2003) Nature 421, 859-863
» Aravind, L. i Koonin, E. V. (2001) Genome Biology 2, 0007.1-0007.8
„Bodell, W. J. i Singer, B. (1979) Biochemistry 18, 2860–2863
» Boiteux, S. i Laval, J. (1982) Biochimie (Paryż) 64, 637-641
» Larson, K., Sahm, J., Shenkar, R. i Strauss, B. (1985) Mutat. Rozdzielczość 150, 77-84
» Dinglay, S., Trewick, SC, Lindahl, T. i Sedgwick, B. (2000) Genes Dev. 14, 2097-2105

Naprawa pęknięć DNA

Fotoreaktywacja

Absorpcja energii promieniowania UV przez cząsteczki DNA prowadzi do powstawania różnego rodzaju uszkodzeń. Chociaż mogą wystąpić pęknięcia jedno- i dwuniciowe oraz połączenia krzyżowe DNA-białko, większość uszkodzeń wywołanych promieniowaniem UV wynika z modyfikacji zasad azotowych, z utworzeniem dimerów cyklobutanowo-pirymidynowych (CPD) i fotoproduktów pirymidyno-pirymidonowych (6 -4PP) są najczęstszymi rodzajami fotouszkodzeń.

Dimery pirymidyny są inhibitorami zarówno replikacji, jak i transkrypcji, co spowalnia wzrost i prowadzi do mutagenezy podczas replikacji DNA, jeśli takie uszkodzenia nie zostaną naprawione.

Aby usunąć uszkodzenia DNA wywołane światłem, wiele organizmów wykorzystuje enzymy, które specyficznie wiążą się z CPD (fotoliaza CPD) lub 6-4PP (fotoliaza 6-4PP) i korygują te uszkodzenia. Fotoliazy CPD występują u bakterii, grzybów, roślin, bezkręgowców i wielu kręgowców; fotoliazy 6-4PP występują dotychczas tylko u Drosophila, jedwabników, Xenopus laevis i grzechotników, ale nie u Escherichia coli ani drożdży. Fotoliazy nie wykryto u ludzi. Fotoliazy zawierają FAD jako kofaktor katalityczny i dodatkowy chromofor jako antenę zbierającą światło.

Dodatkowe chromofory to 5,10-metenylotetrahydrofolian (MTHF) lub 8-hydroksy-5-deazoriboflawina (8-HDF), z maksimami absorpcji przy długości fali odpowiednio 380 i 440 nm. Struktury krystaliczne fotoliaz CPD z E. coli i Anacystis nidulans sugerują, że aby związać DNA, enzymy obracają dimer pirymidyny z dupleksu do studzienki zawierającej kofaktor katalityczny. Pierścień cyklobutanowy jest następnie rozszczepiany w wyniku przeniesienia elektronów indukowanego światłem. Fotoliazy CPD selektywnie rozpoznają CPD, podobnie jak białka wiążące DNA. Światło białe lub promieniowanie UV-B indukuje ekspresję fotoliaz CPD. W przeciwieństwie do fotoliaz CPD, fotoliazy 6-4PP ulegają stabilnej ekspresji i nie są regulowane ani przez światło białe, ani przez promieniowanie UV-B.

Schematyczne przedstawienie fotoreaktywacji w chromatynie. Oktamery Gitone są niebieskie, DNA jest czarne. Fotoliaza wiąże się z dimerami cyklobutanopirymidyny (CPD), obraca dimer pirymidyny i regeneruje natywne pirymidyny w reakcji zależnej od światła. Fotoliaza preferencyjnie naprawia CPD w DNA linketa. Naprawa nukleosomów jest powolna i prawdopodobnie jest ułatwiona dzięki dynamicznym właściwościom nukleosomów, które przenoszą uszkodzenia DNA do regionu DNA łącznika.

Pierwszym scharakteryzowanym członkiem rodziny fotoliaz była klasa fotoliaz specyficznych dla CDP z mikroorganizmów, zdefiniowana jako fotoliazy klasy I. Niedawno odkryto blisko spokrewnioną klasę fotoliaz specyficznych dla fotoproduktów; członków tej rodziny znaleziono u Drosophila melanogaster, Xenopus laevis i Arabidopsis thaliana. Kryptochromy, które są fotoreceptorami fioletowej części widma światła występującego w roślinach i innych organizmach, są również blisko spokrewnione z fotoliazami klasy I.

Bardziej odlegle spokrewnioną rodzinę fotoliaz CPD, zwaną fotoliazami klasy II, zidentyfikowano u wielu gatunków, w tym zwierząt, Archaebacterium, Eubacterium i roślin wyższych. Wykazano, że wszystkie scharakteryzowane fotoliazy zawierają zmniejszoną FAD, a większość zawiera wtórne chromofory, w zależności od gatunku, MTHF lub 8-HDF. Podobny mechanizm reakcji zaproponowano dla obu klas fotoliaz CPD. Chromofor MTHF lub 8-HDF działa jak antena, która pochłania światło fioletowe i wykorzystuje pochłoniętą energię do regeneracji FADH-.

Skład kofaktora fotoliazy roślinnej nie jest w pełni poznany, chociaż ostatnio wykazano, że fotoliazy CPD z Arabidopsis zawierające jedynie FADH mają aktywność enzymatyczną.

Literatura:

» Fritz Thoma, Światło i ciemność w naprawie chromatyny: naprawa uszkodzeń DNA wywołanych promieniowaniem UV metodą naprawy fotoliazy i wycinania nukleotydów, Institut fur Zellbiologie, ETH-Zurich, Honggerberg, CH-8093 Zurich, Szwajcaria
» Charakterystyka enzymów fotoliazy Arabidopsis i analiza ich roli w ochronie przed promieniowaniem ultrafioletowym B, Wanda M. Waterworth 1, Qing Jiang, Christopher E. West, M. Nikaido i Clifford M. Bray

Historia odkryć

Uszkodzenia jednoniciowego i dwuniciowego DNA

Badania nad reparacją rozpoczęły się od pracy A. Kelnera (USA), który odkrył zjawisko fotoreaktywacji (PR) - zmniejszenie uszkodzeń obiektów biologicznych spowodowanych promieniami ultrafioletowymi (UV) z późniejszą ekspozycją na jasne światło widzialne ( lekka naprawa).

Naprawa przez wycięcie

W komórkach odkryto naprawę poreplikacyjną E coli, niezdolny do rozszczepienia dimerów tyminy. Jest to jedyny rodzaj naprawy, który nie posiada etapu rozpoznania uszkodzenia.

Notatki

Fundacja Wikimedia. 2010.

Zobacz, co oznacza „naprawa DNA” w innych słownikach:

Naprawa defektów DNA powstałych w wyniku mutacji lub rekombinacji. Dokonuje tego system enzymów naprawczych, z których niektóre ustalają miejsce uszkodzenia, inne „wycinają”, jeszcze inne syntetyzują uszkodzone obszary, a jeszcze inne... ... Słownik mikrobiologii

Naprawa DNA- - korekta „błędów” w pierwotnej strukturze DNA w wyniku działania specjalnych enzymów naprawczych… Krótki słownik terminów biochemicznych

Naprawa DNA- - Tematy biotechnologii PL Naprawa DNA ... Przewodnik tłumacza technicznego

Naprawa DNA- DNR reparacija statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis DNR struktūros atsikūrimas po pažeidimo. atitikmenys: pol. naprawa DNA rus. Naprawa DNA... Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

NAPRAWA DNA- Przywrócenie pierwotnej struktury cząsteczki DNA, tj. prawidłowa sekwencja nukleotydów... Terminy i definicje stosowane w hodowli, genetyce i rozrodzie zwierząt gospodarskich

Naprawa DNA- * Naprawa DNA * Naprawa DNA Enzymatyczna korekcja błędów w sekwencji nukleotydowej cząsteczki DNA. Mechanizmy DNA s. 13 chronić informację genetyczną organizmu przed uszkodzeniami powodowanymi przez mutageny środowiskowe (np. ultrafiolet,... ...

Polimeraza DNA zależna od DNA Polimeraza DNA- Polimeraza DNA zależna od DNA, polimeraza DNA * Polimeraza DNA zależna od DNA, polimeraza DNA * Polimeraza DNA zależna od DNA lub polimeraza DNA enzym, który katalizuje polimeryzację (patrz) trifosforanów dezoksyrybonukleozydów do polimeru... ... Genetyka. słownik encyklopedyczny

- (od późnego łac. repario przywracanie), charakterystyczne dla wszystkich komórek organizmów żywych, przywracanie pierwotnej (natywnej) struktury DNA w przypadku jej naruszenia. Uszkodzenie struktury DNA może prowadzić do zablokowania replikacji DNA (śmiertelne... ... Encyklopedia chemiczna

Naprawa: Naprawa DNA to zdolność komórek do naprawy uszkodzeń chemicznych i pęknięć w cząsteczkach DNA. Reparacje są formą odpowiedzialności finansowej podmiotu prawa międzynarodowego za szkodę wyrządzoną na skutek międzynarodowego... ...Wikipedii

System wykrywania i naprawy insercji, pominięć i błędnych par nukleotydów powstałych w procesie replikacji i rekombinacji DNA, a także w wyniku niektórych rodzajów uszkodzeń DNA. Sam fakt nieprawidłowego sparowania nie pozwala... ... Wikipedia

Książki

• Metylacja DNA u roślin. Mechanizmy i rola biologiczna, B. F. Vanyushin. Ta lektura jednego z pionierów i znanych światowych liderów w badaniu metylacji DNA w różnych organizmach szczegółowo przedstawia aktualny stan ogólnego problemu biologicznego...

Uszkodzone podczas normalnej biosyntezy DNA w komórce lub w wyniku narażenia na działanie odczynników fizycznych lub chemicznych. Dokonują tego specjalne układy enzymatyczne komórki. Szereg chorób dziedzicznych (np. xeroderma pigmentosum) wiąże się z zaburzeniami systemów naprawczych.

Historia odkryć

Badania nad reparacją rozpoczęły się od pracy Alberta Kellnera (USA), który w 1948 roku odkrył zjawisko fotoreaktywacji - zmniejszenie uszkodzeń obiektów biologicznych spowodowanych promieniami ultrafioletowymi (UV) po późniejszej ekspozycji na jasne światło widzialne ( lekka naprawa).

R. Setlow, K. Rupert (USA) i inni szybko ustalili, że fotoreaktywacja jest procesem fotochemicznym zachodzącym przy udziale specjalnego enzymu i prowadzącym do rozszczepienia dimerów tyminy powstających w DNA podczas absorpcji kwantu UV.

Później, badając genetyczną kontrolę wrażliwości bakterii na światło UV i promieniowanie jonizujące, odkryto to ciemna naprawa- zdolność komórek do eliminowania uszkodzeń DNA bez udziału światła widzialnego. Mechanizm ciemnej naprawy komórek bakteryjnych naświetlonych światłem UV przewidział A. P. Howard-Flanders i potwierdzono eksperymentalnie w 1964 roku przez F. Hanawalta i D. Petitjohna (USA). Wykazano, że u bakterii po napromienianiu wycina się uszkodzone fragmenty DNA ze zmienionymi nukleotydami i w powstałych przerwach następuje ponowna synteza DNA.

Systemy naprawcze istnieją nie tylko w mikroorganizmach, ale także w komórkach zwierzęcych i ludzkich, w których bada się je w kulturach tkankowych. Znana jest dziedziczna choroba człowieka - xeroderma pigmentosum, w której naprawa jest upośledzona.

Źródła uszkodzeń DNA

Główne rodzaje uszkodzeń DNA

Struktura systemu odszkodowań

Każdy system naprawczy składa się z następujących elementów:

• Helikaza DNA to enzym, który „rozpoznaje” chemicznie zmienione miejsca w łańcuchu i przerywa łańcuch w pobliżu miejsca uszkodzenia;
• DNaza (deoksyrybonukleaza) to enzym, który „przecina” 1 łańcuch DNA (sekwencję nukleotydową) przy wiązaniu fosfodiestrowym i usuwa uszkodzony odcinek: egzonukleaza działa na nukleotydy końcowe 3` lub 5`, endonukleaza - na nukleotydy inne niż końcowe;
• Polimeraza DNA to enzym syntetyzujący odpowiednią sekcję łańcucha DNA w celu zastąpienia usuniętej;
• Ligaza DNA jest enzymem, który zamyka ostatnie wiązanie w łańcuchu polimeru i tym samym przywraca jego ciągłość.

Rodzaje zadośćuczynienia

Bezpośrednie zadośćuczynienie

Naprawa bezpośrednia to najprostszy sposób na wyeliminowanie uszkodzeń DNA, w którym zwykle biorą udział określone enzymy, które są w stanie szybko (zwykle w jednym etapie) wyeliminować odpowiednie uszkodzenia, przywracając pierwotną strukturę nukleotydów. Tak jest na przykład w przypadku metylotransferazy O6-metyloguaniny-DNA, która usuwa grupę metylową z zasady azotowej na jedną z własnych reszt cysteinowych.

Naprawa przez wycięcie

Naprawa przez wycinanie (ang. wycinanie - cięcie) polega na usunięciu uszkodzonych zasad azotowych z DNA i późniejszym przywróceniu normalnej struktury cząsteczki wzdłuż łańcucha komplementarnego. Układ enzymatyczny usuwa krótką jednoniciową sekwencję dwuniciowego DNA zawierającą niedopasowane lub uszkodzone zasady i zastępuje je poprzez syntezę sekwencji komplementarnej do pozostałej nici.

Naprawa przez wycięcie jest najczęstszą metodą naprawy zmodyfikowanych zasad DNA. Polega na rozpoznawaniu zmodyfikowanej zasady przez różne glikozylazy, które rozszczepiają wiązanie N-glikozydowe tej zasady ze szkieletem cukrowo-fosforanowym cząsteczki DNA. Jednocześnie istnieją glikozylazy, które specyficznie rozpoznają obecność pewnych zmodyfikowanych zasad w DNA (hydroksymetylouracyl, hipoksantyna, 5-metylouracyl, 3-metyloadenina, 7-metyloguanina itp.). W przypadku wielu glikozylaz opisano obecnie polimorfizm związany z zastąpieniem jednego z nukleotydów w sekwencji kodującej genu. Wiele izoform tych enzymów powiązano ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka [Chen, 2003].

Wysoką stabilność DNA zapewnia nie tylko zachowanie jego struktury i wysoka dokładność replikacji, ale także obecność specjalnych układów w komórkach wszystkich żywych organizmów remont które usuwają uszkodzenia DNA.

Działanie różnych substancji chemicznych, promieniowania jonizującego i promieniowania ultrafioletowego może powodować następujące uszkodzenia struktury DNA:

· uszkodzenie pojedynczych zasad (deaminacja prowadząca do przemiany cytozyny w uracyl, adeniny w hipoksantynę; alkilacja zasad; włączenie analogów zasad, insercja i delecja nukleotydów);

uszkodzenie par zasad (tworzenie dimerów tyminy);

przerwy w łańcuchu (pojedyncze i podwójne);

tworzenie wiązań krzyżowych między zasadami, a także wiązań krzyżowych DNA-białko.

Część z tych naruszeń może nastąpić także samoistnie, tj. bez udziału jakichkolwiek szkodliwych czynników.

Wszelkiego rodzaju uszkodzenia prowadzą do rozerwania drugorzędowej struktury DNA, co powoduje częściowe lub całkowite zablokowanie replikacji. Takie zaburzenia konformacyjne służą jako cele dla systemów naprawczych. Proces odtwarzania struktury DNA polega na tym, że informacja genetyczna jest reprezentowana w DNA w dwóch kopiach – po jednej w każdej z nici podwójnej helisy. Dzięki temu uszkodzenia w jednym z łańcuchów mogą zostać usunięte przez enzym naprawczy, a ten odcinek łańcucha zostaje ponownie zsyntetyzowany w normalnej postaci dzięki informacji zawartej w nieuszkodzonym łańcuchu.

Obecnie zidentyfikowano trzy główne mechanizmy naprawy DNA: fotoreaktywację, wycięcie i naprawę poreplikacyjną. Dwa ostatnie typy nazywane są również naprawą ciemną.

Fotoreaktywacja polega na trawieniu przez enzym fotoliaza, aktywowane światłem widzialnym, dimery tyminy, które pojawiają się w DNA pod wpływem promieniowania ultrafioletowego.

Wycięcie naprawa polega na rozpoznaniu uszkodzeń DNA, wycięciu uszkodzonego obszaru, resyntezie DNA z wykorzystaniem matrycy nienaruszonego łańcucha, przywróceniu ciągłości łańcucha DNA. Metoda ta nazywana jest również naprawą przez rodzaj wycięcia-wymiany lub, bardziej w przenośni, mechanizmem „łata-cięcie”. Naprawa przez wycinanie jest procesem wieloetapowym i obejmuje:

1) „uznanie” szkody;

2) przecięcie jednej nici DNA w pobliżu miejsca uszkodzenia (nacięcie);

3) usunięcie uszkodzonego obszaru (wycięcie);

4) Resynteza DNA w miejscu usuniętego miejsca;

5) przywrócenie ciągłości naprawionego łańcucha poprzez utworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy nukleotydami
(Rysunek 6.2)

Ryż. 6.2 Schemat naprawy przez wycięcie

Reparacja zaczyna się od aneksji DNA-N-glikozylazy do uszkodzonej podstawy. Istnieje wiele N-glikozylaz DNA specyficznych dla różnych modyfikowanych zasad. Enzymy hydrolitycznie rozszczepiają wiązanie N-glikozydowe pomiędzy modyfikowaną zasadą a dezoksyrybozą, co prowadzi do powstania w nici DNA miejsca AP (apurynowo-pirymidynowego) (pierwszy etap). Naprawa serwisu AP może nastąpić wyłącznie przy udziale Insertazy DNA, który dodaje zasadę do dezoksyrybozy zgodnie z zasadą komplementarności. W tym przypadku nie ma potrzeby przecinania nici DNA, wycinania nieprawidłowego nukleotydu i naprawiania pęknięcia. W przypadku bardziej złożonych uszkodzeń struktury DNA konieczny jest udział całego kompleksu enzymów biorących udział w naprawie (ryc. 6.2.): Endonukleaza AP rozpoznaje miejsce AP i przecina w jego pobliżu nić DNA (etap II). Gdy tylko nastąpi przerwa w obwodzie, następuje Egzonukleaza AP, który usuwa fragment DNA zawierający błąd (etap III). Polimeraza DNA B wypełnia lukę powstałą w myśl zasady komplementarności (etap IV). Ligaza DNAłączy koniec 3¢ nowo zsyntetyzowanego fragmentu z łańcuchem głównym i kończy naprawę uszkodzeń (etap V).

Postreplikacyjne naprawa jest aktywowana w przypadkach, gdy naprawa przez wycięcie nie jest w stanie poradzić sobie z wyeliminowaniem wszystkich uszkodzeń DNA przed jego replikacją. W tym przypadku reprodukcja uszkodzonych cząsteczek prowadzi do pojawienia się DNA z jednoniciowymi przerwami, a podczas rekombinacji przywracana jest natywna struktura.

Wrodzone wady układu naprawczego są przyczyną takich chorób dziedzicznych jak xeroderma pigmentosum, ataksja-teleangiektazja, trichotiodystrofia, progeria.

NAPRAWA DNA

Systemy naprawcze

2 Naprawa przez wycięcie. Przykłady i typy

3 Naprawa błędów replikacji DNA

4 Naprawa rekombinacyjna (poreplikacyjna) w bakteriach

5 SOS naprawa

Ewolucja systemów naprawy DNA od bakterii do ludzi jest dość konserwatywna i najczęściej badane są w przypadku E. coli.

Znane są dwa rodzaje zadośćuczynienia:bezpośrednie i wycinające

Bezpośrednie zadośćuczynienie

Naprawa bezpośrednia to najprostszy sposób eliminacji uszkodzeń DNA, w którym zwykle biorą udział określone enzymy, które są w stanie szybko (zwykle w jednym etapie) wyeliminować odpowiadające im uszkodzenia, przywracając pierwotną strukturę nukleotydów.

1. To działa np.Metyltransferaza DNA O6-metyloguaniny

(enzym samobójczy), który usuwa grupę metylową z zasady azotowej na jedną z własnych reszt cysteinowych

U E. coli w ciągu 1 minuty można zsyntetyzować do 100 cząsteczek tego białka. Białko podobne pod względem funkcji do wyższych eukariontów najwyraźniej odgrywa ważną rolę w ochronie przed rakiem wywołanym wewnętrznymi i zewnętrznymi czynnikami alkilującymi.

Insertaza DNA

2. Insertazy DNA

fotoliaza

3. Dimery tyminy są „rozłączone” przez bezpośrednie zadośćuczynienie w roli głównejfotoliaza, przeprowadzając odpowiednią transformację fotochemiczną. Fotoliazy DNA to grupa enzymów aktywowanych światłem o długości fali 300 - 600 nm (obszar widzialny), dla których posiadają w swojej strukturze specjalne światłoczułe centrum.

Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie i występują u bakterii, drożdży, owadów, gadów, płazów i ludzi. Enzymy te wymagają różnych kofaktorów (FADH, kwas tetrahydrofoliowy itp.) zaangażowanych w fotochemiczną aktywację enzymu. Fotoliaza E. coli jest białkiem o masie cząsteczkowej 35 kDa, ściśle związanym z oligorybonukleotyd o długości 10-15 nukleotydów niezbędne do działania enzymów.

Przykłady zadośćuczynienia bezpośredniego

1. Zasada metylowana O 6-mG dimetylowany przez enzym metylotransferazęMetyltransferaza DNA O6-metyloguaniny (enzym samobójczy), który przenosi grupę metylową na jedną z jej reszt

cysteina

2. Miejsca AP można naprawić poprzez bezpośrednią insercję puryn przy udziale enzymów tzwInsertazy DNA(z angielskiej wkładki - wkładka).

SCHEMAT PRZYKŁADU BEZPOŚREDNIEJ NAPRAWY USZKODZEŃ W DNA – zasada metylowana O6- mgdemetylowany przez enzym metylotransferazę, który przenosi grupę metylową na jedną z jej reszt aminokwasowych cysteiny.

3. Fotoliaza przyłącza się do dimeru tyminy i po naświetleniu tego kompleksu światłem widzialnym (300-600 nm) dimer ulega rozplątaniu

SCHEMAT PRZYKŁADU BEZPOŚREDNIEJ NAPRAWY USZKODZEŃ W DNA – Fotoliaza

przyłącza się do dimeru tyminy i po naświetleniu widmem światła widzialnego dimer ten ulega rozplątaniu

Naprawa przez wycięcie

(z angielskiego wycięcia - cięcie).

DEFINICJA

Naprawa przez wycięcie obejmuje usunięcie uszkodzone zasady azotowe z DNA i późniejsze wyzdrowienie normalna struktura molekularna.

MECHANIZM

Naprawa przez wycinanie zwykle obejmuje kilka enzymów, a sam proces obejmuje

nie tylko zniszczone ,

ale także sąsiadujące z nim nukleotydy .

WARUNKI

Naprawa przez wycięcie wymaga drugiej (uzupełniającej) nici DNA. Ogólny uproszczony schemat naprawy przez wycinanie pokazano na ryc. 171.

KROKI

Pierwszym krokiem w naprawie przez wycięcie jest usunięcie nieprawidłowych zasad azotowych. Jest katalizowana przez grupęDNA-N-glikozylaza- enzymy rozszczepiające wiązanie glikozydowe pomiędzy dezoksyrybozą i zasadą azotową.

WAŻNA UWAGA:

UosobaDNA-N-glikozylazymają wysoką specyficzność substratową: różne enzymy z tej rodziny rozpoznają i tną różne anomalne podstawy(8-oksoguanina, uracyl, metylopuryny itp.).

UbakteriaDNA-N-glikozylazynie ma takiej specyficzności substratowej

WSPÓLNE ENZYMY NAPRAWCZE WYCIĘCIA

NAZWA	FUNKCJONOWAĆ	MECHANIZM
DNA-N-glikozylazy	wycięcie nieprawidłowych zasad azotowych	rozszczepia wiązanie glikozydowe pomiędzy dezoksyrybozą i zasada azotowa
Endonukleaza AP	stwarza warunki do działania kolejnego enzymu - egzonukleazy	łamie szkielet cukrowo-fosforanowy cząsteczki DNA w miejscu AP
egzonukleaza	uwalnia kilka nukleotydów	sekwencyjnie odcina kilka nukleotydów z uszkodzonego odcinka jednej nici DNA

KONKRETNE ETAPY TEGO MECHANIZMU:

W wyniku akcji DNA- N-glikozylazapowstaje miejsce AP, które jest atakowane przez enzym Endonukleaza AP. Rozbija szkielet cukrowo-fosforanowy cząsteczki DNA w miejscu AP i tym samym stwarza warunki do pracy kolejnego enzymu - egzonukleazy, który sekwencyjnie odcina kilka nukleotydów z uszkodzonego odcinka jednej nici DNA.

W komórkach bakteryjnych zwolniona przestrzeń jest wypełniona odpowiednimi nukleotydami z udziałem Polimeraza DNA I, zorientowany w stronę drugiej (komplementarnej) nici DNA.

Ponieważ polimeraza DNA I jest zdolna do wydłużania 3-calowego końca jednej z nici w miejscu pęknięcia dwuniciowego DNA i usuwania nukleotydów z 5-calowego końca tego samego pęknięcia,

te. realizować „transmisja nicka” enzym ten odgrywa kluczową rolę w naprawie DNA. Przeprowadzane jest ostateczne zszycie naprawionych obszarów Ligaza DNA.

W komórkach eukariotycznych (ssaczych).

Naprawie wycinania DNA w komórkach ssaków towarzyszy gwałtowny wzrost aktywności innego enzymu -poli ADPolimeraza R-rybozy . To się stało ADP-rybozylacja białek chromatyny(histony i białka niehistonowe), co prowadzi do osłabienia ich połączenia z DNA i otwiera dostęp do enzymów naprawczych.

Dawca ADP-rybozadziała w tych reakcjachNAD+, których rezerwy ulegają znacznemu uszczupleniu podczas naprawy przez wycinanie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim:

Pozostałości naładowane ujemnie ADP-ryboza od wewnętrznego składu cząsteczki NAD+ dodaj przez radykałglutamina kwas lub fosfoserynado białek chromatyny, co prowadzi do neutralizacji ładunków dodatnich tych białek i osłabienia ich kontaktu z DNA.

CO TO JEST GRUPA ENZYMÓW

Glikozylazy DNA

rozszczepia wiązanie glikozydowe pomiędzy dezoksyrybozą i zasadą azotową

co powoduje wycięcie nieprawidłowych zasad azotowych

Glikozylazy DNA bierze udział w eliminacji uszkodzeń oksydacyjnych DNA w komórkach prokarioty i eukarionty, są bardzo zróżnicowane i różnią się specyficznością substratową, strukturą przestrzenną i sposobami interakcji z DNA.

Do najlepiej zbadanych glikozylaz DNA należą:

endonukleaza III(EndoIII),

tworzy amidopirymidynową glikozylazę DNA (FPG),

Muta T I

Mut Ycoli.

Endonukleaza IIIE. coli rozpoznaje i specyficznie odcina DNA utleniony zasady pirymidynowe.

Enzym ten jest monomerycznym białkiem globularnym składającym się z 211 aminokwasów pozostałości (masa cząsteczkowa 23,4 kDa). Zsekwencjonowano gen kodujący Endo III i określono jego sekwencję nukleotydową. Endo III jest białko siarkowo-żelazowe [(4 Fe-4S )2+ białko] posiadające element struktura ponadgimnazjalna typu „klucz grecki” (spirala – spinka do włosów – spirala), służąc do wiązania się z DNA. Wyizolowano także enzymy o podobnej specyficzności substratowej i podobnych sekwencjach aminokwasów komórki bydlęce i ludzkie.

Tworzą glikozylazę DNA amidopirydyny E. coli „rozpoznaje” i odcina utlenione związki heterocykliczne z DNA zasady purynowe .

SCHEMAT NAPRAWY WYCIĘCIA ETAP 1

DNAN

SCHEMAT NAPRAWY WYCIĘCIA

1 DNANglikozydaza usuwa uszkodzoną zasadę

Endonukleaza AP rozbija DNA

2 Egzonukleaza usuwa pewną liczbę nukleotydów

3 Polimeraza DNA wypełnia pusty obszar dopełniaczem

Mononukleotydy

Ligaza DNA łączy ze sobą naprawioną nić DNA

Muta T- małe białko o masie cząsteczkowej 15 kDa, wykazujące aktywność trifosfatazy nukleozydowej, w której przeważają hydrolizuje dGTP do dGMP i pirofosforanu.

Biologiczna rola Mut T ma na celu zapobieganie tworzeniu się par niekanonicznych podczas replikacjiO: G I O: 8-okso-G.

Takie pary mogą pojawić się, gdy forma utleniona

dGTP (8-okso-dGTP) staje się podłoże Polimerazy DNA.

Muta T hydrolizuje 8-okso-dGTP10 razy szybciej niż dGTP.

To robi 8-okso-dGTPnajbardziej preferowanym podłożemMutaTi wyjaśnia jego rolę funkcjonalną.

Mut Yjest specyficzną glikozylazą DNA adeniny, która rozszczepia wiązanie N-glikozydowe pomiędzy adeniną i dezoksyrybozą adenozyna, tworząc niekanoniczną parę z guaniną.

Funkcjonalną rolą tego enzymu jest zapobieganie mutacjom

T:A - G:A przez rozszczepienie nienaruszonej pozostałości adeninaz pary zasad A: 8-okso-G.

Naprawa przez wycięcie nukleotydu

(Zależny od ATP mechanizm usuwania uszkodzeń DNA)

Ostatnio w naprawie przez wycięcie szczególną uwagę zwrócono na zależny od ATP mechanizm usuwania uszkodzeń z DNA. Ten rodzaj naprawy przez wycinanie nazywa się naprawą przez wycinanie nukleotydów (NER).

Obejmuje DWA ETAPY :

1. usunięcie z DNAfragmenty oligonukleotydów zawierające uszkodzenia oraz

Eksynukleaza

2. późniejsza rekonstrukcja łańcucha DNA przy udziale kompleksu enzymów (nukleazy, polimerazy DNA, ligazy DNA itp.).

Następuje usunięcie fragmentu DNA po obu stronach uszkodzonego nukleotyd. Długość usuniętych fragmentów oligonukleotydów różni się u prokariotów i eukariontów.

Usunięcie fragmentu DNA z prokariotów

Tak więc w E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, fragment długości 12-13 nukleotydy,

Usunięcie fragmentu DNA z eukariontów

oraz u drożdży, płazów i ludzi fragment składający się z 24-32 nukleotydy.

Eksynukleazaenzym usuwający fragmenty DNA

Fragment DNA jest rozcinany przez enzymeksinukleaza(ekscynukleaza). U E. coli enzym ten składa się z 3 różnych protomerów -

uvrA

uwr B

uwr C

z których każdy pełni specyficzną funkcję podczas cięcia przez wycinanie fragmentu DNA. Nazwę tych białek podają pierwsze litery słów„naprawa ultrafioletowa”.

Protomer uvr Ama aktywność ATPazy, wiąże się z DNA w postaci dimeru, przeprowadzając

podstawowe rozpoznawanie uszkodzeń i

wiązaćuwr B

Protomer uvr B ma:

1. Utajony Aktywność ATPazy i utajonej helikazy, niezbędna do zmiany konformacji i rozwinięcia podwójnej helisy DNA;

2. Endonukleaza aktywność, rozrywając wiązanie międzynukleotydowe (fosfodiestrowe) z bokuKoniec Zrozdrobniony fragment.

Protomer uvr Czachowuje się jak endonukleaza, wprowadzając przerwę w naprawionej nici DNAKońcówki 5".wycięty fragment.

Zatem protomeryuvr A, uvr B, uvr Coddziałują z DNA w określonej sekwencji, przeprowadzając reakcję zależną od ATProzszczepienie fragmentu oligonukleotydu z naprawianej nici DNA.

Powstała przerwa w cząsteczce DNA jest odtwarzana przy udziale polimerazy DNA I i ligazy DNA. Model naprawy przez wycinanie z udziałem powyższych enzymów pokazano na ryc. 172.

Naprawy wycinające u ludzi

Naprawy przez wycięcie u ludzi są również zależne od ATP i obejmujątrzy główne etapy :

rozpoznanie szkody,

podwójne przecięcie nici DNA,

synteza redukcyjna i

podwiązanie naprawionej nici.

Jednak naprawa ludzkiego DNA przez wycięcie obejmuje

25 różnych polipeptydów ,

16 z których biorą udział w rozszczepianiu fragmentu oligonukleotydu, będąc protomeramieksinukleazy,

i reszta 9 przeprowadzić syntezę naprawionej części cząsteczki.

W systemie naprawy DNA u człowieka bardzo istotną rolę odgrywają białka transkrypcyjne -

Polimeraza RNA II I

TF pon- jeden z sześciu głównych czynników transkrypcyjnych eukarionty.

Należy zauważyć, że naprawa przez wycięcie u prokariotów, podobnie jak u eukariotów, zależy od stanu funkcjonalnego DNA:

Transkrypcja DNA jest naprawiana szybciej

niż transkrypcyjnie nieaktywny.

Zjawisko to tłumaczą następujące czynniki:

struktura chromatyny,

homologia łańcuchów transkrybowanych odcinków DNA,

efekt uszkodzenia nici i jego wpływ na polimerazę RNA.

WAŻNA UWAGA:

ŁAŃCUCH KODOWANIA DNA (łańcuch przechowywania informacji)

ŁAŃCUCH MATRYCY DNA (informacje są z niego zapisywane)

Wiadomo, że tak duże szkody jak tworzenie dimerów tyminy, blokują transkrypcję zarówno u bakterii, jak i u ludzi, jeśli występują łańcuch matrycowy DNA (uszkodzenie kodowanie więzy nie wpływać do kompleksu transkrypcyjnego). Polimeraza RNA zatrzymuje się w miejscu uszkodzenia DNA i blokuje funkcjonowanie kompleksu transkrypcyjnego.

Współczynnik łączenia naprawy transkrypcji (TRCF) .

U E. coli w zwiększonej naprawie transkrypcji pośredniczy jedno specjalne białko -czynnik łączenia naprawy transkrypcji (TRCF) .

To białko promuje :

1. odłączenie polimerazy RNA od DNA

2. jednocześnie stymuluje tworzenie kompleksu białkowego,

Przeprowadzenie naprawy uszkodzonego obszaru.

Po zakończeniu naprawy polimeraza RNA powraca do swojej pierwotnej pozycji, a transkrypcja jest kontynuowana (patrz rysunek).

Tak więc ogólny schemat naprawy wycinającej

1. DNA-N -glikozylaza usuwa uszkodzoną zasadę

2. Endonukleaza AP przerywa łańcuch DNA

3. Egzonukleaza usuwa pewną liczbę nukleotydów

4. Polimeraza DNA wypełnia pusty obszar

Nukleotydy komplementarne

5. Ligaza DNA łączy ze sobą naprawioną nić DNA

Naprawa błędów replikacji DNA

przez metylację

Błędy w parowaniu zasad azotowych podczas replikacji DNA zdarzają się dość często (u bakterii raz na 10 tys. nukleotydów), w wyniku czegodo nici potomnej DNA włącza się nukleotydy, które nie są komplementarne do nukleotydów łańcucha macierzystego -niedopasowania(eng. niedopasowanie rz odpowiadam).

ChociażPolimeraza DNA Iprokarioty mają zdolność do samokorygowania, swoich wysiłków mających na celu wyeliminowanie błędnie przyłączonych nukleotydów czasami nie wystarczą, a następnie w DNA pozostają pewne nieprawidłowe (niekomplementarne) pary.

W takim przypadku naprawa odbywa się przy użyciu określonego systemu, z którym jest powiązanyMetylacja DNA . Działanie tego systemu naprawczego polega na tym, że po replikacji, po pewnym czasie (kilkunastu minutach) DNA ulega metylacji.

W E. coli metylowany głównie adenina z edukacją

N6-metylo-adenina (N6-mA).

Do tego momentu nowo zsyntetyzowany(pomocniczy)łańcuch pozostaje niemetylowany.

Jeśli taki łańcuch zawiera niesparowane nukleotydy, to podlega naprawie: W ten sposóbmetylacja oznacza DNA i

zawiera system korekcji błędów replikacja.

W tym systemie napraw rozpoznawane są specjalne konstrukcje:

podsekwencjaG-N6-mA-T-CI Następny za nim następuje deformacja

w podwójnej helisie, gdzie nie ma komplementarności (ryc. poniżej).

W eliminacji niesparowanych nukleotydów w częściowo metylowany Cząsteczka DNA obejmuje dość złożony kompleks enzymów naprawczych, który skanuje powierzchnię cząsteczki DNA,przecina część łańcucha potomnego uciekając się do niedopasowanie, a następnie stwarza warunki do rozwoju

jego niezbędne (komplementarne) nukleotydy.

Różne składniki tego kompleksu mają różne działanienukleaza,

helikaza,

ATPaza,

niezbędne do wprowadzenia pęknięć w DNA i rozszczepienia nukleotydów, rozwinięcia podwójnej helisy DNA i dostarczenia energii do ruchu kompleksu wzdłuż naprawionej części cząsteczki.

U ludzi zidentyfikowano kompleks enzymów naprawczych o podobnej strukturze i funkcji.

Naprawa rekombinacyjna (poreplikacyjna).

W przypadkach, gdy z tego czy innego powodu wyżej wymienione systemy naprawcze zostaną zakłócone, w łańcuchach DNA mogą powstać luki (niedostatecznie naprawione odcinki), które czasami dość znaczne rozmiary, co jest obarczone zakłóceniami systemu replikacji i może prowadzić do śmierci komórki.

W tym przypadku komórka jest w stanie wykorzystać inną cząsteczkę DNA uzyskaną po replikacji do naprawy jednej cząsteczki DNA, czyli przyciągnąć w tym celu mechanizmrekombinacja.

W bakteriach

U bakterii bierze udział w naprawie rekombinacyjnej.białko Rec A. Wiąże się z jednoniciowym regionem DNA i włącza go w rekombinacjęhomologiczne regiony nienaruszonych nici innej cząsteczki DNA .

W rezultacie naprawiane są zarówno uszkodzone (zawierające luki), jak i nienaruszone nici cząsteczki DNA sparowany z nienaruszonymi, komplementarnymi regionami DNA, co otwiera możliwość naprawy poprzez wyżej opisane systemy.

W tym przypadku może tak być ciąć pewien fragment i

pożywnyza jego pomocą luki w uszkodzonym obwodzie.

Luki i pęknięcia powstałe w łańcuchach DNA są wypełniane poprzez uczestnictwoPolimeraza DNA I i ligaza DNA .

Naprawa SOS

Istnienie tego systemu po raz pierwszy postulował M. Radman w 1974 roku. Nadał on także nazwę temu mechanizmowi włączając do niego międzynarodowy sygnał alarmowy „SOS” (ratuj nasze dusze).

Rzeczywiście, ten system włącza się, kiedy Uszkodzenia DNA stają się tak duże, że zagrażają życiu komórki. Następuje w tym przypadku indukcja aktywności zróżnicowanej grupy genów biorących udział w różnych procesach komórkowych związanych z naprawą DNA.

Włączenie określonych genów, determinowanych wielkością uszkodzeń w DNA, prowadzi do odpowiedzi komórkowych o różnym znaczeniu (zaczynając od standardowych naprawa uszkodzonych nukleotydy i zakończenie tłumienie podział komórek).

Większość studiowanaNaprawa SOSw E. coli, której głównymi uczestnikami są kodowane białka geny Rec.AILex A.

Pierwszy z nich jest wielofunkcyjnyRec. Białko, udział

V Rekombinacja DNA, I

V regulacja transkrypcji genów faga lambda, wpływające na E. coli,

i drugi (białko Lex A)Jest represor transkrypcję dużej grupy genów przeznaczonych do Naprawa DNA bakteria. Kiedy zostanie zahamowany lub rozwiązany naprawa jest aktywowana.

Wiążący Rec A z Lexem Awskazówki do podziału tego ostatniego i odpowiednio do aktywacja genów naprawczych.

Służy z kolei indukcja bakteryjnego systemu SOSfaga lambda sygnał zagrożenia i powoduje zmianę profaga szlak pasywny w aktywny (lityczny). istnienie, powodując w ten sposób śmierć komórki gospodarza.

System naprawy SOS zidentyfikowano nie tylko u bakterii, ale także u zwierząt i ludzi.

Geny zaangażowane w naprawę uszkodzeń DNA SOS

Geny	Konsekwencje aktywacji genów
uvr A, B, C, D	Naprawa uszkodzeń wtórnej struktury DNA
Rec.A	Naprawa poreplikacyjna, indukcja systemu SOS
lex A	Wyłączenie systemu SOS
rec N,ruv	Naprawa pęknięć dwużyłowych
	Zapewnienie naprawy rekombinacyjnej
umu C, D	Mutageneza spowodowana zmianami właściwości polimerazy DNA
sul A	Tłumienie podziału komórek

Wniosek

Naprawa uszkodzeń DNA jest ściśle powiązana z innymi podstawowymi procesami genetyki molekularnej: replikacja, transkrypcja i rekombinacja. Okazuje się, że wszystkie te procesy są splecione w ogólny system interakcji, obsługiwany przez dużą liczbę różnorodnych białek, z których wiele to cząsteczki wielofunkcyjne kontrolę nad wdrażaniem informacji genetycznej w komórkach pro- i eukariotycznych. Jednocześnie oczywiste jest, że natura „nie skąpi” na elementach kontrolnych, tworząc wysoce złożone systemy korygowania tych uszkodzeń w DNA są niebezpieczne dla organizmu, a zwłaszcza dla jego potomstwa. Natomiast w przypadkach, gdy możliwości naprawcze nie wystarczą do zachowania statusu genetycznego organizmu, pojawia się potrzeba programowanej śmierci komórki -apoptoza..

SCHEMAT NAPRAWY PO WYCIĘCIU NUKLEOTYDÓW W mi. COLIZ UDZIAŁEM EXINUCLEASE

1. MECHANIZM NIEZALEŻNY od TRANSKRYPCJI

2. MECHANIZM ZALEŻNY OD TRANSKRYPCJI

3. OGÓLNY ETAP NAPRAWY

LEGENDA

A - białkouwr A

B - białkouwr W

C - białkouwr Z

mały czarny trójkąt - znak wskazuje miejsce uszkodzenia

SCHEMAT NAPRAWY ZWIĄZONY Z Metylacją DNA