Chromatografia wysokosprawna. Wysokosprawna chromatografia cieczowa zanieczyszczeń naturalnych i ścieków

(głównie międzycząsteczkowe) na granicy faz. Jako metoda analityczna HPLC należy do grupy metod, która ze względu na złożoność badanych obiektów obejmuje wstępne rozdzielenie początkowej złożonej mieszaniny na stosunkowo proste. Otrzymane proste mieszaniny są następnie analizowane konwencjonalnymi metodami fizykochemicznymi lub specjalnymi metodami opracowanymi dla chromatografii.

Metoda HPLC ma szerokie zastosowanie w takich dziedzinach jak chemia, petrochemia, biologia, biotechnologia, medycyna, przetwórstwo spożywcze, ochrona środowiska, produkcja leków i wielu innych.

Zgodnie z mechanizmem rozdziału analizowanych lub rozdzielonych substancji, HPLC dzieli się na adsorpcję, dystrybucję, wymianę jonową, wykluczanie, wymianę ligandów i inne.

Należy pamiętać, że w pracy praktycznej separacja często przebiega nie przez jeden, ale przez kilka mechanizmów jednocześnie. Tak więc separacja wykluczeń może być skomplikowana przez efekty adsorpcji, adsorpcji - dystrybucji i odwrotnie. Jednocześnie im większa różnica między substancjami w próbce pod względem stopnia jonizacji, zasadowości lub kwasowości, pod względem masy cząsteczkowej, polaryzowalności i innych parametrów, tym bardziej prawdopodobne jest, że pojawi się inny mechanizm separacji dla takich substancji.

HPLC w normalnej fazie

Faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma, dlatego w składzie eluentu dominuje rozpuszczalnik niepolarny:

• Heksan:izopropanol = 95:5 (dla substancji o niskiej polarności)
• Chloroform:metanol = 95:5 (dla substancji średnio polarnych)
• Chloroform:metanol = 80:20 (dla substancji silnie polarnych)

HPLC z odwróconą fazą

Faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, więc woda jest prawie zawsze obecna w eluencie. W takim przypadku zawsze można zapewnić całkowite rozpuszczenie BAS w fazie ruchomej, prawie zawsze można zastosować detekcję UV, prawie wszystkie fazy ruchome są wzajemnie mieszalne, można zastosować elucję gradientową, kolumnę można szybko zregenerować -zrównoważony, kolumnę można zregenerować.

Typowe eluenty do HPLC z odwróconą fazą to:

• Acetonitryl: woda
• metanol: woda
• Izopropanol: woda

Matryce do HPLC

Matryce stosowane w HPLC to związki nieorganiczne, takie jak krzemionka (żel krzemionkowy) lub tlenek glinu, lub polimery organiczne, takie jak polistyren (usieciowany diwinylobenzenem) lub polimetakrylan. Żel krzemionkowy jest oczywiście obecnie powszechnie akceptowany.

Główne cechy matrycy:

• Wielkość cząstek (µm);
• Wielkość porów wewnętrznych (Å, nm).

Otrzymywanie żelu krzemionkowego do HPLC:

1. Tworzenie mikrosfer kwasu polikrzemowego;
2. Suszenie cząstek żelu krzemionkowego;
3. Separacja powietrza.

Cząsteczki sorbentu:

• Regularny (kulisty): wyższa odporność na ciśnienie, wyższy koszt;
• Niesferyczne: mniejsza odporność na ciśnienie.

Wielkość porów w HPLC jest jednym z najważniejszych parametrów. Im mniejszy rozmiar porów, tym gorsza ich przepuszczalność dla cząsteczek eluowanych substancji. A co za tym idzie, im gorsza pojemność sorpcyjna sorbentów. Im większe pory, tym mniejsza, po pierwsze, stabilność mechaniczna cząstek sorbentu, a po drugie, mniejsza powierzchnia sorpcyjna, a co za tym idzie, gorsza efektywność.

Przeszczepy fazy stacjonarnej

HPLC w fazie normalnej:

• Faza stacjonarna szczepiona propylonitrylem (nitrylem);
• Faza stacjonarna ze szczepieniem propyloaminą (amina).

HPLC z odwróconą fazą:

• Faza stacjonarna z przeszczepem alkilowym;
• Faza stacjonarna z przeszczepem alkilosililu.

End-capping - zabezpieczenie nieszczepionych obszarów sorbentu poprzez dodatkowe szczepienie „małymi” cząsteczkami. Hydrofobowe end-capping (C1, C2): wyższa selektywność, gorsza zwilżalność; hydrofilowe end-capping (diol): niższa selektywność, wyższa zwilżalność.

Detektory HPLC

• UV
• Tablica diod
• Fluorescencyjny
• Elektrochemiczny
• refraktometryczny
• selektywny masowo

Spinki do mankietów

Fundacja Wikimedia. 2010 .

Zobacz, czym jest „Wysokosprawna chromatografia cieczowa” w innych słownikach:

wysokosprawna chromatografia cieczowa- - [AS Goldberg. Angielsko-rosyjski słownik energetyczny. 2006] Tematy ogólne energia EN wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC … Podręcznik tłumacza technicznego

Termin wysokosprawna chromatografia cieczowa Termin angielski wysokosprawna chromatografia cieczowa Synonimy Skróty HPLC, HPLC Pojęcia pokrewne adsorpcja, oligopeptyd, proteomika, sorbent, fulleren, endohedral, chromatografia… …

W chromatografii cieczowej w celu zwiększenia skuteczności rozdziału rozpuszczalnik (eluent) pod ciśnieniem (powyżej 3x107 Pa) pompowany jest przez kolumny wypełnione sorbentem z cząstkami o małej średnicy (do 1 μm), a perfuzja ... ...

Rodzaj chromatografii, w której ciecz (eluent) służy jako faza ruchoma i jest fazą stacjonarną. sorbent, telewizor. nośnik z płynem lub żelem nałożonym na jego powierzchnię. Przeprowadza się w kolumnie wypełnionej sorbentem (chromatografia kolumnowa), na płaskiej ... ... Naturalna nauka. słownik encyklopedyczny

- [κρώμα (υroma) color] proces polegający na nierównej zdolności poszczególnych składników mieszaniny (ciekłej lub gazowej) do zatrzymywania się na powierzchni adsorbentu zarówno w przypadku ich absorpcji ze strumienia nośnika, jak i w przypadku.. ... Encyklopedia geologiczna

- (z innych greckich ... Wikipedia

Termin chromatografia Angielski termin chromatografia Synonimy Skróty Pojęcia powiązane wysokosprawna chromatografia cieczowa, klatrat, laboratorium na chipie, porozymetria, proteom, proteomika, sorbent, enzym, fuleren, endoedral… … Słownik encyklopedyczny nanotechnologii

Chromatografia cieczowa oparta na rozkładzie. zdolność rozdzielonych jonów do wymiany jonowej z utrwaloną. jony sorbentu powstające w wyniku dysocjacji grup jonogennych tego ostatniego. Wymieniacze kationowe służą do separacji kationów, do ... ... Encyklopedia chemiczna

HPLC- wysokosprawna chromatografia cieczowa ... Słownik skrótów języka rosyjskiego

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest jedną ze skutecznych metod rozdzielania złożonych mieszanin substancji, która jest szeroko stosowana zarówno w chemii analitycznej, jak iw technologii chemicznej. Podstawą rozdziału chromatograficznego jest udział… Wikipedia

Książki

• Praktyczna wysokosprawna chromatografia cieczowa, Veronica R. Mayer. Oddajemy w ręce Czytelnika piąte wydanie książki, które zostało wzbogacone o nowoczesne metody i sprzęt. W książce wiele zostało poprawione i dodano dużą liczbę odniesień. Miejsca w tekście, w których...

Chromatografia cieczowa Jest to metoda rozdzielania i analizy złożonych mieszanin substancji, w których fazą ruchomą jest ciecz. Ma zastosowanie do rozdzielania szerszego zakresu substancji niż metoda chromatografii gazowej. Wynika to z faktu, że większość substancji nie jest lotna, wiele z nich jest niestabilnych w wysokich temperaturach (zwłaszcza związki wysokocząsteczkowe) i rozkładają się po przejściu w stan gazowy. Rozdzielanie substancji metodą chromatografii cieczowej najczęściej przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

Cechy wszystkich rodzajów chromatografii cieczowej wynikają z faktu, że fazą ruchomą jest w niej ciecz, a sorpcja składników z eluentu gazowego i ciekłego przebiega inaczej. Jeżeli w chromatografii gazowej gaz nośny pełni jedynie funkcję transportową i nie jest sorbowany przez fazę stacjonarną, to ciekła faza ruchoma w chromatografii cieczowej jest eluentem aktywnym, jej cząsteczki mogą być sorbowane przez fazę stacjonarną. Podczas przechodzenia przez kolumnę cząsteczki składników analizowanej mieszaniny znajdujące się w eluencie muszą wypierać cząsteczki eluentu z powierzchniowej warstwy sorbentu, co prowadzi do zmniejszenia energii oddziaływania między cząsteczkami eluentu. analizowanej substancji i powierzchni sorbentu. Dlatego wartości zatrzymanych woluminów V R, proporcjonalna do zmiany energii swobodnej układu, jest mniejsza w chromatografii cieczowej niż gazowej, a zakres liniowości izotermy sorpcji w chromatografii cieczowej jest szerszy.

Stosując różne eluenty można zmieniać parametry retencji i selektywność układu chromatograficznego. Selektywność w chromatografii cieczowej, w przeciwieństwie do chromatografii gazowej, zależy nie od jednego, ale od dwóch czynników - natury fazy ruchomej (eluentu) i stacjonarnej.

Ciekła faza ruchoma ma większą gęstość i lepkość niż faza gazowa, współczynniki dyfuzji D I 3-4 rzędy wielkości mniejsze niż w gazie. Prowadzi to do spowolnienia przenoszenia masy w chromatografii cieczowej w porównaniu z chromatografią gazową. Równanie Van Deemtera ze względu na fakt, że termin W nie odgrywa roli w chromatografii cieczowej ( D I  D G), zmienia się również graficzna zależność wydajności H na prędkość liniową przepływu fazy ruchomej ma postać pokazaną na rys. 1.9.

W klasycznej wersji kolumnowej chromatografii cieczowej na szklaną kolumnę o wysokości 1–2 m wypełnioną sorbentem o wielkości cząstek 100 μm i eluentem wprowadza się badaną próbkę rozpuszczoną w eluencie, a eluent przepuszcza się przez , pobierając porcje eluatu na wylocie z kolumny. Ta wersja chromatografii cieczowej jest nadal stosowana w praktyce laboratoryjnej, ale ponieważ szybkość przepływu eluentu pod działaniem grawitacji jest niewielka, analiza jest długa.

Nowoczesna wersja chromatografii cieczowej, tzw. wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC, wykorzystuje sorbenty objętościowe i powierzchniowo porowate o wielkości cząstek 5–10 µm, pompy ciśnieniowe zapewniające ciśnienie w układzie do 400 atm oraz wysoce czułe detektory. Szybki transfer masy i wysoka skuteczność rozdzielania umożliwiają wykorzystanie HPLC do rozdzielania molekuł (chromatografia cieczowo-adsorpcyjna i ciecz-ciecz), do rozdzielania jonów (chromatografia jonowymienna, jonowymienna, chromatografia par jonowych), do rozdzielanie makrocząsteczek (chromatografia wykluczania wielkościowego).

1.3. RETENCJA I WYTRZYMAŁOŚĆ ROZPUSZCZALNIKA

Aby anality mogły zostać rozdzielone na kolumnie, jak wspomniano powyżej, współczynnik pojemności k" musi być większy od 0, czyli substancje muszą być zatrzymane przez fazę stacjonarną, sorbent. Współczynnik wydajności nie powinien być jednak duże, aby uzyskać akceptowalny czas elucji.Jeżeli dla danej mieszaniny substancji zostanie wybrana faza stacjonarna, która je zatrzymuje, to dalsze prace nad opracowaniem procedury analitycznej polegają na doborze rozpuszczalnika, który w idealnym przypadku dawałby różne dla wszystkich składowych, ale akceptowalne niezbyt duże k. Osiąga się to poprzez zmianę siły wymywania rozpuszczalnika.

W przypadku chromatografii adsorpcyjnej na żelu krzemionkowym lub tlenku glinu z reguły moc rozpuszczalnika dwuskładnikowego (np. heksanu z dodatkiem izopropanolu) zwiększa się poprzez zwiększenie w nim zawartości składnika polarnego (izopropanolu) lub zredukowane poprzez zmniejszenie zawartości izopropanolu. Jeśli zawartość składnika polarnego stanie się zbyt niska (poniżej 0,1%), należy go zastąpić słabszym eluentem. Robi się to samo, zastępując składnik polarny lub niepolarny innym, nawet jeśli ten system nie zapewnia pożądanej selektywności w odniesieniu do interesujących składników mieszaniny. Przy doborze układów rozpuszczalników brane są pod uwagę zarówno rozpuszczalności składników mieszaniny, jak i szeregi eluotropowe rozpuszczalników zestawione przez różnych autorów.

W przybliżeniu w ten sam sposób dobiera się moc rozpuszczalnika w przypadku stosowania szczepionych faz polarnych (nitryl, amino, diol, nitro itp.), biorąc pod uwagę możliwe reakcje chemiczne i wykluczając niebezpieczne dla fazy rozpuszczalniki (np. , aldehydy i ketony dla fazy aminowej).

W przypadku chromatografii z odwróconymi fazami moc rozpuszczalnika zwiększa się poprzez zwiększenie zawartości składnika organicznego (metanolu, acetonitrylu lub THF) w eluencie i zmniejsza poprzez dodanie większej ilości wody. Jeśli nie można osiągnąć pożądanej selektywności, stosuje się inny składnik organiczny lub podejmuje się próby jego zmiany za pomocą różnych dodatków (kwasów, odczynników par jonowych itp.).

W rozdziałach metodą chromatografii jonowymiennej moc rozpuszczalnika zmienia się poprzez zwiększanie lub zmniejszanie stężenia roztworu buforowego lub zmianę pH, w niektórych przypadkach stosuje się modyfikację substancjami organicznymi.

Jednakże, zwłaszcza w przypadku złożonych mieszanin naturalnych i biologicznych, często nie jest możliwe dobranie mocy rozpuszczalnika w taki sposób, aby wszystkie składniki próbki zostały wymyte w akceptowalnym czasie. Wtedy trzeba uciekać się do elucji gradientowej, tj. stosować rozpuszczalnik, którego siła elucji w trakcie analizy zmienia się tak, że stale wzrasta zgodnie z ustalonym programem. Dzięki tej technice możliwe jest uzyskanie elucji wszystkich składników złożonych mieszanin w stosunkowo krótkim czasie i ich rozdzielenie na składniki w postaci wąskich pików.

1.6.1. Adsorpcyjna chromatografia cieczowa. Adsorpcyjna chromatografia cieczowa, w zależności od polarności fazy stacjonarnej i ruchomej, dzieli się na chromatografię w fazie normalnej (NPC) i w fazie odwróconej (RPC). W NPC stosuje się polarny adsorbent i niepolarne fazy ruchome, w OFC stosuje się niepolarny adsorbent i polarne fazy ruchome, ale w obu przypadkach wybór fazy ruchomej jest często ważniejszy niż wybór fazy ruchomej. stacjonarny. Faza stacjonarna musi zawierać substancje, które mają zostać rozdzielone. Faza ruchoma, czyli rozpuszczalnik, musi zapewniać różne pojemności kolumn i wydajne rozdzielanie w rozsądnym czasie.

Jako fazę stacjonarną w adsorpcyjnej chromatografii cieczowej stosuje się polarne i niepolarne drobno zdyspergowane materiały porowate o powierzchni właściwej większej niż 50 m2/g. Adsorbenty polarne (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil itp.) mają na powierzchni grupy słabo kwaśne, zdolne do zatrzymywania substancji o właściwościach zasadowych. Adsorbenty te stosowane są głównie do separacji związków niepolarnych i średniopolarnych. Ich wadą jest duża wrażliwość na zawartość wody w stosowanych eluentach. Aby wyeliminować tę wadę, polarne sorbenty poddaje się działaniu amin, dioli i innych reagentów, co powoduje szczepienie powierzchniowe tych reagentów, modyfikację powierzchni i zmianę selektywności w stosunku do analitów.

Adsorbenty niepolarne (sadza grafityzowana, ziemia okrzemkowa, ziemia okrzemkowa) są nieselektywne w stosunku do cząsteczek polarnych. Aby uzyskać niepolarne adsorbenty, grupy niepolarne są często szczepione na powierzchni, na przykład żelu krzemionkowego, na przykład alkilosililu - SiR 3, gdzie grupy R - alkilowe to C2-C22.

Faza ruchoma powinna całkowicie rozpuścić analizowaną próbkę, mieć niską lepkość (aby współczynniki dyfuzji były wystarczająco duże), pożądane jest, aby można było z niej oddzielić wydzielone składniki. Musi być obojętny dla materiałów wszystkich części chromatografu, bezpieczny, tani, odpowiedni dla detektora.

Fazy ​​ruchome stosowane w chromatografii cieczowej różnią się siłą elucji. Zdolność elucyjna rozpuszczalnika pokazuje, ile razy energia sorpcji danego eluentu na danym adsorbencie jest większa od energii sorpcji eluentu wybranego jako wzorzec, np. n-heptanu. Słabe rozpuszczalniki są słabo adsorbowane przez fazę stacjonarną, przez co współczynniki dystrybucji substancji sorbowanych (sorbinian) są wysokie. I odwrotnie, silne rozpuszczalniki dobrze się adsorbują, więc współczynniki podziału sorbinianów są niskie. Im mocniejszy rozpuszczalnik, tym większa rozpuszczalność w nim analizowanej próbki, tym silniejsze oddziaływanie rozpuszczalnik-sorbinian.

Aby zapewnić wysoką skuteczność separacji na kolumnie, konieczny jest dobór fazy ruchomej o polarności optymalnej dla rozdzielanej mieszaniny w wybranych warunkach separacji. Zwykle najpierw wybiera się fazę stacjonarną, która ma polaryzację zbliżoną do biegunowości rozdzielanych składników. Następnie wybiera się fazę ruchomą, zapewniając, że współczynnik pojemności k" okazało się, że mieści się w przedziale od 2 do 5. Jeśli polaryzacja fazy ruchomej jest zbyt zbliżona do polaryzacji fazy stacjonarnej, czas retencji składników będzie zbyt krótki, a jeśli polaryzacja fazy ruchomej i stacjonarnej fazy bardzo się różnią, czas retencji staje się zbyt długi.

Przy doborze faz ruchomych kierują się tzw. szeregiem eluotropowym, opartym na wykorzystaniu wskaźników polaryzacji Snider R", który dzieli wszystkie rozpuszczalniki na silne (polarne) i słabe (słabo polarne i niepolarne). Skala polarności opiera się na rozpuszczalności substancji stosowanych jako fazy ruchome w dioksanie, nitrometanie i etanolu.

W tabeli 1.2 przedstawiono wartości wskaźnika polarności i siły elucji (w odniesieniu do SiO 2 ) szeregu rozpuszczalników najczęściej stosowanych w chromatografii cieczowej jako fazy ruchome. Wskazano tu również granice przezroczystości krótkofalowej tych rozpuszczalników, co ułatwia dobór warunków do wykrywania składników mieszaniny.

Tabela 1.2

Charakterystyka rozpuszczalników stosowanych w chromatografii cieczowej

Rozpuszczalnik	Indeks polaryzacji	Moc elucji (SiO 2)	Limit przezroczystości fal krótkich
Fluorakan
Cykloheksan
N-Heksan
Tetrachlorek węgla
Eter diizopropylowy
eter dietylowy
dichlorometan
tetrahydrofuran
Chloroform
Kwas octowy
acetonitryl
nitrometan

W chromatografii cieczowej często stosuje się nie pojedyncze rozpuszczalniki, ale ich mieszaniny. Często niewielkie dodatki innego rozpuszczalnika, zwłaszcza wody, znacznie zwiększają siłę elucji eluentu.

Podczas rozdzielania mieszanin wieloskładnikowych jedna faza ruchoma jako eluent może nie rozdzielić wszystkich składników próbki w rozsądnym czasie. W tym przypadku stosuje się metodę elucji stopniowej lub gradientowej, w której podczas chromatografii stosuje się kolejno coraz mocniejsze eluenty, co pozwala na elucję silnie retencji substancji w krótszym czasie.

W chromatografii cieczowej jest ich kilka empiryczny zasady, które są bardzo przydatne przy wyborze eluentu:

 sorpcja związku z reguły wzrasta wraz ze wzrostem w nim liczby wiązań podwójnych i grup OH;

 spadek sorpcji wielu związków organicznych: kwasów, alkoholi, aldehydów, ketonów, estrów, węglowodorów nienasyconych, węglowodorów nasyconych;

 do rozdzielania substancji o różnej polarności i rozdzielania substancji z różnych klas stosuje się chromatografię w normalnych fazach: analizowana próbka jest rozpuszczana i eluowana niepolarnym eluentem, związki różnych klas opuszczają kolumnę z polarnym adsorbentem w różnym czasie, podczas gdy czas retencji związków o różnych grupach funkcyjnych wzrasta podczas przejścia ze związków niepolarnych do słabo polarnych. W przypadku bardzo polarnych cząsteczek czasy retencji są tak długie, że analiza nie jest możliwa przy użyciu niepolarnego eluentu. Aby skrócić czas retencji składników polarnych, przechodzi się do polarnych eluentów;

 w wariancie z fazą odwróconą faza stacjonarna (adsorbent niepolarny) silniej adsorbuje składnik niepolarny z eluentów polarnych, np. z wody;

 Zmniejszając polarność eluentu poprzez dodanie mniej polarnego rozpuszczalnika, można zmniejszyć retencję składników.

1.6.2. Chromatografia cieczowa z podziałem. W chromatografii rozdzielczej lub cieczowo-cieczowej rozdział składników analizowanej próbki wynika z różnic współczynników ich rozkładu pomiędzy dwiema fazami ciekłymi, które nie mieszają się ze sobą, z których jedna jest nieruchoma i znajduje się na powierzchni lub w porach stałego nieruchomego nośnika, a drugi jest ruchomy.

Ze względu na charakter sił oddziaływań, które powodują różny rozkład między dwiema fazami substancji różniących się budową chemiczną, chromatografia podziałowa jest podobna do chromatografii adsorpcyjnej, tj. tutaj rozdział również opiera się na różnicy sił oddziaływanie międzycząsteczkowe składników analizowanej próbki z fazą ciekłą stacjonarną i ruchomą.

W zależności od techniki wykonania chromatografia podziałowa, podobnie jak chromatografia adsorpcyjna, może być kolumnowa lub płaska (papierowa lub cienkowarstwowa).

Jako nośniki stałe stosuje się substancje, które są obojętne dla ruchomego rozpuszczalnika i składników analizowanej próbki, ale zdolne do zatrzymywania fazy stacjonarnej na powierzchni iw porach. Najczęściej jako nośniki stosuje się substancje polarne (celuloza, żel krzemionkowy, skrobia). Nanoszone są na fazę stacjonarną - polarny rozpuszczalnik, najczęściej wodę lub alkohol. W tym przypadku jako fazy ruchome stosuje się substancje mniej polarne lub niepolarne (alkohole, aminy, ketony, węglowodory itp.). Ten rodzaj chromatografii z podziałem nazywa się normalna faza. Służy do oddzielania substancji polarnych.

Druga wersja chromatografii rozdziałowej różni się tym, że jako stacjonarną fazę stałą stosuje się nośniki niepolarne (guma, fluoroplast, hydrofobizowany żel krzemionkowy), jako stacjonarną fazę ciekłą rozpuszczalniki niepolarne (węglowodory), a jako fazę ciekłą stacjonarne rozpuszczalniki polarne (alkohole, aldehydy). ) jako ruchoma faza ciekła. , ketony itp., często woda). Ten wariant chromatografii z podziałem nazywa się odwrócona faza i służy do oddzielania substancji niepolarnych.

Dla uzyskania optymalnego rozdzielenia składników analizowanej próbki bardzo ważny jest dobór fazy ruchomej. Rozpuszczalniki (faza ciekła ruchoma i stacjonarna) powinny być tak dobrane, aby współczynniki podziału składników mieszaniny znacznie się różniły. Fazy ​​ciekłe podlegają następującym warunkom wymagania:

1) zastosowane rozpuszczalniki powinny dobrze rozpuszczać rozdzielane substancje, a ich rozpuszczalność w fazie stacjonarnej powinna być większa niż w fazie ruchomej;

2) rozpuszczalniki stosowane jako faza ruchoma i faza stacjonarna muszą być wzajemnie nasycone, tj. skład rozpuszczalnika musi być stały podczas przechodzenia przez kolumnę;

3) oddziaływanie rozpuszczalników stosowanych jako faza ruchoma z fazą stacjonarną powinno być minimalne.

Najczęściej w rozdzielającej chromatografii cieczowej jako ruchome fazy ciekłe stosuje się nie pojedyncze substancje, ale ich mieszaniny w różnych proporcjach. Pozwala to kontrolować polaryzację fazy ruchomej, zmieniać stosunek polaryzacji fazy ruchomej i stacjonarnej oraz uzyskać optymalne warunki rozdziału składników danej analizowanej mieszaniny.

Istotną wadą tej metody chromatograficznej jest dość szybkie wypłukiwanie z nośnika naniesionej stacjonarnej fazy ciekłej. Aby go wyeliminować, rozpuszczalnik stosowany jako faza ruchoma nasyca się substancją stosowaną jako stacjonarna faza ciekła lub stabilizuje się stacjonarną fazę ciekłą poprzez szczepienie jej na nośniku.

Odmianą chromatografii cieczowej z podziałem jest szeroko stosowana metoda HPLC.

Najbardziej powszechnymi systemami chromatograficznymi są systemy, które mają zasadę montażu modułowego. Pompy, odgazowywacze, detektory, autosamplery, piece kolumnowe, kolektory frakcji, elementy sterujące systemem chromatograficznym i rejestratory są dostępne jako osobne moduły. Szeroka gama modułów pozwala elastycznie rozwiązywać różne problemy analityczne, w razie potrzeby szybko zmieniać konfigurację systemu, przy minimalnych kosztach. Równolegle produkowane są również monomodułowe (zintegrowane) LC, których główną zaletą jest miniaturyzacja poszczególnych bloków oraz kompaktowość urządzenia.

W zależności od metody elucji chromatografy cieczowe dzielą się na izokratyczne i gradientowe.

Schemat chromatografu izokratycznego

Faza ruchoma z pojemnika (1) poprzez filtr wlotowy (9) podawana jest przez wysokociśnieniową pompę precyzyjną (2) do układu podawania próbki (3) - iniektora ręcznego lub autosamplera, gdzie również wstrzykiwana jest próbka . Ponadto przez filtr liniowy (8) próbka z prądem fazy ruchomej wchodzi do elementu (elementów) separacji (4) - przez kolumnę wstępną do kolumny separacyjnej. Następnie eluat wchodzi do detektora (5) i jest usuwany do zbiornika spustowego (7). Gdy eluat przepływa przez obwód pomiarowy detektora, następuje rejestracja chromatogramu i przekazanie danych do rejestratora analogowego (rejestratora) (6) lub innego systemu zbierania i przetwarzania danych chromatograficznych (integratora lub komputera). W zależności od konstrukcji modułów funkcjonalnych, system może być sterowany z klawiatury modułu sterującego (zwykle pompy lub sterownika systemu), z klawiatur każdego z modułów systemu lub za pomocą programu sterującego z komputera osobistego.

W przypadku elucji gradientowej stosuje się dwa zasadniczo różne typy chromatografów cieczowych. Różnią się one punktem powstawania gradientu składu fazy ruchomej.

Schemat chromatografu gradientowego z utworzeniem gradientu składu fazy ruchomej na linii niskiego ciśnienia.

Faza ruchoma ze zbiorników (1) poprzez filtry wlotowe (9) i programator gradientu (10) podawana jest precyzyjną pompą wysokociśnieniową (2) do układu dozowania próbki (3) - iniektora ręcznego lub autosamplera , gdzie próbka jest również wstrzykiwana. Działanie zaworów programatora gradientu jest kontrolowane przez moduł sterujący systemu (pompa lub sterownik) lub przez program sterujący na komputerze PC. Układy tego typu tworzą gradient binarny, trójwymiarowy i czterowymiarowy. Postać funkcji przetwarzania gradientu zależy od konkretnego modułu sterującego lub programu sterującego, a także funkcjonalności modułów sterowanych i sterujących. Ponadto przez filtr liniowy (8) próbka z prądem fazy ruchomej wchodzi do elementu (elementów) separacji (4) - przez kolumnę wstępną do kolumny separacyjnej. Następnie eluat wpływa do detektora (5) i jest odprowadzany do zbiornika spustowego (7). Gdy eluat przepływa przez obwód pomiarowy detektora, następuje rejestracja chromatogramu i przekazanie danych do rejestratora analogowego (rejestratora) (6) lub innego systemu zbierania i przetwarzania danych chromatograficznych (integratora lub komputera). W zależności od konstrukcji modułów funkcjonalnych, system może być sterowany z klawiatury modułu sterującego (zwykle jest to pompa lub sterownik systemu) lub za pomocą programu sterującego z komputera osobistego. W przypadku sterowania modułem sterującym istnieje możliwość samodzielnego sterowania czujką z własnej klawiatury.

Pomimo pozornej atrakcyjności takich systemów (wykorzystują tylko jedną wysokociśnieniową pompę precyzyjną), systemy te mają szereg wad, wśród których być może główną jest konieczność dokładnego odgazowania składników fazy ruchomej jeszcze przed mikser niskociśnieniowy (komora programatora gradientu). Odbywa się to za pomocą specjalnych odgazowywaczy przepływowych. Dzięki temu ich koszt staje się porównywalny z innym typem układów gradientowych – układami z tworzeniem składu gradientowego fazy ruchomej na linii wysokiego ciśnienia.

Zasadniczą różnicą między układami z tworzeniem składu gradientowego fazy ruchomej w przewodzie wysokiego ciśnienia jest mieszanie składników w przewodzie wysokiego ciśnienia, oczywiście przy takim podejściu liczba pomp precyzyjnych jest określana liczbą zbiorników do mieszania faza ruchoma. Dzięki takiemu podejściu wymagania dotyczące dokładności odgazowania komponentów są znacznie zmniejszone.

Schemat chromatografu gradientowego z utworzeniem gradientu składu fazy ruchomej na linii wysokiego ciśnienia.

Faza ruchoma ze zbiorników (1) poprzez filtry wlotowe (9) podawana jest wysokociśnieniowymi pompami precyzyjnymi (2 i 11) przez mieszalnik przepływowy statyczny lub dynamiczny (10) do układu dozowania próbki (3) - instrukcja iniektora lub autosamplera, do którego również wstrzykiwana jest próbka. Pracą pomp sterowanych steruje moduł sterujący systemu (pompa nadrzędna lub sterownik) lub program sterujący na komputerze PC. W tym przypadku sterowane są wszystkie pompy. Systemy tego typu tworzą gradient binarny lub trójwymiarowy. Postać funkcji przetwarzania gradientu zależy od konkretnego modułu sterującego lub programu sterującego, a także funkcjonalności modułów sterowanych i sterujących. Ponadto przez filtr liniowy (8) próbka z prądem fazy ruchomej wchodzi do elementu (elementów) separacji (4) - przez kolumnę wstępną do kolumny separacyjnej. Następnie eluat wpływa do detektora (5) i jest usuwany do zbiornika spustowego (7). Gdy eluat przepływa przez obwód pomiarowy detektora, następuje rejestracja chromatogramu i przekazanie danych do rejestratora analogowego (rejestratora) (6) lub innego systemu zbierania i przetwarzania danych chromatograficznych (integratora lub komputera). W zależności od konstrukcji modułów funkcjonalnych, system może być sterowany z klawiatury modułu sterującego (zwykle jest to pompa lub sterownik systemu) lub za pomocą programu sterującego z komputera osobistego. W przypadku sterowania modułem sterującym istnieje możliwość samodzielnego sterowania czujką z własnej klawiatury.

Proponowane schematy są raczej uproszczone. Układy mogą zawierać dodatkowe urządzenia - termostat kolumnowy, układy derywatyzacji pokolumnowej, układy przygotowania i zatężania próbek, recykler rozpuszczalników, układy membranowe do tłumienia przewodnictwa elektrycznego tła (dla chromatografii jonowej), dodatkowe układy zabezpieczające (filtry, kolumny) itp. . Na schematach moduły manometryczne również nie są pokazane oddzielnie. Z reguły urządzenia te są wbudowane w jednostki pompowe. Jednostki te mogą łączyć wiele pomp, pompę z programatorem gradientu i wspólny sterownik systemu. Struktura systemu zależy od jego konfiguracji i konkretnego producenta.

Tak radykalne skomplikowanie technicznego wsparcia procesu chromatograficznego prowadzi do pojawienia się szeregu wymagań dotyczących właściwości fazy ruchomej, których nie ma w klasycznej chromatografii kolumnowej i planarnej. Faza ciekła musi nadawać się do wykrywania (być przezroczysta w danym obszarze widma lub mieć niski współczynnik załamania światła, określoną przewodność lub przenikalność elektryczną itp.), obojętna w stosunku do materiałów części traktu chromatograficznego, nie tworzyć pęcherzyki gazu w zaworach pompy i celce detektora, nie posiadają zanieczyszczeń mechanicznych.

W chromatografii cieczowej stosuje się wiele typów pomp. Niskociśnieniowe LC często wykorzystuje pompy perystaltyczne (Rysunek 1).

Rys.1 Programowalna pompa perystaltyczna MasterFlex.

W HPLC stosuje się pompy wysokociśnieniowe zapewniające przepływ fazy ruchomej przez kolumnę o określonych parametrach.

Najważniejsze parametry techniczne pomp HPLC to: zakres przepływu; maksymalne ciśnienie robocze; powtarzalność przepływu; zakres pulsacji zasilania rozpuszczalnikiem.

Ze względu na charakter dostarczania rozpuszczalnika pompy mogą mieć stały dopływ (przepływ) i stałe ciśnienie. Zasadniczo w pracach analitycznych stosuje się tryb stałego przepływu, podczas napełniania kolumn stosuje się tryb stałego ciśnienia.

Zgodnie z zasadą działania pompy HPLC dzielą się na strzykawka i dalej tłok nurnikowy odwzajemniający się .

Pompy strzykawkowe

Główną cechą wyróżniającą te pompy jest ich cykliczna praca, dlatego też chromatografy w których te pompy są stosowane różnią się także pracą cykliczną.

Ryż. 2. Zasadniczy układ pompy strzykawkowej do HPLC.

Ryż. 2A. Pompa strzykawkowa.

Jednostka sterująca BU dostarcza napięcie do silnika D, który określa prędkość i kierunek jego obrotów. Obroty silnika za pomocą przekładni P zamieniane są na ruch tłoka P wewnątrz cylindra D. Pompa pracuje w 2 cyklach. W cyklu napełniania zawór K2 jest zamknięty, K1 jest otwarty, rozpuszczalnik przepływa ze zbiornika do cylindra C. W trybie zasilania zawór K1 jest zamknięty, a przez zawór K2 faza ruchoma dostaje się do urządzenia dozującego.

Pompy tego typu charakteryzują się niemal całkowitym brakiem pulsacji przepływu fazy ruchomej podczas pracy.

Wady pompy:

a) duże zużycie czasu i rozpuszczalnika do przemywania przy zmianie rozpuszczalnika;

b) objętość PF ograniczona przez objętość strzykawki, a więc ograniczony czas rozdzielania;

c) zawieszenie separacji podczas napełniania pompy;

d) duże gabaryty i ciężar przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiego przepływu i ciśnienia (potrzebny jest mocny silnik i duża siła tłoka przy jego dużej powierzchni).

Tłokowe pompy tłokowe.

Ryż. 3. Główne urządzenie pompy nurnikowej.

Zasada działania.

Silnik D przez skrzynię biegów R wykonuje ruch posuwisto-zwrotny tłoka P, poruszając się w głowicy roboczej pompy. Zawory K1 i K2 otwierają się, gdy pompa znajduje się odpowiednio w fazie ssania i tłoczenia. Wielkość dozowania objętościowego określają trzy parametry: średnica tłoka (zwykle 3,13; 5,0; 7,0 mm), jego amplituda (12-18 mm) oraz częstotliwość (która zależy od prędkości obrotowej silnika i skrzyni biegów).

Pompy tego typu zapewniają stały przepływ objętościowy fazy ruchomej przez długi czas. Maksymalne ciśnienie robocze 300-500 atm, natężenie przepływu 0,01-10 ml/min. Powtarzalność podawania objętościowego -0,5%. Główną wadą jest to, że rozpuszczalnik jest podawany do układu w postaci serii następujących po sobie impulsów, a więc występują pulsacje ciśnienia i przepływu (rys. 4). Jest to główny powód zwiększonego szumu i odczulania prawie wszystkich detektorów stosowanych w LC, zwłaszcza elektrochemicznych.

Ryc.4. Pulsacja pompy tłokowej.

Sposoby radzenia sobie z pulsacją.

1. Zastosowanie urządzeń tłumiących.

Są to rurki spiralne o specjalnym profilu wykonane ze stali nierdzewnej, włączone szeregowo lub równolegle w układ między pompą a dystrybutorem.

Ryż. 5. Amortyzator spiralny.

Przepustnica jest odkręcana wraz ze wzrostem ciśnienia w niej (przyspieszenie pompy). Wraz ze spadkiem ciśnienia skręca się, zmniejsza się jego objętość, wyciska część rozpuszczalnika, utrzymując stałą prędkość przepływu i zmniejszając pulsacje. Taki tłumik działa dobrze przy ciśnieniu 50 atm i wyższym.

Przy ciśnieniu 5-30 atm lepiej wygładza pulsacje przepustnica powietrza, wykonany z kolumny (ryc. 6.). Powietrze w zatkanej kolumnie (6x200 mm) zostaje sprężone i pulsacje wygasają. Powietrze w nim rozpuszcza się w ciągu 24 godzin.

Ryż. 6. Przepustnica powietrza.

2. Korzystanie z urządzeń elektronicznych.

W przypadku stosowania elektronicznego przetwornika ciśnienia odczyty z przetwornika mogą być wykorzystane do sterowania pracą pompy. Gdy ciśnienie spada, prędkość obrotowa silnika wzrasta i kompensuje spadek ciśnienia. Możliwe jest również skompensowanie nieszczelności w zaworach i częściowo w mankietach. Zastosowanie elektronicznego tłumika (BPZh-80, KhPZh-1 itp.) Umożliwia zmniejszenie pulsacji ciśnienia do 1 atm przy ciśnieniu 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Jonowymienna, jonowa, chromatografia par jonowych. Metody chromatografii jonowymiennej, jonowymiennej i par jonowych opierają się na dynamicznym procesie wymiany jonów związanych z fazą stacjonarną na wprowadzane do kolumny jony eluentu. Głównym celem procesu chromatograficznego jest oddzielenie jonów nieorganicznych lub organicznych o tym samym znaku. Retencja w tego typu chromatografii jest określana przez zmianę energii swobodnej reakcji wymiany jonowej. Stosunek stężeń jonów wymieniających w roztworze iw fazie sorbentu charakteryzuje się równowagą jonowymienną. Wymiana jonowa polega na tym, że niektóre substancje (wymieniacze jonowe) zanurzone w roztworze elektrolitu absorbują z niego kationy lub aniony, uwalniając do roztworu równoważną ilość innych jonów o ładunku tego samego znaku. Pomiędzy wymieniaczem kationowym a roztworem następuje wymiana kationów, pomiędzy wymieniaczem anionowym a roztworem następuje wymiana anionów.

Wymieniacze kationowe to najczęściej specjalnie syntetyzowane nierozpuszczalne substancje polimerowe zawierające w swojej strukturze kwaśne grupy jonogenne: -SO 3 H; –COOH; -OH; –PO3H2; –AsO 3 H 2 .

Wzory chemiczne wymieniaczy kationowych można schematycznie przedstawić jako R-SO3H; R-SO 3 Na. W pierwszym przypadku wymieniacz kationowy występuje w formie H, w drugim w formie Na. R oznacza matrycę polimerową.

Reakcje wymiany kationów są zapisywane jako zwykłe heterogeniczne reakcje chemiczne:

RN + Na + RNa + H +

Wymieniacze anionowe zawierają w swojej strukturze podstawowe grupy jonogenne: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + itd. Ich wzory chemiczne można przedstawić jako RNH 3 OH i RNH 3 Cl lub ROH, RCl. W pierwszym przypadku wymieniacz anionowy występuje w formie OH, w drugim w formie Cl. Reakcję wymiany anionowej można zapisać w następujący sposób:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Znane są amfoteryczne wymieniacze jonowe, które zawierają w swojej strukturze zarówno grupy kwasowe, jak i zasadowe. Wymieniacze jonowe, które mają w swoim składzie tego samego rodzaju (na przykład SO 3 H) grupy kwasowe (zasadowe), nazywane są jednofunkcyjnymi; wymieniacze jonowe zawierające heterogeniczne (na przykład - SO 3 H, - OH) grupy kwasowe (zasadowe) - wielofunkcyjne.

Jednofunkcyjne wymieniacze jonowe otrzymuje się w reakcji polimeryzacji. Reakcja polikondensacji umożliwia otrzymanie wielofunkcyjnych wymieniaczy jonowych. Aby otrzymane wymieniacze jonowe miały odpowiednio wysokie właściwości użytkowe, muszą być nierozpuszczalne, ale pęczniejące w odpowiednim rozpuszczalniku oraz posiadać odpowiednio dużą liczbę grup jonogennych zdolnych do wymiany z grupami jonogennymi analizowanej próbki. Można to osiągnąć, jeśli otrzymane łańcuchy polimerowe są wystarczająco rozgałęzione i połączone ze sobą „mostkami sieciującymi”. Np. przy otrzymywaniu wymieniaczy kationowych typu polimeryzacyjnego na bazie styrenu jako środek sieciujący stosuje się najczęściej diwinylobenzen, którego wprowadzenie w ilości do 16% zapewnia wytworzenie wymieniaczy jonowych o różnym stopniu pęcznienia i, w związku z tym pozwala kontrolować porowatość wymieniacza jonowego. Stopień spęcznienia wymieniacza jonowego, wyrażony w mililitrach/gram, jest objętością 1 g powietrzno-suchego wymieniacza jonowego umieszczonego w kolumnie.

Wymieniacz jonowy pochłania z reguły jeden z przeciwjonów - jonów w fazie ruchomej, czyli wykazuje pewną selektywność. Eksperymentalnie ustalono serie powinowactwa lub selektywności jonów względem wymieniaczy jonowych różnego typu. Na przykład przy niskich stężeniach roztworów na silnie kwaśnych wymieniaczach kationowych jony o tym samym ładunku są sorpowane w następującej kolejności:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

W przypadku jonów o różnych ładunkach wchłanialność wzrasta wraz ze wzrostem ładunku:

Na+Ca2+

Jednak zmiana warunków prowadzenia reakcji wymiany jonowej może prowadzić do inwersji szeregu. Szeregi powinowactwa zostały również ustalone dla wymieniaczy anionowych. Np. sorpowalność anionów na silnie zasadowych wymieniaczach anionowych wzrasta w szeregu:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 - .

Wymieniacze jonowe zawierające w swojej strukturze grupy silnie kwaśne lub silnie zasadowe wchodzą w reakcje jonowymienne z dowolnymi jonami w roztworze, które mają ładunki tego samego znaku co znak przeciwjonu. Takie wymieniacze jonowe nazywane są uniwersalnymi.

Proces wymiany jonowej między analitem a wymieniaczem jonowym można przeprowadzić na jeden z trzech sposobów: statyczny, dynamiczny (metoda z filtrem jonowymiennym) oraz chromatograficzny.

Metoda statyczna wymiana jonowa polega na tym, że próbkę wymieniacza jonowego styka się z pewną objętością roztworu i miesza lub wstrząsa przez określony czas, aż do ustalenia równowagi. Jest to szybka i prosta metoda wymiany jonowej, służąca do zatężania jonów z rozcieńczonych roztworów, usuwania niepożądanych zanieczyszczeń, ale nie zapewnia całkowitej absorpcji jonów, ponieważ wymiana jonowa jest procesem nierównowagowym, a zatem nie gwarantuje całkowitego oddzielenia jonów.

Podczas przeprowadzania wymiany jonowej w sposób dynamiczny przez kolumnę z wymieniaczem jonowym przepuszcza się roztwór, który przemieszczając się wzdłuż kolumny styka się z nowymi granulkami wymieniacza jonowego. Ten proces zapewnia pełniejszą wymianę niż metoda statyczna, ponieważ produkty wymiany są usuwane przez przepływ roztworu. Mogą koncentrować jony z rozcieńczonych roztworów i oddzielać jony, które znacznie różnią się właściwościami, na przykład jony o różnym ładunku (oddzielić kationy od anionów), ale oddzielenie jonów o tym samym znaku ładunku jest prawie niemożliwe. Ilościowe rozdzielenie takich jonów jest możliwe tylko przy wielokrotnym powtarzaniu elementarnych aktów sorpcji-desorpcji w warunkach dynamicznych, tj. metoda chromatograficzna . Podczas pracy tą metodą stosuje się wysokie warstwy wymieniacza jonowego, a rozdzielaną mieszaninę wprowadza się do tej warstwy w ilości znacznie mniejszej niż pojemność kolumny, dzięki czemu zapewnione jest powtarzalne powtarzanie elementarnych aktów wymiany jonowej .

Zgodnie z techniką analizy, chromatografia jonowymienna jest podobna do chromatografii molekularnej i może być prowadzona zgodnie z opcjami eluentu (rozwijania), czołowego i przemieszczenia. Różnica między chromatografią molekularną i jonowymienną polega na tym, że w chromatografii molekularnej oddzielone składniki mieszaniny są eluowane z kolumny czystym eluentem, podczas gdy w chromatografii jonowymiennej jako eluent stosuje się roztwór elektrolitu. W takim przypadku wymieniany jon eluentu powinien być sorbowany mniej selektywnie niż którykolwiek z jonów rozdzielanej mieszaniny.

Podczas przeprowadzania najczęściej stosowanej rozwijającej chromatografii jonowymiennej kolumnę wypełnioną wymieniaczem jonowym przemywa się najpierw roztworem elektrolitu, aż wymieniacz jonowy całkowicie zastąpi wszystkie swoje jony jonami zawartymi w eluencie. Następnie do kolumny wprowadza się niewielką objętość roztworu analitu, który zawiera dające się rozdzielić jony w ilości około 1% pojemności wymieniacza jonowego. Następnie kolumnę przemywa się roztworem eluentu, pobierając frakcje eluatu i poddając je analizie.

Mieszaninę jonów Cl - , Br - , J - można rozdzielić na silnie zasadowej żywicy anionowymiennej (polistyren usieciowany zawierający grupy czwartorzędowych zasad amoniowych N (CH 3) 3 +), np. AB-17, który ma zakres selektywności (selektywności): NO 3 - Cl – Br – J – . W rezultacie jako eluent stosuje się roztwór NaNO 3 . Najpierw ten roztwór przepuszcza się przez wymieniacz jonowy, aż do całkowitego nasycenia jonami NO 3 -. Gdy rozdzielana mieszanina jest wprowadzana do kolumny, jony Cl – , Br – , J – są pochłaniane przez wymieniacz anionowy, wypierając jony NO 3 –. Podczas kolejnego płukania kolumny roztworem NaNO 3 jony Cl – , Br – , J – w górnych warstwach anionitu są stopniowo ponownie zastępowane przez jony NO 3 –. Najszybciej przemieszczą się jony Cl -, najdłużej w kolumnie pozostaną jony J -. Różnica w selektywności wymieniacza jonowego względem jonów mieszaniny powoduje, że w kolumnie tworzą się oddzielne strefy zaadsorbowanych jonów Cl – , Br – i J – poruszających się po kolumnie z różnymi prędkościami. W miarę przesuwania się wzdłuż kolumny zwiększa się odległość między strefami. W każdej strefie znajduje się tylko jeden z anionów rozdzielanej mieszaniny i anion eluentu, w przerwie między strefami tylko jeden anion eluentu. Tym samym w eluencie na wylocie z kolumny pojawią się frakcje zawierające poszczególne składniki rozdzielanej mieszaniny.

Aby rozwiązać praktyczne problemy, warunki separacji jonów zmienia się, dobierając odpowiednią fazę ruchomą (skład, stężenie, pH, siłę jonową) lub zmieniając porowatość matrycy polimerowej wymieniacza jonowego, czyli liczbę wiązań międzyłańcuchowych w matrycy i tworząc sita jonowymienne, które są przepuszczalne dla jednych jonów i zdolne do ich wymiany, a nieprzepuszczalne dla innych. Możliwa jest również zmiana charakteru i wzajemnego ułożenia grup jonogennych, a także otrzymywanie sorbentów zdolnych do selektywnych reakcji chemicznych dzięki tworzeniu kompleksów. Wysoką selektywność wykazują np. kompleksujące wymieniacze jonowe zawierające w swojej strukturze grupy chelatujące odczynników organicznych dimetyloglioksymu, ditizonu, 8-hydroksychinoliny itp., a także etery koronowe.

Największe zastosowanie w chromatografii jonowymiennej, jonowej i par jonowych znajduje się w syntetycznych makro- i mikrosieciowych organicznych wymieniaczach jonowych o dużej pojemności wymiennej (3–7 mmol/g), a także w nieorganicznych materiałach jonowymiennych. Wymieniacze mikrosiatkowe są zdolne do wymiany jonów tylko w stanie spęcznionym, podczas gdy wymieniacze makrosiatkowe są zdolne do wymiany jonów w stanie spęcznionym i niespuchniętym. Innym typem strukturalnym wymieniaczy jonowych są powierzchniowo-filmowe wymieniacze jonowe, których stały rdzeń wykonany jest z nieporowatego kopolimeru styrenu i diwinylobenzenu, szkła lub żelu krzemionkowego i otoczony jest cienką warstwą wymieniacza jonowego. Całkowita średnica takiej cząstki wynosi około 40 µm, a grubość warstewki wymieniacza jonowego wynosi 1 µm. Wadą takich wymieniaczy jonowych jest stosunkowo duża średnica cząstek i mała zdolność wymiany ze względu na małą powierzchnię właściwą, w wyniku czego konieczna jest praca z małymi próbkami i odpowiednio stosowanie detektorów o wysokiej czułości. Ponadto takie wymieniacze jonowe szybko ulegają zatruciu i nie są zdolne do regeneracji.

W wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej i chromatografii jonowej polistyrenowe wymieniacze jonowe o porowatej przestrzeni, objętościowo porowate krzemionki o średnicy granulek około 10 μm oraz praktycznie niepęczniejące kopolimery powierzchniowo porowate i modyfikowane powierzchniowo styrenu i diwinylobenzenu z stosuje się jonogenne grupy sulfo i aminowe.

W chromatografii par jonowych stosuje się sorbenty „szczotkowe” - żele krzemionkowe ze szczepionymi odwróconymi fazami C 2, C 8, C 18, które łatwo przekształcają się w wymieniacz kationowy po absorpcji jonowych środków powierzchniowo czynnych z fazy ruchomej, na przykład alkil siarczany lub sole czwartorzędowych zasad amoniowych.

Przy przeprowadzaniu rozdziału chromatograficznego z użyciem wymieniaczy jonowych jako fazę ruchomą najczęściej stosuje się wodne roztwory soli. Wynika to z faktu, że woda ma doskonałe właściwości rozpuszczające i jonizujące, dzięki czemu cząsteczki analizowanej próbki natychmiast dysocjują na jony, grupy jonowymienne wymieniacza jonowego ulegają uwodnieniu, a także przechodzą w postać całkowicie lub częściowo zdysocjowaną. Zapewnia to szybką wymianę przeciwjonów. Siła elucji fazy ruchomej zależy głównie od pH, siły jonowej, charakteru roztworu buforowego, zawartości rozpuszczalnika organicznego lub środka powierzchniowo czynnego (chromatografia par jonowych).

Wartość pH dobiera się w zależności od charakteru grup jonogennych, rozdzielanych jonów i matrycy. Możliwa jest praca z jonitami silnie kwaśnymi i silnie zasadowymi przy pH = 2–12, słabo kwaśnymi przy pH = 5–12, a słabo zasadowymi przy pH = 2–6. Sorbenty na bazie krzemionki nie mogą być stosowane przy pH 9. Siła jonowa fazy ruchomej wpływa na pojemność wymieniacza jonowego. Wraz ze wzrostem siły jonowej sorpcja jonów zwykle maleje, ponieważ zwiększa się siła elucji fazy ruchomej. Dlatego na początku separacji faza ruchoma powinna mieć niską siłę jonową (0,05–0,1), a końcowa wartość tej cechy nie powinna przekraczać 2. W elucji gradientowej często stosuje się bufory o wzrastającej sile jonowej.

Do selektywnej elucji jonów absorbowanych przez wymieniacz jonowy, wodę, roztwory buforowe (fosforanowe, octanowe, boranowe, wodorowęglanowe itp.) o określonej wartości pH i sile jonowej, roztwory mineralne (chlorowodorowe, azotowe, siarkowe, fosforowe) i kwasy organiczne (fenol, cytrynowy, mlekowy, winowy, szczawiowy, EDTA). Wybór eluentu ułatwia fakt, że wyznaczono i przedstawiono w tabelach graniczne współczynniki dystrybucji większości pierwiastków pomiędzy wodnymi (wodno-organicznymi) roztworami wielu kompleksantów i standardowymi wymieniaczami jonowymi.

1.6.4. Chromatografia wykluczania wielkości. Chromatografia wykluczania jest rodzajem chromatografii cieczowej, w której rozdział składników opiera się na rozkładzie cząsteczek według ich wielkości między rozpuszczalnikiem w porach sorbentu a rozpuszczalnikiem przepływającym między jego cząstkami. Podczas separacji małe cząsteczki dostają się do sieci polimerowej, w której porach rozpuszczalnik pełni funkcję fazy stacjonarnej i tam są zatrzymywane. Duże cząsteczki nie mogą przeniknąć przez sieć polimerową i są wypłukiwane z kolumny przez fazę ruchomą. Najpierw eluowane są największe cząsteczki, potem średnie, a na końcu małe.

Chromatografia wykluczania wielkości jest podzielona na przenikanie żelowe i filtrację żelową. W chromatografii żelowo-permeacyjnej rozdzielanie zachodzi na polimerach, które pęcznieją w rozpuszczalnikach organicznych. Wersja chromatografii wykluczania z filtracją żelową obejmuje zastosowanie pęczniejących w wodzie polimerów jako faz stacjonarnych.

Czas przebywania składników analizowanej próbki w kolumnie wykluczania zależy od wielkości ich cząsteczek i dyfuzji do porów sorbentu, a także od wielkości porów fazy stacjonarnej.

W tego rodzaju chromatografii cieczowej współczynnik podziału D dla najmniejszych cząsteczek analizowanej próbki, które poruszają się w kolumnie chromatograficznej z najmniejszą prędkością, wnikając w siatkę fazy stacjonarnej, wynosi 1, ponieważ faza ruchoma i rozpuszczalnik w porach fazy stacjonarnej mają ten sam skład. W tym przypadku główne równanie chromatografii kolumnowej ma postać

Duże cząsteczki, które nie wchodzą w pory fazy stacjonarnej, są eluowane z kolumny wraz z fazą ruchomą. Dla nich D= 0, za V R =V M. Taki zakres wartości współczynników dystrybucji (od 0 do 1) jest typowy tylko dla chromatografii wykluczania.

Wszystkie cząsteczki analizowanej substancji wieloskładnikowej należy wymyć z kolumny przepuszczając z niej niewielką objętość rozpuszczalnika V M zanim V M +V S i rozdzielanie jest zakończone przed wyjściem piku rozpuszczalnika. Dlatego w tego typu chromatografii konieczne jest stosowanie odpowiednio długich kolumn o dużej objętości wolnej. V M oraz dużą liczbę porów w sorbencie.

Rozdzielczość pików chromatograficznych w rozdziałach z wykluczeniem wielkości można poprawić, stosując elucję gradientową mieszanymi rozpuszczalnikami.

Każdy sorbent stosowany w chromatografii wykluczania wielkości charakteryzuje się określoną objętością porów, a co za tym idzie, określonym obszarem dających się oddzielić mas cząsteczkowych i określoną krzywą kalibracji. W tym przypadku krzywa kalibracji charakteryzująca zależność zatrzymanej objętości od masy cząsteczkowej lub wielkości cząsteczek ma z reguły postać złożoną.

Fazy ​​stacjonarne w chromatografii wykluczania są dobierane na podstawie określonych zadań analitycznych. Wstępnie ustala się, jaki układ rozpuszczalników można zastosować do analizy (wodny czy wodno-organiczny). W zależności od tego określa się rodzaj sorbentu. Jeśli próbki rozpuszczalne w wodzie mają być rozdzielane, jako fazy stacjonarne stosuje się na przykład pęczniejące w wodzie usieciowane dekstrany (Sephadex) lub poliakryloamidy (Biogel P). Separację substancji rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych można przeprowadzić na polistyrenach o różnym stopniu usieciowania, pęczniejących w rozpuszczalnikach organicznych (styrogel, poragel, biobid C). Takie spęczniałe żele na ogół nie są stabilne ciśnieniowo i umożliwiają bardzo niskie prędkości przepływu fazy ruchomej, co wydłuża czas analizy. W celu wdrożenia wysokowydajnej wersji chromatografii wykluczania konieczne jest stosowanie faz stacjonarnych o sztywnych matrycach – żelach krzemionkowych, których wadę – wysoką aktywność adsorpcyjną – eliminuje silanizacja powierzchniowa lub dobór eluentu o odpowiedniej polarności .

Substancje, które można stosować jako fazy ruchome w chromatografii wykluczania zależnego od wielkości to:

 całkowicie rozpuścić analizowaną próbkę;

 dobrze zwilżyć sorbent;

 przeciwdziałać adsorpcji składników próbki na sorbencie;

 mają niską lepkość i toksyczność.

1.6.5. Chromatografia planarna. Chromatografia planarna obejmuje chromatografię cienkowarstwową i bibułową. Te rodzaje chromatografii cieczowej są proste w technice, ekspresowe, nie wymagają drogiego sprzętu, co jest ich niezaprzeczalną zaletą.

Rozdzielanie mieszanin substancji tymi metodami można przeprowadzić przy użyciu różnych systemów chromatograficznych. Dlatego rozróżnia się adsorpcję, dystrybucję, normalną i odwróconą fazę, wymianę jonową itp., Papier i chromatografię cienkowarstwową. Obecnie najczęściej stosowana jest chromatografia cienkowarstwowa.

Technika chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej jest podobna. Celulozowe włókno papierowe jest stosowane jako faza stacjonarna w chromatografii bibułowej, a różne sorbenty (Al 2 O 3 , żel krzemionkowy itp.) nakłada się w jednolitej, cienkiej (100-300 μm) warstwie na szklane, metalowe lub plastikowe podłoże (nośnik ) w chromatografii cienkowarstwowej . Warstwa adsorpcyjna na nośniku może być utrwalona lub nie.

Rozdział chromatograficzny w metodach planarnych, jak również na kolumnie, polega na przenoszeniu składników analitu przez fazę ruchomą wzdłuż warstwy fazy stacjonarnej z różną szybkością, zgodnie ze współczynnikami rozdziału rozdzielanych substancji . W obu przypadkach stosowane są układy chromatograficzne ciecz-ciało stałe (mechanizm separacji adsorpcyjnej), ciecz-ciecz-ciało stałe (dystrybucja, wymiana jonowa i inne mechanizmy).

Jako fazy ruchome stosuje się różne rozpuszczalniki lub ich mieszaniny, kwasy organiczne lub nieorganiczne.

Praktyczne uzyskiwanie chromatogramów planarnych polega na tym, co następuje.

Na pasku bibuły chromatograficznej lub na cienkiej warstwie sorbentu zaznacza się ołówkiem linię startową w odległości 1 cm od dolnej krawędzi paska lub płytki. Za pomocą mikropipety nanosi się próbkę na linię startową w postaci plamki o średnicy nie większej niż 2-3 mm. Następnie krawędź paska lub płytki jest opuszczana do naczynia z fazą ruchomą, znajdującego się w szczelnej komorze. Gdy faza ruchoma unosi się wzdłuż paska lub płytki i zachodzą liczne elementarne akty sorpcji-desorpcji, dystrybucji między dwiema fazami ciekłymi, wymiany jonowej itp., które są powszechne w chromatografii, następuje rozdzielenie składników analizowanej mieszaniny. Proces jest zwykle kontynuowany do momentu, gdy rozpuszczalnik minie linię startową 10 cm, po czym pasek lub płytka są wyjmowane z komory i suszone. Jeśli składniki analitu są zabarwione, dają odpowiednie kolorowe plamy na chromatogramie. Aby wykryć niezabarwione składniki analitu, należy opracować chromatogram. Opracowanie chromatogramu i detekcja składników próbki może odbywać się różnymi metodami i zależy od składu analizowanych mieszanin. Manifestację można wykonać:

-Korzystanie ze światła UV. Metoda ma zastosowanie do wykrywania substancji zdolnych do emitowania własnego promieniowania (luminescencji) w zakresie długości fal widzialnych pod wpływem promieniowania UV;

 za pomocą odczynników-wywoływaczy. Przykładowo obecność aminokwasów w analizowanej mieszaninie można wykryć za pomocą ninhydryny. Wysuszony chromatogram zanurza się w 0,2% roztworze ninhydryny w acetonie, a następnie suszy. Plamy odpowiadające różnym składnikom mieszaniny nabierają wizualnego iz reguły specyficznego koloru dla każdej substancji;

- za pomocą jodu. W tym przypadku wykryty chromatogram jest wprowadzany do naczynia, na dnie którego znajdują się kryształy jodu. Opary jodu są silniej adsorbowane na plamach, dzięki czemu plamy są uwidocznione. Jod jest niespecyficznym odczynnikiem wywołującym. Za pomocą określonych odczynników można nie tylko określić liczbę składników mieszaniny, ale także zidentyfikować rozdzielane substancje po kolorze plam.

Chromatografię bibułową i cienkowarstwową przeprowadza się najczęściej w opisanym powyżej tzw. wariancie wstępującym. Dość często, aby poprawić jakość chromatogramów, konieczne jest stosowanie bardziej złożonych wariantów chromatografii planarnej, np. top-down, kołowej, dwuwymiarowej. W chromatografii papierowej lub cienkowarstwowej w dół analit jest nakładany na linię początkową płytki lub paska papieru u góry, a eluent jest podawany z góry zamiast z dołu. Pozytywny efekt ulepszonej separacji wynika z wkładu sił grawitacyjnych składników w proces separacji.

Zarówno chromatografia upstream, jak i downstream może być przeprowadzona w wersji jedno- i dwuwymiarowej. W przeciwieństwie do opisanego powyżej jednowymiarowego procesu rozdzielania na płaskim złożu, w dwuwymiarowym rozdzielaniu chromatograficznym rozdział analizowanej próbki przeprowadza się najpierw w jednym rozpuszczalniku, następnie rozdziela się w kierunku prostopadłym do pierwszego, stosując inny rozpuszczalnik, obracając pierwszy chromatogram o 90°C.

W chromatografii kołowej analit jest nakładany w postaci kropli na środek płytki lub arkusza bibuły chromatograficznej. Tutaj również dodaje się kroplami jeden lub więcej rozpuszczalników. Prowadzi to do tego, że otrzymany chromatogram jest zbiorem promienistych plam.

Położenie plam (stref) tworzących rozdzielone składniki analitu na chromatogramie płaskim charakteryzuje się wartościami względnej prędkości ruchu składników w cienkiej warstwie R fi. Wartość eksperymentalna R fi zdefiniowany jako stosunek odległości Ł I, przeszedł I-ta składowa, do odległości Ł przepuszczany przez rozpuszczalnik od linii startu do linii frontu (ryc. 1.10):

Wartość R fi zależy od rodzaju danego składnika analizowanej próbki, rodzaju fazy stacjonarnej, jej grubości, rodzaju i jakości fazy ruchomej, sposobu aplikacji próbki i innych czynników, ale zawsze R fi 1.

Wartość R fi jest w rzeczywistości identyczny z czasem retencji substancji lub jej objętością retencji, która charakteryzuje szybkość przechodzenia substancji przez kolumnę chromatograficzną i może służyć do jakościowej identyfikacji składników analizowanej próbki, a średnica plamki jest identyczna do wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego, a zatem w pewnym stopniu odzwierciedla ilościową zawartość substancji.

Ilościowe oznaczenie składu analizowanej próbki w najprostszym przypadku można ocenić wizualnie na podstawie intensywności barwy wewnętrznej plam lub intensywności poświaty fluorescencyjnej powstałych plam podczas detekcji UV. Do tych celów szeroko stosuje się elucję plam chromatograficznych. W takim przypadku plamkę uzyskaną na chromatogramie ostrożnie wycina się lub zeskrobuje, traktuje odpowiednim rozpuszczalnikiem, a otrzymany roztwór bada się odpowiednią metodą fizykochemiczną. Można również skorzystać z metody grawimetrycznej, w której z chromatogramu wycina się i waży odpowiednią plamkę. Ilość substancji określa się na podstawie różnicy gramatury czystego papieru o tej samej powierzchni i papieru z substancją.

Papier (BH ) I chromatografia cienkowarstwowa (TLC ) zgodnie z mechanizmem separacji należą do chromatografia podziałowa . W metodzie HD nośnik jest szczególny papier chromatograficzny z pewnymi właściwościami. Faza stacjonarna jest wodą zaadsorbowaną na powierzchni i porach papieru (do 20%), mobilnym - rozpuszczalnikiem organicznym, mieszającym się lub niemieszalnym z wodą, roztworami wodnymi lub elektrolitycznymi.

Mechanizm dość skomplikowane na papierze. W fazie stacjonarnej substancja może być zatrzymywana nie tylko dzięki rozpuszczeniu w wodzie zaadsorbowanej przez papier, ale także zostać zaadsorbowanym bezpośrednio celuloza. Rysowane na papierze wspólne komponenty przechodzą w fazę ruchomą i poruszają się przez kapilary papieru z różnymi prędkościami zgodnie z współczynnik dystrybucji międzyfazowej każda z nich. Najpierw chromatografia część substancji z papieru przechodzi do faza mobilna i ruszaj dalej. Gdy rozpuszczalnik organiczny dotrze do obszaru papieru, który nie zawiera substancji rozpuszczonej, redystrybucja : z fazy organicznej substancja przechodzi do fazy wodnej, zaadsorbowanej na papierze. Ponieważ komponenty mają różne powinowactwo do sorbentu , gdy eluent się porusza, następuje separacja: niektóre substancje są opóźnione na początku ścieżki, inne poruszają się dalej. Tutaj są połączone termodynamiczny (ustanowienie równowagi rozkładu substancji między fazami) i kinetyczny (ruchome elementy z różnymi prędkościami) aspekty separacji. W rezultacie każdy składnik jest skoncentrowany na określonym obszarze arkusza papieru: strefy poszczególnych elementów NA chromatogram . Zastosowanie chromatografii na papierze ma szereg istotnych wad: proces rozdzielania zależy od składu i właściwości papieru, zmiana zawartości wody w porach papieru wraz ze zmianą warunków przechowywania, bardzo mała szybkość chromatografii ( do kilku dni) i małą powtarzalność wyników. Te niedociągnięcia poważnie wpływają na rozpowszechnienie chromatografii bibułowej jako metody chromatograficznej.

W metoda TLC proces rozdzielania mieszaniny substancji odbywa się w cienkiej warstwie sorbent osadzone na obojętnym stałym podłożu i dostarczane przez ruch faza mobilna (rozpuszczalnik) przez sorbent pod działaniem siły kapilarne . Przezmechanizm separacji wyróżnić chromatografia podziałowa, adsorpcyjna i jonowymienna . Rozdzielenie składników następuje w tych przypadkach albo w wyniku ich różnych współczynników podziału między dwiema fazami ciekłymi ( chromatografia podziałowa ), lub z powodu różnej adsorbowalności związków przez sorbent ( chromatografia adsorpcyjna ). Metoda adsorpcyjna opiera się na różnych stopniach sorpcji-desorpcji wydzielonych składników na fazie stacjonarnej. Adsorpcja wykonane na koszt siły van der Waalsa , co jest podstawą adsorpcja fizyczna , wielocząsteczkowy (tworzenie się kilku warstw adsorbatu na powierzchni adsorbentu) i chemisorpcja (oddziaływanie chemiczne adsorbentu i adsorbatu).

W przypadku stosowania takich sorbentów do TLC jak glinka Lub Żel krzemionkowy odgrywać rolę w separacji dystrybucja , I adsorpcja na rozwiniętej powierzchni czynnej sorbentu (150–750 m2/g). Dystrybucja składniki mieszaniny występują między wodą na powierzchni nośnika (np adsorbenty , Jak glinka , skrobia , celuloza , ziemia okrzemkowa - I woda formularz faza stacjonarna ) i rozpuszczalnik przemieszczający się przez tę fazę stacjonarną ( faza mobilna ). Składnik mieszaniny, który jest łatwiej rozpuszczalny w wodzie, porusza się wolniej niż ten, który jest łatwiej rozpuszczalny w fazie ruchomej.

Adsorpcja przejawia się w tym, że pomiędzy przewoźnik , na przykład tlenek glinu, a składniki mieszaniny są ustawione równowagi adsorpcji - dla każdego komponentu własny, którego wynikiem jest różna prędkość jazdy składniki mieszanki. Można wyróżnić dwa skrajne przypadki:

a) stężenie substancji na adsorbencie wynosi zero. Substancja całkowicie rozpuszcza się w fazie ruchomej i jest przez nią unoszona (porusza się wraz z front rozpuszczalnika ).

b) substancja jest całkowicie zaadsorbowana, nie wchodzi w interakcje z rozpuszczalnikiem i pozostaje na starcie.

W praktyce przy umiejętnym doborze rozpuszczalnika i adsorbentu dystrybucja związki znajdują się pomiędzy tymi skrajnymi przypadkami, a substancja stopniowo przeniósł ponad z jednej warstwy sorbentu na drugą w wyniku zachodzących jednocześnie procesów sorpcja I desorpcja .

Rozpuszczalnik przechodzący przez sorbent nazywa się eluent , proces przemieszczania substancji wraz z eluentem  elucja . Gdy ciecz porusza się po płycie, mieszanina substancji rozdziela się pod wpływem działania sił adsorpcja , dystrybucja , wymiana jonów lub kombinacja wszystkich tych czynników. W rezultacie oddziel strefy chromatograficzne składniki mieszanki tj. okazało się chromatogram .

Prawidłowy wybór sorbent I eluent określa skuteczność rozdziału mieszaniny. Mobilność badanej substancji zależy od jej powinowactwa do sorbentu i siła elucji (polarność) eluentu. Wraz ze wzrostem polarności związku rośnie jego powinowactwo do polarnego sorbentu. Zwiększając stopień adsorpcji Żel krzemionkowy związki organiczne są ułożone w rzędzie: węglowodory<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь na żel krzemionkowy eluenty można ułożyć w rosnącej kolejności „biegunowości” ( moc elucji ) i tworzą szereg rozpuszczalników ( szereg eluotropowy ) zgodnie z danymi eksperymentalnymi: alkany> benzen> chloroform> eter dietylowy> octan etylu> alkohole C 2 -C 4> woda> aceton> kwas octowy> metanol. Tak więc związek polarny, alkohol, jest dość silnie adsorbowany na żelu krzemionkowym i dlatego porusza się słabo pod działaniem takiego niepolarnego rozpuszczalnika jak heksan i pozostaje w pobliżu linii startu. Z kolei niepolarny węglowodór aromatyczny bifenyl jest zauważalnie bardziej mobilny w heksanie, ale nawet tutaj do osiągnięcia R F około 0,5 potrzebny jest bardziej polarny aprotonowy eluent, chlorek metylenu. siła eluentu regulować za pomocą mieszanin rozpuszczalników - sąsiadów szereg eluotropowy z różną polaryzacją.

Obecnie TLC wykorzystuje głównie następujące elementy sorbenty : do separacji substancje lipofilowe  Żel krzemionkowy , glinka , celuloza acetylowana , poliamidy ; oddzielić substancje hydrofilowe  celuloza , celulozowe wymieniacze jonowe , ziemia okrzemkowa , poliamidy . Najważniejszą cechą sorbentu jest jego działalność , tj. umiejętność absorbować (przytrzymać) składniki mieszaniny do rozdzielenia. Za granicą produkuje wiele firm Żel krzemionkowy , ziemia okrzemkowa I glinka z dodatkiem 5% gipsu, który służy do mocowania warstwy sorbentu przy samodzielnej produkcji płyt.

Najpopularniejszym sorbentem jest Żel krzemionkowy - uwodniony kwas krzemowy, powstały w wyniku działania kwasów mineralnych na Na 2 SiO 3 i suszenia powstałego zolu. Po zmieleniu zolu stosuje się frakcję o określonej wielkości ziarna (podana na tabliczce, zwykle 5-20 mikronów). Żel krzemionkowy Jest sorbent polarny z grupami OH jako miejscami aktywnymi. Łatwo sorbuje wodę na powierzchni i tworzy wiązania wodorowe.

Glinka jest słabo zasadowym adsorbentem i jest stosowany głównie do separacji związków słabo zasadowych i obojętnych. Wadą płytek na tlenku glinu jest obowiązkowa aktywacja powierzchni przed użyciem w suszarce w wysokiej temperaturze (100-150 o C) oraz mała zdolność adsorpcyjna warstwy w porównaniu z żelem krzemionkowym.

ziemia okrzemkowa - adsorbent pozyskiwany z naturalnych minerałów - ziemi okrzemkowej. Sorbent ma właściwości hydrofilowe i mniejszą zdolność adsorpcyjną warstwy w porównaniu z żelem krzemionkowym.

Celuloza: płytki cienkowarstwowe powlekane celulozą są bardzo skuteczne w oddzielaniu złożonych cząsteczek organicznych. Adsorbentem są głównie kulki celulozowe o średnicy do 50 mikronów, utrwalone na nośniku za pomocą skrobi. Podobnie jak w przypadku chromatografii bibułowej, wzrost czoła rozpuszczalnika jest bardzo powolny.

Analiza chromatograficzna odbywa się na płytach przemysłowych produkcji czeskiej” Silufol » (« Silufol „”) z folii aluminiowej, czasem wzmocnionej tekturą, oraz „ Siluplast » wykonane z tworzywa sztucznego pokrytego warstwą sorbentów - silikażelu LS 5-40 ze spoiwem skrobiowym lub gipsowym (do 10%) lub tlenku glinu ze wskaźnikami fluorescencyjnymi lub bez. Rekordy " Silufol » charakteryzują się dużą szybkością elucji, jednak charakteryzują się niską mocą separacji i niską czułością. Podczas przechowywania są wrażliwe na warunki (wilgoć, temperatura, agresywne media itp.). Zaopatrzenie firm indywidualnych płytki chromatograficzne z warstwą sorbentu o różnej (zwykle do 0,25 mm), ale ściśle stałej grubości (żel krzemionkowy, celuloza, żywica jonowymienna), na szkle i podłożach wykonanych z folii aluminiowej, tworzyw sztucznych, impregnowanego włókna szklanego.

Talerze " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) produkowane są w Rosji na bazie polimeru (politereftalan etylenu klasa P) lub aluminium (gatunek AF) z naniesioną warstwą roboczą sorbent mikrofrakcjonowanego żelu krzemionkowego gatunki STX-1A i STX-1VE (produkowane w ZSRR jako frakcjonowany żel krzemionkowy KSKG) o grubości 90-120 mikronów (do 200 mikronów), mocowane specjalnym spoiwem - silikasol . W przypadku zastosowania zolu kwasu krzemowego (silikazolu) jako spoiwa, który po podgrzaniu przekształca się w żel krzemionkowy, otrzymane płytki TLC składają się z dwóch składników: warstwy żelu krzemionkowego i podłoża. Jednorodność grubości warstwy sorbentu na jednej płytce wynosi ±5 µm. Przykład oznaczenia: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UF (10x10)" - wysokowydajne płytki TLC na podłożu aluminiowym, z luminoforem, 10x10 cm.

W przypadku zastosowania podłoża szklanego (klasa C) takie płytki są wielokrotnego użytku i odporne chemicznie. Ich odporność chemiczna jest określona przez odporność chemiczną żelu krzemionkowego. Dzięki temu płytki TLC można wielokrotnie poddawać działaniu agresywnych odczynników, np. gorącej mieszaniny chromu, co znosi ograniczenia w stosowaniu korelujących odczynników do wykrywania plam i modyfikacji sorbentu oraz umożliwia wielokrotne (do 30 i więcej razy) regeneracja płytek mieszanką chromu. Talerze szklane można przyciąć do żądanego rozmiaru. Można kontrolować wytrzymałość mechaniczną warstwy sorbentu, zapewniając z jednej strony transport i wielokrotną obróbkę płytek, a z drugiej strony możliwość ekstrakcji warstw adsorbentu z wydzielonymi substancjami w celu późniejszego wypłukania poszczególnych związków z sorbentu i ich dalsze badanie metodami instrumentalnymi (spektrometria IR i UV). , metody dyfrakcji rentgenowskiej, NMR itp.).

Płytki różnią się wielkością frakcji (rozkładem cząstek) żelu krzemionkowego tworzącego warstwę. Na płytkach analitycznych (klasa A) frakcja wynosi 5-17 mikronów, na wysoce wydajnych (klasa B) - 8-12 mikronów. Węższy rozkład zwiększa wydajność płytek, tj. plamy rozdzielanych substancji stają się bardziej zwarte (mniejsze) i dlatego są lepiej rozdzielane, gdy czoło eluentu przechodzi krótszą odległość. Na rosyjskich waflach warstwy analityczne i wysokowydajne nie różnią się zbytnio, w przeciwieństwie do wafli firmy Merck (Niemcy). Płytki o wysokiej wydajności powinny być używane, jeśli substancji nie można rozdzielić na płytkach analitycznych. Płytki we wszystkich modyfikacjach są produkowane z luminoforem (stopień UV) ze wzbudzeniem 254 nm. Okres przydatności do spożycia nie jest ograniczony, płyty " Sorbfil » szeroko przetestowany w analizie pochodnych aminokwasów, pestycydów, lipidów, antybiotyków.

Przeprowadza się metodę TLC identyfikacja jakościowa składniki. ilościowe dla TLC jest również możliwe, wymaga to nałożenia dokładnej ilości substancji i dodatku badania densytometryczne z wyraźnym utrwaleniem intensywności plam. Najczęstsze jest metoda półilościowa . Opiera się na porównanie wizualne wielkość i intensywność plamki składnika o odpowiednich właściwościach serii plamek tej samej substancji o różnych stężeniach ( wzorcowe roztwory wzorcowe ). Przy użyciu próbki w ilości 1–5 μg taka prosta metoda zapewnia dokładność oznaczenia zawartości składnika na poziomie około 5–10%. Często w celu oznaczenia składników w próbce konieczne jest przeprowadzenie przygotowania próbki w celu uzyskania mieszaniny zawierającej analizowane związki. Przygotowanie próbki polega na ekstrakcji leków z próbki rozpuszczalnikami organicznymi ( N-heksan, eter naftowy, eter dietylowy, chloroform), oczyszczanie ekstraktu, a następnie chromatografia na cienkiej warstwie tlenku glinu lub żelu krzemionkowego.

Istnieje kilka wariantów TLC i BC, różniących się sposobem dostawa rozpuszczalnika . W zależności od kierunku ruchu fazy ruchomej wyróżnia się:

A)chromatografia rosnąca  fazę ruchomą wylewa się na dno komory separacyjnej, papier (płytkę) ustawia pionowo;

B)chromatografia zstępująca  faza ruchoma jest podawana od góry i przemieszcza się w dół wzdłuż warstwy sorbentu płytki lub bibuły;

V)chromatografia radialna  poziome przesuwanie czoła rozpuszczalnika: faza ruchoma jest doprowadzana do środka krążka papierowego (płytki), gdzie osadza się rozdzielana mieszanina.

Najczęstsze jest elucja w górę (chromatografia). Przód eluent podczas ruchu od dołu do góry. Wybór rozpuszczalnika (fazy ruchomej) zależy od rodzaju sorbentu i właściwości rozdzielanych substancji.

Separacja chromatograficzna Metody BC i TLC są przeprowadzane w komora separacyjna z zakręcaną pokrywą. Ilościową miarą szybkości przenoszenia substancji przy użyciu określonego adsorbentu i rozpuszczalnika jest wartość R F (z angielskiego. zatrzymanie czynnik – współczynnik opóźnienia, parametr ten jest analogiczny do czasu retencji). Pozycja strefy chromatografowanego składnika ustawić na rozmiar współczynnik R F równy stosunkowi prędkości jego strefy do prędkości czoła rozpuszczalnika. Wartość R F jest zawsze mniejsza od jedności i nie zależy od długości chromatogramu. Według kwoty R F pod wpływem różnych czynników. Tak więc w niskich temperaturach substancje poruszają się wolniej; zanieczyszczenie rozpuszczalnikami, niejednorodność adsorbentu, obce jony w analizowanym roztworze mogą zmienić wartość R F do 10%. W wybranym układzie anality muszą mieć różne wartości R F i rozłożone na całej długości chromatogramu. Pożądane jest, aby wartości R F mieścić się w przedziale 0,05-0,85.

W praktyce wartość R F obliczany jako stosunek odległości l przebytą przez substancję na odległość Ł przepuszczany przez rozpuszczalnik:

R F = ll (6.1 )

Zwykle do obliczeń wybierz centrum punktowe (Rys. 1). Wartość R F zależy od wielu czynników np papier chromatograficzny (jego porowatość, gęstość, grubość, stopień uwodnienia) oraz sorbent (wielkość ziarna, charakter grup na powierzchni, grubość warstwy, jej wilgotność, rodzaj substancji, skład fazy ruchomej), warunki eksperymentu (temperatura, czas chromatografii itp.). Przy stałości wszystkich parametrów chromatografii wartość R F określone tylko przez indywidualne właściwości każdego składnika.

Ryż. 1. Oznaczanie wartości na chromatogramie RF dla komponentów A I W,

ich stopień separacji Rs oraz liczbę półek teoretycznych N .

Wydajność BC i TLC zależy również od selektywność i czułość reakcje stosowane do wykrywania składników analizowanej mieszaniny. Zwykle stosuje się odczynniki, które tworzą barwne związki z oznaczanymi składnikami – wywoływaczami. Dla bardziej niezawodnego identyfikacja wspólnych komponentów stosować " świadkowie " -rozwiązania standardowe substancje (w tym samym rozpuszczalniku co próbka), które prawdopodobnie będą obecne w próbce. Substancja standardowa nanosi się na linię startową obok analizowanej próbki i poddaje chromatografii w tych samych warunkach. W praktyce często stosuje się wartość względną:

R F rel = R F X / R F podstawka (6.2)

Gdzie R F podstawka również obliczone według wzoru (6.1). Efektywność rozdział chromatograficzny charakteryzować liczba równoważnych półek teoretycznych i oni wysoki . Zatem w metodzie TLC liczba równoważnych półek teoretycznych N A dla komponentu A mieszaninę do rozdzielenia oblicza się według wzoru:

N A = 16 (l OO / A (A )) 2 (6.3)

Wartości l OO I A (A ) ustalona jak na rys. 6.1. Następnie wysokość równoważnej półki teoretycznej H A Jest:

H A = l OO /N = A (A ) 2 / 16 l OO . (6.4)

Separacja jest praktycznie możliwa, jeśli R F (A)  R F (W)  0,1 .

Aby scharakteryzować separację dwóch składników A I W używać stopień (kryterium) podziału Rs :

Rs =  ja / (A (A) / 2 + A (B) / 2)= 2  ja / (A (A) + A (B)) (6.5)

Gdzie  l  odległość między środkami punktów składowych A I W;

A (A) I A (W)  średnice plamek A I W na chromatogramie (ryc. 6.1). Więcej Rs , tym wyraźniej rozdzielają się plamy składników A I W na chromatogramie. Warunki chromatografia są tak dobrane, że wartość Rs różna od zera i jeden, wartość optymalna Rs wynosi 0,3  0,7. Dla stawki selektywność separacji dwa komponenty A I W używać współczynnik separacji α :

α = l B / l A (6.6)

Jeśli α = 1, to składowe A I W nie są rozdzielone.

(głównie międzycząsteczkowe) na granicy faz. Jako metoda analityczna HPLC należy do grupy metod, która ze względu na złożoność badanych obiektów obejmuje wstępne rozdzielenie początkowej złożonej mieszaniny na stosunkowo proste. Otrzymane proste mieszaniny są następnie analizowane konwencjonalnymi metodami fizykochemicznymi lub specjalnymi metodami opracowanymi dla chromatografii.

Metoda HPLC ma szerokie zastosowanie w takich dziedzinach jak chemia, petrochemia, biologia, biotechnologia, medycyna, przetwórstwo spożywcze, ochrona środowiska, produkcja leków i wielu innych.

Zgodnie z mechanizmem rozdziału analizowanych lub rozdzielonych substancji, HPLC dzieli się na adsorpcję, dystrybucję, wymianę jonową, wykluczanie, wymianę ligandów i inne.

Należy pamiętać, że w pracy praktycznej separacja często przebiega nie przez jeden, ale przez kilka mechanizmów jednocześnie. Tak więc separacja wykluczeń może być skomplikowana przez efekty adsorpcji, adsorpcji - dystrybucji i odwrotnie. Jednocześnie im większa różnica między substancjami w próbce pod względem stopnia jonizacji, zasadowości lub kwasowości, pod względem masy cząsteczkowej, polaryzowalności i innych parametrów, tym bardziej prawdopodobne jest, że pojawi się inny mechanizm separacji dla takich substancji.

HPLC w normalnej fazie

Faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma, dlatego w składzie eluentu dominuje rozpuszczalnik niepolarny:

• Heksan:izopropanol = 95:5 (dla substancji o niskiej polarności)
• Chloroform:metanol = 95:5 (dla substancji średnio polarnych)
• Chloroform:metanol = 80:20 (dla substancji silnie polarnych)

HPLC z odwróconą fazą

Faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, więc woda jest prawie zawsze obecna w eluencie. W takim przypadku zawsze można zapewnić całkowite rozpuszczenie BAS w fazie ruchomej, prawie zawsze można zastosować detekcję UV, prawie wszystkie fazy ruchome są wzajemnie mieszalne, można zastosować elucję gradientową, kolumnę można szybko zregenerować -zrównoważony, kolumnę można zregenerować.

Typowe eluenty do HPLC z odwróconą fazą to:

• Acetonitryl: woda
• metanol: woda
• Izopropanol: woda

Matryce do HPLC

Matryce stosowane w HPLC to związki nieorganiczne, takie jak krzemionka (żel krzemionkowy) lub tlenek glinu, lub polimery organiczne, takie jak polistyren (usieciowany diwinylobenzenem) lub polimetakrylan. Żel krzemionkowy jest oczywiście obecnie powszechnie akceptowany.

Główne cechy matrycy:

• Wielkość cząstek (µm);
• Wielkość porów wewnętrznych (Å, nm).

Otrzymywanie żelu krzemionkowego do HPLC:

1. Tworzenie mikrosfer kwasu polikrzemowego;
2. Suszenie cząstek żelu krzemionkowego;
3. Separacja powietrza.

Cząsteczki sorbentu:

• Regularny (kulisty): wyższa odporność na ciśnienie, wyższy koszt;
• Niesferyczne: mniejsza odporność na ciśnienie.

Wielkość porów w HPLC jest jednym z najważniejszych parametrów. Im mniejszy rozmiar porów, tym gorsza ich przepuszczalność dla cząsteczek eluowanych substancji. A co za tym idzie, im gorsza pojemność sorpcyjna sorbentów. Im większe pory, tym mniejsza, po pierwsze, stabilność mechaniczna cząstek sorbentu, a po drugie, mniejsza powierzchnia sorpcyjna, a co za tym idzie, gorsza efektywność.

Przeszczepy fazy stacjonarnej

HPLC w fazie normalnej:

• Faza stacjonarna szczepiona propylonitrylem (nitrylem);
• Faza stacjonarna ze szczepieniem propyloaminą (amina).

HPLC z odwróconą fazą:

• Faza stacjonarna z przeszczepem alkilowym;
• Faza stacjonarna z przeszczepem alkilosililu.

End-capping - zabezpieczenie nieszczepionych obszarów sorbentu poprzez dodatkowe szczepienie „małymi” cząsteczkami. Hydrofobowe end-capping (C1, C2): wyższa selektywność, gorsza zwilżalność; hydrofilowe end-capping (diol): niższa selektywność, wyższa zwilżalność.

Detektory HPLC

• UV
• Tablica diod
• Fluorescencyjny
• Elektrochemiczny
• refraktometryczny
• selektywny masowo

Spinki do mankietów

Fundacja Wikimedia. 2010 .

• Chromatografia
• Chromatografia podziałowa

Zobacz, co „” znajduje się w innych słownikach:

wysokosprawna chromatografia cieczowa- - [AS Goldberg. Angielsko-rosyjski słownik energetyczny. 2006] Tematy ogólne energia EN wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC … Podręcznik tłumacza technicznego

wysokosprawna chromatografia cieczowa- Termin wysokosprawna chromatografia cieczowa Termin angielski wysokosprawna chromatografia cieczowa Synonimy Skróty HPLC, HPLC Powiązane terminy adsorpcja, oligopeptyd, proteomika, sorbent, fulleren, endohedral, chromatografia… …

WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA- chromatografia cieczowa, w celu zwiększenia skuteczności rozdziału rozpuszczalnik (eluent) pod ciśnieniem (powyżej 3x107 Pa) pompowany jest przez kolumny wypełnione sorbentem o cząstkach o małej średnicy (do 1 mikrona) i perfuzja. ...

CHROMATOGRAFIA CIECZOWA- rodzaj chromatografii, w której ciecz (eluent) służy jako faza ruchoma, a jest to faza stacjonarna. sorbent, telewizor. nośnik z płynem lub żelem nałożonym na jego powierzchnię. Przeprowadza się w kolumnie wypełnionej sorbentem (chromatografia kolumnowa), na płaskiej ... ... Naturalna nauka. słownik encyklopedyczny

Chromatografia- [κρώμα (υroma) color] proces polegający na nierównej zdolności poszczególnych składników mieszaniny (ciekłej lub gazowej) do zatrzymywania się na powierzchni adsorbentu zarówno w przypadku ich absorpcji ze strumienia nośnika, jak i w przypadku.. ... Encyklopedia geologiczna

Chromatografia- (z innych greckich ... Wikipedia

chromatografia- Termin chromatografia Angielski termin chromatografia Synonimy Skróty Pojęcia powiązane wysokosprawna chromatografia cieczowa, klatrat, laboratorium na chipie, porozymetria, proteom, proteomika, sorbent, enzym, fulleren, endohedral… … Słownik encyklopedyczny nanotechnologii

CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA- chromatografia cieczowa oparta na rozkładzie. zdolność rozdzielonych jonów do wymiany jonowej z utrwaloną. jony sorbentu powstające w wyniku dysocjacji grup jonogennych tego ostatniego. Wymieniacze kationowe służą do separacji kationów, do ... ... Encyklopedia chemiczna

HPLC- wysokosprawna chromatografia cieczowa ... Słownik skrótów języka rosyjskiego

HPLC- Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest jedną ze skutecznych metod rozdzielania złożonych mieszanin substancji, która jest szeroko stosowana zarówno w chemii analitycznej, jak iw technologii chemicznej. Podstawą rozdziału chromatograficznego jest udział… Wikipedia

Książki

• Praktyczna wysokosprawna chromatografia cieczowa, Veronica R. Mayer. Oddajemy w ręce Czytelnika piąte wydanie książki, które zostało wzbogacone o nowoczesne metody i sprzęt. W książce wiele zostało poprawione i dodano dużą liczbę odniesień. Miejsca w tekście, w których...

W wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) charakter procesów zachodzących w kolumnie chromatograficznej jest zasadniczo identyczny z procesami w chromatografii gazowej. Różnica polega tylko na zastosowaniu cieczy jako fazy stacjonarnej. Ze względu na dużą gęstość ciekłych faz ruchomych i wysoką rezystancję kolumn, chromatografia gazowa i cieczowa znacznie różnią się oprzyrządowaniem.

W HPLC jako fazy ruchome stosuje się zwykle czyste rozpuszczalniki lub ich mieszaniny.

Do wytworzenia strumienia czystego rozpuszczalnika (lub mieszanin rozpuszczalników), zwanego eluentem w chromatografii cieczowej, stosuje się pompy, które są częścią układu hydraulicznego chromatografu.

Chromatografia adsorpcyjna jest przeprowadzana w wyniku oddziaływania substancji z adsorbentami, takimi jak żel krzemionkowy lub tlenek glinu, które posiadają centra aktywne na powierzchni. Różnica w zdolności do oddziaływania z centrami adsorpcji różnych cząsteczek próbki prowadzi do ich rozdzielania na strefy w procesie przemieszczania się z fazą ruchomą przez kolumnę. Uzyskany w tym przypadku podział stref składowych zależy od interakcji zarówno z rozpuszczalnikiem, jak i adsorbentem.

Adsorbenty z żelu krzemionkowego o różnych objętościach, powierzchniach i średnicach porów znajdują największe zastosowanie w HPLC. Znacznie rzadziej stosuje się tlenek glinu i inne adsorbenty. Główny powód tego:

Niewystarczająca wytrzymałość mechaniczna, która nie pozwala na pakowanie i stosowanie przy podwyższonych ciśnieniach typowych dla HPLC;

żel krzemionkowy w porównaniu z tlenkiem glinu ma szerszy zakres porowatości, powierzchni i średnicy porów; znacznie wyższa aktywność katalityczna tlenku glinu prowadzi do zniekształcenia wyników analizy na skutek rozkładu składników próbki lub ich nieodwracalnej chemisorpcji.

Detektory HPLC

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) służy do wykrywania polarnych substancji nielotnych, których z jakiegoś powodu nie można przekształcić w postać dogodną dla chromatografii gazowej, nawet w postaci pochodnych. Takie substancje obejmują w szczególności kwasy sulfonowe, rozpuszczalne w wodzie barwniki i niektóre pestycydy, takie jak pochodne fenylomocznika.

Detektory:

UV - detektor z matrycą diodową. „Matryca” fotodiod (jest ich ponad dwieście) stale rejestruje sygnały w zakresie UV i widzialnym widma, zapewniając tym samym rejestrację widm UV-B w trybie skanowania. Umożliwia to ciągłą rejestrację z wysoką czułością niezniekształconych widm składników szybko przechodzących przez specjalną celę.

W porównaniu z detekcją jednofalową, która nie dostarcza informacji o „czystości” piku, możliwość porównania pełnego widma matrycy diodowej zapewnia wynik identyfikacji ze znacznie większym stopniem pewności.

Detektor fluorescencyjny. Duża popularność detektorów fluorescencyjnych wynika z bardzo wysokiej selektywności i czułości oraz faktu, że wiele zanieczyszczeń środowiska fluoryzuje (np. węglowodory poliaromatyczne).

Detektor elektrochemiczny służy do wykrywania substancji łatwo utleniających się lub redukujących: fenole, merkaptany, aminy, nitro aromatyczne i halogenopochodne, aldehydy, ketony, benzydyny.

Chromatograficzne rozdzielanie mieszaniny na kolumnie ze względu na powolny postęp PF zajmuje dużo czasu. Aby przyspieszyć proces, chromatografię przeprowadza się pod ciśnieniem. Ta metoda nazywana jest wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC).

Modernizacja aparatury stosowanej w klasycznej cieczowej chromatografii kolumnowej uczyniła ją jedną z obiecujących i nowoczesnych metod analitycznych. Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest wygodną metodą rozdzielania, preparatywnego izolowania oraz analizy jakościowej i ilościowej nielotnych związków termolabilnych zarówno o małej, jak i dużej masie cząsteczkowej.

W zależności od rodzaju sorbentu stosowanego w tej metodzie stosuje się 2 warianty chromatografii: na sorbencie polarnym z eluentem niepolarnym (opcja direct phase) oraz na sorbencie niepolarnym z eluentem polarnym – tzw. -fazowa wysokosprawna chromatografia cieczowa (RPHLC).

Gdy eluent przechodzi do eluentu, równowaga w warunkach RPHLC ustala się wielokrotnie szybciej niż w warunkach polarnych sorbentów i niewodnych PF. Dzięki temu, a także wygodzie pracy z eluentami wodnymi i wodno-alkoholowymi, RPHLC zyskało obecnie dużą popularność. Większość analiz HPLC przeprowadza się przy użyciu tej metody.

Detektory. Rejestracja wyjścia z kolumny oddzielnego składnika odbywa się za pomocą detektora. Do rejestracji można wykorzystać zmianę dowolnego sygnału analitycznego pochodzącego z fazy ruchomej i związanego z charakterem i ilością składnika mieszaniny. Chromatografia cieczowa wykorzystuje takie sygnały analityczne, jak absorpcja lub emisja światła wychodzącego roztworu (detektory fotometryczne i fluorymetryczne), współczynnik załamania światła (detektory refraktometryczne), potencjał i przewodnictwo elektryczne (detektory elektrochemiczne) itp.

Wykrywany w sposób ciągły sygnał jest rejestrowany przez rejestrator. Chromatogram to sekwencja sygnałów detektora zarejestrowanych na taśmie rejestratora, generowanych w momencie opuszczania kolumny przez poszczególne składniki mieszaniny. W przypadku rozdzielenia mieszaniny na chromatogramie zewnętrznym widoczne są pojedyncze piki. Położenie piku na chromatogramie służy do identyfikacji substancji, wysokość lub powierzchnia piku - do oznaczania ilościowego.

Aplikacja

HPLC znajduje najszersze zastosowanie w następujących obszarach analizy chemicznej (wyróżniono obiekty analiz, w których HPLC praktycznie nie ma konkurencji):

· Kontrola jakości żywności - dodatki tonizujące i smakowe, aldehydy, ketony, witaminy, cukry, barwniki, konserwanty, hormony, antybiotyki, triazyny, karbaminiany i inne pestycydy, mikotoksyny, nitrozoaminy, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne itp.

· Ochrona środowiska - fenole, nitrozwiązki organiczne, mono- i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, szereg pestycydów, główne aniony i kationy.

· Kryminalistyka - narkotyki, organiczne materiały wybuchowe i barwniki, silne farmaceutyki.

· Przemysł farmaceutyczny - hormony steroidowe, praktycznie wszystkie produkty syntezy organicznej, antybiotyki, preparaty polimerowe, witaminy, preparaty białkowe.

Medycyna - wymienione substancje biochemiczne i lecznicze oraz ich metabolity w płynach biologicznych (aminokwasy, puryny i pirymidyny, hormony steroidowe, lipidy) w diagnostyce chorób, określaniu szybkości wydalania leków z organizmu w celu ich indywidualnego dawkowania .

· Rolnictwo - oznaczanie azotanów i fosforanów w glebach w celu określenia wymaganej ilości nawozów, oznaczanie wartości odżywczej pasz (aminokwasy i witaminy), analiza pestycydów w glebie, wodzie i produktach rolniczych.

Biochemia, chemia bioorganiczna, inżynieria genetyczna, biotechnologia - cukry, lipidy, steroidy, białka, aminokwasy, nukleozydy i ich pochodne, witaminy, peptydy, oligonukleotydy, porfiryny itp.

· Chemia organiczna - wszystkie trwałe produkty syntezy organicznej, barwniki, związki termolabilne, związki nielotne; chemia nieorganiczna (praktycznie wszystkie rozpuszczalne związki w postaci jonów i związków kompleksowych).

· Kontrola jakości i bezpieczeństwa produktów spożywczych, napojów alkoholowych i bezalkoholowych, wody pitnej, chemii gospodarczej, perfum na wszystkich etapach ich produkcji;

określenie charakteru zanieczyszczenia w miejscu katastrofy spowodowanej przez człowieka lub sytuacji nadzwyczajnej;

wykrywanie i analiza substancji odurzających, silnie działających, trujących i wybuchowych;

oznaczanie obecności substancji szkodliwych (wielopierścieniowe i inne węglowodory aromatyczne, fenole, pestycydy, barwniki organiczne, jony metali ciężkich, alkalicznych i ziem alkalicznych) w ściekach płynnych, emisjach do powietrza i odpadach stałych z przedsiębiorstw oraz w organizmach żywych;

· monitorowanie procesów syntezy organicznej, przeróbki ropy naftowej i węgla, produkcji biochemicznej i mikrobiologicznej;

analiza jakości gleby do nawożenia, obecności pestycydów i herbicydów w glebie, wodzie i produktach oraz wartości odżywczej pasz; złożone zadania badawcze i analityczne; uzyskanie mikro ilości ultraczystej substancji.



Chromatografia cieczowa

Chromatografia cieczowa jest rodzajem chromatografii, w której faza mobilna, zwany eluentem, wynosi płyn. Faza stacjonarna Może sorbent stały, stały nośnik z płynem osadzonym na jego powierzchni Lub żel.

Wyróżnić kolumnowy I cienka warstwa chromatografia cieczowa. W wersji kolumnowej porcja rozdzielanej mieszaniny substancji przepuszczana jest przez kolumnę wypełnioną fazą stacjonarną w przepływie eluentu poruszającego się pod ciśnieniem lub pod wpływem grawitacji. W chromatografii cienkowarstwowej eluent porusza się pod działaniem sił kapilarnych wzdłuż płaskiej warstwy sorbentu osadzonego na płytce szklanej lub folii metalowej, wzdłuż porowatej błony polimerowej lub wzdłuż paska specjalnego papieru chromatograficznego. Opracowano również metodę cienkowarstwowej chromatografii cieczowej pod ciśnieniem, w której eluent jest pompowany przez warstwę sorbentu umieszczoną pomiędzy płytkami.

Istnieje kilka rodzajów chromatografii cieczowej, np analityczny(do analizy mieszanin substancji) i przygotowawczy(w celu wyizolowania czystych składników).

Wyróżnić chromatografia cieczowa (LC) w wersji klasycznej, przeprowadzonej o godz ciśnienie atmosferyczne, I wysoka prędkość) prowadzone o godz wysokie ciśnienie krwi. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) wykorzystuje kolumny o średnicy do 5 mm, gęsto upakowane sorbentem o małych cząstkach (3-10 µm). Do pompowania eluentu przez kolumnę stosuje się ciśnienie do 3,107 Pa. Ten rodzaj chromatografii nazywa się chromatografia wysokociśnieniowa. Przepuszczenie eluentu przez kolumnę pod wysokim ciśnieniem umożliwia znaczne zwiększenie szybkości analizy i znaczne zwiększenie wydajności separacji dzięki zastosowaniu drobno zdyspergowanego sorbentu.

Opcje HPLC Czy chromatografia mikrokolumnowa na kolumnach o małej średnicy wypełnionych sorbentem i chromatografia kapilarna na pustych i wypełnionych sorbentem kolumnach kapilarnych. Metoda HPLC umożliwia obecnie izolowanie, analizę ilościową i jakościową złożonych mieszanin związków organicznych.

Chromatografia cieczowa jest najważniejszą fizyko-chemiczną metodą badawczą w chemii, biologii, biochemii, medycynie i biotechnologii. To jest używane do:

badanie procesów metabolicznych leków w organizmach żywych;

diagnostyka w medycynie;

· analiza produktów syntez chemicznych i petrochemicznych, półproduktów, barwników, paliw, smarów, olejów, ścieków;

· badanie izoterm sorpcji z roztworu, kinetyki i selektywności procesów chemicznych;

wybór

analiza i separacja mieszanin, ich oczyszczanie i izolacja wielu substancji biologicznych, takich jak aminokwasy, białka, enzymy, wirusy, kwasy nukleinowe, węglowodany, lipidy, hormony.

W chemii związków wielkocząsteczkowych oraz w produkcji polimerów chromatografię cieczową wykorzystuje się do analizy jakości monomerów, badania rozkładu masy cząsteczkowej oraz rozkładu według rodzaju funkcyjności oligomerów i polimerów, co jest niezbędne do kontroli produktu.

Chromatografia cieczowa znajduje również zastosowanie w przemyśle perfumeryjnym, spożywczym, do analizy zanieczyszczeń środowiska oraz w kryminalistyce.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) została opracowana i wprowadzona w połowie lat siedemdziesiątych. Wtedy pojawiły się pierwsze chromatografy cieczowe.

Chromatografia cieczowa jest optymalną metodą analizy chemicznie i termicznie nietrwałych cząsteczek, substancji wielkocząsteczkowych o obniżonej lotności. Można to wytłumaczyć szczególną rolą fazy ruchomej w LC, w przeciwieństwie do chromatografii gazowej: eluent pełni nie tylko funkcję transportową.

2. Podstawowe pojęcia i klasyfikacja metod chromatografii cieczowej.

Przez mechanizm retencji wydzielonych substancji przez fazę stacjonarną LC wyróżnić:

chromatografia osadowa, na podstawie różnej rozpuszczalności osadów, które powstają podczas interakcji składników analizowanej mieszaniny z precypitantem. Zaletą tej metody jest to, że powstałe strefy wzdłuż sorbentu mają ostre granice, zawierają osady tylko jednej substancji i często są oddzielone strefami czystego sorbentu. Jednak ta metoda nie znalazła jeszcze szerokiej dystrybucji.

· chromatografia adsorpcyjna , w którym rozdzielanie przeprowadza się w wyniku oddziaływania wydzielonej substancji z adsorbent jak tlenek glinu lub żel krzemionkowy, mając na powierzchni aktywne ośrodki polarne. Rozpuszczalnik(eluent) - ciecz niepolarna.

Ryż. Schemat rozdziału mieszaniny substancji metodą chromatografii adsorpcyjnej

http://www. xumuk. en/biologhim/bio/img014.jpg

Mechanizm sorpcji polega na specyficznym oddziaływaniu między polarną powierzchnią sorbentu a polarnymi (lub zdolnymi do polaryzacji) obszarami cząsteczek analizowanego składnika (rys.). Interakcja zachodzi w wyniku interakcji donor-akceptor lub tworzenia wiązań wodorowych.

Ryż. Schemat adsorpcyjnej chromatografii cieczowej

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Ryż. . Chromatografia podziałowa z fazą związaną (wariant fazy normalnej).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezpract-chr. HTML

Na normalna faza W wariancie rozdzielającej chromatografii cieczowej jako modyfikatory powierzchni żelu krzemionkowego (fazy związane) stosuje się podstawione alkilochlorosilany zawierające grupy polarne, takie jak nitryl, amino, itp. (Rys.). Zastosowanie faz związanych umożliwia precyzyjną kontrolę właściwości sorpcyjnych powierzchni fazy stacjonarnej i uzyskanie wysokiej skuteczności separacji.

odwrócona faza chromatografia cieczowa opiera się na rozkładzie składników mieszaniny między polarnym eluentem a niepolarnymi grupami (długimi łańcuchami alkilowymi) szczepionymi na powierzchni sorbentu (rys.). Rzadziej stosowany jest wariant chromatografii cieczowej z fazą na nośniku, w której ciekła faza stacjonarna jest nakładana na nieruchomy nośnik.

Ryż. . Chromatografia podziałowa z fazą związaną (wersja z odwróconą fazą). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezpract-chr. HTML

Chromatografia cieczowa z podziałem obejmuje płyn ekstrakcyjny chromatografia, w której fazą stacjonarną jest ekstrahent organiczny osadzony na stałym nośniku, a fazą ruchomą wodny roztwór rozdzielanych związków. Odpowiednimi ekstrahentami są np. fenole, fosforany trialkilu, aminy, czwartorzędowe zasady amoniowe i związki fosforoorganiczne zawierające siarkę. Ekstrakcyjna chromatografia cieczowa służy do oddzielania i zatężania związków nieorganicznych, takich jak jony metali alkalicznych, aktynowce i inne podobne pierwiastki w przetwarzaniu wypalonego paliwa jądrowego.

chromatografia jonowymienna, który opiera się na odwracalnej stechiometrycznej wymianie jonów zawartych w analizowanym roztworze na jony ruchome wchodzące w skład wymieniacze jonowe. W zależności od znaku ładunku grup jonizujących wymieniacze jonowe dzielą się na wymieniacze kationowe I wymieniacze anionowe. Istnieje również amfoteryczne wymieniacze jonowe –amfolity, które mogą jednocześnie wymieniać zarówno kationy, jak i aniony. Chromatografię jonowymienną stosuje się wyłącznie do rozdzielania cząstek naładowanych. Separacja opiera się na zdolności żywicy jonowymiennej do zatrzymywania różnych jonów o różnej sile. jonit składa się z matrycy polimerowej i związanych z nią grup aktywnych, które są zdolne do wymiany jonów. wymieniacz kationowy posiada właściwości kwaśne lub słabo kwaśne, gdyż obejmuje grupy: - SO3H, -CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 i inne, w których ruchome są jony wodoru. wymieniacze anionowe mają właściwości zasadowe lub słabo zasadowe i zawierają grupy: = NH2, - NH2, -NR3 +, -OH i inne. Separacja jonów jest kontrolowana poprzez dobór optymalnych wartości pH eluentu oraz jego siły jonowej. Schematycznie wymianę jonową można przedstawić za pomocą reakcji:

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (wymiana kationowa)

R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (wymiana anionowa)

Wymieniacze jonitowe muszą spełniać następujące wymagania: być stabilnymi chemicznie w różnych środowiskach, wytrzymałymi mechanicznie w stanie suchym, a zwłaszcza w stanie spęczniałym, posiadać wysoką chłonność i zdolność do dobrej regeneracji.

W chromatografii jonowymiennej (jonowej) oddzielone aniony (kationy) są wykrywane jako kwasy (odpowiednie zasady) przez bardzo czuły detektor konduktometryczny, w którym wysokowydajne kolumny wypełnione są powierzchniowo czynnym wymieniaczem jonowym o małej pojemności.

chromatografia par jonowych, co można uznać za połączenie chromatografii adsorpcyjnej i jonowymiennej. Metoda opiera się na ekstrakcji substancji jonowych – ich przeniesieniu z fazy wodnej do fazy organicznej w postaci par jonowych. W tym celu do fazy ruchomej dodaje się przeciwjon, który jest w stanie selektywnie reagować z analizowanymi składnikami, zamieniając je w związki kompleksowe z utworzeniem pary jonowej. Główną zaletą tej opcji jest możliwość jednoczesnej analizy substancji kwaśnych, zasadowych i obojętnych.

chromatografia wymiany ligandów oparte na różna zdolność rozdzielonych związków do tworzenia kompleksów z kationami metali przejściowych– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 itd. - oraz grupy wiążące (ligandy) fazy stacjonarnej. Część sfery koordynacyjnej jonów metali zajmują cząsteczki wody lub inne słabe ligandy, które mogą być wypierane przez cząsteczki rozdzielanych związków. Ten rodzaj chromatografii służy do rozdzielania izomerów optycznych.

chromatografia wykluczania wielkości(sito, żel-penetracja, żel-filtracja), na których opiera się separacja różnice w wielkości cząsteczek.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Ryż. Schemat chromatografii żelowo-permeacyjnej

Chromatografii powinowactwa(biospecyficzny), oparty na fakcie, że wiele biologicznie aktywnych makrocząsteczek, na przykład enzymów, może specyficznie wiązać się z określonym odczynnikiem. Odczynnik utrwala się na nośniku (często agarozie), następnie przemywa analizowaną mieszaniną. Tylko pożądana makrocząsteczka jest zatrzymywana na polimerze (ryc.).

Ryż. Schemat chromatografii powinowactwa

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezpract-chr. HTML

Następnie usuwa się go z polimeru przepuszczając roztwór związku, który ma jeszcze większe powinowactwo do makrocząsteczki. Taka chromatografia jest szczególnie skuteczna w biotechnologii i biomedycynie do izolacji enzymów, białek i hormonów.

w zależności na sposób poruszania się substancji Istnieją następujące rodzaje chromatografii cieczowej: ujawniający, czołowy I przemieszczenie.
Najczęściej używany wskazujący wariant, w którym porcja rozdzielanej mieszaniny jest wprowadzana do kolumny w strumieniu eluentu. Wyjście składników mieszaniny z kolumny rejestruje się na chromatogramie jako piki. (Ryż.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Ryż. Schemat rozwijającego się wariantu chromatografii

Wysokość Lub obszar szczytowy charakteryzuje stężenie składników, A trzymany wolumeny – jakościowy skład mieszanki. Identyfikacja składników odbywa się zwykle poprzez koincydencję czasów retencji z substancjami wzorcowymi, stosuje się również metody chemiczne lub fizykochemiczne.

Na czołowy W wariancie (rys.) mieszanina rozdzielanych substancji przepuszczana jest w sposób ciągły przez kolumnę, która pełni rolę fazy ruchomej. Dzięki temu w czystej postaci można otrzymać tylko tę substancję, która jest najmniej zaadsorbowana w kolumnie.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Ryż. Schemat przedniego wariantu chromatografii

Chromatogram w tym przypadku jest stopniem, którego wysokości są proporcjonalne do stężeń składników; objętości retencji określa się na podstawie czasów retencji składników. Różniczkując taki chromatogram, uzyskuje się obraz podobny do tego, jaki uzyskano w wariancie wywołującym.

W przemieszczenie W wariancie składniki mieszaniny wprowadzane do kolumny są wypierane przez eluent, który jest adsorbowany silniej niż jakikolwiek składnik. W efekcie uzyskuje się przylegające do siebie frakcje rozdzielonych substancji, o kolejności uwalniania składników decyduje siła ich oddziaływania z powierzchnią sorbentu (rys.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Ryż. Schemat chromatografii przemieszczenia

3. Podstawowe wielkości chromatograficzne i ich wyznaczanie.

Podczas rozdzielania substancji za pomocą chromatografii cieczowej, jak wspomniano powyżej, można zastosować opcje wywoływania, czołowe i przesunięcia. Najczęściej stosuje się wariant rozwijający, w którym porcję rozdzielanej mieszaniny wprowadza się do kolumny w strumieniu eluentu. Wyjście składników mieszaniny z kolumny rejestruje się na chromatogramie jako piki. Na podstawie chromatogramu (ryc.) określić:

czasy retencji składników niesorbujących (t0), rozdzielonych (tR1, tR2, tR3, itp.); szerokość podstawy piku (tw1, tw2 itd.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

B) skorygowana objętość retencji składników ,

Gdzie t "R- poprawiony czas retencji komponentu;

C) współczynnik pojemności kolumny w odniesieniu do danego elementu ;

D) wydajność kolumny scharakteryzowany liczba równoważnych półek teoretycznych

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

F) pozwolenie https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

współczynnik pojemności k" ma znaczący wpływ na wartość R S: przy zmianie k„od 0 do 10 (limity optymalne) R S znacznie wzrasta. Oznaczający k" zależy od podwójnej powierzchni sorbentu i jego ilości w kolumnie, a także od stałej równowagi adsorpcji (stała Henry'ego).

Współczynnik selektywności α jest określona przez różnicę stałych równowagi adsorpcji dwóch rozdzielonych składników. Wraz ze wzrostem α (od 1 do ~ 5) R S gwałtownie wzrasta, przy dalszym wzroście α - niewiele się zmienia. Selektywność kolumny zależy od takich czynników jak budowa chemiczna powierzchni sorbentu, skład eluentu, temperatura kolumny oraz struktura rozdzielanych związków. Ponieważ sorpcja chromatografowanych substancji w chromatografii cieczowej jest determinowana parami oddziaływań trzech głównych składników układu – sorbentu, rozdzielanych substancji i eluentu, zmiana składu eluentu jest wygodnym sposobem optymalizacji proces separacji.

Wydajność kolumny zależy od wielkości cząstek i struktury porów adsorbentu, jednorodności wypełnienia kolumny, lepkości eluentu i szybkości przenoszenia masy. Wydłużenie kolumny nie zawsze prowadzi do poprawy separacji, ponieważ zwiększa się opór kolumny, zwiększa się ciśnienie eluentu na wlocie i czas trwania eksperymentu, maleje czułość i dokładność analizy na skutek poszerzania się piku analizowany składnik. Jeśli , to piki dwóch substancji na chromatogramie są prawie całkowicie rozdzielone. Wraz ze wzrostem R S zwiększa czas separacji. Na R S < 1 - niezadowalająca separacja. W chromatografii preparatywnej, ze względu na wprowadzanie stosunkowo dużych ilości dających się rozdzielić substancji, kolumna pracuje z przeciążeniem. W tym przypadku współczynnik pojemności maleje, wysokość odpowiadająca talerzowi teoretycznemu wzrasta, co prowadzi do spadku rozdzielczości.

4. Adsorbenty

Chromatograficzne rozdzielenie mieszaniny będzie skuteczne, jeśli odpowiednio dobrany zostanie adsorbent i rozpuszczalnik (eluent).

Adsorbent nie może oddziaływać chemicznie z rozdzielanymi składnikami ani wykazywać działania katalitycznego na rozpuszczalnik. Konieczne jest również, aby adsorbent był selektywny w stosunku do składników mieszaniny. Odpowiednio dobrany adsorbent powinien charakteryzować się maksymalną zdolnością absorpcyjną.

Wyróżnić polarny (hydrofilowy) I adsorbenty niepolarne (hydrofobowe).. Należy pamiętać, że powinowactwo adsorpcyjne substancji polarnych do sorbentów polarnych jest znacznie większe niż do sorbentów niepolarnych.

Jako adsorbenty stosuje się tlenek glinu, węgiel aktywny, żel krzemionkowy, zeolity, celulozę i niektóre minerały.

Tlenek glinuAl2O3 – Adsorbent amfoteryczny(Ryc.) Na nim mieszaniny można rozdzielić substancje polarne, I w rozpuszczalnikach niepolarnych. Neutralny tlenek glinu jest zwykle używany do chromatografii z niewodnych roztworów nasyconych węglowodorów, aldehydów, alkoholi, fenoli, ketonów i eterów.

Ryż. Tlenek glinu do chromatografii

http://obrazy. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktywność Al2O3 zależy od zawartości w nim wilgoci. Bezwodny tlenek glinu ma najwyższą aktywność. Jest warunkowo traktowany jako jednostka. W razie potrzeby można przygotować tlenek glinu o różnej zawartości wilgoci, mieszając świeżo przygotowany tlenek glinu z wodą (skala Brockmanna).

Zależność aktywności tlenku glinu od wilgotności

Na przykład Al2O3 o aktywności 1,5-2 służy do oddzielania węglowodorów; do separacji alkoholi i ketonów - 2-3,5.

Powierzchnia właściwa tlenku glinu wynosi 230-380 m2/g.

Żel krzemionkowy(hydroksylowany lub modyfikowany chemicznie) to wysuszony galaretowaty ditlenek krzemu, który otrzymuje się z przesyconych roztworów kwasów krzemowych ( N SiO2 M H2O) przy pH > 5-6. (Rys.) Stały sorbent hydrofilowy.

Ryż. Żel krzemionkowy

http://www. Żel krzemionkowy. /

http://żel krzemionkowy. ru/images/askg. gif

Wielkość cząstek żelu krzemionkowego w kolumnach analitycznych wynosi 3-10 µm, w kolumnach preparatywnych 20-70 µm. Mały rozmiar cząstek zwiększa szybkość przenoszenia masy i poprawia wydajność kolumny. Nowoczesne kolumny analityczne mają długość 10–25 cm. Wypełnione są żelem krzemionkowym o wielkości cząstek 5 mikronów i umożliwiają rozdzielanie złożonych mieszanin 20-30 składników. Gdy wielkość cząstek zmniejsza się do 3–5 µm, zwiększa się wydajność kolumny, ale zwiększa się również jej rezystancja. Tak więc, aby osiągnąć szybkość przepływu eluentu 0,5-2,0 ml/min, wymagane jest ciśnienie (1-3)·107Pa. Żel krzemionkowy wytrzymuje taki spadek ciśnienia, podczas gdy polimerowe granulki sorbentu są bardziej elastyczne i odkształcają się. Ostatnio opracowano wytrzymałe mechanicznie sorbenty polimerowe o strukturze makroporowatej o gęstej sieci, które pod względem wydajności są zbliżone do żeli krzemionkowych. Kształt cząstek sorbentu o wielkości 10 µm i większych nie ma większego wpływu na wydajność kolumny, jednak preferowane są sorbenty o kształcie kulistym, które dają bardziej przepuszczalne wypełnienie.

Ryż. Sferyczny żel krzemionkowy

http://obrazy. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Wewnętrzna struktura cząsteczki żelu krzemionkowego to system połączonych kanałów. Do chromatografii cieczowej stosuje się sorbenty o średnicy porów 6–25 nm. Rozdzielanie metodą chromatografii cieczowej przeprowadza się głównie na żelach krzemionkowych modyfikowanych w reakcji alkilo- i arylochlorosilanów lub alkiletoksysilanów z silanolowymi grupami powierzchniowymi. Za pomocą takich reakcji szczepione są grupy C8H17-, C18H37- lub C6H5- (w celu uzyskania sorbentów o hydrofobizowanej powierzchni), grupy nitrylowe, hydroksylowe itp. (ryc.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Ryż. Struktura modyfikowanego żelu krzemionkowego

żele krzemionkowe stosowany w chromatografii do rozdzielania mieszanin produktów ropopochodnych, wyższa kwasy tłuszczowe, ich estry, aminy aromatyczne, nitropochodne związki organiczne. Żel krzemionkowy – sorbent hydrofilowy, łatwo zwilżalny wodą. Dlatego nie może być stosowany do sorpcji z roztworów wodnych. Aktywność żelu krzemionkowego zależy od zawartości w nim wody: im mniej wody zawiera, tym większa jest aktywność (skala Brockmanna).

Zależność aktywności żelu krzemionkowego od zawartości wilgoci

Powierzchnia właściwa żeli krzemionkowych wynosi 500-600 m2/g.

węgle aktywne są formą węgla, która podczas przetwarzania staje się niezwykle porowata i ma bardzo dużą powierzchnię dostępną do adsorpcji lub reakcji chemicznych (rys.) Mają powierzchnię właściwą 1300-1700 m2/g.

Ryż. Węgiel aktywowany

http://e-katalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Główny wpływ na strukturę porów węgli aktywnych mają surowce wyjściowe do ich produkcji. Węgle aktywne na bazie łupin orzecha kokosowego charakteryzują się większym udziałem mikroporów (do 2 nm), na bazie węgla większym udziałem mezoporów (2-50 nm). Duży udział makroporów jest charakterystyczny dla węgli aktywnych na bazie drewna (powyżej 50 nm). Mikropory szczególnie dobrze nadają się do adsorpcji małych cząsteczek, a mezopory do adsorpcji większych cząsteczek organicznych.

Zeolity (sita molekularne)– porowate krystaliczne glinokrzemiany metali alkalicznych i ziem alkalicznych pochodzenia naturalnego i syntetycznego. (Ryż.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Ryż. Zeolity

http://www. zeolit. spb. pl/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. pl/kciuk. php? file=/uploads/products/6.jpg&x_width=250

Istnieją cztery rodzaje zeolitów (A, X, Y, M) o różnych strukturach krystalicznych. W zależności od kationu zeolity oznacza się następująco: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Cecha zeolitów czy to pory kryształów mają wymiary rzędu 0,4-1 nm, współmierne do wielkości cząsteczek wiele substancji ciekłych lub gazowych. Jeśli cząsteczki substancji są w stanie wniknąć w te pory, wówczas w porach kryształów zeolitu zachodzi adsorpcja. Większe cząsteczki substancji nie są adsorbowane. Wybierając zeolity o różnej wielkości porów, można wyraźnie rozdzielić mieszaniny różnych substancji.

Powierzchnia właściwa zeolitów wynosi 750-800 m2/g.

Przy wyborze adsorbentu należy wziąć pod uwagę budowę substancji oraz ich rozpuszczalność. Na przykład węglowodory nasycone są słabo adsorbowane, podczas gdy węglowodory nienasycone (mają wiązania podwójne) są lepsze. Grupy funkcyjne zwiększają zdolność substancji do adsorpcji.

5. Eluenty

Przy wyborze rozpuszczalnika (eluentu) należy wziąć pod uwagę charakter adsorbentu oraz właściwości substancji w rozdzielanej mieszaninie. Eluenty powinny dobrze rozpuszczać wszystkie składniki chromatografii, mieć niską lepkość, zapewniać wymagany poziom selektywności, być tanie, nietoksyczne, obojętne, kompatybilne z metodami detekcji (np. benzen nie może być stosowany jako eluent z detektorem UV) .

W chromatografii z normalną fazą stosuje się zwykle węglowodory (heksan, heptan, izooktan, cykloheksan) z dodatkiem niewielkich ilości CHCl3 chloroformu, izo-C3H7OH izopropanolu, eteru diizopropylowego; w chromatografii z odwróconymi fazami - mieszanina wody z acetonitrylem CH3CN, metanolem CH3OH, etanolem C2H5OH, dioksanem, tetrahydrofuranem, dimetyloformamidem. Aby wyodrębnić poszczególne składniki mieszaniny rozdzielone podczas chromatografii, często są one wymywane sekwencyjnie (elucja). W tym celu stosuje się rozpuszczalniki o różnej zdolności desorpcyjnej. Rozpuszczalniki są ułożone malejąco według zdolności desorpcyjnej w adsorbentach polarnych - Szeregi eluotropowe Trappego. Jeżeli składniki rozdzielanej mieszaniny mają zbliżone wartości k" ( współczynnik pojemności kolumny w odniesieniu do tego składnika), następnie chromatografować z jednym eluentem. Jeżeli poszczególne składniki mieszaniny są silnie zatrzymywane przez sorbent, należy zastosować serię eluentów o wzrastającej mocy.

Eluotropowy zakres rozpuszczalników

6. Sprzęt do chromatografii cieczowej

W nowoczesnej chromatografii cieczowej stosuje się przyrządy o różnym stopniu skomplikowania – od najprostszych układów po chromatografy z najwyższej półki.
W skład nowoczesnego chromatografu cieczowego wchodzą: zbiorniki na eluenty, pompy wysokociśnieniowe, dozownik, kolumna chromatograficzna, detektor, urządzenie rejestrujące, układ sterowania i obróbki matematycznej wyników.

na ryc. przedstawiono schemat blokowy chromatografu cieczowego, zawierający minimalny niezbędny zestaw elementów, w takiej czy innej postaci, obecnych w dowolnym układzie chromatograficznym.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Ryż. Schemat chromatografu cieczowego: 1 - zbiornik na fazę ruchomą, 2 - pompa, 3 - inżektor, 4 - kolumna, 5 - termostat, 6 - detektory, 7 - układ rejestrujący, 8 - komputer.

Zbiornik dla fazy ruchomej, musi mieć wystarczającą zdolność do analizy i urządzenie do odgazowywania rozpuszczalników aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków gazów rozpuszczonych w eluencie w kolumnie i detektorze.

Pompa przeznaczony w celu wytworzenia stałego przepływu rozpuszczalnika. Jego konstrukcja zależy przede wszystkim od ciśnienia roboczego w układzie. Do pracy w zakresie 10-500 MPa stosuje się pompy typu nurnikowego (strzykawkowego). Ich wadą jest konieczność okresowych przerw w uzupełnianiu eluentem. Do prostych układów o niskich ciśnieniach roboczych rzędu 1-5 MPa stosuje się niedrogie pompy perystaltyczne. Eluenty dostają się do pompy przez filtr, który zatrzymuje cząsteczki pyłu (większe niż 0,2 µm). Czasami przez eluenty przepływa niewielki strumień helu w celu usunięcia rozpuszczonego powietrza i zapobieżenia tworzeniu się pęcherzyków w detektorze (zwłaszcza w przypadku eluentów wodnych i polarnych). W chromatografach analitycznych eluent dostarczany jest do kolumny za pomocą pomp tłokowych z układem sprzężenia zwrotnego, które umożliwiają wygładzenie pulsacji przepływu w granicach 1–2% i zapewniają prędkości objętościowe od 0,1 do 25 ml/min przy ciśnieniach do ~3,107 Rocznie. W chromatografii mikrokolumnowej objętościowe natężenia przepływu eluentów są znacznie mniejsze - 10-1000 µl/min. W przypadku elucji gradientowej stosuje się kilka pomp, które są sterowane programatorem i podają 2-3 składniki eluentu do komory mieszania, pozostawiając stały całkowity przepływ. Aby wprowadzić próbkę do kolumny pod wysokim ciśnieniem, bez zatrzymywania przepływu, stosuje się specjalne zawory mikrodozujące, połączone z pętlą o znanej objętości dla badanej próbki roztworu. Opracowano systemy dozowania z automatycznym pobieraniem próbek i wstrzykiwaniem próbek za pomocą kurków lub strzykawek do mikrodozowania.

Wtryskiwacz zapewnia wymieszać iniekcję próbki składników dających się rozdzielić do kolumny z wystarczająco wysoką odtwarzalnością. Proste systemy wstrzykiwania próbek typu „stop-flow” wymagają zatrzymania pompy i dlatego są mniej wygodne niż pipety pętlowe Reodyne.

głośniki do HPLC są najczęściej wykonane z polerowanej rurki ze stali nierdzewnej o długości 10–25 cm i średnicy wewnętrznej 3–5 mm.

Ryż. Kolumny chromatograficzne do chromatografii cieczowej

Także używany szklane kolumny umieszczony w metalowej obudowie; w chromatografii mikrokolumnowej - drukowane metalowe kolumny o średnicy wewnętrznej 1,0-1,5mm, pakowane szklane mikrokolumny o średnicy 70-150 mikronów i puste kolumny kapilarneśrednica 10-100 mikronów; w chromatografii preparatywnej - kolumny o średnicy od 2 do 10 cm lub większej. Do równomiernego i gęstego wypełnienia kolumn sorbentem stosuje się metodę pakowania zawiesinowego. Zawiesinę przygotowuje się z sorbentu i odpowiedniej cieczy organicznej, którą podaje się do kolumny pod ciśnieniem do 5 107 Pa. Aby określić rozdzielone składniki opuszczające kolumnę używać detektory. stałość temperatury ubezpieczony termostat.

Detektory do chromatografii cieczowej posiadają kuwetę przepływową, w której dokonuje się ciągłego pomiaru dowolnej właściwości przepływającego eluentu. Muszą być bardzo wrażliwi. Aby zwiększyć czułość detektora, czasami stosuje się derywatyzację składników mieszaniny po kolumnie. W tym celu do strumienia eluentu wprowadza się takie reagenty, które wchodząc w interakcje z rozdzielanymi substancjami tworzą pochodne o wyraźniejszych właściwościach, np. silniej absorbują w zakresie UV lub widzialnym widma lub mają większą zdolność fluorescencyjną . Czasami derywatyzację przeprowadza się przed analizą chromatograficzną i oddziela się pochodne, a nie materiały wyjściowe. Najpopularniejsze typy detektory ogólnego przeznaczenia są refraktometry, zmierzenie współczynnik załamania światła, I detektory spektrofotometryczne definiowanie gęstość optyczna rozpuszczalnika przy stałej długości fali (zwykle w zakresie ultrafioletu). DO Zalety refraktometrów(I Wady spektrofotometrów) należy przypisać niska wrażliwość na rodzaj znajomości, które mogą zawierać lub nie zawierać grup chromoforowych. Z drugiej strony zastosowanie refraktometrów ogranicza się do układów izokratycznych (ze stałym składem eluentu), więc zastosowanie gradientu rozpuszczalnika nie jest w tym przypadku możliwe.

Differential" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">wzmacniacz różnicowy i rejestrator. Pożądane jest również posiadanie integrator, co umożliwia obliczenie względnych powierzchni otrzymanych pików. W złożonych układach chromatograficznych blok interfejsu, łącząc chromatograf z komputer osobisty, która nie tylko zbiera i przetwarza informacje, ale także steruje urządzeniem, oblicza charakterystykę ilościową, aw niektórych przypadkach skład jakościowy mieszanin. mikroprocesor zapewnia automatyczne wstrzykiwanie próbki, zmienić przez dany program składu eluentu z elucją gradientową, utrzymywanie temperatura kolumny.

Bruker". Ryż. chromatograf cieczowy Jasco

Pytania do samokontroli

Co to jest chromatografia cieczowa? Nazwij jego rodzaje, obszary zastosowania. Lista o Podstawowe wielkości chromatograficzne i ich definicja Jakie istnieją rodzaje chromatografii cieczowej w zależności od mechanizmu zatrzymywania rozdzielanych substancji przez fazę stacjonarną LC? Jakie rodzaje chromatografii istnieją w zależności od metody ruchu substancji? Jakie substancje są stosowane jako adsorbenty? Jaka jest różnica? Co to jest ciekła faza ruchoma - eluent? wymagania dotyczące rozpuszczalników. Jaka jest różnica między chromatografią podziałową a chromatografią adsorpcyjną? Wymień główne części obwodu chromatografu cieczowego, ich przeznaczenie.

Spis wykorzystanej literatury

1 „Chromatografia cieczowa w medycynie”

Http://dziennik. isp. rssi. pl/artykuły/pdf/0011_035.pdf

2 „Wprowadzenie do wysokosprawnej chromatografii cieczowej”

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezpract-chr. HTML

3 „Chromatografia cieczowa”

http://e-nauka. en/index/?id=1540

4 „Chromatografia”

http://belchem. ludzie. pl/chromatography1.html