Prawie wszystkie reakcje biochemiczne mają charakter enzymatyczny. Enzymy(biokatalizatory) to substancje białkowe aktywowane przez kationy metali. Znanych jest około 2000 różnych enzymów, z których wyizolowano około 150, a niektóre z nich są stosowane jako leki. Trypsynę i chymotrypsynę stosuje się w leczeniu zapalenia oskrzeli i płuc; pepsyna – do leczenia zapalenia żołądka; plazmina – stosowana w leczeniu zawału serca; Pankreatyna – do leczenia trzustki. Enzymy różnią się od konwencjonalnych katalizatorów: (a) wyższą aktywnością katalityczną; (b) wysoka specyficzność, tj. selektywność działania.
Mechanizm reakcji enzymatycznej z jednym substratem można przedstawić na poniższym schemacie:
gdzie E jest enzymem,
S - podłoże,
ES – kompleks enzym-substrat,
P jest produktem reakcji.
Charakterystyczną cechą pierwszego etapu reakcji enzymatycznej jest Stała Michaelisa (K M). KM jest odwrotnością stałej równowagi:
Stała Michaelisa (K M) charakteryzuje stabilność kompleksu enzym-substrat (ES). Im niższa stała Michaelisa (K M), tym kompleks jest bardziej stabilny.
Szybkość reakcji enzymatycznej jest równa szybkości jej etapu ograniczającego szybkość:
gdzie k 2 jest stałą szybkości, zwaną Liczba rewolucji Lub aktywność molekularna enzymu.
molekularna aktywność enzymatyczna(k 2) jest równa liczbie cząsteczek substratu ulegających przemianom pod wpływem jednej cząsteczki enzymu w ciągu 1 minuty w temperaturze 25 0 C. Stała ta przyjmuje wartości z zakresu: 1·10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .
Dla ureazy, która przyspiesza hydrolizę mocznika, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1 ; dla trifosfatazy adenozyny, która przyspiesza hydrolizę ATP, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1 ; dla katalazy, która przyspiesza rozkład H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.
Jednakże równanie kinetyczne reakcji enzymatycznej w postaci, w jakiej podano powyżej, jest praktycznie niemożliwe do zastosowania ze względu na brak możliwości eksperymentalnego określenia stężenia kompleksu enzym-substrat (). Wyrażone w innych wielkościach, które można łatwo wyznaczyć eksperymentalnie, otrzymujemy równanie kinetyczne reakcji enzymatycznych, zwany według równania Michaelisa-Mentena (1913):
,
gdzie iloczyn k 2 [E] suma jest wartością stałą, którą oznaczamy (prędkość maksymalna).
Odpowiednio: 
Rozważmy szczególne przypadki równania Michaelisa-Mentena.
1) Zatem przy niskim stężeniu substratu K M >> [S].
co odpowiada równaniu kinetycznemu reakcji pierwszego rzędu.
2) Przy wysokim stężeniu substratu K m<< [S], поэтому
co odpowiada równaniu kinetycznemu reakcji zerowego rzędu.
Zatem przy niskim stężeniu substratu szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta wraz ze wzrostem zawartości substratu w układzie, a przy wysokim stężeniu substratu krzywa kinetyczna osiąga plateau (szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu) (rys. 30).
Rysunek 30. - Krzywa kinetyczna reakcji enzymatycznej
Jeżeli [S] = K M, to
co pozwala graficznie wyznaczyć stałą Michaelisa K m (ryc. 31).
Rysunek 31. - Graficzna definicja stałej Michaelisa
Na aktywność enzymów wpływają: (a) temperatura, (b) kwasowość podłoża, (c) obecność inhibitorów. Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej omówiono w rozdziale 9.3.
Wpływ kwasowości podłoża na szybkość reakcji enzymatycznej przedstawiono na rysunku 32. Maksymalna aktywność enzymu odpowiada optymalnej wartości pH (pH opt).
Rysunek 32. - Wpływ kwasowości roztworu na aktywność enzymu
Dla większości enzymów optymalne wartości pH pokrywają się z wartościami fizjologicznymi (7,3 - 7,4). Istnieją jednak enzymy, których normalne funkcjonowanie wymaga środowiska silnie kwaśnego (pepsyna - 1,5 - 2,5) lub wystarczająco zasadowego (arginaza - 9,5 - 9,9).
Inhibitory enzymów- są to substancje zajmujące część centrów aktywnych cząsteczek enzymów, w wyniku czego zmniejsza się szybkość reakcji enzymatycznej. Kationy metali ciężkich, kwasy organiczne i inne związki działają jako inhibitory.
Wykład 11
Struktura atomowa
Istnieją dwie definicje pojęcia „atom”. Atom to najmniejsza cząstka pierwiastka chemicznego, która zachowuje swoje właściwości chemiczne.
Atom to elektrycznie obojętny mikrosystem składający się z dodatnio naładowanego rdzenia i ujemnie naładowanej powłoki elektronowej.
Doktryna atomu przeszła długą drogę rozwoju. Główne etapy rozwoju atomizmu obejmują:
1) naturalny etap filozoficzny - okres kształtowania się koncepcji atomowej budowy materii, niepotwierdzony eksperymentalnie (V w. p.n.e. - XVI w. n.e.);
2) etap powstawania hipotezy o atomie jako najmniejszej cząstce pierwiastka chemicznego (XVIII-XIX w.);
3) etap tworzenia modeli fizycznych oddających złożoność budowy atomu i pozwalających opisać jego właściwości (początek XX w.)
4) współczesny etap atomizmu nazywany jest mechaniką kwantową. Mechanika kwantowa to dziedzina fizyki badająca ruch cząstek elementarnych.
PLAN
11.1. Struktura jądra. Izotopy.
11.2. Kwantowo-mechaniczny model powłoki elektronowej atomu.
11.3. Właściwości fizykochemiczne atomów.
Struktura jądra. Izotopy
jądro atomowe jest cząstką naładowaną dodatnio, składającą się z protonów, neutronów i innych cząstek elementarnych.
Powszechnie przyjmuje się, że głównymi cząstkami elementarnymi jądra są protony i neutrony. Proton (p) – jest cząstką elementarną, której względna masa atomowa wynosi 1 urn, a jej względny ładunek wynosi + 1. Neutron (n) – Jest to cząstka elementarna, która nie ma ładunku elektrycznego i której masa jest równa masie protonu.
99,95% masy atomu koncentruje się w jądrze. Pomiędzy cząstkami elementarnymi występują specjalne jądrowe siły rozciągania, które znacznie przewyższają siły odpychania elektrostatycznego.
Podstawową cechą atomu jest opłata jego jądra, równa liczbie protonów i pokrywająca się z liczbą atomową pierwiastka w układzie okresowym pierwiastków chemicznych. Nazywa się zbiór (typ) atomów o tym samym ładunku jądrowym pierwiastek chemiczny. W przyrodzie występują pierwiastki o liczbach od 1 do 92.
Izotopy- są to atomy tego samego pierwiastka chemicznego, zawierające w jądrze tę samą liczbę protonów i różną liczbę neutronów.
gdzie liczba masowa (A) jest masą jądra, z jest ładunkiem jądra.
Każdy pierwiastek chemiczny jest mieszaniną izotopów. Z reguły nazwa izotopów pokrywa się z nazwą pierwiastka chemicznego. Jednakże wprowadzono specjalne nazwy izotopów wodoru. Pierwiastek chemiczny wodór jest reprezentowany przez trzy izotopy:
Liczba p Liczba n
Protium N 1 0
Deuter D 1 1
Tryt T 1 2
Izotopy pierwiastka chemicznego mogą być zarówno stabilne, jak i radioaktywne. Izotopy promieniotwórcze zawierają jądra, które samoistnie się rozpadają, uwalniając cząstki i energię. Stabilność jądra zależy od stosunku neutronów do protonów.
Dostając się do organizmu, radionuklidy zakłócają najważniejsze procesy biochemiczne, obniżają odporność i skażają organizm na choroby. Organizm chroni się przed skutkami promieniowania selektywnie pochłaniając pierwiastki z otoczenia. Izotopy trwałe mają pierwszeństwo przed izotopami radioaktywnymi. Innymi słowy, izotopy stabilne blokują akumulację izotopów promieniotwórczych w organizmach żywych (Tabela 8).
Książka S. Shannona „Odżywianie w epoce atomowej” podaje następujące dane. Jeśli dawka blokująca wynosząca ~100 mg stabilnego izotopu jodu zostanie przyjęta nie później niż 2 godziny po przedostaniu się I-131 do organizmu, wychwyt radiojodu przez tarczycę zostanie zmniejszony o 90%.
Radioizotopy są stosowane w medycynie
w diagnostyce niektórych chorób,
· do leczenia wszelkich postaci nowotworów,
· do badań patofizjologicznych.
Tabela 8 – Efekt blokujący stabilnych izotopów
Kinetyka enzymów bada szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy w zależności od różnych warunków (stężenie, temperatura, pH itp.) ich oddziaływania z substratem.
Enzymy są jednak białkami wrażliwymi na wpływ różnych wpływów zewnętrznych. Dlatego też badając szybkość reakcji enzymatycznych, biorą pod uwagę głównie stężenia reagujących substancji, a starają się minimalizować wpływ temperatury, pH środowiska, aktywatorów, inhibitorów i innych czynników oraz stworzyć warunki standardowe. Po pierwsze, jest to wartość pH środowiska optymalna dla danego enzymu. Po drugie, jeśli to możliwe, zaleca się utrzymanie temperatury 25°C. Po trzecie, osiąga się całkowite nasycenie enzymu substratem. Ten punkt jest szczególnie ważny, ponieważ przy niskich stężeniach substratu nie wszystkie cząsteczki enzymu biorą udział w reakcji (ryc. 6.5, A), co oznacza, że wynik będzie daleki od maksymalnego możliwego. Największą moc katalizowanej reakcji, przy niezmienionych warunkach, uzyskuje się, gdy w przemianie uczestniczy każda cząsteczka enzymu, tj. przy wysokim stężeniu kompleksu enzym-substrat (ryc. 6.5, V). Jeżeli stężenie substratu nie zapewnia całkowitego nasycenia enzymu (ryc. 6.5, B), wówczas szybkość reakcji nie osiąga wartości maksymalnej.
Ryż. 65.
A - przy niskim stężeniu substratu; 6 - przy niewystarczającym stężeniu substratu; V - gdy enzym jest całkowicie nasycony substratem
Nazywa się szybkość reakcji enzymatycznej mierzoną w powyższych warunkach i całkowite nasycenie enzymu substratem maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej (V).
Oznacza się szybkość reakcji enzymatycznej, określoną, gdy enzym nie jest całkowicie nasycony substratem w.
Katalizę enzymatyczną można uprościć za pomocą poniższego diagramu:
gdzie F oznacza enzym; S - podłoże; FS - kompleks enzym-substrat.
Każdy etap tego procesu charakteryzuje się określoną szybkością. Jednostką miary szybkości reakcji enzymatycznej jest liczba moli substratu przekształconego w jednostce czasu(taka sama jak szybkość normalnej reakcji).
Oddziaływanie enzymu z substratem prowadzi do powstania kompleksu enzym-substrat, jednak proces ten jest odwracalny. Szybkości reakcji do przodu i do tyłu zależą od stężeń reagentów i są opisane odpowiednimi równaniami:
W równowadze równanie (6.3) jest ważne, ponieważ szybkości reakcji do przodu i do tyłu są równe.
Podstawiając wartości prędkości reakcji do przodu (6.1) i do tyłu (6.2) do równania (6.3), otrzymujemy równość:
Stan równowagi charakteryzuje się odpowiednim stała równowagi K p, równy stosunkowi stałych reakcji do przodu i do tyłu (6,5). Nazywa się odwrotnością stałej równowagi stała substratu Ks, lub stała dysocjacji kompleksu enzym-substrat:
Z równania (6.6) wynika, że stała substratu maleje przy wysokich stężeniach kompleksu enzym-substrat, tj. z dużą stabilnością. W konsekwencji stała substratu charakteryzuje powinowactwo enzymu do substratu oraz stosunek stałych szybkości tworzenia i dysocjacji kompleksu enzym-substrat.
Zjawisko nasycenia enzymu substratem badali Leonor Michaelis i Maud Mepten. Na podstawie matematycznego przetwarzania wyników wyprowadzono równanie (6.7), które otrzymało swoją nazwę, z której wynika, że przy dużym stężeniu substratu i małej wartości stałej substratu szybkość reakcji enzymatycznej dąży do maksimum . Jednak równanie to jest ograniczone, ponieważ nie uwzględnia wszystkich parametrów:
Kompleks enzym-substrat podczas reakcji może ulegać przemianom w różnych kierunkach:
- dysocjują na substancje macierzyste;
- przekształcić się w produkt, z którego enzym zostaje oddzielony w niezmienionej postaci.
Dlatego też, aby opisać ogólne działanie procesu enzymatycznego, koncepcja stałe Michaelisa Kt, co wyraża związek pomiędzy stałymi szybkości wszystkich trzech reakcji katalizy enzymatycznej (6.8). Jeśli oba wyrazy podzielimy przez stałą szybkości reakcji tworzenia kompleksu enzym-substrat, otrzymamy wyrażenie (6.9):
Z równania (6.9) wynika ważny wniosek: stała Michaelisa jest zawsze o wartość większa od stałej substratu k 2 /k v
Liczebnie Kt równe stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji wynosi połowę maksymalnej możliwej prędkości i odpowiada nasyceniu enzymu substratem, jak na ryc. 6,5, B. Ponieważ w praktyce nie zawsze udaje się osiągnąć całkowite nasycenie enzymu substratem, właśnie tak jest Kt wykorzystywane do porównawczej charakterystyki właściwości kinetycznych enzymów.
Szybkość reakcji enzymatycznej, gdy enzym nie jest całkowicie nasycony substratem (6.10), zależy od stężenia kompleksu enzym-substrat. Współczynnik proporcjonalności jest stałą reakcji uwalniania enzymu i produktu, ponieważ zmienia to stężenie kompleksu enzym-substrat:
Po przekształceniach, biorąc pod uwagę powyższe zależności, szybkość reakcji enzymatycznej, gdy enzym nie jest całkowicie nasycony substratem, opisuje równanie (6.11), tj. zależy od stężenia enzymu, substratu i ich powinowactwa Ks:
Graficzna zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu nie jest liniowa. Jak widać z rys. 6.6, wraz ze wzrostem stężenia substratu obserwuje się wzrost aktywności enzymu. Jednakże, gdy osiągnięte zostanie maksymalne nasycenie enzymu substratem, szybkość reakcji enzymatycznej staje się maksymalna. Dlatego czynnikiem ograniczającym szybkość reakcji jest tworzenie kompleksu enzym-substrat.
Praktyka pokazała, że stężenia substratów z reguły wyrażane są w wartościach znacznie mniejszych niż jedność (10 6 -10 3 mol). Przy takich wielkościach dość trudno jest operować w obliczeniach. Dlatego G. Lineweaver i D. Burke zaproponowali wyrażenie graficznej zależności szybkości reakcji enzymatycznej nie we współrzędnych bezpośrednich, ale w odwrotnych. Wyszli z założenia, że dla równych wielkości ich odwrotności są również równe:
Ryż. 6.6.
Po przekształceniu wyrażenia (6.13) otrzymujemy wyrażenie o nazwie Równanie Lineweavera-Burka (6.14):
Zależność graficzna równania Lineweavera-Burka jest liniowa (ryc. 6.7). Właściwości kinetyczne enzymu określa się w następujący sposób:
- odcinek odcięty na osi rzędnych jest równy 1/V;
- odcinek odcięty na osi odciętej jest równy -1 /Do t.
Ryż. 6.7.
Uważa się, że metoda Lineweavera-Burka pozwala określić maksymalną szybkość reakcji dokładniej niż we współrzędnych bezpośrednich. Z tego wykresu można również uzyskać cenne informacje dotyczące hamowania enzymów.
Istnieją inne sposoby transformacji równania Michaelisa-Mentena. Zależności graficzne służą do badania wpływu różnych czynników zewnętrznych na proces enzymatyczny.
Ta gałąź enzymologii bada wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznej. Biorąc pod uwagę ogólne równanie katalizy enzymatycznej odwracalnej reakcji przemiany jednego substratu w jeden produkt (1),
Do głównych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznej należy wymienić: stężenie substratu [S], stężenie enzymu [E] i stężenie produktu reakcji [P].
Oddziaływanie niektórych enzymów z ich substratem można opisać hiperboliczną krzywą zależności szybkości reakcji enzymatycznej V od stężenia substratu [S] (ryc. 19):
Ryc. 19. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.
Na tej krzywej można wyróżnić trzy przekroje, które można wytłumaczyć zapisami mechanizmu oddziaływania enzymu z substratem: OA – przekrój bezpośrednio proporcjonalnej zależności V od [S], centrów aktywnych enzymu są stopniowo wypełniane cząsteczkami substratu, tworząc niestabilny kompleks ES; sekcja AB - krzywoliniowa zależność V od [S], nie osiągnięto jeszcze całkowitego nasycenia centrów aktywnych enzymu cząsteczkami substratu. Kompleks ES jest niestabilny przed osiągnięciem stanu przejściowego, prawdopodobieństwo odwrotnej dysocjacji do E i S jest nadal wysokie; przekrój BC - zależność opisana jest równaniem zerowego rzędu, przekrój jest równoległy do osi [S], osiągnięto całkowite nasycenie aktywnych enzymów cząsteczkami substratu, V=V max.
Charakterystyczny kształt krzywej opisuje matematycznie równanie Briggsa-Haldane’a:
V=V maks. ● [S]/Km + [S] (2),
gdzie Km jest stałą Michaelisa-Mentena, liczbowo równą stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie Vmax.
Im niższa wartość Km enzymu, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, tym szybciej zostaje osiągnięty stan przejściowy substratu, który przekształca się w produkt reakcji. Znalezienie wartości Km dla każdego specyficznego dla grupy substratu enzymatycznego jest ważne w określeniu biologicznej roli tego enzymu w komórce.
Dla większości enzymów nie da się skonstruować krzywej hiperbolicznej (Rys. 19), w tym przypadku stosuje się metodę podwójnych odwrotności (Lineweaver-Burk), tj. wykreślono graficzną zależność 1/[V] od 1/[S] (rys. 20). Metoda konstruowania takich krzywych w doświadczeniu jest bardzo wygodna przy badaniu wpływu różnego rodzaju inhibitorów na aktywność enzymów (patrz dalej w tekście).
Ryc.20. Wykres 1/[V] w funkcji 1/[S] (metoda Lineweavera-Burka),
gdzie y jest sekcją odcięcia - , a x jest sekcją odcięcia - 
, tangens kąta α - .
Zależność szybkości reakcji enzymatycznej V od stężenia enzymu [E].
Tę zależność graficzną (rys. 21) rozważa się w optymalnej temperaturze i pH środowiska, przy stężeniach substratu znacznie wyższych od stężenia nasycenia centrów aktywnych enzymu.
Ryż. 21. Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej.
Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia kofaktora lub koenzymu. W przypadku złożonych enzymów należy wziąć pod uwagę, że niedobór koenzymowych form witamin w przypadku hipowitaminozy i naruszenie przyjmowania jonów metali do organizmu koniecznie prowadzi do zmniejszenia stężenia odpowiednich enzymów niezbędnych do przebiegu procesów metabolicznych. Należy zatem stwierdzić, że aktywność enzymu jest bezpośrednio zależna od stężenia kofaktora, czyli koenzymu.
Wpływ stężenia produktu na szybkość reakcji enzymatycznej. W przypadku reakcji odwracalnych zachodzących w organizmie człowieka należy wziąć pod uwagę, że produkty reakcji bezpośredniej mogą zostać wykorzystane przez enzym jako substraty reakcji odwrotnej. Dlatego kierunek przepływu i moment osiągnięcia Vmax zależą od stosunku stężeń wyjściowych substratów i produktów reakcji. Przykładowo aktywność aminotransferazy alaninowej, która katalizuje przemianę:
Alanina + alfa-ketoglutaran ↔ pirogronian + glutaminian
zależy w komórce od stosunku stężeń:
[alanina + alfa-ketoglutaran] / [pirogronian + glutaminian].
MECHANIZM DZIAŁANIA ENZYMÓW. TEORIE KATALIZY ENZYMATYCZNEJ
Enzymy, podobnie jak katalizatory niebiałkowe, zwiększają szybkość reakcji chemicznej ze względu na ich zdolność do zmniejszania energii aktywacji tej reakcji. Energię aktywacji reakcji enzymatycznej oblicza się jako różnicę pomiędzy wartością energii w układzie zachodzącej reakcji, który osiągnął stan przejściowy, a energią wyznaczoną na początku reakcji (patrz zależność graficzna na rys. 22).
Ryż. 22. Graficzna zależność stanu energetycznego reakcji chemicznej bez enzymu (1) i w obecności enzymu (2) od czasu reakcji.
Prace V. Henry'ego, a w szczególności L. Michaelisa, M. Mentena nad badaniem mechanizmu odwracalnych reakcji enzymatycznych monosubstratu pozwoliły postulować, że enzym E najpierw odwracalnie i stosunkowo szybko łączy się ze swoim substratem S, tworząc enzym- kompleks substratów (ES):
E+S<=>ES (1)
Tworzenie się ES następuje w wyniku wiązań wodorowych, oddziaływań elektrostatycznych, hydrofobowych, w niektórych przypadkach kowalencyjnych, wiązań koordynacyjnych między bocznymi rodnikami reszt aminokwasowych centrum aktywnego a grupami funkcyjnymi substratu. W enzymach złożonych funkcję kontaktu z substratem może pełnić także niebiałkowa część struktury.
Kompleks enzym-substrat następnie rozpada się w drugiej, wolniejszej, odwracalnej reakcji, tworząc produkt reakcji P i wolny enzym E:
ES<=>PE<=>E+P (2)
Obecnie, dzięki pracom wyżej wymienionych naukowców, a także Keilin D., Chance B., Koshland D. (teoria „indukowanej korespondencji”), istnieją teoretyczne zapisy dotyczące czterech głównych punktów mechanizmu działania enzymu na podłożu, które określają zdolność enzymów do przyspieszania reakcji chemicznych:
1. Orientacja i podejście . Enzym jest w stanie związać cząsteczkę substratu w taki sposób, że atakowane przez enzym wiązanie nie tylko znajduje się w bliskiej odległości od grupy katalitycznej, ale jest także odpowiednio względem niej zorientowane. Prawdopodobieństwo, że kompleks ES osiągnie stan przejściowy poprzez orientację i bliskość, znacznie wzrasta.
2. Stres i wysiłek : indukowana korespondencja. Przyłączenie substratu może powodować zmiany konformacyjne w cząsteczce enzymu, co prowadzi do napięć w strukturze centrum aktywnego, a także w pewnym stopniu deformuje związany substrat, ułatwiając w ten sposób osiągnięcie przez kompleks ES stanu przejściowego. Pomiędzy cząsteczkami E i S powstaje tak zwana korespondencja indukowana.
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYWNYCH
Vfr określa się na podstawie ilości substancji ulegającej przemianie w jednostce czasu. V tych reakcji zależy od wpływu czynników zewnętrznych (temperatura, pH, narażenie na związki naturalne i obce itp.).
Vfr jest miarą aktywności katalitycznej i jest po prostu określany jako aktywność enzymatyczna.
Aktywność enzymu można zmierzyć jedynie pośrednio:
1) o ilość przeliczonego S;
2) wzrost stężenia P w jednostce czasu.
Aby wyrazić stężenie enzymu, użyj:
a) jednostką miary enzymów jest ilość enzymu, która katalizuje konwersję 1 µmol S na minutę. [µmol/min];
b) 1 catal (cat) – ilość enzymów zdolna do spowodowania przemiany 1 mola S w P w ciągu 1 sekundy. [mol/s].
1 kot = 6×107E; 1E = 16,67 (n kot)
Aby wyrazić aktywność enzymu, użyj:
a) aktywność właściwa enzymów to liczba enzymów na 1 mg lub liczba kotów. na 1 kg białka;
b) aktywność molekularna lub liczba przemian to liczba cząsteczek S ulegających konwersji przez jedną cząsteczkę E w ciągu 1 minuty.
Jedna cząsteczka katalazy erytrocytów rozkłada 5 × 106 cząsteczek H2O2 w ciągu 1 minuty.
Specyfika działania enzymów
Pojęcie kompleksu ES i ACP jest ściśle związane ze szczególną właściwością enzymów – ich specyficznością. Według stopnia szczegółowości (w kolejności malejącej) wyróżnia się:
I. Stereochemiczna specyficzność substratowa – w tym przypadku enzymy katalizują tylko 1 formę S (1 izomer). Na przykład hydrataza fumaranowa katalizuje jedynie konwersję kwasu fumarowego, ale nie katalizuje konwersji jego izomeru, kwasu maleinowego.
II. Bezwzględna specyficzność substratowa - E jest przekształcane tylko przez 1S. Na przykład ureaza przekształca tylko mocznik.
III. Absolutna specyficzność grupy S. Enzymy działają na grupę podobnych S-b. Na przykład alkohol DG przetwarza nie tylko etanol, ale także inne alkohole alifatyczne.
IV. Względna specyficzność grupy S. Enzym nie działa na grupę cząsteczek S, ale na pewne wiązania pewnych grup S. Na przykład pepsyna i trypsyna są specyficzne dla wiązań peptydowych w różnych białkach.
V. Względna specyficzność S. Enzym katalizuje, przekształcając się w S-b, należące do różnych grup związków chemicznych. Na przykład enzym cytochrom-450 katalizuje reakcje hydroksylacji aż do 7000 różnych S-b. Jest to najmniej specyficzny układ enzymatyczny.
Istnieją dwie teorie wyjaśniające specyficzność enzymów.
Hipoteza E. Fishera jest hipotezą „klucza i zamka” lub hipotezą „szablonu”. Według Fischera enzym jest sztywną strukturą, której ACP jest dokładnym „odlewem” S. Jeśli S pasuje do E jak klucz do zamka, to reakcja nastąpi. Jeśli S zostanie nieznacznie zmienione („klucz”), to nie odpowiada ACF („zamek”) i reakcja staje się niemożliwa. Chociaż to wyjaśnienie jest logiczne, hipoteza Fishera nie wyjaśnia, na czym zatem opiera się bezwzględna i względna specyfika grupy. Na przykład cytochrom-450 łączy się z tak dużą liczbą S-b, różniącą się budową.
Te zewnętrzne sprzeczności wyjaśnia hipoteza Koshlanda lub hipoteza wymuszonej korespondencji. Według Koshlanda cząsteczka enzymu nie jest „sztywna”, ale elastyczna, struktura i konfiguracja enzymu oraz jego ACP zaczynają się zmieniać w momencie, gdy enzym przyłącza się do S lub innych ligandów. Podczas tworzenia kompleksu E-S oprócz komplementarności geometrycznej zachodzi także komplementarność elektrostatyczna, która zachodzi w wyniku parowania przeciwnie naładowanych cząsteczek E i S. W rzeczywistości najwyraźniej mają miejsce oba warianty addycji.
Hipoteza Koshlanda pozwala wyjaśnić, dlaczego zachodzi transformacja bliskich analogów S-in. Jeżeli „fałszywy” substrat (quasi-S) różni się od naturalnego i ACP przyjmuje konformację zbliżoną do prawdziwego substratu, to układ grup katalitycznych w takim kompleksie E-S umożliwi zajście reakcji. Enzym zdaje się nie zauważać tego „oszustwa”, chociaż reakcja nie przebiega tak szybko, jak w przypadku prawdziwego substratu. Jeżeli konfiguracja quasi-substratu nie pozwala na prawidłowe umiejscowienie grupy katalitycznej, to w tym przypadku reakcja nie będzie przebiegać. Te. jeśli zakres przegrupowań konformacyjnych ogranicza się do jednego możliwego, to enzym jest wysoce specyficzny, a jeśli możliwości przegrupowań ACP są duże, to enzym działa również na quasi-substraty.
Zależność Vfr od pH środowiska
Każdy enzym ma swoje optymalne pH, przy którym Vfr jest maksymalne. Odchylenie pH w tym czy innym kierunku prowadzi do zmniejszenia aktywności enzymu. Większość enzymów ma pH ~7,0, to znaczy odpowiada fizjologicznym wartościom pH.
Przy optymalnej wartości pH grupy funkcyjne ACP i samego S są w najkorzystniejszej formie wiązania. Niektóre enzymy mają optymalne pH, które znacznie różni się od wartości fizjologicznych, pepsyna jest w 100% aktywna przy pH = 1,5-2,5; arginaza – przy pH = 10.
Zależność Vfr od temperatury
Wraz ze wzrostem temperatury otoczenia Vfr wzrasta, osiągając optymalne wartości ~ 20-40°С dla większości enzymów.
Termolabilność enzymów jest związana ze strukturą ich białek: gdy temperatura wzrasta do 40-50°C i więcej, ulegają one denaturacji.
W przypadku niektórych enzymów denaturacja zachodzi w temperaturze 0°C.
W przypadku dowolnych reakcji chemicznych, przy wzroście temperatury na każde 10°C, V reakcji wzrasta 2-3 razy, w przypadku reakcji enzymatycznych współczynnik ten jest niższy - 2 lub nawet mniej. Wyjątek: termostabilny enzym cyklaza adenimianowa wytrzymuje temperatury 100°C, a enzym katalaza jest aktywny w temperaturze 0°C.
Zależność Vfr od stężenia. S.
Mechanizm działania enzymów opisuje równanie Michaelisa-Mentena. Zależność Vfr od [S] można ustalić graficznie.
a) zgodnie z krzywą Michaelisa: im mniejszy Km, tym większe Vm i tym większe powinowactwo E do S.
Vmax odpowiada stanowi całkowitego nasycenia enzymu S-obj.
w roztworze występuje nadmiar E (3 mol S, 5 mol E) jest to miejsce nasycenia enzymu S-vol.
b) metodę odwrotności Laincivera-Burka, gdzie zależność Vfr od [S] oblicza się w wielkościach odwrotnych.
Regulacja aktywności enzymów.
Enzymy są katalizatorami o kontrolowanej aktywności, więc Vfr można kontrolować za pomocą enzymów. Regulację działania można przeprowadzić poprzez oddziaływanie enzymów z różnymi składnikami biologicznymi lub związkami obcymi (lekami, truciznami), które nazywane są modyfikatorami. Jeżeli w obecności modyfikatora Vfr wzrasta, wówczas takie modyfikatory nazywane są aktywatorami, a jeśli maleje, nazywane są inhibitorami.
Aktywacja enzymów.
Istnieje kilka rodzajów aktywacji enzymów.
1. Aktywacja poprzez oddziaływanie na podjednostki cząsteczek enzymów. Niektóre enzymy mają SN w postaci 2 podjednostek: katalitycznej i regulacyjnej. Podczas zapisywania sytuacji awaryjnej ACF jest ukryty.
Na przykład wiele enzymów w organizmie wytwarzanych jest jako proenzymy lub zymogeny, to znaczy w stanie nieaktywnym. W razie potrzeby aktywowana jest określona ich liczba. Na przykład nieaktywny trypsynogen jest przekształcany w aktywną trypsynę przez enzym enterokinazę.
2. Jony wpływają na aktywację enzymów:
a) kationy - ich działanie jest bardziej specyficzne niż anionów. Same kationy mogą działać jako grupy prostetyczne w enzymach (Fe w cytochromie) lub poprzez swoją obecność wpływać na enzym, aktywując go. Na przykład anhydraza węglanowa jest aktywowana w obecności Zn+2.
b) aniony - działają mniej specyficznie i zwykle wpływają na 2. etap d.f. – rozpad kompleksu ES. Czasami jednak aniony są bezpośrednimi aktywatorami enzymów. Na przykład Cl– aktywuje nieaktywny pepsynogen i przekształca go w aktywną pepsynę.
3. Aktywacja poprzez ochronę enzymów przed dezaktywującym wpływem różnych wpływów. Zawiera specyficzne substancje zapobiegające negatywnemu wpływowi na enzymy.
Hamowanie enzymów.
Substancje powodujące częściowe lub całkowite hamowanie enzymów nazywane są inhibitorami (I). Inhibitory mają właściwość ścisłego wiązania się z enzymem. Na tej podstawie wyróżnia się hamowanie: odwracalne i nieodwracalne.
Przy odwracalnym hamowaniu I i E oddziałują. Jeśli inhibitor zostanie w jakiś sposób zneutralizowany (na przykład przez dializę), wówczas aktywność E zostanie przywrócona. Jeśli nie da się tego osiągnąć, mówimy o nieodwracalnym hamowaniu.
Odwracalne hamowanie
konkurencyjny niekonkurencyjny
Inhibicję konkurencyjną mogą powodować substancje o strukturze podobnej do prawdziwej S.
I i S konkurują o ACP, a kompleks z enzymem tworzy związek mający więcej cząsteczek. Albo I, albo S wiąże się z enzymem; dla takiego hamowania obowiązuje równanie: .
Podczas hamowania konkurencyjnego NIGDY nie tworzy się trójskładnikowy kompleks ESI i tym właśnie różni się ten typ hamowania od innych.
Na przykład bursztynian DG jest zawarty w gospodarstwach. Systemy CTK. Jego naturalnym S jest bursztynian. Inhibitorami mogą być szczawiooctan, malonian (quasi-substraty).
W nadmiarze inhibitor wiąże się w spolaryzowanych grupach z bursztynianem ACP DG.
Przy hamowaniu konkurencyjnym Vmax nigdy się nie zmienia, ale Km tak. Nachylenie krzywych w obecności I wzrasta, w wyniku czego wzrasta Km
Na podstawie wyników eksperymentu z wykorzystaniem krzywej Michaelisa-Mentena można ustalić konkurencyjny charakter I (poprzez zwiększenie Km i stabilność Vmax). Charakter tej krzywej wskazuje również, że proces jest odwracalny, to znaczy zwiększając [S], można skrócić czas do osiągnięcia Vmax.
Metoda hamowania konkurencyjnego znalazła szerokie zastosowanie w praktyce medycznej.
Kwas paraaminobenzoesowy i sulfonamid mają podobną strukturę. Komórka bakteryjna wykorzystuje p-ABA do syntezy kwasu foliowego, który jest składnikiem enzymów bakteryjnych. S/a blokuje działanie enzymów syntetyzujących kwas foliowy, w efekcie czego zatrzymuje się rozwój bakterii.
Hamowanie niekonkurencyjne jest hamowaniem odwracalnym, gdy I oddziałuje nie z ACP, ale z innymi grupami funkcyjnymi enzymów, czyli w tym przypadku nie mam strukturalnego podobieństwa do S. Dodatek takiego inhibitora zmniejsza aktywność enzymu, a nie jego powinowactwo do S, czyli inhibitor nie zmienia Km, ale zmniejsza max. Vfr.
Przy tego rodzaju hamowaniu powstają nieaktywne kompleksy o niskiej dysocjacji E I lub E I S. Na przykład działanie HCN, innych związków chemicznych wiążących jony Me lub inne grupy funkcyjne w cząsteczce enzymu.
Hamowanie mieszane (lub typ częściowo niekonkurencyjny) - spadek Vmax łączy się ze wzrostem Km.
W tym przypadku tworzy się kompleks EIS, a znajdujący się w nim S ulega powolnej przemianie katalitycznej.
Hamowanie substratu to spadek Vfr ze znacznym wzrostem [S]. Początkowo wraz ze wzrostem [S] Vfr rośnie, osiągając maksimum, ale wraz z dalszym wzrostem [S] Vfr zaczyna spadać.
Mechanizm hamującego działania nadmiaru S jest zróżnicowany. Najczęściej jest to oddziaływanie związków pośrednich E S z jedną lub większą liczbą cząsteczek S, w wyniku czego powstaje związek nieaktywny, a następnie
istnieje kompleks, który nie wytwarza produktów reakcji.
Metody regulacji aktywności enzymów
W żywym organizmie zachodzą jednocześnie reakcje syntezy, rozkładu i wzajemnej konwersji tysięcy różnych substancji. Wszystkie te liczne reakcje są regulowane w organizmie poprzez różne mechanizmy, z których najważniejsze to:
a) regulacja typu sprzężenia zwrotnego; zwykle charakterystyczne dla reakcji syntezy. Nagromadzenie produktów reakcji powyżej dopuszczalnego poziomu ma silne działanie hamujące na pierwszy etap procesu:
b) allosteryczna regulacja aktywności enzymów - charakterystyczna tylko dla specjalnej grupy enzymów z SN, które posiadają centra regulacyjne wiązania efektorów allosterycznych. Efektory ujemne hamują konwersję S i działają jako inhibitory allosteryczne. Natomiast efektory pozytywne przyspieszają Vfr, dlatego zalicza się je do aktywatorów allosterycznych.
Mechanizm działania inhibitorów allosterycznych na enzym polega na zmianie ACP tego enzymu. Spadek Vfr jest albo konsekwencją wzrostu Km, albo wynikiem spadku Vmax, przy tych samych nasycających stężeniach S. Przeciwnie, aktywatory allosteryczne ułatwiają konwersję S do ACP, czemu towarzyszy albo zmniejszenie Km, albo zwiększenie Vmax.
Kompartmentalizacja to zjawisko, w którym membrany służą do przestrzennego oddzielania
a) enzym z jego S (na przykład enzymy lizomalne z substancji, na które działają w cytoplazmie);
b) procesy, które są jednocześnie wzajemnie niezgodne. Synteza kwasów tłuszczowych zachodzi w rozpuszczalnej części cytoplazmy, a rozkład kwasów tłuszczowych następuje w mitochondriach.
Kinetyka reakcji enzymatycznych. Ta gałąź enzymologii bada wpływ czynników chemicznych i fizycznych na szybkość reakcji enzymatycznych. W 1913 roku Michaelis i Menten stworzyli teorię kinetyki enzymatycznej opartą na fakcie, że enzym (E) oddziałuje z substratem (S), tworząc pośredni kompleks enzym-substrat (ES), który dalej rozkłada się na enzym i produkt reakcji według równania:
Każdy etap interakcji między substratem a enzymem charakteryzuje się własnymi stałymi szybkości. Stosunek sumy stałych szybkości rozkładu kompleksu enzym-substrat do stałej szybkości tworzenia kompleksu enzym-substrat nazywany jest stałą Michaelisa (Km). Określają powinowactwo enzymu do substratu. Im niższa stała Michaelisa, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, tym większa szybkość katalizowanej przez niego reakcji. Na podstawie wartości Km reakcje katalityczne można podzielić na szybkie (Km 106 mol/l lub mniej) i wolne (Km 102 do 106).
Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od temperatury, środowiska reakcji, stężenia reagentów, ilości enzymu i innych czynników.
1. Rozważmy zależność szybkości reakcji od ilości enzymu. Pod warunkiem, że substratu jest nadmiar, szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości enzymu, ale przy nadmiarze enzymu wzrost szybkości reakcji będzie się zmniejszał, ponieważ substratu nie będzie już wystarczającej ilości.
2. Szybkość reakcji chemicznych jest proporcjonalna do stężenia reagujących substancji (prawo działania mas). Prawo to dotyczy również reakcji enzymatycznych, ale z pewnymi ograniczeniami. Na stałym
W przypadku dużych ilości enzymu szybkość reakcji jest rzeczywiście proporcjonalna do stężenia substratu, ale tylko w zakresie niskich stężeń. Przy dużych stężeniach substratu enzym ulega nasyceniu substratem, czyli przychodzi moment, w którym wszystkie cząsteczki enzymu są już zaangażowane w proces katalityczny i nie nastąpi wzrost szybkości reakcji. Szybkość reakcji osiąga poziom maksymalny (Vmax), po czym nie zależy już od stężenia substratu. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu należy wyznaczyć w tej części krzywej, która znajduje się poniżej Vmax. Technicznie łatwiej jest określić nie prędkość maksymalną, ale ½ Vmax. Parametr ten jest główną cechą reakcji enzymatycznej i umożliwia wyznaczenie stałej Michaelisa (Km).
Km (stała Michaelisa) to stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest o połowę mniejsza. Z tego wyprowadzamy równanie Michaelisa – Mentena określające szybkość reakcji enzymatycznej.
