24.11.202227.05.2017

] jednak definicja przeciwutleniaczy jako związków chemicznych nie daje pełnego obrazu właściwości ochronnych badanego obiektu: określa je nie tylko ilość tego czy innego przeciwutleniacza, ale także aktywność każdego z nich . Aktywność przeciwutleniająca lub aktywność przeciwutleniająca, AOA, to stała szybkości reakcji przeciwutleniacza z wolnym rodnikiem (kInH). Metoda chemiluminescencji (CL) pozwala określić całkowitą ilość rodników, jakie przeciwutleniacze wiążą w próbce (całkowita pojemność przeciwutleniająca, TAU), a przy zastosowaniu metody matematycznego modelowania kinetyki CL także szybkość powstawania i reakcji rodniki z przeciwutleniaczami, czyli AOA [ , , ].

Najpowszechniejsza modyfikacja metody chemiluminescencyjnej służącej do określenia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej opiera się na zastosowaniu luminolu jako aktywatora chemiluminescencji [ , , , ]. Próbkę umieszcza się w kuwecie chemiluminometru z dodatkiem luminolu, nadtlenku wodoru i związku zdolnego do wytwarzania rodników w wyniku samorzutnego rozkładu (termolizy), np. 2,2'-azobis-(2-amidynopropanu). dichlorowodorek (ABAP): ABAP → 2R. W obecności tlenu cząsteczkowego rodnik alkilowy R tworzy rodnik nadtlenkowy ROO: R + O 2 → ROO. Ponadto rodnik nadtlenkowy utlenia luminol (LH 2) sondy chemiluminescencyjnej i powstaje rodnik luminolowy (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . Z LH poprzez powstanie związków pośrednich (wodoronadtlenku luminolu i endonadtlenku luminolu) w stanie elektronowo wzbudzonym powstaje cząsteczka końcowego produktu utleniania luminolu, kwasu aminoftalowego, który emituje foton, w wyniku czego obserwuje się chemiluminescencję . Intensywność CL jest proporcjonalna do szybkości produkcji fotonów, która z kolei jest proporcjonalna do stacjonarnego stężenia LH w układzie. Oddziałując z rodnikami, przeciwutleniacze przerywają opisany łańcuch przemian i zapobiegają powstaniu fotonu.

Związki ulegające termolizie nie są jedynym możliwym źródłem rodników w analizie zdolności przeciwutleniającej próbki metodą chemiluminescencyjną. Alternatywami są układy peroksydaza chrzanowa – nadtlenek wodoru [ , ], hemina – nadtlenek wodoru, cytochrom Z–kardiolipina – nadtlenek wodoru itp. Schemat reakcji utleniania luminolu przez peroksydazy omawiają prace Cormiera i in. .

Krzywe kinetyczne CL dla tych układów odzwierciedlają dwa etapy reakcji: etap wzrostu intensywności CL i etap plateau lub stopniowego spadku luminescencji, gdy intensywność CL jest stała lub powoli maleje. W artykule opisano dwa podejścia do pomiaru całkowitej pojemności przeciwutleniającej, które uwzględniają tę cechę krzywych. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxyant Potential) opiera się na pomiarze okresu utajonego CL τ i można je stosować do oznaczania przeciwutleniaczy takich jak troloks czy kwas askorbinowy: charakteryzują się one dużą wartością stałej szybkości reakcji z rodnikami i dlatego można je nazwać silnymi przeciwutleniaczami. W okresie utajonym następuje ich całkowite utlenienie. Metoda TAR (Total Antioksydant Reactivity) mierzy stopień wygaszenia chemiluminescencji Q na plateau lub na maksimum krzywej chemiluminescencji: wzór , gdzie I to intensywność chemiluminescencji bez przeciwutleniacza, a I 1 to intensywność CL w obecności przeciwutleniacza. Metodę tę stosuje się, jeśli w układzie dominują słabe przeciwutleniacze o niskich stałych szybkości oddziaływania z rodnikami - znacznie niższych w porównaniu ze stałą luminolu.

Działanie przeciwutleniaczy charakteryzuje się nie tylko wskaźnikami τ I Q. Jak wynika z [ , ], wpływ takich przeciwutleniaczy jak kwas moczowy w układzie hemina–H2O2–luminol lub tokoferol, rutyna i kwercetyna w cytochromie Z–kardiolipina–H 2 O 2 –luminol, charakteryzujący się zmianą maksymalnego tempa wzrostu CL ( vmaks). Jak pokazują wyniki matematycznego modelowania kinetyki, wartości stałych szybkości oddziaływania tych przeciwutleniaczy z rodnikami są zbliżone do wartości stałej luminolu, dlatego takie przeciwutleniacze można nazwać przeciwutleniaczami o średniej sile.

Jeżeli badany materiał, w szczególności surowce roślinne, zawierał tylko jeden rodzaj przeciwutleniaczy, wówczas ich zawartość można scharakteryzować jednym z trzech wymienionych powyżej wskaźników ( τ , Q Lub vmaks). Surowce roślinne zawierają jednak mieszaninę przeciwutleniaczy o różnej mocy. Aby rozwiązać ten problem, niektórzy autorzy [ , , , ] wykorzystali zmianę sumy światła chemiluminescencji w pewnym czasie ∆S, obliczoną ze wzoru , gdzie ∆ S0 i ∆ SS- Sumy światła CL dla danego czasu T odpowiednio w próbce kontrolnej i badanej. Czas powinien być wystarczający do utlenienia wszystkich przeciwutleniaczy w układzie, czyli do tego, aby krzywa CL próbki badanej osiągnęła poziom krzywej CL próbki kontrolnej. To ostatnie sugeruje, że badacze powinni nie tylko rejestrować sumę światła luminescencji, ale także rejestrować krzywą kinetyki CL przez wystarczająco długi czas, co nie zawsze się robi.

Ponieważ wszystkie mierzone wskaźniki zależą od urządzenia i warunków pomiaru, działanie przeciwutleniające substancji w badanym układzie zwykle porównuje się z działaniem przeciwutleniacza przyjętego jako standard, na przykład Troloxu [ , ].

Wielu autorów stosowało układ peroksydaza chrzanowa – nadtlenek wodoru do analizy całkowitej zdolności przeciwutleniającej materiałów roślinnych. W pracach [ , ] do oszacowania ilości przeciwutleniaczy w próbkach wykorzystano okres utajony CL (metoda TRAP), natomiast w pracach [ , , ] wykorzystano pole pod krzywą rozwoju CL. Wymienione prace nie dostarczają jednak jednoznacznego uzasadnienia wyboru tego czy innego parametru szacowania TAU.

Celem badań było określenie, jak stosunek różnych typów przeciwutleniaczy wpływa na TAU oraz modyfikacja metody chemiluminescencji w taki sposób, aby móc dokładniej określić TAU w materiałach roślinnych. W tym celu postawiliśmy sobie kilka zadań. Po pierwsze, porównanie kinetyki CL badanych obiektów z kinetyką standardowych przeciwutleniaczy trzech typów (silnych, średnich i słabych), aby zrozumieć, który rodzaj przeciwutleniaczy wnosi główny wkład w TAE badanych obiektów. Po drugie, obliczenie RAE badanych obiektów poprzez pomiar spadku sumy światła CL pod wpływem tych obiektów w porównaniu z działaniem przeciwutleniacza, który zapewnia największy udział w TAC.

MATERIAŁY I METODY

Obiektem badań były przemysłowe próbki owoców głogu, jarzębiny i dzikiej róży produkowane przez Krasnogorskleksredstva JSC (Rosja) oraz owoce malin zebrane przez autorów w rejonie Moskwy w warunkach naturalnego wzrostu i suszone w temperaturze 60–80°C, aż przestaną wydzielać sok i odkształcenia ciśnieniowe.

Odczynnikami do analizy zdolności przeciwutleniającej metodą chemiluminescencyjną były: KH 2 PO 4, 20 mM roztwór buforowy (pH 7,4); peroksydaza z korzeni chrzanu (aktywność 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM roztwór wodny; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazynodion, hydrazyd kwasu 3-aminoftalowego, M=177,11), 1 mM roztwór wodny; nadtlenek wodoru (H2O2, M = 34,01), 1 mM roztwór wodny; roztwory przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy, kwercetyna, tokoferol). Wszystkie odczynniki zostały wyprodukowane przez firmę Sigma Aldrich (USA).

Wywary z owoców głogu, jarzębiny i dzikiej róży oraz napar z owoców malin przygotowano zgodnie z metodologią Farmakopei Państwowej ZSRR, określoną w ogólnym artykule farmakopealnym „Napary i wywary”.

Całkowitą zdolność przeciwutleniającą określono rejestrując chemiluminescencję na chemiluminometrze Lum-100 (DISoft, Rosja) przy użyciu oprogramowania PowerGraph 3.3. Do oznaczania TAU w surowcach roślinnych stosuje się 40 µl luminolu o stężeniu 1 mM, 40 µl peroksydazy chrzanowej o stężeniu 0,1 µM, od 10 do 50 µl wywaru lub naparu (w zależności od stężenia) oraz bufor fosforanowy w ilości potrzebnej do doprowadzenia całkowitej objętości próbki do 1 ml. W urządzeniu zainstalowano kuwetę i rejestrowano CL, obserwując sygnał tła. Po 48 s rejestracji sygnału tła do kuwety dodano 100 µl H2O2 o stężeniu 1 mM i rejestrację CL kontynuowano przez 10 min. Przygotowano cztery próbki o różnym stężeniu każdego z obiektów roślinnych. Rejestrowano także CL dla roztworów kwasu askorbinowego, kwercetyny i tokoferolu w pięciu różnych stężeniach każdego z przeciwutleniaczy. Następnie przeliczono TAU próbek wywarów i naparów dla kwercetyny.

Stężenia luminolu, peroksydazy chrzanowej i nadtlenku wodoru dobrano tak, aby w rozsądnym czasie (nie dłuższym niż 10 minut) określić zdolność przeciwutleniającą wodnych ekstraktów z leczniczych surowców roślinnych. W tym czasie krzywe chemiluminescencji dla przeciwutleniaczy askorbinianu i flawonoidu kwercetyny (głównych przeciwutleniaczy materiałów roślinnych) osiągnęły plateau, co wskazywało na całkowite zniszczenie przeciwutleniaczy w ustroju. Rozcieńczenia badanych próbek oraz stężenia roztworów przeciwutleniaczy wzorcowych (pokazane w podpisach pod rysunkami) dobrano tak, aby wszystkie krzywe kinetyczne CL mierzono przy tej samej czułości aparatu.

Zdolność przeciwutleniającą obliczono na podstawie zmiany powierzchni (∆ S) pod krzywą kinetyczną chemiluminescencji (suma światła) z dodatkiem substancji zawierającej przeciwutleniacz. W tym celu policzyliśmy S0 dla układu bez przeciwutleniacza i odjęto od niego powierzchnię SS charakteryzujący układ, do którego dodano przeciwutleniacz. Wartość ∆ S zależy od czułości chemiluminometru i warunków pomiaru. Stosunek ∆ S/C V(Gdzie C- stężenie badanego materiału biologicznego w kuwecie, g/l, oraz V- objętość kuwety, l) wyraża zdolność przeciwutleniającą 1 g badanego materiału, tj. surowców roślinnych.

Zdolność przeciwutleniająca ∆ SA roztwór standardowego przeciwutleniacza, takiego jak kwercetyna, umieszczony w tej samej objętości mieszaniny reakcyjnej. Stosunek ∆ SA/CAV(Gdzie C A- stężenie wagowe przeciwutleniacza w kuwecie, g/l) wyraża zdolność przeciwutleniającą 1 g przeciwutleniacza.

Dla każdego ze standardowych przeciwutleniaczy rejestrowano sygnał z roztworów o kilku stężeniach, aby mieć pewność, że obliczenia prowadzone są w granicach zależności liniowej, a uzyskane wyniki są powtarzalne. Rzeczywiście uzyskano liniową zależność (∆ SA = k A C A) sygnał ze stężenia, z którego obliczono współczynnik stechiometryczny k A. Według kryterium Fishera wartości uzyskane dla standardowych przeciwutleniaczy k A statystycznie istotne z prawdopodobieństwem 0,975. Następnie dla każdej z czterech próbek roślin rejestrowano sygnał z czterech stężeń i dla wszystkich próbek liniową zależność sygnału od stężenia (∆ S = k C), który posłużył do obliczenia współczynnika stechiometrycznego k. Z prawdopodobieństwem 0,975 (test Fischera) wartości k uzyskane dla próbek roślinnych są istotne statystycznie. Całkowitą pojemność przeciwutleniającą materiału roślinnego w przeliczeniu na masę standardowego przeciwutleniacza (mg%) określono ze wzoru .

Wartości przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (M ± δ) na p

WYNIKI BADANIA

Badanie kinetyki chemiluminescencji w obecności askorbinianu sodu (Rys. 1. Wpływ askorbinianu sodu na kinetykę chemiluminescencji" data-note="Stężenia składników układu: luminol - 40 µM, peroksydaza chrzanowa - 4 nM, nadtlenek wodoru - 100 µM. Krzywe: 1 - próbka kontrolna, 2 - 0,05 µM, 3 - 0,10 µM, 4 - 0,15 µM, 5 - 0,2 µM, 6 - 0,25 µM askorbinianu sodu Przeciwutleniacz charakteryzuje się okresem utajonym, w którym CL jest prawie całkowicie stłumiony.Jego czas trwania jest proporcjonalna do ilości przeciwutleniacza w ustroju. Jednocześnie nie zmienia się nachylenie krzywych CL ani intensywność CL na plateau. Dzieje się tak dlatego, że kwas askorbinowy jest silnym przeciwutleniaczem, który wychwytuje wszystkie rodniki utworzone w układzie, w tym rodniki luminolu, a CL nie rozwija się, dopóki cały askorbinian nie zostanie utleniony.

Inni badacze również wykazali, że wyniki analizy chemicznej i wartość TAU określona metodą chemiluminescencyjną często nie są ze sobą zgodne. W pracy całkowita pojemność antyoksydacyjna oznaczona w układzie peroksydaza–luminol–nadtlenek wodoru korelowała z zawartością związków triterpenowych. Natomiast w pracy tych samych autorów, w której przedmiotem badań była inna roślina, nie zaobserwowano korelacji pomiędzy TAU a zawartością jakiejkolwiek grupy substancji, w tym flawonoidów.

Rozbieżności te wynikają z co najmniej trzech czynników. Po pierwsze, istotna jest aktywność przeciwutleniaczy, czyli szybkość ich oddziaływania z rodnikami, która jest różna dla różnych przeciwutleniaczy wchodzących w skład próbki roślinnej. Według Izmailova stałe szybkości odpowiednich reakcji meksydolu, tokoferolu i kwercetyny są powiązane jako 0,04: 2: 60. Po drugie, każda cząsteczka przeciwutleniacza, wchodząc w reakcję chemiczną, może przechwycić inną liczbę rodników. Według pracy kwercetyna, kwas moczowy i askorbinowy przechwytywały odpowiednio 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 i 0,5 ± 0,2 rodników na przereagowaną cząsteczkę przeciwutleniacza (stosowano układ hemina–H 2 O 2) – luminol). Po trzecie, na wyniki badań mogła mieć wpływ obecność aktywności peroksydazy w samych próbkach roślin, podobnie jak w pracy, a także obecność w próbkach wapnia, który, jak wykazano w pracy, jest w stanie zwiększyć aktywność peroksydazy chrzanowej w określonych warunkach. Zwykle powoduje to większą intensywność CL na plateau niż na krzywych kontrolnych, czego jednak nie zaobserwowaliśmy.

Pierwszy czynnik mocno ogranicza stosowanie takiego parametru jak zmiana sumy światła, gdyż czas pomiaru chemiluminescencji powinien być dłuższy niż czas zużycia wszystkich przeciwutleniaczy w badanej próbce. Nadejście tego momentu można ocenić jedynie poprzez pomiar kinetyki chemiluminescencji. Ponadto udział słabych przeciwutleniaczy w OAE jest mocno niedoceniany, ponieważ czas ich całkowitego utlenienia jest wielokrotnie dłuższy niż dopuszczalny czas pomiaru (10–20 min).

Jeszcze większe znaczenie ma współczynnik stechiometryczny przeciwutleniacza. Liczba rodników N, przechwycone przez to, jest równe , gdzie ρ - współczynnik stechiometryczny i ∆ M- zmiana stężenia przeciwutleniacza w trakcie pomiaru, w naszym przypadku - początkowego stężenia substancji badanej w badanej próbce.

Różnica w sumie światła blasku przy braku przeciwutleniacza i w jego obecności jest proporcjonalna do N. Całkowita liczba przechwyconych rodników wynosi , gdzie ρi jest współczynnikiem stechiometrycznym konkretnego przeciwutleniacza, oraz ja- jego stężenie podczas pomiaru. Całkowita liczba przechwyconych rodników oczywiście nie jest równa całkowitej ilości przeciwutleniaczy, ponieważ współczynniki ρi nie tylko nie są równe jedności, ale także znacznie się różnią dla różnych przeciwutleniaczy.

Wartość N jest proporcjonalna do różnicy w sumach światła zmierzonych w określonym czasie pomiędzy próbką zawierającą przeciwutleniacz i próbką kontrolną niezawierającą przeciwutleniaczy: S = k n, Gdzie k- stały współczynnik w tych samych warunkach pomiaru.

Metoda rozważana w artykule pozwala określić całkowitą pojemność przeciwutleniającą, natomiast analiza chemiczna pozwala na określenie całkowitej zawartości przeciwutleniaczy w produkcie. Dlatego metoda chemiluminescencji wydaje się dostarczać większej ilości informacji niż analizy chemiczne.

Wybraliśmy warunki do oceny całkowitej zdolności antyoksydacyjnej surowców roślinnych poprzez rejestrację kinetyki chemiluminescencji w układzie składającym się z peroksydazy chrzanowej, nadtlenku wodoru i luminolu (stężenia składników odpowiednio 4 nM, 100 μM i 40 μM; bufor fosforanowy 20 mM , pH 7,4), zapewniał utlenianie silnych przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy) i umiarkowanych przeciwutleniaczy (kwercetyna) w ciągu 10 min. Taki czas trwania pomiaru jest wygodny i zapewnia wymaganą jakość pomiarów.

Analiza kinetyki chemiluminescencji wykazała, że w badanych obiektach (wywary z jarzębiny, dzikiej róży, owoców głogu i naparu z owoców malin) głównymi przeciwutleniaczami są przeciwutleniacze o średniej mocy, do których zaliczają się flawonoidy, oraz przeciwutleniacze o słabej mocy (tokoferol itp.). ). Na podstawie spadku sumy światła chemiluminescencji obliczono całkowitą zdolność antyoksydacyjną badanych obiektów. Porównanie uzyskanych wartości TAU z wynikami analiz chemicznych wykazało, że produkty zawierające tę samą ilość antyoksydantów w różnych proporcjach mogą różnić się zdolnością do skutecznej ochrony organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Opisana technika jest obiecująca w badaniu obiektów roślinnych zawierających mieszaninę różnych przeciwutleniaczy. Jednocześnie charakteryzuje się prostotą i niskim kosztem badań. Połączenie pomiaru kinetyki chemiluminescencji z matematycznym modelowaniem reakcji pozwoli nie tylko zautomatyzować proces wyznaczania TAU, ale także określić udział poszczególnych grup przeciwutleniaczy we wskaźniku.

Słowa kluczowe

wolny rodnik/przeciwutleniacz/ aktywność antyoksydacyjna / całkowita zdolność przeciwutleniająca / chemiluminescencja/ luminol / wolne rodniki / przeciwutleniacz / aktywność przeciwutleniająca / całkowita zdolność antyoksydacyjna / chemiluminescencja / luminol

adnotacja artykuł naukowy z zakresu nauk chemicznych, autor artykułu naukowego - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Surowce roślinne lecznicze są jednym ze źródeł przeciwutleniaczy dla organizmu człowieka. Wśród metod oznaczania zawartości przeciwutleniaczy w obiektach roślinnych szeroko rozpowszechniona jest metoda analizy chemiluminescencyjnej. W niniejszej pracy wykorzystano ją do oszacowania całkowita zdolność przeciwutleniająca(OAU) wywary z owoców jarzębiny, dzikiej róży i głogu oraz napar z owoców malin. W doświadczeniu zarejestrowano kinetykę chemiluminescencja w układzie składającym się z peroksydazy chrzanowej, nadtlenku wodoru i luminolu. Stężenia i objętości składników układu w próbce dobrano tak, aby w czasie pomiaru (10 min) silne przeciwutleniacze (kwas askorbinowy) i średnio silne przeciwutleniacze (kwercetyna) uległy całkowitemu utlenieniu. Zaproponowano i uzasadniono metodę obliczania TAU w oparciu o zmianę sumy światła. chemiluminescencja w obecności próbek roślinnych. Analiza kinetyczna chemiluminescencja wykazały, że w badanych obiektach dominują przeciwutleniacze o średniej sile, do których zaliczają się flawonoidy, oraz przeciwutleniacze słabe (tokoferol itp.). Porównanie obliczonych wartości TAU dla badanych obiektów z danymi z ich analizy chemicznej wykazało, że produkty zawierające tę samą ilość przeciwutleniaczy w różnych proporcjach ze względu na rodzaj mogą różnić się zdolnością do ochrony organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Opisana technika jest obiecująca w badaniu obiektów roślinnych zawierających mieszaninę różnego rodzaju przeciwutleniaczy.

Powiązane tematy prace naukowe z zakresu nauk chemicznych, autor pracy naukowej - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Oznaczanie przeciwutleniaczy metodą aktywowanej chemiluminescencji przy użyciu 2,2"-azo-bis(2-amidynopropanu)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Władimirow Yu.A.
Przeciwutleniające działanie dihydrokwercetyny i rutyny w reakcjach peroksydazowych katalizowanych przez cytochrom c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Władimirow Yu.A.
Ocena zdolności utleniającej i przeciwutleniającej substratów biologicznych metodą chemiluminescencji indukowanej reakcją Fentona
2016 / Piskarev Igor Michajłowicz, I.P. Iwanowa
Oznaczanie zawartości lipowodoronadtlenków w lipoproteinach surowicy krwi za pomocą układu mikroperoksydaza-luminol
2011 / Teselkin Jurij Olegowicz, Babenkowa Irina Władimirowna
Metody badania przeciwutleniaczy
2004 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V.
Aktywność przeciwutleniająca roślin stosowanych w etnomedycynie Tuwy
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Badanie właściwości przeciwutleniających Fosprenilu w różnych biologicznych systemach testowych
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu Sanina, A. D. Agafonova
Wpływ różnych dawek polichlorowanych bifenyli na stan samoistnej i indukowanej immunoglobuliną chemiluminescencji zależnej od luminolu krwi pełnej
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samohodova O.V.
Ocena układu peroksydacji lipidów w ochronie antyoksydacyjnej u dzieci z pierwotnym nadciśnieniem tętniczym metodami spektrofotometrii i chemiluminescencji
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Chemiluminescencyjne oznaczanie całkowitej zdolności przeciwutleniającej w materiale roślin leczniczych

Surowiec roślinny leczniczy jest jednym ze źródeł przeciwutleniaczy dla organizmu człowieka. Analiza chemiluminescencyjna jest jedną z powszechnych metod oznaczania zawartości przeciwutleniaczy w materiałach roślinnych. W naszej pracy wykorzystano analizę chemiluminescencyjną do określenia całkowitej pojemności antyoksydacyjnej (TAC) wywarów owocowych z jarzębiny, róży i głogu oraz naparu z owoców malin. W ramach eksperymentów ustalono kinetykę chemiluminescencji układu składającego się z peroksydazy chrzanowej, nadtlenku wodoru i luminolu. Stężenia i objętości składników układu dobierano tak, aby podczas pomiaru (10 minut) silne przeciwutleniacze (kwas askorbinowy) i przeciwutleniacze o średniej sile (kwercetyna) uległy całkowitemu utlenieniu. Zaproponowano i uzasadniono metodę obliczania TAC w oparciu o zmiany sumy światła chemiluminescencji w obecności próbek roślinnych. Analiza kinetyki chemiluminescencji wykazała, że w badanych obiektach dominują przeciwutleniacze o średniej sile, do których zaliczają się flawonoidy oraz przeciwutleniacze słabe (tokoferol i inne). Porównanie obliczonych wartości TAC dla badanych obiektów i danych z ich analizy chemicznej wykazało, że produkty zawierające tę samą ilość przeciwutleniaczy przy różnych proporcjach przeciwutleniaczy według rodzaju mogą różnić się zdolnością do ochrony organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników . Opisana technika jest obiecująca w badaniu obiektów roślinnych zawierających mieszaninę różnych rodzajów przeciwutleniaczy.

Tekst pracy naukowej na temat „Metoda chemiluminescencyjna określania całkowitej zdolności przeciwutleniającej w surowcach roślin leczniczych”

Chemiluminescencyjna metoda oznaczania całkowitej pojemności przeciwutleniającej w materiałach roślin leczniczych

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Katedra Biofizyki Medycznej, Wydział Medycyny Podstawowej, Moskiewski Uniwersytet Państwowy im. Łomonosowa, Moskwa

2 Katedra Farmakognozji, Wydział Farmaceutyczny,

I. M. Sechenov Pierwszy Moskiewski Państwowy Uniwersytet Medyczny w Moskwie

Surowce roślinne lecznicze są jednym ze źródeł przeciwutleniaczy dla organizmu człowieka. Wśród metod oznaczania zawartości przeciwutleniaczy w obiektach roślinnych rozpowszechniona jest metoda analizy chemiluminescencji. W niniejszej pracy wykorzystano ją do oceny całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (TOA) wywarów z owoców jarzębiny, dzikiej róży i głogu oraz naparu z owoców malin. W doświadczeniu rejestrowano kinetykę chemiluminescencji w układzie składającym się z peroksydazy chrzanowej, nadtlenku wodoru i luminolu. Stężenia i objętości składników układu w próbce dobrano tak, aby w czasie pomiaru (10 min) silne przeciwutleniacze (kwas askorbinowy) i średnio silne przeciwutleniacze (kwercetyna) uległy całkowitemu utlenieniu. Zaproponowano i uzasadniono metodę obliczania RAE w oparciu o zmianę sumy światła chemiluminescencji w obecności próbek roślinnych. Analiza kinetyki chemiluminescencji wykazała, że w badanych obiektach dominują przeciwutleniacze umiarkowanie silne, do których zaliczają się flawonoidy, oraz przeciwutleniacze słabe (tokoferol itp.). Porównanie obliczonych wartości TAU dla badanych obiektów z danymi z ich analizy chemicznej wykazało, że produkty zawierające tę samą ilość przeciwutleniaczy w różnych proporcjach ze względu na rodzaj mogą różnić się zdolnością do ochrony organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Opisana technika jest obiecująca w badaniu obiektów roślinnych zawierających mieszaninę różnego rodzaju przeciwutleniaczy.

Słowa kluczowe: wolne rodniki, przeciwutleniacz, aktywność przeciwutleniająca, całkowita pojemność antyoksydacyjna, chemiluminescencja, luminol

Finansowanie: Praca ta została wsparta przez Rosyjską Fundację Nauki, grant nr 14-15-00375.

Ex3 Korespondencję należy kierować na adres: Georgy Konstantinovich Vladimirov

119192, Moskwa, Łomonosowski pr-t, 31, budynek 5; [e-mail chroniony]

Artykuł wpłynął: 10.03.2016 Artykuł przyjęty do publikacji: 18.03.2016

chemiluminescencyjne oznaczanie całkowitej zdolności przeciwutleniającej w materiale roślin leczniczych

1 Katedra Biofizyki Medycznej, Wydział Medycyny Podstawowej, Moskiewski Uniwersytet Państwowy im. Łomonosowa, Moskwa, Rosja

2 Katedra Farmakognozji, Wydział Farmaceutyczny,

Pierwszy Moskiewski Państwowy Uniwersytet Medyczny im. Sieczenowa w Moskwie, Rosja

Słowa kluczowe: wolne rodniki, przeciwutleniacz, aktywność przeciwutleniająca, całkowita pojemność antyoksydacyjna, chemiluminescencja, luminol

Finansowanie: praca została wsparta przez Rosyjską Fundację Nauki, grant nr. 14-15-00375.

Podziękowania: autorzy dziękują Andriejowi Aleksiejewowi z Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego im. Łomonosowa za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentu. Korespondencję należy kierować na adres: Jerzy Władimirow

Prospekt Łomonosowski, zm. 31, k. 5, Moskwa, Rosja, 119192; ur [e-mail chroniony] Otrzymano: 10.03.2016 Zaakceptowano: 18.03.2016

Powstające w organizmie wolne rodniki zakłócają strukturę błon komórkowych, co z kolei prowadzi do rozwoju różnych stanów patologicznych. Niszczycielskiemu działaniu oksydacyjnemu rodników zapobiega system obrony antyoksydacyjnej organizmu, w którym ważną rolę odgrywają związki niskocząsteczkowe – wychwytywacze rodników (pułapki). Jednym ze źródeł antyoksydantów są lecznicze surowce roślinne, a także preparaty na ich bazie, których badanie potencjału przeciwutleniającego pozwala zwiększyć ich działanie profilaktyczne i lecznicze.

W pracach rozważane są główne metody oznaczania przeciwutleniaczy, jednak definicja przeciwutleniaczy jako związków chemicznych nie daje pełnego obrazu właściwości ochronnych badanego obiektu: określa się je nie tylko ilością tego czy innego przeciwutleniacza , ale także działalnością każdego z nich. Aktywność przeciwutleniająca lub aktywność przeciwutleniająca, AOA, to stała szybkości reakcji przeciwutleniacza z wolnym rodnikiem (kInH). Metoda chemiluminescencji (CL) pozwala określić całkowitą ilość rodników, jakie przeciwutleniacze wiążą w próbce (całkowita pojemność przeciwutleniająca, TAU), a przy zastosowaniu metody matematycznego modelowania kinetyki CL także szybkość powstawania i reakcji rodniki z przeciwutleniaczami, czyli AOA.

Najpopularniejsza modyfikacja metody chemiluminescencyjnej służącej do określenia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej polega na zastosowaniu luminolu jako aktywatora chemiluminescencji. Próbkę z dodatkiem luminolu, nadtlenku wodoru i związku zdolnego do wytwarzania rodników w wyniku samorzutnego rozkładu (termolizy), np. dichlorowodorku 2,2"-azobis-(2-amidynopropanu) (ABAP) umieszcza się w ogniwo chemiluminometru:

W obecności tlenu cząsteczkowego rodnik alkilowy R^ tworzy rodnik nadtlenkowy ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Z LH, poprzez utworzenie substancji pośrednich (wodoronadtlenku luminolu i endonadtlenku luminolu), w stanie elektronowo wzbudzonym powstaje cząsteczka końcowego produktu utleniania luminolu, kwasu aminoftalowego, która emituje foton , w wyniku czego obserwuje się chemiluminescencję . Intensywność CL jest proporcjonalna do szybkości produkcji fotonów, która z kolei jest proporcjonalna do stacjonarnego stężenia LH w układzie. Oddziałując z rodnikami, przeciwutleniacze przerywają opisany łańcuch przemian i zapobiegają powstaniu fotonu.

Związki ulegające termolizie nie są jedynym możliwym źródłem rodników w analizie zdolności przeciwutleniającej próbki metodą chemiluminescencyjną. Alternatywami są układy peroksydaza chrzanowa-nadtlenek wodoru, hemina-nadtlenek wodoru, cytochrom c-kardiolipina-nadtlenek wodoru itp. Schemat reakcji utleniania luminolu przez peroksydazy rozważany jest w pracy Cormiera i in. .

Krzywe kinetyczne CL dla tych układów odzwierciedlają dwa etapy reakcji: etap wzrostu intensywności CL i etap plateau lub stopniowego spadku luminescencji, gdy

Intensywność CL jest stała lub powoli maleje. W artykule opisano dwa podejścia do pomiaru całkowitej pojemności przeciwutleniającej, które uwzględniają tę cechę krzywych. Metoda TRAP (Total Reactive Antioksydant Potential) opiera się na pomiarze okresu utajenia CL t i może być wykorzystana do oznaczania przeciwutleniaczy takich jak trolox czy kwas askorbinowy: charakteryzują się one dużą stałą szybkości reakcji z rodnikami i z tego powodu mogą nazwać silnymi przeciwutleniaczami. . W okresie utajonym następuje ich całkowite utlenienie. Metoda TAR (całkowita reaktywność antyoksydacyjna) mierzy stopień wygaszenia chemiluminescencji q na plateau lub na maksimum krzywej chemiluminescencji:

gdzie I to intensywność chemiluminescencji bez przeciwutleniacza, a 11 to intensywność CL w obecności przeciwutleniacza. Metodę tę stosuje się, jeśli w układzie dominują słabe przeciwutleniacze o niskich stałych szybkości oddziaływania z rodnikami - znacznie niższych w porównaniu ze stałą luminolu.

Działanie przeciwutleniaczy charakteryzuje się nie tylko wskaźnikami t i c. Jak wynika z prac, działanie takich przeciwutleniaczy jak kwas moczowy w układzie hemina-H2O2-luminol czy tokoferol, rutyna i kwercetyna w układzie cytochrom c-kardiolipina-H202-luminol charakteryzuje się zmianą maksymalnego tempa wzrostu CL (utx). Jak pokazują wyniki matematycznego modelowania kinetyki, wartości stałych szybkości oddziaływania tych przeciwutleniaczy z rodnikami są zbliżone do wartości stałej luminolu, dlatego takie przeciwutleniacze można nazwać przeciwutleniaczami o średniej sile.

DE = DE0 - DE,

gdzie DE0 i DE5 to sumy światła CL w danym czasie? odpowiednio w próbce kontrolnej i badanej. Czas powinien być wystarczający do utlenienia wszystkich przeciwutleniaczy w układzie, czyli do tego, aby krzywa CL próbki badanej osiągnęła poziom krzywej CL próbki kontrolnej. To ostatnie sugeruje, że badacze powinni nie tylko rejestrować sumę światła luminescencji, ale także rejestrować krzywą kinetyki CL przez wystarczająco długi czas, co nie zawsze się robi.

Ponieważ wszystkie mierzone wskaźniki zależą od instrumentu i warunków pomiaru, działanie przeciwutleniające substancji w badanym układzie jest zwykle porównywane z działaniem przeciwutleniacza przyjętego jako standard, na przykład Trolox.

Do analizy całkowitej zdolności antyoksydacyjnej surowców roślinnych przez wielu autorów stosowano układ peroksydaza chrzanowa-nadtlenek wodoru. W pracach do oszacowania ilości przeciwutleniaczy w próbkach wykorzystano okres utajony CL (metoda TRAP), a w pracach pole pod krzywą rozwoju CL. Prace te nie dostarczają jednak jednoznacznego uzasadnienia

wybór jednego lub drugiego parametru do oszacowania OAU.

Celem badań było określenie, jak stosunek różnych typów przeciwutleniaczy wpływa na TAU oraz modyfikacja metody chemiluminescencji w taki sposób, aby móc dokładniej określić TAU w materiałach roślinnych. W tym celu postawiliśmy sobie kilka zadań. Po pierwsze, porównanie kinetyki CL badanych obiektów z kinetyką standardowych przeciwutleniaczy trzech typów (silnych, średnich i słabych), aby zrozumieć, który rodzaj przeciwutleniaczy wnosi główny wkład w TAE badanych obiektów. Po drugie, obliczenie TAE badanych obiektów poprzez pomiar spadku sumy światła CL pod wpływem tych obiektów w porównaniu z działaniem przeciwutleniacza, który zapewnia największy udział w TAE.

MATERIAŁY I METODY

Obiektem badań były przemysłowe próbki owoców głogu, jarzębiny i dzikiej róży produkowane przez firmę Krasnogorskleksredstva JSC (Rosja) oraz owoce malin zebrane przez autorów w rejonie Moskwy w warunkach naturalnego wzrostu i suszone w temperaturze 60°C. -80°C do czasu, aż przestaną wydzielać sok i odkształcenia ciśnieniowe.

Odczynnikami do analizy zdolności antyoksydacyjnej metodą chemiluminescencyjną były: KH2PO4, 20 mM roztwór buforowy (pH 7,4); peroksydaza z korzeni chrzanu (aktywność 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM roztwór wodny; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazynodion, hydrazyd kwasu 3-aminoftalowego, M=177,11), 1 mM roztwór wodny; nadtlenek wodoru (H2O2, M = 34,01), 1 mM roztwór wodny; roztwory przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy, kwercetyna, tokoferol). Wszystkie odczynniki zostały wyprodukowane przez firmę Sigma Aldrich (USA).

osiągnął plateau, co wskazywało na całkowite zniszczenie przeciwutleniaczy w ustroju. Rozcieńczenia badanych próbek oraz stężenia roztworów przeciwutleniaczy wzorcowych (wskazane w podpisach rysunków) zostały dobrane w taki sposób, aby wszystkie krzywe kinetyczne CL mierzono przy tej samej czułości instrumentu.

Zdolność przeciwutleniającą obliczono na podstawie zmiany pola powierzchni (AS) pod krzywą kinetyki chemiluminescencji (suma światła) po dodaniu substancji zawierającej przeciwutleniacz. W tym celu obliczyliśmy S0 dla układu bez przeciwutleniacza i odjęliśmy od niego pole powierzchni SS charakteryzujące układ, do którego dodano przeciwutleniacz. Wartość AS zależy od czułości chemiluminometru i warunków pomiaru. Stosunek AS/C ▪ V (gdzie C to stężenie badanego materiału biologicznego w kuwecie, g/l, a V to objętość kuwety, l) wyraża zdolność antyoksydacyjną 1 g badanego materiału, tj. , materiał roślinny.

W podobny sposób obliczono pojemność przeciwutleniającą ASa roztworu standardowego przeciwutleniacza, np. kwercetyny, umieszczonego w tej samej objętości mieszaniny reakcyjnej. Stosunek AS/CĘ V (gdzie CA oznacza stężenie wagowe przeciwutleniacza w kuwecie, g/l) wyraża zdolność przeciwutleniającą 1 g przeciwutleniacza.

Dla każdego ze standardowych przeciwutleniaczy rejestrowano sygnał z roztworów o kilku stężeniach, aby mieć pewność, że obliczenia prowadzone są w granicach zależności liniowej, a uzyskane wyniki są powtarzalne. Rzeczywiście uzyskano liniową zależność (ASa = kA ─ CA) sygnału od stężenia, z której obliczono współczynnik stechiometryczny kA. Zgodnie z kryterium Fishera wartości kA uzyskane dla standardowych przeciwutleniaczy są istotne statystycznie z prawdopodobieństwem 0,975. Następnie dla każdej z czterech próbek roślin rejestrowano sygnał z czterech stężeń i dla wszystkich próbek uzyskano liniową zależność sygnału od stężenia (AS = k·C), z czego obliczono współczynnik stechiometryczny k. Z prawdopodobieństwem 0,975 (test Fischera) wartości k uzyskane dla próbek roślinnych są istotne statystycznie. Całkowitą pojemność przeciwutleniającą materiału roślinnego w przeliczeniu na masę standardowego przeciwutleniacza (mg%) określono ze wzoru

OAU = k ■ 105. k

Wartości przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (M ± 5) na p<0,05.

WYNIKI BADANIA

Badanie kinetyki chemiluminescencji w obecności askorbinianu sodu (ryc. 1) wykazało, że przeciwutleniacz ten charakteryzuje się okresem utajonym, kiedy CL jest prawie całkowicie stłumiony. Czas jego trwania jest proporcjonalny do ilości przeciwutleniacza w ustroju. W tym przypadku nie zmienia się ani nachylenie krzywych CL, ani intensywność CL na plateau. Wyjaśnia to fakt, że kwas askorbinowy jest silnym przeciwutleniaczem, który przechwytuje wszystkie rodniki powstałe w ustroju, w tym rodniki luminolu, a CL nie rozwija się, dopóki cały askorbinian nie zostanie utleniony.

Działanie tokoferolu (ryc. 2) objawiało się spadkiem intensywności CL na plateau, co jest charakterystyczne dla słabych antyoksydantów, choć tokoferol uznawany jest za jeden z najbardziej

silne przeciwutleniacze. Być może rozbieżność ta wynika z faktu, że w naszym eksperymencie wolne rodniki znajdowały się w roztworze wodnym, podczas gdy działanie tokoferolu bada się zwykle w ośrodkach niepolarnych. W pracy, w której źródłem rodników był kompleks cytochromu c z kardiolipiną, a w obrębie tego kompleksu zachodziła reakcja z luminolem, tokoferol wykazywał właściwości przeciwutleniacza o średniej sile.

Po zbadaniu wpływu różnych stężeń kwercetyny na nasz organizm (ryc. 3) i porównaniu krzywych kinetycznych dla niej oraz askorbinianu sodu i tokoferolu można zauważyć, że główne działanie kwercetyny objawia się zmianą nachylenia nachylenia krzywe, czyli tempo rozwoju CL, które jest typowe dla umiarkowanych przeciwutleniaczy.

Krzywe CL dla wszystkich badanych wywarów (ryc. 4) przypominają krzywe dla kwercetyny z niewielkim spadkiem intensywności CL na końcu, tj. po osiągnięciu

Czas, min

Ryż. 1. Wpływ askorbinianu sodu na kinetykę chemiluminescencji

Stężenia składników układu: luminol – 40 µM, peroksydaza chrzanowa – 4 nM, nadtlenek wodoru – 100 µM. Krzywe: 1 - próbka kontrolna; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM askorbinian sodu.

Płaskowyż. Jak wykazano w pracy, takie zachowanie jest typowe dla przeciwutleniaczy o średniej sile, do których w naszym przypadku zaliczają się polifenole – flawonoidy i garbniki. W przypadku naparu z owoców malin (ryc. 4, D) zauważalny jest spadek chemiluminescencji na poziomie plateau, co jest typowe dla słabych przeciwutleniaczy, którymi w tym przypadku jest tokoferol. Pod względem kwercetyny i tokoferolu napar z owoców malin zawiera 4,7 ± 0,9 µmol/g kwercetyny i 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferolu.

Porównując krzywe chemiluminescencji uzyskane dla różnych stężeń czterech badanych ekstraktów wodnych z surowców roślinnych, wykazano, że udział średnich i słabych antyoksydantów w całkowitej pojemności antyoksydacyjnej próbek zmniejszał się w następującej kolejności: napar z owoców malin (ryc. 4, D), wywar z owoców dzikiej róży (ryc. 4, C), wywar z owoców jarzębiny (ryc. 4, A), wywar z owoców głogu (ryc. 4, B). W tabeli przedstawiono wartości AS w przeliczeniu na stężenie C badanej substancji w kuwecie oraz wartości całkowitej pojemności przeciwutleniającej w przeliczeniu na kwercetynę.

DYSKUSJA WYNIKÓW

Dane uzyskane w trakcie eksperymentów oraz obliczone na ich podstawie wartości TAU badanych obiektów porównano z zawartością w nich głównych przeciwutleniaczy, oznaczoną metodami analizy chemicznej. Pomimo tego, że dodatnia korelacja pomiędzy całkowitą ilością przeciwutleniaczy i TAU w różnych obiektach jest niezaprzeczalna, zauważalne są różnice pomiędzy tymi wskaźnikami. Przykładowo, jeśli weźmiemy sumę zawartości flawonoidów, garbników i kwasu askorbinowego, to okaże się, że jest to więcej niż obliczone TAU dla wszystkich badanych obiektów, z wyjątkiem wywaru z owoców głogu (tabela).

Inni badacze również wykazali, że wyniki analizy chemicznej i wartość TAU określona metodą chemiluminescencyjną często nie są ze sobą zgodne. W pracy określono całkowitą zdolność przeciwutleniającą

46 Czas, min

Ja" "h chi----.

Ryż. 2. Wpływ tokoferolu na kinetykę chemiluminescencji

Stężenia składników układu: luminol – 40 µM, peroksydaza chrzanowa – 4 nM, nadtlenek wodoru – 100 µM. Krzywe: 1 - próbka kontrolna; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - 0,2 μM tokoferolu.

46 Czas, min

Ryż. Ryc. 3. Wpływ kwercetyny na kinetykę chemiluminescencji. Stężenia składników układu: luminol – 40 µM, peroksydaza chrzanowa – 4 nM, nadtlenek wodoru – 100 µM. Krzywe: 1 - próbka kontrolna; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 μM; 4 - 0,04 μM; 5 - 0,05 µM; 6 - 0,06 μM kwercetyny.

Czas, min

46 Czas, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Czas, min

Ryż. Ryc. 4. Wpływ wywarów z owoców jarzębiny (A), głogu (B), dzikiej róży (C) i naparu z owoców malin (D) na kinetykę chemiluminescencji. (A) Krzywe: 1 - próbka kontrolna; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l wywaru z owoców jarzębiny. (B) Krzywe: 1 – próbka kontrolna; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l wywar z owoców głogu. (C) Krzywe: 1 – próbka kontrolna; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l wywar z dzikiej róży. (D) Krzywe: 1 – próbka kontrolna; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l naparu z malin.

w układzie peroksydaza-luminol-nadtlenek wodoru skorelowana z zawartością związków triterpenowych. Natomiast w pracy tych samych autorów, w której przedmiotem badań była inna roślina, nie zaobserwowano korelacji pomiędzy TAU a zawartością jakiejkolwiek grupy substancji, w tym flawonoidów.

Rozbieżności te wynikają z co najmniej trzech czynników. Po pierwsze, istotna jest aktywność przeciwutleniaczy, czyli szybkość ich oddziaływania z rodnikami, która jest różna dla różnych przeciwutleniaczy wchodzących w skład próbki roślinnej. Według Izmailova stałe szybkości odpowiednich reakcji meksydolu, tokoferolu i kwercetyny są powiązane jako 0,04: 2: 60. Po drugie, każda cząsteczka przeciwutleniacza, wchodząc w reakcję chemiczną, może przechwycić inną liczbę rodników. Jak wynika z pracy, kwasy kwercetyna, moczowy i askorbinowy przechwytywały odpowiednio 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 i 0,5 ± 0,2 rodników na przereagowaną cząsteczkę przeciwutleniacza (stosowano układ gemin-H2O2-luminol). Po trzecie, na wyniki badań mogła mieć wpływ obecność aktywności peroksydazy w samych próbkach roślin, podobnie jak w pracy, a także obecność w próbkach wapnia, który, jak wykazano w pracy, jest w stanie zwiększyć aktywność peroksydazy chrzanowej w określonych warunkach. Zwykle skutkuje to więcej

wyższe natężenie CL na plateau niż na krzywych kontrolnych, czego jednak nie zaobserwowaliśmy.

Jeszcze większe znaczenie ma współczynnik stechiometryczny przeciwutleniacza. Liczba rodników n przechwyconych przez nie jest równa

gdzie p jest współczynnikiem stechiometrycznym, a Am jest zmianą stężenia przeciwutleniacza podczas pomiaru, w naszym przypadku początkowego stężenia substancji badanej w badanej próbce.

Różnica sumy światła luminescencji przy braku przeciwutleniacza i w jego obecności jest proporcjonalna do n. Całkowita liczba przechwyconych rodników wynosi n = Y.p. M,

gdzie jest współczynnikiem stechiometrycznym konkretnego przeciwutleniacza, a m jest jego stężeniem podczas zmiany

Obiekt badania Flawonoidy, mg%* Garbniki, mg%* Kwas askorbinowy, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. jednostki OAU, mg% kwercetyny

Wywar z owoców jarzębiny 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Wywar z dzikiej róży 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Wywar z owoców głogu 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Napar z suszonych malin 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Uwaga: * - dane literackie, . AS - zmiana sumy światła dla próbki, rel. jednostki, C - stężenie próbki w kuwecie, g/l. Obliczone wartości są wiarygodne w p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

ren. Całkowita liczba przechwyconych rodników nie jest oczywiście równa całkowitej ilości przeciwutleniaczy, ponieważ współczynniki pt nie tylko nie są równe jedności, ale także różnią się istotnie dla różnych przeciwutleniaczy.

Wartość n jest proporcjonalna do różnicy w sumach światła zmierzonych w określonym czasie pomiędzy próbką zawierającą przeciwutleniacz i próbką kontrolną nie zawierającą przeciwutleniaczy:

gdzie k jest współczynnikiem, który jest stały w tych samych warunkach pomiaru.

Warunki wybraliśmy do oceny całkowitej zdolności antyoksydacyjnej surowców roślinnych poprzez rejestrację kinetyki chemiluminescencji w układzie składającym się z peroksydazy chrzanowej, nadtlenku wodoru i luminolu (stężenia składników wynoszą odpowiednio 4 nM, 100 μM i 40 μM; 20 mM bufor fosforanowy, pH 7,4),

zapewnia utlenianie silnych przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy) i umiarkowanych przeciwutleniaczy (kwercetyna) w ciągu 10 min. Taki czas trwania pomiaru jest wygodny i zapewnia wymaganą jakość pomiarów.

Literatura

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Wolne rodniki jako uczestnicy procesów regulacyjnych i patologicznych. W: Grigoriev A. I., Władimirow Yu. A., red. Nauki podstawowe - medycyna. Biofizyka. Miód. technologia Moskwa: MAKS Press; 2015. tom 1. s. 38-71.

3. Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V. Metody badania przeciwutleniaczy. Chem. rast. surowy materiał. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Batovska D. I., Trofimov A. V. Aktywność przeciwutleniająca chalkonu. Chemiluminescencyjne oznaczanie reaktywności oraz kwantowo-chemiczne obliczanie energii i struktur odczynników i półproduktów. Kinetyka i kataliza. 2010; 51 ust. 4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil „ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

Chemiluminescencja za pośrednictwem rodników: różnorodność mechanistyczna i podstawy testu antyoksydacyjnego. Arkivoc. 2007; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Ocena zdolności przeciwrodnikowej metodą chemiluminescencji luminolu indukowanej H2O2-heminą. J Rolnictwo Chem. 3 grudnia 2003; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Wolne rodniki i chemiluminescencja komórkowa. Sukcesy biol. chemia 2009; 49:341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Chemiluminescencja kinetyczna jako metoda badania reakcji wolnorodnikowych. Biofizyka. 2011; 56(6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Oznaczanie aktywności przeciwutleniającej poprzez pomiar kinetyki chemiluminescencji. Fotobiologia i fotomedycyna. 2011; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescencja luminolu indukowana termolizą 2,2"-azo-bis(2-amidynopropanu). Bezpłatna

Radic Res Commun. 1992; 17 ust. 5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O zastosowaniu wygaszania luminescencji luminolu do oceny aktywności SOD. Free Radic Biol Med. 1994 czerwiec; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Ocena całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (TRAP) i całkowitej reaktywności przeciwutleniającej na podstawie pomiarów chemiluminescencji wzmocnionej luminolem. Free Radic Biol Med. luty 1995; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Badanie mechanizmu luminescencyjnej peroksydacji luminolu technikami zatrzymanego przepływu. J Biol Chem. 25 września 1968; 243(18): 4706-14.

21. Alekseev A. V., Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Oznaczanie przeciwutleniaczy metodą aktywowanej chemiluminescencji przy użyciu 2,2'-azo-bis(2-amidynopropanu). Biuletyn Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego. Ser. 2. Khim. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Ministerstwo Zdrowia ZSRR Farmakopea Państwowa ZSRR XI wyd. Wydanie. 2 „Ogólne metody analizy. Lecznicze materiały roślinne”. M.: Medycyna; 1987. s. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Badanie preparatów ekstraktu z dzikiej róży. Apteka. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Badanie owoców głogu różnymi sposobami konserwacji i ekstrakcji wody. Apteka. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Biologicznie aktywne substancje z owoców i ekstrakty wodne maliny pospolitej. Apteka. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Badanie substancji biologicznie czynnych owoców głogu – surowce do przygotowania homeopatycznych nalewek matrixowych. W sobotę naukowy tr. Na podstawie materiałów XXIV Mosku. międzynarodowy homeopata. konf. „Rozwój metody homeopatycznej we współczesnej medycynie”; 24-25 stycznia 2014; Moskwa. M.; 2014. s. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Badanie składu substancji biologicznie czynnych w surowcach roślin leczniczych różnymi metodami konserwacji. W sobotę streszczenia na podstawie XX Ross. nat. kongr. „Człowiek i medycyna”; 15-19 kwietnia 2013; Moskwa. Moskwa: EkoOnis; 2013. s. 184-90.

30. Alexandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Badanie aktywności peroksydazy w ekstraktach z kłączy i korzeni chrzanu oraz jej stabilność na różne wpływy. Vestn. Uniwersytet Państwowy w Moskwie. Ser. 2. Chem. 2006; 47(5):350-2.

1. Proskurnina EV, Władimirow YuA. Free radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. W: Grigor „ev AI, Vladimirov YuA, red. Fundamental” nye nauki - meditsine. Biofizicheskie meditsinskie tehnologii. Moskwa: MAKS Press; 2015.v. 1. s. 38-71. Rosyjski.

2. Chanda S, Dave R. Modele in vitro do oceny aktywności przeciwutleniającej i niektórych roślin leczniczych posiadających właściwości przeciwutleniające: przegląd. Afr J Microbiol Res. grudzień 2009; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel "nogo Syr" ja. 2004; (3): 63-75. Rosyjski.

4. Vasil „ev RF, K” „ncheva VD, Fedorova GF, B” „tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost” khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobynosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinetyka i kataliza. 2010; 51 ust. 4): 533-41. Rosyjski.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA i in. Potencjał przeciwutleniający związków pokrewnych kurkuminie badany za pomocą kinetyki chemiluminescencji, wydajności rozrywania łańcuchów, aktywności oczyszczającej (ORAC) i obliczeń DFT. Beilstein J. Org Chem. 11 sierpnia 2015; 11:1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL Chemiluminescencja za pośrednictwem rodników peroksy-rodnikowych: różnorodność mechanistyczna i podstawy testu przeciwutleniającego, Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF Łatwy test chemiluminescencji dla właściwości przeciwutleniających lipidów roślinnych: podstawy i przykłady ilustrujące Analityk 2009 październik; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Ocena zdolności przeciwrodnikowej luminolu indukowanego H2O2-heminą

9. Władimirow YuA, Proskurnina EV. Bezpłatne radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49:341-88. Rosyjski.

10. Władimirow YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya as metoda izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. biofizyka. 2011; 56(6): 1081-90. Rosyjski.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Władimirow YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologia i fotomeditsina. 2011; 7(2):70-6. Rosyjski.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescencja luminolu wywołana termolizą 2,2"-azo-bis(2-amidynopropanu). Free Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O zastosowaniu wygaszania luminescencji luminolu do oceny aktywności SOD. Free Radic Biol Med. 1994 czerwiec; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Widoczna chemiluminescencja związana z reakcją methemoglobiny lub oksyhemoglobiny z nadtlenkiem wodoru. Fotochemik Fotobiol. listopad 1994; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV i in. Ocena in vitro aktywności przeciwutleniającej liposomalnych flawonoli metodą układu HRP-H2O2-luminol. J Mikrokapsułka. 2011; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Badanie mechanizmu

luminescencyjnej peroksydacji luminolu technikami zatrzymanego przepływu. J Biol Chem. 25 września 1968; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Właściwości fitochemiczne, działanie wychwytujące wolne rodniki i neuroprotekcja pięciu ekstraktów roślin leczniczych. Uzupełnienie oparte na Evid Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. EPUB 2011, 10 sierpnia.

19. Chang CL, Lin CS. Skład fitochemiczny, aktywność przeciwutleniająca i działanie neuroprotekcyjne ekstraktów z Terminalia chebula Retzius. Uzupełnienie oparte na Evid Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. EPUB 2011, 5 lipca.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Ocena aktywności przeciwutleniającej różnych flawonoidów metodą chemiluminescencji. AAPS PharmSci. 2003; 5(2):111-5.

21. Aleksiejew AV, Proskurnina EV, Władimirow YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Biuletyn Chemii Uniwersytetu Moskiewskiego. 2012; 53(3): 187-93. Rosyjski.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Zastosowanie zoptymalizowanego testu chemiluminescencyjnego do oznaczania zdolności antyoksydacyjnej ekstraktów ziołowych. Luminescencja. 2012 listopad-grudzień; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Całkowite przeciwutleniacze o niskiej masie cząsteczkowej jako parametr podsumowujący, oznaczany ilościowo w próbkach biologicznych za pomocą testu hamowania chemiluminescencji. Protokół Nat. wrzesień 2010; 5(10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11. wyd. Is. 2. „Analiza metod Obshchie.

Lekarstvennoe rastitel „noe syr” e”, Moskwa: Medltsina, 1987, s. 147-8. Rosyjski.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatovshipovnika. Apteka. 2012; (2): 14-6. Rosyjski.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposóbov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmacja. 2010; (5): 16-8. Rosyjski.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmacja. 2014; (1): 8-10. Rosyjski.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Materiały z 14. Międzynarodowej Konferencji Homeopatycznej w Moskwie „Razvitie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi meditsine”; 24–25 stycznia 2014 r.; Moskwa M., 2014. s. 146-7 . Rosyjski.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr" e razlichnykh sposóbov konservatsii. Materiały XX Rosyjskiego Kongresu Narodowego „Chelovek i lekarstvo”; 2013 kwiecień 1519; Moskwa. Moskwa: EkOOnis; 2013. s. 184-90. Rosyjski.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Biuletyn Chemii Uniwersytetu Moskiewskiego. 2006; 47 (5): 350-2. Rosyjski.

1 Bolshakova L.S. 1Milentiew V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Państwowy Instytut Ekonomii i Handlu Oryola

2 Federalna Państwowa Instytucja Budżetowa „Centrum Chemizacji i Radiologii Rolniczej „Orłowski”

3 Federalna państwowa budżetowa instytucja edukacyjna wyższego kształcenia zawodowego „Uniwersytet Państwowy - Kompleks edukacyjny, naukowo-przemysłowy”

Badano możliwość wykorzystania chemiluminescencji do oceny aktywności przeciwutleniającej substancji spożywczych. Proponowana metoda opiera się na chemiluminescencji luminolu w środowisku zasadowym, której intensywność zależy od ilości nadtlenków w próbce chemiluminescencyjnej. Chemiluminescencję rejestrowano przy użyciu opracowanego układu zawierającego pompę dozującą, światłoszczelną komorę, szklaną próżniową rurkę fotopowielacza i system komputerowy. Aby zwiększyć chemiluminescencję, do luminolu dodano roztwór żelazicyjanku potasu. Zmiany intensywności chemiluminescencji rejestrowano w momencie wprowadzenia analizowanej próbki do roztworu luminolu. Jako próbkę do analiz wykorzystano ekstrakt z mniszka lekarskiego otrzymany w drodze suchej destylacji niskotemperaturowej. Zawiera związki fenolowe znane z wysokiej aktywności przeciwutleniającej. Stwierdzono, że metoda chemiluminescencji może być stosowana do określania właściwości przeciwutleniających różnych związków spożywczych.

Link bibliograficzny

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. WYKORZYSTANIE CHEMILUMINESCENCJI DO OCENY WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCYCH SKŁADNIKÓW SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH // Racjonalne żywienie, dodatki do żywności i biostymulatory. - 2014. - nr 6. - s. 36-37;
Adres URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (data dostępu: 17.12.2019). Zwracamy uwagę na czasopisma wydawane przez wydawnictwo „Akademia Historii Naturalnej”

Praca dyplomowa

1.4 Metody badań przeciwutleniaczy

aktywność przeciwutleniającą klasyfikuje się: zgodnie z metodami rejestracji manifestowanego AOA (objętościowa, fotometryczna, chemiluminescencyjna, fluorescencyjna, elektrochemiczna); według rodzaju źródła utleniania; według rodzaju utlenionego związku; zgodnie z metodą pomiaru utlenionego związku.

Jednakże najbardziej znanymi metodami określania aktywności przeciwutleniającej są:

1 TEAC (równoważnik antyoksydacyjny troloksu): metoda opiera się na następującej reakcji:

Metmioglobina + H 2 O 2 > Ferrylglobina + ABTS > ABTS * + AO.

Metoda równoważności Troloxu (TEAC) opiera się na zdolności przeciwutleniaczy do redukcji kationów rodników 2,2-azynobisowych (ABTS), a tym samym hamowania absorpcji w części widma o długich falach (600 nm). Istotną wadą metody jest dwuetapowa reakcja otrzymania rodnika. Wydłuża to czas analizy i może zwiększać rozrzut wyników, pomimo stosowania do analizy standaryzowanego zestawu odczynników.

2 FRAP (żelazowa siła przeciwutleniająca redukująca): metoda opiera się na następującej reakcji:

Fe(III)-Trypirydylotriazyna+AO>Fe(II)-Trypirydylotriazyna.

Zdolność redukująca żelazo/przeciwutleniająca (FRAP). Wykorzystuje się tu reakcję redukcji Fe(III)-tripirydylotriazyny do Fe(II)-tripirydylotriazyny. Jednak metodą tą nie można określić niektórych przeciwutleniaczy, takich jak glutation. Metoda ta pozwala na bezpośrednie oznaczenie przeciwutleniaczy o niskiej masie cząsteczkowej. Przy niskim pH redukcji kompleksu trójpirydylotriazyny Fe(III) do kompleksu Fe(II) towarzyszy pojawienie się intensywnej niebieskiej barwy. Pomiary opierają się na zdolności przeciwutleniaczy do tłumienia efektu utleniającego cząstek reakcyjnych wytwarzanych w mieszaninie reakcyjnej. Metoda ta jest prosta, szybka i tania w wykonaniu.

3 ORAC (zdolność pochłaniania rodników tlenowych): metoda opiera się na następującej reakcji:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminol.

Oznaczanie zdolności do pochłaniania rodników tlenowych (ORAC). W metodzie tej rejestrowana jest fluorescencja substratu (fikoerytryny lub fluoresceiny), która zachodzi w wyniku jego oddziaływania z RFT. Jeśli w próbce testowej znajdują się przeciwutleniacze, obserwuje się spadek fluorescencji w porównaniu z próbką kontrolną. Metoda ta została pierwotnie opracowana przez dr Guohua Cao w Narodowym Instytucie ds. Agingu w 1992 r. W 1996 r. dr Cao dołączył do dr Ronalda Pryera we wspólnej grupie w Centrum Badań nad Agingiem USDA, gdzie zbadano półautomatyczną metodę rozwinięty.

4 TRAP (parametr całkowitego wychwytywania rodników): metoda opiera się na reakcji:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Metoda ta wykorzystuje zdolność przeciwutleniaczy do oddziaływania z rodnikiem nadtlenkowym, dichlorowodorkiem 2,2-azobis(2-amidynopropanu) (AAPH). Modyfikacje TRAP polegają na metodach rejestracji sygnału analitycznego. Najczęściej rodnik nadtlenkowy AAPH w końcowej fazie analizy oddziałuje z substratem luminescencyjnym (luminol), fluorescencyjnym (dioctan dichlorofluorescyny, DCFH-DA) lub innym optycznie czynnym substratem.

Rozpuszczalna w wodzie pochodna witaminy E Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy) stosowana jest jako standard w metodach TEAC, ORAC i TRAP.

W ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie wykorzystaniem metod elektrochemicznych do oceny aktywności przeciwutleniającej. Metody te charakteryzują się dużą czułością i szybkością analizy.

Ocena aktywności przeciwutleniającej niektórych produktów spożywczych przeprowadzana jest metodą potencjometryczną, polegającą na wykorzystaniu właściwości substancji przeciwutleniających do uczestniczenia w reakcjach redoks ze względu na grupy enolowe (-OH) i sulfhydrylowe (-SH).

Określenie właściwości przeciwutleniających roztworów opiera się na chemicznym oddziaływaniu przeciwutleniaczy z układem mediatorów, co prowadzi do zmiany jego potencjału redoks. Ogniwo elektrochemiczne to naczynie zawierające roztwór buforowy fosforanu K-Na, układ mediatorów Fe(III)/Fe(II) i złożoną elektrodę przed pomiarem potencjału redoks. Aktywność przeciwutleniającą szacuje się w g-eq/l.

Amperometryczna metoda określania aktywności przeciwutleniającej polega na pomiarze prądu elektrycznego powstającego podczas utleniania substancji badanej na powierzchni elektrody roboczej, która znajduje się pod pewnym potencjałem. Czułość metody amperometrycznej zależy zarówno od rodzaju elektrody roboczej, jak i od przyłożonego do niej potencjału. Granica wykrywalności amperometrycznego detektora polifenoli, flawonoidów kształtuje się na poziomie nanopikogramów, przy tak niskich stężeniach istnieje mniejsze prawdopodobieństwo wzajemnego oddziaływania różnych przeciwutleniaczy w ich łącznej obecności, w szczególności ujawnienia się zjawiska synergizmu . Do wad metody należy jej specyficzność: w tych warunkach nie można analizować przeciwutleniaczy, które same ulegają utlenieniu lub redukcji w obszarze potencjałów elektroredukcji tlenu. Zaletami tej metody są szybkość, prostata i czułość.

Galwanostatyczna metoda kulometryczna z wykorzystaniem utleniaczy elektrogenerowanych - metoda ma zastosowanie do analizy przeciwutleniaczy rozpuszczalnych w tłuszczach.

Opracowano różne metody oznaczania kwasu askorbinowego:

metoda amperometryczna z zastosowaniem elektrody aluminiowej modyfikowanej warstwą heksacyjanożelazianu niklu(II) metodą zanurzeniową w roztworze prostym;

metoda spektrofotometrycznego i wizualnego oznaczania kwasu askorbinowego w fazie stałej z zastosowaniem kserożelu kwasu krzemowego modyfikowanego odczynnikiem Wawela i miedzi (II) jako proszku wskaźnikowego;

chemiluminescencyjne oznaczanie kwasu askorbinowego można przeprowadzić metodą wtrysku przepływowego zgodnie z reakcją chemiluminescencyjną rodaminy B z cerem (IV) w środowisku kwasu siarkowego.

oznaczanie kwasu askorbinowego w zakresie 10 -8 -10 -3 g/cm 3 metodą woltamperometrii anodowej w ośrodkach wodnych i wodno-organicznych.

Najpopularniejsza jest metoda FRAP, gdyż jest ekspresowa i bardzo czuła. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat opracowano wiele odmian metod określania aktywności przeciwutleniającej metodą FRAP (tabela 1).

Tabela 1 Rozwój metody FRAP i jej zastosowanie do określania aktywności przeciwutleniającej różnych obiektów

	Obiekty analizy	Notatki
	osocze krwi	t=4min. Badano stechiometrię i addytywność reakcji.
	Herbata, wino	Oznaczanie AOA pod wpływem polifenoli
		Porównuje się wartości AOA różnych rodzajów herbat
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Rozwiązania modelowe	t=30min. Stwierdzono wpływ rozpuszczalnika niewodnego
	Rośliny
	krew, tkanka	Metoda PIA. Sprawdzono wpływ substancji obcych.
Firuzi, Lacanna, Petrucci i in.	Rozwiązania modelowe	Badano czułość oznaczania różnych AO w funkcji ich struktury i potencjału redoks.
Katalinic, Miłosz,	Różne wina
Temirdaszew, Ciupko i inni.	Mieszanki modelowe
Loginova, Konovalova	Leki. Przygotowania	Metoda badania
Temirdaszew, Ciupko i inni.	Wina wytrawne czerwone	Korelacja AOA z innymi wskaźnikami jakości wina
Tabela 1 – ciąg dalszy
	Mieszanki modelowe	Czułość oznaczania różnych AO
Wierszynin, Własowa, Ciupko	Mieszanki modelowe	Stwierdzono nieaddytywność sygnału przy braku środka utleniającego
Anisimowicz, Deineka i inni.	Rozwiązania modelowe	Zaproponowano parametry kinetyczne do estymacji AOA.

Uwagi: konwencjonalnie oznakowane: PIA-analiza wtryskowo-przepływowa, TPTZ-tripirydylotriazyna, DIP-2,2, -dipirydyl, PHEN-o-fenantrolina, DPA-kwas pirydynodikarboksylowy, FZ-ferrozyna, AA-kwas askorbinowy, CT-katechol, t - czas ekspozycji, min.

Oddziaływanie białek i polielektrolitów w roztworach wodnych

Do charakteryzowania kompleksów białkowo-polielektrolitowych stosuje się różne metody analizy. Metody instrumentalne dostarczają informacji o właściwościach strukturalnych i optycznych, a także określają dynamikę i charakter wiązania PEC...

Wpływ związków d-metalu na szybkość dysocjacji cząsteczki wody w membranie bipolarnej

W procesie syntezy nowych BPM dużą uwagę należy zwrócić na badanie właściwości otrzymanych próbek w celu późniejszego doboru warunków syntezy zapewniających poprawę właściwości elektrochemicznych syntetyzowanych membran...

Dopalacze i syntetyczne kannabinoidy

Wykrywanie syntetycznych kannabinoidów w mieszaninach roślinnych można przeprowadzić różnymi metodami fizykochemicznymi, takimi jak chromatografia ze spektrometrią mas, chromatografia gazowa, cienkowarstwowa i wysokosprawna chromatografia cieczowa.

Opracowanie metody oznaczania flawonoidów w surowcach roślin leczniczych

Synteza i właściwości farmakologiczne chinolinonów-2

Przedmiot badań: Chinolinon-2. Metoda badań: Za pomocą programu komputerowego „Marvin JS” stworzono strukturę substancji. Następnie została wysłana na stronę „http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php” w celu dalszego zbadania…

Termospektralna metoda badania produktów parowania polimeru epoksydowego

Technologia otrzymywania wysoko oczyszczonego chitozanu z muszli skorupiaków

Oznaczanie masy cząsteczkowej chitozanu Masę cząsteczkową chitozanu oznaczono wiskozymetrycznie zgodnie ze standardową metodą. Roztwory o stężeniach 0,05 i 0,5 g/dl przygotowano rozpuszczając odważoną porcję proszku polimerowego w buforze octanowym (0...

Charakterystyka fizyczna i geograficzna obszaru parku przyrodniczego

1 Milentiew V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Państwowy Instytut Ekonomii i Handlu Oryola

2 Federalna Państwowa Instytucja Budżetowa „Centrum Chemizacji i Radiologii Rolniczej „Orłowski”

3 Federalna państwowa budżetowa instytucja edukacyjna wyższego kształcenia zawodowego „Uniwersytet Państwowy - Kompleks edukacyjny, naukowo-przemysłowy”

chemiluminescencja

aktywność antyoksydacyjna

nadtlenki

składniki odżywcze

1. Wasiliew R.F. Chemiczny blask // Chemia i chemicy, 21.01.10. – Adres URL: http://chemistry-chemists.com. (data dostępu: 22.08.13).

2. Władimirow Yu.A. Wolne rodniki i przeciwutleniacze // Vestn. RAMN. - 1998. - nr 7. - s. 43–51.

3. Kondrashova E.A. Chemiluminescencja jako najczulsza metoda immunoenzymatyczna i jej zastosowanie Kliniczna diagnostyka laboratoryjna. - 1999. - nr 9. - s. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Analiza chemiluminescencyjna // Immunologia. - 1991. - nr 1. - s. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktywna chemiluminescencja w układzie fagocytozy // Mikrobiologia. - 1987. - nr 1. - S. 109–115.

6. Szerstniew M.P. Zależne i niezależne od wapnia szlaki wytwarzania chemiluminescencji komórkowej.Zagadnienia chemiluminescencji. - 1991. - nr 2. - S. 1–4.

Dziś chemiluminescencja to duża dziedzina nauki zlokalizowana na styku chemii, fizyki i biologii. W przypadku chemiluminescencji następuje bezpośrednia konwersja energii chemicznej na energię drgań elektromagnetycznych, tj. w świat. Wykorzystując chemiluminescencję można dowiedzieć się jak przebiega reakcja, jaki jest jej mechanizm, niezbędny do sprawnego i racjonalnego przebiegu procesów technologicznych. Jeśli procesowi technologicznemu otrzymywania dowolnego produktu chemicznego towarzyszy chemiluminescencja, wówczas jej intensywność może służyć jako miara szybkości procesu: im szybsza reakcja, tym jaśniejszy blask. Podczas reakcji chemiluminescencji powstają produkty bogate w energię, które następnie oddają energię poprzez emisję światła, czyli energia chemiczna zamieniana jest na energię promieniowania elektromagnetycznego.

Celem pracy było zbadanie możliwości wykorzystania chemiluminescencji do oceny aktywności przeciwutleniającej substancji spożywczych.

Wyniki badań i dyskusja

Problem oceny aktywności przeciwutleniającej substancji spożywczych jest bardzo istotny. Użycie terminu „działanie przeciwutleniające” w celu wykazania przydatności konkretnego produktu często odbywa się bez żadnych argumentów chemicznych i biochemicznych. Z reguły aktywność przeciwutleniająca dowolnej substancji odnosi się do skuteczności zmniejszania liczby nadtlenkowej. Sama koncepcja liczby nadtlenkowej również nie oddaje w pełni jej istoty chemicznej, ponieważ nie w pełni odpowiada kinetyce i termodynamice etapów metabolizmu konkretnego produktu spożywczego. Ponadto wartość ta służy do charakteryzowania lipidów w postaci tłuszczów. Jednak procesy utleniania i powstawania nadtlenków w organizmie zachodzą nie tylko przy użyciu tłuszczów, ale także innych produktów. Innymi słowy, zawartość nadtlenku w konkretnym produkcie można określić jako „odważoną” na swego rodzaju wadze, gdzie „masa referencyjna” jest jednostką stężenia w środowisku kwaśnym jonu jodkowego utlenionego przez nadtlenki, jak np. w wyniku czego powstaje jod cząsteczkowy:

Ja- - e → Ja; (1)

Ja + Ja → I20. (2)

Miareczkując jod cząsteczkowy roztworem zawierającym tiosiarczan sodu, ustala się jego stężenie, a co za tym idzie, określa się ilość utleniaczy jonów jodkowych, tj. związki nadtlenkowe, które w rzeczywistości nazywa się liczbą nadtlenkową. Określenie liczby nadtlenkowej za pomocą tego rodzaju „ważenia” opiera się na reakcji pokazanej na ryc. 1.

Ryż. 1. Oznaczanie liczby nadtlenkowej za pomocą tiosiarczanu sodu

Zatem stężenie nadtlenków określa się z równania

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

gdzie ϒ jest współczynnikiem korelacji pomiędzy stężeniem jodu cząsteczkowego a stężeniem nadtlenków.

Proponowana metoda oznaczania nadtlenków w produktach opiera się na chemiluminescencji luminolu (C[lm]) w środowisku zasadowym, której intensywność (Ichl) zależy od stężenia nadtlenków (C[-O-O-]), w środowisku próbka chemiluminescencyjna:

MPH. = Ϧchl ω, (4)

gdzie Ϧchl jest wydajnością kwantową chemiluminescencji; ω - szybkość reakcji z udziałem nadtlenków:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

gdzie kchl jest stałą szybkości reakcji lub przy:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

Ilość nadtlenków (-O-O-) określa suma światła (S):

Wartość S zależy od stopnia całkowitego zużycia nadtlenku w reakcji chemiluminescencyjnej.

Aby wyznaczyć stałą K, konstruuje się krzywą kalibracyjną dla zależności sumy światła S od stężenia nadtlenku, które określa się przez miareczkowanie:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Jako nadtlenki stosuje się nadtlenek wodoru H2O2.

Następnie porównuje się dane uzyskane z równań (3) i (9). Na podstawie porównania ϒ i K wysunięto wniosek o koordynacji mechanizmów reakcji leżących u podstaw oznaczania nadtlenków tymi metodami. Stwierdzono, że w tym zakresie stężeń nadtlenku ϒ i K rzeczywiście zgadzają się ze sobą i dlatego można je wykorzystać do określenia liczby nadtlenkowej.

Chemiluminescencję obserwowano w środowisku alkalicznym zawierającym luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazynodion, hydrazyd 3-aminoftalowy, H2L). Rejestrowano go przy użyciu układu chemiluminescencyjnego, w tym szklanego fotopowielacza próżniowego. Fotopowielacz zasilany jest z prostownika wysokiego napięcia (7) sprzężonego z blokiem (9) wzmacniającym sygnał fotopowielacza, który jest rejestrowany na wyświetlaczu monitora komputera (5).

Ryż. 2. Rejestracja chemiluminescencji analizowanego produktu: 1 - pompa dozująca; 2 - komora światłoszczelna; 3 - lustro; 4 - kuweta; 5 - system komputerowy; 6 - fotopowielacz; 7 - prostownik wysokiego napięcia; 8 - urządzenie umożliwiające określenie obszaru widmowego promieniowania chemiluminescencyjnego; 9 - blok wzmacniający sygnał fotopowielacza

Do wprowadzenia analizowanej próbki do kuwety (4) zawierającej chemiluminescencyjny roztwór luminolu wymagana jest pompa dozująca (1). Dozownik ten pełni funkcję mieszadła dla wstrzykniętej próbki roztworem chemiluminescencyjnym. Aby zwiększyć szybkość reakcji i intensywność chemiluminescencji, do luminolu dodano roztwór żelazicyjanku potasu. Mieszanie odbywa się za pomocą pęcherzyków powietrza uzyskanych poprzez przepompowanie powietrza przez ciecz za pomocą pompy. Zwierciadło (3) umieszczone w komorze światłoszczelnej (2) służy do lepszego zbierania światła promieniowania chemiluminescencyjnego padającego na fotokatodę fotopowielacza (6) zamontowanego w komorze światłoszczelnej. Dozownik umożliwia wprowadzenie do kuwety wybranych składników płynu bez konieczności otwierania światłoszczelnej komory (2) w trakcie doświadczeń. W tym przypadku ciecze te dostają się do kuwety (4) przez rurki szklane lub plastikowe. System komputerowy umożliwia rejestrację zależności natężenia luminescencji I od czasu t, czyli kinetyki chemiluminescencji:

System komputerowy odzwierciedla stałe wzrostu i spadku w funkcji I = f(t), które są sprzężone ze stałymi szybkości reakcji powodujących chemiluminescencję, czyli z ich kinetyką. W komorze chemiluminescencyjnej znajduje się urządzenie (8), które umożliwia wyznaczenie obszaru widmowego promieniowania chemiluminescencyjnego, czyli zależności:

Ja = f1(λ). (jedenaście)

Blok ten jest kasetą w formie dysku, w której zamontowane są filtry graniczne. Wymiana filtrów świetlnych odbywa się poprzez obrót kasety dyskowej wokół osi poziomej łączącej środki płaszczyzny filtrów świetlnych z płaszczyzną fotokatody fotopowielacza.

Proces pomiaru przebiega w następujący sposób:

1. Wyznacza się reakcję fotopowielacza na zmiany jego napięcia zasilania oraz na zmiany natężenia referencyjnego źródła światła padającego na jego katodę.

2. Kuwetę napełnia się roztworem luminolu w środowisku zasadowym.

3. Dozownik napełnia się analizowaną próbką.

4. Rejestruje się zależność intensywności chemiluminescencji od czasu t. Chemiluminescencję monitoruje się do czasu t1, w którym zmiana I1 od czasu t jest minimalna: I1 = f1(t).

5. Porcję analizowanego roztworu podaje się za pomocą dozownika.

6. Obserwuje się chemiluminescencję analizowanej próbki, której kinetyka wynosi I = f(t).

Na ryc. Na rysunku 3 przedstawiono wykres zależności funkcji (I1 = f1(t)), sprzężony z wykresem (I = f(t)), po wprowadzeniu analizowanego rozwiązania.

Jak widać z rys. 3, zmienia się intensywność chemiluminescencji luminolu: po dodaniu analizowanej próbki po gwałtownym wzroście następuje gwałtowny spadek luminescencji.

Ponieważ wzmocnienie chemiluminescencji podczas utleniania luminolu wiąże się z powstawaniem nadtlenków, spadek intensywności chemiluminescencji po wprowadzeniu analizowanej próbki wskazuje na zmniejszenie ich liczby. Można zatem mówić o występowaniu aktywności przeciwutleniającej w związkach wchodzących w skład analizowanej próbki.

Należy zaznaczyć, że jako analizowaną próbkę wykorzystano ekstrakt z mniszka lekarskiego uzyskany w drodze suchej destylacji niskotemperaturowej, zawierający związki fenolowe charakteryzujące się dużą aktywnością przeciwutleniającą.

Ryż. Rys. 3. Wykres zależności funkcji (I1 = f1(t)), sprzężony z wykresem (I = f(t)), po wprowadzeniu analizowanego rozwiązania

Ponadto w trakcie eksperymentu stwierdzono, że za pomocą chemiluminescencji można określić ilość nadtlenków w układach superrozcieńczonych, co ma znaczenie dla oceny rozpoczęcia utleniania produktów np. podczas ich przechowywania.

Tym samym przeprowadzone badania wykazały, że metoda oznaczania nadtlenków w produktach, oparta na chemiluminescencji luminolu w środowisku zasadowym, pozwala na ocenę aktywności przeciwutleniającej substancji spożywczych i może być wykorzystana do określenia właściwości przeciwutleniających różnych produktów spożywczych. związki.

Recenzenci:

Litvinova E.V., doktor nauk technicznych, profesor Wydziału Technologii, Organizacji i Higieny Żywności, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., doktor nauk biologicznych, dyrektor INIT, FSBEI HPE „Oryol State Agrarian University”, Orel.

Pracę wpłynęło do redakcji 8 listopada 2013 roku.

Link bibliograficzny

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. WYKORZYSTANIE CHEMILUMINESCENCJI DO OCENY WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCYCH SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH // Badania Podstawowe. - 2013. - nr 10-11. - S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (data dostępu: 17.12.2019). Zwracamy uwagę na czasopisma wydawane przez wydawnictwo „Akademia Historii Naturalnej”

adnotacja artykuł naukowy z zakresu nauk chemicznych, autor artykułu naukowego - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Powiązane tematy prace naukowe z zakresu nauk chemicznych, autor pracy naukowej - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Chemiluminescencyjne oznaczanie całkowitej zdolności przeciwutleniającej w materiale roślin leczniczych

Tekst pracy naukowej na temat „Metoda chemiluminescencyjna określania całkowitej zdolności przeciwutleniającej w surowcach roślin leczniczych”

Link bibliograficzny

1.4 Metody badań przeciwutleniaczy

Link bibliograficzny

Funkcje organelli komórkowych

Algorytm pisania eseju z nauk społecznych

Czarnobyl we wspomnieniach naocznych świadków Straszne historie o Czarnobylu