Oddzielenie białek od zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych
Metoda sita membranowego (dializa)
Stosowana jest membrana dializacyjna, która jest polimerem i ma pory o określonej wielkości. Małe cząsteczki (zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej) przechodzą przez pory membrany, a duże cząsteczki (białka) są zatrzymywane. W ten sposób białka zostają wypłukane z zanieczyszczeń.
Rozdzielanie białek według masy cząsteczkowej
Chromatografia żelowa
Kolumna chromatograficzna wypełniona jest granulkami żelowymi (Sephadex), które posiadają pory o określonej wielkości. Do kolumny dodaje się mieszaninę białek. Białka, których rozmiar jest mniejszy niż rozmiar porów Sephadexu, pozostają w kolumnie, gdyż „utkwią” w porach, a reszta swobodnie opuszcza kolumnę. Wielkość białka zależy od jego masy cząsteczkowej.
Ultrawirowanie
Metoda ta opiera się na różnym tempie sedymentacji (wytrącania) cząsteczek białka w roztworach o różnych gradientach gęstości (bufor sacharozowy lub chlorek cezu).
Elektroforeza
Metoda ta opiera się na różnym tempie migracji białek i peptydów w polu elektrycznym w zależności od ładunku.
Nośniki do elektroforezy mogą służyć żele, octan celulozy i agar. Oddzielone cząsteczki poruszają się w żelu w zależności od ich wielkości: te, które są duże, przejdą przez pory żelu z opóźnieniem. Mniejsze cząsteczki napotkają mniejszy opór i dlatego poruszają się szybciej. W rezultacie po elektroforezie duże cząsteczki będą bliżej początku niż mniejsze.
Elektroforezę można zastosować do rozdzielenia białek według masy cząsteczkowej. W tym celu stosuje się elektroforezę PAGE w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-Na).
DDS-Na jest substancją difilową i zawiera grupę naładowaną oraz grupę hydrofobową. Białka wiążą się z SDS-Na swoimi hydrofobowymi rodnikami i przy tym ulegają denaturacji. W ten sposób białka mają wyrównany kształt i ładunek. Następnie ruchliwość białka podczas elektroforezy zależy tylko od jego masy cząsteczkowej.
wysalanie: strącanie solami metali alkalicznych, ziem alkalicznych (chlorek sodu, siarczan magnezu), siarczan amonu; pierwotna struktura białka nie jest zakłócona;
zeznanie: stosowanie środków odwadniających: alkoholu lub acetonu w niskich temperaturach (ok. –20 С).
Podczas stosowania tych metod białka tracą swoją powłokę hydratacyjną i wytrącają się w roztworze.
Denaturacja- naruszenie struktury przestrzennej białek (zachowana zostaje pierwotna struktura cząsteczki). Może być odwracalny (struktura białka zostaje przywrócona po usunięciu czynnika denaturującego) lub nieodwracalny (struktura przestrzenna cząsteczki nie zostaje przywrócona np. podczas wytrącania białek stężonymi kwasami mineralnymi, solami metali ciężkich).
Metody separacji białek. Separacja białek od zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych
Dializa
Stosowana jest specjalna membrana polimerowa, która ma pory o określonej wielkości. Małe cząsteczki (zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej) przechodzą przez pory membrany, a duże cząsteczki (białka) są zatrzymywane. W ten sposób białka są wypłukiwane z zanieczyszczeń.
Rozdzielanie białek według masy cząsteczkowej
Chromatografia żelowa
Kolumna chromatograficzna wypełniona jest granulkami żelowymi (Sephadex), które posiadają pory o określonej wielkości. Do kolumny dodaje się mieszaninę białek. Białka, których wielkość jest mniejsza niż wielkość porów Sephadexu, pozostają w kolumnie, gdyż „utkwią” w porach, a reszta swobodnie opuszcza kolumnę (ryc. 2.1). Wielkość białka zależy od jego masy cząsteczkowej.
Ryż. 2.1. Separacja białek metodą filtracji żelowej
Ultrawirowanie
Metoda ta opiera się na różnym tempie sedymentacji (wytrącania) cząsteczek białka w roztworach o różnych gradientach gęstości (bufor sacharozowy lub chlorek cezu) (ryc. 2.2).
Ryż. 2.2. Rozdzielanie białek metodą ultrawirowania
Elektroforeza
Metoda ta opiera się na różnym tempie migracji białek i peptydów w polu elektrycznym w zależności od ładunku.
Nośniki do elektroforezy mogą służyć żele, octan celulozy i agar. Oddzielone cząsteczki poruszają się w żelu w zależności od ich wielkości: te, które są większe, przejdą przez pory żelu z opóźnieniem. Mniejsze cząsteczki napotkają mniejszy opór i dlatego poruszają się szybciej. W rezultacie po elektroforezie większe cząsteczki będą bliżej początku niż mniejsze (ryc. 2.3).
Ryż. 2.3. Separacja białek metodą elektroforezy żelowej
Elektroforezę można również zastosować do rozdzielenia białek według masy cząsteczkowej. Do tego używają Elektroforeza PAGE w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-Na).
Izolacja poszczególnych białek
Chromatografii powinowactwa
Metoda opiera się na zdolności białek do silnego wiązania się z różnymi cząsteczkami poprzez wiązania niekowalencyjne. Stosowany do izolacji i oczyszczania enzymów, immunoglobulin i białek receptorowych.
Cząsteczki substancji (ligandy), z którymi specyficznie wiążą się określone białka, łączą się kowalencyjnie z cząsteczkami substancji obojętnej. Mieszaninę białek dodaje się do kolumny, a pożądane białko trwale łączy się z ligandem. Pozostałe białka swobodnie opuszczają kolumnę. Zatrzymane białko można następnie wypłukać z kolumny za pomocą roztworu buforowego zawierającego wolny ligand. Ta wysoce czuła metoda pozwala na wyizolowanie bardzo małych ilości białka w czystej postaci z ekstraktu komórkowego zawierającego setki innych białek.
Ogniskowanie izoelektryczne
Metoda opiera się na różnych wartościach IET białek. Białka rozdziela się metodą elektroforezy na płytce z amfoliną (jest to substancja, w której wstępnie tworzy się gradient pH w zakresie od 3 do 10). Podczas elektroforezy białka rozdzielane są według ich wartości IET (w IET ładunek białka będzie wynosić zero i nie będzie ono poruszało się w polu elektrycznym).
Elektroforeza 2D
Jest to połączenie ogniskowania izoelektrycznego i elektroforezy z SDS-Na. Elektroforezę najpierw przeprowadza się w kierunku poziomym na płytce z amfoliną. Białka rozdziela się według ładunku (IET). Następnie płytkę traktuje się roztworem SDS-Na i przeprowadza elektroforezę w kierunku pionowym. Białka rozdziela się na podstawie masy cząsteczkowej.
Immunoelektroforeza (Western blot)
Metoda analityczna stosowana do identyfikacji określonych białek w próbce (rysunek 2.4).
Izolacja białek z materiału biologicznego.
Rozdział białek według masy cząsteczkowej metodą elektroforezy w PAGE z SDS-Na.
Przeniesienie białek z żelu na płytkę polimerową w celu ułatwienia dalszej pracy.
Traktowanie płytki roztworem niespecyficznego białka w celu wypełnienia pozostałych porów.
Zatem po tym etapie otrzymuje się płytkę, której pory zawierają oddzielone białka, a przestrzeń między nimi wypełnia białko niespecyficzne. Teraz musimy ustalić, czy wśród białek jest to, którego szukamy, które jest odpowiedzialne za jakąś chorobę. Do wykrywania stosuje się leczenie przeciwciałami. Przeciwciała pierwszorzędowe to przeciwciała skierowane przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Przeciwciała wtórne oznaczają przeciwciała przeciwko przeciwciałom pierwotnym. Do przeciwciał wtórnych dodawany jest dodatkowy specjalny znacznik (tzw. sonda molekularna), dzięki czemu można następnie wizualizować wyniki. Jako znacznik stosuje się radioaktywny fosforan lub enzym ściśle związany z przeciwciałem wtórnym. Wiązanie najpierw z przeciwciałami pierwotnymi, a następnie z przeciwciałami wtórnymi ma dwa cele: standaryzację metody i poprawę wyników.
Traktowanie roztworem przeciwciał pierwszorzędowych wiązanie następuje w miejscu płytki, w którym znajduje się antygen (pożądane białko).
Usunięcie niezwiązanych przeciwciał (płukanie).
Traktowanie roztworem znakowanych przeciwciał wtórnych w celu dalszego rozwoju.
Usunięcie niezwiązanych przeciwciał wtórnych (płukanie).
Ryż. 2.4. Immunoelektroforeza (Western blot)
Jeżeli w materiale biologicznym obecne jest pożądane białko, na płytce pojawia się prążek wskazujący wiązanie tego białka z odpowiednimi przeciwciałami.
Badanie właściwości fizykochemicznych, składu chemicznego i struktury jest możliwe jedynie poprzez badanie oczyszczonego preparatu białkowego. Do izolacji i frakcjonowania poszczególnych białek stosuje się: wysalanie, wytrącanie rozpuszczalnikami organicznymi, filtrację żelową, elektroforezę, chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa.
Wysalanie białek opiera się na zależności rozpuszczalności białek od właściwości ośrodka. Białka są słabiej rozpuszczalne w wodzie destylowanej niż w słabych roztworach soli, ponieważ niskie stężenia jonów utrzymują ich otoczki hydratacyjne. Jednak przy wysokich stężeniach soli cząsteczki białka tracą swoje powłoki hydratacyjne, agregaty i tworzy się osad. Po usunięciu soli białka wracają do roztworu, zachowując swoje natywne właściwości i konformację.
Do izolacji poszczególnych białek wykorzystuje się zmiany rozpuszczalności przy różnych stężeniach soli i pH. Najczęściej do wysalania białek stosuje się roztwory siarczanu amonu o różnych stężeniach.
Wytrącanie białek z roztworu bez ich denaturacji przeprowadza się za pomocą środków odwodorniających – rozpuszczalników organicznych (etanol, aceton).
Filtracja żelowa opiera się na rozdziale białek ze względu na wielkość i kształt cząsteczki. Rozdział odbywa się w kolumnach chromatograficznych wypełnionych porowatymi granulkami żelowymi (Sephadex, agaroza) w roztworze buforowym o określonej wartości pH. Granulki żelowe są przepuszczalne dla białek dzięki wewnętrznym kanałom (porom) o określonej średniej średnicy, których wielkość zależy od rodzaju żelu (Sephadex G-25, G-200 itp.). Mieszaninę białek dodaje się do kolumny, a następnie przemywa (eluuje) roztworem buforowym o określonej wartości pH. Duże cząsteczki białka nie wnikają w pory żelu i poruszają się z dużą prędkością wraz z rozpuszczalnikiem. Małe cząsteczki zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej (sól) lub inne białka są zatrzymywane przez granulki żelowe i wolniej wymywane z kolumny (ryc. 1.29). Na wylocie kolumny roztwór (eluat) zbiera się w postaci oddzielnych frakcji.
Ryż. 1,29. Separacja białek metodą filtracji żelowej
Elektroforeza opiera się na właściwości naładowanych cząsteczek białka, polegającej na poruszaniu się w polu elektrycznym z prędkością proporcjonalną do ich całkowitego ładunku. Białka, które mają całkowity ładunek ujemny przy danej wartości pH, przemieszczają się w kierunku anody, a ładunek dodatni przesuwa się w stronę katody. Elektroforezę przeprowadza się na różnych nośnikach: papierze, żelu skrobiowym, żelu poliakryloamidowym itp. Prędkość ruchu zależy od ładunku, masy i kształtu cząsteczek białka. Po zakończeniu elektroforezy strefy białek na nośniku barwi się specjalnymi barwnikami (ryc. 1.30, A).
Rozdzielczość elektroforezy w żelu jest większa niż na papierze, dlatego podczas elektroforezy białek surowicy krwi na papierze wyodrębnia się 5 frakcji (albumina, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globuliny) oraz w żelu poliakryloamidowym - do 18 frakcji (ryc. 1.30, B).
Ryż. 1.30. Elektroferogram białek surowicy krwi osoby zdrowej
A- elektroforogram białek surowicy krwi na papierze;
B- ilość białek osocza różnych frakcji.
I - γ-globuliny; II - β-globuliny; III - 2 -globuliny;
IV - 1 -globuliny; V - albuminy
Chromatografia jonowymienna opiera się na separacji białek różniących się ładunkiem całkowitym. Roztwór białka o określonej wartości pH przepuszcza się przez kolumnę chromatograficzną wypełnioną stałym porowatym sorbentem, przy czym część białek zostaje zatrzymana w wyniku oddziaływania elektrostatycznego. Jako sorbenty stosuje się substancje jonowymienne: wymieniacze anionowe (zawierające grupy kationowe) do izolacji białek kwaśnych; wymieniacze kationowe (zawierające grupy anionowe) do izolacji niezbędnych białek.
Podczas przepuszczania białka przez kolumnę siła jego wiązania z wymieniaczem jonowym zależy od wielkości ładunku przeciwnego do ładunku sorbentu. Białka zaadsorbowane na sorbencie jonowymiennym eluuje się roztworami buforowymi o różnym stężeniu soli i pH, uzyskując różne frakcje białkowe.
Chromatografii powinowactwa opiera się na specyficzności wiązania białka z ligandem przyłączonym do stałego podłoża. Jako ligandy stosuje się substraty enzymatyczne, grupy prostetyczne holoprotein, antygeny itp. Podczas przepuszczania mieszaniny białek przez kolumnę do ligandu przyłącza się tylko białko komplementarne (ryc. 1.31, A), wszystkie pozostałe wychodzą wraz z roztworem. Zaadsorbowane białko eluuje się roztworem o różnej wartości pH (ryc. 1.31, B). Metoda ta jest wysoce specyficzna i pozwala na otrzymanie wysoko oczyszczonych preparatów białkowych.
Izolacja i oczyszczanie białek zwykle odbywa się w kilku etapach przy użyciu różnych metod. Kolejność etapów dobierana jest empirycznie i może być różna dla różnych białek. Wysoki stopień oczyszczenia białek jest bardzo ważny zarówno przy stosowaniu ich jako leków (hormon insuliny itp.), jak i przy diagnozowaniu różnych chorób poprzez zmianę składu białkowego tkanek, krwi, śliny itp.
Zestaw białek w komórkach różnych narządów dorosłego człowieka jest indywidualny i utrzymuje się na stosunkowo stałym poziomie przez całe życie. Wyspecjalizowane tkanki mogą zawierać określone białka, takie jak hemoglobina w czerwonych krwinkach, aktyna i miozyna w mięśniach, rodopsyna w siatkówce oraz różne typy kolagenu w kościach i tkankach łącznych. Niektóre białka występują w wielu tkankach, ale w różnych ilościach. Wybrane zmiany składu
Ryż. 1.31. Rozdzielanie białek metodą chromatografii powinowactwa
A- wiązanie wyizolowanego białka ze specyficznym ligandem przyłączonym do obojętnego nośnika; B- uzyskanie roztworu pojedynczego białka
białka tkanek i krwi są możliwe i są związane przede wszystkim z dietą, składem żywności i aktywnością fizyczną człowieka.
W chorobach skład białkowy komórek krwi i tkanek może się znacznie zmienić, często rozwija się niedobór dowolnego białka lub zmniejszenie jego aktywności - proteinopatia. Dlatego oznaczenie wyraźnych zmian w składzie białek krwi i tkanek służy do diagnozowania różnych chorób w badaniach klinicznych.
Po wyekstrahowaniu mieszaniny białek z materiału biologicznego następuje jej rozdzielenie na poszczególne frakcje białkowe. Opracowano kilka metod frakcjonowania białek w oparciu o różne właściwości fizykochemiczne białek.
– wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym – metoda opiera się na właściwości białek do wytrącania się w punkcie izoelektrycznym w wyniku neutralizacji ładunku cząsteczki białka. Dla każdego białka wartość punktu izoelektrycznego jest ściśle indywidualna, dlatego metoda ta pozwala na izolację poszczególnych białek (więcej informacji o metodzie można znaleźć w pracy laboratoryjnej nr 3 w kursie „Biochemia”).
– frakcjonowanie białek metodą wysalania – opiera się na różnej rozpuszczalności białek w stężonych roztworach soli obojętnych, w zależności od masy cząsteczkowej (więcej informacji o metodzie można znaleźć w pracy laboratoryjnej nr 3 w kursie „Biochemia”).
– metoda separacji elektroforetycznej białka na frakcje - opisane w dziale właściwości fizykochemiczne białek.
Oprócz metod przedstawionych powyżej, są one powszechnie stosowane do rozdzielania białek na frakcje. metody chromatograficzne . Najczęściej stosuje się chromatografię kolumnową.
Osobliwością tej metody jest to, że mieszaninę cząsteczek różnych białek i peptydów przepuszcza się przez kolumnę zawierającą stały porowaty materiał (matrycę). W wyniku interakcji z matrycą różne białka przechodzą przez kolumnę z różną szybkością. Po dotarciu białek w określonej kolejności na dno kolumny zbiera się je w oddzielnych frakcjach do probówek.
Atrakcja trzy główne typy chromatografia kolumnowa:
– wymiana jonów – do chromatografii białek stosuje się wymieniacze jonowe na bazie celulozy lub innych polimerów hydrofilowych, np. dietyloaminoetylocelulozę (DEAE-celuloza), zawierającą grupy kationowe (ładunek ujemny) lub zawierającą karboksymetylocelulozę (CM-celuloza), zawierającą grupy aminowe (ładunek dodatni) :
Im silniejsze wiązanie białek z DEAE-celulozą, tym większa liczba grup karboksylowych w cząsteczce białka. Białka zaadsorbowane na celulozie DEAE można wymyć (eluować) z kolumny roztworami chlorku sodu o rosnących stężeniach. Najpierw eluowane są luźno związane białka, a wraz ze wzrostem stężenia soli eluowane są inne białka, w kolejności rosnącego powinowactwa do DEAE-celulozy.
Podobnie stosuje się celulozę CM, ale powinowactwo do niej białek jest wprost proporcjonalne do liczby grup aminowych w cząsteczce białka.
Aby usunąć związane białko, zmienia się również pH eluentu.
– chromatografia żelowo-filtracyjna – ma drugą nazwę „metoda sita molekularnego”. Jako sita stosuje się Sephadex (dekstran polisacharydowy poddany działaniu epichlorku hydryny). Ziarna Sephadexu pęcznieją w wodzie i tworzą żel. Spęcznione granulki mają pory o określonej średnicy.
Rozdzielenie polega na tym, że ziarna Sephadexu (pory granulek) są nieprzepuszczalne lub w ograniczonym stopniu przepuszczalne dla substancji o dużej masie cząsteczkowej, a małe cząsteczki swobodnie dyfundują (wnikają) w pory ziaren.
Żelopodobną masę spęczniałego Sephadexu umieszcza się w szklanej kolumnie (probówce), na powierzchnię żelu nakłada się warstwę roztworu białka (ryc. 12, a), a następnie przepuszcza się roztwór buforowy (ciecz eluująca). kolumna. Białka przechodzą wzdłuż kolumny pomiędzy granulkami im wolniej, tym niższa jest ich masa cząsteczkowa, gdyż cząsteczki białka o jeszcze mniejszej masie cząsteczkowej łatwiej dyfundują do granulek (do porów) (ryc. 12).
Ryż. 12. Frakcjonowanie białek metodą filtracji żelowej
Białka wymywa się (eluuje) z kolumny w kolejności malejącej masy cząsteczkowej. W rezultacie najpierw eluowane są duże cząsteczki białka (ryc. 12, b), które nie dyfundują do ziaren, następnie małe cząsteczki, a na końcu drobnocząsteczkowe zanieczyszczenia.
Metodę tę stosuje się nie tylko do frakcjonowania białek według masy cząsteczkowej, ale także do oczyszczania ich z zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej.
– Chromatografii powinowactwa – lub chromatografia powinowactwa. Zasada metody polega na tym, że dochodzi do selektywnego oddziaływania białek z określonymi substancjami – ligandami przyłączonymi do nośników (ryc. 13).
Jako nośnik stosuje się sefarozę aktywowaną bromkiem cyjanu. Do Sepharose przyłączane są ligandy różnego pochodzenia – substrat, bądź antygen, bądź receptor, który powinowactwa zwiąże tylko jedno białko z mieszaniny:
– substrat → enzym;
– antygen → przeciwciało;
– hormon → receptor dla danego hormonu.
Inne białka niezwiązane z ligandem usuwa się poprzez przemywanie kolumny.
Ryż. 13. Mechanizm chromatografii powinowactwa
Usuwanie białka związanego z powinowactwem z kolumny przeprowadza się przy użyciu roztworu buforowego (eluent). Do buforu wprowadza się detergent, który osłabia wiązania pomiędzy białkiem a ligandem, lub przez kolumnę przepuszcza się roztwór o wysokim stężeniu wolnego ligandu. W tym przypadku białko łatwiej wiąże się z wolnym ligandem i jest wypłukane (wyeluowane) z kolumny.
Praca laboratoryjna nr 8
ELEKTROFORETYCZNA SEPARACJA BIAŁEK
Metoda opiera się na fakcie, że cząsteczki białka mają ładunek elektryczny, którego wielkość i znak są określone przez skład aminokwasowy białka, pH i siłę jonową środowiska. Pod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego naładowane cząsteczki przemieszczają się w roztworze w kierunku przeciwnie naładowanego bieguna. Prędkość ruchu cząstek białka jest proporcjonalna do wielkości ich ładunku i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząstek i stopnia ich uwodnienia.
Obecnie rozpowszechniona jest tzw. „elektroforeza strefowa” – elektroforeza na stałym nośniku (na paskach papieru, agarze, skrobi, akrylamidzie) impregnowanym roztworem buforowym o żądanej wartości pH. Położenie białek na papierze lub żelu określa się poprzez utrwalenie ich, a następnie wybarwienie jednym lub innym barwnikiem (najczęściej błękitem bromofenolowym, czernią amidową lub błękitem Coomassie). Ilość białka w każdej frakcji można w przybliżeniu określić na podstawie intensywności koloru powiązanego barwnika. Definicja ta nie podaje ściśle ilościowego stosunku frakcji białkowych, gdyż ilość barwnika związanego przez różne białka nie jest taka sama.
ELEKTROFOREZA HA PAPIER
Rozdzielanie analizowanej mieszaniny następuje na niektórych rodzajach bibuł chromatograficznych impregnowanych roztworem buforowym w urządzeniach do elektroforezy. Białka rozdzielane są przy napięciach do 500 V.
Komora do elektroforezy składa się z wanny z plexi i zamontowanej na niej pokrywy (1). Wanna posiada 2 komory elektrodowe (2), z których każda jest przedzielona podłużną przegrodą (3) na dwie komory komunikujące się ze sobą. Bo wewnętrzne przegródki przegródek obniżają elektrody, a końce pasków papieru do zewnętrznych przegródek (4), którego główna część umieszczona jest na poziomej płycie z kolcami (5), umieszczonej w środkowej części komory. Pomiędzy płytą poziomą a zewnętrznym przedziałem przedziałów elektrod znajdują się drążki (6),
Ryc.2. Schemat urządzenia do elektroforezy niskonapięciowej
przez które przerzucane są paski papieru i które służą do ich podtrzymywania. Pod górną pokrywą komory znajduje się płyta z plexi z dużymi okrągłymi otworami (7), na której umieszcza się arkusze bibuły filtracyjnej nasączonej wodą destylowaną i złożone 4-5 razy. Arkusze te pozwalają zwiększyć szczelność komory, a co za tym idzie, ograniczają parowanie cieczy z elektroforezy podczas elektroforezy.
Za pomocą elektroforezy papierowej uczniowie proszeni są o oddzielenie białek surowicy krwi. Metodą tą można podzielić surowicę krwi na 5 - 9 frakcji i w każdej z nich określić względną zawartość białka. Rozdział przeprowadza się w roztworze buforowym (pH 8,6 - 8,9) o gradiencie potencjału 3 - 5 V/cm (120 - 350 V dla pasków o długości 40 - 45 cm) w temperaturze pokojowej. Prąd nie powinien przekraczać 0,1 - 0,3 mA na każdy centymetr przekroju paska papieru. Zwiększanie siły prądu więcej niż 2 razy jest niedopuszczalne, ponieważ spowoduje to nadmierne nagrzewanie, znaczny wzrost parowania i V ostatecznie – spalenie papieru
Odczynniki:
1. Roztwór buforowy. Może być użyte:
a) bufor weronal-medinal (pH 8,6): rozpuścić 10,32 gmedinalu (sól sodowa weronalu) w 300 ml wody destylowanej, dodać 1,84 gweronalu, podgrzewać mieszając w łaźni wodnej do rozpuszczenia i dodać wodę do 1 litra;
b) bufor octanu weronalu (pH 8,6): 4,3 weronalu, 0,95 wodorotlenku sodu i 3,24 octanu sodu rozpuszcza się w 300 ml wody destylowanej. Do roztworu dodać 30 ml 0,1 M roztworu HCl i dodać wodę do 1 litra;
c) Bufor Tris (pH 8,9): 60,5 g Tris, 6 etylenodiaminotetraoctowy i 4,6 kwasu borowego rozpuszcza się w 1 wodzie destylowanej.
2. Rozwiązania do barwienia elektroforogramów:
a) kwaśny niebiesko-czarny barwnik (podobny do czerni amidowej 10 B) -0,2 g mieszaniny: kwas octowy (lodowaty) - 100 ml + alkohol metylowy - 900 ml;
b) błękit bromofenolowy – 0,5 g, chlorek rtęci – 10 g, kwas octowy (lodowaty) – 20 ml, woda destylowana – 980 ml;
c) błękit bromofenolowy – 0,1 g, ZnSO4 · 7H 2 O – 50 g, kwas octowy (lodowaty) 50 ml, woda destylowana – 900 ml.
3. Roztwory do wymycia elektroforogramów z barwnika niezwiązanego z białkiem i utrwalenia barwnika na białku:
a) kwas octowy - 2% roztwór;
b) octan sodu – 2% roztwór przygotowany z 10% roztworu kwasu octowego.
4. Roztwory do elucji kolorowych produktów z elektroforogramów:
a) ekstrahować błękit bromofenolowy - 0,01 M roztwór NaOH;
b) ekstrahować kwaśny niebiesko-czarny barwnik – 0,1 M roztwór NaOH.
Sprzęt: probówki; kuwety, spektrofotometr, aparat do elektroforezy, bibuły chromatograficzne: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM itp.
Pobranie surowicy krwi. Do suchej probówki wirówkowej pobiera się 2 - 3 ml krwi i pozostawia na 1/2 - 1 h. Za pomocą cienkiego szklanego pręta ostrożnie okrążyć ścianki probówki, aby oddzielić od nich skrzep, odwirować i wlać surowicę do czysta rura.
Przygotowanie aparatu. Przedziały elektrod napełnia się roztworem buforowym do tego samego poziomu (aby uniknąć przepełnienia buforu), około 800 ml w każdym przedziale. Bo wewnętrzne części przedziałów elektrod zanurzają elektrody. Na kartce papieru chromatograficznego (18x45 cm) (w przypadku stosowania cienkich rodzajów papieru lepiej nakładać próbki na osobne paski o szerokości 4-5 cm) w odległości 15 cm od jednego z jej wąskich boków, użyj zwykłej miękkiej ołówkiem (grafit zapobiega rozlewaniu się cieczy) do obrysowania miejsc nałożenia próbek. Są to prostokąty (2 x 0,3 cm), których duże boki są prostopadłe do długości paska papieru. Odległość pomiędzy strefami początkowymi a krawędziami elektroforegramu wynosi 2 cm Elektroforeogram impregnowany jest buforem, w którym będzie przebiegać elektroforeza. W tym celu przeciąga się go przez kuwetę z roztworem buforowym. Końce pasków papieru (6-8 cm) nie są zwilżone. Nadmiar buforu usuwa się poprzez osuszenie pasków pomiędzy dwoma lub trzema arkuszami bibuły filtracyjnej. Mokry elektroforogram umieszcza się w komorze na środkowej poziomej płytce (5), a końce opuszcza się do zewnętrznych przedziałów przedziałów elektrod.Urządzenie szczelnie zamyka się pokrywą, pod którą znajdują się arkusze bibuły filtracyjnej zwilżonej woda.
Przeprowadzenie elektroforezy. Po całkowitym nasyceniu pasków bibuły roztworem buforowym, za pomocą pipety 0,1 ml na zaznaczone obszary nanosi się próbki 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg białka) surowicy. Komorę zamyka się pokrywą i włącza prąd. Czas trwania elektroforezy wynosi 22 - 24 godziny przy napięciu 200 - 300 V
Utrwalanie i barwienie elektroforogramów. Po zakończeniu elektroforezy należy wyłączyć prąd i natychmiast usunąć elektroforeogramy z urządzenia. Umieszcza się je na specjalnym stojaku i suszy na powietrzu pod przeciągiem, następnie w piekarniku nagrzanym na 105°C na 20 minut w celu utrwalenia białek na papierze, po czym umieszcza się je w emaliowanej kuwecie, napełnia barwnikiem i pozostawia na 2 - 3 godziny lub więcej. Barwnik odsącza się i elektroforogramy wypłukuje się z jego nadmiaru zalewając 3-4 razy 2% roztworem kwasu octowego, każdorazowo przez 5-10 minut. Obszary papieru niezawierające białka muszą być całkowicie wolne od barwnika. Aby utrwalić kolorowe produkty, elektroforogramy napełnia się 2% roztworem octanu sodu przez 2 minuty i suszy na powietrzu pod zasysaniem.
Oznaczanie proporcji poszczególnych frakcji białkowych. Przy pH 8,6 białka surowicy są naładowane ujemnie i poruszają się w polu elektrycznym w kierunku anody. Frakcją najszybciej przemieszczającą się do anody jest albumina, a następnie α 1 -, α 2 -, β- i γ-globuliny (patrz ryc. 3) . Sekcje taśm papierowych, na których pojawiły się plamy białkowe, dzielimy poprzecznymi liniami za pomocą prostego ołówka na paski o szerokości 3-5 mm i wycinamy wzdłuż tych linii. Każdy pasek rozgniata się i umieszcza w osobnej, ponumerowanej probówce, wypełnionej 3 ml 0,01 M roztworu NaOH, pozostawionej na godzinę w celu usunięcia farby z papieru, a następnie dla każdego roztworu oznacza się wartość gęstości optycznej na fotokolorymetrze ( spektrofotometr) przy 612 nm.
Ryż. 3. Elektroferogram surowicy krwi ludzkiej i krzywa rozkładu frakcji białkowych
Próbka kontrolna jest przetwarzana równolegle. W tym celu z niezabarwionych obszarów elektroforogramu wycina się pasek.
Na podstawie uzyskanych danych na elektroforogramie nanosi się krzywą rozkładu produktów kolorowych, na osi odciętych zaznacza się numery probówek, a na osi rzędnych odpowiednią wartość gęstości optycznej (patrz rys. 3). . Oblicza się procentową zawartość frakcji białkowych w surowicy krwi. W tym celu narysowaną krzywą dzieli się według minimów na liczbę odcinków odpowiadających poszczególnym ułamkom. Wielkość powierzchni każdej sekcji jest proporcjonalna do ilości farby połączonej z białkiem danej frakcji. Stosunek tych obszarów oblicza się wagowo (waga odcinków papieru jest proporcjonalna do ich powierzchni), całą powierzchnię przyjmuje się jako 100%. Jeśli dysponujesz densytometrem, na podstawie densytogramu możesz określić stosunek frakcji białkowych w surowicy krwi.
Po uprzednim określeniu zawartości białka w serwatce oblicza się jego ilość dla każdej frakcji.
