DNA-Reparatur

allgemeine Informationen

DNA-schädigende Mittel

Strahlung

1. ionisierende Strahlung (Gammastrahlen, Röntgenstrahlen)

2. Ultraviolette Strahlung (insbesondere ~260 nm, in diesem Bereich findet die maximale Absorption von DNA statt)

Reaktive Sauerstoffradikale, die während der normalen Zellatmung auf verschiedenen biochemischen Wegen entstehen.
Umweltchemikalien.

viele Kohlenwasserstoffe.

Chemikalien, die in der Chemotherapie gegen Krebs verwendet werden.

Arten von DNA-Schäden

1. Alle vier Basen in der DNA (A, T, C, G) können an verschiedenen Positionen kovalent modifiziert werden.
Am häufigsten ist der Verlust der Aminogruppe (Desaminierung) – in diesem Fall wird C zu U.
Falscher Baseneinbau aufgrund von Fehlern in der Arbeit von DNA-Polymerasen während der Replikation.
Meistens ist Uracil anstelle von Thymin enthalten.
Strukturverstöße.
Brüche können in der DNA auftreten. Brüche können einzelsträngig sein oder beide DNA-Stränge können brechen.

Ionisierende Strahlung kann eine häufige Ursache für solche Brüche sein.
Eine kovalente Bindung kann zwischen benachbarten Basen gebildet werden, und die Bindung kann zwischen benachbarten Basen im selben Strang oder zwischen zwei DNA-Strängen gebildet werden.
Arten von DNA-Schäden
ein Basiswechsel
Apurinisierung
Wechsel von s nach y
Substitution von A durch Hypoxanthin
Basenalkylierung
Insertion oder Deletion eines Nukleotids
Einbettung einer ähnlichen Basis
Wechsel von zwei Stützpunkten
Bildung von Thymin-Dimeren
Vernetzung mit einem bifunktionellen Alkylierungsmittel
Kettenbruch
ionisierende Strahlung
radioaktive Zerstörung von Kernelementen
Querverbindungen
zwischen den Basen eines Fadens oder zweier paralleler Fäden
zwischen DNA und Proteinmolekülen wie Histone

Reparatur von beschädigten Basen

Beschädigte Basen können auf verschiedene Arten repariert werden:
Direkte Reparatur von chemischen Schäden.

Exzisionsreparatur (ER), bei der die beschädigte Basis entfernt und durch eine neue ersetzt wird. Es gibt drei Exzisionsreparaturmodelle, von denen jedes seinen eigenen Satz von Enzymen verwendet.
Basisexzisionsreparatur (BER).
Nukleotidexzisionsreparatur (NER).
Mismatch Reparation (MMR).

Direkte Schadensbehebung.

Die häufigste Ursache für Punktmutationen beim Menschen ist die spontane Addition einer Methylgruppe, eine Art der Alkylierung. Solche Modifikationen werden durch Enzyme namens Glykosylasen korrigiert, die den Fehler korrigieren, ohne den DNA-Strang zu zerstören.

Einige Medikamente, die in der Chemotherapie verwendet werden, schädigen auch die DNA durch Alkylierung.
Das Problem der Reparatur besteht darin, dass die Zelle mit einer begrenzten Anzahl von Enzymen und Mechanismen viele Schäden bewältigen muss, die durch eine Vielzahl chemischer und physikalischer Einwirkungen verursacht werden.

Basisexzisionsreparatur (BER)

Wichtigste Schlüsselereignisse:

1. Entfernung der beschädigten Basis (tritt etwa 20.000 Mal am Tag in jeder Zelle des menschlichen Körpers auf) DNA-Glykosylamin. Menschen haben mindestens 8 Gene, die verschiedene DNA-Glykosylasen codieren, von denen jedes einen anderen Satz von Basenschäden erkennt.
2. Die Entfernung von Desoxyribophosphat führt zur Bildung einer Lücke in der DNA.
3. Ersetzung durch das richtige Nukleotid. Diese Funktion wird beim Menschen von der Betta-DNA-Polymerase übernommen.
4. Ligatur des Kettenbruchs. Es gibt zwei Enzyme, beide benötigen ATP.

Nukleotidexzisionsreparatur (NER)

NER unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von BER.
Verwendung verschiedener Enzymsysteme.
Selbst wenn der Fehler in einem Nukleotid liegt, werden im Schadensbereich viele Nukleotide auf einmal entfernt.

Wichtigste Schlüsselereignisse von NER:
1. Schäden werden durch einen oder mehrere Faktoren erkannt, die mit der Schadensstelle verbunden sind.
2. DNA wickelt sich an der Schadensstelle ab. Dieser Prozess beinhaltet
verschiedene Transkriptionsfaktoren IIH, TFIIH, (die auch bei der normalen Transkription funktionieren).
3. Der DNA-Schnitt erfolgt von den 3"- und 5"-Enden der Beschädigung, wodurch das DNA-Fragment, das das beschädigte Nukleotid enthält, entfernt wird.
4. Ein neuer DNA-Strang wird nach der Vorlage eines intakten DNA-Strangs durch Delta- oder Epsilon-Polymerasen vervollständigt.
5. Ligasen vernetzen das neu synthetisierte Ende der Kette.

Pigment-Xerodermie (XP)
XP ist eine seltene Erbkrankheit des Menschen, die bei Lichteinwirkung Hautschäden verursacht, die letztendlich zur Entwicklung von Hautkrebs und zum Tod des Patienten führen.
Die Krankheit tritt aufgrund von Mutationen in den Genen auf, die an der NER-Reparatur beteiligt sind. Zum Beispiel:
XPA codiert ein Protein, das an die Verletzungsstelle bindet und den Aufbau des Reparaturkomplexes unterstützt.
XPB und XPD, die Bestandteile des Transkriptionsfaktors TFIIH sind. Bestimmte Mutationen in XPB und XPD können auch für vorzeitiges Altern verantwortlich sein.
XPF schneidet den DNA-Strang am 5-Zoll-Ende des Schadens.

Das XPG schneidet die Kette am 3"-Ende.

Mismatch Reparation (MMR)

Die Mismatch-Reparatur korrigiert fälschlicherweise eingebettete intakte Basen, die keine normale Watson-Crick-Paarung bilden (A T, C G). Solche Fehler treten während des Betriebs der DNA-Polymerase während der Replikation auf.
Die Mismatch-Reparatur umfasst Enzyme, die sowohl an der BER- als auch an der NER-Reparatur beteiligt sind, sowie spezialisierte Enzyme.
Die DNA-Synthese während der Fehlpaarungsreparatur wird von den DNA-Polymerasen Delta oder Epsilon durchgeführt.
Das Mismatch-Reparatursystem ist an der Erhöhung der Genauigkeit der Rekombination während der Meiose beteiligt.

Reparatur von DNA-Brüchen

Ionisierende Strahlung und einige Chemikalien können einen oder zwei DNA-Stränge brechen.
Einzelstrangbrüche (SSB)
Brüche in einem der DNA-Stränge werden oft durch Enzyme repariert, die an der BER-Reparatur beteiligt sind.
Doppelstrangbrüche (DSB)
Es gibt zwei Mechanismen, die in der Lage sind, DNA-Doppelstrangbrüche zu beseitigen:
Direkte Verbindung von gebrochenen Enden. Dieser Prozess erfordert spezielle
Enzyme, die die gebrochenen Enden mit ihrer anschließenden Vernähung erkennen und binden. Wenn die gebrochene DNA stumpfe Enden hat und die Verbindung zweier DNA-Fragmente zufällig erfolgt, wird eine solche Reparatur als NHEJ bezeichnet. Das Ku-Protein ist für NHEJ essentiell. Ku ist eine heterodimere Untereinheit, die aus zwei Proteinen Ku70 und Ku80 besteht.
Ursache für Translokationen können Fehler sein, die beim direkten Anhängen auftreten.
Polynukleotid-Ligase- restauriert. einzelne Kette DNA-Brüche

Homologe Rekombination

Die homologe Rekombination ist in der Lage, gebrochene Enden von Chromosomen zu reparieren, indem DNA aus dem intakten Schwesterchromatid verwendet wird, das nach der Chromosomenduplikation verfügbar ist.
Die für die homologe Rekombination erforderlichen Gene sind BRCA-1 und BRCA-2.

Genumwandlung
Der Spender des neuen Gens kann sein:
homologes Chromosom (während der Meiose)
Schwesterchromatid (auch während der Meiose)
dupliziertes Gen auf demselben Chromosom (während der Mitose)

Korrektur von Fehlern durch 3'-5'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase während der Replikation (nur in Prokaryoten) (Mutation von E. coli mutD-Mutator-Change-DNA-Pol.III-Untereinheit)
Thymin-Dimere, Photolyase-Enzymgen-phr (in niederen Eukaryoten)
Entfernung angehängter Alkyl- und Methylgruppen – O-6-Methylguanin-Transferase (ada-Gen) – entfernt O-6-Methylguanin
Exzision r. Basen [E. coli] [Mensch | Schadenserkennung. XPA-Protein in Verbindung mit RPA | beteiligt f-r transkr. TFIIH (P52, P34, P44, P62, XPB-XPD-Helicase-Aktivität) | ERCC1-XPF, XPG - Nukleasen, schneiden DNA auf beiden Seiten des Schadens. | DNA-Polymerase- und Hilfsstoffe. Proteine ​​RFC und PCNA füllen die Lücke]
R. stickstoffhaltige Basen.-Glykosylase entfernt basisch.
AP-Stelle (Apurin, Apyrimidin) | AP-Endonuklease erkennt eine Lücke, einen Schnitt. 5'-DNA
postreplikativ r. (PRP)
SOS-r. Proteine ​​komp. mit DNA-Polymerase, Tochter. DNA baut sich gegen Schäden auf. DNS

Abkürzungen.
BER - Reparatur der Basisexzision

NER - Nukleotid-Exzisionsreparatur
MMR - Mismatch-Reparatur
NHEJ - Nonhomologes End-Joining

Fehlanpassung

Bei der Replikation können aufgrund von Polymerasefehlern nicht komplementäre Nukleotide eingefügt werden, was zu Mutationen im Tochter-DNA-Strang führen kann. Ungepaarte Basen werden von Mismatch-Reparaturenzymen erkannt und führen den Austausch fehlgepaarter Nukleotide durch.

Enzyme dieses Systems sorgen für homologe Rekombination sowie Verzögerung des Zellzyklus als Reaktion auf DNA-Schädigung.
Das Mismatch-Reparatursystem von E. coli, das MutHLS-Proteine ​​verwendet, erkennt und repariert alle nicht komplementären Basenpaare außer C–C. Außerdem repariert dieses System kleine Inserts in einem der DNA-Stränge, die durch Replikationsfehler entstanden sind und deren Länge vier Nukleotide nicht überschreitet.
Normalerweise ist E. coli-DNA methyliert Dam-Methylase nach Websites GATC. Nachdem die Replikation jedoch abgeschlossen ist, bleibt der Tochterstrang der DNA für einige Zeit unmethyliert.
Dieses System kann in vitro rekonstruiert werden
DNA mit einem einzelnen methylierten Strang als Substrat, zu der gereinigte Proteine ​​MutH, MutL, MutS, UvrD (Helicase II), DNA-Polymerase III, Holoenzym, DNA-Ligase, SSB-Protein und eine der Exonukleasen: ExoI, ExoVII oder RecJ hinzugefügt werden . Der Reparaturprozess wird initiiert, indem ein Einzelstrangbruch in den unmethylierten Strang in der Nähe der teilweise methylierten GATC-Stelle eingeführt wird, gefolgt von einer Hydrolyse des DNA-Strangs und dem Auffüllen der resultierenden Einzelstranglücke. In diesem Fall bindet das MutS-Protein an fehlgepaarte Nukleotide. Das MutL-Protein hat keine enzymatische Aktivität, obwohl es mit MutS interagiert und für die Aktivierung von MutH, einer Endonuklease, die Einzelstrang-DNA-Brüche durchführt, notwendig ist. Somit stimuliert der an der DNA-Stelle mit einem fehlgepaarten Nukleotid zusammengesetzte MutS-MutL-Komplex die Endonuklease(Nickase)-Aktivität von MutH. Das zellfreie System erfordert nicht das Vorhandensein von MutH in Gegenwart eines Einzelstrangbruchs im DNA-Substrat. MutHLS-Reparatursystem kann
Verwenden Sie teilweise methylierte GATC-Sequenzen, die sich über und unter der beschädigten DNA-Region befinden. Gleichzeitig im
an der Exzision des irrtümlich eingefügten Nukleotids ist zusätzlich zur Helikase II eine der Exonukleasen beteiligt: ​​ExoI (3'-exo), ExoVII (3'- und 5'-exo) oder RecJ (5'-exo). über die Lage der GATC-Stelle in Bezug auf das korrigierte Nukleotid. Nach dem Ausschneiden des Nukleotids wird die resultierende einzelsträngige Lücke mit dem DNA-Polymerase-III-Holoenzym in Gegenwart des SSB-Proteins und der DNA-Ligase gefüllt. Es sollte betont werden, dass die Verwendung des MutH-Proteins und der Dam-Methylase zur Erkennung des Tochterstrangs der replizierten DNA eine einzigartige Eigenschaft von Gram-negativen Bakterien ist. Gram-positive Bakterien methylieren keine DNA-Stränge für Markierungszwecke. Wenn die GATC-Stellen vollständig methyliert sind, modifiziert das MutHLS-Reparatursystem von E. coli fehlgepaarte Nukleotide in beiden DNA-Strängen mit gleicher Effizienz.
E. coli hat mindestens zwei spezifischere
Nicht übereinstimmende Nukleotidreparaturwege. Das VSP-System (Very Short Patch Repair Pathway) repariert nicht komplementäre G-T-Paare und ersetzt sie durch G-C. Es wird angenommen, dass solche Paare als Ergebnis der Desaminierung von 5-Methylcytosin an Stellen gebildet werden, an denen C-Reste durch Dcm-Methylase methyliert werden. Bei geringerer Effizienz ersetzt dasselbe System G–U-Paare durch G–C. Ein weiteres MutY-abhängiges Reparatursystem kehrt spezifisch die Auswirkungen der oxidativen Schädigung von Guanin um. Wird dGTP zu 8-Oxo-dGTP oxidiert, spaltet das MutT-Protein letzteres und verhindert so den Einbau in die DNA. Schaltet es dennoch den entgegengesetzten Rest C ein, dann entfernt die Fpg-Glycosylase (MutM) diese modifizierte Base. Falls 8-Oxo-G in der DNA verbleibt, paart es sich in der nächsten Replikationsrunde mit A, und als Ergebnis kann die G-C>T-A-Transversion auftreten. In diesem Fall wirkt das MutY-Protein als DNA-Glykosylase, indem es den A-Rest aus dem falschen Paar entfernt, und als AP-Lyase, die einen Einzelstrang einführt
Pause in der Nähe des AP-Standorts. Das Folgende sind die oben bereits im Zusammenhang mit dem Funktionieren des BER-Reparatursystems diskutierten Prozesse. Die Reaktionsfolge, an der MutY beteiligt ist, repariert auch nicht komplementäre A–G- und A–C-Paare, um C–G- bzw. G–C-Paare zu bilden. Mismatched base repair in Eukaryoten tritt auf, wenn
Beteiligung eines Komplexes von Proteinen ähnlich dem MutHLS-System von Bakterien. Das menschliche GTBP-Protein ist ein Homolog des bakteriellen MutS-Proteins, während in Hefe das Msh6-Protein die entsprechende Rolle spielt. Die Erkennung fehlgepaarter Nukleotide beim Menschen erfolgt durch das MSH2-GTBP-Heterodimer. MutL-Homologe in S. cerevisiae-Zellen sind MLH1- und PMS2-Proteine, die auch als heterodimere Komplexe existieren. Mutationen in den Genen, die diese Proteine ​​beim Menschen codieren, werden von der Bildung eines Mutator-Phänotyps und der Entwicklung von erblichem nicht-polypösem Dickdarmkrebs (HNPCC-Syndrom) begleitet.

Direkte Wiedergutmachung

Es gibt zwei Hauptwege für die Reparatur von Alkylbasen: Basenexzisionsreparatur (BER) und direkte Reparatur beschädigter Basen. Während der BER spalten DNA-Glykosylasen im ersten Schritt zytotoxische alkylierte Basen in der DNA unter Bildung der AP-Stelle und deren anschließender Prozessierung.Bei der direkten Reparatur werden zwei Methoden angewendet: Reparatur durch Alkyltransferasen oder Oxidation der Alkylgruppe, in beiden Fällen erfolgt eine Regeneration intakter Basen. Wenn die Reparatur durch Alkyltransferasen erfolgt (bei Säugetieren wird auf diesem Weg nur O 6 -Alkylguanin repariert), dann überträgt die O 6 -Alkylguanin-Transferase (AGT) eine Methyl- oder Ethylgruppe von O 6 -Alkylguanin auf einen ihrer eigenen Cysteinreste . Das aufgrund seiner eigenen Aktivität alkylierte Protein wird inaktiviert, kann aber als Regulator der Aktivität seines eigenen Gens und mehrerer anderer dienen. Im Gegensatz zu selbstmörderischen O 6 -Methylguanin-Transferasen, die stark mutagen und toxisch demethylieren
Schädigung von O 6 -Methylguanin, AlkB aus E. coli und seinen humanen Analoga hABH2 und hABH3 oxidiert 1-Methyladenin (1-meA) und 3-Methylcytosin (3-meC) Methylgruppen in DNA, um unmodifizierte Adenin- und Cytosinbasen zu regenerieren.

O 6 -Alkylguanin-Transferase

O 6 -Alkylguanin-Transferase-Aktivität findet sich in den meisten Organismen und verhindert die mutagene Wirkung von O 6 -Alkylguanin. AGT wandelt O 6 -Alkylguanin in Guanin um, indem es in einer irreversiblen Reaktion eine Alkylgruppe aus der DNA auf einen reaktiven Cysteinrest im Protein überträgt.

Diese kovalente Bindung einer Alkylgruppe an einen Cysteinrest inaktiviert das Enzym. Daher ist AGT ein selbstmörderisches Enzym, das nach einem proteolytischen Abbau unterliegt
Transalkylierungsreaktionen. Strukturstudien zeigen, dass sich das aktive Zentrum von AGT im Enzymvolumen in einigem Abstand von der DNA-Bindungsstelle befindet. Es wird angenommen, dass das Enzym durch einen "Nucleotid-Flip"-Mechanismus "funktioniert", um die Substratbase nahe an die nucleophile aktive Stelle von AGT zu bringen.

Die Bedeutung von AGT beim Schutz von Säugetieren vor den toxischen und mutagenen Wirkungen von Alkylierungsmitteln wurde an Mäusen nachgewiesen. Transgene Mäuse, die AGT überexprimieren, zeigen eine signifikant niedrigere Rate der Tumorentstehung als Reaktion auf die Wirkung des Methylierungsmittels N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff, während AGT-defiziente Mäuse im Vergleich viel anfälliger für eine Tumorinitiierung und die toxischen Wirkungen dieses Mittels waren zu wilden Mäusen. AGT ist ein wichtiges Enzym in der Antitumortherapie, da es die zytotoxischen Wirkungen von Antitumormitteln der Klasse der Chlorethylnitrosoharnstoffe (CENU), z.
BCNU (N,N-bis(2-chlorethyl)N-nitrosoharnstoff) oder Temozolomid. Es hat sich gezeigt, dass die Menge, in der AGT in Tumoren vorhanden ist, hauptsächlich bestimmt, wie günstig das Ergebnis einer Antitumortherapie mit CENU sein wird. CENU reagiert zunächst mit der O 6 -Carbonylgruppe von Guanin, um die Verbindung zu bilden 4 , das anschließend zu N 1 , O 6 -Ethanoguanin umgewandelt wird 5 . Verbindung 5 regruppiert sich innerhalb weniger Stunden zu einer physiologisch aktiven ICL 6 . AGT greift in die Bildung ein 6 bei der Interaktion mit 4 oder 5 B. Guanin erneuern oder ein DNA-Protein-Addukt bilden 8 . Experimentelle Bestätigung der Adduktbildung 8 , aber es wurde in zu geringer Menge für seine detaillierte Beschreibung isoliert. In einer biochemischen Untersuchung dieses Problems wurde N 1 , O 6 -Ethanoxanthin eingeführt
9 als stabiler Gegenpart 5 in DNA. Ethanoxanthin 9 reagiert mit AGT, um ein stabiles DNA-Protein-Addukt zu bilden 7 . Dieser Ansatz ermöglichte die Bildung eines kovalent gebundenen AGT-DNA-Addukts 10 in großen Mengen, die verwendet werden können, um die Struktur von AGT zu bestimmen, die mit DNA assoziiert ist. Die Wechselwirkung von AGT und Alkylierungstherapie hat zur Suche nach AGT-Inhibitoren geführt, die in der Krebstherapie in Verbindung mit Alkylierungsmitteln verwendet werden können. Bisher wurden Inhibitoren geschaffen, hauptsächlich Guaninderivate mit Substituenten in der O 6 -Position. O 6 -Benzylguanin 2 hat sich als typischer AGT-Hemmer herausgestellt, mit dem neue Moleküle verglichen werden. Die Wirksamkeit von O 6 -BzG bei der Verstärkung der CENU-Zytotoxizität wurde in Tiermodellen gezeigt. Der limitierende Faktor dieses therapeutischen Ansatzes ist die Toxizität für gesunde Organe, teilweise für das Knochenmark. Manche
Eine Gruppe von Wissenschaftlern will dieses Problem umgehen, indem sie eine gegen die O 6 -BzG-Hemmung resistente ATG-Variante generiert, die zum Schutz des Knochenmarks durch Gentransfer eingesetzt werden kann.

AlkB-, hABH2- und hABH3-Oxidoreduktasen

Ein weiterer Weg zur direkten Reparatur von Alkylbasen ist die Oxidation der Alkylgruppe unter Regenerierung der intakten stickstoffhaltigen Base. Das AlkB-Enzym von Escherichia coli und zwei humane Analoga, hABH2 und hABH3, demethylieren gezielt 1-Methyladenin und 3-Methylcytosin in der DNA. Aber im Gegensatz zu AGT haben diese Enzyme eine Substratspezifität, die auf die Oberfläche der G:C- und A:T-Basenpaare gerichtet ist. Schädigung von 1-Alkyladenin
und 3-Methylcytosin werden gebildet, wenn Adenin und Cytosin in einer Einzelstrangstruktur vorliegen (während der Replikation oder Transkription) und Substrate für AlkB, hABH2 und hABH3 sind. Sie oxidieren die Methylgruppen von 1-Methyladenin (1-meA) und 3-Methylcytosin (3-meC) in der DNA, um die stickstoffhaltigen Basen von Adenin und Cytosin zu regenerieren. Es wurde auch gezeigt, dass AlkB vor toxischen Schäden schützt – ein Addukt mit einer Ethylgruppe und wandelt 1-Ethyladenin in Adenin in DNA um, das als Ergebnis der Reaktion Acetaldehyd produziert. Auf diese Weise werden Schäden an dem bekannten mutagenen und karzinogenen Ethylenoxid repariert, das endogen während des Ethylenstoffwechsels gebildet wird und auch weithin als Begasungsmittel für die Sterilisation verwendet wird. Durch Ethylenoxid erzeugte Hydroxyethyladdukte werden in der Zell-DNA gefunden. Auch andere kleinalkylierende Epoxide werden in großen Mengen in der chemischen Industrie eingesetzt. AlkB reduziert nachweislich die toxischen Wirkungen von DNA-schädigenden Mitteln, die Hydroxyethyl erzeugen,
Propyl- und Hydroxypropyladdukte. AlkB repariert alkylierte 1-me-dATP-Triphosphate aktiv, aber ineffizient. Es wurde angenommen, dass diese Fähigkeit den Grad des Einbaus von Alkyltriphosphaten während der DNA-Synthese verringern kann; außerdem kann das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in E. coli 1-me-dATP als Vorläufer für die in-vitro-DNA-Synthese verwenden. Die menschlichen Enzyme hABH2 und hABH3 demethylierten auch 1-Methyladenin-Reste in Poly(dA) und waren auf kurzen Substraten unwirksam. Somit hatte hABH3 eine sehr geringe Aktivität auf dem d(Tp1-meApT)-Trimer, während auf hABH2 keine Aktivität gefunden wurde.

AlkB und seine humanen Analoga sind Teil der α-Ketoglutarat/Fe(II)-abhängigen Superfamilie der Dioxygenasen, und während des Reparaturprozesses treten die Decarboxylierung von β-Ketoglutarat und die oxidative Demethylierung der beschädigten Base zusammen auf. 1-meA- und 3-meC-Läsionen werden hauptsächlich in einzelsträngiger DNA gebildet und vermutlich
treten an der Replikationsgabel und in aktiv transkribierten Genen auf, wo sie DNA- und RNA-Polymerasen blockieren können. Tatsächlich reparieren AlkB, hABH2 und hABH3 diese Läsionen in einzelsträngiger DNA, aber Oligonukleotide, die nach der Alkylierung an den komplementären Strang anneliert werden, reparieren ebenfalls. AlkB 1-Methadenin-Reparatureffizienz hängt nicht von der Polynukleotidstruktur ab, aber das Vorhandensein einer Nukleotid-5'-Phosphatgruppe ist erforderlich.Auch die menschlichen Enzyme hABH2 und hABH3 demethylierten 1-Methyladeninreste zu Poly(dA), sie waren auf kurzen Substraten unwirksam Zusätzlich wurden positiv geladene Läsionen (Ribonukleoside 1-meA bzw. 3-meC, pKa = 9,3 und 9,6) besser repariert als ungeladene Basen (1-meG und 3-meT Grad 3-meT). durch AlkB repariert werden, dann ist die formal positive Ladung der Base keine notwendige Bedingung für das Funktionieren von AlkB.
Es ist noch nicht klar, ob dieses Ergebnis davon abhängt, dass positiv geladene Basen durch elektrostatische Wechselwirkungen mit AlkB besser erkannt werden, oder ob positiv geladene Basen DNA nach der Methylgruppenhydroxylierung einfach zu einer besseren Abgangsgruppe machen.

Abkürzungen:

• AGT - Alkylguanin-Transferase
• BER - Basenexzisionsreparatur
• DNA - Desoxyribonukleinsäure
• RNA - Ribonukleinsäure
• BCNU - N,N-bis(2-Chlorethyl)N-Nitrosoharnstoff
• CENU - Chlorethylnitrosoharnstoff
• O 6 -BzG-O 6 -Benzylguanin
• 1-meA - 1-Methyladenin
• 1-meG - 1-Methylguanin
• 3-meC - 3-Methylcytosin
• 3-meT - 3-Methylthymin

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Reparatur von DNA-Brüchen

Photoreaktivierung

Die Absorption von UV-Strahlungsenergie durch DNA-Moleküle führt zur Bildung verschiedener Arten von Schäden. Obwohl Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie DNA-Protein-Vernetzungen auftreten können, ist der Großteil der UV-induzierten Schäden auf die Modifikation stickstoffhaltiger Basen mit der Bildung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD) und Pyrimidin-Pyrimidon zurückzuführen Fotoprodukte (6-4PP) als die häufigsten Arten von Lichtschäden.

Pyrimidin-Dimere sind Inhibitoren sowohl der Replikation als auch der Transkription, was das Wachstum verzögert und während der DNA-Replikation zur Mutagenese führt, wenn ein solcher Schaden nicht repariert wird.

Enzyme, die spezifisch an CPD (CPD-Photolyase) oder 6-4PP (6-4PP-Photolyase) binden und diese Schäden reparieren, werden verwendet, um lichtinduzierte DNA-Schäden in vielen Organismen zu reparieren. CPD-Photolyasen wurden in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Wirbellosen und vielen Wirbeltieren gefunden, 6-4PP-Photolyasen wurden bisher nur in Drosophila, Seidenraupe, Xenopus laevis und Klapperschlangen gefunden, nicht aber in Escherichia coli oder Hefe. Photolyase wurde beim Menschen nicht gefunden. Photolyasen enthalten FAD als katalytischen Cofaktor und einen zusätzlichen Chromophor als Lichtsammelantenne.

Zusätzliche Chromophore sind entweder 5,10-Methenyltetrahydrofolat (MTHF) oder 8-Hydroxy-5-deazoriboflavin (8-HDF) mit Absorptionsmaxima bei 380 bzw. 440 nm. Die Kristallstrukturen der CPD-Photolyasen von E. coli und Anacystis nidulans bestätigen, dass die Enzyme das Pyrimidin-Dimer von der Duplex- zu der Vertiefung drehen, die den katalytischen Cofaktor enthält, um an DNA zu binden. Der Cyclobutanring wird dann durch elektronenlichtinduzierten Transfer gespalten. CPD-Photolyasen erkennen selektiv CPD, ähnlich wie DNA-bindende Proteine. Weißes Licht oder UV-B-Strahlung induziert die Expression von CPD-Photolyasen. Im Gegensatz zu CPD-Photolyasen wird die 6-4PP-Photolyase stabil exprimiert und weder durch weißes Licht noch durch UV-B-Strahlung reguliert.

Schematische Darstellung der Photoreaktivierung in Chromatin. Giton-Oktamere sind blau, DNA ist schwarz. Photolyase bindet an Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPD), rotiert das Pyrimidin-Dimer und regeneriert native Pyrimidine in einer lichtabhängigen Reaktion. Photolyase repariert bevorzugt CPD in Linket-DNA. Die Reparatur in Nukleosomen wird verlangsamt und vermutlich erleichtert durch die dynamischen Eigenschaften von Nukleosomen, die DNA-Schäden in die Linker-DNA-Region verschieben.

Die Klasse der CDP-spezifischen Photolyasen aus Mikroorganismen, definiert als Photolyasen der Klasse I, war das erste Mitglied der Photolyase-Familie, das charakterisiert wurde. Eine eng verwandte Klasse von Photolyasen, die spezifisch für 6-4-Photoprodukte sind, wurde kürzlich entdeckt, Mitglieder dieser Familie wurden in Drosophila melanogaster, Xenopus laevis und Arabidopsis thaliana gefunden. Cryptochrome, die Photorezeptoren für den violetten Teil des Lichtspektrums von Pflanzen und anderen Organismen sind, sind ebenfalls eng mit Photolyasen der Klasse I verwandt.

Eine entfernter verwandte Familie von CPD-Photolyasen, die als Klasse-II-Photolyasen bezeichnet werden, wurde in einer Reihe von Arten identifiziert, einschließlich Tieren, Archaebacterium, Eubacterium und höheren Pflanzen. Es wurde gezeigt, dass alle charakterisierten Photolyasen reduziertes FAD enthalten, und die meisten enthalten sekundäre Chromophore, abhängig von der Spezies, entweder MTHF oder 8-HDF. Ein ähnlicher Reaktionsmechanismus wurde für beide Klassen von CPD-Photolyasen vorgeschlagen. Der MTHF- oder 8-HDF-Chromophor ist wie eine Antenne, die violettes Licht absorbiert und die absorbierte Energie verwendet, um FADH- zu regenerieren.

Die Zusammensetzung des pflanzlichen Photolyase-Cofaktors ist nicht vollständig geklärt, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass CPD-Photolyasen aus Arabidopsis, die nur FADH enthalten, enzymatische Aktivität aufweisen.

Literatur:

» Fritz Thoma, Hell und dunkel in der Chromatinreparatur: Reparatur von UV-induzierten DNA-Läsionen durch Photolyase- und Nukleotid-Exzisionsreparatur, Institut für Zellbiologie, ETH-Zürich, Honggerberg, CH-8093 Zürich, Schweiz
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Entdeckungsgeschichte

Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA-Schäden

Die Untersuchung der Reparatur wurde durch die Arbeit von A. Kellner (USA) initiiert, der das Phänomen der Photoreaktivierung (PR) entdeckte - eine Verringerung der durch ultraviolette (UV) Strahlen verursachten Schäden an biologischen Objekten mit anschließender Exposition gegenüber hellem sichtbarem Licht ( leichte Reparatur).

Exzisionsreparatur

Postreplikative Reparatur wurde in Zellen entdeckt E coli nicht in der Lage, Thymin-Dimere zu spalten. Dies ist die einzige Art der Reparatur, die keinen Schadenserkennungsschritt hat.

Anmerkungen

Wikimedia-Stiftung. 2010 .

Sehen Sie, was "DNA-Reparatur" in anderen Wörterbüchern ist:

Reparatur von DNA-Defekten, die durch Mutation oder Rekombination entstehen. Sie wird von einem System reparativer Enzyme durchgeführt, von denen einige die Schadensstelle feststellen, andere „herausschneiden“, andere beschädigte Bereiche synthetisieren, viertens ... ... Wörterbuch der Mikrobiologie

DNA-Reparatur- - Korrektur von "Fehlern" in der Primärstruktur der DNA infolge der Wirkung spezieller Reparaturenzyme ... Prägnantes Wörterbuch biochemischer Begriffe

DNA-Reparatur- — Biotechnologiethemen DE DNA-Reparatur … Handbuch für technische Übersetzer

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DNA-REPARATUR- Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur im DNA-Molekül, d.h. richtige Nukleotidfolge... Begriffe und Definitionen, die in der Zucht, Genetik und Reproduktion von Nutztieren verwendet werden

DNA-Reparatur- * DNA-Reparatur * DNA-Reparatur Enzymatische Fehlerkorrektur in der Nukleotidsequenz des DNA-Moleküls. Mechanismen der DNA r. schützt die körpereigene Erbinformation vor Schäden durch umweltbedingte Mutagene (z. B. ultraviolettes Licht, ... ...

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- (aus dem späten Lateinischen reparatio Wiederherstellung), charakteristisch für alle Zellen lebender Organismen, Wiederherstellung der ursprünglichen (nativen) DNA-Struktur im Falle ihrer Verletzung. Schäden an der DNA-Struktur können zur Blockierung der DNA-Replikation führen (tödlich ... ... Chemische Enzyklopädie

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Ein System zum Erkennen und Reparieren von Insertionen, Lücken und Nichtübereinstimmungen von Nukleotiden, die während der DNA-Replikation und -Rekombination sowie als Ergebnis bestimmter Arten von DNA-Schäden auftreten. Die bloße Tatsache der Nichtübereinstimmung erlaubt nicht ... ... Wikipedia

Bücher

• DNA-Methylierung in Pflanzen. Mechanismen und biologische Rolle, BF Vanyushin. Diese Lektüre eines der Pioniere und berühmten Weltführer in der Erforschung der DNA-Methylierung in verschiedenen Organismen beschreibt den aktuellen Stand des allgemeinen biologischen Problems, ...

Beschädigt während der normalen DNA-Biosynthese in der Zelle oder als Ergebnis der Einwirkung physikalischer oder chemischer Reagenzien. Sie wird von speziellen Enzymsystemen der Zelle durchgeführt. Eine Reihe von Erbkrankheiten (z. B. Xeroderma pigmentosum) sind mit gestörten Reparatursystemen verbunden.

Entdeckungsgeschichte

Der Beginn der Untersuchung der Reparatur wurde durch die Arbeit von Albert Kellner (USA) gelegt, der 1948 das Phänomen der Photoreaktivierung entdeckte - eine Verringerung der durch ultraviolette (UV) Strahlen verursachten Schäden an biologischen Objekten mit anschließender Einwirkung von hellem sichtbarem Licht ( leichte Reparatur).

R. Setlow, K. Rupert (USA) und andere stellten bald fest, dass die Photoreaktivierung ein photochemischer Prozess ist, der unter Beteiligung eines speziellen Enzyms abläuft und bei Absorption eines UV-Quants zur Spaltung von in der DNA gebildeten Thymin-Dimeren führt.

Später, als die genetische Kontrolle der bakteriellen Empfindlichkeit gegenüber UV-Licht und ionisierender Strahlung untersucht wurde, wurde es entdeckt dunkle Reparatur- die Eigenschaft von Zellen, Schäden in der DNA ohne die Beteiligung von sichtbarem Licht zu beseitigen. Der Mechanismus der Dunkelreparatur von mit UV-Licht bestrahlten Bakterienzellen wurde von A. P. Howard-Flanders vorhergesagt und 1964 von F. Hanawalt und D. Petitjohn (USA) experimentell bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass bei Bakterien nach der Bestrahlung beschädigte DNA-Abschnitte mit veränderten Nukleotiden herausgeschnitten und in den entstandenen Lücken DNA neu synthetisiert wird.

Reparatursysteme existieren nicht nur in Mikroorganismen, sondern auch in tierischen und menschlichen Zellen, in denen sie in Gewebekulturen untersucht werden. Es ist eine Erbkrankheit einer Person bekannt - Xeroderma pigmentosa, bei der die Reparatur gestört ist.

Quellen von DNA-Schäden

Haupttypen von DNA-Schäden

Das Gerät des Reparatursystems

Jedes der Reparatursysteme enthält die folgenden Komponenten:

• DNA-Helikase – ein Enzym, das chemisch veränderte Abschnitte in der Kette „erkennt“ und die Kette in der Nähe des Schadens bricht;
• DNase (Desoxyribonuklease) – ein Enzym, das 1 DNA-Kette (eine Sequenz von Nukleotiden) entlang einer Phosphodiesterbindung „schneidet“ und einen beschädigten Bereich entfernt: Exonuklease wirkt auf die terminalen Nukleotide 3’ oder 5’, Endonuklease wirkt auf andere Nukleotide als die terminalen;
• DNA-Polymerase - ein Enzym, das den entsprechenden Abschnitt der DNA-Kette synthetisiert, um den gelöschten zu ersetzen;
• DNA-Ligase ist ein Enzym, das die letzte Bindung in der Polymerkette schließt und dadurch ihre Kontinuität wiederherstellt.

Arten der Wiedergutmachung

Direkte Wiedergutmachung

Direkte Reparatur ist der einfachste Weg, Schäden in der DNA zu beseitigen, was normalerweise spezifische Enzyme umfasst, die den entsprechenden Schaden schnell (normalerweise in einem Schritt) beseitigen und die ursprüngliche Nukleotidstruktur wiederherstellen können. So wirkt beispielsweise die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase, die die Methylgruppe von der stickstoffhaltigen Base an einen eigenen Cysteinrest abspaltet.

Exzisionsreparatur

Die Exzisionsreparatur (engl. Exzision - Schneiden) umfasst die Entfernung beschädigter stickstoffhaltiger Basen aus der DNA und die anschließende Wiederherstellung der normalen Struktur des Moleküls entlang der komplementären Kette. Das Enzymsystem entfernt eine kurze einzelsträngige Sequenz doppelsträngiger DNA, die fehlgepaarte oder beschädigte Basen enthält, und ersetzt sie, indem es eine Sequenz synthetisiert, die zum verbleibenden Strang komplementär ist.

Exzisionsreparatur ist die gebräuchlichste Methode zur Reparatur modifizierter DNA-Basen. Sie beruht auf der Erkennung einer modifizierten Base durch verschiedene Glykosylasen, die die N-glykosidische Bindung dieser Base mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat des DNA-Moleküls spalten. Gleichzeitig gibt es Glykosylasen, die spezifisch das Vorhandensein bestimmter modifizierter Basen (Oxymethyluracil, Hypoxanthin, 5-Methyluracil, 3-Methyladenin, 7-Methylguanin usw.) in der DNA erkennen. Für viele Glycosylasen wurde bisher ein Polymorphismus beschrieben, der mit dem Austausch eines der Nukleotide in der codierenden Sequenz des Gens verbunden ist. Für eine Reihe von Isoformen dieser Enzyme wurde ein Zusammenhang mit einem erhöhten Risiko für onkologische Erkrankungen festgestellt [Chen, 2003].

Die hohe Stabilität der DNA wird nicht nur durch den Konservatismus ihrer Struktur und die hohe Replikationsgenauigkeit gewährleistet, sondern auch durch das Vorhandensein spezieller Systeme in den Zellen aller lebenden Organismen. Wiedergutmachungen die Schäden aus der DNA entfernen.

Die Einwirkung verschiedener Chemikalien, ionisierender Strahlung und ultravioletter Strahlung kann folgende Schäden an der DNA-Struktur verursachen:

Schädigung einzelner Basen (Desaminierung, die zur Umwandlung von Cytosin in Uracil, Adenin in Hypoxanthin führt; Basenalkylierung; Einschluss von Basenanaloga, Insertionen und Deletionen von Nukleotiden);

Basenpaarschädigung (Bildung von Thymin-Dimeren);

Kettenbrüche (einfach und doppelt);

die Bildung von Vernetzungen zwischen Basen sowie DNA-Protein-Vernetzungen.

Einige dieser Verstöße können auch spontan auftreten, d.h. ohne Beteiligung schädlicher Faktoren.

Jede Art von Beschädigung führt zu einer Verletzung der Sekundärstruktur der DNA, was die Ursache für eine teilweise oder vollständige Blockierung der Replikation ist. Solche Konformationsstörungen dienen als Ziel für Reparatursysteme. Der Prozess der Wiederherstellung der DNA-Struktur basiert auf der Tatsache, dass die genetische Information in der DNA durch zwei Kopien repräsentiert wird – eine in jeder der Ketten der Doppelhelix. Dadurch kann ein Schaden in einer der Ketten durch das Reparaturenzym beseitigt werden und dieser Kettenabschnitt wird aufgrund der in der unbeschädigten Kette enthaltenen Informationen in seiner normalen Form neu synthetisiert.

Derzeit wurden drei Hauptmechanismen der DNA-Reparatur identifiziert: Photoreaktivierung, Exzision und Reparatur nach der Replikation. Die letzten beiden Arten werden auch als dunkle Wiedergutmachung bezeichnet.

Photoreaktivierung wird durch ein Enzym abgebaut Photolyase, aktiviert durch sichtbares Licht, Thymin-Dimere, die in der DNA unter Einwirkung von ultravioletter Strahlung vorkommen.

ausschneiden Die Reparatur besteht in der Erkennung des DNA-Schadens, der Entfernung des beschädigten Bereichs, der Resynthese der DNA nach dem Muster der intakten Kette mit Wiederherstellung der DNA-Kettenkontinuität. Diese Methode wird auch als Reparation nach der Art der Spaltung - Substitution oder bildlicher ausgedrückt als "Cut - Patch" -Mechanismus bezeichnet. Die Exzisionsreparatur ist ein mehrstufiger Prozess und besteht aus:

1) „Anerkennung“ von Schäden;

2) Inzision eines DNA-Strangs in der Nähe des Schadens (Inzision);

3) Entfernung des beschädigten Bereichs (Exzision);

4) DNA-Resynthese an der Stelle der entfernten Stelle;

5) Wiederherstellung der Kontinuität der reparierten Kette aufgrund der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden
(Abbildung 6.2)

Reis. 6.2 Exzisionsreparaturschema

Die Wiedergutmachung beginnt mit dem Beitritt DNA-N-Glycosylase zur beschädigten Basis. Es gibt viele DNA-N-Glykosylasen, die für verschiedene modifizierte Basen spezifisch sind. Enzyme spalten hydrolytisch die N-glykosidische Bindung zwischen der veränderten Base und Desoxyribose, was zur Bildung einer AP-Stelle (Apurin-Apyrimidin) in der DNA-Kette führt (erster Schritt). Die Reparatur der AP-Site kann nur unter Beteiligung von erfolgen DNA-Insertasen, das der Desoxyribose gemäß der Komplementaritätsregel eine Base hinzufügt. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, den DNA-Strang zu schneiden, das falsche Nukleotid herauszuschneiden und den Bruch zu reparieren. Bei komplexeren Schäden an der DNA-Struktur ist die Beteiligung des gesamten an der Reparatur beteiligten Enzymkomplexes erforderlich (Abb. 6.2.): AP-Endonuklease erkennt die AP-Stelle und schneidet die DNA-Kette in der Nähe davon (Stadium II). Sobald im Stromkreis eine Unterbrechung auftritt, kommt die Arbeit ins Spiel AP-Exonuklease, die ein fehlerhaftes DNA-Fragment entfernt (Stadium III). DNA-Polymerase b baut die entstandene Lücke nach dem Prinzip der Komplementarität auf (Stufe IV). DNA-Ligase verbindet das 3¢-Ende des neu synthetisierten Fragments mit der Hauptkette und vervollständigt die Schadensreparatur (Stadium V).

Postreplikativ Die Reparatur wird in den Fällen eingeschaltet, in denen die Exzision nicht mit der Beseitigung aller DNA-Schäden vor ihrer Replikation fertig wird. In diesem Fall führt die Reproduktion beschädigter Moleküle zum Auftreten von DNA mit Einzelstranglücken, und die native Struktur wird während der Rekombination wiederhergestellt.

Angeborene Defekte im Reparatursystem sind die Ursache für Erbkrankheiten wie Xeroderma pigmentosum, Ataxie-Teleangiektasie, Trichothiodystrophie und Progerie.

DNA-REPARATUR

Wiedergutmachungssysteme

2 Exzisionsreparatur. Beispiele und Typen

3 Reparatur von DNA-Replikationsfehlern

4 Rekombinante (postreplikative) Reparatur in Bakterien

5 SOS-Wiedergutmachung

DNA-Reparatursysteme sind in der Evolution von Bakterien zu Menschen ziemlich konservativ und werden am besten in E. coli untersucht.

Es gibt zwei Arten der Wiedergutmachung:gerade und ausschneidend

Direkte Wiedergutmachung

Direkte Reparatur ist der einfachste Weg, Schäden in der DNA zu beseitigen, was normalerweise spezifische Enzyme umfasst, die den entsprechenden Schaden schnell (normalerweise in einem Schritt) beseitigen und die ursprüngliche Struktur der Nukleotide wiederherstellen können.

1. Das funktioniert bspw.O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase

(ein selbstmörderisches Enzym), das eine Methylgruppe von einer stickstoffhaltigen Base zu einem seiner eigenen Cysteinreste entfernt

In E. coli können bis zu 100 Moleküle dieses Proteins in 1 Minute synthetisiert werden. Das funktionsähnliche Protein höherer Eukaryoten spielt offensichtlich eine wichtige Rolle beim Schutz vor Krebs, der durch interne und externe alkylierende Faktoren verursacht wird.

DNA-Insertase

2. DNA-Insertasen

Photolyase

3. Thymin-Dimere werden von "gestickt". direkte Wiedergutmachung mitPhotolyase, die die entsprechende photochemische Umwandlung durchführen. DNA-Photolyasen sind eine Gruppe lichtaktivierter Enzyme mit einer Wellenlänge von 300 - 600 nm (sichtbarer Bereich), für die sie in ihrer Struktur ein spezielles lichtempfindliches Zentrum besitzen.

Sie sind in der Natur weit verbreitet und kommen in Bakterien, Hefen, Insekten, Reptilien, Amphibien und Menschen vor. Diese Enzyme benötigen eine Vielzahl von Cofaktoren (FADH, Tetrahydrofolsäure usw.), die an der photochemischen Aktivierung des Enzyms beteiligt sind. E. coli-Photolyase ist ein 35-kDa-Protein, an das fest gebunden ist Oligoribonukleotid 10-15 Nukleotide lang für die Enzymaktivität erforderlich.

Beispiele für direkte Wiedergutmachung

1. Methylierte Base O 6-mG durch das Enzym Methyltransferase dimethyliertO6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (ein selbstmörderisches Enzym), das eine Methylgruppe auf einen seiner Reste überträgt

Cystein

2. AP-Stellen können durch direkte Insertion von Purinen mit Hilfe sogenannter Enzyme repariert werdenDNA-Insertasen(aus dem englischen Insert- Insert).

SCHEMA EINES BEISPIELS FÜR DIE REPARATUR DIREKTER SCHÄDEN IN DNA – methylierter Base Ö6- mgdurch das Enzym Methyltransferase demethyliert, das eine Methylgruppe auf einen seiner Cystein-Aminosäurereste überträgt.

3. Photolyase bindet an das Thymin-Dimer, und nach Bestrahlung dieses Komplexes mit sichtbarem Licht (300–600 nm) dehnt sich das Dimer aus

SCHEMA EINES BEISPIELS FÜR DIE DIREKTE REPARATUR VON SCHÄDEN IN DER DNA – Photolyase

lagert sich an das Thymin-Dimer an und nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht dehnt sich dieses Dimer aus

Exzisionsreparatur

(aus dem Englischen Exzision - Schneiden).

DEFINITION

Exzisionsreparatur beinhaltet Entfernung beschädigte stickstoffhaltige Basen aus DNA und anschließende Genesung normale Molekularstruktur.

MECHANISMUS

An der Exzisionsreparatur sind normalerweise mehrere Enzyme beteiligt, und der Prozess selbst wirkt sich aus

nicht nur beschädigt ,

aber auch benachbarte Nukleotide .

BEDINGUNGEN

Für die Exzisionsreparatur ist ein zweiter (komplementärer) DNA-Strang erforderlich. Das allgemeine vereinfachte Schema der Exzisionsreparatur ist in Abb. 1 gezeigt. 171.

STUFEN

Der erste Schritt bei der Exzisionsreparatur ist die Exzision der abnormalen stickstoffhaltigen Basen. Es wird von einer Gruppe katalysiertDNA-N-Glykosylase- Enzyme, die die glykosidische Bindung zwischen Desoxyribose und einer stickstoffhaltigen Base spalten.

WICHTIGER HINWEIS:

BeimenschlichDNA-N-Glykosylasehaben eine hohe Substratspezifität: verschiedene Enzyme dieser Familie erkennen und exzidieren verschiedene anomale Basen(8-Oxoguanin, Uracil, Methylpurine usw.).

BeiBakterienDNA-N-Glykosylasehat keine solche Substratspezifität.

ALLGEMEINE EXZISIONSREPARATURENZYME

NAME	FUNKTION	MECHANISMUS
DNA-N-Glykosylase	Exzision abnormaler stickstoffhaltiger Basen	spaltet die glykosidische Bindung zwischen Desoxyribose und stickstoffhaltige Base
AP-Endonuklease	schafft Bedingungen für die Arbeit des nächsten Enzyms - Exonukleasen	bricht das Zucker-Phosphat-Rückgrat des DNA-Moleküls an der AP-Stelle
Exonuklease	spaltet einige Nukleotide	spaltet nacheinander mehrere Nukleotide aus dem beschädigten Abschnitt eines DNA-Strangs ab

SPEZIFISCHE FOLGESCHRITTE DIESER MECHANISE:

Als Ergebnis der Aktion DNA- N-Glykosylasees entsteht eine AP-Stelle, die vom Enzym angegriffen wird AR-Endonuklease. Es bricht das Zucker-Phosphat-Rückgrat des DNA-Moleküls an der AP-Stelle und schafft damit die Voraussetzungen für die Arbeit des nächsten Enzyms - Exonukleasen, das nacheinander mehrere Nukleotide vom beschädigten Abschnitt eines DNA-Strangs abspaltet.

In Bakterienzellen der frei gewordene Platz wird mit den entsprechenden Nukleotiden bei der Beteiligung aufgefüllt DNA-Polymerase I am zweiten (komplementären) DNA-Strang orientiert.

Da die DNA-Polymerase I in der Lage ist, das 3'-Ende eines der Stränge an einem Bruch in doppelsträngiger DNA zu verlängern und Nukleotide vom 5'-Ende desselben Bruchs zu entfernen,

diese. realisieren „nick-broadcast“ spielt dieses Enzym eine Schlüsselrolle bei der DNA-Reparatur. Die abschließende Vernähung der reparierten Stellen erfolgt DNA-Ligase.

In eukaryotischen (Säugetier-) Zellen

Die DNA-Exzisionsreparatur in Säugetierzellen wird von einem starken Anstieg der Aktivität eines anderen Enzyms begleitet.Poly ADP-Ribose-Polymerase . Gleichzeitig passiert es ADP-Ribosylierung von Chromatinproteinen(Histone und Nicht-Histon-Proteine), was zu einer Schwächung ihrer Verbindung mit der DNA führt und Reparaturenzymen den Zugang öffnet.

Spender ADP-Ribosebei diesen ReaktionenNAD+, deren Reserven bei der exzisiven Reparatur von Schäden durch Röntgenbestrahlung stark erschöpft sind:

Negativ geladene Reste ADP-Ribose aus der inneren Zusammensetzung des Moleküls NAD+ beitreten über ein RadikalGlutamin Säuren bzw Phosphoserinzu Chromatinproteinen, was zur Neutralisierung der positiven Ladungen dieser Proteine ​​und zur Schwächung ihres Kontakts mit der DNA führt.

WAS IST EINE GRUPPE VON ENZYMEN

DNA - Glykosylasen

spaltet die glykosidische Bindung zwischen Desoxyribose und stickstoffhaltiger Base

was zur Exzision abnormer stickstoffhaltiger Basen führt

DNA - Glykosylasen , beteiligt an der Beseitigung von oxidativen Schäden an der DNA in Zellen Prokaryoten und Eukaryoten, sind sehr vielfältig und unterscheiden sich in Substratspezifität, räumlicher Struktur und Wechselwirkungsmodi mit DNA.

Zu den am besten untersuchten DNA-Glykosylasen gehören:

Endonuclease III(EndoIII),

bildet Amidopyrimidin-DNA-Glykosylase (FPG)

Köter Und

Mut Ycoli.

Endonuklease IIIE. coli erkennt DNA und spaltet sie spezifisch ab oxidiert Pyrimidinbasen.

Dieses Enzym ist ein monomeres globuläres Protein, bestehend aus 211 Aminosäuren Reste (Molekulargewicht 23,4 kDa). Das für Endo III kodierende Gen wurde sequenziert und seine Nukleotidsequenz wurde ermittelt. Endo III ist Eisen-Schwefel-Protein [(4 Fe-4S )2+-Protein], das das Element enthält suprasekundäre Struktur tippe "Griechischer Schlüssel" (Spirale - Haarnadel - Spirale), dient der DNA-Bindung. Enzyme mit ähnlicher Substratspezifität und ähnlichen Aminosäuresequenzen wurden ebenfalls isoliert Rinder- und menschliche Zellen.

Amido-Pyridin-DNA-Glykosylase bilden E. coli "erkennt" und spaltet oxidierte Heterocyclen Basen der Purinreihe .

EXZISIONSREPARATURSCHEMA STUFE 1

DNSN

EXCISION REPARATURSCHEMA

1 DNSNGlycosidase entfernt die beschädigte Base

AR-Endonuklease bricht DNA

2 Exonuklease entfernt eine Reihe von Nukleotiden

3 DNA-Polymerase füllt die freie Stelle mit komplementärem

Mononukleotide

DNA-Ligase vernetzt den reparierten DNA-Strang

Köter- ein kleines Protein mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, das überwiegend Nukleosid-Triphosphatase-Aktivität aufweist hydrolysiert dGTP zu dGMP und Pyrophosphat.

Biologische Rolle von Mut T soll die Bildung von nicht-kanonischen Paaren während der Replikation verhindernA:G Und A: 8-Oxo-G.

Solche Paare können wann erscheinen oxidierte Form

dGTP (8-oxo-dGTP) wird Substrat DNA-Polymerase.

Köter hydrolysiert 8-oxo-dGTP10 Mal schneller als dGTP.

Es tut 8-oxo-dGTPam meisten bevorzugtes SubstratMutTund erklärt seine funktionelle Rolle.

Mut Yist eine spezifische Adenin-DNA-Glykosylase, die die N-glykosidische Bindung zwischen Adenin und Desoxyribose spaltet Adenosin, Bildung eines nicht-kanonischen Paares mit Guanin.

Die funktionelle Rolle dieses Enzyms besteht darin, Mutationen zu verhindern

T:A - G:A von Spaltung intakter Reste Adeninaus Basenpaar A: 8-Oxo-G.

Nukleotidexzisionsreparatur

(ATP-abhängiger Mechanismus zur Entfernung von DNA-Schäden)

In letzter Zeit wurde bei der Exzisionsreparatur dem ATP-abhängigen Mechanismus zur Entfernung von DNA-Schäden besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Diese Art der Exzisionsreparatur wird als Nukleotidexzisionsreparatur (NER) bezeichnet.

Es umfasst ZWEI STUFEN :

1. Entfernung von DNAOligonukleotidfragmente Schäden enthalten und

Excinuclease

2. anschließende Rekonstruktion der DNA-Kette unter Beteiligung eines Enzymkomplexes (Nukleasen, DNA-Polymerasen, DNA-Ligasen usw.).

Die Entfernung eines DNA-Fragments erfolgt auf beiden Seiten des beschädigten Nukleotid. Die Länge der entfernten Oligonukleotidfragmente unterscheidet sich zwischen Prokaryoten und Eukaryoten.

Entfernung eines DNA-Fragments aus Prokaryoten

Also, in E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, ein Längenfragment 12-13 Nukleotide

Entfernung eines DNA-Fragments aus Eukaryoten

und in Hefe, Amphibien und Menschen, ein Fragment bestehend aus 24-32 Nukleotide.

Excinuclease- ein Enzym, das DNA-Fragmente entfernt

DNA-Fragment wird durch ein Enzym gespaltenexcinuclease(Excinuclease). In E. coli besteht dieses Enzym aus 3 verschiedenen Protomeren -

uvra

uvr B

uvr C

von denen jedes während der Exzisionsspaltung eines DNA-Fragments eine spezifische Funktion erfüllt. Der Name dieser Proteine ​​ergibt sich aus den Anfangsbuchstaben der Wörter"Ultraviolett-Reparatur".

Protomer uvr Ahat ATPase-Aktivität, bindet an DNA in Form eines Dimers, Durchführung

primäre Schadenserkennung und

Bindunguvr B

Protomer uvr B hat:

1 . Latent ATPase und latente Helikaseaktivität, die notwendig sind, um Konformationen zu ändern und die DNA-Doppelhelix abzuwickeln;

2. Endonuklease Aktivität, Spaltung der Internukleotid (Phosphodiester)-Bindung von der SeiteZ"-Endegespaltenes Fragment.

Protomer uvr Cverhält sich wie Endonuklease, Einführung eines Bruchs in den reparierten DNA-Strang mit5"-EndeSchnittfragment.

Also die Protomereuvr A, uvr B, uvr Cinteragieren mit DNA in einer bestimmten Sequenz und führen eine ATP-abhängige Reaktion durchSpaltung des Oligonukleotidfragments aus dem DNA-Strang, der repariert wird.

Die entstandene Lücke im DNA-Molekül wird unter Beteiligung von DNA-Polymerase I und DNA-Ligase repariert. Das Modell der Exzisionsreparatur unter Beteiligung der oben genannten Enzyme ist in Abb. 1 dargestellt. 172.

Exzisionsreparaturen beim Menschen

Menschliche Exzisionsreparaturen sind ebenfalls ATP-abhängig und schließen eindrei Hauptschritte :

Schadenserkennung,

doppeltes Schneiden des DNA-Strangs,

reduktive Synthese u

Ligatur des reparierten Strangs.

Die Exzisionsreparatur menschlicher DNA beinhaltet jedoch

25 verschiedene Polypeptide ,

16 von denen an der Spaltung des Oligonukleotidfragments beteiligt sind, wobei es sich um Protomere handeltExzinucleasen,

und der Rest 9 führen die Synthese des reparierten Teils des Moleküls durch.

Im DNA-Reparatursystem des Menschen spielen Transkriptionsproteine ​​eine sehr wichtige Rolle -

RNA-Polymerase II Und

TF Moeiner der sechs wichtigsten Transkriptionsfaktoren Eukaryoten.

Es sollte beachtet werden, dass die Exzisionsreparatur sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten vom Funktionszustand der DNA abhängt:

transkribierte DNA wird schneller repariert

als transkriptionell inaktiv.

Dieses Phänomen wird durch die folgenden Faktoren erklärt:

Chromatinstruktur,

Homologie von Ketten transkribierter DNA-Regionen,

Kettenschadenseffekt und seine Wirkung auf die RNA-Polymerase.

WICHTIGER HINWEIS:

CODING CHAIN ​​​​DNA (Kette der Informationsspeicherung)

MATRIX CHAIN ​​​​of DNA (Informationen werden daraus abgeschrieben)

Es ist bekannt, dass so große Schäden wie Bildung von Thymin-Dimeren, blockieren die Transkription sowohl bei Bakterien als auch beim Menschen, wenn sie auftreten Matrixschaltung DNA (Schäden an Kodierung Ketten nicht beeinflussen zum Transkriptionskomplex). Die RNA-Polymerase stoppt an der Stelle der DNA-Schädigung und blockiert die Arbeit des Transkriptionskomplexes.

Transkriptions-Reparatur-Kopplungsfaktor (TRCF) .

In E. coli wird die Verbesserung der transkriptionellen Reparatur durch ein spezielles Protein vermittelt -Transkriptions-Reparatur-Kopplungsfaktor (TRCF) .

Dieses Protein trägt dazu bei :

1. Ablösung der RNA-Polymerase von der DNA

2. stimuliert gleichzeitig die Bildung eines Proteinkomplexes,

Durchführung der Reparatur der beschädigten Stelle.

Am Ende der Reparatur setzt die RNA-Polymerase ein und die Transkription wird fortgesetzt (siehe Abb.).

Also das allgemeine Schema der Exzisionsreparatur

1. DNA-N -Glykosylase entfernt beschädigte Basen

2. AR-Endonuklease fügt einen Bruch in die DNA-Kette ein

3. Exonuklease entfernt eine Reihe von Nukleotiden

4. DNA-Polymerase füllt den frei gewordenen Bereich

Komplementäre Nukleotide

5. DNA-Ligase vernetzt den reparierten DNA-Strang

Reparatur von DNA-Replikationsfehlern

durch Methylierung

Fehler bei der Paarung stickstoffhaltiger Basen während der DNA-Replikation treten häufig auf (in Bakterien einmal pro 10.000 Nukleotide), was dazu führtin den Tochterstrang der DNA Nukleotide, die nicht komplementär zu den Nukleotiden der Mutterkette sind, sind enthalten -Fehlanpassungen(englisch mismatch n e passen).

Trotz der Tatsache, dassDNA-Polymerase IDer Prokaryot hat die Fähigkeit, seine Bemühungen, irrtümlich angehängte Nukleotide zu eliminieren, selbst zu korrigieren manchmal nicht genug, und dann verbleiben einige falsche (nicht komplementäre) Paare in der DNA.

In diesem Fall erfolgt die Reparatur unter Verwendung eines bestimmten zugeordneten SystemsDNA-Methylierung . Die Wirkungsweise dieses Reparatursystems beruht darauf, dass die DNA nach der Replikation nach einer gewissen Zeit (einige Minuten) methyliert wird.

E coli methyliert meistens Adenin mit Bildung

N6-Methyladenin (N6-mA).

Bis zu diesem Punkt ist die neu synthetisierte(Tochtergesellschaft)die Kette bleibt unmethyliert.

Wenn es in einer solchen Kette ungepaarte Nukleotide gibt, dann wird sie repariert: AlsoMethylierung markiert DNA und

enthält ein Fehlerkorrektursystem Reproduzieren.

In diesem Wiedergutmachungssystem werden besondere Strukturen anerkannt:

FolgeG-N6-mA-T-CUnd nächste dahinter Verformung

in der Doppelhelix an der Stelle fehlender Komplementarität (Abbildung unten).

bei der Eliminierung ungepaarter Nukleotide in halbmethyliert an dem DNA-Molekül ist ein ziemlich komplexer Komplex von Reparaturenzymen beteiligt, der die Oberfläche des DNA-Moleküls abtastet,schneidet einen Abschnitt der untergeordneten Kette Rückgriff auf Mismatcham, und schafft dann Bedingungen für den Aufbau

seine gewünschten (komplementären) Nukleotide.

Verschiedene Komponenten dieses Komplexes haben unterschiedliche Aktivitäten.Nuklease,

Spirale,

ATPaznoi,

notwendig, um DNA-Brüche einzuführen und Nukleotide zu spalten, die DNA-Doppelhelix abzuwickeln und Energie für die Bewegung des Komplexes entlang des reparierten Teils des Moleküls bereitzustellen.

Ein in Struktur und Funktion ähnlicher Komplex von Reparaturenzymen wurde auch beim Menschen gefunden.

Rekombinante (postreplikative) Reparatur

In den Fällen, in denen aus dem einen oder anderen Grund die oben genannten Reparatursysteme gestört sind, können sich Lücken (nicht reparierte Bereiche) in DNA-Ketten bilden, die beschädigt wurden manchmal ziemlich bedeutend, die mit einer Störung des Replikationssystems behaftet ist und zum Zelltod führen kann.

In diesem Fall ist die Zelle in der Lage, für die Reparatur eines DNA-Moleküls ein anderes nach der Replikation erhaltenes DNA-Molekül zu verwenden, d. h. den Mechanismus für diesen Zweck einzubeziehenRekombination.

Bei Bakterien

Bei Bakterien ist die rekombinante Reparatur beteiligtRec A-Protein. Es bindet an eine einzelsträngige DNA-Region und beteiligt diese an der Rekombination mithomologe Regionen intakter Stränge eines anderen DNA-Moleküls .

Als Ergebnis stellen sich sowohl die gebrochenen (mit Lücken) als auch die intakten Ketten des zu reparierenden DNA-Moleküls heraus gepaart mit intakten komplementären DNA-Bereichen, was die Möglichkeit der Reparatur durch die oben beschriebenen Systeme eröffnet.

Gleichzeitig kann es sein Schneiden spezifisches Fragment und

Füllungmit seiner Hilfe Lücken in der defekten Kette.

Die entstehenden Lücken und Brüche in den DNA-Ketten werden unter Mitwirkung aufgefülltDNA-Polymerase I und DNA-Ligase .

SOS-Wiedergutmachung

Die Existenz dieses Systems wurde erstmals 1974 von M. Radman postuliert. Er gab diesem Mechanismus auch den Namen, indem er das internationale Notsignal „SOS“ (save our souls) darin aufnahm.

In der Tat schaltet sich dieses System ein, wenn Schäden an der DNA werden so groß, dass sie das Leben der Zelle bedrohen. In diesem Fall wird die Aktivität einer diversen Gruppe von Genen induziert, die an verschiedenen zellulären Prozessen im Zusammenhang mit der DNA-Reparatur beteiligt sind.

Die Einbeziehung bestimmter Gene, bestimmt durch das Ausmaß der Schädigung in der DNA, führt zu zellulären Reaktionen unterschiedlicher Bedeutung (beginnend mit dem Standard Reparatur von beschädigten Nukleotide und Endung Unterdrückung Zellteilung).

Am meisten studiertSOS-Wiedergutmachungin E. coli, deren Hauptakteure Proteine ​​kodieren Gene Rec AUndLex A.

Der erste ist ein multifunktionalerRec A-Protein teilnehmen

v DNA-Rekombination, und auch

v Regulation der Gentranskription Phage Lambdadie E. coli infiziert,

und zweitens (Lex A-Protein)Ist Unterdrücker Transkription einer großen Gruppe von Genen bestimmt für DNA-Reparatur Bakterien. Wenn es gehemmt oder gelöst wird Reparatur aktiviert.

Bindung Rec A mit Lex Aführt zur Spaltung des letzteren und entsprechend zu Aktivierung von Reparaturgenen.

Dies wiederum dient der Induktion des bakteriellen SOS-SystemsPhage Lambda Gefahrensignal und bewirkt, dass der Prophagen abschaltet passiver zu aktiver (lytischer) Pfad Existenz, also verursacht Tod der Wirtszelle.

Das SOS-Reparatursystem wurde nicht nur bei Bakterien, sondern auch bei Tieren und Menschen gefunden.

Gene, die an der Reparatur von SOS-DNA-Schäden beteiligt sind

Gene	Folgen der Genaktivierung
uvr A, B, C, D	Reparatur von Schäden an der Sekundärstruktur der DNA
Rec A	Postreplikative Reparatur, SOS-Systeminduktion
Lex A	Ausschalten des SOS-Systems
rec N, ruv	Reparatur von Doppelstrangbrüchen
	Gewährleistung der Rekombinationsreparatur
umu C, D	Mutagenese, die durch Veränderungen in den Eigenschaften der DNA-Polymerase verursacht wird
sul A	Unterdrückung der Zellteilung

Abschluss

Die Reparatur von DNA-Schäden ist eng mit anderen grundlegenden molekulargenetischen Prozessen verbunden: Replikation, Transkription und Rekombination. All diese Prozesse sind verflochten in ein gemeinsames System von Wechselwirkungen, die von einer großen Anzahl unterschiedlicher Proteine ​​bedient werden, von denen viele polyfunktionelle Moleküle sind, an denen sie beteiligt sind Kontrolle über die Implementierung genetischer Informationen in pro- und eukaryotischen Zellen. Gleichzeitig ist klar, dass die Natur „nicht sparen“ auf Steuerelemente, wodurch die komplexesten Systeme zur Korrektur dieser Schäden in der DNA geschaffen werden sind gefährlich für den Organismus und insbesondere für seine Nachkommen. Andererseits ist in jenen Fällen, in denen die Reparaturkapazität nicht ausreicht, um den genetischen Status des Organismus aufrechtzuerhalten, ein programmierter Zelltod erforderlich -Apoptose..

SCHEMA DER NUKLEOTID-EXZISIONSREPARATUR IN E. COLIMIT DER BETEILIGUNG VON EXINUCLEASE

1. TRANSKRIPTIONS-UNABHÄNGIGER MECHANISMUS

2. ÜBERTRAGUNGSABHÄNGIGER MECHANISMUS

3. ALLGEMEINE REPARATURPHASE

SYMBOLE

A - Eiweißuvr A

B - Proteinuvr IN

C - Proteinuvr MIT

kleines schwarzes Dreieck - das Schild zeigt den Schadensort an

REPARATURSCHEMA IM ZUSAMMENHANG MIT DNA-METHYLIERUNG