Die Festphasensynthese oder Festphasentechnologie, die oft als Keramiktechnologie bezeichnet wird, ist bei der Herstellung anorganischer Materialien für verschiedene Bereiche der Wissenschaft und Industrie am weitesten verbreitet. Dazu gehören Kernbrennstoffe, Materialien für die Raumfahrttechnik, Radioelektronik, Instrumentenbau, Katalysatoren, feuerfeste Materialien, Hochtemperatursupraleiter, Halbleiter, Ferroelektrika und Piezoelektrika, Magnete, verschiedene Verbundwerkstoffe und viele andere.

Die Festphasensynthese basiert auf chemischen Reaktionen, bei denen mindestens einer der Reaktanten in Form eines Feststoffs vorliegt. Solche Reaktionen werden als heterogene oder Festphasenreaktionen bezeichnet. Die Festphasenwechselwirkung besteht im Gegensatz zu Reaktionen in einem flüssigen oder gasförmigen Medium aus zwei grundlegenden Prozessen: der chemischen Reaktion selbst und der Übertragung von Materie in die Reaktionszone.

Festphasenreaktionen mit Beteiligung kristalliner Komponenten zeichnen sich durch eine begrenzte Beweglichkeit ihrer Atome oder Ionen und eine komplexe Abhängigkeit von vielen Faktoren aus. Dazu gehören beispielsweise die chemische Struktur und die damit verbundene Reaktivität reagierender Feststoffe, die Art und Konzentration von Defekten, der Zustand der Oberfläche und Morphologie der Reaktionszone, die Kontaktfläche wechselwirkender Reagenzien, die vorläufige mechanochemische Aktivierung und eine Reihe von Andere. All dies bestimmt die Komplexität der Mechanismen heterogener Reaktionen. Die Untersuchung heterogener Reaktionen basiert auf der Festkörperchemie, der chemischen Physik und der physikalischen Chemie der Oberfläche von Festkörpern sowie auf den Gesetzen der Thermodynamik und Kinetik.

Der Mechanismus von Festphasenreaktionen wird oft nur auf der Grundlage beurteilt, dass experimentelle Daten zum Grad der Wechselwirkung als Funktion der Zeit am besten durch ein spezifisches kinetisches Modell und die entsprechende kinetische Gleichung beschrieben werden. Dieser Ansatz kann zu falschen Schlussfolgerungen führen.

Prozesse in Festphasenmaterialien weisen eine Reihe wichtiger Unterschiede zu Prozessen in Flüssigkeiten oder Gasen auf. Diese Unterschiede sind zum einen mit einer deutlich (um mehrere Größenordnungen) geringeren Diffusionsgeschwindigkeit in Festkörpern verbunden, die eine Mittelung der Konzentration der Komponenten im System verhindert und somit zu einer räumlichen Lokalisierung der ablaufenden Prozesse führt. Die räumliche Lokalisierung wiederum führt dazu, dass sowohl die spezifische Geschwindigkeit des Prozesses (oder der Diffusionskoeffizient) als auch die Geometrie der Reaktionszone zur beobachteten Kinetik von Prozessen beitragen. Solche durch geometrische Faktoren bestimmten Merkmale von Festphasenprozessen werden topochemisch genannt. Da die diskutierten Umwandlungen außerdem räumlich lokalisiert sind, kann ihre Geschwindigkeit sowohl durch die Prozesse selbst an der Phasengrenze (Reaktionskontrolle) als auch durch die Geschwindigkeit der Zufuhr einer der Komponenten zu dieser Grenze oder der Entfernung des Produkts bestimmt werden( s) (Diffusionskontrolle). Diese Fälle für einfache Systeme, für die die Modellannahmen erfüllt sind, können im Experiment anhand der Art der Zeitabhängigkeit des Transformationsgrades identifiziert werden. Ein weiteres Merkmal von Phasenumwandlungen in Festkörpern hängt damit zusammen, dass die Bildung eines Kerns einer neuen Phase in einer festen Matrix in dieser zum Auftreten elastischer Spannungen führt, deren Energie in manchen Fällen bei der Betrachtung berücksichtigt werden muss die Thermodynamik dieser Transformationen.

Eine Vielzahl von Faktoren, die die Kinetik von Festphasenprozessen und die Mikrostruktur der resultierenden Materialien beeinflussen, bestimmt auch die Vielfalt der Klassifizierungsarten dieser Prozesse. Betrachtet man also die Stabilität eines Systems in Bezug auf Schwankungen verschiedener Art, heterogen (im Fall von Systemen, die gegenüber kleinen Schwankungen des eingenommenen Volumens stabil und gegenüber großen instabil sind) und homogen (im Fall von Systemen, die stabil sind). (instabile bis kleine Schwankungen) Prozesse werden unterschieden. Als Beispiel für heterogene Prozesse können wir Transformationen nennen, die durch den Mechanismus der Bildung und des Wachstums von Kernen erfolgen; für homogene Prozesse können einige Ordnungs-Unordnungs-Übergänge und die spinodale Zerlegung fester Lösungen genannt werden.

Bei heterogenen Prozessen muss zwischen heterogener und homogener Keimbildung und heterogenen und homogenen Prozessen unterschieden werden. Unter heterogener Keimbildung versteht man die Bildung von Keimen an Strukturdefekten (einschließlich Punktversetzungsdefekten und Phasengrenzen); homogene Keimbildung – die Bildung von Keimen in einem defektfreien Volumen der festen Phase.

Bei der Analyse des Produkts der Festphasenumwandlung werden einphasige und mehrphasige Kerne unterschieden. Bei mehrphasigen Kernen ist das Produkt des Prozesses eine mehrphasige Kolonie mit einer charakteristischen Mikrostruktur, die durch die Oberflächenenergie der Grenze der resultierenden Phasen bestimmt wird; Prozesse dieser Art werden im Gegensatz zu kontinuierlichen Prozessen bei der Bildung und dem Wachstum einphasiger Kerne als intermittierend bezeichnet.

Eine weitere Methode zur Klassifizierung von Festphasenumwandlungen basiert auf einem Vergleich der Zusammensetzung der Anfangsphase und der Zusammensetzung des Reaktionsprodukts. Wenn sie zusammenfallen, spricht man von Nichtdiffusionsprozessen, und wenn sich die Zusammensetzung ändert, spricht man von Diffusionsprozessen. Darüber hinaus ist es sinnvoll, von den Nichtdiffusionsprozessen kooperative Prozesse (z. B. martensitische Umwandlung) zu unterscheiden, die durch die gleichzeitige leichte Bewegung von Atomen in einem großen Volumen der Anfangsphase ablaufen.

Diffusionsfreie Phasenumwandlungen können sich in der Art der thermodynamischen Eigenschaften unterscheiden, die sich während des Prozesses ändern.

Transformationen erster Art sind Prozesse, bei denen sich die Ableitungen des chemischen Potentials in Abhängigkeit von der Temperatur oder dem Druck ändern. Dies impliziert eine abrupte Änderung thermodynamischer Parameter wie Entropie, Volumen, Enthalpie und innere Energie während des Phasenübergangs. Bei Transformationen zweiter Art ändern sich die ersten Ableitungen des chemischen Potentials nach intensiven Parametern nicht, wohl aber die Ableitungen höherer Ordnung (ausgehend von der zweiten). Bei diesen Prozessen kommt es bei kontinuierlicher Entropie und Volumen des Systems zu einer abrupten Änderung der Größen, ausgedrückt durch die zweiten Ableitungen der Gibbs-Energie: Wärmekapazität, Wärmeausdehnungskoeffizient, Kompressibilität usw.

Festphasenreaktionen zwischen zwei Phasen (Kontakte zwischen drei oder mehr Phasen sind unwahrscheinlich, und die entsprechenden Prozesse können als Kombinationen mehrerer Zweiphasenreaktionen dargestellt werden) sind Diffusionsprozesse und können entweder heterogen oder homogen sein, mit sowohl heterogener als auch homogener Keimbildung . Homogene Prozesse und Prozesse mit homogener Keimbildung bei solchen Reaktionen sind beispielsweise bei der Bildung eines metastabilen Mischkristalls mit anschließender Zersetzung (sogenannte interne Reaktionen) möglich. Ein Beispiel für solche Prozesse ist die innere Oxidation.

Voraussetzung für das thermodynamische Gleichgewicht bei einer Festphasenumwandlung ist wie bei jeder anderen chemischen Umwandlung die Gleichheit der chemischen Potentiale der Komponenten in den Ausgangsstoffen und Reaktionsprodukten. Bei der Wechselwirkung zweier fester Phasen kann die angedeutete Gleichheit chemischer Potentiale auf unterschiedliche Weise realisiert werden: 1) Umverteilung der Komponenten in den Anfangsphasen unter Bildung fester Lösungen; 2) die Bildung neuer Phasen mit einer anderen Kristallstruktur (was normalerweise als Festphasenreaktion bezeichnet wird) und da das chemische Potenzial der Komponente in den verschiedenen Phasen eines Mehrphasensystems nicht von der Menge abhängt In jeder Phase kann ein Gleichgewicht nur durch vollständige Transformation der Anfangsphasen erreicht werden. Die zuverlässigsten Informationen über den Mechanismus von Festphasenreaktionen erhält man durch eine komplexe Nutzung, die die gleichzeitige Beobachtung mehrerer Parameter des Reaktionssystems ermöglicht, darunter Phasenzusammensetzung, thermische Effekte, Massenänderungen und andere.

Die thermodynamische Theorie von Festphasenreaktionen wurde von Wagner vorgeschlagen und später von Schmalzried am Beispiel von Additionsreaktionen weiterentwickelt.

Bisher gibt es keine einheitliche Klassifizierung einer Vielzahl heterogener Reaktionen. Dies liegt an der Schwierigkeit, ein Kriterium als Grundlage für eine solche universelle Klassifizierung auszuwählen. Nach chemischen Kriterien werden Reaktionen in Oxidations-, Reduktions-, Zersetzungs-, Kombinations-, Austauschreaktionen usw. unterteilt. Neben dem angegebenen Kriterium wird es häufig als Hauptkriterium für den physikalischen Zustand von Reagenzien verwendet:

Ein charakteristisches Merkmal aller heterogenen Reaktionen ist die Existenz und Lokalisierung an der Grenzfläche der Reaktionszone. Die meist geringe Dicke der Reaktionszone trennt zwei Raumbereiche, die von Substanzen unterschiedlicher Zusammensetzung und mit unterschiedlichen Eigenschaften eingenommen werden. Die Gründe für die Bildung einer Reaktionszone werden üblicherweise in zwei Gruppen eingeteilt: die relative Langsamkeit von Diffusionsprozessen und chemische Gründe. Die letzte Gruppe ist auf die hohe Reaktivität von Atomen oder Molekülen zurückzuführen, die sich auf der Oberfläche eines festen Reagenzes oder an der Grenzfläche zwischen zwei vorhandenen Phasen befinden. Es ist bekannt, dass die Oberfläche einer festen oder flüssigen Substanz andere Eigenschaften aufweist als die Masse einer kompakten Probe. Dadurch werden die Eigenschaften der Phasenschnittstelle spezifisch. Dabei kommt es zu einer deutlichen Umstrukturierung der Kristallpackung, die Spannung zwischen zwei Kristallgittern nimmt ab und es kommt zu einer Veränderung der chemischen Zusammensetzung.

Da der Stofftransport durch Diffusion erfolgt und die Diffusionsmobilität fester Partikel von der Fehlerhaftigkeit ihrer Struktur abhängt, ist mit einem erheblichen Einfluss von Fehlern auf den Mechanismus und die Kinetik von Festphasenreaktionen zu rechnen. Diese Stufe geht der chemischen Stufe der Umwandlung reagierender Substanzen an der Grenzfläche voraus. Somit wird die Kinetik heterogener Reaktionen sowohl durch die Art der chemischen Reaktion selbst als auch durch die Art der Abgabe des Stoffes an die Reaktionszone bestimmt. Demnach wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch die chemische Stufe (chemische Kinetik) oder die Diffusion (Diffusionskinetik) begrenzt. Dieses Phänomen wird in der Realität beobachtet.

Laut Wagner erfolgt die Diffusion und damit die Reaktion in Festkörpern hauptsächlich aufgrund der Beweglichkeit von Ionen und Elektronen, die durch den Nichtgleichgewichtszustand des Gitters verursacht wird. Verschiedene Gitterionen bewegen sich mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch es hindurch. Insbesondere ist die Beweglichkeit von Anionen im Vergleich zur Beweglichkeit von Kationen in den allermeisten Fällen vernachlässigbar. Daher erfolgt die Diffusion und damit die Reaktion in Feststoffen aufgrund der Bewegung von Kationen. In diesem Fall kann die Diffusion ungleicher Kationen in die gleiche Richtung oder aufeinander zu erfolgen. Bei Kationen unterschiedlicher Ladung bleibt die elektrische Neutralität des Systems aufgrund der Elektronenbewegung erhalten. Aufgrund der unterschiedlichen Bewegungsgeschwindigkeit unterschiedlich geladener Kationen im System entsteht ein elektrisches Potential. Dadurch verringert sich die Bewegungsgeschwindigkeit mobilerer Ionen und umgekehrt die Bewegungsgeschwindigkeit weniger mobiler Ionen? erhöht sich. Das resultierende elektrische Potenzial reguliert somit die Diffusionsgeschwindigkeiten von Ionen. Letztere und die dadurch bestimmte Geschwindigkeit des gesamten Festphasenumwandlungsprozesses können anhand der elektronischen Leitfähigkeit und der Übertragungszahlen berechnet werden. Es ist offensichtlich, dass eine gerichtete Diffusion von Ionen nur in einem elektrischen Feld oder bei Vorhandensein eines Konzentrationsgradienten im System möglich ist.

Bei der Synthese von Substanzen im festen Zustand ist es häufig erforderlich, nicht nur die chemische (Element- und Phasen-)Zusammensetzung des resultierenden Produkts, sondern auch seine mikrostrukturelle Organisation zu kontrollieren. Dies ist auf die starke Abhängigkeit sowohl chemischer (z. B. Aktivität bei Festphasenreaktionen) als auch vieler physikalischer (magnetischer, elektrischer, optischer usw.) Eigenschaften von den Merkmalen der strukturellen Organisation eines Festkörpers auf verschiedenen Hierarchieebenen zurückzuführen. Die erste dieser Ebenen umfasst die elementare Zusammensetzung eines Festkörpers und die Methode der relativen Anordnung der Atome von Elementen im Raum – die Kristallstruktur (oder Merkmale der unmittelbaren Koordinationsumgebung von Atomen in amorphen Festkörpern) sowie die Zusammensetzung und Konzentration von Punktfehlern. Als nächste Ebene der Festkörperstruktur können wir die Verteilung ausgedehnter Defekte im Kristall betrachten, die die Größe der Bereiche bestimmt, in denen (bereinigt um das Vorhandensein von Punktdefekten) translatorische Symmetrie in der Anordnung der Atome beobachtet wird. Solche Regionen können als perfekte Mikrokristalle betrachtet werden und werden als Regionen kohärenter Streuung bezeichnet. Wenn man von kohärenten Streubereichen spricht, muss man bedenken, dass sie im Allgemeinen nicht den kompakten Partikeln entsprechen, die ein Festphasenmaterial bilden, das eine beträchtliche Anzahl ausgedehnter Defekte und folglich kohärente Streubereiche enthalten kann. Das Zusammentreffen kohärenter Streubereiche mit Partikeln (die in diesem Fall als Einzeldomänen bezeichnet werden) wird normalerweise nur bei ausreichend kleinen (weniger als 100 nm) Größen der letzteren beobachtet. Nachfolgende Strukturebenen können mit der Form und Größenverteilung der das pulverförmige oder keramische Material bildenden Partikel, ihrer Aggregation, der Aggregation von Primäraggregaten usw. in Zusammenhang stehen.

Unterschiedliche Anwendungen von Festphasenmaterialien stellen unterschiedliche, oft gegensätzliche Anforderungen an die oben aufgeführten Struktureigenschaften und erfordern daher unterschiedliche Synthesemethoden. Daher ist es richtiger, über Synthesemethoden nicht von Festphasensubstanzen, sondern von Festphasenmaterialien zu sprechen und jeweils eine Synthesemethode unter Berücksichtigung des späteren Anwendungsbereichs des resultierenden Produkts auszuwählen.

Generell lassen sich Methoden zur Synthese von Festphasenmaterialien nach ihrem Abstand zu thermodynamischen Gleichgewichtsbedingungen für den Ablauf der eingesetzten chemischen Prozesse klassifizieren. In Übereinstimmung mit allgemeinen Gesetzen wird unter Bedingungen, die einem Zustand entsprechen, der maximal vom Gleichgewichtszustand entfernt ist, ein deutlicher Überschuss der Keimbildungsrate gegenüber der Wachstumsrate der gebildeten Keime beobachtet, was offensichtlich zur Bildung der am stärksten verteilten Keime führt Produkt. Wird der Prozess in der Nähe des thermodynamischen Gleichgewichts durchgeführt, erfolgt das Wachstum bereits gebildeter Keime schneller als die Bildung neuer, was wiederum die Gewinnung grobkristalliner (im Grenzfall einkristalliner) Materialien ermöglicht. Die Geschwindigkeit des Kristallwachstums wird weitgehend durch die Konzentration ausgedehnter (Nichtgleichgewichts-)Defekte in ihnen bestimmt.

Die kombinatorische Synthese kann nicht nur in Lösung (Flüssigphasensynthese), sondern auch an der Oberfläche einer festen, chemisch inerten Phase durchgeführt werden. Dabei wird der erste Ausgangsstoff chemisch mit funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Polymerträgers „verknüpft“ (am häufigsten wird eine Ester- oder Amidbindung verwendet) und mit einer Lösung des zweiten Ausgangsstoffs behandelt, die in erheblichem Maße eingenommen wird Überschuss, damit die Reaktion vollständig abläuft. Diese Reaktionsform bietet eine gewisse Bequemlichkeit, da die Technik der Produktisolierung vereinfacht wird: Das Polymer (normalerweise in Form von Granulat) wird einfach filtriert, gründlich gewaschen, um alle verbleibenden Reagenzien zu entfernen, und die Zielverbindung wird chemisch abgespalten Es.

In der organischen Chemie gibt es keine einzige Reaktion, die in der Praxis ohnehin quantitative Ausbeuten der Zielprodukte liefert. Die einzige Ausnahme ist offenbar die vollständige Verbrennung organischer Stoffe in Sauerstoff bei hohen Temperaturen zu CO 2 und H 2 O. Daher ist die Reinigung des Zielprodukts immer eine unverzichtbare und oft die schwierigste und zeitaufwändigste Aufgabe. Eine besonders anspruchsvolle Aufgabe ist die Isolierung von Peptidsyntheseprodukten, beispielsweise die Trennung einer komplexen Mischung von Polypeptiden. Daher hat sich in der Peptidsynthese die in den frühen 60er Jahren des 20. Jahrhunderts von R.B. Merifield entwickelte Synthesemethode auf einem festen Polymersubstrat am weitesten verbreitet.

Der Polymerträger bei der Merrifield-Methode ist körniges vernetztes Polystyrol, das Chlormethylgruppen in Benzolkernen enthält. Dabei handelt es sich um Linker, die den Träger mit dem ersten Aminosäurerest des Polypeptids verbinden. Diese Gruppen wandeln das Polymer in ein funktionelles Analogon von Benzylchlorid um und verleihen ihm die Fähigkeit, bei der Reaktion mit Carboxylat-Anionen leicht Esterbindungen zu bilden. Die Kondensation eines solchen Harzes mit N-geschützten Aminosäuren führt zur Bildung der entsprechenden Benzylester. Durch die Entfernung des N-Schutzes entsteht ein C-geschütztes Derivat der ersten Aminosäure, das kovalent an das Polymer gebunden ist. Die Aminoacylierung der freigesetzten Aminogruppe mit einem N-geschützten Derivat der zweiten Aminosäure und die anschließende Entfernung des N-Schutzes führen zu einem ähnlichen Dipeptidderivat, das ebenfalls an das Polymer gebunden ist:

Ein solcher zweistufiger Zyklus (Entschützung – Aminoacylierung) kann im Prinzip so oft wiederholt werden, bis eine Polypeptidkette einer bestimmten Länge aufgebaut ist.

Die Weiterentwicklung von Merifields Ideen zielte vor allem auf die Suche und Schaffung neuer Polymermaterialien für Substrate, die Entwicklung von Methoden zur Produkttrennung und die Schaffung automatisierter Anlagen für den gesamten Zyklus der Polypeptidsynthese

Die Wirksamkeit der Methode von Merifield wurde durch die erfolgreiche Synthese einer Reihe natürlicher Polypeptide, insbesondere Insulin, nachgewiesen. Besonders deutlich wurden seine Vorteile am Beispiel der Synthese des Enzyms Ribonuklease. Beispielsweise synthetisierten Hirschman und 22 Mitarbeiter unter großem Aufwand über mehrere Jahre hinweg das Enzym Ribonuklease (124 Aminosäurereste) mithilfe traditioneller Flüssigphasenmethoden. Fast gleichzeitig wurde das gleiche Protein durch automatisierte Festphasensynthese gewonnen. Im zweiten Fall wurde eine Synthese mit insgesamt 11.931 verschiedenen Vorgängen, darunter 369 chemische Reaktionen, von zwei Teilnehmern (Gatte und Merrifield) in nur wenigen Monaten abgeschlossen.

Merrifields Ideen dienten als Grundlage für die Entwicklung verschiedener Methoden zur kombinatorischen Synthese von Bibliotheken von Polypeptiden unterschiedlicher Struktur.

So wurde 1982 eine originelle Strategie für die mehrstufige Parallelsynthese von Peptiden auf der Festphase vorgeschlagen, die als „Split-Methode“ bekannt ist ( Teilt(Splitting, Separation) oder die „Mix and Divide“-Methode (Abb. 3). Sein Wesen ist wie folgt. Nehmen wir an, dass Sie aus drei Aminosäuren (A, B und C) alle möglichen Kombinationen von Tripeptiden erhalten müssen. Dazu wird ein Granulat des festen Polymerträgers (P) in drei gleiche Portionen aufgeteilt und mit einer Lösung einer der Aminosäuren behandelt. Dabei binden alle Aminosäuren mit einer ihrer funktionellen Gruppen chemisch an die Oberfläche des Polymers. Die resultierenden drei Polymerqualitäten werden gründlich gemischt und die Mischung erneut in drei Teile geteilt. Jede Portion, die alle drei Aminosäuren in gleichen Mengen enthält, wird dann erneut mit einer der gleichen drei Aminosäuren behandelt, um neun Dipeptide (drei Mischungen aus drei Produkten) herzustellen. Durch erneutes Mischen, Teilen in drei gleiche Teile und Bearbeiten mit Aminosäuren erhält man die gewünschten 27 Tripeptide (drei Gemische aus neun Produkten) in nur neun Schritten, wohingegen deren getrennte Gewinnung eine Synthese von 27 × 3 = 81 Schritten erfordern würde.

"Biologe. Zeitschrift Armenien, 1 (65), 2013 FESTPHASENSYNTHESE VON KARDIOAKTIVEN PEPTID, ISOLIERT AUS SCHWEIN-ATRIUM G.S. CHAILYAN Institut für Biochemie, benannt nach. Bunyatyan NAS RA..."

Experimentelle und theoretische Artikel

Experimentelle und theoretische Artikel

Biologe. Zeitschrift Armenien, 1 (65), 2013

FESTPHASENSYNTHESE VON KARDIOAKTIVEN PEPTID,

VON SCHWEIN-ATRIA ISOLIERT

G.S. CHAILIAN

Institut für Biochemie benannt nach. Bunyatyan NAS RA

[email protected].

Um die Forschung fortzusetzen, Akademiker. Galoyan führten wir eine Reihe von Experimenten durch, um neu isolierte Peptidverbindungen aus den Vorhöfen und Ohrmuschelteilen des Schweineherzens zu isolieren, zu reinigen und deren biologische Orientierung zu bestimmen. Zur Durchführung von Biotests war es notwendig, präparative Mengen der Testproben zu gewinnen. Dazu verwendeten wir die Methode der Festphasensynthese von Peptiden mit ihrer weiteren Modifikation. Die Reinheit und Identität der synthetisierten Medikamente wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektralanalyse überprüft.

Festphasensynthese – Fmoc-Aminosäuren – HPLC – Phenylisothiocyanat – Massenspektralanalyse:

fmoc- – – Für weitere von Galoyan durchgeführte Studien wurde eine Reihe von Experimenten zur Isolierung, Reinigung und Bestimmung der biologischen Richtung von aus Schweinevorhöfen isolierten Peptiden durchgeführt. Zur Durchführung der Biotests war die präparative Probenmenge erforderlich. Es wurde eine modifizierte Methode der Festphasen-Peptidsynthese verwendet. Die Reinheit und Identität des synthetisierten Peptids wurde durch HPLC und Massenspektralanalyse bestimmt.

Festphasensynthese – Hochleistungsflüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie – Fmoc-Aminosäuren – Kardiopeptide – Vorhöfe. Viele Jahre am Institut für Biochemie der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Republik Armenien in der Abteilung für Biochemie von Neurohormonen, Acad. Galoyan und seine Kollegen untersuchten die Regulierungswege und Wirkmechanismen hypothalamischer Neurohormone auf verschiedene Prozesse im Körper.

Die Bestätigung der Idee der miteinander verbundenen, voneinander abhängigen, integralen Funktionsweise eines Systems wie Hypothalamus – Hypophyse – Nebennieren war ein Wendepunkt in der Endokrinologie. Ergänzung dieses Konzepts der Festphasensynthese von kardioaktivem PEPTID aus dem Schweinevorhof der von Galoyan vorgeschlagenen Triade in Bezug auf die Wechselwirkung von Hypothalamus und Hypophyse

– Herz, ist eine große wissenschaftliche Errungenschaft. Anschließend wurde ein neues Zielgewebe, das Herz, entdeckt, die Fähigkeit dieses Organs, die Funktion spezifischer Peptide zu steuern, sowie die Existenz eines Rückkopplungsmechanismus zwischen dem Hypothalamus und dem Herzen durch diese Peptide nachgewiesen.

Die Entdeckung kardioaktiver Verbindungen – Neurohormone K, C, G und einer Reihe anderer im Hypothalamus verschiedener Tiere – diente nicht nur als Beginn der Arbeiten zur Untersuchung der molekularen Wirkmechanismen dieser Neurohormone, sondern auch zur Suche nach ähnlichen Verbindungen im Herzen. Grundlage für eine umfassende Untersuchung der biochemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften kardioaktiver Wirkstoffe waren Daten zum Vorhandensein von zwei kardioaktiven Verbindungen im Herzmuskel. Die Beteiligung des Neurohormons „C“ an der Regulierung glykolytischer Prozesse und des Spiegels zyklischer Nukleotide durch Hemmung von PDE cAMP, cAMP-abhängiger Proteinkinase usw. wurde nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindung ein niedriges Molekulargewicht hat und als Glykopeptid klassifiziert wird.

Im Labor für analytische Chromatographie und Peptidsynthese führten wir Arbeiten zur Isolierung und Reinigung von Peptidverbindungen aus den Vorhöfen und Ohrmuschelzonen des Schweineherzens durch. Bei der Trennung von Peptidfraktionen mittels präparativer HPLC haben wir 20 Verbindungen mit Peptidnatur isoliert und gereinigt, bis sie einen homogenen Zustand erreichten. Um die biologische Richtung zu bestimmen, wurden alle Medikamente auf Veränderungen der EKG-Komponenten bei Ratten getestet. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass sieben Verbindungen unterschiedliche Einflüsse auf bestimmte EKG-Komponenten haben.

Peptid Nr. 7 zeigte die größte Aktivität bei der Veränderung der Amplitude der R-Komponente, der Dauer des QRS-Komplexes, der Amplitude von S und anderen Parametern.

Um die biologischen Wirkmechanismen dieses Arzneimittels zu untersuchen, war eine große Anzahl von Testproben erforderlich. Aufgrund der Tatsache, dass der Prozess der Isolierung und Reinigung biologischer Produkte äußerst ineffektiv, arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist und keine gute Reproduzierbarkeit gewährleisten kann, ist die chemische Synthese dieses Arzneimittels äußerst dringlich geworden. Bei der Analyse der Weltliteratur auf dem Gebiet der chemischen Synthese von Peptiden kamen wir zu dem Schluss, dass die für uns optimalste Methode die Festphasensynthesemethode unter Verwendung von fmoc-geschützten Aminosäuren ist. Die 1984 entdeckte Festphasen-Peptidsynthese bietet gegenüber der herkömmlichen Synthese viele Vorteile in Bezug auf Effizienz sowie bequeme Verarbeitung und Reinigung.

Mithilfe verschiedener Methoden: Hydrolyse dieses Arzneimittels, Modifikation der Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat, erhielten wir die Aminosäurezusammensetzung von Peptid Nr. 7. Mithilfe von Daten aus Massenspektral- und NMR-Analysen sowie dem Edmond-Abbau konnten wir nicht nur die Aminosäurezusammensetzung, sondern auch die Aminosäuresequenz von Peptid Nr. 7 ermitteln.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Ein effektiver Festphasensyntheseprozess hängt weitgehend von der richtigen Wahl verschiedener Bedingungen für seine Umsetzung ab, wie z. B. der Wahl des Harzes, des Lösungsmittels und der Synthesekinetik. Diese Variablen beeinflussen den Quellungsgrad des Harzes und seine Verbindung mit Aminosäuren, die Anzahl der Bindungsstellen, was letztendlich die Synthese des Peptids als Ganzes beeinflusst. Wir haben den Festphasensyntheseprozess an unsere untersuchten Peptide angepasst und dabei die Besonderheiten ihrer Aminosäuresequenz berücksichtigt.

G.S. CHAILIAN Materialien und Methoden. Alle verwendeten Reagenzien, Lösungsmittel und Harze stammen von Advanced Chem Techcompany. Wir verwendeten fmoc-Gruppen zum Schutz der N-Termini von Aminosäuren während der Synthese und Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel während der gesamten Synthese. Als Träger verwendeten wir säurelabiles 2-Chlortritylharz. Die Entschützung der fmoc-Gruppen wurde mit einer Lösung von Piperidin in DMF durchgeführt.

Sehr wichtig im Syntheseprozess ist die Platzierung der ersten Aminosäure auf dem Harz. Zwei Gramm 2Cl-Trt-Harz wurden in eine 10-ml-Spritze gegossen. DMF wurde in eine Spritze aufgezogen und das Harz 15 Minuten lang quellen gelassen. Anschließend wurde das DMF ausgewaschen. Anschließend wurde eine Lösung der ersten Aminosäure (fmoc-Pro) und eines Reaktionsaktivators (DIPEA) im Verhältnis 1RESIN/1,2FMOC-PRO/4DIPEA in die Spritze aufgezogen. Die Reaktion zur Zugabe der ersten Aminosäure dauerte 3 Stunden. Eine sehr wichtige Voraussetzung für die Synthese ist das Fehlen freier Linker nach Zugabe der ersten Aminosäure, daher wurde das Harz nach der Bindung mit der ersten Aminosäure mit einer Mischung behandelt aus Methylen, DIPEA (Diisoproylethylamin) und DMF im Verhältnis 80DMF/15MEOH/5DIPEA, um eventuell verbleibende freie Enden zu blockieren. Danach wurde das DMF-Harz fünfmal 5 Minuten lang gewaschen. Anschließend wurden die Aminosäuren mit einer 30 %igen Lösung von Pipedin in DMF 8 Mal für 5 Minuten entblockt. Danach wurde das Harz fünfmal 5 Minuten lang mit DMF gewaschen. Dieser Zyklus wurde während der gesamten Peptidsynthese wiederholt. Nach jedem Schritt der Aminosäurezugabe und -deblockierung wurde der Reaktionsfortschritt durch den Kaiser-Test überwacht, bei dem es sich um die Reaktion von Ninhydrin mit einer freien Aminogruppe unter Bildung einer charakteristischen dunkelblauen Farbe handelt. Dank dieses Tests wurde eine schrittweise Überwachung der Aminosäurebindungs- und Deblockierungsreaktionen möglich.

Die Reinigung und Kontrolle des synthetisierten Peptids Nr. 7 erfolgte auf einem präparativen 2-Komponenten-HPLC-System der Firma Waters (USA). Zur Injektion der Probe wurde ein Rheodyne-Injektor mit einem Schleifenvolumen von 500 μl verwendet. Die Detektion erfolgte im Bereich von 190–360 nm. Für die Umkehrphasen-HPLC verwendeten wir eine Symmetry Si-100 C18-Säule (4,6 x 250 mm). Die Flussrate betrug 50 ml/min. Es wurde ein Gradienteneluierungssystem H2O/ACN/TFA (98/2/0,1)/(0,100,0,1) verwendet. Analysezeit 15 Min. Die Rechromatographie wurde auf einem Knauer HPLC-Analysesystem durchgeführt. Es wurde eine XbridgeC18-Säule (2,6 x 150 mm) verwendet. Die Detektion erfolgte bei 214 nm.

Um die erhaltenen Daten zu bestätigen, wurde das synthetisierte Medikament einer Massenspektralanalyse bei CSU „Analitycal Spectrometry“ unterzogen.

Resultate und Diskussion. Die aus dem Chromatogramm erhaltenen Daten legen nahe, dass die Reinheit des synthetisierten Peptids Nr. 7 nach der Reinigung mehr als 99,6 % beträgt (Abb. 1).

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Wir führten eine vergleichende chromatographische Analyse des nativen Peptids Nr. 7 auf einer X-bridgeC18-Säule unter den gleichen Bedingungen wie sein synthetisiertes Analogon durch. Die Vergleichsergebnisse werden dargestellt (Abb. 2).

FESTPHASENSYNTHESE VON KARDIOAKTIVEM PEPTID, ISOLIERT AUS DEM SCHWEINEATRIUM

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Reis. 4. Spektrogramme synthetisierter (A) und nativer (B) Arzneimittel.

G.S. CHAILIAN Wie aus einem Vergleich der Chromatogramme hervorgeht, sind das synthetisierte Analogon und das native Peptid Nr. 7 hinsichtlich Masse und Freisetzungszeit identisch, was auf die Identität ihrer Strukturen und Aminosäuresequenz hinweist. So konnten wir mithilfe der Methode der Festphasen-Peptidsynthese und unter Berücksichtigung der Strukturmerkmale des untersuchten Peptids ein homogenes und mit dem nativen Peptid identisches, bestehend aus 9 Aminosäuren erhalten. Wenn wir über eine ausreichende Menge des Medikaments verfügen, planen wir, in Zukunft eine Reihe von Biotests durchzuführen, um nicht nur die Art und Weise zu identifizieren, wie dieses Peptid die Herzaktivität reguliert, sondern auch die Wirkmechanismen auf andere Organe und Systeme.

LITERATUR

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Erkennung und Identifizierung einer neuen 1 im Herzen eines Bullen.

kardioaktive Proteine. Frage Honig. Chemie, 37, 2, p. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Isolierung und Charakterisierung 2.

kardioaktives tryptisches Fragment des Trägerproteins des Neurohormons „C“. Neurochemie, 2, 3, p. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Trennung von niedermolekularen koronaraktiven Verbindungen 3.

Herzmuskel mithilfe einer Kombination aus Gelfiltrations- und Polyacrylamid-Gelelektrophoresemethoden. Biologe. Zeitschrift Armenia, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Verteilung kardioaktiver Proteinkomplexe im Herzen verschiedener Tiere. Biologe. Zeitschrift Armenia, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, UdSSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biochemie neuartiger kardioaktiver Hormone und Immunmodulatoren des Funktionssystems Neurosekretorischer Hypothalamus, endokrines Herz. Science Publ. P. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, 3. Auflage, Springer Publishers, 500 S., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 S., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Die Reinigung koronarodilatorischer Proteine, die aus dem Hypothalamus isoliert wurden. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, S. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March’s fortgeschrittene organische Chemie. Herausgegeben von John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, S. 133, 2007.

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Ähnliche Werke:

„COMMUNITIES PUBLISHING HOUSE „SCIENCE“ Moskau 1979 UDC 581.55:56.017 Plotnikov V.V. Entwicklung der Struktur von Pflanzengemeinschaften. M.: Wissenschaft, S. 1979, 276 Über modernen Metal …“

„Neuigkeiten des nach ihm benannten Museumsfonds. A.A. Brauner Nr. 2 Band I 2004 Nachrichten des nach ihm benannten Museumsfonds. "

Die Erfindung betrifft ein Festphasenverfahren zur Synthese eines Peptids der Formel H-D-Nal-Thr-NH 2, das sowohl Boc-geschützte als auch Fmoc-geschützte Aminosäuren und ein chlormethyliertes Polystyrolharz verwendet. 10 Gehalt Fliege.

Technologiegebiet, auf das sich die Erfindung bezieht

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das drei oder mehr Aminosäurereste enthält, mit einer N-terminalen Aminosäure, einer vorletzten Aminosäure neben der N-terminalen Aminosäure und einer C-terminalen Aminosäure.

Stand der Technik

Die Festphasen-Peptidsynthese wurde 1963 eingeführt, um viele der Probleme der Zwischenreinigungsschritte zu überwinden, die mit der Peptidsynthese in Lösung verbunden sind (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. Auflage, 1984). Bei der Festphasensynthese werden Aminosäuren zu einem Peptid beliebiger Sequenz zusammengesetzt (z. B. verkettet), während ein Ende der Kette (z. B. der C-Terminus) an einen unlöslichen Träger gebunden wird. Sobald die gewünschte Sequenz auf dem Träger (Träger) zusammengesetzt ist, wird das Peptid anschließend vom Träger freigesetzt (d. h. gespalten). Zwei Standardschutzgruppen für die α-Aminogruppen verbindender Aminosäuren sind Boc, das mit einer starken Säure entfernt wird, und Fmoc, das mit einer Base entfernt wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein praktisches Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung einer Kombination dieser beiden α-Aminoschutze in einer einzigen Synthese auf einem kostengünstigen chlormethylierten Polystyrolharz bereit.

Bei der Entwicklung einer Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung eines der oben genannten α-Aminogruppen-Schutzschemata ist es wichtig, dass alle reaktiven „Seitengruppen“ der Aminosäurebestandteile des Peptids vor unerwünschten chemischen Reaktionen während des Kettenaufbaus geschützt werden. Es ist auch wünschenswert, dass die zum Schutz der verschiedenen Seitengruppen ausgewählten chemischen Gruppen nicht durch die zum Entschützen der α-Aminogruppen verwendeten Reagenzien entfernt werden. Drittens ist es wichtig, dass die Verbindung der wachsenden Peptidkette mit dem Harzpartikel gegenüber den Reagenzien, die im Kettenaufbauprozess verwendet werden, resistent ist, um jegliche Art von Aminogruppenschutz zu entfernen. Im Falle eines α-Aminogruppenschutzschemas unter Verwendung von Fmoc muss der Seitengruppenschutz gegenüber den alkalischen Reagenzien, die zur Entfernung von Fmoc verwendet werden, beständig sein. In der Praxis werden diese Seitenkettenschutzgruppen normalerweise mit schwach sauren Reagenzien entfernt, nachdem der Peptidkettenaufbau abgeschlossen ist. Wenn das α-Amino-Schutzschema unter Verwendung von Boc verwendet wird, muss der Seitengruppenschutz resistent gegen das schwach saure Reagenz sein, das in jedem Zyklus zur Entfernung der Boc-Gruppe verwendet wird. In der Praxis werden diese Seitenkettenschutzgruppen im α-Amino-Schutzschema mit Boc normalerweise mit wasserfreiem HF entfernt, nachdem der Peptidkettenaufbau abgeschlossen ist. Daher sind in der Praxis die Gruppen, die üblicherweise zum Schutz von Seitenketten im Schema zum Schutz der -Aminogruppen mit Fmoc verwendet werden, unter den Bedingungen instabil, die zum Entschützen der -Aminogruppen mit Boc verwendet werden. Daher werden die beiden Arten von Schemata zum Schutz von α-Aminogruppen während des Aufbaus der Peptidkette in der Festphasen-Peptidsynthese nicht kombiniert. Darüber hinaus kommt die Literatur zu dem Schluss, dass das billigste Polymerharz, das in der Peptidsynthese verwendet wird (chlormethyliertes Polystyrol oder „Merifield-Harz“), häufig zusammen mit durch Boc-Gruppen geschützten Aminosäuren verwendet wird, dass es im Fall des Schutzes von α-Amino nicht anwendbar ist aufgrund seiner Instabilität unter alkalischen Bedingungen durch Fmoc-Gruppen ersetzt (siehe Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. Aufl., 1984). Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Kombinieren sowohl Boc-geschützter als auch Fmoc-geschützter Aminosäuren auf Merifield-Harz während der Festphasensynthese bestimmter Peptide.

Lanreotide®, ein Somatostatin-Analogon, hemmt bekanntermaßen die Freisetzung von Wachstumshormonen und hemmt außerdem Insulin, Glucagon und die exokrine Pankreassekretion.

Das US-Patent Nr. 4,853,371 offenbart und beansprucht Lanreotide®, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein Verfahren zur Hemmung der Sekretion von Wachstumshormon, Insulin, Glucagon und exokriner Pankreassekretion.

Das US-Patent Nr. 5,147,856 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Restenose.

Das US-Patent Nr. 5.411.943 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Hepatomen.

Das US-Patent Nr. 5.073.541 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Lungenkrebs.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/089410, eingereicht am 9. Juli 1993, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Melanomen.

Das US-Patent Nr. 5.504.069 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Hemmung des beschleunigten Wachstums eines soliden Tumors.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/854941, eingereicht am 13. Mai 1997, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Gewichtsabnahme.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/854943, eingereicht am 13. Mai 1997, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Insulinresistenz und Syndrom X.

Das US-Patent Nr. 5.688.418 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Verlängerung der Lebensfähigkeit von Pankreaszellen.

Die PCT-Anmeldung Nr. PCT/US 97/14154 offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Fibrose.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/855311, eingereicht am 13. Mai 1997, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Hyperlipidämie.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/440061, eingereicht am 12. Mai 1995, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Hyperamylinämie.

Die US-Patentanmeldung Nr. 08/852221, eingereicht am 7. Mai 1997, offenbart die Verwendung von Lanreotide® zur Behandlung von Hyperprolaktinämie und Prolaktinomen.

Das Wesentliche der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids bereit, das drei oder mehr Aminosäurereste enthält, eine N-terminale Aminosäure, eine vorletzte Aminosäure neben der N-terminalen Aminosäure und eine C-terminale Aminosäure aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: die folgenden Schritte:

(a) Anbringen einer ersten Aminosäure an ein festes Trägerharz durch eine Esterbindung, um ein erstes Additionsprodukt zu bilden, was Folgendes umfasst: (i) Umsetzen einer wässrigen Lösung von Cäsiumcarbonat mit einer alkoholischen Lösung der ersten Aminosäure, um ein Cäsiumsalz zu bilden der ersten Aminosäure, (ii) Erhalten eines lösungsmittelfreien Cäsiumsalzes der ersten Aminosäure, (iii) Umsetzen des festen Harzträgers mit dem Cäsiumsalz der ersten Aminosäure in einem trockenen (wasserfreien) polaren aprotischen Lösungsmittel ein erstes Additionsprodukt bilden,

wobei die erste Aminosäure der C-terminalen Aminosäure des Peptids entspricht, die Aminogruppe der Nicht-Seitenkette (Hauptkette) der ersten Aminosäure durch Boc blockiert ist und die erste Aminosäure keine Funktion aufweist Gruppe in der Seitenkette, für die Schutz erforderlich ist, und das feste Trägerharz ist ein chlormethyliertes Polystyrolharz;

(b) Entschützen (Deblockieren) von Boc vom ersten Additionsprodukt mit einer Säure, um ein entschütztes erstes Additionsprodukt zu bilden;

(c) optional Hinzufügen einer weiteren Aminosäure zum freigesetzten ersten Additionsprodukt, was die Reaktion der nächsten Aminosäure mit dem freigesetzten ersten Additionsprodukt in einem organischen Lösungsmittel, das ein Peptidverlängerungsreagenz enthält, umfasst, um ein blockiertes (geschütztes) nächstes Additionsprodukt zu erzeugen, wobei die nächste Aminosäure in der Hauptkette eine durch Boc blockierte Aminogruppe aufweist und wenn die folgende Aminosäure eine oder mehrere funktionelle Seitenkettengruppen aufweist, dann erfordern die funktionellen Seitenkettengruppen keinen Schutz, ebenso wenig wie die funktionellen Seitenkettengruppen haben Schutzgruppen, die gegenüber den sauren oder alkalischen Reagenzien, die zum Entfernen des Schutzes bzw. Boc und Fmoc verwendet werden, resistent sind;

(d) Entschützen von Boc vom blockierten nächsten Additionsprodukt, was die Reaktion des blockierten nächsten Additionsprodukts mit einer Säure umfasst, um das entblockte nächste Additionsprodukt zu erhalten;

(e) optional Wiederholen der Schritte (c) und (d) und in jedem Zyklus wird das freigesetzte Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition gebildet, wobei X die Anzahl der erforderlichen Wiederholungen des Zyklus ist;

(e) Hinzufügen einer weiteren Aminosäure zum freigesetzten ersten Additionsprodukt aus Schritt (b) oder optional zum freigesetzten (X+1)-ten nächsten Additionsprodukt aus Schritt (e), was die Reaktion der nächsten Aminosäure mit diesem beinhaltet erstes Additionsprodukt oder mit dem nichtblockierten (X+1)-ten nächsten Additionsprodukt in einem organischen Lösungsmittel, das ein Reagens zur Verlängerung des Peptids enthält, um ein blockiertes (geschütztes) nächstes Additionsprodukt zu erzeugen, wobei die nächste Aminosäure ein Fmoc-blockiertes Rückgrat aufweist Aminogruppe, vorausgesetzt, dass, wenn die nächste Aminosäure eine oder mehrere funktionelle Gruppen in der Seitenkette hat, die funktionellen Gruppen in der Seitenkette keinen Schutz benötigen oder die funktionellen Gruppen in der Seitenkette Schutzgruppen haben, die gegen die Aminogruppe resistent sind alkalische Reagenzien zur Entschützung von Fmoc;

(g) Entschützen von Fmoc vom blockierten nächsten Additionsprodukt, was die Reaktion des blockierten nächsten Additionsprodukts mit einem primären oder sekundären Amin umfasst, um das entblockte nächste Additionsprodukt zu erhalten;

(h) optional Wiederholen der Schritte (e) und (g) und in jedem Zyklus wird das deblockierte Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition gebildet, wobei X die Anzahl der erforderlichen Wiederholungen des Zyklus ist, bis der vorletzte ist im Peptid enthalten und enthält eine deblockierte Aminosäure;

(i) Hinzufügen einer N-terminalen Aminosäure zum deblockierten Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition, was die Reaktion der N-terminalen Aminosäure mit dem deblockierten Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition beinhaltet in einem organischen Lösungsmittel, das ein Peptidverlängerungsreagenz enthält, wodurch ein blockiertes Vervollständigungsprodukt entsteht, wobei die N-terminale Aminosäure eine durch Boc oder Fmoc blockierte Rückgrataminogruppe aufweist;

(j) Entschützen des verkappten Adduktors mit einer Säure im Fall von Boc oder einer Base im Fall von Fmoc, um ein fertiges Peptidprodukt auf dem Harz zu bilden;

(j) wenn das fertige Peptidharzprodukt funktionelle Seitenkettengruppen enthält, dann optional Entschützen der Seitenkettenfunktionsgruppen des fertigen Peptidharzprodukts, was die Reaktion des fertigen Peptidharzprodukts mit geeigneten Entschützungsreagenzien einschließt, um das fertige Peptidharz zu erhalten Produkt. Peptidprodukt auf entschütztem Harz; Und

(k) Abspalten des Peptids vom festen Harzträger innerhalb des fertigen Harz-Peptidprodukts oder des entschützten Harz-vollständigen Peptidprodukts, um ein Peptid herzustellen, was die Reaktion des mit Harz vervollständigten Peptidprodukts oder des entschützten Harz-vollständigen Peptidprodukts mit Ammoniak, einem primären Amin oder a umfasst sekundäres Amin, bis die Abspaltung des Peptids vom Harz im Wesentlichen vollständig ist;

vorausgesetzt, dass die Schritte (e) und (g) der Peptidsynthese mindestens einmal durchgeführt werden müssen.

Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Ammoniak, das primäre Amin oder das sekundäre Amin in Schritt (l) in einem Lösungsmittel vorliegt, das einen Alkohol und gegebenenfalls ein aprotisches polares Lösungsmittel enthält.

Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Schritt (k) weiterhin die folgenden Schritte umfasst:

Ausfällung des gespaltenen Peptids aus dem Lösungsmittel;

Trennen des festen Harzträgers und des ausgefällten Peptids durch Filtration; und

Extrahieren des Peptids mit einer sauren Lösung, um das Peptid zu isolieren.

Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem die erste Aminosäure Boc-L-Thr ist.

Bevorzugt ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei dem die erste Aminosäure ein Cäsiumsalz von Boc-L-Thr ist, was ein Boc-L-Thr-Harz als erstes Additionsprodukt ergibt, und das deblockierte erste Additionsprodukt ein H-L-Thr-Harz ist .

Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe in Schritt (i) verwendete Säure Trifluoressigsäure (TFA) ist.

Ein bevorzugtes Verfahren, das mit dem unmittelbar vorhergehenden Verfahren verwandt ist, ist ein Verfahren, bei dem das organische Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform oder Dimethylformamid und das Peptidverlängerungsreagenz Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Ethyl-N''-(3-dimethylaminopropyl) ist )Carbodiimid.

Ein bevorzugtes Verfahren, das mit dem unmittelbar vorhergehenden Verfahren zusammenhängt, ist ein Verfahren, das die Durchführung der Schritte (e) und (g) sechsmal nach der Bildung des entschützten ersten Additionsprodukts der Formel H-L-Thr-Harz umfasst, wobei die nachfolgenden Aminosäuren vorliegen in der Reihenfolge hinzugefügt: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) und Fmoc-L- Cys(Acm) unter Bildung des Produkts H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz.

Eine bevorzugte Methode im Zusammenhang mit der unmittelbar vorhergehenden Methode ist eine Methode, die die Zugabe von Boc-D-Nal zu H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys( Acm)-Tnr-Harz gemäß Schritt (c), um Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Act)-Thr-Harz zu erhalten.

Eine bevorzugte Methode, die mit der unmittelbar vorhergehenden Methode verwandt ist, beinhaltet die gleichzeitige Entfernung der Boc-Gruppe, die D- -Nal schützt, der O-t-Bu-Gruppe, die Tyr schützt, und der Boc-Gruppe, die Lys in Boc-D- -Nal-Cys(Acm) schützt )-Tyr( O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz gemäß Schritt (i), um ein vollständiges Peptidprodukt auf dem Harz der Formel H-D- -Nal zu erhalten -Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz.

Eine bevorzugte Methode, die mit der unmittelbar vorhergehenden Methode verwandt ist, beinhaltet die Entfernung des Peptids H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr aus dem festen Harz durch Durchführung der H-D- Nal-Cys-Reaktion (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-Harze mit Ammoniak in einem Lösungsmittel, das Alkohol und optional ein aprotisches polares Lösungsmittel enthält, bis zur nahezu vollständigen Eliminierung, um H-D- zu erhalten. -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

Ein bevorzugtes Verfahren, das mit dem unmittelbar vorhergehenden Verfahren verwandt ist, ist das Verfahren, bei dem der Alkohol Methanol und das polare aprotische Lösungsmittel Dimethylformamid ist.

Die bevorzugte Methode der unmittelbar vorhergehenden Methode beinhaltet die gleichzeitige Entfernung der Cys-schützenden Acm-Gruppen und die Zyklisierung der resultierenden entschützten Cys-Reste in das resultierende Peptidprodukt der Formel H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 durch Reaktion von H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 mit einer Jodlösung in Alkohol bis zur fast vollständigen Entschützung und Cyclisierung, um H-D-Nal-Thr-NH 2 zu erhalten.

Eine bevorzugte Methode, die mit der unmittelbar vorhergehenden Methode verwandt ist, ist die Methode, bei der das Peptid H-D-Nal-Thr-NH 2 ist.

Eine bevorzugte Methode, die mit der unmittelbar vorhergehenden Methode verwandt ist, ist die Methode, bei der das Peptid ein Somatostatin-Analogon ist.

Die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe sind wie folgt definiert:

„erste Aminosäure“: umfasst jede Aminosäure, in der die Aminogruppe in der Hauptkette (nicht in der Seitenkette) durch Boc geschützt ist, die im Handel erhältlich ist oder nach Methoden synthetisiert werden kann, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind Kunst, zum Beispiel Boc-L-Thr;

„Erstadditionsprodukt“: beschreibt ein Produkt, das an einen festen Harzträger gebunden ist und durch die Zugabe einer ersten Aminosäure zum festen Harzträger entsteht, beispielsweise Boc-L-Thr-Harz;

„entschütztes erstes Additionsprodukt“: beschreibt ein Produkt, das aus der Entfernung oder Entfernung einer Boc-Gruppe aus dem ersten Additionsprodukt resultiert – zum Beispiel ein H-L-Thr-Harz, wobei „H“ den verfügbaren Rückgrat-Aminowasserstoff darstellt, der aus dem Entschützungsschritt resultiert ;

„nächste Aminosäure“: beschreibt jede Aminosäure, in der die Aminogruppe in der Hauptkette durch Boc oder Fmoc geschützt ist, die im Handel erhältlich ist oder nach Methoden synthetisiert werden kann, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Da Schritt (c) und Schritt (e) Teil eines Wiederholungszyklus sein können, in dem der Schritt mehr als einmal durchgeführt wird, kann bei jeder Durchführung von Schritt (c) oder Schritt (e) die „nächste Aminosäure“ unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bekannter oder möglicherweise synthetisierter Aminosäuren, bei denen die Aminogruppe in der Hauptkette durch Boc oder Fmoc geschützt ist;

„(X+1)-tes blockiertes Produkt der nächsten Addition“: beschreibt das an das feste Trägerharz gebundene Produkt, das aus der Kombination der nächsten Aminosäure mit dem „nicht blockierten Produkt der nächsten Addition“ resultiert. Da die Schritte (c) und (d) sowie die Schritte (e) und (g) Teil eines sich wiederholenden Zyklus sein können, in dem weitere Aminosäuren hinzugefügt werden können, bezieht sich der Begriff „blockiertes Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition“. auf das Produkt, das als Ergebnis jedes der vorherigen Beitrittszyklen erhalten wurde;

„unblockiertes Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition“: beschreibt das Produkt, das aus der Entfernung der Fmoc-Gruppe aus dem „blockierten Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition“ resultiert;

„fertiges Peptidprodukt auf Harz“: beschreibt ein Peptidprodukt, das an einen festen Harzträger gebunden ist, nachdem die N-terminale Aminosäure an die Peptidkette angehängt wurde und nachdem die Rückgrat-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure entschützt oder entschützt wurde , das aber noch Schutzgruppen an den funktionellen Gruppen der Seitenketten aufweist, die nicht durch die Reaktion entfernt wurden, die die Schutzgruppe von der Hauptkette der N-terminalen Aminosäure entfernt; Und

„fertiges Peptidprodukt auf entschütztem Harz“: beschreibt ein Peptidprodukt, das an einen festen Harzträger gebunden ist, bei dem alle funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenkette entfernt oder entschützt wurden.

Beispiele für Säuren, die zum Entschützen von Boc verwendet werden können, sind Trifluoressigsäure (TFA), Methansulfonsäure und organische Lösungen, die HCl enthalten.

Beispiele für primäre und sekundäre Amine, die zum Entschützen von Fmoc verwendet werden können, sind 4-(Aminomethyl)piperidin, Piperidin, Diethylamin, DBU und Tris(2-aminoethyl)amin.

Beispiele für nicht nukleophile Basen, die zur Neutralisierung von TFA-Salzen freier Aminogruppen (RNH 3 + CF 3 COO -) verwendet werden können, diese Salze müssen vor oder während der Zugabe der nächsten Aminogruppe in „freie“ Amine (NH 2) umgewandelt werden Säure, sonst findet die Addition nicht statt) sind Diisopropylethylamin (DIEA) und Triethylamin (TEA).

Beispiele für organische Lösungsmittel, die bei Aminosäureadditionsreaktionen verwendet werden können, sind Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Dimethylformamid, Diethylacetamid, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, 1-Methyl-2-pyrrolidon, Acetonitril oder eine Kombination dieser Lösungsmittel.

Beispiele für Peptidverlängerungsmittel umfassen substituierte Carbodiimide wie Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Ethyl-N''-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.

Die Carboxylgruppen und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidamidbindung beteiligt sind, werden Carboxylgruppe bzw. „Nicht-Seitenketten“-Aminogruppe genannt. Andererseits werden alle funktionellen Aminosäuregruppen, die nicht an der Bildung der Peptidamidbindung beteiligt sind, als funktionelle „Seitenketten“-Gruppen bezeichnet.

Der Begriff „basenstabile Gruppe“ bezieht sich auf Schutzgruppen, die zum Schutz funktioneller Gruppen von Aminosäuren verwendet werden, die (1) basenstabil sind, beispielsweise nicht durch Basen wie 4-(Aminoethyl)piperidin, Piperidin oder Tris(2) entfernt werden können -Aminoethyl)amine, die üblicherweise zur Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe verwendet werden, und (2) können mit einer Säure wie Trifluoressigsäure oder einer anderen Methode wie katalytischer Hydrierung entfernt werden.

Die Symbole „Fmoc“ und „Boc“ werden hier und in der beigefügten Formel zur Bezeichnung von 9-Fluorenylmethoxycarbonyl bzw. tert-Butyloxycarbonyl verwendet.

Das oben beschriebene Verfahren kann auf die Herstellung von Peptiden, vorzugsweise Somatostatin-Analoga, wie Lanreotide®-Octapeptid, angewendet werden, das die folgende Formel aufweist: H-D-Nal-Thr-NH 2 . Wenn H-D-Nal-Thr-NH 2 synthetisiert werden soll, können die basenstabilen Schutzgruppen, die zum Schutz der funktionellen Gruppen der Cys-, Lys- und Tyr-Seitenketten verwendet werden, Acetamidomethyl (Acm), Boc bzw. tert-Butyl sein. Acm wird für Cys bevorzugt.

Mit Somatostatin-Analogon ist ein Peptid gemeint, das eine ähnliche (dh Agonist) oder entgegengesetzte (dh Antagonist) biologische Aktivität wie Somatostatin aufweist.

In der Formel H-D- -Nal--Thr-NH 2 bezieht sich jedes der üblichen dreibuchstabigen Aminosäuresymbole (z. B. Lys) auf einen Strukturrest der Aminosäure. Beispielsweise steht das Symbol Lys in der obigen Formel für -NH-CH((CH 2) 4 NH 2)-CO-. Das Symbol D- -Nal- steht für den Aminosäurerest D-2-Naphthylalanilyl. Die Klammern deuten auf eine Disulfidbindung hin, die die freien Thiole zweier Cys-Reste im Peptid verbindet, was darauf hinweist, dass die Aminosäuren des Peptids innerhalb der Klammern einen Zyklus bilden.

Basierend auf der hier gegebenen Beschreibung wird ein Fachmann in der Lage sein, die vorliegende Erfindung in vollem Umfang zu nutzen.

Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, allgemein verstanden werden. Darüber hinaus werden alle hierin zitierten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und sonstigen Referenzen durch Bezugnahme hierin aufgenommen.

Das Peptid kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt werden.

Eine Lösung von 0,5 Moläquivalenten Cäsiumcarbonat in Wasser wird langsam zu einer Lösung von 1 Moläquivalent Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) gegeben, wobei AA 1 der in Alkohol gelösten C-terminalen Aminosäure entspricht. vorzugsweise Methanol. Die resultierende Mischung wird etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, dann werden der gesamte Alkohol und das gesamte Wasser unter reduziertem Druck entfernt, um ein trockenes Pulver des Cäsiumsalzes Boc-AA 1 zu erhalten. Merifield-Harz, 1,0 Äquivalent (chlormethyliertes Polystyrol, 200–400 Mesh, Chlorioneneinschluss 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky oder Polymer Laboratories, Church Stretton, England) wird mit einem chlorierten Lösungsmittel, vorzugsweise Dichlormethan (DCM), gewaschen. ein Alkohol, vorzugsweise Methanol, und ein polares aprotisches Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF). Das Cäsiumsalz Boc-AA 1-Pulver wird in einem wasserfreien (trockenen) polaren aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF, gelöst und die Lösung mit dem vorgewaschenen Harz kombiniert. Die Aufschlämmung wird bei etwa 45–65°C, vorzugsweise bei 50–60°C, etwa 48 bis 106 Stunden, vorzugsweise 85 bis 90 Stunden lang, unter einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff sanft gerührt. Das Harz wird durch Filtration abgetrennt und gründlich mit einem polaren aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF, Wasser und schließlich mit einem Alkohol wie MeOH gewaschen. Das Boc-AA 1-Harz wird unter vermindertem Druck getrocknet.

Vos-AA 1-Harz wird in einen Glasreaktor mit einem Filterboden aus großporösem geschmolzenem Glas gegeben. Das Harz wird mit einem chlorierten Lösungsmittel wie DCM gewaschen, mit einer organischen Säure, vorzugsweise 25 % TFA in DCM, entblockt, kurz mit einer chlorierten Lösung wie DCM und einem Alkohol wie MeOH gewaschen, mit einer organischen Base, vorzugsweise Triethylamin, neutralisiert DCM gewaschen und erneut mit DCM und einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie DMF gewaschen, wodurch ein entschütztes AA 1-Harz entsteht.

Dem entschützten AA 1-Harz wird dann optional eine beliebige Anzahl an Aminosäuren zugesetzt. Wenn die nächste Aminosäure eine -Aminogruppe mit Fmoc-Schutz (Fmoc-AA x) hat, dann erfordert die Seitenkettengruppe entweder keinen Schutz (z. B. Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe oder Fmoc-Thr). oder die Seitenkette schützt mit einer basenresistenten Gruppe. Ein molarer Überschuss an Fmoc-AA x (wobei x die Aminosäurepositionsnummer im Peptid ist, gemessen vom C-Terminus) wird über etwa 60 Minuten an das entschützte AA 1-Harz unter Verwendung eines Peptidverlängerungsreagenzes wie Diisopropylcarbodiimid (DIC) gekoppelt ), in einer DCM/DMF-Mischung. Das Additionsharz wird mit DMF, Alkohol und DCM gewaschen, um Fmoc-AA x -AA 1-Harz zu erhalten. Die Anhaftung kann mit der Kaiser-Ninhydrin-Methode getestet werden. Das Fmoc-AA x -AA 1-Harz wird dann einmal mit DMF gewaschen und dann mit einer Basenlösung in einem organischen Lösungsmittel wie Piperidin in DMF entblockiert, um ein AA x -AA 1-Harz zu erhalten. Das AA x -AA 1-Harz wird dann mit DMF gewaschen, gefolgt von mehreren Wäschen sowohl mit einem Alkohol wie MeOH als auch mit DCM. Das AA x -AA 1-Harz wird dann einmal etwa 3 Minuten lang mit DMF, dreimal mit Isopropanol, vorzugsweise jedes Mal etwa 2 Minuten lang, und dreimal mit DCM, vorzugsweise jeweils etwa 2 Minuten lang, gewaschen. Das Harz ist dann für die weitere Anbringung entweder einer Fmoc-geschützten Aminosäure wie oben beschrieben oder einer Boc-geschützten Aminosäure wie unten beschrieben bereit.

Wenn eine nachfolgende Aminosäure, die an das entschützte AA 1 -Harz angehängt werden soll, so ausgewählt wird, dass sie eine geschützte Boc-Aminogruppe (Boc-AA x) aufweist, muss die Seitenkettengruppe ebenfalls nicht geschützt werden (dies könnte Boc sein). Gly, Boc-Ala, Boc-Phe oder Boc-Thr) oder die Seitenkette muss durch eine Gruppe geschützt sein, die sowohl gegen Entfernung durch Säure als auch Base resistent ist – dies könnte Boc-Cys(Acm) sein. Bei Auswahl von Boc-AA x erfolgt die Zugabe mit denselben Reagenzien und Lösungsmitteln wie im oben beschriebenen Fall für Fmoc-Aminosäuren und die Vollständigkeit (Abschluss) der Zugabe kann mit der Kaiser-Ninhydrin-Methode überprüft werden. Das Boc-AA x -AA 1-Harz wird dann mit einer Säurelösung in einem organischen Lösungsmittel wie TFA in DCM entschützt, um ein CF 3 CO - H + -AA x -AA 1-Harz herzustellen. Dieses Harz wird dann mehrmals mit chlorierten Lösungsmitteln wie DCM und einem Alkohol wie MeOH gewaschen und mit einer nicht nukleophilen Base wie Triethylamin in DCM neutralisiert, gefolgt von mehreren weiteren Wäschen mit einem chlorierten Lösungsmittel wie DCM, was AA x ergibt -AA 1 - Harz Das Harz ist dann für die weitere Anbringung der Boc- oder Fmoc-geschützten Aminosäure wie oben beschrieben bereit.

Abhängig von der gewünschten Peptidsequenz und der Art der verwendeten α-Amino-geschützten Aminosäure (entweder Fmoc-geschützt oder Boc-geschützt) wird eine geeignete Kombination der oben beschriebenen Kopplungsverfahren verwendet, je nachdem, welche Aminosäure diese besetzen soll Seitenkettenposition in der Peptidsequenz mit einer Schutzgruppe, die entweder mit einer Base entfernt werden kann, was zur Entfernung von Fmoc aus der -Aminogruppe erforderlich ist, oder mit einer Säure, die zur Entfernung von Boc aus der -Aminogruppe erforderlich ist. Eine solche geschützte Aminosäure kann N- -Boc-N"- -Fmoc-Lysin oder N- -Fmoc-N"- -Boc-Lysin sein. Wenn dies der Fall ist, müssen alle für die α-Aminogruppen der nachfolgenden Aminosäuren ausgewählten Schutzgruppen bis zur N-terminalen Aminosäure mit der für diese Position ausgewählten Seitengruppenschutzgruppe kompatibel sein. Dies bedeutet, dass die Seitenkettenschutzgruppen gegenüber dem Entschützungsmittel resistent sein müssen, das zum Entschützen der α-Aminogruppen nachfolgender Aminosäuren verwendet wird. Für eine N-terminale Aminosäure kann entweder Boc oder Fmoc als -Aminogruppenschutz verwendet werden, da die Entschützung der N-terminalen Aminosäure gleichzeitig einige der geschützten Seitenketten entschützen kann, ohne die Peptidsynthesestrategie unerwünscht zu beeinflussen, da nein Aminosäuren, die übrig bleiben, werden hinzugefügt.

Die fertige Peptidkette, die noch am Harz haftet, muss entschützt und freigesetzt werden. Um alle basenstabilen Schutzgruppen und gegebenenfalls die N-terminale Aminosäure-Blockierungsgruppe zu entfernen, wird das Peptid auf dem Harz mit einer Säure in einem organischen Lösungsmittel wie TFA in DCM behandelt. Um alle säurestabilen Schutzgruppen und ggf. die N-terminale Aminosäure-Blockierungsgruppe zu entfernen, wird das Peptid auf dem Harz mit einer organischen Base wie Piperidin in DMF behandelt. Alternativ können die säurestabilen Gruppen beibehalten werden, bis sie durch anschließende Spaltung des Peptids mit Ammoniak oder einer Aminbase entfernt werden. Das entschützte Peptid auf dem Harz wird dann mit einem chlorierten Lösungsmittel wie DCM und einem Alkohol wie MeOH gewaschen und unter reduziertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Das Peptid wird vom Harz abgespalten und der C-Terminus in ein Amid umgewandelt, indem das Peptid in einer 3:1 MeOH/DMF-Mischung auf dem Harz suspendiert wird. Die Suspension wird unter einer Stickstoffatmosphäre auf eine Temperatur unter etwa 10 °C abgekühlt und wasserfreies Ammoniakgas wird unter die Oberfläche des Lösungsmittels eingeleitet, bis die Lösung damit gesättigt ist, während die Temperatur unter etwa 10 °C gehalten wird. Die Aufschlämmung wird etwa 24 Stunden lang leicht gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 20 °C ansteigen kann. Der Grad der Vollständigkeit der Reaktion wird durch das Verschwinden des Methylether-Zwischenprodukts bei HPLC unter geeigneten Bedingungen je nach Peptidtyp überprüft. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und die erforderliche Menge an wasserfreiem Ammoniak zugegeben, bis die dem Methylester entsprechende HPLC-Peakfläche weniger als 10 % der Peakfläche des gewünschten Produkts beträgt. Die Aufschlämmung wird auf eine Temperatur unter etwa 10 °C abgekühlt und das Rühren wird über Nacht fortgesetzt, um das Peptid auszufällen. Der Niederschlag und das Harz werden durch Filtration getrennt und mit kaltem MeOH gewaschen. Der Niederschlag und das Harz werden unter vermindertem Druck getrocknet und das Produkt mit einer wässrigen Essigsäurelösung aus dem Harz extrahiert.

Wenn das Peptid geschützte Cys-Reste in seiner Sequenz enthält, können die Thiolgruppen entschützt werden und die Reste können gemäß dem folgenden Verfahren zyklisiert werden. Das Acm-geschützte Cys-Gruppen enthaltende Peptid wird in einer wässrigen Essigsäurelösung in einer Stickstoffatmosphäre gelöst. Die Lösung wird schnell gemischt und eine Lösung von Jod in Alkohol in einer Portion hinzugefügt. Die Mischung wird gerührt und die Vollständigkeit der Schutzgruppenentfernung wird mittels HPLC überprüft. Anschließend wird die Reaktion durch Titration mit einer 2 %igen Natriumthiosulfatlösung gestoppt, bis die Farbe der Lösung verschwindet. Das Rohgemisch wird durch präparative Chromatographie auf einer C8-Kartusche mit einem Gradienten aus Acetonitril in 0,1 Ammoniumacetatpuffer gereinigt, auf einer C8-Kartusche mit einem Gradienten aus Acetonitril in 0,25 N Essigsäure entsalzt und lyophilisiert, um das Zielpeptid zu erhalten.

Beispiel für die Umsetzung der Erfindung

Das folgende Beispiel dient zur Veranschaulichung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung und sollte nicht als Einschränkung seines Umfangs ausgelegt werden.

Beispiel 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2

A) Boc-L-Thr-Harz

Eine Lösung von 2,58 g Cäsiumcarbonat in 2,5 ml Wasser wurde langsam zu einer Lösung von 3,48 g Boc-L-Threonin (Bachem California, Torrance, Kalifornien), gelöst in 7 ml Methanol, gegeben. Die resultierende Mischung wurde etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, dann wurden das gesamte Methanol und das gesamte Wasser unter reduziertem Druck entfernt, um trockenes Boc-L-Threonin-Cäsiumsalzpulver zu erhalten. 10 g Merifield-Harz (chlormethyliertes Polystyrol, 200–400 Mesh, Chloreinschluss 1,3 mEq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) wurden mit Dichlormethan (DCM), Methanol (MeOH) und Dimethylformamid (DMF) (jeweils 2 Mal 70) gewaschen ml). Das Cäsiumsalz Boc-L-Threonin-Pulver wurde in 60 ml trockenem DMF gelöst und die Lösung wurde mit dem wie oben gewaschenen Harz kombiniert. Die Aufschlämmung wurde bei einer Temperatur von etwa 50–60 °C etwa 85 bis 90 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre sanft gerührt. Das Harz wurde durch Filtration abgetrennt und gründlich mit DMF, entionisiertem Wasser und schließlich MeOH gewaschen. Das Boc-Threonin-Harz wurde unter reduziertem Druck bei etwa 40 °C getrocknet. Der Threonin-Einschluss betrug 0,85 ± 0,15 meq/g trockenes Harz.

B) H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz

2,0 g Boc-Threonin-Harz aus Schritt (A) wurden in einen 50-ml-Glasreaktor mit großporigem Schmelzglasfilterboden gegeben (Beladung 1,74 mmol). Das Harz wurde zweimal mit DCM (20 ml) gewaschen, jedes Mal etwa 5 Minuten lang, mit 25 % TFA in DCM (30 ml) entblockt – das erste Mal etwa 2 Minuten lang und das zweite Mal etwa 25 Minuten lang, gewaschen 3 mal etwa 2 Minuten lang mit DCM (20 ml), Isopropanol (20 ml) und DCM (20 ml) gewaschen, zweimal etwa 5 Minuten lang mit 10 % Triethylamin in DCM (20 ml) neutralisiert, dreimal etwa 2 Minuten lang mit DCM gewaschen und einmal mit DMF (20 ml) etwa 5 Minuten lang gespült.

Zu dem entblockten Harz wurden 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 Äquivalente) Fmoc-L-Cystein (Acm) (Bachem, CA) und 683 μl (4,35 mmol, 2,5 Äquivalente) Diisopropylcarbodiimid (DIC) in 14 gegeben ml einer 2:1-Mischung aus DCM/DMF für etwa 1 Stunde. Nach der Kopplung wurde das Harz einmal etwa drei Minuten lang mit DMF (20 ml), dreimal etwa zwei Minuten lang mit Isopropanol und dreimal etwa drei Minuten lang mit DMF (20 ml) gewaschen 2 Min. DXM (20 ml). Die Bindung wurde mit der Kaiser-Nihydrin-Methode getestet.

Nach dem Fügen wurde das Harz einmal mit DMF gewaschen und dann mit einer Lösung von Piperidin in DMF entblockt. Dann wurde das deblockierte Harz mit der Zugabe mit DMF und mehrmals gleichzeitig mit MeOH und DCM gewaschen. Das Additionsharz wurde einmal etwa 3 Minuten lang mit DMF (20 ml), dreimal etwa 2 Minuten lang mit Isopropanol (20 ml) und dreimal jeweils etwa 2 Minuten lang mit DCM (20 ml) gewaschen. Die Bindung wurde mit der Kaiser-Ninhydrin-Methode getestet.

Jede der folgenden geschützten Aminosäuren wurde unter Verwendung von DIC in DMF/DCM an das gewaschene Harz gekoppelt und wie oben beschrieben in der folgenden Reihenfolge entschützt: Fmoc-L-Valin, Fmoc-L-Lysin (Boc), Fmoc-D-Tryptophan, Fmoc-L-Tyrosin (O-t-Bu) und Fmoc-L-Cystein (Acm) (alle von Bachem, Kalifornien), Boc-D-2-Naphthylalanin (Synthech, Albany, OR).

Die vollständige Peptidkette wurde zweimal mit 75:20:5 DCM/TFA/Anisol (30 ml) etwa 2 Minuten und etwa 25 Minuten lang deblockiert und entschützt und dreimal jeweils etwa 2 Minuten lang mit DCM (20 ml) und Isopropanol gewaschen (10 ml) und DCM (20 ml), neutralisiert 2 Mal für etwa 5 Minuten mit 10 % Triethylamin in DCM (20 ml) und gewaschen 3 Mal für etwa 2 Minuten mit DCM (20 ml) und MeOH (20 ml). Das Harz wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Das Trockengewicht betrug 3,91 g (103 % der theoretischen Ausbeute).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

2,93 g des peptidbeladenen Harzes aus Schritt (B) (1,3 mmol-Äq.) wurden in 50 ml einer 3:1 MeOH/DMF-Mischung suspendiert. Die Suspension wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf eine Temperatur unter etwa 10 °C abgekühlt und mit trockenem Ammoniakgas gespült, bis die Lösung damit gesättigt war, während die Temperatur unter etwa 10 °C gehalten wurde. Die Aufschlämmung wurde etwa 24 Stunden lang sanft gerührt, wobei die Temperatur auf etwa 20 °C ansteigen konnte. Der Grad der Vollständigkeit der Reaktion wurde durch das Verschwinden des Methylether-Zwischenprodukts mittels HPLC überprüft (VYDAC® Sorbens, Korngröße 5 μm, Porengröße 100 Å, C18, Elution unter isokratischen Bedingungen 26 % CH 3 CN in 0,1 % TFA, Geschwindigkeit 1 ml/min, Aufnahme bei 220 mm; unter diesen Bedingungen beträgt die Verzögerungszeit Rt ~ 14 min für den Methylester und ~ 9,3 min für das Amidprodukt). Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und überschüssiges wasserfreies Ammoniak zugegeben, bis die dem Methylester entsprechende HPLC-Peakfläche weniger als 10 % der Peakfläche des gewünschten Produkts betrug. Die Aufschlämmung wurde auf eine Temperatur unter etwa 10 °C abgekühlt und das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt, um das Peptid auszufällen. Der Niederschlag und das Harz wurden durch Filtration getrennt und mit 15 ml kaltem MeOH gewaschen. Der Niederschlag und das Harz wurden unter vermindertem Druck getrocknet und das Produkt mit einer 50 %igen wässrigen Essigsäurelösung (3 Portionen zu je 30 ml) aus dem Harz extrahiert. Die HPLC-Analyse zeigte das Vorhandensein von 870 mg (0,70 mmol) des Titelprodukts in der Mischung (96 % Reinheit in einem isokratischen HPLC-System).

D) H-D- -Nal--Thr-NH 2

500 mg (0,40 mmol) des Peptids aus Schritt (B) wurden in 300 ml 4 %iger Essigsäure gelöst und unter einer Stickstoffatmosphäre auf etwa 55 °C erhitzt. Die Lösung wurde schnell gerührt und eine 2 % w/v-Lösung von Jod in 7,7 ml MeOH (0,60 mmol) wurde in einer Portion zugegeben. Die Mischung wurde etwa 15 Minuten lang gerührt, dann wurde die Reaktion durch Titration mit 2 %iger Natriumthiosulfatlösung gestoppt, bis die Farbe verschwand (~ 2 ml). Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Die Mischung wurde durch präparative Chromatographie auf einer C8-Säule (YMC, Inc., Wilmington, NC) mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,1 M Ammoniumacetat gereinigt, auf einer C8 YMC-Säule mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,25 N Essigsäure entsalzt und lyophilisiert, um 350 mg Zielpeptid mit 99 % Reinheit zu ergeben.

Basierend auf der obigen Beschreibung kann ein Fachmann die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung leicht ermitteln und, ohne vom Geist und Umfang derselben abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Anwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit sind auch andere Ausführungsformen der Erfindung von den Ansprüchen umfasst.

BEANSPRUCHEN

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel H-D- -Nal--Thr-NH 2 , wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Anbringen einer ersten Aminosäure an ein festes Trägerharz durch eine Esterbindung, um ein „erstes Additionsprodukt“ zu bilden, was Folgendes umfasst: (i) Umsetzen einer wässrigen Lösung von Cäsiumcarbonat mit einer alkoholischen Lösung der ersten Aminosäure, um a zu bilden Cäsiumsalz der ersten Aminosäure, (ii) Erhalten eines lösungsmittelfreien Cäsiumsalzes der ersten Aminosäure, (iii) Umsetzen des festen Harzträgers mit dem Cäsiumsalz der ersten Aminosäure in einem wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel unter Bildung ein „Erstzusatzprodukt“,

wobei die erste Aminosäure Boc-L-Thr ist, die der C-terminalen Aminosäure des Peptids entspricht, und das feste Trägerharz ein chlormethyliertes Polystyrolharz ist;

(b) Entschützen von Boc vom ersten Additionsprodukt mit einer Säure, um ein „entschütztes erstes Additionsprodukt“ zu bilden;

(c) optional Hinzufügen einer „nächsten Aminosäure“ zum „freigesetzten ersten Additionsprodukt“, was die Reaktion der „nächsten Aminosäure“ mit dem „freigesetzten ersten Additionsprodukt“ in einem organischen Lösungsmittel, das ein Peptidverlängerungsreagens enthält, zur Herstellung umfasst „blockiertes Produkt der folgenden Addition“, wobei die „nächste Aminosäure“ eine Boc-verkappte Aminogruppe in der Hauptkette aufweist, und wenn diese „nächste Aminosäure“ eine oder mehrere funktionelle Gruppen in der Seitenkette aufweist, dann die funktionelle Gruppen in der Seitenkette erfordern keinen Schutz oder diese funktionellen Gruppen in der Seitenkette verfügen über Schutzgruppen, die gegenüber den zur Entschützung verwendeten sauren oder alkalischen Reagenzien, Boc bzw. Fmoc, stabil sind;

(d) Entschützen des Boc des „blockierten nächsten Additionsprodukts“, was die Reaktion des „blockierten nächsten Additionsprodukts“ mit einer Säure umfasst, um das „deblockierte nächste Additionsprodukt“ herzustellen;

(e) optional Wiederholen der Schritte (c) und (d), wobei jeder Zyklus das „entblockte Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition“ erzeugt, wobei X die Anzahl der gewünschten Wiederholungen der Zyklen bezeichnet;

(f) Hinzufügen der „nächsten Aminosäure“ zum „entblockten Produkt der ersten Addition“ aus Schritt (b) oder optional zum „(X+1)-ten entblockierten Produkt der nächsten Addition“ aus Schritt (e), was das Tragen beinhaltet Führen Sie die Reaktion „nächste Aminosäure“ mit dem „nicht blockierten Produkt der ersten Addition“ oder mit dem „(X+1)-ten, nicht blockierten Produkt der nächsten Addition“ in einem organischen Lösungsmittel durch, das ein Peptidverlängerungsreagens enthält, um ein „blockiertes Produkt der nächsten Addition“ herzustellen. wobei die „nächste Aminosäure“ eine Fmoc-verkappte Hauptketten-Aminogruppe aufweist, vorausgesetzt, dass, wenn diese „nächste Aminosäure“ eine oder mehrere funktionelle Seitenkettengruppen aufweist, die funktionellen Seitenkettengruppen keinen Schutz benötigen oder die Seitenkettenfunktionalität nicht erforderlich ist Gruppen haben Schutzgruppen, die gegen alkalische Reagenzien resistent sind, die zum Entschützen von Fmoc verwendet werden;

(g) Entschützen der „blockierten nächsten Addition“ von Fmoc, was die Reaktion der „blockierten nächsten Addition“ mit einem primären oder sekundären Amin umfasst, um eine „deblockierte nächste Addition“ zu erzeugen;

(h) optional Wiederholen der Schritte (e) und (g), wobei jeder Zyklus das „entblockte Produkt der (X+1)-ten nächsten Addition“ erzeugt, wobei X die gewünschte Anzahl von Wiederholungen des Zyklus bis zur Integration ist das Peptid und die vorletzte Aminosäure werden freigesetzt;

(i) Hinzufügen einer N-terminalen Aminosäure zum „freigesetzten Produkt der (X+1)-ten nachfolgenden Addition“, was die Reaktion der N-terminalen Aminosäure mit dem „freigesetzten Produkt der (X+1)-ten „Nachfolgende Addition“ in einem organischen Lösungsmittel, das ein Peptidverlängerungsreagenz enthält, um ein „blockiertes Additionsprodukt“ zu erzeugen, wobei die „N-terminale Aminosäure“ eine durch Boc oder Fmoc blockierte Rückgrat-Aminogruppe aufweist;

(j) Entschützen des verkappten Kopplungsprodukts Boc oder Fmoc durch Reaktion des verkappten Kopplungsprodukts mit einer Säure im Falle von Boc oder einer Base im Falle von Fmoc, um das verkappte Peptidprodukt auf dem Harz zu bilden;

(k) wenn das „vollständige Peptidharzprodukt“ funktionelle Seitenkettengruppen enthält, dann optional die Entschützung der Seitenkettenfunktionsgruppen des „vollständigen Peptidharzprodukts“, was die Reaktion des „vollständigen Peptidharzprodukts“ mit geeigneten Entschützungsreagenzien umfasst um ein „vollständiges Peptidprodukt auf einem entschützten Harz“ herzustellen; Und

(k) Abspalten eines Peptids von einem festen Harzträger in einem „fertigen Peptidharzprodukt“ oder einem „vollständigen entschützten Peptidproduktharz“, um ein Peptid herzustellen, was die Reaktion des „vollständigen Peptidprodukts auf einem Harz“ oder „vollständigen Peptidprodukt“ umfasst auf einem Harz.“ entschütztes Harz mit Ammoniak, einem primären Amin oder einem sekundären Amin, bis das Peptid im Wesentlichen vom Harz entfernt ist;

vorausgesetzt, dass die Schritte (e) und (g) in der Synthese des Peptids sechsmal nach der Bildung des „deblockierten ersten Additionsprodukts“ der Formel H-L-Thr-Harz durchgeführt werden, wobei die nachfolgenden Aminosäuren hinzugefügt werden Reihenfolge: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) und Fmoc-L-Cys(Acm ), um das Produkt H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ammoniak, primäre Amin oder sekundäre Amin in Schritt (k) in einem Lösungsmittel vorliegt, das einen Alkohol und gegebenenfalls ein aprotisches polares Lösungsmittel enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (k) weiterhin die folgenden Schritte umfasst:

(i) Fällung des gespaltenen Peptids aus dem Lösungsmittel;

(ii) Abtrennen des festen Harzträgers und des ausgefällten Peptids durch Filtration; und

(iii) Extrahieren des Peptids mit einer sauren Lösung, um das Peptid zu isolieren.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Aminosäure ein Cäsiumsalz von Boc-L-Thr ist, was ein Boc-L-Thr-Harz als erstes Additionsprodukt ergibt und die „erste Addition entblockt“ wird Produkt“ ist H-L-Thr-Harz.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe in Schritt(en) verwendete Säure Trifluoressigsäure (TFA) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das organische Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform oder Dimethylformamid ist und das Reagens zur Erhöhung des Peptids Diisopropylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Ethyl-N''-(3-dimethylaminopropyl) ist )Carbodiimid.

7. Verfahren nach Anspruch 6, einschließlich der Zugabe von Boc-D- -Nal zu H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)- Thr-Harz gemäß Schritt (i), um Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz zu erhalten.

8. Verfahren nach Anspruch 7, einschließlich der gleichzeitigen Entfernung der Boc-Gruppe, die D- -Nal blockiert, der O-t-Bu-Gruppe, die Tyr schützt, und der Boc-Gruppe, die Lys in Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- schützt. Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz, gemäß Schritt(en), um ein vollständiges Peptidprodukt auf dem Harz der Formel H-D- -Nal-Cys zu erhalten (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-Harz.

9. Verfahren nach Anspruch 8, umfassend die Abspaltung des Peptids H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr vom Festharz durch Durchführung der Reaktion H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-Harze mit Ammoniak in einem Lösungsmittel, das Alkohol und optional ein aprotisches polares Lösungsmittel enthält, bis zur im Wesentlichen vollständigen Eliminierung H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Alkohol Methanol und das polare aprotische Lösungsmittel Dimethylformamid ist.

11. Das Verfahren nach Anspruch 10, einschließlich der gleichzeitigen Entfernung von Acm-Gruppen, die das Cys schützen, und der Zyklisierung der resultierenden entschützten Cys-Reste in einem „vollständigen Peptidharzprodukt“ der Formel H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr -D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 durch Reaktion von H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 mit eine Lösung von Jod in Alkohol bis zur im Wesentlichen vollständigen Entschützung und Cyclisierung, um H-D-Nal-Thr-NH 2 zu ergeben.

Die Festphasensynthese von Peptiden wurde von R. B. Merrifield von der Rockefeller University vorgeschlagen (Nobelpreis 1984). Diese Methode basiert auf dem Aufbau eines Peptids auf einem unlöslichen Polymerträger durch sequentielle Addition von Aminosäureresten mit geschützten α-Amino- und Seitengruppen. Der Plan bestand darin, die Peptidkette schrittweise zusammenzubauen, wobei die Kette während der Synthese an einem Ende an einen festen Träger gebunden wurde. Infolgedessen war die Isolierung und Reinigung von Zwischenprodukten und Zielpeptidderivaten lediglich eine Frage des Filtrierens und gründlichen Waschens des festen Polymers, um alle überschüssigen Reagenzien und in der Lösung verbleibenden Nebenprodukte zu entfernen.

Der Begriff Festphase bezieht sich vielmehr auf die physikalischen Eigenschaften der Substanz auf dem Träger, da die chemische Reaktion auf dem Polymerträger in einer Phase – in Lösung – abläuft. In einem geeigneten Lösungsmittel quillt das Polymer zu einem niedrigviskosen, aber hochstrukturierten Gel (vernetzte Polymere) oder löst sich auf (im Fall nicht vernetzter Polymere) und der Syntheseprozess erfolgt auf ultramikroheterogener Ebene , in einem nahezu homogenen System.

Die organische Festphasensynthese erfordert eine Polymerbasis – Harz. S, an den der Linker angehängt ist L. In der ersten Phase An den Linker wird ein Substratmolekül gebunden A.Molekül A immobilisiert (d. h. ist nicht mehr mobil), behält aber die Fähigkeit, mit einem anderen Reagenz zu reagieren IN(Stufe 2).

Produkt AB verbleibt auf dem Harz und kann so von überschüssigem Reagenz getrennt werden IN(und Nebenprodukte) durch einfaches Waschen. (Sie können immer mehr neue Reagenzien hinzufügen und so das ursprüngliche Substrat sukzessive verkomplizieren A, Hauptsache, der Linker bleibt bei diesen Reaktionen unverändert). Bifunktionaler Linker L ist so gewählt, dass seine Verbindung mit dem Harz erfolgt S war haltbarer als mit dem Untergrund A. Dann im letzten Schritt die Zielverbindung AB kann vom Harz getrennt werden, indem seine Bindung zum Linker aufgebrochen wird. Es ist klar, dass die Verbindung L-AB muss unter milden Bedingungen spalten, ohne die Verbindung selbst (Verklebung) zu beschädigen A-IN), noch Kontakt des Linkers mit dem Harz (Bindung L-S).

Idealerweise wird also durch Waschen des Harzes nach jedem Schritt und Lösen der Verbindung mit dem Träger eine reine Substanz erhalten. Man kann davon ausgehen, dass die Verwendung eines großen Überschusses an Reagenzien und die anschließende Abtrennung vom Harz in vielen Fällen eine Verschiebung des chemischen Gleichgewichts in Richtung der Bildung des Zielprodukts und eine Verkürzung der Synthesezeit ermöglichen. Zu den Nachteilen der organischen Festphasensynthese gehören die Notwendigkeit, einen relativ großen Überschuss (2–30 Äquivalente) an Reagenzien zu verwenden, Schwierigkeiten bei der Identifizierung von Zwischenprodukten der Synthese sowie die relativ hohen Kosten für modifizierte Polymerträger, die durch die bestimmt werden Kosten des Linkers.

Von Merrifield in die Praxis der organischen Synthese eingeführt, ist chlormethyliertes Polystyrol (vernetzt mit einer kleinen Menge Divinylbenzol), das sogenannte Merrifield-Harz, der am besten zugängliche Polymerträger.

Methodik und Hauptphasen der Festphasen-Peptidsynthese

Die gestellte Aufgabe erfordert die Einführung eines Polymerträgers mit einer gepfropften Aminosäure in eine Reaktion mit einem zur Substitution aktivierten Heterocyclus. Betrachten wir den methodischen Aspekt der Gewinnung immobilisierter Aminosäuren auf Polymerträgern genauer.

Bühne1. Immobilisierung einer N-geschützten Aminosäure auf einem Polymerträger.

Der erste Schritt unseres Schemas ist die Immobilisierung der Aminosäure auf einem Polymerträger. Um Nebenprozesse wie die Bildung von Oligopeptiden zu vermeiden, wird die Aminosäure vorgeschützt. Typischerweise werden N-geschützte Aminosäuren verwendet und die resultierende Bindung zwischen der Aminosäure und dem Träger ist vom Amid- oder Estertyp.

Die am häufigsten verwendeten Aminogruppenschutzgruppen in der organischen Festphasensynthese sind Carbamat-Schutzgruppen, tert-Butoxycarbonyl- (Boc) und 9H-Fluor(Fmoc). X ist die geschützte Gruppe:

Es ist zu beachten, dass die Wahl der Schutzgruppe von der Art des verwendeten Polymerträgers abhängt. Die Bedingungen für die Immobilisierung geschützter Aminosäuren sind für verschiedene Arten von Polymerträgern unterschiedlich. Es wird eine Immobilisierung von Boc-Aminosäuren auf Merrifield-Harz, bei dem es sich um chlormethyliertes Polystyrol handelt, durchgeführt vor Ort in Form von Cäsiumsalzen durch Zugabe einer Suspension von Cäsiumcarbonat in Dimethylphthalat (DMF) und katalytischen Mengen Kaliumiodid. Der Überschuss an Reagenzien im Verhältnis zur Trägermenge wird jeweils individuell gewählt und beträgt 1,5–4 Äquivalente.

Die Immobilisierung von Fmoc-Aminosäuren auf einem Wang-Polymerträger (X=O) zur Bildung eines Esterlinkers vom Benzyltyp erfolgt nach der Carbodiimid-Methode unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Gegenwart von 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP). ein Katalysator. Die Immobilisierungsreaktion mit sterisch ungehinderten Aminosäuren erfolgt bei Raumtemperatur. Die Immobilisierung sterisch gehinderter Aminosäuren erfordert eine zweitägige Reaktion bei 40–60 °C und eine wiederholte Immobilisierung (Schema 1). Immobilisierung von Fmoc - Aminosäuren auf den Rink-Polymerträger (X=NH) unter Bildung eines Amid-Linkers vom Benzhydryl-Typ erfolgt in Gegenwart des Castro-Reagens (1H-1,2,3-Benzotriazol-1-yloxy) tris-(Dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Diisopropylethylamin-Base (DIEA) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) als Katalysator. Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur für 2 Stunden bei sterisch ungehinderten Aminosäuren und 4–6 Stunden bei sterisch gehinderten Aminosäuren ab.

Stufe 2.Entschützung einer geschützten Aminosäure auf einem Polymerträger

Im zweiten Schritt, den wir planen (nach der Immobilisierung der geschützten Aminosäure), ist es notwendig, die Schutzgruppe zu entfernen, um die Aminogruppe zu aktivieren. Die Methoden zum Entfernen des Boc- und Fmoc-Schutzes sind unterschiedlich. Die Entfernung des Boc-Schutzes von Aminosäuren auf Merrifield-Harz wird mit 50 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan für eine halbe Stunde durchgeführt; unter diesen Bedingungen bleibt der Merrifield-Linker intakt.

Nach der Schutzgruppenentfernung wird das Harz mit Triethylaminlösung gewaschen, um Trifluoressigsäure zu entfernen. Die Entfernung des Fmoc-Schutzes von Aminosäuren auf Wang- (X=O) und Rink-Trägern (X=NH) wird mit einer 20 %igen Lösung von Piperidin in DMF für 40–50 Minuten durchgeführt.

Eine signifikante Abnahme der Harzmasse nach Entfernung des Fmoc-Schutzes kann als Grundlage für die gravimetrische Bestimmung des Immobilisierungsgrads geschützter Aminosäuren in der ersten Stufe der Festphasensynthese dienen. Es wird empfohlen, das Harz nacheinander mit einer Lösung von Piperidin in Dimethylphthalat zu behandeln – zuerst 5-10 Minuten lang, dann 30 Minuten lang in einer frischen Lösung. Nach dem Entfernen des Schutzes wird das Harz mindestens viermal mit Dimethylphthalat gewaschen, um die Zerstörungsprodukte des Fmoc-Schutzes zu entfernen. Mithilfe des Kaiser-Tests ist es möglich, den Fortschritt der Acylierungsreaktion am Träger zu überwachen oder die Schutzfunktion der Aminogruppe aufzuheben.

Stufe 3.Nukleophile Substitution in Heterozyklen mit einer auf einem Träger immobilisierten Aminosäure

Der nächste Schritt, den wir für die praktische Umsetzung geplant haben, ist die Durchführung der aromatischen nukleophilen Substitutionsreaktion; Die gepfropfte Aminosäure dient als Nukleophil und der aktivierte Heterocyclus liegt in Lösung. Die meisten nukleophilen Substitutionsreaktionen in Trägern unterscheiden sich in der Durchführung nicht von Reaktionen in der flüssigen Phase. Es ist jedoch zu beachten, dass die Prozesstemperatur 120 °C nicht überschreiten sollte, da ab diesem Zeitpunkt die Polystyrolbasis des Trägers zu zerfallen beginnt. Unter den Bedingungen der auf dem Träger durchgeführten Reaktion muss auch der Linker erhalten bleiben.

Bei der Auswahl geeigneter aktivierter heterocyclischer Substrate sollte die Art der Abgangsgruppe im Heterocyclus berücksichtigt werden.

Stufe 4.Entfernen der Zielverbindung von Polymerträgern

Die meisten Linker in der organischen Festphasensynthese werden in einer sauren Umgebung gespalten. Die Säurebeständigkeit von Linkern nimmt stark ab, wenn von Merrifield-Harz zu Wang- und Rink-Harz übergegangen wird. Der Rink-Linker wird unter milderen Bedingungen (10–20 % CF3COOH) gespalten als der Wang-Linker (50 % CF3COOH). Das Merrifield-Harz ist unter diesen Bedingungen passiv und für seine Spaltung wird eine Umesterung in einer NaOMe/MeOH-Lösung verwendet, was zu … die Bildung eines Säureesters.

Erinnern wir uns noch einmal daran, dass die Art des Linkers die Art der terminalen Funktion im resultierenden, vom Substrat entfernten Molekül bestimmt. Wangs Harz produziert Säuren und Rinks Harz produziert Amide.

Vorteile dieses Schemas der Festphasen-Peptidsynthese:

1. An einzelne Granulatkörner können unterschiedliche Ausgangsstoffe gebunden werden. Diese Perlen werden dann gemischt, sodass alle Ausgangsverbindungen in einem einzigen Experiment mit dem Reagenz reagieren können. Dadurch entstehen Reaktionsprodukte an einzelnen Körnern. In den meisten Fällen führt das Mischen der Ausgangsmaterialien in der traditionellen Flüssigchemie zu Fehlern – Polymerisation oder Verharzung der Produkte. Experimente auf festen Substraten schließen diese Effekte aus.

2. Da die Ausgangsmaterialien und Produkte an den festen Träger gebunden sind, können überschüssige Reaktanten und nicht trägergebundene Produkte leicht vom festen Polymerträger abgewaschen werden.

3. Zur Vervollständigung der Reaktion können große Überschüsse an Reagenzien verwendet werden (mehr als 99 %), da diese Überschüsse leicht abgetrennt werden können.

4. Durch die Verwendung geringer Beladungsvolumina (weniger als 0,8 mmol pro Gramm Substrat) können unerwünschte Nebenreaktionen eliminiert werden.

5. Die Zwischenprodukte im Reaktionsgemisch sind an das Granulat gebunden und müssen nicht gereinigt werden.

6. Einzelne Polymerkörner können am Ende des Versuchs getrennt werden und so individuelle Produkte erhalten.

7. Das Polymersubstrat kann regeneriert werden, wenn die Bruchbedingungen ausgewählt und die entsprechenden Ankergruppen – Linker – ausgewählt werden.

8. Eine Automatisierung der Festphasensynthese ist möglich.

Die notwendigen Bedingungen für die Durchführung der Festphasensynthese sind neben der Anwesenheit eines unlöslichen, unter Reaktionsbedingungen inerten Polymerträgers:

Das Vorhandensein eines Ankers oder Linkers ist eine chemische Funktion, die die Verbindung des Substrats mit der aufgetragenen Verbindung gewährleistet. Es muss kovalent an das Harz gebunden sein. Der Anker muss außerdem eine reaktive funktionelle Gruppe sein, damit Substrate mit ihm interagieren können.

Die zwischen Substrat und Linker gebildete Bindung muss unter den Reaktionsbedingungen stabil sein.

Es muss Möglichkeiten geben, die Bindung des Produkts oder Zwischenprodukts an den Linker aufzubrechen.