24.11.202227.05.2017

] Die Definition von Antioxidantien als chemische Verbindungen vermittelt jedoch kein vollständiges Bild der Schutzeigenschaften des untersuchten Objekts: Sie werden nicht nur durch die Menge des einen oder anderen Antioxidans bestimmt, sondern auch durch die Aktivität jedes einzelnen von ihnen . Antioxidative Aktivität oder antioxidative Aktivität, AOA, ist die Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion eines Antioxidans mit einem freien Radikal (kInH). Die Chemilumineszenz (CL)-Methode ermöglicht die Bestimmung der Gesamtmenge an Radikalen, die Antioxidantien in der Probe binden (Gesamtantioxidationskapazität, TAU), und bei Verwendung der Methode der mathematischen Modellierung der CL-Kinetik auch die Geschwindigkeit ihrer Bildung und Reaktion Radikale mit Antioxidantien, also AOA [ , , ].

Die häufigste Modifikation der Chemilumineszenzmethode zur Bestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität basiert auf der Verwendung von Luminol als Chemilumineszenzaktivator [ , , , ]. Eine Probe wird unter Zugabe von Luminol, Wasserstoffperoxid und einer Verbindung, die durch spontane Zersetzung (Thermolyse) Radikale erzeugen kann, beispielsweise 2,2'-Azobis-(2-amidinopropan), in die Küvette des Chemiluminometers gegeben. Dihydrochlorid (ABAP): ABAP → 2R. In Gegenwart von molekularem Sauerstoff bildet der Alkylrest R ein Peroxylradikal ROO : R + O 2 → ROO . Darüber hinaus oxidiert das Peroxylradikal die Chemilumineszenzsonde Luminol (LH 2) und es entsteht das Luminolradikal (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. Aus LH entsteht durch die Bildung von Zwischenprodukten (Luminolhydroperoxid und Luminolendoperoxid) ein Molekül des Endprodukts der Luminoloxidation, Aminophthalsäure, in einem elektronisch angeregten Zustand, das ein Photon emittiert, und als Ergebnis wird Chemilumineszenz beobachtet . Die CL-Intensität ist proportional zur Photonenproduktionsrate, die wiederum proportional zur stationären LH-Konzentration im System ist. Durch die Wechselwirkung mit Radikalen unterbrechen Antioxidantien die beschriebene Umwandlungskette und verhindern die Bildung eines Photons.

Thermolysepflichtige Verbindungen sind nicht die einzige mögliche Radikalquelle bei der Analyse der antioxidativen Kapazität einer Probe mit der Chemilumineszenzmethode. Alternativen sind Systeme Meerrettichperoxidase-Wasserstoffperoxid [ , ], Hämin-Wasserstoffperoxid, Cytochrom Mit–Cardiolipin–Wasserstoffperoxid usw. Das Reaktionsschema der Luminoloxidation durch Peroxidasen wird in der Arbeit von Cormier et al. .

Die kinetischen CL-Kurven für diese Systeme spiegeln zwei Phasen der Reaktion wider: das Stadium eines Anstiegs der CL-Intensität und das Stadium eines Plateaus oder einer allmählichen Abnahme der Lumineszenz, wenn die CL-Intensität entweder konstant ist oder langsam abnimmt. Der Artikel beschreibt zwei Ansätze zur Messung der gesamten antioxidativen Kapazität, die dieses Merkmal der Kurven berücksichtigen. Die TRAP-Methode (Total Reactive Antioxidant Potential) basiert auf der Messung der Latenzzeit von CL τ und können zur Bestimmung von Antioxidantien wie Trolox oder Ascorbinsäure verwendet werden: Sie zeichnen sich durch einen hohen Wert der Remit Radikalen aus und können daher als starke Antioxidantien bezeichnet werden. Während der Latenzzeit erfolgt ihre vollständige Oxidation. Die TAR-Methode (Total Antioxidant Reactivity) misst den Grad der Löschung der Chemilumineszenz Q am Plateau oder am Maximum der Chemilumineszenzkurve: Formel, wobei I die Intensität der Chemilumineszenz ohne Antioxidans und I 1 die Intensität von CL in Gegenwart eines Antioxidans ist. Diese Methode wird verwendet, wenn das System überwiegend schwache Antioxidantien mit niedrigen Geschwindigkeitskonstanten der Wechselwirkung mit Radikalen enthält – viel niedriger im Vergleich zur Luminolkonstante.

Die Wirkung von Antioxidantien wird nicht nur durch Indikatoren charakterisiert τ Und Q. Wie aus [ , ] hervorgeht, ist die Wirkung von Antioxidantien wie Harnsäure im Hämin-H2O2-Luminol- oder Tocopherol-System, Rutin und Quercetin im Cytochrom Mit–Cardiolipin–H 2 O 2 –Luminol, gekennzeichnet durch eine Änderung der maximalen Geschwindigkeit des CL-Anstiegs ( vmax). Wie die Ergebnisse der mathematischen Modellierung der Kinetik zeigen, liegen die Werte der Geschwindigkeitskonstanten der Wechselwirkung dieser Antioxidantien mit Radikalen nahe am Wert der Luminolkonstante, daher können solche Antioxidantien als mittelstarke Antioxidantien bezeichnet werden.

Wenn das untersuchte Material, insbesondere pflanzliche Rohstoffe, nur eine Art von Antioxidantien enthielt, dann könnte ihr Gehalt durch einen der drei oben aufgeführten Indikatoren charakterisiert werden ( τ , Q oder vmax). Doch pflanzliche Rohstoffe enthalten eine Mischung unterschiedlich starker Antioxidantien. Um dieses Problem zu lösen, verwendeten einige Autoren [ , , , ] die Änderung der Chemilumineszenz-Lichtsumme über eine bestimmte Zeit ∆S, berechnet nach der Formel , wobei ∆ S0 und ∆ S S- CL-Lichtsummen für eine bestimmte Zeit T in den Kontroll- bzw. Testproben. Die Zeit sollte für die Oxidation aller Antioxidantien im System ausreichend sein, d. h. damit die CL-Kurve der Testprobe das Niveau der CL-Kurve der Kontrollprobe erreicht. Letzteres legt nahe, dass Forscher nicht nur die Lumineszenzlichtsumme, sondern auch die CL-Kinetikkurve über einen ausreichend langen Zeitraum aufzeichnen sollten, was nicht immer der Fall ist.

Da alle gemessenen Indikatoren vom Gerät und den Messbedingungen abhängen, wird die antioxidative Wirkung einer Substanz im untersuchten System üblicherweise mit der Wirkung eines als Standard verwendeten Antioxidans, beispielsweise Trolox [ , ], verglichen.

Das Meerrettichperoxidase-Wasserstoffperoxid-System wurde von vielen Autoren zur Analyse der gesamten antioxidativen Kapazität von Pflanzenmaterialien verwendet. In Arbeiten [ , ] wurde die Latenzzeit von CL (TRAP-Methode) verwendet, um die Menge an Antioxidantien in Proben abzuschätzen, und in Arbeiten [ , , ] wurde die Fläche unter der CL-Entwicklungskurve verwendet. Die aufgeführten Arbeiten liefern jedoch keine klare Begründung für die Wahl des einen oder anderen Parameters zur Schätzung der TAU.

Ziel der Studie war es, herauszufinden, wie sich das Verhältnis von Antioxidantien verschiedener Arten auf den TAU auswirkt, und die Chemilumineszenzmethode so zu modifizieren, dass der TAU in Pflanzenmaterialien genauer bestimmt werden kann. Dazu haben wir uns mehrere Aufgaben gestellt. Zunächst soll die CL-Kinetik der untersuchten Objekte mit der Kinetik von Standard-Antioxidantien dreier Typen (stark, mittel und schwach) verglichen werden, um zu verstehen, welche Art von Antioxidantien den Hauptbeitrag zur TAE der untersuchten Objekte leisten. Zweitens, um die RAE der untersuchten Objekte zu berechnen, indem die Abnahme der CL-Lichtsumme unter der Wirkung dieser Objekte im Vergleich zur Wirkung des Antioxidans gemessen wird, das den größten Beitrag zum TAC liefert.

MATERIALEN UND METHODEN

Gegenstand der Studie waren industrielle Proben von Weißdorn, Eberesche und Wildrosenfrüchten, die von Krasnogorskleksredstva JSC (Russland) hergestellt wurden, sowie Himbeerfrüchte, die von den Autoren in der Region Moskau unter natürlichen Wachstumsbedingungen gesammelt und bei einer Temperatur von 60 °C getrocknet wurden –80 °C, bis keine Saft mehr mehr entsteht und es zu Druckverformungen kommt.

Die Reagenzien für die Analyse der antioxidativen Kapazität durch die Chemilumineszenzmethode waren: KH 2 PO 4 , 20 mM Pufferlösung (pH 7,4); Peroxidase aus Meerrettichwurzeln (Aktivität 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM wässrige Lösung; Luminol (5-Amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-phthalazindion, 3-Aminophthalsäurehydrazid, M=177,11), 1 mM wässrige Lösung; Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 , M = 34,01), 1 mM wässrige Lösung; Lösungen von Antioxidantien (Ascorbinsäure, Quercetin, Tocopherol). Alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (USA) hergestellt.

Abkochungen aus Weißdorn-, Ebereschen- und Wildrosenfrüchten sowie ein Aufguss aus Himbeerfrüchten wurden nach der Methodik des Staatlichen Arzneibuchs der UdSSR zubereitet, die im allgemeinen Arzneibuchartikel „Aufgüsse und Abkochungen“ dargelegt ist.

Die gesamte antioxidative Kapazität wurde durch Registrierung der Chemilumineszenz auf einem Lum-100-Chemiluminometer (DISoft, Russland) unter Verwendung der PowerGraph 3.3-Software bestimmt. Zur Bestimmung von TAU in pflanzlichen Rohstoffen werden 40 µl Luminol in einer Konzentration von 1 mM, 40 µl Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 0,1 µM, 10 bis 50 µl einer Abkochung oder Infusion (abhängig von der Konzentration) und Phosphatpuffer verwendet in der Menge, die erforderlich ist, um das Gesamtprobenvolumen auf 1 ml zu bringen. Die Küvette wurde in das Gerät eingesetzt und CL wurde unter Beobachtung des Hintergrundsignals aufgezeichnet. Nach 48 Sekunden Registrierung des Hintergrundsignals wurden 100 µl H2O2 in einer Konzentration von 1 mM in die Küvette gegeben und die CL-Registrierung wurde 10 Minuten lang fortgesetzt. Es wurden vier Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen der einzelnen Pflanzenobjekte hergestellt. CL wurde auch für Lösungen von Ascorbinsäure, Quercetin und Tocopherol in fünf verschiedenen Konzentrationen für jedes der Antioxidantien aufgezeichnet. Anschließend wurde der TAU der Proben von Abkochungen und Infusionen für Quercetin neu berechnet.

Die Konzentrationen von Luminol, Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid wurden so ausgewählt, dass die antioxidative Kapazität wässriger Extrakte aus Heilpflanzenmaterialien in angemessener Zeit (nicht mehr als 10 Minuten) bestimmt werden konnte. Während dieser Zeit erreichten die Chemilumineszenzkurven für die Antioxidantien Ascorbat und das Flavonoid Quercetin (die wichtigsten Antioxidantien pflanzlicher Materialien) ein Plateau, was auf die vollständige Zerstörung der Antioxidantien im System hinwies. Die Verdünnungen der untersuchten Proben und die Konzentrationen der Lösungen von Standard-Antioxidantien (in den Bildunterschriften angegeben) wurden so ausgewählt, dass alle kinetischen CL-Kurven mit der gleichen Geräteempfindlichkeit gemessen wurden.

Die antioxidative Kapazität wurde aus der Flächenänderung (∆) berechnet S) unter der kinetischen Kurve der Chemilumineszenz (Lichtsumme) bei Zugabe einer Substanz, die ein Antioxidans enthält. Dafür haben wir gezählt S0 für das System ohne Antioxidans und subtrahiert davon die Fläche S S Charakterisierung des Systems, dem das Antioxidans zugesetzt wurde. ∆-Wert S hängt von der Empfindlichkeit des Chemiluminometers und den Messbedingungen ab. Verhältnis ∆ S/C V(Wo C- Konzentration des untersuchten biologischen Materials in der Küvette, g/l, und V- Küvettenvolumen, l) drückt die antioxidative Kapazität von 1 g des untersuchten Materials, d. h. Pflanzenmaterialien, aus.

Die antioxidative Kapazität ∆ S A Eine Lösung eines Standard-Antioxidans wie Quercetin wird in das gleiche Volumen der Reaktionsmischung gegeben. Verhältnis ∆ S A /C A V(Wo C A- Gewichtskonzentration des Antioxidans in der Küvette, g/l) drückt die antioxidative Kapazität von 1 g des Antioxidans aus.

Für jedes der Standard-Antioxidantien wurde ein Signal aus Lösungen verschiedener Konzentrationen aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass die Berechnungen innerhalb der Grenzen einer linearen Beziehung durchgeführt werden und die erhaltenen Ergebnisse reproduzierbar sind. Tatsächlich wurde eine lineare Abhängigkeit erhalten (∆ S A = k A C A) Signal aus der Konzentration, aus der der stöchiometrische Koeffizient berechnet wurde k A. Nach dem Fisher-Kriterium werden die Werte für Standard-Antioxidantien ermittelt k A statistisch signifikant mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,975. Als nächstes wurde das Signal von vier Konzentrationen für jede der vier Pflanzenproben aufgezeichnet und für alle Proben eine lineare Abhängigkeit des Signals von der Konzentration (∆) ermittelt S = k C), der zur Berechnung des stöchiometrischen Koeffizienten verwendet wurde k. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,975 (Fischer-Test) sind die für Pflanzenproben erhaltenen k-Werte statistisch signifikant. Die gesamte antioxidative Kapazität des Pflanzenmaterials, ausgedrückt als Gewicht des Standardantioxidans (mg%), wurde mithilfe der Formel ermittelt.

Die Werte wurden als arithmetisches Mittel ± Standardabweichung (M ± δ) bei p dargestellt

ERGEBNISSE DER STUDIE

Untersuchung der Chemilumineszenzkinetik in Gegenwart von Natriumascorbat (Abb. 1. Einfluss von Natriumascorbat auf die Chemilumineszenzkinetik) data-note="Konzentrationen der Systemkomponenten: Luminol - 40 µM, Meerrettichperoxidase - 4 nM, Wasserstoffperoxid - 100 µM. Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 – 0,05 µM; 3 – 0,10 µM; 4 – 0,15 µM; 5 – 0,2 µM; 6 – 0,25 µM Natriumascorbat. Antioxidans ist durch eine Latenzzeit gekennzeichnet, in der CL fast vollständig unterdrückt wird. Seine Dauer ist proportional zur Menge des Antioxidans im System. Gleichzeitig ändert sich weder die Steigung der CL-Kurven noch die Intensität des CL auf dem Plateau. Dies liegt daran, dass Ascorbinsäure ein starkes Antioxidans ist, das alle Radikale abfängt im System gebildet, einschließlich Luminolradikalen, und CL entwickelt sich erst, wenn das gesamte Ascorbat oxidiert ist.

Auch andere Forscher haben gezeigt, dass die Ergebnisse der chemischen Analyse und der mit der Chemilumineszenzmethode ermittelte TAU-Wert oft nicht übereinstimmen. In der Arbeit korrelierte die im Peroxidase-Luminol-Wasserstoffperoxid-System ermittelte gesamte antioxidative Kapazität mit dem Gehalt an Triterpenverbindungen. In der Arbeit derselben Autoren, in der eine andere Pflanze untersucht wurde, wurde jedoch kein Zusammenhang zwischen TAU und dem Gehalt irgendeiner Stoffgruppe, einschließlich Flavonoiden, beobachtet.

Diese Diskrepanzen hängen mit mindestens drei Faktoren zusammen. Erstens ist die Aktivität von Antioxidantien wichtig, d. h. die Geschwindigkeit ihrer Wechselwirkung mit Radikalen, die für verschiedene Antioxidantien, aus denen die Pflanzenprobe besteht, unterschiedlich ist. Laut Izmailov liegen die Geschwindigkeitskonstanten der entsprechenden Reaktionen für Mexidol, Tocopherol und Quercetin im Verhältnis 0,04:2:60. Zweitens kann jedes Antioxidansmolekül, das eine chemische Reaktion eingeht, eine unterschiedliche Anzahl von Radikalen abfangen. Laut der Arbeit fingen Quercetin, Harnsäure und Ascorbinsäure 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 bzw. 0,5 ± 0,2 Radikale pro reagiertem Antioxidansmolekül ab (es wurde das Hämin-H 2 O 2-System verwendet – Luminol). Drittens könnten die Ergebnisse der Studie durch das Vorhandensein von Peroxidaseaktivität in den Pflanzenproben selbst, wie in der Arbeit, sowie durch das Vorhandensein von Kalzium in den Proben beeinflusst werden, das, wie in der Arbeit gezeigt, zunehmen kann die Aktivität der Meerrettichperoxidase unter bestimmten Bedingungen. Dies führt normalerweise zu einer höheren CL-Intensität auf dem Plateau als auf den Kontrollkurven, was wir jedoch nicht beobachtet haben.

Der erste Faktor schränkt die Verwendung eines solchen Parameters als Änderung der Lichtsumme stark ein, da die Zeit der Chemilumineszenzmessung länger sein sollte als die Zeit des Verbrauchs aller Antioxidantien in der Testprobe. Die Annäherung an diesen Moment kann nur durch Messung der Chemilumineszenzkinetik beurteilt werden. Darüber hinaus wird der Beitrag schwacher Antioxidantien zur OAE stark unterschätzt, da die Zeit ihrer vollständigen Oxidation um ein Vielfaches länger ist als die akzeptable Messzeit (10–20 Minuten).

Von noch größerer Bedeutung ist der stöchiometrische Koeffizient des Antioxidans. Anzahl der Radikale N, von ihm abgefangen, ist gleich , wo ρ - stöchiometrischer Koeffizient und ∆ M- Änderung der Konzentration des Antioxidans während der Messung, in unserem Fall - die Anfangskonzentration der Testsubstanz in der Testprobe.

Der Unterschied in der Lichtsumme des Glühens in Abwesenheit eines Antioxidans und in dessen Anwesenheit ist proportional zu N. Die Gesamtzahl der abgefangenen Radikale beträgt , wo ρ ich ist der stöchiometrische Koeffizient eines bestimmten Antioxidans und m i- seine Konzentration während der Messung. Die Gesamtzahl der abgefangenen Radikale ist offensichtlich nicht gleich der Gesamtmenge an Antioxidantien, da die Koeffizienten ρ ich sind nicht nur ungleich eins, sondern unterscheiden sich auch erheblich für verschiedene Antioxidantien.

Wert N ist proportional zur Differenz der über einen bestimmten Zeitraum gemessenen Lichtsummen zwischen einer Probe, die ein Antioxidans enthält, und einer Kontrollprobe, die keine Antioxidantien enthält: S = k n, Wo k- Koeffizient konstant unter den gleichen Messbedingungen.

Die im Artikel betrachtete Methode ermöglicht die Bestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität, während die chemische Analyse die Bestimmung des Gesamtgehalts an Antioxidantien im Produkt ermöglicht. Daher scheint die Chemilumineszenzmethode aussagekräftiger zu sein als chemische Analysen.

Die Bedingungen, die wir zur Beurteilung der gesamten antioxidativen Kapazität pflanzlicher Rohstoffe ausgewählt haben, haben wir durch die Aufzeichnung der Chemilumineszenzkinetik in einem System bestehend aus Meerrettichperoxidase, Wasserstoffperoxid und Luminol (Komponentenkonzentrationen – 4 nM, 100 μM bzw. 40 μM; 20 mM Phosphatpuffer) ausgewählt , pH 7,4), sorgte für die Oxidation starker Antioxidantien (Ascorbinsäure) und mäßiger Antioxidantien (Quercetin) in 10 Minuten. Diese Messdauer ist komfortabel und gewährleistet die erforderliche Messqualität.

Eine Analyse der Chemilumineszenzkinetik zeigte, dass in den untersuchten Objekten (Abkochungen von Eberesche, Wildrose, Weißdornfrüchten und Himbeerfruchtaufguss) die Hauptantioxidantien mittelstarke Antioxidantien, einschließlich Flavonoide, und schwach starke Antioxidantien (Tocopherol usw.) sind. ). Basierend auf der Abnahme der Chemilumineszenz-Lichtsumme wurde die gesamte antioxidative Kapazität für die untersuchten Objekte berechnet. Ein Vergleich der erhaltenen TAU-Werte mit den Ergebnissen chemischer Analysen zeigte, dass Produkte, die die gleiche Menge an Antioxidantien in unterschiedlichen Verhältnissen enthalten, sich in ihrer Fähigkeit unterscheiden können, den Körper wirksam vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale zu schützen. Die beschriebene Technik ist vielversprechend für die Untersuchung von Pflanzenobjekten, die eine Mischung verschiedener Antioxidantien enthalten. Gleichzeitig zeichnet es sich durch Einfachheit und geringen Forschungsaufwand aus. Die Kombination der Messung der Chemilumineszenzkinetik mit der mathematischen Modellierung von Reaktionen ermöglicht nicht nur die Automatisierung des Prozesses zur Bestimmung des TAU, sondern auch die Bestimmung des Beitrags einzelner Gruppen von Antioxidantien zum Indikator.

Stichworte

freie Radikale/Antioxidans/ antioxidative Aktivität / gesamte antioxidative Kapazität / Chemilumineszenz/ Luminol / freies Radikal / Antioxidans / antioxidative Aktivität / gesamte antioxidative Kapazität / Chemilumineszenz / Luminol

Anmerkung wissenschaftlicher Artikel in den chemischen Wissenschaften, Autor des wissenschaftlichen Artikels - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Heilpflanzenstoffe sind eine der Quellen für Antioxidantien für den menschlichen Körper. Unter den Methoden zur Bestimmung des Gehalts an Antioxidantien in Pflanzenobjekten ist die Methode der Chemilumineszenzanalyse weit verbreitet. In der vorliegenden Arbeit wurde es zur Schätzung verwendet gesamte antioxidative Kapazität(OAU) Abkochungen von Ebereschen-, Wildrosen- und Weißdornfrüchten und Aufguss von Himbeerfrüchten. Im Experiment wurde die Kinetik aufgezeichnet Chemilumineszenz in einem System bestehend aus Meerrettichperoxidase, Wasserstoffperoxid und Luminol. Die Konzentrationen und Volumina der Systemkomponenten in der Probe wurden so gewählt, dass starke Antioxidantien (Ascorbinsäure) und mittelstarke Antioxidantien (Quercetin) während der Messzeit (10 min) vollständig oxidiert wurden. Es wird eine Methode zur Berechnung der TAU basierend auf einer Änderung der Lichtsumme vorgeschlagen und begründet. Chemilumineszenz in Gegenwart von Pflanzenproben. Kinetische Analyse Chemilumineszenz zeigte, dass in den untersuchten Objekten Antioxidantien mittlerer Stärke, einschließlich Flavonoide, und schwache Antioxidantien (Tocopherol usw.) vorherrschen. Ein Vergleich der berechneten TAU-Werte für die untersuchten Objekte und die Daten ihrer chemischen Analyse zeigten, dass Produkte, die die gleiche Menge an Antioxidantien mit unterschiedlichen Verhältnissen nach Typen enthalten, sich in ihrer Fähigkeit, den Körper vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale zu schützen, unterscheiden können. Die beschriebene Technik ist vielversprechend für die Untersuchung von Pflanzenobjekten, die eine Mischung verschiedener Antioxidantien enthalten.

Chemilumineszenzbestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität in medizinischem Pflanzenmaterial

Heilpflanzenmaterial ist eine der Quellen für Antioxidantien für den menschlichen Körper. Die Chemilumineszenzanalyse ist eine der gängigen Methoden zur Bestimmung des Gehalts an Antioxidantien in Pflanzenmaterialien. In unserer Arbeit wurde die Chemilumineszenzanalyse verwendet, um die gesamte antioxidative Kapazität (TAC) von Fruchtsuds aus Eberesche, Rose und Weißdorn sowie von Himbeerfruchtaufguss zu bestimmen. Experimente ermittelten die Kinetik der Chemilumineszenz eines Systems bestehend aus Meerrettichperoxidase, Wasserstoffperoxid und Luminol. Konzentrationen und Volumina der Komponenten des Systems wurden so gewählt, dass starke Antioxidantien (Ascorbinsäure) und Antioxidantien mittlerer Stärke (Quercetin) während der Messung (10 Minuten) vollständig oxidiert wurden. Eine Methode zur TAC-Berechnung basierend auf Änderungen der Chemilumineszenz-Lichtsumme in Gegenwart von Pflanzenproben wurde vorgeschlagen und begründet. Die Analyse der Chemilumineszenzkinetik zeigte, dass in den untersuchten Objekten Antioxidantien mittlerer Stärke dominieren, darunter Flavonoide und schwache Antioxidantien (Tocopherol und andere). Ein Vergleich der berechneten TAC-Werte für die untersuchten Objekte und ihrer chemischen Analysedaten zeigte, dass Produkte, die die gleiche Menge an Antioxidantien mit unterschiedlichen Anteilen an Antioxidantien je nach Typ enthalten, in ihrer Fähigkeit, den Körper vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale zu schützen, variieren können . Die beschriebene Technik ist vielversprechend für die Untersuchung von Pflanzenobjekten, die eine Mischung verschiedener Arten von Antioxidantien enthalten.

Der Text der wissenschaftlichen Arbeit zum Thema „Chemilumineszenzmethode zur Bestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität in Heilpflanzenmaterialien“

Chemilumineszenzmethode zur Bestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität in medizinischen Pflanzenmaterialien

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Abteilung für medizinische Biophysik, Fakultät für Grundlagenmedizin, Lomonossow-Universität Moskau, Moskau

2 Abteilung für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazie,

I. M. Sechenov Erste Moskauer Staatliche Medizinische Universität, Moskau

Heilpflanzenstoffe sind eine der Quellen für Antioxidantien für den menschlichen Körper. Unter den Methoden zur Bestimmung des Gehalts an Antioxidantien in Pflanzenobjekten ist die Methode der Chemilumineszenzanalyse weit verbreitet. In der vorliegenden Arbeit wurde es verwendet, um die gesamte antioxidative Kapazität (TOA) von Abkochungen aus Ebereschen-, Wildrosen- und Weißdornfrüchten sowie Himbeerfruchtinfusionen zu bewerten. Im Experiment wurde die Kinetik der Chemilumineszenz in einem System bestehend aus Meerrettichperoxidase, Wasserstoffperoxid und Luminol aufgezeichnet. Die Konzentrationen und Volumina der Systemkomponenten in der Probe wurden so gewählt, dass starke Antioxidantien (Ascorbinsäure) und mittelstarke Antioxidantien (Quercetin) während der Messzeit (10 min) vollständig oxidiert wurden. Es wird eine Methode zur Berechnung des RAE vorgeschlagen und begründet, die auf der Änderung der Chemilumineszenz-Lichtsumme in Gegenwart von Pflanzenproben basiert. Eine Analyse der Chemilumineszenzkinetik ergab, dass in den untersuchten Objekten mäßig starke Antioxidantien, darunter Flavonoide, und schwache Antioxidantien (Tocopherol etc.) vorherrschen. Ein Vergleich der berechneten TAU-Werte für die untersuchten Objekte und die Daten ihrer chemischen Analyse zeigten, dass Produkte, die die gleiche Menge an Antioxidantien mit unterschiedlichen Verhältnissen nach Typen enthalten, sich in ihrer Fähigkeit, den Körper vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale zu schützen, unterscheiden können. Die beschriebene Technik ist vielversprechend für die Untersuchung von Pflanzenobjekten, die eine Mischung verschiedener Antioxidantien enthalten.

Schlüsselwörter: freie Radikale, Antioxidans, antioxidative Aktivität, gesamte antioxidative Kapazität, Chemilumineszenz, Luminol

Finanzierung: Diese Arbeit wurde von der Russian Science Foundation unterstützt, Fördernummer 14-15-00375.

Ex3 Korrespondenzadresse ist: Georgy Konstantinovich Vladimirov

119192, Moskau, Lomonosovsky pr-t, 31, Gebäude 5; [email protected]

Artikel erhalten: 10.03.2016 Artikel zur Veröffentlichung angenommen: 18.03.2016

Chemilumineszenzbestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität in medizinischem Pflanzenmaterial

1 Abteilung für medizinische Biophysik, Fakultät für Grundlagenmedizin, Lomonossow-Universität Moskau, Moskau, Russland

2 Abteilung für Pharmakognosie, Fakultät für Pharmazie,

Die Erste Staatliche Medizinische Sechenov-Universität Moskau, Moskau, Russland

Schlüsselwörter: freie Radikale, Antioxidans, antioxidative Aktivität, gesamte antioxidative Kapazität, Chemilumineszenz, Luminol

Finanzierung: Diese Arbeit wurde von der Russian Science Foundation unterstützt, Fördernr. 14-15-00375.

Danksagungen: Die Autoren danken Andrey Alekseev von der Lomonossow-Universität Moskau für seine Unterstützung bei der Durchführung des Experiments. Die Korrespondenz sollte an folgende Adresse gerichtet werden: George Vladimirov

Lomonosovskiy Prospekt, d. 31, k. 5, Moskau, Russland, 119192; ur [email protected] Eingegangen: 10.03.2016 Angenommen: 18.03.2016

Im Körper erzeugte freie Radikale stören die Struktur der Zellmembranen, was wiederum zur Entwicklung verschiedener pathologischer Zustände führt. Die zerstörerische oxidative Wirkung von Radikalen wird durch das antioxidative Abwehrsystem des Körpers verhindert, in dem niedermolekulare Verbindungen – Radikalfänger (Fallen) – eine wichtige Rolle spielen. Eine der Quellen für Antioxidantien sind Heilpflanzenrohstoffe sowie darauf basierende Präparate, deren Untersuchung des antioxidativen Potenzials dazu beiträgt, ihre präventive und therapeutische Wirkung zu steigern.

In den Arbeiten werden die wichtigsten Methoden zur Bestimmung von Antioxidantien betrachtet. Die Definition von Antioxidantien als chemische Verbindungen vermittelt jedoch kein vollständiges Bild der Schutzeigenschaften des untersuchten Objekts: Sie werden nicht nur durch die Menge des einen oder anderen Antioxidans bestimmt , sondern auch durch die Aktivität jedes einzelnen von ihnen. Antioxidative Aktivität oder antioxidative Aktivität, AOA, ist die Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion eines Antioxidans mit einem freien Radikal (kInH). Mit der Chemilumineszenz (CL)-Methode ist es möglich, die Gesamtmenge an Radikalen zu bestimmen, die Antioxidantien in der Probe binden (Gesamtantioxidationskapazität, TAU), und bei Verwendung der Methode der mathematischen Modellierung der CL-Kinetik auch die Geschwindigkeit ihrer Bildung und Reaktion Radikale mit Antioxidantien, also AOA.

In Gegenwart von molekularem Sauerstoff bildet der Alkylrest R^ einen Peroxylrest ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Aus LH entsteht durch die Bildung von Zwischenstoffen (Luminolhydroperoxid und Luminolendoperoxid) ein Molekül des Endprodukts der Luminoloxidation, Aminophthalsäure, in einem elektronisch angeregten Zustand, das ein Photon emittiert , und als Ergebnis wird Chemilumineszenz beobachtet. Die CL-Intensität ist proportional zur Photonenproduktionsrate, die wiederum proportional zur stationären LH-Konzentration im System ist. Durch die Wechselwirkung mit Radikalen unterbrechen Antioxidantien die beschriebene Umwandlungskette und verhindern die Bildung eines Photons.

Thermolysepflichtige Verbindungen sind nicht die einzige mögliche Radikalquelle bei der Analyse der antioxidativen Kapazität einer Probe mit der Chemilumineszenzmethode. Alternativen sind Systeme Meerrettichperoxidase-Wasserstoffperoxid, Hämin-Wasserstoffperoxid, Cytochrom-C-Cardiolipin-Wasserstoffperoxid usw. Das Reaktionsschema der Luminoloxidation durch Peroxidasen wird in der Arbeit von Cormier et al. betrachtet. .

Die CL-Intensität ist entweder konstant oder nimmt langsam ab. Der Artikel beschreibt zwei Ansätze zur Messung der gesamten antioxidativen Kapazität, die dieses Merkmal der Kurven berücksichtigen. Die TRAP-Methode (Total Reactive Antioxidant Potential) basiert auf der Messung der CL-Latenzzeit t und kann zur Bestimmung von Antioxidantien wie Trolox oder Ascorbinsäure verwendet werden: Sie zeichnen sich durch eine hohe Remit Radikalen aus und können daher werden als starke Antioxidantien bezeichnet. . Während der Latenzzeit erfolgt ihre vollständige Oxidation. Die TAR-Methode (Total Antioxidant Reactivity) misst den Grad der Chemilumineszenzlöschung q am Plateau oder am Maximum der Chemilumineszenzkurve:

Dabei ist I die Intensität der Chemilumineszenz ohne Antioxidans und 11 die Intensität von CL in Gegenwart eines Antioxidans. Diese Methode wird verwendet, wenn das System überwiegend schwache Antioxidantien mit niedrigen Geschwindigkeitskonstanten der Wechselwirkung mit Radikalen enthält – viel niedriger im Vergleich zur Luminolkonstante.

Die Wirkung von Antioxidantien wird nicht nur durch die Indikatoren t und c charakterisiert. Wie aus den Arbeiten hervorgeht, ist die Wirkung von Antioxidantien wie Harnsäure im Hämin-H202-Luminol-System oder Tocopherol, Rutin und Quercetin im Cytochrom-C-Cardiolipin-H202-Luminol-System durch eine Änderung der Maximalrate gekennzeichnet des CL-Anstiegs (utx). Wie die Ergebnisse der mathematischen Modellierung der Kinetik zeigen, liegen die Werte der Geschwindigkeitskonstanten der Wechselwirkung dieser Antioxidantien mit Radikalen nahe am Wert der Luminolkonstante, daher können solche Antioxidantien als mittelstarke Antioxidantien bezeichnet werden.

Wenn das untersuchte Material, insbesondere pflanzliche Rohstoffe, nur eine Art von Antioxidantien enthielt, könnte ihr Gehalt durch einen der drei oben aufgeführten Indikatoren (m, q oder V) charakterisiert werden. Doch pflanzliche Rohstoffe enthalten eine Mischung unterschiedlich starker Antioxidantien. Um dieses Problem zu lösen, verwendeten einige Autoren die Änderung der Chemilumineszenz-Lichtsumme über eine bestimmte DE-Zeit, berechnet durch die Formel

DE = DE0 - DE,

Wobei DE0 und DE5 CL-Lichtsummen für eine bestimmte Zeit sind? in den Kontroll- bzw. Testproben. Die Zeit sollte für die Oxidation aller Antioxidantien im System ausreichend sein, d. h. damit die CL-Kurve der Testprobe das Niveau der CL-Kurve der Kontrollprobe erreicht. Letzteres legt nahe, dass Forscher nicht nur die Lumineszenzlichtsumme, sondern auch die CL-Kinetikkurve über einen ausreichend langen Zeitraum aufzeichnen sollten, was nicht immer der Fall ist.

Da alle gemessenen Indikatoren vom Instrument und den Messbedingungen abhängen, wird die antioxidative Wirkung einer Substanz im untersuchten System üblicherweise mit der Wirkung eines als Standard verwendeten Antioxidans, beispielsweise Trolox, verglichen.

Das System Meerrettichperoxidase-Wasserstoffperoxid wurde von vielen Autoren zur Analyse der gesamten antioxidativen Kapazität von Pflanzenmaterialien verwendet. In den Arbeiten wurde zur Schätzung der Menge an Antioxidantien in den Proben die CL-Latenzzeit (TRAP-Methode) und in den Arbeiten die Fläche unter der CL-Entwicklungskurve verwendet. Diese Arbeiten liefern jedoch keine eindeutige Begründung dafür

die Wahl des einen oder anderen Parameters zur Schätzung der OAU.

Ziel der Studie war es, herauszufinden, wie sich das Verhältnis von Antioxidantien verschiedener Arten auf den TAU auswirkt, und die Chemilumineszenzmethode so zu modifizieren, dass der TAU in Pflanzenmaterialien genauer bestimmt werden kann. Dazu haben wir uns mehrere Aufgaben gestellt. Zunächst soll die CL-Kinetik der untersuchten Objekte mit der Kinetik von Standard-Antioxidantien dreier Typen (stark, mittel und schwach) verglichen werden, um zu verstehen, welche Art von Antioxidantien den Hauptbeitrag zur TAE der untersuchten Objekte leisten. Zweitens soll die TAE der untersuchten Objekte berechnet werden, indem die Abnahme der CL-Lichtsumme unter der Wirkung dieser Objekte im Vergleich zur Wirkung des Antioxidans gemessen wird, das den größten Beitrag zur TAE leistet.

MATERIALEN UND METHODEN

Gegenstand der Studie waren industrielle Proben von Weißdorn, Eberesche und Wildrosenfrüchten, die von Krasnogorskleksredstva JSC (Russland) hergestellt wurden, sowie Himbeerfrüchte, die von den Autoren in der Region Moskau unter natürlichen Wachstumsbedingungen gesammelt und bei einer Temperatur von 60 °C getrocknet wurden -80 °C, bis sie keine Saft- und Druckverformungen mehr absondern.

Die Reagenzien für die Analyse der antioxidativen Kapazität durch die Chemilumineszenzmethode waren: KH2PO4, 20 mM Pufferlösung (pH 7,4); Peroxidase aus Meerrettichwurzeln (Aktivität 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM wässrige Lösung; Luminol (5-Amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-phthalazindion, 3-Aminophthalsäurehydrazid, M=177,11), 1 mM wässrige Lösung; Wasserstoffperoxid (H2O2, M = 34,01), 1 mM wässrige Lösung; Lösungen von Antioxidantien (Ascorbinsäure, Quercetin, Tocopherol). Alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (USA) hergestellt.

Die gesamte antioxidative Kapazität wurde durch Registrierung der Chemilumineszenz auf einem Lum-100-Chemiluminometer (DISoft, Russland) unter Verwendung der PowerGraph 3.3-Software bestimmt. Zur Bestimmung von TAU in pflanzlichen Rohstoffen werden 40 µl Luminol in einer Konzentration von 1 mM, 40 µl Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 0,1 µM, 10 bis 50 µl einer Abkochung oder Infusion (abhängig von der Konzentration) und Phosphatpuffer verwendet in der Menge, die erforderlich ist, um das Gesamtprobenvolumen auf 1 ml zu bringen. Die Küvette wurde in das Gerät eingesetzt und CL wurde unter Beobachtung des Hintergrundsignals aufgezeichnet. Nach 48 Sekunden Registrierung des Hintergrundsignals wurden 100 μl H2O2 in einer Konzentration von 1 mM in die Küvette gegeben und die CL-Registrierung wurde 10 Minuten lang fortgesetzt. Es wurden vier Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen der einzelnen Pflanzenobjekte hergestellt. CL wurde auch für Lösungen von Ascorbinsäure, Quercetin und Tocopherol in fünf verschiedenen Konzentrationen für jedes der Antioxidantien aufgezeichnet. Anschließend wurde der TAU der Proben von Abkochungen und Infusionen für Quercetin neu berechnet.

erreichte ein Plateau, was auf die vollständige Zerstörung der Antioxidantien im System hinwies. Die Verdünnungen der untersuchten Proben und die Konzentrationen der Lösungen von Standard-Antioxidantien (in den Bildunterschriften angegeben) wurden so ausgewählt, dass alle kinetischen CL-Kurven mit der gleichen Geräteempfindlichkeit gemessen wurden.

Die antioxidative Kapazität wurde aus der Änderung der Fläche (AS) unter der kinetischen Chemilumineszenzkurve (Lichtsumme) bei Zugabe einer Substanz, die ein Antioxidans enthält, berechnet. Dazu haben wir S0 für das System ohne Antioxidans berechnet und davon die Fläche SS abgezogen, die das System charakterisiert, dem das Antioxidans zugesetzt wurde. Der AS-Wert hängt von der Empfindlichkeit des Chemiluminometers und den Messbedingungen ab. Das Verhältnis AS/C ■ V (wobei C die Konzentration des untersuchten biologischen Materials in der Küvette, g/l, und V das Volumen der Küvette, l) ist, drückt die antioxidative Kapazität von 1 g des untersuchten Materials aus, d. h. , Pflanzenmaterial.

Die antioxidative Kapazität ASa einer Lösung eines Standardantioxidans, beispielsweise Quercetin, im gleichen Volumen der Reaktionsmischung wurde auf ähnliche Weise berechnet. Das Verhältnis AS/CÄ ■ V (wobei CA die Gewichtskonzentration des Antioxidans in der Küvette ist, g/l) drückt die antioxidative Kapazität von 1 g des Antioxidans aus.

Für jedes der Standard-Antioxidantien wurde ein Signal aus Lösungen verschiedener Konzentrationen aufgezeichnet, um sicherzustellen, dass die Berechnungen innerhalb der Grenzen einer linearen Beziehung durchgeführt werden und die erhaltenen Ergebnisse reproduzierbar sind. Tatsächlich wurde eine lineare Abhängigkeit (ASa = kA ■ CA) des Signals von der Konzentration erhalten, aus der der stöchiometrische Koeffizient kA berechnet wurde. Nach dem Fisher-Kriterium sind die für Standard-Antioxidantien erhaltenen kA-Werte mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,975 statistisch signifikant. Als nächstes wurde das Signal von vier Konzentrationen für jede der vier Pflanzenproben aufgezeichnet und für alle Proben eine lineare Abhängigkeit des Signals von der Konzentration (AS = k ■ C) erhalten, aus der der stöchiometrische Koeffizient k berechnet wurde. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,975 (Fischer-Test) sind die für Pflanzenproben erhaltenen k-Werte statistisch signifikant. Die gesamte antioxidative Kapazität des Pflanzenmaterials, ausgedrückt als Gewicht des Standardantioxidans (mg%), wurde durch die Formel ermittelt

OAE = k ■ 105. k

Die Werte wurden als arithmetisches Mittel ± Standardabweichung (M ± 5) bei p dargestellt<0,05.

ERGEBNISSE DER STUDIE

Die Untersuchung der Chemilumineszenzkinetik in Gegenwart von Natriumascorbat (Abb. 1) zeigte, dass dieses Antioxidans durch eine Latenzzeit gekennzeichnet ist, in der CL fast vollständig unterdrückt wird. Seine Dauer ist proportional zur Menge an Antioxidantien im System. In diesem Fall ändert sich weder die Steigung der CL-Kurven noch die CL-Intensität auf dem Plateau. Dies erklärt sich aus der Tatsache, dass Ascorbinsäure ein starkes Antioxidans ist, das alle im System gebildeten Radikale, einschließlich Luminolradikale, abfängt und CL erst entsteht, wenn das gesamte Ascorbat oxidiert ist.

Die Wirkung von Tocopherol (Abb. 2) zeigte sich in einer Abnahme der CL-Intensität auf einem Plateau, was typisch für schwache Antioxidantien ist, obwohl Tocopherol als eines der stärksten gilt

starke Antioxidantien. Möglicherweise ist diese Diskrepanz auf die Tatsache zurückzuführen, dass sich in unserem Experiment freie Radikale in einer wässrigen Lösung befanden, während die Wirkung von Tocopherol normalerweise in unpolaren Medien untersucht wird. In der Arbeit, in der der Komplex von Cytochrom C mit Cardiolipin als Radikalquelle diente und die Reaktion mit Luminol innerhalb dieses Komplexes ablief, hatte Tocopherol die Eigenschaften eines Antioxidans mittlerer Stärke.

Nachdem wir die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Quercetin auf unser System untersucht haben (Abb. 3) und die kinetischen Kurven für Quercetin und Natriumascorbat und Tocopherol verglichen haben, können wir feststellen, dass sich die Hauptwirkung von Quercetin in einer Änderung der Steigung von Quercetin manifestiert Kurven, d. h. die Geschwindigkeit der CL-Entwicklung, die typisch für moderate Antioxidantien ist.

Die CL-Kurven für alle untersuchten Abkochungen (Abb. 4) ähneln den Kurven für Quercetin mit einer leichten Abnahme der CL-Intensität am Ende, d. h. beim Erreichen

Zeit, min

Reis. 1. Wirkung von Natriumascorbat auf die Chemilumineszenzkinetik

Die Konzentrationen der Systemkomponenten: Luminol – 40 μM, Meerrettichperoxidase – 4 nM, Wasserstoffperoxid – 100 μM. Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,05 μM; 3 - 0,10 μM; 4 - 0,15 μM; 5 - 0,2 μM; 6 - 0,25 μM Natriumascorbat.

Plateau. Wie in der Arbeit gezeigt, ist dieses Verhalten typisch für Antioxidantien mittlerer Stärke, zu denen in unserem Fall Polyphenole – Flavonoide und Tannine – gehören. Bei einem Aufguss von Himbeerfrüchten (Abb. 4, D) ist eine Abnahme der Chemilumineszenz auf Plateauebene erkennbar, was typisch für schwache Antioxidantien, in diesem Fall Tocopherol, ist. In Bezug auf Quercetin und Tocopherol enthält der Himbeerfruchtaufguss 4,7 ± 0,9 µmol/g Quercetin und 11,9 ± 0,8 µmol/g Tocopherol.

Beim Vergleich der Chemilumineszenzkurven, die für verschiedene Konzentrationen der vier untersuchten wässrigen Extrakte aus Pflanzenmaterialien erhalten wurden, zeigte sich, dass der Beitrag mittlerer und schwacher Antioxidantien zur gesamten antioxidativen Kapazität der Proben in der folgenden Reihenfolge abnahm: Himbeerfruchtaufguss (Abb. 4, D), Abkochung von Hagebuttenfrüchten (Abb. 4, C), Abkochung von Ebereschenfrüchten (Abb. 4, A), Abkochung von Weißdornfrüchten (Abb. 4, B). Die AS-Werte in Bezug auf die Konzentration C der untersuchten Substanz in der Küvette und die Werte der gesamten antioxidativen Kapazität in Bezug auf Quercetin sind in der Tabelle aufgeführt.

DIE DISKUSSION DER ERGEBNISSE

Die während der Experimente gewonnenen Daten und die auf ihrer Grundlage berechneten TAU-Werte der untersuchten Objekte wurden mit dem Gehalt der darin enthaltenen Hauptantioxidantien verglichen, der mit chemischen Analysemethoden ermittelt wurde. Obwohl zweifellos eine positive Korrelation zwischen der Gesamtmenge an Antioxidantien und TAU in verschiedenen Objekten besteht, gibt es dennoch deutliche Unterschiede zwischen diesen Indikatoren. Nimmt man beispielsweise die Summe des Gehalts an Flavonoiden, Tanninen und Ascorbinsäure, so liegt dieser für alle untersuchten Objekte mit Ausnahme der Abkochung von Weißdornfrüchten (Tabelle) über dem berechneten TAU.

46 Zeit, min

Ich" "h chi----.

Reis. 2. Wirkung von Tocopherol auf die Chemilumineszenzkinetik

Die Konzentrationen der Systemkomponenten: Luminol – 40 μM, Meerrettichperoxidase – 4 nM, Wasserstoffperoxid – 100 μM. Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,01 μM; 3 - 0,025 μM; 4 - 0,06 μM; 5 - 0,1 μM; 6 - 0,2 μM Tocopherol.

46 Zeit, min

Reis. Abb. 3. Wirkung von Quercetin auf die Chemilumineszenzkinetik. Konzentrationen der Systemkomponenten: Luminol – 40 μM, Meerrettichperoxidase – 4 nM, Wasserstoffperoxid – 100 μM. Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,02 μM; 3 - 0,03 μM; 4 - 0,04 μM; 5 - 0,05 μM; 6 - 0,06 μM Quercetin.

Zeit, min

46 Zeit, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Zeit, min

Reis. Abb. 4. Einfluss von Abkochungen aus Ebereschenfrüchten (A), Weißdorn (B), Wildrose (C) und Himbeerfruchtaufguss (D) auf die Chemilumineszenzkinetik. (A) Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l Abkochung von Ebereschenfrüchten. (B) Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l Abkochung von Weißdornfrüchten. (C) Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l Hagebuttensud. (D) Kurven: 1 – Kontrollprobe; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l Aufguss Himbeeren.

im System Peroxidase-Luminol-Wasserstoffperoxid korrelierte mit dem Gehalt an Triterpenverbindungen. In der Arbeit derselben Autoren, in der eine andere Pflanze untersucht wurde, wurde jedoch kein Zusammenhang zwischen TAU und dem Gehalt irgendeiner Stoffgruppe, einschließlich Flavonoiden, beobachtet.

Diese Diskrepanzen hängen mit mindestens drei Faktoren zusammen. Erstens ist die Aktivität von Antioxidantien wichtig, d. h. die Geschwindigkeit ihrer Wechselwirkung mit Radikalen, die für verschiedene Antioxidantien, aus denen die Pflanzenprobe besteht, unterschiedlich ist. Laut Izmailov liegen die Geschwindigkeitskonstanten der entsprechenden Reaktionen für Mexidol, Tocopherol und Quercetin im Verhältnis 0,04:2:60. Zweitens kann jedes Antioxidansmolekül, das eine chemische Reaktion eingeht, eine unterschiedliche Anzahl von Radikalen abfangen. Der Arbeit zufolge fingen Quercetin, Harnsäure und Ascorbinsäure 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 bzw. 0,5 ± 0,2 Radikale pro reagiertem Antioxidansmolekül ab (es wurde das Gemin-H202-Luminol-System verwendet). Drittens könnten die Ergebnisse der Studie durch das Vorhandensein von Peroxidaseaktivität in den Pflanzenproben selbst, wie in der Arbeit, sowie durch das Vorhandensein von Kalzium in den Proben beeinflusst werden, das, wie in der Arbeit gezeigt, zunehmen kann die Aktivität der Meerrettichperoxidase unter bestimmten Bedingungen. Dies führt in der Regel zu mehr

höhere CL-Intensität auf dem Plateau als auf den Kontrollkurven, was wir jedoch nicht beobachteten.

Von noch größerer Bedeutung ist der stöchiometrische Koeffizient des Antioxidans. Die Anzahl der von ihnen abgefangenen Radikale n ist gleich

Dabei ist p der stöchiometrische Koeffizient und Am die Änderung der Antioxidanskonzentration während der Messung, in unserem Fall die Anfangskonzentration der Testsubstanz in der Testprobe.

Der Unterschied in der Lichtsumme der Lumineszenz in Abwesenheit eines Antioxidans und in dessen Anwesenheit ist proportional zu n. Die Gesamtzahl der abgefangenen Radikale beträgt n = Y.p. M,

Dabei ist der stöchiometrische Koeffizient eines bestimmten Antioxidans und m seine Konzentration während der Änderung

Untersuchungsobjekt Flavonoide, mg%* Tannine, mg%* Ascorbinsäure, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. Einheiten OAU, mg% Quercetin

Abkochung von Ebereschenfrüchten 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Abkochung von Hagebutten 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Abkochung von Weißdornfrüchten 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Aufguss von getrockneten Himbeeren 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Hinweis: * - literarische Daten, . AS – Änderung der Lichtsumme für die Probe, rel. Einheiten, C – Konzentration der Probe in der Küvette, g/l. Die berechneten Werte sind bei p zuverlässig<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhenium. Die Gesamtzahl der abgefangenen Radikale ist offensichtlich nicht gleich der Gesamtmenge an Antioxidantien, da die Koeffizienten pt nicht nur ungleich eins sind, sondern sich auch für verschiedene Antioxidantien erheblich unterscheiden.

Der Wert von n ist proportional zur Differenz der über einen bestimmten Zeitraum gemessenen Lichtsummen zwischen einer Probe, die ein Antioxidans enthält, und einer Kontrollprobe, die keine Antioxidantien enthält:

wobei k ein Koeffizient ist, der unter den gleichen Messbedingungen konstant ist.

Die Bedingungen, die wir zur Beurteilung der gesamten antioxidativen Kapazität pflanzlicher Rohstoffe ausgewählt haben, indem wir die Kinetik der Chemilumineszenz in einem System bestehend aus Meerrettichperoxidase, Wasserstoffperoxid und Luminol aufzeichnen (Komponentenkonzentrationen betragen 4 nM, 100 μM bzw. 40 μM); 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4),

sorgte für die Oxidation starker Antioxidantien (Ascorbinsäure) und mittelstarker Antioxidantien (Quercetin) in 10 Minuten. Diese Messdauer ist komfortabel und gewährleistet die erforderliche Messqualität.

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1 Bolshakova L.S. 1Milentiev V.N. 2Sannikow D. P. 3Kazmin V.M. 2

1 Staatliches Institut für Wirtschaft und Handel Orjol

2 Landeshaushaltsanstalt „Zentrum für Chemikalisierung und landwirtschaftliche Radiologie „Orlovsky““

3 Haushaltsstaatliche Bildungseinrichtung für höhere Berufsbildung „Staatliche Universität – Bildungs-, Wissenschafts- und Industriekomplex“

Es wurde die Möglichkeit untersucht, Chemilumineszenz zur Beurteilung der antioxidativen Aktivität von Lebensmittelsubstanzen zu nutzen. Die vorgeschlagene Methode basiert auf der Chemilumineszenz von Luminol in einem alkalischen Medium, deren Intensität von der Menge an Peroxiden in der Chemilumineszenzprobe abhängt. Die Chemilumineszenz wurde mit einem entwickelten Aufbau aufgezeichnet, der eine Dosierpumpe, eine lichtdichte Kammer, eine Vakuum-Photovervielfacherröhre aus Glas und ein Computersystem enthielt. Um die Chemilumineszenz zu verstärken, wurde Luminol eine Lösung aus Kaliumferricyanid zugesetzt. Änderungen der Intensität der Chemilumineszenz wurden zum Zeitpunkt der Einführung der analysierten Probe in die Luminollösung aufgezeichnet. Als analysierte Probe wurde Löwenzahnextrakt verwendet, der durch Trockendestillation bei niedriger Temperatur gewonnen wurde. Es enthält phenolische Verbindungen, die für ihre hohe antioxidative Wirkung bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass mit der Chemilumineszenzmethode die antioxidativen Eigenschaften verschiedener Lebensmittelverbindungen bestimmt werden können.

Bibliografischer Link

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. VERWENDUNG DER CHEMILUMINESZENZ ZUR BEWERTUNG DER ANTIOXIDANTEN EIGENSCHAFTEN VON NÄHRSTOFFEN // Rationelle Ernährung, Lebensmittelzusatzstoffe und Biostimulanzien. - 2014. - Nr. 6. - S. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (Zugriffsdatum: 17.12.2019). Wir machen Sie auf die vom Verlag „Academy of Natural History“ herausgegebenen Zeitschriften aufmerksam.

Diplomarbeit

1.4 Forschungsmethoden für Antioxidantien

Die antioxidative Aktivität wird klassifiziert: nach den Methoden zur Registrierung der manifestierten AOA (volumetrisch, photometrisch, chemilumineszierend, fluoreszierend, elektrochemisch); nach Art der Oxidationsquelle; nach Art der oxidierten Verbindung; entsprechend der Methode zur Messung der oxidierten Verbindung.

Die bekanntesten Methoden zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität sind jedoch:

1 TEAC (Trolox-äquivalente Antioxidanskapazität): Die Methode basiert auf der folgenden Reaktion:

Metmyoglobin + H 2 O 2 > Ferrylglobin + ABTS > ABTS * + AO.

Die Trolox-Äquivalenzmethode (TEAC) basiert auf der Fähigkeit von Antioxidantien, 2,2-Azinobis-Radikalkationen (ABTS) zu reduzieren und dadurch die Absorption im langwelligen Teil des Spektrums (600 nm) zu hemmen. Ein wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist die zweistufige Reaktion zur Gewinnung eines Radikals. Dies verlängert die Analysezeit und kann zu einer größeren Streuung der Ergebnisse führen, obwohl für die Analyse ein standardisierter Reagenziensatz verwendet wird.

2 FRAP (eisenreduzierende antioxidative Kraft): Die Methode basiert auf der folgenden Reaktion:

Fe(III)-Tripyridyltriazin+AO>Fe(II)-Tripyridyltriazin.

Eisenreduzierende/antioxidative Kapazität (FRAP). Hierbei wird die Reduktionsreaktion von Fe(III)-Tripyridyltriazin zu Fe(II)-Tripyridyltriazin genutzt. Allerdings können mit dieser Methode einige Antioxidantien, wie zum Beispiel Glutathion, nicht bestimmt werden. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung niedermolekularer Antioxidantien. Bei niedrigem pH-Wert geht die Reduktion des Fe(III)-Tripyridyltriazin-Komplexes zum Fe(II)-Komplex mit dem Auftreten einer intensiven blauen Farbe einher. Die Messungen basieren auf der Fähigkeit von Antioxidantien, die oxidative Wirkung der im Reaktionsgemisch erzeugten Reaktionspartikel zu unterdrücken. Diese Methode ist einfach, schnell und kostengünstig in der Ausführung.

3 ORAC (Sauerstoffradikalabsorptionskapazität): Die Methode basiert auf der folgenden Reaktion:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO > OH * + Luminol.

Bestimmung der Fähigkeit zur Aufnahme von Sauerstoffradikalen (ORAC). Bei dieser Methode wird die Fluoreszenz des Substrats (Phycoerythrin oder Fluorescein) aufgezeichnet, die durch seine Wechselwirkung mit ROS entsteht. Wenn in der Testprobe Antioxidantien enthalten sind, ist im Vergleich zur Kontrollprobe eine Abnahme der Fluoreszenz zu beobachten. Diese Methode wurde ursprünglich 1992 von Dr. Guohua Cao am National Institute of Aging entwickelt. 1996 schloss sich Dr. Cao mit Dr. Ronald Pryer einer gemeinsamen Gruppe am USDA Research Center for Aging an, wo eine halbautomatische Methode entwickelt wurde entwickelt.

4 TRAP (Total Radical Trapping Antioxidans Parameter): Die Methode basiert auf der folgenden Reaktion:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Diese Methode nutzt die Fähigkeit von Antioxidantien, mit dem Peroxylradikal 2,2-Azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid (AAPH) zu interagieren. TRAP-Modifikationen bestehen in Methoden zur Registrierung eines analytischen Signals. Am häufigsten interagiert das AAPH-Peroxyradikal im Endstadium der Analyse mit einem lumineszierenden (Luminol), fluoreszierenden (Dichlorfluorescindiacetat, DCFH-DA) oder einem anderen optisch aktiven Substrat.

Als Standard für die TEAC-, ORAC- und TRAP-Methoden wird das wasserlösliche Vitamin-E-Derivat Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxysäure) verwendet.

In jüngster Zeit hat das Interesse an der Verwendung elektrochemischer Methoden zur Bewertung der antioxidativen Aktivität zugenommen. Diese Methoden sind hochempfindliche und schnelle Analysen.

Die Bewertung der antioxidativen Aktivität einiger Lebensmittel erfolgt mit der Potentiometrie-Methode, die auf der Nutzung der Eigenschaft antioxidativer Substanzen basiert, an Redoxreaktionen aufgrund von Enol- (-OH) und Sulfhydryl- (-SH) Gruppen teilzunehmen.

Die Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften von Lösungen basiert auf der chemischen Wechselwirkung von Antioxidantien mit dem Mediatorsystem, die zu einer Veränderung ihres Redoxpotentials führt. Die elektrochemische Zelle ist ein Behälter, der vor der Messung des Redoxpotentials eine K-Na-Phosphat-Pufferlösung, ein Fe(III)/Fe(II)-Mediatorsystem und eine komplexe Elektrode enthält. Die antioxidative Aktivität wird in g-eq/l geschätzt.

Die amperometrische Methode zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität basiert auf der Messung des elektrischen Stroms, der bei der Oxidation der Testsubstanz auf der Oberfläche der Arbeitselektrode entsteht, die unter einem bestimmten Potential steht. Die Empfindlichkeit der amperometrischen Methode wird sowohl durch die Art der Arbeitselektrode als auch durch das an sie angelegte Potential bestimmt. Die Nachweisgrenze des amperometrischen Detektors für Polyphenole und Flavonoide liegt im Nano-Pikogramm-Bereich. Bei solch niedrigen Konzentrationen besteht eine geringere Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen Beeinflussung verschiedener Antioxidantien in ihrem gemeinsamen Vorhandensein, insbesondere der Manifestation des Phänomens des Synergismus . Zu den Nachteilen der Methode gehört ihre Spezifität: Unter diesen Bedingungen können Antioxidantien, die ihrerseits im Bereich der Sauerstoff-Elektroreduktionspotentiale oxidiert oder reduziert werden, nicht analysiert werden. Zu den Vorteilen der Methode gehören ihre Schnelligkeit, Prostata und Empfindlichkeit.

Galvanostatische Coulometrie-Methode unter Verwendung elektrogenerierter Oxidationsmittel – die Methode ist auf die Analyse fettlöslicher Antioxidantien anwendbar.

Zur Bestimmung von Ascorbinsäure wurden verschiedene Methoden entwickelt:

ein amperometrisches Verfahren unter Verwendung einer Aluminiumelektrode, die durch ein einfaches Lösungseintauchverfahren mit einem Film aus Nickel(II)-hexacyanoferrat modifiziert wurde;

ein Verfahren zur spektrophotometrischen und visuellen Testbestimmung von Ascorbinsäure in fester Phase unter Verwendung von Kieselsäure-Xerogel, modifiziert mit Wawel-Reagenz und Kupfer (II) als Indikatorpulver;

Die chemilumineszente Bestimmung von Ascorbinsäure kann nach der Fließinjektionsmethode gemäß der chemilumineszierenden Reaktion von Rhodamin B mit Cer (IV) in einem Schwefelsäuremedium durchgeführt werden.

Bestimmung von Ascorbinsäure im Bereich von 10 -8 -10 -3 g/cm 3 durch anodische Voltammetrie in wässrigen und wässrig-organischen Medien.

Am gebräuchlichsten ist die FRAP-Methode, da es sich um eine Express-Methode handelt, die sehr empfindlich ist. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität nach der FRAP-Methode entwickelt (Tabelle 1).

Tabelle 1 Entwicklung der FRAP-Methode und ihre Anwendung zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität verschiedener Objekte

	Analyseobjekte	Anmerkungen
	Blutplasma	t=4min. Die Reaktionsstöchiometrie und Additivität wurden untersucht.
	Tee, Wein	Bestimmung der AOA aufgrund von Polyphenolen
		AOA-Werte verschiedener Teesorten werden verglichen
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Modelllösungen	t=30min. Der Einfluss nichtwässriger Lösungsmittel wurde aufgedeckt
	Pflanzen
	Blut, Gewebe	PIA-Methode. Der Einfluss von Fremdstoffen wurde überprüft.
Firuzi, Lacanna, Petrucci u.a.	Modelllösungen	Die Sensitivität der Bestimmung verschiedener AOs als Funktion ihrer Struktur und ihres Redoxpotentials wurde untersucht.
Katalinic, Milos,	Verschiedene Weine
Temerdaschew, Tsyupko und andere.	Modellmischungen
Loginova, Konovalova	Medikamente. Vorbereitungen	Testmethode
Temerdaschew, Tsyupko und andere.	Trockene Rotweine	Korrelation der AOA mit anderen Indikatoren der Weinqualität
Tabelle 1 Fortsetzung
	Modellmischungen	Die Empfindlichkeit der Bestimmung verschiedener AO
Werschinin, Vlasova, Tsyupko	Modellmischungen	Es wurde die Nichtadditivität des Signals bei Fehlen eines Oxidationsmittels aufgedeckt
Anisimovich, Deineka und andere.	Modelllösungen	Es werden kinetische Parameter für die AOA-Schätzung vorgeschlagen.

Anmerkungen: konventionell gekennzeichnet: FIA-Flow-Injection-Analyse, TPTZ-Tripyridyltriazin, DIP-2,2, -Dipyridyl, PHEN-o-Phenanthrolin, DPA-Pyridindicarbonsäure, FZ-Ferrozin, AA-Ascorbinsäure, CT-Catechol, t - Belichtungszeit, min.

Wechselwirkung zwischen Proteinen und Polyelektrolyten in wässrigen Lösungen

Zur Charakterisierung von Protein-Polyelektrolyt-Komplexen werden verschiedene Analysemethoden eingesetzt. Instrumentelle Methoden liefern Informationen über strukturelle und optische Eigenschaften und bestimmen die Dynamik und Art der PEC-Bindung...

Einfluss von d-Metallverbindungen auf die Dissoziationsgeschwindigkeit eines Wassermoleküls in einer bipolaren Membran

Bei der Synthese neuer BPMs sollte der Untersuchung der Eigenschaften der erhaltenen Proben große Aufmerksamkeit gewidmet werden, um anschließend Synthesebedingungen auszuwählen, die eine Verbesserung der elektrochemischen Eigenschaften der synthetisierten Membranen gewährleisten...

Designerdrogen und synthetische Cannabinoide

Der Nachweis synthetischer Cannabinoide in Pflanzenmischungen kann durch verschiedene physikalisch-chemische Methoden erfolgen, wie zum Beispiel Chromatographie-Massenspektrometrie, Gas-, Dünnschicht- und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ...

Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von Flavonoiden in Heilpflanzenmaterialien

Synthese und pharmakologische Eigenschaften von Chinolinonen-2

Studienobjekt: Chinolinon-2. Forschungsmethode: Mit dem Computerprogramm „Marvin JS“ wurde die Struktur der Substanz erstellt. Als nächstes wurde sie zur weiteren Untersuchung auf die Website „http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php“ geschickt …

Thermospektrale Methode zur Untersuchung der Verdampfungsprodukte eines Epoxidpolymers

Technologie zur Gewinnung von hochreinem Chitosan aus Krustentierschalen

Bestimmung des Molekulargewichts von Chitosan Das Molekulargewicht von Chitosan wurde viskometrisch nach der Standardmethode bestimmt. Lösungen mit einer Konzentration von 0,05 und 0,5 g/dl wurden durch Auflösen einer abgewogenen Portion des Polymerpulvers in einem Acetatpuffer (0...) hergestellt.

Physische und geografische Merkmale des Territoriums des Naturparks

1 Milentiev V.N. 2Sannikow D. P. 3Kazmin V.M. 2

1 Staatliches Institut für Wirtschaft und Handel Orjol

2 Landeshaushaltsanstalt „Zentrum für Chemikalisierung und landwirtschaftliche Radiologie „Orlovsky““

3 Haushaltsstaatliche Bildungseinrichtung für höhere Berufsbildung „Staatliche Universität – Bildungs-, Wissenschafts- und Industriekomplex“

Chemilumineszenz

antioxidative Aktivität

Peroxide

Nährstoffe

1. Wassiljew R.F. Chemisches Leuchten // Chemie und Chemiker, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (Zugriffsdatum: 22.08.13).

2. Vladimirov Yu.A. Freie Radikale und Antioxidantien // Vestn. RAMN. - 1998. - Nr. 7. - S. 43–51.

3. Kondrashova E.A. Chemilumineszenz als empfindlichste Methode des Enzymimmunoassays und ihre Anwendung. Klinische Labordiagnostik. - 1999. - Nr. 9. - S. 32.

4. Lyubimov, G. Yu. Chemilumineszenzanalyse // Immunologie. - 1991. - Nr. 1. - S. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktive Chemilumineszenz im Phagozytosesystem // Mikrobiologie. - 1987. - Nr. 1. - S. 109–115.

6. Sherstnev M.P. Kalziumabhängige und kalziumunabhängige Wege der Zellchemilumineszenzerzeugung. Chemilumineszenzprobleme. - 1991. - Nr. 2. - S. 1–4.

Heute ist die Chemilumineszenz ein großes Wissenschaftsgebiet an der Schnittstelle zwischen Chemie, Physik und Biologie. Bei der Chemilumineszenz erfolgt eine direkte Umwandlung chemischer Energie in die Energie elektromagnetischer Schwingungen, d.h. in die Welt. Mithilfe der Chemilumineszenz kann man lernen, wie die Reaktion abläuft, welchen Mechanismus sie hat und was für die effiziente und rationelle Durchführung technologischer Prozesse notwendig ist. Wenn der technologische Prozess zur Gewinnung eines chemischen Produkts von Chemilumineszenz begleitet wird, kann deren Intensität als Maß für die Geschwindigkeit des Prozesses dienen: Je schneller die Reaktion, desto heller das Leuchten. Bei der Chemilumineszenzreaktion entstehen energiereiche Produkte, die dann durch Emission von Licht Energie abgeben, d. h. chemische Energie wird in elektromagnetische Strahlungsenergie umgewandelt.

Ziel der Studie war es, die Möglichkeit zu untersuchen, Chemilumineszenz zur Beurteilung der antioxidativen Aktivität von Lebensmittelsubstanzen zu nutzen.

Forschungsergebnisse und Diskussion

Das Problem der Beurteilung der antioxidativen Aktivität von Lebensmittelsubstanzen ist sehr relevant. Die Verwendung des Begriffs „antioxidative Aktivität“, um die Nützlichkeit eines bestimmten Produkts zu zeigen, erfolgt oft ohne chemische und biochemische Argumente. In der Regel bezieht sich die antioxidative Aktivität einer Substanz auf die Wirksamkeit der Reduzierung des Peroxidwerts. Auch das eigentliche Konzept des Peroxidwerts offenbart sein chemisches Wesen nicht vollständig, da es nicht vollständig der Kinetik und Thermodynamik der Stoffwechselstadien eines bestimmten Lebensmittelprodukts entspricht. Darüber hinaus wird dieser Wert zur Charakterisierung von Lipiden in Form von Fetten verwendet. Oxidationsprozesse und die Bildung von Peroxiden im Körper treten jedoch nicht nur bei der Verwendung von Fetten auf, sondern auch bei anderen Produkten. Mit anderen Worten kann man sagen, dass der Peroxidgehalt in einem bestimmten Produkt auf einer Art Waage „abgewogen“ wird, wobei das „Referenzgewicht“ eine Konzentrationseinheit des durch Peroxide oxidierten Jodidions in einer sauren Umgebung ist Dabei entsteht molekulares Jod:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Wenn molekulares Jod mit einer Lösung, die Natriumthiosulfat enthält, titriert wird, wird seine Konzentration bestimmt und folglich die Menge an Oxidationsmitteln von Jodidionen bestimmt, d. h. Peroxidverbindungen, die eigentlich Peroxidzahl genannt werden. Die Bestimmung des Peroxidwertes mit dieser Art der „Wiegung“ basiert auf der in Abb. dargestellten Reaktion. 1.

Reis. 1. Bestimmung des Peroxidwerts mit Natriumthiosulfat

Somit wird die Konzentration der Peroxide aus der Gleichung bestimmt

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

wobei ϒ der Korrelationskoeffizient zwischen der Konzentration an molekularem Jod und der Konzentration an Peroxiden ist.

Die vorgeschlagene Methode zur Bestimmung von Peroxiden in Produkten basiert auf der Chemilumineszenz von Luminol (C[lm]) in einem alkalischen Medium, deren Intensität (Ichl) von der Konzentration der Peroxide (C[-O-O-]) in a abhängt Chemilumineszenzprobe:

IHL. = Ϧchl ω, (4)

wobei Ϧchl die Quantenausbeute der Chemilumineszenz ist; ω – Reaktionsgeschwindigkeit mit Peroxiden:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

wobei kchl die Reist oder bei:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

Die Menge an Peroxiden (-O-O-) wird durch die Lichtsumme (S) bestimmt:

Der Wert von S hängt vom Grad der Vollständigkeit des Peroxidverbrauchs bei der Chemilumineszenzreaktion ab.

Zur Bestimmung der Konstante K wird eine Kalibrierkurve für die Abhängigkeit der Lichtsumme S von der Peroxidkonzentration erstellt, die durch Titration bestimmt wird:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Als Peroxide wird Wasserstoffperoxid H2O2 verwendet.

Anschließend werden die aus Gleichung (3) und (9) erhaltenen Daten verglichen. Basierend auf dem Vergleich von ϒ und K wird eine Schlussfolgerung über die Koordination der Reaktionsmechanismen gezogen, die der Bestimmung von Peroxiden mit diesen Methoden zugrunde liegen. Es wurde festgestellt, dass in diesem Bereich der Peroxidkonzentrationen ϒ und K tatsächlich miteinander übereinstimmen und daher zur Bestimmung des Peroxidwerts herangezogen werden können.

Chemilumineszenz wurde in einem alkalischen Medium beobachtet, das Luminol (5-Amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-phthalazindion, 3-Aminophthalsäurehydrazid, H2L) enthielt. Die Aufzeichnung erfolgte mit einem Chemilumineszenz-Aufbau, einschließlich eines Glas-Vakuum-Photomultipliers. Der Photomultiplier wird von einem Hochspannungsgleichrichter (7) mit Strom versorgt, der an einen Block (9) gekoppelt ist, der das Photomultipliersignal verstärkt, das auf dem Computermonitor (5) aufgezeichnet wird.

Reis. 2. Registrierung der Chemilumineszenz des analysierten Produkts: 1 - Dosierpumpe; 2 - lichtdichte Kammer; 3 - Spiegel; 4 - Küvette; 5 - Computersystem; 6 - Photomultiplier; 7 - Hochspannungsgleichrichter; 8 - ein Gerät, mit dem Sie den Spektralbereich der Chemilumineszenzstrahlung bestimmen können; 9 - Block zur Verstärkung des Photomultipliersignals

Eine Dosierpumpe (1) ist erforderlich, um die analysierte Probe in eine Küvette (4) einzuführen, die eine Chemilumineszenzlösung von Luminol enthält. Dieser Spender fungiert als Rührer für die injizierte Probe mit einer Chemilumineszenzlösung. Um die Reaktionsgeschwindigkeit und Intensität der Chemilumineszenz zu erhöhen, wurde Luminol eine Lösung aus Kaliumferricyanid zugesetzt. Das Mischen erfolgt durch Luftblasen, die durch das Pumpen von Luft durch die Lösungsflüssigkeit mit einer Pumpe entstehen. Der in der lichtdichten Kammer (2) befindliche Spiegel (3) dient zur besseren Lichtsammlung der auf die in der lichtdichten Kammer montierten Photokathode des Photomultipliers (6) einfallenden Chemilumineszenzstrahlung. Der Dispenser ermöglicht es Ihnen, während der Experimente die gewünschten Bestandteile der Flüssigkeit in die Küvette einzugeben, ohne die lichtdichte Kammer (2) öffnen zu müssen. In diesem Fall gelangen diese Flüssigkeiten durch Glas- oder Kunststoffröhrchen in die Küvette (4). Mit dem Computersystem können Sie die Abhängigkeit der Lumineszenzintensität I von der Zeit t, also die Chemilumineszenzkinetik, registrieren:

Das Computersystem spiegelt die Anstiegs- und Abfallkonstanten in der Funktion I = f(t) wider, die mit den Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen, die Chemilumineszenz verursachen, also mit ihrer Kinetik, konjugiert sind. In der Chemilumineszenzkammer ist eine Vorrichtung (8) enthalten, die es ermöglicht, den Spektralbereich der Chemilumineszenzstrahlung, also die Abhängigkeit:

I = f1(λ). (elf)

Bei diesem Block handelt es sich um eine Kassette in Form einer Scheibe, in der Grenzfilter montiert sind. Der Wechsel der Lichtfilter erfolgt durch Drehen der Plattenkassette um die horizontale Achse, die die Mittelpunkte der Ebene der Lichtfilter und der Ebene der Photokathode des Photomultipliers verbindet.

Der Messvorgang läuft wie folgt ab:

1. Die Reaktion des Photomultipliers auf Änderungen seiner Versorgungsspannung und auf Änderungen der Intensität der Referenzlichtquelle, die auf seine Kathode fällt, wird eingestellt.

2. Die Küvette wird mit einer Lösung von Luminol in einem alkalischen Medium gefüllt.

3. Der Dispenser wird mit der analysierten Probe gefüllt.

4. Die Abhängigkeit der Intensität der Chemilumineszenz von der Zeit t wird aufgezeichnet. Die Chemilumineszenz wird bis zum Zeitpunkt t1 überwacht, zu dem die Änderung von I1 ab dem Zeitpunkt t minimal ist: I1 = f1(t).

5. Ein Teil der analysierten Lösung wird über einen Spender zugeführt.

6. Es wird eine Chemilumineszenz der analysierten Probe beobachtet, deren Kinetik I = f(t) ist.

Auf Abb. Abbildung 3 zeigt einen Graphen der Abhängigkeit von Funktionen (I1 = f1(t)), konjugiert mit einem Graphen (I = f(t)), nach Einführung der analysierten Lösung.

Wie aus Abb. ersichtlich ist. 3, die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz ändert sich: Auf einen starken Anstieg folgt nach Zugabe der analysierten Probe ein starker Abfall der Lumineszenz.

Da die Verstärkung der Chemilumineszenz während der Oxidation von Luminol mit der Bildung von Peroxiden verbunden ist, deutet die Abnahme der Intensität der Chemilumineszenz nach Einführung der analysierten Probe auf eine Abnahme ihrer Anzahl hin. Daher können wir über das Vorhandensein einer antioxidativen Aktivität in den Verbindungen sprechen, aus denen die analysierte Probe besteht.

Es ist zu beachten, dass als analysierte Probe der durch Trockendestillation bei niedriger Temperatur gewonnene Löwenzahnextrakt verwendet wurde, der phenolische Verbindungen enthält, die für ihre hohe antioxidative Aktivität bekannt sind.

Reis. Abb. 3. Abhängigkeitsgraph der Funktionen (I1 = f1(t)), konjugiert mit dem Graphen (I = f(t)), nach Einführung der analysierten Lösung

Darüber hinaus wurde während des Experiments festgestellt, dass es mithilfe der Chemilumineszenz möglich ist, die Menge an Peroxiden in superverdünnten Systemen zu bestimmen, was wichtig ist, um den Beginn der Oxidation von Produkten beispielsweise während ihrer Lagerung zu beurteilen.

So haben die durchgeführten Studien gezeigt, dass die Methode zur Bestimmung von Peroxiden in Produkten, die auf der Chemilumineszenz von Luminol in alkalischem Medium basiert, eine Bewertung der antioxidativen Aktivität von Lebensmittelsubstanzen ermöglicht und zur Feststellung der antioxidativen Eigenschaften verschiedener Lebensmittel verwendet werden kann Verbindungen.

Rezensenten:

Litvinova E.V., Doktor der technischen Wissenschaften, Professorin der Abteilung für Technologie, Organisation und Lebensmittelhygiene, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., Doktor der Biowissenschaften, Direktorin von INITs, FSBEI HPE „Oryol State Agrarian University“, Orel.

Das Werk ist am 08. November 2013 bei der Redaktion eingegangen.

Bibliografischer Link

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. VERWENDUNG DER CHEMILUMINESZENZ ZUR BEWERTUNG DER ANTIOXIDANTEN EIGENSCHAFTEN VON NÄHRSTOFFEN // Grundlagenforschung. - 2013. - Nr. 10-11. - S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (Zugriffsdatum: 17.12.2019). Wir machen Sie auf die vom Verlag „Academy of Natural History“ herausgegebenen Zeitschriften aufmerksam.

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1.4 Forschungsmethoden für Antioxidantien

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