Trennung von Proteinen von niedermolekularen Verunreinigungen
Membransiebverfahren (Dialyse)
Dabei kommt eine Dialysemembran zum Einsatz, die aus einem Polymer besteht und Poren einer bestimmten Größe aufweist. Kleine Moleküle (Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht) passieren die Poren der Membran, große Moleküle (Proteine) werden zurückgehalten. Auf diese Weise werden die Proteine von Verunreinigungen befreit.
Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht
Gelchromatographie
Die Chromatographiesäule ist mit Gelgranulat (Sephadex) gefüllt, das Poren einer bestimmten Größe aufweist. Der Säule wird eine Proteinmischung zugesetzt. Proteine, deren Größe kleiner als die Größe der Sephadex-Poren ist, werden in der Säule zurückgehalten, da sie in den Poren „stecken“ bleiben, während der Rest die Säule frei verlässt. Die Größe eines Proteins hängt von seinem Molekulargewicht ab.
Ultrazentrifugation
Diese Methode basiert auf unterschiedlichen Sedimentationsraten (Fällung) von Proteinmolekülen in Lösungen mit unterschiedlichen Dichtegradienten (Saccharosepuffer oder Cäsiumchlorid).
Elektrophorese
Diese Methode basiert auf unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeiten von Proteinen und Peptiden in einem elektrischen Feld in Abhängigkeit von der Ladung.
Als Träger für die Elektrophorese können Gele, Celluloseacetat und Agar dienen. Die zu trennenden Moleküle bewegen sich im Gel entsprechend ihrer Größe: Große Moleküle werden beim Durchgang durch die Poren des Gels verzögert. Kleinere Moleküle stoßen auf weniger Widerstand und bewegen sich daher schneller. Dadurch sind große Moleküle nach der Elektrophorese näher am Start als kleinere.
Elektrophorese kann zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht eingesetzt werden. Hierzu wird die PAGE-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-Na) eingesetzt.
DDS-Na ist eine diphile Substanz und enthält eine geladene und eine hydrophobe Gruppe. Proteine binden mit ihren hydrophoben Radikalen an SDS-Na und werden dabei denaturiert. Auf diese Weise werden die Proteine in Form und Ladung ausgerichtet. Danach hängt die Mobilität des Proteins während der Elektrophorese nur noch von seinem Molekulargewicht ab.
aussalzen: Niederschlag mit Salzen von Alkali, Erdalkalimetallen (Natriumchlorid, Magnesiumsulfat), Ammoniumsulfat; die Primärstruktur des Proteins wird nicht gestört;
Ablage: Verwendung wasserentfernender Substanzen: Alkohol oder Aceton bei niedrigen Temperaturen (ca. –20 С).
Bei diesen Methoden verlieren Proteine ihre Hydratationshülle und fallen in Lösung aus.
Denaturierung- Verletzung der räumlichen Struktur von Proteinen (die Primärstruktur des Moleküls bleibt erhalten). Sie kann reversibel (die Proteinstruktur wird nach Entfernung des Denaturierungsmittels wiederhergestellt) oder irreversibel (die räumliche Struktur des Moleküls wird nicht wiederhergestellt, beispielsweise wenn Proteine mit konzentrierten Mineralsäuren, Salzen von Schwermetallen ausgefällt werden) sein.
Methoden zur Proteintrennung Trennung von Proteinen von niedermolekularen Verunreinigungen
Dialyse
Dabei kommt eine spezielle Polymermembran zum Einsatz, die Poren einer bestimmten Größe aufweist. Kleine Moleküle (Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht) passieren die Poren der Membran, große Moleküle (Proteine) werden zurückgehalten. Dadurch werden Proteine von Verunreinigungen abgewaschen.
Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht
Gelchromatographie
Die Chromatographiesäule ist mit Gelgranulat (Sephadex) gefüllt, das Poren einer bestimmten Größe aufweist. Der Säule wird eine Proteinmischung zugesetzt. Proteine, deren Größe kleiner als die Größe der Sephadex-Poren ist, werden in der Säule zurückgehalten, da sie in den Poren „stecken“ bleiben, während der Rest die Säule frei verlässt (Abb. 2.1). Die Größe eines Proteins hängt von seinem Molekulargewicht ab.
Reis. 2.1. Proteintrennung durch Gelfiltration
Ultrazentrifugation
Diese Methode basiert auf unterschiedlichen Sedimentationsraten (Fällung) von Proteinmolekülen in Lösungen mit unterschiedlichen Dichtegradienten (Saccharosepuffer oder Cäsiumchlorid) (Abb. 2.2).
Reis. 2.2. Trennung von Proteinen durch Ultrazentrifugation
Elektrophorese
Diese Methode basiert auf unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeiten von Proteinen und Peptiden in einem elektrischen Feld in Abhängigkeit von der Ladung.
Als Träger für die Elektrophorese können Gele, Celluloseacetat und Agar dienen. Getrennte Moleküle bewegen sich abhängig von ihrer Größe im Gel: Größere Moleküle werden beim Durchgang durch die Poren des Gels verzögert. Kleinere Moleküle stoßen auf weniger Widerstand und bewegen sich daher schneller. Dadurch befinden sich nach der Elektrophorese größere Moleküle näher am Start als kleinere (Abb. 2.3).
Reis. 2.3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
Elektrophorese kann auch zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht eingesetzt werden. Dafür verwenden sie PAGE-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-Na).
Isolierung einzelner Proteine
Affinitätschromatographie
Die Methode basiert auf der Fähigkeit von Proteinen, über nichtkovalente Bindungen fest an verschiedene Moleküle zu binden. Wird zur Isolierung und Reinigung von Enzymen, Immunglobulinen und Rezeptorproteinen verwendet.
Stoffmoleküle (Liganden), an die bestimmte Proteine spezifisch binden, werden kovalent mit Partikeln eines inerten Stoffes verbunden. Die Proteinmischung wird auf die Säule gegeben und das gewünschte Protein wird fest an den Liganden gebunden. Die restlichen Proteine verlassen die Säule frei. Das zurückgehaltene Protein kann dann mit einer Pufferlösung, die den freien Liganden enthält, aus der Säule ausgewaschen werden. Mit dieser hochempfindlichen Methode können sehr kleine Proteinmengen in reiner Form aus einem Zellextrakt isoliert werden, der Hunderte anderer Proteine enthält.
Isoelektrische Fokussierung
Die Methode basiert auf unterschiedlichen IET-Werten von Proteinen. Die Proteintrennung erfolgt durch Elektrophorese auf einer Platte mit Ampholin (dies ist eine Substanz, bei der ein pH-Gradient im Bereich von 3 bis 10 vorgebildet wird). Bei der Elektrophorese werden Proteine nach ihrem IET-Wert getrennt (bei der IET ist die Ladung des Proteins Null und es bewegt sich nicht im elektrischen Feld).
2D-Elektrophorese
Es handelt sich um eine Kombination aus isoelektrischer Fokussierung und Elektrophorese mit SDS-Na. Die Elektrophorese wird zunächst in horizontaler Richtung auf einer Platte mit Ampholin durchgeführt. Proteine werden nach Ladung (IET) getrennt. Anschließend wird die Platte mit einer SDS-Na-Lösung behandelt und eine Elektrophorese in vertikaler Richtung durchgeführt. Proteine werden nach Molekulargewicht getrennt.
Immunelektrophorese (Western Blot)
Eine analytische Methode zur Identifizierung spezifischer Proteine in einer Probe (Abbildung 2.4).
Isolierung von Proteinen aus biologischem Material.
Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht durch Elektrophorese in PAGE mit SDS-Na.
Übertragung von Proteinen vom Gel auf eine Polymerplatte zur Erleichterung der weiteren Arbeit.
Behandlung der Platte mit einer Lösung unspezifischen Proteins, um die verbleibenden Poren zu füllen.
Somit erhält man nach diesem Schritt eine Platte, deren Poren getrennte Proteine enthalten und deren Zwischenraum mit einem unspezifischen Protein gefüllt ist. Jetzt müssen wir feststellen, ob es unter den Proteinen das gesuchte gibt, das für eine Krankheit verantwortlich ist. Zum Nachweis wird eine Antikörperbehandlung eingesetzt. Primärantikörper sind Antikörper gegen das Protein von Interesse. Unter sekundären Antikörpern versteht man Antikörper gegen primäre Antikörper. Den Sekundärantikörpern wird zusätzlich eine spezielle Markierung (sog. molekulare Sonde) hinzugefügt, um die Ergebnisse anschließend sichtbar zu machen. Als Markierung dient ein radioaktives Phosphat oder Enzym, das fest an einen Sekundärantikörper gebunden ist. Die Bindung zuerst an primäre und dann an sekundäre Antikörper hat zwei Ziele: Standardisierung der Methode und Verbesserung der Ergebnisse.
Behandlung mit einer Lösung primärer Antikörper Die Bindung erfolgt an der Stelle der Platte, an der sich das Antigen (das gewünschte Protein) befindet.
Entfernung ungebundener Antikörper (Waschen).
Behandlung mit einer Lösung markierter Sekundärantikörper zur anschließenden Entwicklung.
Entfernung ungebundener Sekundärantikörper (Waschen).
Reis. 2.4. Immunelektrophorese (Western Blot)
Ist das gewünschte Protein im biologischen Material vorhanden, erscheint auf der Platte eine Bande, die die Bindung dieses Proteins an die entsprechenden Antikörper anzeigt.
Die Untersuchung physikalisch-chemischer Eigenschaften, chemischer Zusammensetzung und Struktur ist nur durch die Untersuchung eines gereinigten Proteinpräparats möglich. Zur Isolierung und Fraktionierung einzelner Proteine werden verwendet: Aussalzen, Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Gelfiltration, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie.
Proteine aussalzen basierend auf der Abhängigkeit der Proteinlöslichkeit von den Eigenschaften des Mediums. Proteine sind in destilliertem Wasser weniger löslich als in schwachen Salzlösungen, da bei niedrigen Ionenkonzentrationen ihre Hydratationshüllen erhalten bleiben. Bei hohen Salzkonzentrationen verlieren Proteinmoleküle jedoch ihre Hydratationshülle, aggregieren und es bildet sich ein Niederschlag. Nachdem das Salz entfernt wurde, gehen die Proteine wieder in Lösung und behalten ihre ursprünglichen Eigenschaften und Konformation bei.
Zur Isolierung einzelner Proteine werden Veränderungen der Löslichkeit bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen und pH-Werten genutzt. Am häufigsten werden Ammoniumsulfatlösungen unterschiedlicher Konzentration zum Aussalzen von Proteinen verwendet.
Die Ausfällung von Proteinen aus Lösungen ohne deren Denaturierung erfolgt mit Dehydrierungsmitteln – organischen Lösungsmitteln (Ethanol, Aceton).
Gelfiltration basiert auf der Trennung von Proteinen nach Größe und Form des Moleküls. Die Trennung erfolgt in Chromatographiesäulen, die mit porösen Gelkörnern (Sephadex, Agarose) in einer Pufferlösung mit einem bestimmten pH-Wert gefüllt sind. Gelkörnchen sind dank interner Kanäle (Poren) mit einem bestimmten durchschnittlichen Durchmesser, dessen Größe von der Art des Gels abhängt (Sephadex G-25, G-200 usw.), für Proteine durchlässig. Das Proteingemisch wird auf die Säule gegeben und anschließend mit einer Pufferlösung mit einem bestimmten pH-Wert ausgewaschen (eluiert). Große Proteinmoleküle dringen nicht in die Poren des Gels ein und bewegen sich zusammen mit dem Lösungsmittel mit hoher Geschwindigkeit. Kleine Moleküle einer niedermolekularen Verunreinigung (Salz) oder eines anderen Proteins werden vom Gelgranulat zurückgehalten und langsamer aus der Säule ausgewaschen (Abb. 1.29). Am Säulenausgang wird die Lösung (Eluat) in Form getrennter Fraktionen gesammelt.
Reis. 1.29. Proteintrennung durch Gelfiltration
Elektrophorese basiert auf der Eigenschaft geladener Proteinmoleküle, sich in einem elektrischen Feld mit einer Geschwindigkeit zu bewegen, die proportional zu ihrer Gesamtladung ist. Proteine, die bei einem gegebenen pH-Wert insgesamt eine negative Ladung haben, bewegen sich zur Anode und eine positive Ladung bewegt sich zur Kathode. Die Elektrophorese wird auf verschiedenen Medien durchgeführt: Papier, Stärkegel, Polyacrylamidgel usw. Die Bewegungsgeschwindigkeit hängt von der Ladung, Masse und Form der Proteinmoleküle ab. Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Proteinzonen auf dem Träger mit speziellen Farbstoffen angefärbt (Abb. 1.30, A).
Die Auflösung der Elektrophorese in einem Gel ist höher als auf Papier, daher werden bei der Elektrophorese von Blutserumproteinen auf Papier 5 Fraktionen isoliert (Albumin, α 1 -, α 2 -, β-, γ-Globuline) und in einem Polyacrylamidgel - bis zu 18 Brüche (Abb. 1.30, B).
Reis. 1.30. Elektropherogramm der Blutserumproteine eines gesunden Menschen
A- Elektropherogramm von Blutserumproteinen auf Papier;
B- die Menge an Plasmaproteinen verschiedener Fraktionen.
I – γ-Globuline; II – β-Globuline; III – a 2 -Globuline;
IV – a 1 -Globuline; V – Albumine
Ionenaustauschchromatographie basiert auf der Trennung von Proteinen, die sich in der Gesamtladung unterscheiden. Eine Proteinlösung mit einem bestimmten pH-Wert wird durch eine mit einem festen porösen Sorbens gefüllte Chromatographiesäule geleitet, wobei ein Teil der Proteine durch elektrostatische Wechselwirkung zurückgehalten wird. Als Sorbentien werden Ionenaustauschersubstanzen eingesetzt: Anionenaustauscher (mit kationischen Gruppen) zur Isolierung saurer Proteine; Kationenaustauscher (mit anionischen Gruppen) zur Isolierung essentieller Proteine.
Beim Durchlaufen eines Proteins durch eine Säule hängt die Stärke seiner Bindung an den Ionenaustauscher von der Größe der Ladung ab, die der Ladung des Sorbens entgegengesetzt ist. An einem Ionenaustauschsorbens adsorbierte Proteine werden mit Pufferlösungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen und pH-Werten eluiert, wodurch unterschiedliche Proteinfraktionen erhalten werden.
Affinitätschromatographie basiert auf der Bindungsspezifität des Proteins an den Liganden, der an den festen Träger gebunden ist. Als Liganden werden Enzymsubstrate, prosthetische Gruppen von Holoproteinen, Antigene usw. verwendet. Wenn eine Proteinmischung durch die Säule geleitet wird, bindet nur das komplementäre Protein an den Liganden (Abb. 1.31, A), alle anderen kommen zusammen mit der Lösung heraus. Das adsorbierte Protein wird mit einer Lösung mit einem anderen pH-Wert eluiert (Abb. 1.31, B). Diese Methode ist hochspezifisch und ermöglicht die Gewinnung hochreiner Proteinpräparate.
Die Proteinisolierung und -reinigung erfolgt in der Regel in mehreren Schritten mit unterschiedlichen Methoden. Die Reihenfolge der Schritte wird empirisch ausgewählt und kann für verschiedene Proteine variieren. Ein hoher Grad der Proteinreinigung ist sowohl bei der Verwendung als Arzneimittel (Hormon Insulin usw.) als auch bei der Diagnose verschiedener Krankheiten durch Veränderung der Proteinzusammensetzung von Gewebe, Blut, Speichel usw. sehr wichtig.
Der Satz an Proteinen in den Zellen verschiedener Organe eines Erwachsenen ist individuell und bleibt ein Leben lang relativ konstant. Spezialisierte Gewebe können spezifische Proteine enthalten, wie Hämoglobin in roten Blutkörperchen, Aktin und Myosin in den Muskeln, Rhodopsin in der Netzhaut und verschiedene Arten von Kollagen in Knochen und Bindegewebe. Einige Proteine kommen in vielen Geweben vor, jedoch in unterschiedlichen Mengen. Ausgewählte Kompositionsänderungen
Reis. 1.31. Trennung von Proteinen durch Affinitätschromatographie
A– Bindung des isolierten Proteins an einen spezifischen Liganden, der an einen neutralen Träger gebunden ist; B- Erhalten einer Lösung einzelner Proteine
Proteine aus Gewebe und Blut sind möglich und hängen hauptsächlich mit der Ernährung, der Nahrungszusammensetzung und der körperlichen Aktivität einer Person zusammen.
Bei Krankheiten kann sich die Proteinzusammensetzung von Blut- und Gewebezellen erheblich verändern; häufig kommt es zu einem Mangel an Proteinen oder einer Abnahme seiner Aktivität – Proteinopathie. Daher wird die Bestimmung ausgeprägter Veränderungen in der Proteinzusammensetzung von Blut und Gewebe in klinischen Studien zur Diagnose verschiedener Krankheiten eingesetzt.
Nach der Extraktion einer Proteinmischung aus biologischem Material wird diese in einzelne Proteinfraktionen aufgetrennt. Es wurden mehrere Proteinfraktionierungsmethoden entwickelt, die auf unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von Proteinen basieren.
– Ausfällung von Proteinen am isoelektrischen Punkt – Die Methode basiert auf der Eigenschaft von Proteinen, am isoelektrischen Punkt aufgrund der Neutralisierung der Ladung des Proteinmoleküls auszufallen. Für jedes Protein ist der Wert des isoelektrischen Punkts streng individuell, daher ermöglicht diese Methode die Isolierung einzelner Proteine (weitere Informationen zur Methode finden Sie in der Laborarbeit Nr. 3 im Kurs „Biochemie“).
– Proteinfraktionierung durch Aussalzmethode – basierend auf der unterschiedlichen Löslichkeit von Proteinen in konzentrierten Lösungen neutraler Salze in Abhängigkeit vom Molekulargewicht (weitere Informationen zur Methode finden Sie in der Laborarbeit Nr. 3 im Kurs „Biochemie“).
– elektrophoretische Trennmethode Proteine in Fraktionen - beschrieben im Abschnitt Physikochemische Eigenschaften von Proteinen.
Zusätzlich zu den oben vorgestellten Methoden werden sie häufig zur Auftrennung von Proteinen in Fraktionen eingesetzt. chromatographische Methoden . Am häufigsten wird die Säulenchromatographie verwendet.
Die Besonderheit dieser Methode besteht darin, dass eine Mischung aus Molekülen verschiedener Proteine und Peptide durch eine Säule geleitet wird, die ein festes poröses Material (Matrix) enthält. Aufgrund der Wechselwirkung mit der Matrix passieren verschiedene Proteine die Säule mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Nachdem die Proteine in einer bestimmten Reihenfolge den Boden der Säule erreicht haben, werden sie in getrennten Fraktionen in Reagenzgläsern gesammelt.
Markieren drei Haupttypen Säulenchromatographie:
– Ionenaustausch – Für die Proteinchromatographie werden Ionenaustauscher auf Basis von Zellulose oder anderen hydrophilen Polymeren verwendet, beispielsweise Diethylaminoethylzellulose (DEAE-Zellulose), die kationische Gruppen enthält (negative Ladung) oder Carboxymethylzellulose (CM-Zellulose), die Amingruppen enthält (positive Ladung). :
Je stärker die Bindung von Proteinen an DEAE-Cellulose ist, desto höher ist die Anzahl der Carboxylgruppen im Proteinmolekül. An DEAE-Zellulose adsorbierte Proteine können mit Lösungen steigender Natriumchloridkonzentration aus der Säule gewaschen (eluiert) werden. Lose gebundene Proteine werden zuerst eluiert, und mit zunehmender Salzkonzentration werden andere Proteine eluiert, und zwar in der Reihenfolge zunehmender Affinität für DEAE-Cellulose.
CM-Cellulose wird in ähnlicher Weise verwendet, aber die Affinität von Proteinen dazu ist direkt proportional zur Anzahl der Aminogruppen im Proteinmolekül.
Um gebundenes Protein zu entfernen, wird zusätzlich der pH-Wert des Eluenten verändert.
– Gelfiltrationschromatographie – hat den zweiten Namen „Molekularsiebverfahren“. Als Siebe wird Sephadex (mit Epichloridhydrin behandeltes Polysaccharid Dextran) verwendet. Sephadex-Körner quellen in Wasser auf und bilden ein Gel. Das gequollene Granulat weist Poren mit einem bestimmten Durchmesser auf.
Die Trennung basiert auf der Tatsache, dass Sephadex-Körner (die Poren des Granulats) für Substanzen mit hohem Molekulargewicht undurchlässig oder begrenzt durchlässig sind und kleine Moleküle frei in die Poren der Körner diffundieren (eindringen).
Eine gelartige Masse aus gequollenem Sephadex wird in eine Glassäule (Röhrchen) gegeben, eine Schicht Proteinlösung wird auf die Oberfläche des Gels aufgetragen (Abb. 12, a) und dann wird eine Pufferlösung (Elutionsflüssigkeit) hindurchgeleitet die Kolumne. Proteine passieren die Säule zwischen den Körnern umso langsamer, je niedriger ihr Molekulargewicht ist, da Proteinmoleküle mit noch geringerem Molekulargewicht leichter in die Körnchen (in die Poren) diffundieren (Abb. 12).
Reis. 12. Proteinfraktionierung durch Gelfiltration
Proteine werden in absteigender Reihenfolge ihres Molekulargewichts aus der Säule ausgewaschen (eluiert). Folglich werden zuerst große Proteinmoleküle eluiert (Abb. 12, b), die nicht in die Körner diffundieren, dann kleine Moleküle und zuletzt niedermolekulare Verunreinigungen.
Diese Methode dient nicht nur der Fraktionierung von Proteinen nach Molekulargewicht, sondern auch deren Reinigung von niedermolekularen Verunreinigungen.
– Affinitätschromatographie – oder Affinitätschromatographie. Das Prinzip der Methode besteht darin, dass eine selektive Wechselwirkung von Proteinen mit bestimmten Substanzen erfolgt – Liganden, die an Träger gebunden sind (Abb. 13).
Als Träger wird Bromcyan-aktivierte Sepharose verwendet. An Sepharose sind Liganden unterschiedlicher Herkunft gebunden – ein Substrat, ein Antigen oder ein Rezeptor, der nur ein Protein aus der Mischung affin bindet:
– Substrat → Enzym;
– Antigen → Antikörper;
– Hormon → Rezeptor für ein bestimmtes Hormon.
Andere Proteine, die nicht an den Liganden gebunden sind, werden durch Waschen der Säule entfernt.
Reis. 13. Mechanismus der Affinitätschromatographie
Die Entfernung des affinitätsgebundenen Proteins von der Säule erfolgt mit einer Pufferlösung (Eluent). In den Puffer wird ein Detergens eingebracht, das die Bindungen zwischen dem Protein und dem Liganden schwächt, oder eine Lösung mit einer hohen Konzentration an freiem Liganden wird durch die Säule geleitet. In diesem Fall bindet das Protein leichter an den freien Liganden und wird aus der Säule ausgewaschen (eluiert).
Laborarbeit Nr. 8
ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON PROTEINEN
Die Methode basiert auf der Tatsache, dass Proteinmoleküle eine elektrische Ladung haben, deren Größe und Vorzeichen durch die Aminosäurezusammensetzung des Proteins, den pH-Wert und die Ionenstärke der Umgebung bestimmt werden. Unter dem Einfluss eines äußeren elektrischen Feldes bewegen sich geladene Moleküle in der Lösung in Richtung des entgegengesetzt geladenen Pols. Die Bewegungsgeschwindigkeit von Proteinpartikeln ist proportional zur Größe ihrer Ladung und umgekehrt proportional zur Größe der Partikel und dem Grad ihrer Hydratation.
Derzeit weit verbreitet ist die sogenannte „Zonenelektrophorese“ – Elektrophorese auf einem festen Träger (auf Papierstreifen, Agar, Stärke, Acrylamid), imprägniert mit einer Pufferlösung mit dem gewünschten pH-Wert. Die Position von Proteinen auf Papier oder Gel wird durch Fixieren und anschließendes Anfärben mit dem einen oder anderen Farbstoff (normalerweise Bromphenolblau, Amidschwarz oder Coomassie-Blau) bestimmt. Die Proteinmenge in jeder Fraktion kann näherungsweise durch die Farbintensität des zugehörigen Farbstoffs bestimmt werden. Diese Definition gibt kein streng quantitatives Verhältnis der Proteinfraktionen an, da die Menge des von verschiedenen Proteinen gebundenen Farbstoffs nicht gleich ist.
ELEKTROPHORESE HA-PAPIER
Die Trennung der analysierten Mischung erfolgt auf bestimmten Arten von Chromatographiepapier, das mit einer Pufferlösung in Elektrophoresegeräten imprägniert ist. Die Proteintrennung erfolgt bei Spannungen bis 500 V.
Die Elektrophoresekammer besteht aus einem Plexiglasbad und einem darauf angebrachten Deckel (1). Das Bad verfügt über 2 Elektrodenräume (2), die jeweils durch eine Längstrennwand unterteilt sind (3) in zwei miteinander kommunizierende Fächer. Bo die inneren Fächer der Fächer senken die Elektroden und die Enden der Papierstreifen in die äußeren Fächer (4), Der Hauptteil davon wird auf einer horizontalen Platte mit Spitzen (5) platziert, die sich im mittleren Teil der Kammer befindet. Zwischen der horizontalen Platte und dem Außenfach der Elektrodenfächer befinden sich Stäbe (6),
Abb.2. Gerätediagramm für Niederspannungselektrophorese
durch die Papierstreifen geworfen werden und die als Stütze dienen. Unter der oberen Abdeckung der Kammer befindet sich eine Platte aus Plexiglas mit großen runden Löchern (7), auf die in destilliertem Wasser getränkte und 4-5-fach gefaltete Filterpapierblätter gelegt werden. Diese Folien tragen dazu bei, die Dichtheit der Kammer zu erhöhen und dadurch die Verdunstung von Flüssigkeit aus Elektropherogrammen während der Elektrophorese zu reduzieren.
Mittels Papierelektrophorese werden die Schüler gebeten, Blutserumproteine zu trennen. Mit dieser Methode kann Blutserum in 5 - 9 Fraktionen aufgeteilt und der relative Proteingehalt in jeder Fraktion bestimmt werden. Die Trennung erfolgt in einer Pufferlösung (pH 8,6 – 8,9) mit einem Potentialgradienten von 3 – 5 V/cm (120 – 350 V für Streifen von 40 – 45 cm Länge) bei Raumtemperatur. Der Strom sollte 0,1 - 0,3 mA pro Zentimeter des Papierstreifenquerschnitts nicht überschreiten. Eine Erhöhung der Stromstärke um mehr als das Zweifache ist nicht akzeptabel, da dies zu einer übermäßigen Erwärmung, einem deutlichen Anstieg der Verdunstung usw. führt V letztendlich - Papierverbrennung
Reagenzien:
1. Pufferlösung. Kann verwendet werden:
a) Veronal-Medinal-Puffer (pH 8,6): 10,32 gMedinal (Natriumsalz von Veronal) in 300 ml destilliertem Wasser auflösen, 1,84 gVeronal hinzufügen, unter Rühren im Wasserbad erhitzen, bis es aufgelöst ist, und Wasser auf 1 Liter auffüllen;
b) Veronalacetat-Puffer (pH 8,6): 4,3 Veronal, 0,95 Natriumhydroxid und 3,24 Natriumacetat werden in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. 30 ml 0,1 M HCl-Lösung zur Lösung hinzufügen und Wasser auf 1 Liter auffüllen;
c) Tris-Puffer (pH 8,9): 60,5 g Tris, 6 Ethylendiamintetraessigsäure und 4,6 g Borsäure werden in 1 destilliertem Wasser gelöst.
2. Lösungen zum Färben von Elektropherogrammen:
a) saurer blauschwarzer Farbstoff (ähnlich Amidschwarz 10 B) – 0,2 g Mischung: Essigsäure (Eissäure) – 100 ml + Methylalkohol – 900 ml;
b) Bromphenolblau – 0,5 g, Quecksilberchlorid – 10 g, Essigsäure (Eisessig) – 20 ml, destilliertes Wasser – 980 ml;
c) Bromphenolblau – 0,1 g, ZnSO 4 · 7H 2 O – 50 g, Essigsäure (Eisessig) 50 ml, destilliertes Wasser – 900 ml.
3. Lösungen zum Waschen von Elektropherogrammen von nicht an das Protein gebundenem Farbstoff und zum Fixieren des Farbstoffs auf dem Protein:
a) Essigsäure – 2 %ige Lösung;
b) Natriumacetat – 2 %ige Lösung, hergestellt mit einer 10 %igen Essigsäurelösung.
4. Lösungen zur Elution farbiger Produkte aus Elektropherogrammen:
a) Bromphenolblau – 0,01 M NaOH-Lösung zu extrahieren;
b) um den sauren blauschwarzen Farbstoff zu extrahieren – 0,1 M NaOH-Lösung.
Ausrüstung: Reagenzgläser; Küvetten, Spektrophotometer, Elektrophoresegerät, chromatographisches Papier: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM usw.
Gewinnung von Blutserum. 2–3 ml Blut werden in ein trockenes Zentrifugenröhrchen aufgezogen und 1/2–1 Stunde stehen gelassen. Mit einem dünnen Glasstab vorsichtig die Wände des Röhrchens umkreisen, um das Gerinnsel von ihnen zu trennen, zentrifugieren und das Serum in ein Gefäß gießen sauberes Rohr.
Vorbereiten der Kamera. Die Elektrodenkammern sind bis zum gleichen Füllstand mit Pufferlösung gefüllt (um ein Pufferüberlaufen zu vermeiden), etwa 800 ml pro Kammer. Bo die inneren Teile der Elektrodenkammern tauchen die Elektroden ein. Verwenden Sie auf einem Blatt Chromatographiepapier (18 x 45 cm) (bei Verwendung dünner Papiersorten ist es besser, die Proben auf einzelne Streifen mit einer Breite von 4 bis 5 cm aufzutragen) im Abstand von 15 cm von einer seiner Schmalseiten ein einfaches weiches Papier Bleistift (Graphit verhindert das Ausbreiten der Flüssigkeit), um die Stellen zum Auftragen der Proben zu skizzieren. Es handelt sich um Rechtecke (2 x 0,3 cm), deren große Seiten senkrecht zur Länge des Papierstreifens stehen. Der Abstand zwischen den Startzonen und den Rändern des Elektropherogramms beträgt 2 cm. Das Elektropherogramm ist mit dem Puffer imprägniert, in dem die Elektrophorese stattfinden wird. Dazu wird es durch eine Küvette mit Pufferlösung gezogen. Die Enden der Papierstreifen (6-8 cm) werden nicht benetzt. Überschüssiger Puffer wird durch Abtupfen der Streifen zwischen zwei oder drei Blättern Filterpapier entfernt. Das nasse Elektropherogramm wird in der Kammer auf der zentralen horizontalen Platte (5) platziert und die Enden werden in die äußeren Fächer der Elektrodenfächer abgesenkt. Das Gerät wird mit einem Deckel fest verschlossen, unter dem sich mit angefeuchtete Filterpapierblätter befinden Wasser.
Elektrophorese durchführen. Nachdem die Papierstreifen vollständig mit der Pufferlösung gesättigt sind, werden Proben von 0,01 – 0,02 ml (1 – 2 mg Protein) Serum mit einer 0,1-ml-Pipette auf die markierten Bereiche aufgetragen. Die Kammer wird mit einem Deckel verschlossen und der Strom eingeschaltet. Die Dauer der Elektrophorese beträgt 22 – 24 Stunden bei einer Spannung von 200 – 300 V
Fixierung und Färbung von Elektropherogrammen. Schalten Sie am Ende der Elektrophorese den Strom aus und entfernen Sie die Elektropherogramme sofort aus dem Gerät. Sie werden auf einen speziellen Ständer gestellt und an der Luft unter Zugluft getrocknet, dann 20 Minuten lang in einem Ofen bei 105 °C, um die Proteine auf Papier zu fixieren. Anschließend werden sie in eine Emailleküvette gegeben, mit Farbstoff gefüllt und 2–3 Minuten stehen gelassen Stunden oder mehr. Der Farbstoff wird abgelassen und die Elektropherogramme werden durch 3-4-maliges Gießen mit einer 2%igen Essigsäurelösung für jeweils 5-10 Minuten von ihrem Überschuss abgewaschen. Papierbereiche, die kein Eiweiß enthalten, müssen völlig frei von Farbstoffen sein. Zur Fixierung der gefärbten Produkte werden Elektropherogramme 2 Minuten lang mit einer 2 %igen Natriumacetatlösung gefüllt und an der Luft unter Absaugen getrocknet.
Bestimmung des Verhältnisses einzelner Proteinfraktionen. Bei pH 8,6 sind Serumproteine negativ geladen und bewegen sich im elektrischen Feld in Richtung Anode. Die Fraktion, die sich am schnellsten zur Anode bewegt, ist Albumin, gefolgt von α 1 -, α 2 -, β- und γ-Globulinen (siehe Abb. 3). . Abschnitte von Papierbändern, auf denen Proteinflecken aufgetreten sind, werden mit einem einfachen Bleistift durch Querlinien in 3-5 mm breite Streifen geteilt und entlang dieser Linien geschnitten. Jeder Streifen wird zerkleinert und in ein separates nummeriertes Reagenzglas gegeben, mit 3 ml 0,01 M NaOH-Lösung gefüllt, eine Stunde stehen gelassen, um die Farbe vom Papier zu entfernen, und dann wird der Wert der optischen Dichte für jede Lösung auf einem Fotokolorimeter ermittelt ( Spektralphotometer) bei 612 nm.
Reis. 3. Elektropherogramm des menschlichen Blutserums und Verteilungskurve der Proteinfraktionen
Parallel dazu wird eine Kontrollprobe verarbeitet. Dazu wird aus den ungefärbten Bereichen des Elektropherogramms ein Streifen ausgeschnitten.
Basierend auf den erhaltenen Daten wird im Elektropherogramm eine Verteilungskurve der farbigen Produkte aufgetragen. Auf der Abszissenachse sind die Nummern der Röhrchen und auf der Ordinatenachse der entsprechende Wert der optischen Dichte aufgetragen (siehe Abb. 3). . Der Prozentsatz der Proteinfraktionen im Blutserum wird berechnet. Dazu wird die gezeichnete Kurve entsprechend den Minima in mehrere Abschnitte unterteilt, die einzelnen Brüchen entsprechen. Die Größe der Fläche jedes Abschnitts ist proportional zur Menge an Farbe, kombiniert mit dem Protein einer bestimmten Fraktion. Das Verhältnis zwischen diesen Flächen wird nach Gewicht berechnet (das Gewicht der Papierabschnitte ist proportional zu ihrer Fläche), die Gesamtfläche wird als 100 % angenommen. Wenn Sie über ein Densitometer verfügen, kann das Verhältnis der Proteinfraktionen im Blutserum anhand eines Densitogramms bestimmt werden.
Nachdem zuvor der Proteingehalt in der Molke bestimmt wurde, wird dessen Menge für jede Fraktion berechnet.
