възстановяване на ДНК

Главна информация

Увреждащи ДНК агенти

Радиация

1. йонизиращо лъчение (гама лъчи, рентгенови лъчи)

2. Ултравиолетово лъчение (особено ~260 nm, именно в тази област се получава максимална абсорбция на ДНК)

Реактивните кислородни радикали се образуват по време на нормалното клетъчно дишане в различни биохимични пътища.
Екологични химикали.

Много въглеводороди.

Химикали, използвани в противотуморна химиотерапия.

Видове увреждания на ДНК

1. Всички четири бази в ДНК (A, T, C, G) могат да бъдат ковалентно модифицирани на различни позиции.
Най-честата е загубата на аминогрупа (дезаминиране) - в този случай C се превръща в U.
Неправилното включване на бази възниква поради грешки в работата на ДНК полимеразите по време на репликацията.
Най-често срещаното включване е урацил вместо тимин.
Нарушения на структурата.
В ДНК могат да възникнат прекъсвания. Скъсванията могат да бъдат едноверижни или и двете ДНК вериги могат да бъдат счупени.

Йонизиращото лъчение може да бъде често срещана причина за такива разкъсвания.
Ковалентна връзка може да се образува между съседни бази и връзката може да се образува между съседни бази на една и съща верига или между две вериги на ДНК.
видове увреждания на ДНК
смяна на една база
апуринизация
замяна на C с Y
заместване на А с хипоксантин
основно алкилиране
вмъкване или изтриване на нуклеотид
вграждане на подобна основа
смяна на две основи
образуване на тиминови димери
омрежване с бифункционален алкилиращ агент
прекъсване на веригата
йонизиращо лъчение
радиоактивно разрушаване на основните елементи
напречни връзки
между основите на една нишка или две успоредни нишки
между ДНК и протеинови молекули, като хистони

Ремонт на повредени основи

Повредените основи могат да бъдат поправени по различни начини:
Директно химическо възстановяване на повреда.

Ексцизионна корекция (ER), при която увредената основа се отстранява и се заменя с нова. Има три модела на ексцизионно възстановяване, като всеки използва собствен набор от ензими.
Основна ексцизионна корекция (BER).
Възстановяване чрез ексцизия на нуклеотиди (NER).
Ремонт на несъответствие (MMR).

Директно отстраняване на щети.

Най-честата причина за точкови мутации при хората е спонтанното добавяне на метилова група, вид алкилиране. Такива модификации се коригират от ензими, наречени гликозилази, които коригират грешката, без да разрушават ДНК веригата.

Някои лекарства, използвани в химиотерапията, също увреждат ДНК чрез алкилиране.
Проблемът с възстановяването е, че с ограничен набор от ензими и механизми клетката трябва да се справи с много повреди, причинени от голямо разнообразие от химични и физични агенти.

Основна ексцизионна корекция (BER)

Основни ключови събития:

1. Отстраняване на увредената основа (случва се ~20 000 пъти на ден във всяка клетка на човешкото тяло) ДНК гликозиламин. Хората имат най-малко 8 гена, кодиращи различни ДНК гликозилази, всяка от които разпознава различен набор от базови лезии.
2. Отстраняването на дезоксирибофосфата води до образуването на празнота в ДНК.
3. Замяна с правилния нуклеотид. Тази функция при хората се изпълнява от ДНК полимераза бета.
4. Лигиране на прекъсването на веригата. Има два ензима, и двата изискват АТФ.

Възстановяване чрез ексцизия на нуклеотиди (NER)

NER се различава от BER по няколко начина.
Използване на различни ензимни системи.
Дори ако грешката е в един нуклеотид, много нуклеотиди в зоната на увреждане се отстраняват наведнъж.

Основни ключови събития на NER:
1. Повредата се разпознава по един или повече фактори, свързани с мястото на повреда.
2. ДНК се развива на мястото на увреждане. Този процес включва
различни транскрипционни фактори IIH, TFIIH (които работят и по време на нормална транскрипция).
3. ДНК се срязва в 3" и 5" края на увреждането, в резултат на което се отстранява ДНК фрагмента, съдържащ увредения нуклеотид.
4. Нова ДНК верига се завършва с помощта на шаблона на неувредена ДНК верига от делта или епсилон полимерази.
5. Лигазите омрежват новосинтезирания край на веригата.

Пигментна ксеродерма (XP)
XP е рядко наследствено заболяване при човека, което се проявява в увреждане на кожата при излагане на светлина, което в крайна сметка води до развитие на рак на кожата и смърт на пациента.
Заболяването възниква поради мутации в гени, участващи в възстановяването на NER. Например:
XPA кодира протеин, който се свързва с мястото на нараняване и подпомага сглобяването на възстановителния комплекс.
XPB и XPD, които са части от транскрипционния фактор TFIIH. Някои мутации в XPB и XPD също могат да причинят преждевременно стареене.
XPF отрязва ДНК веригата от 5" края на увреждането.

XPG реже веригата от 3" края.

Репарация на несъответствие (MMR)

Поправката на несъответствие коригира несъответстващите непокътнати бази, които не образуват нормално сдвояване на Watson-Crick (AT, C G). Такива грешки възникват по време на работата на ДНК полимераза по време на репликация.
Възстановяването на несъответствие включва ензими, участващи в възстановяването на BER и NER, както и специализирани ензими.
Синтезът на ДНК по време на възстановяването на несъответствието се извършва от ДНК полимерази делта или епсилон.
Системата за възстановяване на несъответствието участва в повишаването на точността на рекомбинацията по време на мейозата.

Възстановяване на прекъсване на ДНК

Йонизиращото лъчение и някои химикали могат да разрушат една или две вериги на ДНК.
Едноверижни прекъсвания (SSB)
Прекъсванията в една от ДНК веригите често се поправят от ензими, участващи в възстановяването на BER.
Двуверижни прекъсвания (DSB)
Има два механизма, които могат да елиминират разкъсванията на двойноверижната ДНК:
Директно свързване на счупени краища. Този процес изисква специални
ензими, които разпознават и свързват счупени краища и след това ги зашиват заедно. Ако счупената ДНК има тъпи краища и съединяването на два ДНК фрагмента става произволно, тогава това възстановяване се нарича NHEJ. Протеинът Ku е необходим за NHEJ. Ku е хетеродимерна субединица, състояща се от два протеина Ku70 и Ku80.
Грешките, възникващи по време на директно прикачване, могат да причинят транслокации.
Полинуклеотидна лигаза- възстановен единична верига ДНК прекъсвания

Хомоложна рекомбинация

Хомоложната рекомбинация е в състояние да поправи счупени краища на хромозоми, използвайки ДНК на неувреден сестрински хроматид, наличен след хромозомно дублиране.
Гените, необходими за хомоложна рекомбинация, са BRCA-1 и BRCA-2.

Конверсия на ген
Новият генен донор може да бъде:
хомоложна хромозома (по време на мейоза)
сестрински хроматид (също по време на мейоза)
дублиран ген на същата хромозома (по време на митоза)

Коригиране на грешки, дължащи се на 3'-5' екзонуклеазна активност на полимеразата по време на репликация (само при прокариоти) (мутация E. coli mutD-мутаторна промяна - субединица на ДНК-pol.III)
Тиминови димери, фотолиазен ензимен ген-phr (при нисши еукариоти)
Отстраняване на свързани алкилови и метилови групи - O-6-метилгуанин трансфераза (ada ген) - премахва O-6-метилгуанин
ексцизионно r. бази [E.coli] [човешки | разпознаване на щети XPA протеин във връзка с RPA | участва f-r transcr. TFIIH (P52, P34, P44, P62, XPB-XPD-хеликазна активност) | ERCC1-XPF, XPG – нуклеази, изрязват ДНК от двете страни на увреждането. | ДНК полимераза и спомагателни. RFC и PCNA протеини запълват празнината]
Р. азотно-основната гликозилаза премахва основната.
AP място (апуриново, апиримидиново) | AP ендонуклеазата разпознава празнината, разреза. 5' ДНК
пострепликативно r. (PRR)
SOS-р. протеини съед. с ДНК полимераза, док. ДНК се изгражда срещу увреждането. ДНК

Съкращения.
BER - Възстановяване на основна ексцизия

NER - възстановяване на нуклеотидна ексцизия
MMR - Поправка на несъответствие
NHEJ - Нехомоложно крайно свързване

Поправка на несъответствие

По време на процеса на репликация, в резултат на полимеразни грешки, могат да бъдат вмъкнати некомплементарни нуклеотиди, което може да доведе до мутации в дъщерната ДНК верига. Несдвоените бази се разпознават от ензимите за възстановяване на несъответствието и заместват несъответстващите нуклеотиди.

Ензимите на тази система осигуряват хомоложна рекомбинация, както и спиране на клетъчния цикъл в отговор на увреждане на ДНК.
Системата за възстановяване на несъответствието на E. coli, използваща протеините MutHLS, разпознава и поправя всички некомплементарни базови двойки, с изключение на C–C. В допълнение, тази система поправя малки вмъквания в една от ДНК веригите в резултат на грешки при репликация, чиято дължина не надвишава четири нуклеотида.
Обикновено E. coli има метилирана ДНК Дам метилазапо сайт GATC. Въпреки това, след като репликацията приключи, дъщерната ДНК верига остава неметилирана за известно време.
Тази система може да бъде възстановена in vitro с помощта на
ДНК с една метилирана верига като субстрат, към който се добавят пречистени протеини MutH, MutL, MutS, UvrD (хеликаза II), холоензим ДНК полимераза III, ДНК лигаза, SSB протеин и една от екзонуклеазите: ExoI, ExoVII или RecJ. Процесът на възстановяване се инициира чрез въвеждане на едноверижно прекъсване в неметилираната верига близо до частично метилираното GATC място, последвано от хидролиза на ДНК веригата и запълване на получената едноверижна празнина. В този случай протеинът MutS се свързва с неправилно сдвоени нуклеотиди. Протеинът MutL няма ензимна активност, въпреки че взаимодейства с MutS и е необходим за активирането на MutH, ендонуклеаза, която извършва разкъсвания на едноверижна ДНК. По този начин, комплексът MutS-MutL, сглобен на място на ДНК с неправилно сдвоен нуклеотид, стимулира ендонуклеазната (никазна) активност на MutH. Безклетъчната система не изисква наличието на MutH в присъствието на едноверижно прекъсване в ДНК субстрата. Системата за ремонт MutHLS може
използвайте частично метилирани GATC последователности, разположени нагоре и надолу по веригата на увредената ДНК област. В същото време, в
В допълнение към хеликаза II, изрязването на погрешно включен нуклеотид включва една от екзонуклеазите: ExoI (3'-exo), ExoVII (3'- и 5'-exo) или RecJ (5'-exo), в зависимост от местоположение на GATC сайта по отношение на коригирания нуклеотид. След изрязване на нуклеотид, получената едноверижна празнина се запълва от холоензима на ДНК полимераза III в присъствието на SSB протеин и ДНК лигаза. Трябва да се подчертае, че използването на MutH протеин и Dam метилаза за разпознаване на дъщерната верига на репликирана ДНК е уникално свойство на Грам-отрицателните бактерии. Грам-положителните бактерии не метилират ДНК вериги за целите на маркирането. Ако GATC местата са напълно метилирани, системата за възстановяване на E. coli MutHLS модифицира несъответстващите нуклеотиди на двете ДНК вериги с еднаква ефективност.
E. coli има поне още две специфични
пътища за възстановяване на несъответстващи нуклеотиди. Системата VSP (много къс път за възстановяване на кръпка) поправя некомплементарни G–T двойки, като ги замества с G–C. Смята се, че такива двойки се образуват в резултат на дезаминиране на 5-метилцитозин в местата, където C остатъците са метилирани от Dcm метилаза. С по-ниска ефективност, същата система замества G–U двойки с G–C. Друга MutY-зависима ремонтна система специално елиминира последствията от окислителното увреждане на гуанина. Ако dGTP се окислява до образуване на 8-оксо-dGTP, протеинът MutT разцепва последния, предотвратявайки включването му в ДНК. Ако въпреки това е включен срещу C остатъка, тогава Fpg гликозилазата (MutM) премахва тази модифицирана база. В случай, че 8-оксо-G остане в ДНК, в следващия кръг на репликация той се сдвоява с А и в резултат на това може да настъпи трансверсия G–C>T–A. В този случай протеинът MutY действа като ДНК гликозилаза, премахвайки А остатъка от неправилна двойка, и като АР лиаза, въвеждайки едноверижен
празнина в съседство с мястото на AP. Това е последвано от вече обсъдените по-горе процеси във връзка с функционирането на системата за ремонт на BER. Последователността от реакции, включващи MutY, също възстановява некомплементарни A–G и A–C двойки, за да образува съответно C–G и G–C двойки. Ремонтът на несъответстващите бази в еукариотите се случва, когато
участието на комплекс от протеини, подобни на бактериалната MutHLS система. Човешкият GTBP протеин е хомолог на бактериалния MutS протеин, а в дрождите Msh6 протеинът играе съответна роля. Разпознаването на несъответстващи нуклеотиди при хора се извършва от хетеродимера MSH2–GTBP. Хомолозите на MutL в клетките на S. cerevisiae са протеините MLH1 и PMS2, които също съществуват като хетеродимерни комплекси. Мутациите в гените, кодиращи тези протеини при хората, са придружени от формирането на мутационен фенотип и развитието на наследствен неполипозен рак на дебелото черво (HNPCC синдром).

Директно обезщетение

Има два основни пътя за възстановяване на алкилирани бази: възстановяване чрез изрязване на основата (BER) и възстановяване на директна ексцизия на основата. В BER, ДНК гликозилазите разцепват цитотоксични алкилирани бази в ДНК в първия етап с образуването на AP място и последващата му обработка.В случай на директно възстановяване се прилагат два метода: възстановяване чрез алкилтрансферази или окисление на алкиловата група, в и в двата случая възниква регенерация на непокътнати основи. Ако възстановяването настъпи от алкилтрансферази (при бозайниците само O6-алкилгуанин се възстановява по този път), тогава O6-алкилгуанин трансферазата (AGT) прехвърля метилова или етилова група от O6-алкилгуанин към един от собствените си цистеинови остатъци . Протеин, алкилиран в резултат на собствената си активност, е инактивиран, но може да служи като регулатор на активността на своя ген и няколко други. За разлика от суицидните О6-метилгуанин трансферази, които специфично деметилират силно мутагенни и токсични
Увреждане на O6-метилгуанин, AlkB от E. coli и неговите човешки двойници hABH2 и hABH3 окисляват метиловите групи на 1-метиладенин (1-meA) и 3-метилцитозин (3-meC) в ДНК, за да регенерират немодифицираните бази аденин и цитозин.

О6-алкилгуанин трансфераза

O6-алкилгуанинтрансферазната активност се открива в повечето организми и пречи на мутагенния ефект на O6-алкилгуанина. AGT превръща O6-алкилгуанин в гуанин чрез прехвърляне на алкилова група от ДНК към реактивен цистеинов остатък в протеина в необратима реакция.

Това ковалентно добавяне на алкилова група към цистеинов остатък инактивира ензима. Следователно AGT е самоубийствен ензим, който претърпява протеолитично разграждане след едно
реакции на трансалкилиране. Структурните изследвания разкриват, че активният център на AGT е разположен в по-голямата част от ензима на известно разстояние от ДНК-свързващото място. Смята се, че ензимът "работи" чрез механизъм за "обръщане на нуклеотиди", за да доближи субстратната основа и нуклеофилното активно място на AGT.

Значението на AGT в защитата на бозайниците от токсичните и мутагенни ефекти на алкилиращите агенти е доказано при мишки. Трансгенните мишки, свръхекспресиращи AGT, показват значително по-ниски нива на иницииране на тумор в отговор на метилиращия агент N-methyl-N-nitrosourea, докато мишки с дефицит на AGT са много по-податливи на иницииране на тумор и токсични ефекти на този агент в сравнение с немутантни мишки . AGT е важен ензим в противораковата терапия, тъй като противодейства на цитотоксичните ефекти на класа противоракови агенти хлороетилнитрозоурея (CENU), напр.
BCNU (N,N-bis(2-chloroethyl)N-nitrosourea) или темозоломид. Доказано е, че количеството, в което AGT присъства в туморите, до голяма степен определя колко благоприятен ще бъде резултатът от антитуморната терапия с CENU. CENU първоначално реагира с O6-карбонилната група на гуанина, за да образува съединението 4 , който впоследствие се превръща в N 1, O 6 -етаногуанин 5 . Съединение 5 се прегрупира в рамките на няколко часа във физиологично активен ICL 6 . AGT пречи на образуването 6 при взаимодействие с 4 или 5 , подновяване на гуанин или образуване на адукт ДНК-протеин 8 . Получено е експериментално потвърждение за образуване на адукт 8 , но е изолиран в твърде малко количество за подробното му описание. По време на биохимично изследване на този проблем беше въведен N1,O6-етаноксантин
9 като стабилен аналог 5 в ДНК. Етаноксантин 9 реагира с AGT, за да образува стабилен адукт ДНК-протеин 7 . Този подход позволява образуването на ковалентно свързан AGT-ДНК адукт 10 в големи количества, които могат да се използват за определяне на структурата на AGT, свързан с ДНК. Взаимодействието на AGT и алкилиращата терапия доведе до търсенето на инхибитори на AGT, които могат да се използват в терапията на рак заедно с алкилиращи агенти. Към днешна дата са създадени инхибитори, главно гуанинови производни със заместители на позиция O 6. О6-бензилгуанин 2 е установено, че е типичният AGT инхибитор, с който се сравняват новите молекули. Ефективността на O 6 -BzG за повишаване на цитотоксичността на CENU е демонстрирана при животински модели. Ограничаващият фактор на този терапевтичен подход е токсичността за здрави органи, отчасти за костния мозък. някои
Група учени се стремят да заобиколят този проблем, като генерират вариант на ATG, който е устойчив на инхибиране на O 6 -BzG, който може да се използва за защита на костния мозък чрез генен трансфер.

AlkB, hABH2 и hABH3 оксидоредуктази

Друг начин за директно възстановяване на алкилирани основи е окисляването на алкиловата група с регенериране на непокътната азотна основа. Ензимът AlkB в Escherichia coli и два човешки аналога hABH2 и hABH3 специфично деметилират 1-метиладенин и 3-метилцитозин в ДНК. Но за разлика от AGT, тези ензими имат субстратна специфичност, насочена към повърхността на базовите двойки G:C и A:T. Увреждане на 1-алкиладенин
и 3-метилцитозин се образуват, когато аденинът и цитозинът са в едноверижна структура (по време на репликация или транскрипция) и са субстрати за AlkB, hABH2 и hABH3. Те окисляват метиловите групи на 1-метиладенин (1-меА) и 3-метилцитозин (3-меС) в ДНК, за да регенерират азотните бази аденин и цитозин. Доказано е също, че AlkB предпазва от токсични увреждания - свързва се с етилова група и превръща 1-етиладенин в аденин в ДНК, произвеждайки ацеталдехид в резултат на реакцията. По този начин се поправя увреждането на известния мутагенен и канцерогенен етиленов оксид, който се образува ендогенно по време на метаболизма на етилена и също така се използва широко като фумигант за стерилизация. Хидроксиетил адукти, генерирани от етилен оксид, се намират в клетъчната ДНК. Други малки алкилиращи епоксиди също се използват в големи количества в химическото производство. Доказано е, че AlkB намалява токсичните ефекти на агентите, генериращи хидроксиетилен, увреждащи ДНК.
пропилови и хидроксипропилови адукти. AlkB възстановява алкилираните трифосфати с 1-me-dATP активно, но неефективно. Предполага се, че тази способност може да намали нивото на включване на алкилирани трифосфати по време на синтеза на ДНК; в допълнение, фрагментът Klenow на ДНК полимераза I в Е. coli може да използва 1-me-dATP като прекурсор за синтеза на ДНК in vitro. Човешките ензими hABH2 и hABH3 също деметилират 1-метиладенинови остатъци в поли(dA), но са неефективни при къси субстрати. По този начин, hABH3 има много ниска активност върху d(Tp1-meApT) тримера, докато не е открита активност за hABH2.

AlkB и неговите човешки двойници са част от β-кетоглутарат/Fe(II)-зависимото суперсемейство на диоксигеназите и процесът на възстановяване включва комбинация от декарбоксилиране на β-кетоглутарат и окислително деметилиране на увредената основа. 1-meA и 3-meC лезиите се образуват главно в едноверижна ДНК и вероятно
се появяват в репликационната вилка и в активно транскрибираните гени, където могат да блокират ДНК и РНК полимеразите. Всъщност, AlkB, hABH2 и hABH3 поправят тези лезии в едноверижна ДНК, но поправката се извършва и върху олигонуклеотиди, закалени към комплементарната верига след алкилиране. Ефективността на възстановяването на 1-метиладенин от AlkB не зависи от полинуклеотидната структура, но е необходимо присъствието на нуклеотидна 5"-фосфатна група. Също така, човешките ензими hABH2 и hABH3 деметилират 1-метиладенинови остатъци в поли(dA); те са били неефективни върху къси субстрати.В допълнение, лезиите, съдържащи положителен заряд (рибонуклеозидите 1-meA и 3-meC имат pKa = 9,3 и 9,6, съответно) са по-добре поправени от незаредените бази (1-meG и 3-meT). Въпреки това, тъй като 1-meG (и в по-малка степен 3-meT) бяха поправени от AlkB, тогава официалният положителен заряд на основата не е необходимо условие за функционирането на AlkB. От тази гледна точка
Не е ясно дали този резултат се дължи на това, че положително заредените бази се разпознават по-добре чрез електростатични взаимодействия с AlkB или дали положително заредените бази просто правят ДНК по-добра напускаща група след хидроксилиране на метиловата група.

Съкращения:

• AGT - алкилгуанин трансфераза
• BER - възстановяване на база ексцизия
• ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина
• РНК - рибонуклеинова киселина
• BCNU - N,N-бис(2-хлороетил)N-нитрозокарбамид
• CENU - хлоретилнитрозокарбамид
• O 6 -BzG - O 6 -бензилгуанин
• 1-меА - 1-метиладенин
• 1-meG - 1-метилгуанин
• 3-meC - 3-метилцитозин
• 3-meT - 3-метилтимин

Литература:

» Орландо Д. Шарер (2003) Angew. Chem. Вътр. Изд. 42, 2946-2974
» James C. Delaney и John M. Essigmann Мутагенеза, генотоксичност и възстановяване на 1-метиладенин, 3-алкилцитозини, 1-метилгуанин и 3-метилтимин в alkB Escherichia coli
» Pertti Koivisto, Tod Duncan, Tomas Lindahl и Barbara Sedgwick Минимален метилиран субстрат и разширен субстратен диапазон на протеин AlkB на Escherichia coli, 1-метиладенин-ДНК диоксигеназа*
» Дънкан, Т., Тревик, С. К., Койвисто, П., Бейтс, П. А., Линдал, Т. и Седжуик, Б. (2002) Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 99, 16660-16665. 5. Aas, P.A., Otterlei, M., Falnes, P.O., Vagbo, C.B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E. и др. ал. (2003) Nature 421, 859-863.
Холис, Т., Лау, А. и Еленбергер, Т. (2000) Mutat. Рез. 460, 201-210
" Daniels, D. S. и Tainer, JA (2000) Mutat. Рез. 460, 151-163
" Trewick, S.C., Henshaw, T.F., Hausinger, R.P., Lindahl, T. и Sedgwick, B. (2002) Nature 419, 174-178
» Falnes, P. O., Johansen, R. F. и Seeberg, E. (2002) Nature 419, 178-181
» Дънкан, Т., Тревик, С. К., Койвисто, П., Бейтс, П. А., Линдал, Т. и Седжуик, Б. (2002) Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 99, 16660-16665
» Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E. и Krokan , H. E. (2003) Nature 421, 859-863
» Аравинд, Л. и Кунин, Е. В. (2001) Биология на генома 2, 0007.1-0007.8
" Bodell, W. J. и Singer, B. (1979) Биохимия 18, 2860-2863
» Boiteux, S. и Laval, J. (1982) Biochimie (Париж) 64, 637-641
» Larson, K., Sahm, J., Shenkar, R. и Strauss, B. (1985) Mutat. Рез. 150, 77-84
» Dinglay, S., Trewick, S. C., Lindahl, T. и Sedgwick, B. (2000) Genes Dev. 14, 2097-2105

Възстановяване на прекъсване на ДНК

Фотореактивиране

Поглъщането на енергията на ултравиолетовите лъчи от ДНК молекулите води до образуването на различни видове увреждания. Въпреки че могат да се появят скъсвания на единични и двойни вериги и ДНК-протеинови кръстосани връзки, по-голямата част от UV-индуцираните увреждания се дължат на модификация на азотни бази, с образуването на циклобутан пиримидинови димери (CPD) и пиримидин-пиримидонови фотопродукти (6 -4PP), които са най-често срещаните видове фотоповреди.

Пиримидиновите димери са инхибитори както на репликацията, така и на транскрипцията, което забавя растежа и води до мутагенеза по време на репликация на ДНК, ако такова увреждане остане непоправено.

За да премахнат увреждането на ДНК, предизвикано от светлина, много организми използват ензими, които се свързват специфично с CPD (CPD фотолиаза) или 6-4PP (6-4PP фотолиаза) и коригират тези увреждания. CPD фотолиазите се намират в бактерии, гъбички, растения, безгръбначни и много гръбначни; 6-4PP фотолиази се срещат досега само в Drosophila, копринени буби, Xenopus laevis и гърмящи змии, но не и в Escherichia coli или дрожди. Фотолиазите не са открити при хора. Фотолиазите съдържат FAD като каталитичен кофактор и допълнителен хромофор като антена за събиране на светлина.

Допълнителните хромофори са или 5,10-метенилтетрахидрофолат (MTHF), или 8-хидрокси-5-деазорибофлавин (8-HDF), с максимуми на абсорбция при дължини на вълните съответно 380 и 440 nm. Кристалните структури на CPD фотолиазите от E. coli и Anacystis nidulans предполагат, че за да свържат ДНК, ензимите въртят пиримидиновия димер от дуплекса в ямка, съдържаща каталитичния кофактор. След това циклобутановият пръстен се разцепва чрез индуциран от светлина трансфер на електрони. CPD фотолиазите селективно разпознават CPD, подобно на ДНК-свързващите протеини. Бялата светлина или UV-B радиацията индуцира експресията на CPD фотолиази. За разлика от CPD фотолиазите, 6-4PP фотолиазите са стабилно експресирани и не се регулират нито от бяла светлина, нито от UV-B радиация.

Схематично представяне на фотореактивацията в хроматина. Gitone октамерите са сини, ДНК е черна. Фотолиазата се свързва с циклобутан пиримидиновите димери (CPD), върти пиримидиновия димер и регенерира нативните пиримидини в реакция, зависима от светлината. Фотолиазата преференциално възстановява CPDs в свързващата ДНК. Ремонтът в нуклеозомите е бавен и вероятно се улеснява от динамичните свойства на нуклеозомите, които придвижват увреждането на ДНК към линкерната ДНК област.

Клас CDP-специфични фотолиази от микроорганизми, определени като фотолиази от клас I, е първият характеризиран член на семейството на фотолиазите. Наскоро беше открит тясно свързан клас от 6-4 фотолиази, специфични за фотопродукта; членове на това семейство са открити в Drosophila melanogaster, Xenopus laevis и Arabidopsis thaliana. Криптохромите, които са фоторецептори за виолетовата част от светлинния спектър, намиращи се в растения и други организми, също са тясно свързани с фотолиазите от клас I.

По-далечно свързано семейство CPD фотолиази, наречено клас II фотолиаза, е идентифицирано в редица видове, включително животни, Archaebacterium, Eubacterium и висши растения. Доказано е, че всички характеризирани фотолиази съдържат намален FAD и повечето съдържат вторични хромофори, в зависимост от вида, или на MTHF, или на 8-HDF. Подобен механизъм на реакция е предложен и за двата класа CPD фотолиази. MTHF или 8-HDF хромофорът е като антена, която абсорбира виолетова светлина и използва абсорбираната енергия за регенериране на FADH-.

Съставът на растителния фотолиазен кофактор не е напълно разбран, въпреки че наскоро беше показано, че CPD фотолиазите от Arabidopsis, съдържащи само FADH, имат ензимна активност.

Литература:

» Fritz Thoma, Light and dark in chromatin repair: repair of UV-induced DNA lesions by photolyase and nucleotide excision repair, Institut fur Zellbiologie, ETH-Zurich, Honggerberg, CH-8093 Zurich, Switzerland
» Характеризиране на фотолиазните ензими на Arabidopsis и анализ на тяхната роля в защитата от ултравиолетово-B лъчение, Wanda M. Waterworth 1, Qing Jiang, Christopher E. West, M. Nikaido и Clifford M. Bray

История на откритието

Увреждане на едноверижна и двуверижна ДНК

Изследването на репарацията започва с работата на А. Келнер (САЩ), който открива феномена на фотореактивацията (PR) - намаляване на увреждането на биологични обекти, причинено от ултравиолетови (UV) лъчи с последващо излагане на ярка видима светлина ( лека репарация).

Ремонт на ексцизия

Пострепликативното възстановяване е открито в клетките E.Coli, неспособни да разцепват тиминовите димери. Това е единственият вид ремонт, който няма етап на разпознаване на повреда.

Бележки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е „ремонт на ДНК“ в други речници:

Поправяне на дефекти в ДНК в резултат на мутация или рекомбинация. Осъществява се от система от репаративни ензими, едни от които установяват мястото на увреждането, други го „изрязват“, трети синтезират увредените участъци, а трети... ... Речник по микробиология

възстановяване на ДНК- - коригиране на "грешки" в първичната структура на ДНК в резултат на действието на специални ремонтни ензими ... Кратък речник на биохимичните термини

възстановяване на ДНК- - Биотехнологични теми EN Ремонт на ДНК ... Ръководство за технически преводач

възстановяване на ДНК- DNR reparacija statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis DNR struktūros atsikūrimas po pažeidimo. атитикменис: англ. Ремонт на ДНК рус. ремонт на ДНК... Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

РЕМОНТ на ДНК- Възстановяване на оригиналната структура в ДНК молекулата, т.е. правилна нуклеотидна последователност... Термини и определения, използвани в развъждането, генетиката и репродукцията на селскостопанските животни

възстановяване на ДНК- * ДНК възстановяване * ДНК възстановяване ензимна корекция на грешки в нуклеотидната последователност на ДНК молекула. Механизми на ДНК стр. защитава генетичната информация на тялото от увреждане, причинено от мутагени на околната среда (напр. ултравиолетови,... ...

ДНК-зависима ДНК полимераза ДНК полимераза- ДНК зависима ДНК полимераза, ДНК полимераза * ДНК зависима ДНК полимераза, ДНК полимераза * ДНК зависима ДНК полимераза или ДНК полимераза ензим, който катализира полимеризацията (виж) на дезоксирибонуклеозид трифосфати в полимер... ... Генетика. енциклопедичен речник

- (от късно лат. reparatio възстановяване), характерно за всички клетки на живи организми, възстановяване на оригиналната (нативна) структура на ДНК в случай на нейното нарушение. Увреждането на структурата на ДНК може да доведе до блокиране на репликацията на ДНК (смъртоносно... ... Химическа енциклопедия

Ремонт: Ремонтът на ДНК е способността на клетките да поправят химически увреждания и счупвания в ДНК молекулите. Репарациите са форма на финансова отговорност на субект на международното право за вреди, причинени в резултат на международно... ... Wikipedia

Система за откриване и поправяне на вмъквания, пропуски и неправилно сдвояване на нуклеотиди, които възникват по време на процеса на репликация и рекомбинация на ДНК, както и в резултат на определени видове увреждане на ДНК. Самият факт на неправилно сдвояване не позволява... ... Уикипедия

Книги

• ДНК метилиране в растенията. Механизми и биологична роля, Б. Ф. Ванюшин. Това четиво от един от пионерите и известни световни лидери в изследването на метилирането на ДНК в различни организми излага подробно текущото състояние на общия биологичен проблем...

Увреден по време на нормална биосинтеза на ДНК в клетката или в резултат на излагане на физични или химични реагенти. Осъществява се от специални ензимни системи на клетката. Редица наследствени заболявания (напр. пигментна ксеродерма) са свързани с нарушения на възстановителните системи.

История на откритието

Изследването на възстановяването започва с работата на Алберт Келнер (САЩ), който през 1948 г. открива феномена на фотореактивацията - намаляване на увреждането на биологични обекти, причинено от ултравиолетови (UV) лъчи при последващо излагане на ярка видима светлина ( лека репарация).

Р. Сетлоу, К. Рупърт (САЩ) и други скоро установиха, че фотореактивацията е фотохимичен процес, който протича с участието на специален ензим и води до разделяне на тиминови димери, образувани в ДНК по време на абсорбцията на UV квант.

По-късно, при изучаване на генетичния контрол на чувствителността на бактериите към UV светлина и йонизиращо лъчение, беше открито тъмен ремонт- способността на клетките да елиминират увреждане на ДНК без участието на видима светлина. Механизмът на тъмно възстановяване на бактериални клетки, облъчени с ултравиолетова светлина, е предсказан от A. P. Howard-Flanders и експериментално потвърден през 1964 г. от F. Hanawalt и D. Petitjohn (САЩ). Доказано е, че при бактериите след облъчване увредените ДНК участъци с променени нуклеотиди се изрязват и ДНК се ресинтезира в получените празнини.

Системите за възстановяване съществуват не само в микроорганизмите, но и в животинските и човешките клетки, в които те се изследват в тъканни култури. Известно е наследствено заболяване на човека - пигментна ксеродерма, при което възстановяването е нарушено.

Източници на увреждане на ДНК

Основни видове увреждания на ДНК

Структурата на репарационната система

Всяка ремонтна система включва следните компоненти:

• ДНК хеликазата е ензим, който "разпознава" химически променени места във верига и прекъсва веригата близо до увреждането;
• ДНКаза (дезоксирибонуклеаза) е ензим, който "разрязва" 1 ДНК верига (нуклеотидна последователност) при фосфодиестерна връзка и премахва увредения участък: екзонуклеазата работи върху крайни нуклеотиди 3` или 5`, ендонуклеаза - върху нуклеотиди, различни от крайните;
• ДНК полимеразата е ензим, който синтезира съответния участък от ДНК веригата, за да замени отстранения;
• ДНК лигазата е ензим, който затваря последната връзка в полимерна верига и по този начин възстановява нейната непрекъснатост.

Видове репарация

Директно обезщетение

Директното възстановяване е най-простият начин за елиминиране на увреждане в ДНК, което обикновено включва специфични ензими, които могат бързо (обикновено в една стъпка) да елиминират съответното увреждане, възстановявайки оригиналната структура на нуклеотидите. Такъв е случаят, например, с O6-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза, която премахва метилова група от азотна основа върху един от нейните собствени цистеинови остатъци.

Ремонт на ексцизия

Ексцизионният ремонт (англ. excision - рязане) включва отстраняване на повредени азотни бази от ДНК и последващо възстановяване на нормалната структура на молекулата по протежение на комплементарната верига. Ензимната система премахва къса едноверижна последователност от двойноверижна ДНК, съдържаща несъответстващи или повредени бази, и ги замества чрез синтезиране на последователност, комплементарна на останалата верига.

Ексцизионното възстановяване е най-разпространеният метод за възстановяване на модифицирани ДНК бази. Основава се на разпознаването на модифицирана база от различни гликозилази, които разцепват N-гликозидната връзка на тази основа със захарно-фосфатния скелет на ДНК молекулата. В същото време има гликозилази, които специфично разпознават наличието на определени модифицирани бази в ДНК (хидроксиметилурацил, хипоксантин, 5-метилурацил, 3-метиладенин, 7-метилгуанин и др.). За много гликозилази вече е описан полиморфизъм, свързан със заместването на един от нуклеотидите в кодиращата последователност на гена. Редица изоформи на тези ензими са свързани с повишен риск от рак [Chen, 2003].

Високата стабилност на ДНК се осигурява не само от запазването на нейната структура и високата точност на репликация, но и от наличието на специални системи в клетките на всички живи организми репарации, елиминирайки увреждането на ДНК, което възниква в него.

Действието на различни химикали, йонизиращо лъчение и ултравиолетово лъчение може да причини следните увреждания на структурата на ДНК:

· увреждане на единични бази (дезаминиране, водещо до превръщане на цитозин в урацил, аденин в хипоксантин; алкилиране на основи; включване на базови аналози, вмъкване и изтриване на нуклеотиди);

· увреждане на базови двойки (образуване на тиминови димери);

· прекъсвачи (единични и двойни);

· образуване на напречни връзки между базите, както и ДНК-протеинови напречни връзки.

Някои от тези нарушения могат да възникнат и спонтанно, т.е. без участието на увреждащи фактори.

Всеки вид увреждане води до нарушаване на вторичната структура на ДНК, което причинява частично или пълно блокиране на репликацията. Такива конформационни смущения служат като цели за възстановителни системи. Процесът на възстановяване на структурата на ДНК се основава на факта, че генетичната информация е представена в ДНК в две копия - по едно във всяка от нишките на двойната спирала. Благодарение на това увреждането в една от веригите може да бъде отстранено чрез ремонтен ензим и този участък от веригата се ресинтезира в нормалната си форма благодарение на информацията, съдържаща се в неувредената верига.

Понастоящем са идентифицирани три основни механизма на възстановяване на ДНК: фотореактивиране, изрязване и пост-репликативно възстановяване. Последните два вида се наричат ​​още тъмна поправка.

Фотореактивиранесе състои от смилане от ензим фотолиаза, активирани от видима светлина, тиминови димери, които се появяват в ДНК под въздействието на ултравиолетова радиация.

Ексцизиярепарацията се състои от разпознаване на увреждане на ДНК, изрязване на увредената област, ресинтез на ДНК с помощта на шаблона на непокътната верига, възстановяване на непрекъснатостта на веригата на ДНК. Този метод се нарича още ремонт от типа ексцизия-замяна, или по-образно, механизмът “cut-patch”. Възстановяването чрез ексцизия е многоетапен процес и се състои от:

1) „признаване“ на щета;

2) срязване на една ДНК верига близо до увреждането (разрез);

3) отстраняване на увредената зона (изрязване);

4) ресинтез на ДНК на мястото на изтритото място;

5) възстановяване на непрекъснатостта на ремонтираната верига поради образуването на фосфодиестерни връзки между нуклеотидите
(Фигура 6.2)

Ориз. 6.2 Схема за ремонт на ексцизия

Репарацията започва с анексията ДНК-N-гликозилазикъм повредената основа. Има много ДНК N-гликозилази, специфични за различни модифицирани бази. Ензимите хидролитично разцепват N-гликозидната връзка между модифицираната основа и дезоксирибозата, което води до образуването на АР (апуриново-апиримидиново) място в ДНК веригата (първа стъпка). Ремонтът на AP сайт може да се извърши само с участието на ДНК инсертази, който добавя основа към дезоксирибозата според правилото за комплементарност. В този случай не е необходимо да се отрязва ДНК веригата, да се изрязва неправилният нуклеотид и да се поправя счупването. За по-сложно увреждане на структурата на ДНК е необходимо участието на целия комплекс от ензими, участващи в възстановяването (фиг. 6.2.): АР ендонуклеазаразпознава AP мястото и отрязва ДНК веригата близо до него (етап II). Веднага щом възникне прекъсване във веригата, АР екзонуклеаза, който премахва ДНК фрагмента, съдържащ грешката (етап III). ДНК полимераза bзапълва възникналата празнина според принципа на допълване (етап IV). ДНК лигазасвързва 3¢-края на новосинтезирания фрагмент с главната верига и завършва възстановяването на щетите (етап V).

Пострепликативнавъзстановяването се активира в случаите, когато възстановяването чрез ексцизия не може да се справи с елиминирането на всички увреждания на ДНК преди нейната репликация. В този случай възпроизвеждането на увредени молекули води до появата на ДНК с едноверижни пропуски и естествената структура се възстановява по време на рекомбинация.

Вродените дефекти на възстановителната система са причина за такива наследствени заболявания като пигментна ксеродерма, атаксия-телеангиектазия, трихотиодистрофия, прогерия.

РЕМОНТ на ДНК

Репарационни системи

2 Ремонт на ексцизия. Примери и видове

3 Поправка на грешки при репликация на ДНК

4 Рекомбинантно (пострепликативно) възстановяване при бактерии

5 SOS ремонт

Системите за възстановяване на ДНК са доста консервативни в еволюцията от бактериите до хората и са най-изучени при E. coli.

Известни са два вида репарация:директен и ексцизионен

Директно обезщетение

Директното възстановяване е най-простият начин за елиминиране на увреждане в ДНК, което обикновено включва специфични ензими, които могат бързо (обикновено на един етап) да елиминират съответното увреждане, възстановявайки оригиналната структура на нуклеотидите.

1. Това работи, напр.О6-метилгуанин ДНК метилтрансфераза

(самоубийствен ензим), който премахва метилова група от азотна основа върху един от нейните собствени цистеинови остатъци

В E. coli за 1 минута могат да се синтезират до 100 молекули от този протеин. Протеин, подобен по функция на висшите еукариоти, очевидно играе важна роля в защитата срещу рак, причинен от вътрешни и външни алкилиращи фактори.

ДНК инсертаза

2. ДНК инсертази

фотолиаза

3. Тиминовите димери са „разединени“ от пряка репарацияВ ролитефотолиаза, извършвайки съответната фотохимична трансформация. ДНК фотолиазите са група светлинно активирани ензими с дължина на вълната 300 - 600 nm (видима област), за които имат специален светлочувствителен център в структурата си.

Те са широко разпространени в природата и се намират в бактерии, дрожди, насекоми, влечуги, земноводни и хора. Тези ензими изискват различни кофактори (FADH, тетрахидрофолиева киселина и др.), участващи във фотохимичното активиране на ензима. Фотолиазата на Е. coli е протеин с молекулно тегло 35 kDa, тясно свързан с олигорибонуклеотид с дължина 10-15 нуклеотиданеобходими за ензимната активност.

Примери за директно обезщетение

1. Метилирана основа O 6-mG диметилиран от ензима метилтрансферазаО6-метилгуанин ДНК метилтрансфераза (суициден ензим), който прехвърля метилова група към един от остатъците си

цистеин

2. AP местата могат да бъдат поправени чрез директно вкарване на пурини с участието на ензими, т.нарДНК инсертази(от английското вмъкване - вмъкване).

ДИАГРАМА НА ПРИМЕР ЗА ДИРЕКТНО ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ПОВРЕДИ В ДНК – метилирана база О6- mGдеметилиран от ензима метилтрансфераза, който прехвърля метилова група към един от неговите цистеинови аминокиселинни остатъци.

3. Фотолиазата се прикрепя към тиминовия димер и след облъчване на този комплекс с видима светлина (300-600 nm), димерът се разплита

ДИАГРАМА НА ПРИМЕР ЗА ДИРЕКТНО ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ПОВРЕДИ В ДНК – фотолиаза

се прикрепя към тиминовия димер и след облъчване с видимия спектър на светлината, този димер се разплита

Ремонт на ексцизия

(от английски excision - изрязване).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Ексцизионният ремонт включва изтриванеувредени азотни бази от ДНК и последващо възстановяваненормална молекулярна структура.

МЕХАНИЗЪМ

Ексцизионното възстановяване обикновено включва няколко ензима, а самият процес включва

не само повредени ,

но и съседните на него нуклеотиди .

УСЛОВИЯ

Възстановяването чрез ексцизия изисква втора (комплементарна) верига на ДНК. Обща опростена диаграма на възстановяване чрез ексцизия е показана на фиг. 171.

СТЪПКИ

Първата стъпка в ремонта чрез ексцизия е отстраняването на необичайни азотни основи. Катализира се от групатаДНК-н-гликозилаза- ензими, които разцепват гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотната основа.

ВАЖНО СЪОБЩЕНИЕ:

UчовекДНК-н-гликозилазиимат висока субстратна специфичност: различни ензими от това семейство разпознават и отрязват различни аномални основания(8-оксогуанин, урацил, метилпурини и др.).

UбактерииДНК-н-гликозилазиняма такава субстратна специфичност

ОБЩИ ЕНЗИМИ ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ЕКЗИЦИЯТА

ИМЕ	ФУНКЦИЯ	МЕХАНИЗЪМ
ДНК-н-гликозилази	изрязване на анормални азотни бази	разцепва гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотна основа
АР ендонуклеаза	създава условия за работа на следващия ензим - екзонуклеази	разрушава захарно-фосфатния скелет на ДНК молекулата на мястото на АР
екзонуклеаза	освобождава няколко нуклеотида	последователно отцепва няколко нуклеотида от повреден участък на една ДНК верига

СПЕЦИФИЧНИ ПОСЛЕДВАЩИ СТЪПКИ НА ТОЗИ МЕХАНИЗЪМ:

В резултат на действието ДНК- н-гликозилазаобразува се АР място, което се атакува от ензима АР ендонуклеаза. Той разрушава захарно-фосфатния гръбнак на молекулата на ДНК в AP мястото и по този начин създава условия за работата на следващия ензим - екзонуклеази, който последователно отцепва няколко нуклеотида от увредения участък на една ДНК верига.

В бактериалните клетки освободеното място се запълва със съответните нуклеотиди с участието ДНК полимераза I, ориентиран към втората (комплементарна) верига на ДНК.

Тъй като ДНК полимераза I е способна да удължи 3" края на една от веригите на мястото на прекъсване на двойноверижна ДНК и да отстранява нуклеотиди от 5" края на същото прекъсване,

тези. осъзнавам „ник излъчване“ , този ензим играе ключова роля в възстановяването на ДНК. Извършва се окончателно зашиване на ремонтираните участъци ДНК лигаза.

В еукариотни (бозайникови) клетки

Ексцизионното възстановяване на ДНК в клетките на бозайниците е придружено от рязък скок в активността на друг ензим -поли АдR-рибоза полимераза . Това се случва ADP-рибозилиране на хроматинови протеини(хистони и нехистонови протеини), което води до отслабване на връзката им с ДНК и отваря достъп до възстановителни ензими.

Донор ADP-рибозадейства в тези реакцииNAD+, чиито резерви са силно изчерпани по време на ексцизионно възстановяване на щети, причинени от рентгеново облъчване:

Отрицателно заредени остатъци ADP-рибозаот вътрешния състав на молекулата NAD+добавяне чрез радикалглутаминкиселина или фосфосеринкъм хроматиновите протеини, което води до неутрализиране на положителните заряди на тези протеини и отслабване на контакта им с ДНК.

КАКВО Е ГРУПА ЕНЗИМИ

ДНК гликозилази

разцепва гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотната основа

което води до изрязване на анормални азотни бази

ДНК гликозилази участващи в елиминирането на окислителното увреждане на ДНК в клетките прокариоти и еукариоти, са много разнообразни и се различават по субстратна специфичност, пространствена структура и методи на взаимодействие с ДНК.

Най-изследваните ДНК гликозилази включват:

ендонуклеаза III(ЕндоIII),

образува амидопиримидин ДНК гликозилаза (Fpg),

Мут ТИ

Мут Йколи.

Ендонуклеаза IIIE. coli "разпознава" и специфично разцепва ДНК окислени пиримидинови бази.

Този ензим е мономерен глобуларен протеин, състоящ се от 211 аминокиселиниостатъци (моларна маса 23,4 kDa). Генът, кодиращ Endo III, е секвениран и е определена неговата нуклеотидна последователност. Ендо III е желязо-сярен протеин [(4 Fe-4S )2+ протеин] с елемента надвторична структураТип "гръцки ключ" (спирала - фиби - спирала), служещи за свързване с ДНК. Ензими с подобна субстратна специфичност и подобни аминокиселинни последователности също са изолирани от говежди и човешки клетки.

Образувайте амидо пиридин ДНК гликозилаза E. coli "разпознава" и разцепва окислените хетероциклични съединения от ДНК пуринови бази .

СХЕМА НА ЕКЗИЗИОНЕН ВЪЗСТАНОВЕН ЕТАП 1

ДНКн

СХЕМА ЗА РЕМОНТИРАНЕ НА ЕКЗЦИЗИЯ

1 ДНКнгликозидазата премахва повредената основа

АР ендонуклеазата разрушава ДНК

2 Екзонуклеазата премахва определен брой нуклеотиди

3 ДНК полимераза запълва освободената област с комплементар

Мононуклеотиди

ДНК лигаза зашива поправената ДНК верига заедно

Мут Т- малък протеин с молекулно тегло 15 kDa с нуклеозид трифосфатазна активност, която е предимно хидролизира dGTP до dGMP и пирофосфат.

Биологичната роля на Mut T е да предотврати образуването на неканонични двойки по време на репликацияA:GИ A: 8-оксо-G.

Такива двойки могат да се появят, когато окислена форма

dGTP (8-оксо-dGTP)става субстратДНК полимерази.

Мут Тхидролизира 8-оксо-dGTP10 пъти по-бързо от dGTP.

Това го прави 8-оксо-dGTPнай-предпочитаният субстратМътTи обяснява неговата функционална роля.

Мут Йе специфична аденин ДНК гликозилаза, която разцепва N-гликозидната връзка между аденин и дезоксирибоза аденозин,образувайки неканонична двойка с гуанин.

Функционалната роля на този ензим е да предотвратява мутация

T:A - G:A от разцепване на непокътнатия остатък аденинот базова двойка А: 8-оксо-G.

Възстановяване на нуклеотидна ексцизия

(АТФ-зависим механизъм за отстраняване на увреждане на ДНК)

Напоследък при възстановяването чрез ексцизия специално внимание се обръща на АТФ-зависимия механизъм за отстраняване на увреждане от ДНК. Този тип ексцизионно възстановяване се нарича нуклеотидно ексцизионно възстановяване (NER).

Включва ДВА ЕТАПА :

1. отстраняване от ДНКолигонуклеотидни фрагменти съдържащи щети и

Ексинуклеаза

2. последваща реконструкция на ДНК веригата с участието на комплекс от ензими (нуклеази, ДНК полимерази, ДНК лигази и др.).

Настъпва отстраняване на ДНК фрагмент от двете страни на повредениянуклеотид. Дължината на отстранените олигонуклеотидни фрагменти е различна при прокариотите и еукариотите.

Отстраняване на ДНК фрагмент от прокариоти

По този начин, в E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, фрагмент дължина 12-13 нуклеотиди,

Отстраняване на ДНК фрагмент в еукариоти

а при дрождите, земноводните и хората – фрагмент, състоящ се от 24-32 нуклеотиди.

Ексинуклеаза– ензим, който премахва ДНК фрагменти

Разцепването на ДНК фрагмент се извършва от ензимексинуклеаза(ексцинуклеаза). В E. coli този ензим се състои от 3 различни протомера -

uvrA

увр Б

uvr C

всеки от които изпълнява специфична функция по време на ексцизионно разцепване на ДНК фрагмент. Имената на тези протеини са дадени от първите букви на думите"ултра виолетов ремонт".

Протомер uvr Aима АТФ-азна активност, свързва се с ДНК под формата на димер, извършвайки

първоначално разпознаване на щети и

връзванеувр Б

Протомер uvr Bима:

1 . Латентен АТФазна и латентна хеликаза активност, необходими за промяна на конформациите и разплитане на двойната спирала на ДНК;

2. Ендонуклеаза активност, разцепвайки междунуклеотидната (фосфодиестерна) връзка отZ"-крайнащърбен фрагмент.

Протомер uvr Cдейства като ендонуклеаза, въвеждайки прекъсване в ДНК веригата, с която се ремонтира5" завършваизрязан фрагмент.

По този начин, протомериuvr A, uvr B, uvr Cвзаимодействат с ДНК в специфична последователност, осъществявайки АТФ-зависима реакцияразцепване на олигонуклеотиден фрагмент от ДНК веригата, която се ремонтира.

Получената празнина в молекулата на ДНК се възстановява с участието на ДНК полимераза I и ДНК лигаза. Модел на ексцизионно възстановяване, включващ горните ензими, е показан на фиг. 172.

Възстановяване чрез ексцизия при хора

Ексцизионните ремонти при хора също са зависими от АТФ и включваттри основни етапа :

разпознаване на щети,

рязане на двойна ДНК верига

редуктивен синтез и

лигиране на ремонтираната нишка.

Въпреки това възстановяването на човешката ДНК включва

25 различни полипептида ,

16 от които участват в разцепването на олигонуклеотидния фрагмент, като са протомериексинуклеази,

и останалото 9 осъществяват синтеза на поправената част от молекулата.

В системата за възстановяване на ДНК при хората, транскрипционните протеини играят много важна роля -

РНК полимераза II И

TF Пон- един от шестте основни транскрипционни фактора еукариоти.

Трябва да се отбележи, че ексцизионното възстановяване при прокариоти, както и при еукариоти, зависи от функционалното състояние на ДНК:

Транскрибираната ДНК се поправя по-бързо

отколкото транскрипционно неактивен.

Това явление се обяснява със следните фактори:

структура на хроматина,

хомология на веригите на транскрибираните ДНК участъци,

ефектът от увреждане на веригата и влиянието му върху РНК полимеразата.

ВАЖНО СЪОБЩЕНИЕ:

ДНК КОДИРАЩА ВЕРИГА (верига за съхранение на информация)

ДНК МАТРИЧНА ВЕРИГА ​​(информацията се копира от нея)

Известно е, че такива големи щети като образуване на тиминови димери, блокират транскрипцията както при бактерии, така и при хора, ако се появят на матрична веригаДНК (увреждане на кодираневериги не влияяткъм транскрипционния комплекс). РНК полимеразата спира на мястото на увреждане на ДНК и блокира функционирането на транскрипционния комплекс.

Фактор на свързване на транскрипция и възстановяване (TRCF) .

В E. coli повишеното възстановяване на транскрипцията се медиира от един специален протеин -транскрипционно-възстановителен свързващ фактор (TRCF) .

Този протеин насърчава :

1. отделяне на РНК полимераза от ДНК

2. едновременно стимулира образуването на протеинов комплекс,

Извършване на ремонт на увредената зона.

След като възстановяването приключи, РНК полимеразата се връща в първоначалната си позиция и транскрипцията продължава (виж фигурата).

Така че общата схема на ексцизия ремонт

1. ДНК-N -гликозилазата премахва увредената основа

2. АР ендонуклеазата разкъсва ДНК веригата

3. Екзонуклеазата премахва определен брой нуклеотиди

4. ДНК полимеразата запълва освободената зона

Допълнителни нуклеотиди

5. ДНК лигаза зашива поправената ДНК верига заедно

Ремонт на грешка при репликация на ДНК

чрез метилиране

Грешките в сдвояването на азотни бази по време на репликацията на ДНК възникват доста често (в бактериите, веднъж на 10 хиляди нуклеотида), в резултат на коетокъм дъщерната верига на ДНК включени са нуклеотиди, които не са комплементарни на нуклеотидите на майчината верига -несъответствия(англ. mismatch n д кореспондират).

Макар чеДНК полимераза Iпрокариотите имат способността да се самокоригират, усилията си да елиминират погрешно прикрепени нуклеотиди понякога те не са достатъчни, а след това някои неправилни (некомплементарни) двойки остават в ДНК.

В този случай ремонтът се извършва с помощта на специфична система, свързана сДНК метилиране . Действието на тази система за възстановяване се основава на факта, че след репликация, след определено време (няколко минути), ДНК претърпява метилиране.

В E. coli метилиранпредимно аденин с образование

N6-метил-аденин (N6-mA).

До този момент, ново синтезиран(дъщерно дружество)веригата остава неметилирана.

Ако такава верига съдържа несдвоени нуклеотиди, тогава тя претърпява ремонт: Такаметилирането маркира ДНК и

включва система за коригиране на грешки репликация.

В тази система за ремонт се разпознават специални структури:

подпоследователностG-N6-mA-T-CИ следващиязад него има деформация

в двойната спирала, където няма комплементарност (фиг. по-долу).

При елиминирането на несдвоени нуклеотиди в полу-метилиранДНК молекулата включва доста сложен комплекс от ремонтни ензими, които сканират повърхността на ДНК молекулата,отрязва част от дъщерна верига прибягвайки до несъответствие, а след това създава условия за развитие

неговите необходими (комплементарни) нуклеотиди.

Различните компоненти на този комплекс имат различни дейностинуклеаза,

хеликаза,

АТФаза,

необходими за въвеждане на прекъсвания в ДНК и разцепване на нуклеотиди, развиване на двойната спирала на ДНК и осигуряване на енергия за движението на комплекса по ремонтираната част на молекулата.

Комплекс от възстановителни ензими, сходни по структура и функция, е идентифициран при хората.

Рекомбинантно (пострепликативно) възстановяване

В случаите, когато по една или друга причина горепосочените възстановителни системи са нарушени, могат да се образуват пропуски (недостатъчно възстановени участъци) във веригите на ДНК, които са понякога доста значителни размери, което е изпълнено с нарушаване на системата за репликация и може да доведе до клетъчна смърт.

В този случай клетката може да използва друга ДНК молекула, получена след репликация, за да поправи една ДНК молекула, т.е. да привлече механизъм за тази целрекомбинация.

В бактериите

При бактериите той участва в рекомбинантното възстановяване.протеин Rec A. Той се свързва с едноверижен регион на ДНК и го включва в рекомбинация схомоложни региони на непокътнати вериги на друга ДНК молекула .

В резултат на това както счупените (съдържащи пропуски), така и непокътнатите вериги на ДНК молекулата, която се ремонтира, се сдвоенис непокътнати комплементарни ДНК региони, което отваря възможността за възстановяване чрез гореописаните системи.

В този случай може да има рязанеопределен фрагмент и

пълнежс негова помощ пропуски в дефектната верига.

Празнините и прекъсванията, които възникват във веригите на ДНК, се запълват с участиетоДНК полимераза I и ДНК лигаза .

SOS възстановяване

Съществуването на тази система е постулирано за първи път от М. Радман през 1974 г. Той също така дава името на този механизъм, като включва в него международния сигнал за бедствие „SOS” (спаси душите ни).

Всъщност тази система се включва, когато Увреждането на ДНК става толкова голямо, че застрашава живота на клетката. В този случай възниква индукция на активността на разнообразна група гени, участващи в различни клетъчни процеси, свързани с възстановяването на ДНК.

Включването на определени гени, определени от степента на увреждане в ДНК, води до различни по значимост клетъчни отговори (започвайки от стандартните възстановяване на повреденинуклеотиди и край потисканеклетъчно делене).

Най-проучениSOS възстановяванев E. coli, основните участници в които са протеини, кодирани гени Rec AИЛекс А.

Първият от тях е многофункционаленRec A протеин, участващи

V ДНК рекомбинация, и

V регулиране на генната транскрипция фаг ламбда, засягащи E. coli,

и второ (Lex A протеин)е репресортранскрипция на голяма група гени, предназначени за възстановяване на ДНКбактерии. Когато е инхибиран или разрешен ремонтът е активиран.

Подвързване Rec A с Lex Aводи до разделянето на последнияи съответно на активиране на ремонтни гени.

От своя страна, индуцирането на бактериалната SOS система служи зафаг ламбда сигнал за опасности кара профага да превключи от пасивен към активен (литичен) пътсъществуване, като по този начин причинява смърт на клетка гостоприемник.

Системата за възстановяване на SOS е идентифицирана не само при бактерии, но и при животни и хора.

Гени, участващи в възстановяването на увреждане на SOS ДНК

Гени	Последици от активиране на ген
uvr A, B, C, D	Възстановяване на увреждане на вторичната структура на ДНК
Rec A	Пострепликативна репарация, индукция на SOS системата
лекс А	Изключване на SOS системата
rec N,ruv	Ремонт на двужилни прекъсвания
	Осигуряване на рекомбинантен ремонт
umu C, D	Мутагенеза, причинена от промени в свойствата на ДНК полимеразата
сул А	Потискане на клетъчното делене

Заключение

Поправянето на увреждане на ДНК е тясно свързано с други фундаментални молекулярно-генетични процеси: репликация, транскрипция и рекомбинация.Всички тези процеси се оказват преплетенив обща система от взаимодействия, обслужвана от голям брой различни протеини, много от които са мултифункционални молекули, участващи в контрол върху внедряването на генетична информацияв про- и еукариотни клетки. В същото време е очевидно, че природата "не пести"върху контролните елементи, създавайки изключително сложни системи за коригиране на тези увреждания в ДНК, които са опасниза тялото и особено за неговото потомство. От друга страна, в случаите, когато възможностите за възстановяване не са достатъчни за запазване на генетичния статус на организма, възниква необходимостта от програмирана клетъчна смърт -апоптоза..

СХЕМА ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА НУКЛЕОТИДНА ЕКЗИЦИЯ д. COLIС УЧАСТИЕТО НА EXINUCLEASE

1. НЕЗАВИСИМ МЕХАНИЗЪМ ОТ ТРАНСКРИПЦИЯТА

2. МЕХАНИЗЪМ, ЗАВИСИМ ОТ ТРАНСКРИПЦИЯТА

3. ОБЩ ЕТАП НА РЕМОНТ

ЛЕГЕНДА

А - протеинuvr А

B - протеинuvr IN

С - протеинuvr СЪС

малък черен триъгълник - знакът показва местоположението на повредата

СХЕМА ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ, СВЪРЗАНА С ДНК МЕТИЛИРАНЕ