Високоефективна хроматография. Високоефективна течна хроматография на замърсители от природни и отпадъчни води

(главно междумолекулни) на фазовия интерфейс. Като метод за анализ HPLC е част от група методи, които поради сложността на изследваните обекти включват предварително разделяне на оригиналната сложна смес на относително прости. След това получените прости смеси се анализират с помощта на конвенционални физикохимични методи или специални методи, разработени за хроматография.

Методът HPLC се използва широко в области като химия, нефтохимия, биология, биотехнологии, медицина, хранително-вкусова промишленост, опазване на околната среда, фармацевтично производство и много други.

Според механизма на разделяне на анализираните или разделени вещества, HPLC се разделя на адсорбция, разпределение, йонообмен, изключване, лиганд обмен и други.

Трябва да се има предвид, че в практическата работа разделянето често става не чрез един, а чрез няколко механизма едновременно. По този начин разделянето на изключването може да бъде усложнено от адсорбционни ефекти, адсорбционното разделяне чрез ефекти на разпределение и обратно. Освен това, колкото по-голяма е разликата между веществата в дадена проба по отношение на степен на йонизация, основност или киселинност, молекулно тегло, поляризуемост и други параметри, толкова по-голяма е вероятността за различен механизъм на разделяне на такива вещества.

Нормална фаза HPLC

Стационарната фаза е по-полярна от подвижната фаза, поради което неполярният разтворител преобладава в елуента:

• Хексан:изопропанол = 95:5 (за вещества с ниска полярност)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (за среднополярни вещества)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (за силно полярни вещества)

HPLC с обърната фаза

Стационарната фаза е по-малко полярна от подвижната фаза, така че елуентът почти винаги съдържа вода. В този случай винаги е възможно да се осигури пълно разтваряне на BAS в подвижната фаза, почти винаги е възможно да се използва UV откриване, почти всички подвижни фази са взаимно смесими, може да се използва градиентно елуиране, колоната може бързо да се преработи -еквилибриран, колоната може да се регенерира.

Обичайните елуенти за обратнофазова HPLC са:

• Ацетонитрил: вода
• Метанол: вода
• Изопропанол: вода

Матрици за HPLC

Матриците, използвани в HPLC, са неорганични съединения като силикагел или алуминиев оксид, или органични полимери като полистирен (омрежен с дивинилбензен) или полиметакрилат. Силикагелът, разбира се, вече е общоприет.

Основни характеристики на матрицата:

• Размер на частиците (µm);
• Размер на вътрешните пори (Å, nm).

Приготвяне на силикагел за HPLC:

1. Формоване на микросфери от полисилициева киселина;
2. Изсушаване на частици силикагел;
3. Разделяне на въздуха.

Сорбент частици:

• Редовен (сферичен): по-висока устойчивост на натиск, по-висока цена;
• Несферични: по-ниска устойчивост на натиск.

Размерът на порите в HPLC е един от най-важните параметри. Колкото по-малък е размерът на порите, толкова по-лоша е тяхната пропускливост за молекулите на елуираните вещества. И следователно, толкова по-лош е сорбционният капацитет на сорбентите. Колкото по-големи са порите, толкова по-малка е, първо, механичната стабилност на частиците на сорбента и, второ, колкото по-малка е сорбционната повърхност, следователно, толкова по-лоша е ефективността.

Ваксинации в стационарна фаза

Нормална фаза HPLC:

• Стационарна фаза с присаждане на пропилнитрил (нитрил);
• Стационарна фаза с присаждане на пропиламин (амин).

HPLC с обърната фаза:

• Стационарна фаза с присаждане на алкил;
• Стационарна фаза с алкилсилилно присаждане.

End-capping е защитата на неприсадени участъци от сорбента чрез допълнително присаждане с „малки“ молекули. Хидрофобно крайно затваряне (C1, C2): по-висока селективност, по-лоша омокряемост; хидрофилно крайно затваряне (диол): по-ниска селективност, по-висока омокряемост.

Детектори за HPLC

• UV
• Диодна матрица
• Флуоресцентни
• Електрохимия
• Рефрактометричен
• Масово селективно

Връзки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е „високоефективна течна хроматография“ в други речници:

високоефективна Течна хроматография- - [A.S. Goldberg. Англо-руски енергиен речник. 2006] Теми: енергия като цяло EN високоефективна течна хроматография HPLC ... Ръководство за технически преводач

Терминът високоефективна течна хроматография Терминът на английски високоефективна течна хроматография Синоними Съкращения HPLC, HPLC Сродни термини адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фулерен, ендоедрален, хроматография... ...

Течна хроматография, при която, за да се повиши ефективността на разделяне, разтворителят (елуент) под налягане (повече от 3x107 Pa) се изпомпва през колони, напълнени със сорбент с частици с малък диаметър (до 1 μm), както и перфузионни филтри. употребявано......

Вид хроматография, при която течността (елуент) служи като подвижна фаза и неподвижна. сорбент, телевизор носител с течност или гел, нанесен върху повърхността му. Извършва се в колона, пълна със сорбент (колонна хроматография) върху плоска... ... Естествени науки. енциклопедичен речник

- [κρώμα (υrum) цвят] процес, основан на неравномерната способност на отделните компоненти на сместа (течни или газообразни) да останат на повърхността на адсорбента както при абсорбирането им от носещия поток, така и когато ... ... Геоложка енциклопедия

- (от други гръцки ... Уикипедия

Терминът хроматография Терминът на английски chromatography Синоними Съкращения Сродни термини високоефективна течна хроматография, клатрат, лаборатория на чип, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, ензим, фулерен, ендоедрален... ... Енциклопедичен речник по нанотехнологии

Течна хроматография на базата на разг. способност на отделените йони за йонообмен с фиксирани. йони на сорбента, образувани в резултат на дисоциация на йоногенните групи на последния. Катионообменниците се използват за разделяне на катиони, за... ... Химическа енциклопедия

HPLC- високоефективна Течна хроматография… Речник на руските съкращения

Високоефективната течна хроматография (HPLC) е един от ефективните методи за разделяне на сложни смеси от вещества, широко използван както в аналитичната химия, така и в химичните технологии. В основата на хроматографското разделяне е участието ... Wikipedia

Книги

• Практическа високоефективна течна хроматография, Veronica R. Mayer. Представяме на читателя 5-то издание на книгата, допълнено със съвременни методи и оборудване. Много са подобрени в книгата и са добавени голям брой препратки. Тези места в текста, където...

Течна хроматография е метод за разделяне и анализиране на сложни смеси от вещества, в които течността служи като подвижна фаза. Приложим е за разделянето на по-широк спектър от вещества от газовата хроматография. Това се дължи на факта, че повечето вещества не са летливи, много от тях са нестабилни при високи температури (особено високомолекулни съединения) и се разлагат, когато се превърнат в газообразно състояние. Разделянето на вещества чрез течна хроматография най-често се извършва при стайна температура.

Характеристиките на всички видове течна хроматография се дължат на факта, че подвижната фаза в нея е течна и сорбцията на компоненти от газообразен и течен елуент протича по различен начин. Ако в газовата хроматография газът носител изпълнява само транспортна функция и не се сорбира от неподвижната фаза, тогава течната подвижна фаза в течната хроматография е активен елуент; нейните молекули могат да бъдат сорбирани от неподвижната фаза. Когато преминават през колоната, молекулите на компонентите на анализираната смес, намиращи се в елуента, трябва да изместят молекулите на елуента от повърхностния слой на сорбента, което води до намаляване на енергията на взаимодействие на молекулите на аналита. с повърхността на сорбента. Следователно стойностите на задържаните обеми V Р, пропорционална на промяната в свободната енергия на системата, е по-малка при течната хроматография, отколкото при газовата хроматография, а диапазонът на линейност на сорбционната изотерма при течната хроматография е по-широк.

Чрез използване на различни елуенти, параметрите на задържане и селективността на хроматографската система могат да бъдат променени. Селективността при течната хроматография, за разлика от газовата, се определя не от един, а от два фактора - естеството на подвижната (елуент) и неподвижната фаза.

Течната подвижна фаза има по-висока плътност и вискозитет от газообразната фаза, коефициенти на дифузия д и 3–4 порядъка по-ниска, отколкото в газ. Това води до по-бавен масопренос при течната хроматография в сравнение с газовата хроматография. Уравнението на Van Deemter поради факта, че членът INне играе роля в течната хроматография ( д и  д Ж), графичната зависимост на ефективността също се променя нот линейния дебит на подвижната фаза има формата, показана на фиг. 1.9.

В класическия вариант на колонна течна хроматография, анализираната проба, разтворена в елуента, се въвежда в стъклена колона с височина 1–2 m, пълна със сорбент с размер на частиците 100 μm и елуент, като елуентът се пропуска през , като се избират части от елуата на изхода на колоната. Тази версия на течна хроматография все още се използва в лабораторната практика, но тъй като скоростта на преминаване на елуента под въздействието на гравитацията е ниска, анализът е дълъг.

Модерната версия на течната хроматография, така наречената високоефективна течна хроматография HPLC, използва обемни и повърхностно порести сорбенти с размер на частиците 5–10 микрона, инжекционни помпи, осигуряващи системно налягане до 400 atm, и високочувствителни детектори. Бързият масов трансфер и високата ефективност на разделяне правят възможно използването на HPLC за разделяне на молекули (течна адсорбция и разделителна хроматография течност-течност), за разделяне на йони (йонна хроматография, йонна хроматография), за разделяне на макромолекули (хроматография с изключване по размер).

1.3. ЗАДЪРЖАНЕ НА РАЗТВОРИТЕЛ И ЗДРАВИНА

За да могат анализираните вещества да бъдат разделени на колоната, както е споменато по-горе, коефициентът на капацитет k" трябва да бъде по-голям от 0, т.е. веществата трябва да бъдат задържани от неподвижната фаза, сорбента. Коефициентът на капацитет обаче не трябва е твърде голям, за да се получи приемливо време на елуиране.Ако за дадена смес от вещества е избрана неподвижна фаза, която ги задържа, тогава по-нататъшната работа по разработването на техника за анализ се състои в избора на разтворител, който в идеалния случай би осигурил различни, но приемливи не много голямо k ". Това се постига чрез промяна на силата на елуиране на разтворителя.

В случай на адсорбционна хроматография върху силикагел или алуминиев оксид, като правило, силата на двукомпонентен разтворител (например хексан с добавяне на изопропанол) се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на полярния компонент (изопропанол), или намалява чрез намаляване на съдържанието на изопропанол. Ако съдържанието на полярния компонент стане твърде ниско (по-малко от 0,1%), той трябва да бъде заменен с по-слаба сила на елуиране. Същото се прави, като се заменя или полярен, или неполярен компонент с други, дори ако тази система не осигурява желаната селективност по отношение на представляващите интерес компоненти в сместа. При избора на системи от разтворители се вземат предвид както разтворимостта на компонентите на сместа, така и елуотропните серии от разтворители, съставени от различни автори.

Силата на разтворителя се избира приблизително по същия начин, когато се използват присадени полярни фази (нитрил, амино, диол, нитро и т.н.), като се вземат предвид възможните химични реакции и се изключват разтворители, опасни за фазата (например алдехиди и кетони за амино фазата).

В случай на обратнофазова хроматография, силата на разтворителя се повишава чрез увеличаване на съдържанието на органичния компонент в елуента (метанол, ацетонитрил или THF) и се намалява чрез добавяне на повече вода. Ако не е възможно да се постигне желаната селективност, те използват друг органичен компонент или се опитват да го променят с помощта на различни добавки (киселини, реагенти за йонни двойки и др.).

При разделяне чрез йонообменна хроматография силата на разтворителя се променя чрез увеличаване или намаляване на концентрацията на буферния разтвор или промяна на рН; в някои случаи се използва модификация с органични вещества.

Въпреки това, особено в случай на сложни естествени и биологични смеси, често не е възможно да се избере силата на разтворителя, така че всички компоненти на пробата да се елуират в приемлив период от време. Тогава трябва да прибегнете до градиентно елуиране, т.е. използвайте разтворител, чиято сила на елуиране се променя по време на процеса на анализ, така че постоянно да се увеличава според предварително определена програма. Тази техника позволява да се постигне елуиране на всички компоненти на сложни смеси за относително кратък период от време и тяхното разделяне на компоненти под формата на тесни пикове.

1.6.1. Адсорбционна течна хроматография. Адсорбционната течна хроматография, в зависимост от полярността на стационарната и подвижната фаза, се разделя на нормалнофазова (NPC) и обратнофазова (RPC) хроматография. В NPC се използват полярен адсорбент и неполярни подвижни фази; в OPC се използват неполярен адсорбент и полярни подвижни фази, но и в двата варианта изборът на подвижната фаза често е по-важен от избора на стационарна фаза. Стационарната фаза трябва да задържа веществата, които се разделят. Подвижната фаза, т.е. разтворителят, трябва да осигури променлив капацитет на колоната и ефективно разделяне в рамките на приемливо време.

Като стационарна фаза в адсорбционната течна хроматография се използват полярни и неполярни фино диспергирани порести материали със специфична повърхност над 50 m 2 /g. Полярните адсорбенти (SiO 2 , Al 2 O 3 , флорисил и др.) имат слаби киселинни групи на повърхността, които могат да задържат вещества с основни свойства. Тези адсорбенти се използват главно за разделяне на неполярни и умерено полярни съединения. Недостатъкът им е високата чувствителност към съдържанието на вода в използваните елуенти. За да се елиминира този недостатък, полярните сорбенти се третират с амини, диоли и други реагенти, което води до повърхностно присаждане на тези реагенти, повърхностна модификация и промяна в селективността по отношение на аналитите.

Неполярните адсорбенти (графитизирани сажди, диатомитна пръст, кизелгур) са неселективни към полярните молекули. За да се получат неполярни адсорбенти, неполярните групи често се присаждат върху повърхността на, например, силикагел, например алкилсилил SiR 3, където Rалкиловите групи са C 2 C 22.

Подвижната фаза трябва напълно да разтваря анализираната проба, да има нисък вискозитет (така че коефициентите на дифузия да са достатъчно големи) и е желателно да е възможно да се изолират отделените компоненти от нея. Той трябва да бъде инертен по отношение на материалите на всички части на хроматографа, безопасен, евтин и подходящ за детектора.

Мобилните фази, използвани в течната хроматография, се различават по своята сила на елуиране. Силата на елуиране на разтворител показва колко пъти сорбционната енергия на даден елуент върху даден адсорбент е по-голяма от сорбционната енергия на елуента, избран като стандарт, например n-хептан. Слабите разтворители се адсорбират слабо от неподвижната фаза, поради което коефициентите на разпределение на сорбираните вещества (сорбат) са високи. Напротив, силните разтворители се адсорбират добре, така че коефициентите на разпределение на сорбата са ниски. Колкото по-силен е разтворителят, толкова по-висока е разтворимостта на анализираната проба в него и толкова по-силно е взаимодействието разтворител-сорбат.

За да се осигури висока ефективност на разделяне на колона, е необходимо да се избере подвижна фаза, която има полярност, която е оптимална за сместа, която ще се разделя при избраните условия на разделяне. Обикновено първо се избира стационарна фаза, която има полярност, близка до тази на компонентите, които се разделят. След това се избира подвижната фаза, като се гарантира, че коеф к" се оказа в диапазона от 2 до 5. Ако полярността на подвижната фаза е твърде близка до полярността на неподвижната фаза, времето на задържане на компонентите ще бъде твърде кратко и ако полярностите на подвижната и неподвижната фаза фазите са много различни, времето на задържане ще стане твърде дълго.

При избора на подвижни фази те се ръководят от така наречената елуотропна серия, основана на използването на индекси на полярност Снайдер R", който разделя всички разтворители на силни (полярни) и слаби (слабо полярни и неполярни). Скалата на полярността се основава на разтворимостта на веществата, използвани като подвижни фази в диоксан, нитрометан и етанол.

Таблица 1.2 показва стойностите на индексите на полярността и силата на елуиране (по отношение на SiO 2) за редица разтворители, които най-често се използват в течната хроматография като подвижни фази. Тук са посочени и късовълновите граници на прозрачност на тези разтворители, което улеснява избора на условия за откриване на компонентите на сместа.

Таблица 1.2

Характеристики на разтворителите, използвани в течната хроматография

Разтворител	Индекс на полярността	Сила на елуиране (SiO 2)	Граница на прозрачност на къси вълни
Флуороалкан
Циклохексан
н-Хексан
Тетрахлорметан
Диизопропилов етер
Диетилов етер
Дихлорометан
Тетрахидрофуран
Хлороформ
Оцетна киселина
Ацетонитрил
Нитрометан

В течната хроматография често се използват смеси от тях, а не отделни разтворители. Често незначителни добавки на друг разтворител, особено вода, ще увеличат значително силата на елуента на елуента.

При разделяне на многокомпонентни смеси една подвижна фаза като елуент може да не раздели всички компоненти на пробата за приемливо време. В този случай се използва стъпаловиден или градиентен метод на елуиране, при който все по-силни елуенти се използват последователно по време на хроматографския процес, което прави възможно елуирането на силно задържани вещества за по-малко време.

В течната хроматография има някои емпириченправила, които са много полезни при избора на елуент:

- сорбцията на съединение, като правило, се увеличава с увеличаване на броя на двойните връзки и ОН групите в него;

 намалява сорбцията на редица органични съединения: киселини алкохолиалдехидикетониестериненаситени въглеводородинаситени въглеводороди;

 за разделяне на вещества с различна полярност и отделяне на вещества от различни класове се използва нормалнофазова хроматография: анализираната проба се разтваря и елуира с неполярен елуент, съединения от различни класове напускат колоната с полярен адсорбент по различно време, докато времето на задържане на съединения с различни функционални групи се увеличава при прехода от неполярни съединения към слабо полярни. За много полярни молекули времето на задържане е толкова дълго, че анализът не е възможен с неполярен елуент. За да намалите времето на задържане на полярните компоненти, преминете към полярни елуенти;

 във варианта с обърната фаза стационарната фаза (неполярен адсорбент) по-силно адсорбира неполярния компонент от полярни елуенти, например от вода;

- Чрез намаляване на полярността на елуента чрез добавяне на по-малко полярен разтворител може да се намали задържането на компоненти.

1.6.2. Разпределителна течна хроматография.При разделителна или течно-течна хроматография, разделянето на компонентите на анализираната проба се дължи на разликите в коефициентите на тяхното разпределение между две несмесващи се течни фази, едната от които е неподвижна и се намира на повърхността или в порите на твърдо вещество. стационарен превозвач, а вторият е мобилен.

От гледна точка на естеството на силите на взаимодействие, които определят различното разпределение между двете фази на веществата, които се различават по своята химична структура, разделителната хроматография е подобна на адсорбционната хроматография, т.е. и тук разделянето се основава на разликата в силите на междумолекулно взаимодействие между компонентите на анализираната проба и неподвижната и подвижната течна фаза.

В зависимост от техниката разделителната хроматография, подобно на адсорбционната хроматография, може да бъде колонна или планарна (хартиена или тънкослойна).

Като твърди носители се използват вещества, които са безразлични към подвижния разтворител и компонентите на анализираната проба, но способни да задържат неподвижната фаза на повърхността и в порите. Най-често като носители се използват полярни вещества (целулоза, силикагел, нишесте). Към тях се прилага неподвижна фаза — полярен разтворител, най-често вода или алкохол. В този случай като подвижни фази се използват по-малко полярни или неполярни вещества (алкохоли, амини, кетони, въглеводороди и др.). Този тип разделителна хроматография се нарича нормална фаза. Използва се за разделяне на полярни вещества.

Втората версия на разделителната хроматография се различава по това, че неполярни носители (каучук, флуоропласт, хидрофобизиран силикагел) се използват като неподвижна твърда фаза, неполярни разтворители (въглеводороди) се използват като неподвижна течна фаза и полярни разтворители (алкохоли , алдехиди) се използват като подвижна течна фаза, кетони и др., често вода). Тази версия на разделителната хроматография се нарича обърната фазаи се използва за разделяне на неполярни вещества.

За постигане на оптимално разделяне на компонентите на анализираната проба, изборът на подвижната фаза е много важен. Разтворителите (подвижни и неподвижни течни фази) трябва да бъдат избрани така, че коефициентите на разпределение на компонентите на сместа да се различават значително. За течните фази се прилагат следните изисквания: изисквания:

1) използваните разтворители трябва да разтварят добре разделяните вещества и тяхната разтворимост в неподвижната фаза трябва да бъде по-голяма, отколкото в подвижната фаза;

2) разтворителите, използвани като подвижна и неподвижна фази, трябва да бъдат взаимно наситени, т.е. съставът на разтворителя трябва да бъде постоянен по време на преминаване през колоната;

3) взаимодействието на разтворителите, използвани като подвижна фаза, с неподвижната фаза трябва да бъде минимално.

Най-често при разпределителната течна хроматография като подвижни течни фази не се използват отделни вещества, а техни смеси в различни съотношения. Това позволява да се регулира полярността на подвижната фаза, да се промени съотношението на полярността на подвижната и неподвижната фази и да се постигнат оптимални условия за разделяне на компонентите на определена анализирана смес.

Съществен недостатък на този хроматографски метод е, че нанесената неподвижна течна фаза бързо се отмива от носителя. За да се елиминира, разтворителят, използван като подвижна фаза, се насища с вещество, използвано като неподвижна течна фаза, или неподвижната течна фаза се стабилизира чрез присаждането й към носителя.

Разновидност на разпределителната течна хроматография е широко използваният HPLC метод.

Най-често срещаните хроматографски системи са системи, които имат модулен принцип на сглобяване. Помпи, дегазиращи устройства, детектори, дозатори (автосамплери), колонни термостати, фракционни колектори, блокове за управление на хроматографска система и записващи устройства се предлагат като отделни модули. Богат избор от модули ви позволява гъвкаво да решавате различни аналитични проблеми и бързо да променяте конфигурацията на системата, ако е необходимо, с минимални разходи. В същото време се произвеждат и мономодулни (интегрирани) LC, чието основно предимство е миниатюризацията на отделните единици и компактността на устройството.

В зависимост от метода на елуиране течните хроматографи се делят на изократни и градиентни.

Схема на изократичен хроматограф

Подвижната фаза от контейнера (1) през входния филтър (9) се подава от прецизна помпа за високо налягане (2) към системата за инжектиране на пробата (3) - ръчен инжектор или автосамплер, като пробата също се въвежда там . След това, през вграден филтър (8), пробата с ток на подвижната фаза навлиза в разделителния елемент (елементи) (4) - през предколоната в разделителната колона. След това елуатът влиза в детектора (5) и се отстранява в дренажния контейнер (7). Когато елуатът преминава през измервателната верига на детектора, хроматограмата се записва и данните се прехвърлят към аналогово записващо устройство (рекордер) (6) или друга система за събиране и обработка на хроматографски данни (интегратор или компютър). В зависимост от дизайна на функционалните модули, системата може да се управлява от клавиатурата на управляващия модул (обикновено помпа или системен контролер), от клавиатурите на всеки от системните модули или чрез управляваща програма от персонален компютър.

В случай на градиентно елуиране се използват два принципно различни типа течни хроматографи. Те се различават по точката, в която се образува градиентът на състава на подвижната фаза.

Схема на градиентен хроматограф с образуване на градиент на състава на подвижната фаза на линия с ниско налягане.

Подвижната фаза от контейнери (1) през входни филтри (9) и градиентен програматор (10) се подава от прецизна помпа за високо налягане (2) към системата за инжектиране на пробата (3) - ръчен инжектор или автосамплер, и там също се въвежда проба. Работата на градиентните програмиращи клапани се контролира или от модула за управление на системата (помпа или контролер), или от програма за управление на компютър. Системите от този тип образуват двоичен, триизмерен и четириизмерен градиент. Формата на функцията за обработка на градиента зависи от конкретния управляващ модул или управляваща програма, както и от функционалността на управлявания и контролния модул. След това, през вграден филтър (8), пробата с ток на подвижната фаза навлиза в разделителния елемент (елементи) (4) - през предколоната в разделителната колона. След това елуатът влиза в детектора (5) и се отстранява в дренажния контейнер (7). Когато елуатът преминава през измервателната верига на детектора, хроматограмата се записва и данните се прехвърлят към аналогово записващо устройство (рекордер) (6) или друга система за събиране и обработка на хроматографски данни (интегратор или компютър). В зависимост от дизайна на функционалните модули, системата може да се управлява от клавиатурата на управляващия модул (обикновено помпа или системен контролер) или да се осъществява чрез програма за управление от персонален компютър. При управление от контролен модул е ​​възможно детектора да се управлява самостоятелно от собствената му клавиатура.

Въпреки очевидната привлекателност на такива системи (те използват само една прецизна помпа за високо налягане), тези системи имат редица недостатъци, сред които може би основният е строгата необходимост от пълно обезгазяване на компонентите на подвижната фаза дори преди миксер с ниско налягане (камера за градиентен програматор). Извършва се с помощта на специални проточни дегазатори. Поради този факт тяхната цена става сравнима с друг тип градиентни системи - системи с образуване на подвижна фазова градиентна композиция върху линия с високо налягане.

Основната разлика между системите с образуване на градиентен състав на подвижната фаза на линия за високо налягане е смесването на компонентите в линията за високо налягане; естествено, при този подход броят на прецизните помпи се определя от броя на резервоарите за смесване на подвижната фаза. С този подход значително се намаляват изискванията за пълно обезгазяване на компонентите.

Схема на градиентен хроматограф с образуване на градиент на състава на подвижната фаза върху линия с високо налягане.

Подвижната фаза от контейнери (1) през входни филтри (9) се подава от прецизни помпи за високо налягане (2 и 11) през статичен или динамичен поточен смесител (10) в системата за въвеждане на пробата (3) - ръчен инжектор или autosampler, като пробата също се въвежда там. Работата на контролираните помпи се управлява или от модула за управление на системата (главна помпа или контролер) или от програма за управление на компютър. В този случай всички помпи са управляеми. Системи от този тип образуват двоичен или триизмерен градиент. Формата на функцията за обработка на градиента зависи от конкретния управляващ модул или управляваща програма, както и от функционалността на управлявания и контролния модул. След това, през вграден филтър (8), пробата с ток на подвижната фаза навлиза в разделителния елемент (елементи) (4) - през предколоната в разделителната колона. След това елуатът влиза в детектора (5) и се отстранява в дренажния контейнер (7). Когато елуатът преминава през измервателната верига на детектора, хроматограмата се записва и данните се прехвърлят към аналогово записващо устройство (рекордер) (6) или друга система за събиране и обработка на хроматографски данни (интегратор или компютър). В зависимост от дизайна на функционалните модули, системата може да се управлява от клавиатурата на управляващия модул (обикновено помпа или системен контролер) или да се осъществява чрез програма за управление от персонален компютър. При управление от контролен модул е ​​възможно детектора да се управлява самостоятелно от собствената му клавиатура.

Предложените схеми са доста опростени. Системите могат да включват допълнителни устройства - колонен термостат, системи за следколонна дериватизация, системи за подготовка на пробите и концентриране на пробите, рециклатор на разтворители, мембранни системи за потискане на фоновата електропроводимост (за йонна хроматография), допълнителни защитни системи (филтри, колони), и т.н. Диаграмите също така не показват отделно манометрични модули. По правило тези устройства са вградени в помпени агрегати. Тези модули могат да комбинират няколко помпи, помпа с градиентен програматор и общ системен контролер. Структурата на системата зависи от нейната конфигурация и всеки конкретен производител.

Такова радикално усложняване на техническата поддръжка на хроматографския процес води до появата на редица изисквания към свойствата на подвижната фаза, които липсват в класическата колонна и планарна хроматография. Течната фаза трябва да бъде подходяща за откриване (да е прозрачна в дадена област от спектъра или да има нисък индекс на пречупване, определена електрическа проводимост или диелектрична константа и т.н.), инертна към материалите на частите на хроматографския тракт, да не образува газ мехурчета в клапаните на помпата и детекторната клетка, нямат механични примеси.

В течна хроматографияИзползват се много видове помпи. За LC с ниско налягане често се използват перисталтични помпи (фиг. 1).

Фиг. 1 Програмируема перисталтична помпа MasterFlex.

При HPLC се използват помпи с високо налягане, за да се осигури потокът на подвижната фаза през колоната с определени параметри.

Най-важните технически характеристики на HPLC помпите включват: диапазон на потока; максимално работно налягане; възпроизводимост на потока; диапазон на пулсация на подаването на разтворител.

В зависимост от естеството на подаването на разтворителя помпите могат да бъдат с постоянно захранване (дебит) и постоянно налягане. По принцип по време на аналитичната работа се използва режим на постоянен дебит, а при пълнене на колони се използва режим на постоянно налягане.

Въз основа на принципа на работа HPLC помпите се разделят на: спринцовка и на бутало възвратно-постъпателно .

Шприцови помпи

Основната отличителна черта на тези помпи е цикличният характер на тяхната работа и следователно хроматографите, в които се използват тези помпи, също се отличават с цикличната си работа.

Ориз. 2. Основен дизайн на спринцовкова помпа за HPLC.

Ориз. 2А. Спринцова помпа.

Блокът за управление BU подава напрежение към двигателя D, което определя скоростта и посоката на неговото въртене. Въртенето на двигателя с помощта на скоростната кутия P се преобразува в движение на буталото P вътре в цилиндъра D. Помпата работи в 2 цикъла. По време на цикъла на пълнене клапан К2 е затворен, К1 е отворен, разтворителят тече от резервоара в цилиндър С. В режим на захранване клапан К1 е затворен и през клапан К2 подвижната фаза влиза в дозиращото устройство.

Помпите от този тип се характеризират с почти пълна липса на пулсации в потока на подвижната фаза по време на работа.

Недостатъци на помпата:

а) висока консумация на време и разтворител за измиване при смяна на разтворителя;

б) обемът на PF е ограничен от обема на спринцовката и следователно времето за разделяне е ограничено;

в) спиране на отделянето при пълнене на помпата;

г) големи размери и тегло при осигуряване на висок поток и налягане (необходим е мощен двигател и голяма сила на буталото с голямата му площ).

Бутални бутални помпи.

Ориз. 3. Основна конструкция на бутална помпа.

Принцип на действие.

Мотор D, чрез скоростна кутия P, поставя буталото P в възвратно-постъпателно движение, движейки се в работната глава на помпата. Вентилите K1 и K2 се отварят, когато помпата е съответно във фаза на засмукване и подаване. Количеството на обемното подаване се определя от три параметъра: диаметър на буталото (обикновено 3,13; 5,0; 7,0 mm), неговата амплитуда (12-18 mm) и честота (която зависи от скоростта на въртене на двигателя и скоростната кутия).

Помпите от този тип осигуряват постоянно обемно захранване на подвижната фаза за дълго време. Максимално работно налягане 300-500 atm, дебит 0,01-10 ml/min. Обемна повторяемост на подаването -0,5%. Основният недостатък е, че разтворителят се подава към системата под формата на поредица от последователни импулси, така че има пулсации на налягането и потока (фиг. 4). Това е основната причина за повишения шум и намалената чувствителност на почти всички детектори, използвани в LC, особено електрохимичните.

Фиг.4. Пулсации на буталната помпа.

Начини за справяне с пулсациите.

1. Приложение на демпферни устройства.

Това са спирални тръби със специален профил, изработени от неръждаема стомана, свързани последователно или успоредно на системата между помпата и дозатора.

Ориз. 5. Спирален амортисьор.

Амортисьорът се развива с увеличаване на налягането в него (ускоряване на помпата). Когато налягането падне, той се извива, обемът му намалява, той изстисква част от разтворителя, поддържа постоянен дебит и намалява пулсациите. Този амортисьор работи добре при налягане от 50 atm и повече.

При налягане 5-30 atm изглажда пулсациите по-добре въздушна клапа, направен от колона (фиг. 6.). Въздухът в амортизираната колона (6x200 mm) се компресира и пулсациите се гасят. Въздухът се разтваря в него в рамките на 24 часа.

Ориз. 6. Въздушна клапа.

2. Приложение на електронни устройства.

Когато използвате електронен сензор за налягане, можете да използвате показанията на сензора, за да контролирате работата на помпата. Когато налягането падне, оборотите на двигателя се увеличават и компенсират намаляването на налягането. Също така е възможно да се компенсират течовете във вентилите и частично в маншетите. Използването на електронен амортисьор (BPZh-80, KhPZh-1 и др.) Ви позволява да намалите пулсациите на налягането до 1 atm при налягане от 100-150 kgf / cm2.

1.6.3. Йонообменна, йонна, йонно-двойна хроматография.Методите за йонообменна, йонна и йонно-двойна хроматография се основават на динамичния процес на заместване на йони, свързани със стационарната фаза, с йони на елуента, влизащи в колоната. Основната цел на хроматографския процес е разделянето на неорганични или органични йони със същия знак. Задържането при тези видове хроматография се определя от промяната в свободната енергия на йонообменната реакция. Съотношението на концентрациите на обменените йони в разтвора и във фазата на сорбента се характеризира с йонообменно равновесие. Йонообменът е, че някои вещества (йонообменници), когато са потопени в електролитен разтвор, абсорбират катиони или аниони от него, освобождавайки в разтвора еквивалентно количество други йони със заряд със същия знак. Настъпва обмен на катиони между катионния обменник и разтвора и обмен на аниони възниква между анионния обменник и разтвора.

Катионообменниците най-често са специално синтезирани неразтворими полимерни вещества, съдържащи в структурата си йоногенни групи с кисела природа: –SO 3 H; –COOH; –OH; –PO3H2; –AsO 3 H 2 .

Химичните формули на катионобменниците могат да бъдат схематично изобразени като R-SO 3 H; R-SO 3 Na. В първия случай катионният обменник е в Н-форма, във втория - в Na-форма. R – полимерна матрица.

Реакциите на катионен обмен се записват като обикновени хетерогенни химични реакции:

RNa +Na + RNa+H +

Анионообменниците съдържат в структурата си основни йоногенни групи: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + и т.н. Техните химични формули могат да бъдат изобразени като RNH 3 OH и RNH 3 Cl или ROH, RCl. В първия случай анионобменникът е в ОН форма, във втория случай в Cl форма. Реакцията на анионен обмен може да бъде записана по следния начин:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Известни са амфотерни йонообменници, които съдържат както киселинни, така и основни групи в своята структура. Йонообменниците, съдържащи същия тип (например SO 3 H) киселинни (основни) групи, се наричат ​​монофункционални; йонообменниците, съдържащи различни видове (например SO 3 H, OH) киселинни (основни) групи, са полифункционални.

Монофункционалните йонообменници се получават чрез реакция на полимеризация. Реакцията на поликондензация позволява получаването на многофункционални йонообменници. За да могат получените йонообменници да имат достатъчно високи експлоатационни характеристики, те трябва да са неразтворими, но набъбващи в съответния разтворител и да имат достатъчно голям брой йоногенни групи, способни да се обменят с йоногенни групи на анализираната проба. Това може да се постигне, ако получените полимерни вериги са достатъчно разклонени и свързани една с друга чрез омрежващи мостове. Например, при получаването на полимеризационен тип катионобменници на базата на стирен, дивинилбензенът най-често се използва като омрежващ агент, чието въвеждане в количество до 16% осигурява производството на йонообменници с различна степен на набъбване и следователно прави възможно регулирането на порьозността на йонообменника. Степента на набъбване на йонообменника, изразена в милилитър/грам, е обемът на 1 g въздушно-сух йонообменник, опакован в колона.

Йонообменникът абсорбира, като правило, един от противойоните - йони, присъстващи в подвижната фаза, т.е. проявява определена селективност. Афинитетната серия или селективността на йони по отношение на различни видове йонообменници е експериментално установена. Например, при ниски концентрации на разтвор върху силно киселинни катионобменници, йони със същия заряд се сорбират в следната последователност:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

За йони с различни заряди сорбцията се увеличава с увеличаване на заряда:

Na+ Ca 2+

Промяната на условията на йонообменната реакция обаче може да доведе до обръщане на серията. Установени са и афинитетни серии за анионобменници. Например, сорбируемостта на аниони върху силни основни анионобменници нараства в следния ред:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Йонообменниците, съдържащи в структурата си силно киселинни или силно основни групи, влизат в йонообменни реакции с всякакви йони в разтвор със заряди със същия знак като знака на противойона. Такива йонообменници се наричат ​​универсални.

Процесът на йонообмен между аналита и йонообменника може да се извърши по един от трите начина: статичен, динамичен (метод на йонообменен филтър) и хроматографски.

Статичен метод йонен обмен е, че проба от йонообменника се поставя в контакт с определен обем разтвор и се смесва или разклаща за определено време, докато се установи равновесие. Това е бърз и прост метод за йонен обмен, използван за концентриране на йони от разредени разтвори, премахване на ненужните примеси, но не гарантира пълна абсорбция на йони, тъй като йонният обмен е неравновесен процес и в резултат на това не гарантира пълно разделяне на йони.

При извършване на йонообмен по динамичен начин през колоната с йонообменника преминава разтвор, който при движението си по колоната влиза в контакт с нови йонообменни гранули. Този процес осигурява по-пълен обмен от статичния метод, тъй като продуктите на обмена се отстраняват от потока на разтвора. Те могат да концентрират йони от разредени разтвори и да разделят йони, които се различават значително по свойства, например йони с различни заряди (разделят катиони от аниони), но разделянето на йони с еднакъв знак на заряд е почти невъзможно. Количественото разделяне на такива йони е възможно само при многократно повторение на елементарни актове на сорбция-десорбция при динамични условия, т.е. хроматографски метод . При работа с този метод се използват високи слоеве йонообменник и сместа, която трябва да се раздели, се въвежда в този слой в количество, значително по-малко от капацитета на колоната, поради което се осигуряват многократни повторения на елементарни йонообменни действия.

По отношение на техниката на анализ, йонообменната хроматография е подобна на молекулярната хроматография и може да се извърши с помощта на опции за елуент (проявяване), фронтална и изместваща. Разликата между молекулярната и йонообменната хроматография е, че при молекулярната хроматография отделените компоненти на сместа се елуират от колоната с чист елуент, докато при йонообменната хроматография като елуент се използва електролитен разтвор. В този случай обмененият йон на елуента трябва да бъде сорбиран по-малко селективно от който и да е от йоните на сместа, която се разделя.

При извършване на йонообменна хроматография за проявяване, която се използва най-често, колона, пълна с йонообменник, първо се промива с електролитен разтвор, докато всички нейни йони бъдат напълно заменени в йонообменника от йоните, съдържащи се в елуента. След това в колоната се въвежда малък обем разтвор на аналита, съдържащ отделените йони в количество около 1% от йонообменния капацитет. След това колоната се промива с разтвора на елуента, като се избират фракциите на елуата и се анализират.

Смес от Cl – , Br – , J – йони може да се раздели на силно основен анионобменник (омрежен полистирен, съдържащ групи от кватернерни амониеви бази – N (CH 3) 3 +), например AB-17, който има серия от селективност (селективност): NO 3 – Cl – Br – J – . В резултат на това като елуент се използва разтвор на NaNO3. Първо, този разтвор преминава през йонообменника до пълно насищане с NO 3 – йони. Когато сместа за разделяне се въведе в колоната, йоните Cl – , Br – , J – се абсорбират от анионобменника, измествайки NO 3 – йони. Когато колоната впоследствие се промие с разтвор на NaNO 3, Cl – , Br – , J – йони в горните слоеве на анионобменника постепенно се заместват отново с NO 3 – йони. Cl – йоните ще бъдат изместени най-бързо, а J – йоните ще останат в колоната най-дълго. Разликата в селективността на йонообменника към йоните на сместа води до образуването на отделни зони от сорбирани Cl – , Br – и J – йони в колоната, движещи се по колоната с различна скорост. Докато се движите по колоната, разстоянието между зоните се увеличава. Във всяка зона има само един от анионите на разделяната смес и анионът на елуента, а в интервала между зоните има само анионът на елуента. Така в елуента на изхода на колоната ще се появят фракции, които съдържат отделни компоненти на сместа, която се разделя.

За решаване на практически проблеми условията за разделяне на йони се променят чрез избор на подходяща подвижна фаза (състав, концентрация, рН, йонна сила) или промяна на порьозността на полимерната матрица на йонообменника, т.е. броя на междуверижните връзки в матрица и създаване на йонообменни сита, които са пропускливи за някои йони и способни да ги обменят и непроницаеми за други. Възможно е също така да се промени природата и относителното разположение на йоногенните групи, както и да се получат сорбенти, способни на селективни химични реакции поради образуването на комплекси. Например, комплексообразуващите йонообменници, съдържащи в структурата си хелатни групи от органични реагенти диметилглиоксим, дитизон, 8-хидроксихинолин и др., Както и краун етери, имат висока селективност.

Най-голямото приложение в йонообменната, йонната и йонно-двойната хроматография се намира в синтетични макро- и микромрежови органични йонообменници с голям обменен капацитет (3–7 mmol/g), както и неорганични йонообменни материали. Микромрежестите йонообменници са способни да обменят йони само в набъбнало състояние, докато макромрежестите йонообменници са способни да обменят йони само в набъбнало и ненабъбнало състояние. Друг структурен тип йонообменници са йонообменници с повърхностен филм, чието твърдо ядро ​​е направено от непорест съполимер на стирен и дивинилбензен, стъкло или силикагел и е заобиколено от тънък филм от йонообменник. Общият диаметър на такава частица е около 40 µm, дебелината на йонообменния филм е 1 µm. Недостатъкът на такива йонообменници е относително големият диаметър на частиците и ниският обменен капацитет поради ниската специфична повърхност, в резултат на което е необходимо да се работи с малки проби и съответно да се използват високочувствителни детектори. В допълнение, такива йонообменници бързо се отравят и не могат да се регенерират.

При високоефективен йонообмен и йонна хроматография, обемни порести полистиренови йонообменници, обемни порести силициеви диоксиди с диаметър на гранулата от около 10 микрона, както и практически ненабъбващи повърхностно порести и повърхностно модифицирани съполимери на стирен и дивинилбензен с йоногенен сулфо - и се използват аминогрупи.

В йонно-двойната хроматография се използват сорбенти с "четка" - силикагелове с присадени обратни фази С 2, С 8, С 18, които лесно се превръщат в катионен обменник при абсорбиране на йонни повърхностноактивни вещества от подвижната фаза, например алкилсулфати или соли на кватернерни амониеви бази.

При извършване на хроматографско разделяне с йонообменници най-често като подвижна фаза се използват водни разтвори на соли. Това се дължи на факта, че водата има отлични разтварящи и йонизиращи свойства, поради което молекулите на анализираната проба моментално се дисоциират на йони, йонообменните групи на йонообменника се хидратират и също се превръщат в напълно или частично дисоциирана форма. Това осигурява бърз обмен на противойони. Силата на елуиране на подвижната фаза се влияе главно от рН, йонна сила, природата на буферния разтвор и съдържанието на органичен разтворител или повърхностно активно вещество (йонна двойка хроматография).

Стойността на pH се избира в зависимост от природата на йоногенните групи, отделените йони и матрицата. Можете да работите със силно киселинни и силно основни йонообменници при pH = 2–12, със слабо киселинни при pH = 5–12, със слабо основни при pH = 2–6. Сорбентите на основата на силициев диоксид не могат да се използват при pH 9. Йонната сила на подвижната фаза влияе върху капацитета на йонообменника. С увеличаване на йонната сила сорбцията на йони обикновено намалява, тъй като силата на елуиране на подвижната фаза се увеличава. Следователно в началото на разделянето подвижната фаза трябва да има ниска йонна сила (0,05–0,1), а крайната стойност на тази характеристика не трябва да надвишава 2. При градиентно елуиране често се използват буфери с нарастваща йонна сила.

За селективно елуиране на йони, абсорбирани от йонообменник, можете да използвате вода, буферни разтвори (фосфат, ацетат, борат, хидрокарбонат и др.) с определена стойност на pH и йонна сила, минерални разтвори (солен, азотен, сяра, фосфор) и органични (фенол, лимонена, млечна, винена, оксалова, EDTA) киселини. Изборът на елуент се улеснява от факта, че граничните коефициенти на разпределение на повечето елементи между водни (водно-органични) разтвори на много комплексанти и йонообменници от стандартен тип са определени и представени в таблици.

1.6.4. Хроматография с изключване по размер.Хроматографията с изключване на размера е вид течна хроматография, при която разделянето на компонентите се основава на разпределението на молекулите според техния размер между разтворителя, разположен в порите на сорбента, и разтворителя, протичащ между неговите частици. По време на процеса на разделяне малките молекули навлизат в полимерната мрежа, в порите на която разтворителят служи като неподвижна фаза, и се задържат там. Големите молекули не могат да проникнат през полимерната мрежа и се измиват от колоната от подвижната фаза. Първо се елуират най-големите молекули, след това средните и накрая малките.

Хроматографията с изключване по размер се разделя на гел проникване и гел филтрация. При гел-проникващата хроматография разделянето става върху полимери, които набъбват в органични разтворители. Версията с гел филтрация на хроматография с изключване по размер включва използването на полимери, които набъбват във вода като неподвижни фази.

Продължителността на задържане на компонентите на анализираната проба в колоната за изключване на размера зависи от размера на техните молекули и дифузия в порите на сорбента, както и от размера на порите на неподвижната фаза.

При този тип течна хроматография коефициентът на разпределение дза най-малките молекули на анализираната проба, които се движат в хроматографската колона с най-ниска скорост, прониквайки в мрежата на стационарната фаза, той е равен на 1, тъй като подвижната фаза и разтворителят, разположен в порите на неподвижната фаза, имат същия състав. В този случай основното уравнение на колонната хроматография приема формата

Големи молекули, които не се вписват в порите на неподвижната фаза, се елуират от колоната заедно с подвижната фаза. За тях д= 0, а V Р =V м. Този диапазон от стойности на коефициента на разпределение (от 0 до 1) е типичен само за хроматография с изключване на размера.

Всички молекули на многокомпонентното вещество, което се анализира, трябва да бъдат измити от колоната чрез преминаване на малък обем разтворител от V мпреди V м +V си разделянето завършва преди да се освободи пикът на разтворителя. Следователно при този тип хроматография е необходимо да се използват доста дълги колони с голям свободен обем V ми голям брой пори в сорбента.

Разделителната способност на хроматографските пикове при разделянето с изключване по размер може да се подобри чрез използване на градиентно елуиране със смесени разтворители.

Всеки сорбент, използван в хроматографията с изключване по размер, се характеризира с определен обем на порите и следователно има определена област на отделими молекулни тегла и определена калибровъчна крива. В този случай калибровъчната графика, характеризираща зависимостта на задържания обем от молекулното тегло или размера на молекулата, като правило, има сложен вид.

Стационарните фази в хроматографията с изключване по размер се избират въз основа на специфични аналитични задачи. Първоначално се установява коя система от разтворители може да се използва за анализ (водна или водно-органична). В зависимост от това се определя вида на сорбента. Ако е необходимо да се отделят водоразтворими проби, като неподвижни фази се използват например набъбващи във вода омрежени декстрани (Sephadex) или полиакриламиди (Biogel R). Разделянето на вещества, разтворими в органични разтворители, може да се извърши върху полистирени с различна степен на омрежване, набъбване в органични разтворители (стирогел, порагел, биобид С). Такива набъбнали гелове обикновено са нестабилни под налягане и позволяват много ниски скорости на потока на подвижната фаза, което увеличава времето за анализ. За да се извърши високоефективна версия на хроматография с изключване на размера, е необходимо да се използват стационарни фази с твърди матрици - силикагели, чийто недостатък - висока адсорбционна активност - се елиминира чрез силанизиране на повърхността или избор на елуент, който съответства на полярност.

Веществата, които могат да се използват като подвижни фази в хроматографията с изключване по размер, са:

- напълно разтворете анализираната проба;

 намокрете добре сорбента;

- противодейства на адсорбцията на компонентите на пробата върху сорбента;

 имат нисък вискозитет и токсичност.

1.6.5. Равнинна хроматография. Равнинната хроматография включва тънкослойна хроматография и хартиена хроматография. Тези видове течна хроматография са прости по техника, бързи и не изискват скъпо оборудване, което е тяхното неоспоримо предимство.

Разделянето на смес от вещества по тези методи може да се извърши с помощта на различни хроматографски системи. Следователно се разграничават адсорбционна, разпределителна, нормално- и обратнофазова, йонообменна и др.хартиена и тънкослойна хроматография. Понастоящем най-широко се използва тънкослойна хроматография.

Хартиената и тънкослойната хроматография са сходни по техника. Целулозните влакна от хартия се използват като неподвижна фаза в хартиената хроматография; при тънкослойна хроматография различни сорбенти (Al 2 O 3, силикагел и др.) се нанасят в равномерен тънък (100–300 μm) слой върху стъкло, метален или пластмасов субстрат (носител) . Адсорбиращият слой върху носителя може или не може да бъде прикрепен.

Хроматографското разделяне при равнинни методи, както и в колона, се дължи на прехвърлянето на компонентите на аналита от подвижната фаза по протежение на слоя неподвижна фаза с различни скорости в съответствие с коефициентите на разпределение на веществата, които се разделят. И в двата случая се използват хроматографски системи: течност - твърд сорбент (механизъм на адсорбционно разделяне), течност - течност - твърд носител (разпределение, йонообмен и други механизми).

Като подвижни фази се използват различни разтворители или смеси от тях, органични или неорганични киселини.

Практическото производство на планарни хроматограми е както следва.

Върху лента от хроматографска хартия или върху тънък слой сорбент, маркирайте начална линия с молив на разстояние 1 cm от долния ръб на лентата или плочата. С помощта на микропипета нанесете пробата върху началната линия под формата на петно ​​с диаметър не повече от 2–3 mm. След това ръбът на лентата или плочата се спуска в съд, съдържащ подвижната фаза, разположен в запечатана камера. Тъй като подвижната фаза се издига по протежение на лентата или плочата и възникват множество елементарни актове на сорбция-десорбция, разпределение между две течни фази, йонообмен и др., които са често срещани в хроматографията, компонентите на анализираната смес се разделят. Процесът обикновено продължава, докато разтворителят премине от началната линия 10 см. След това лентата или плочата се изваждат от камерата и се изсушават. Ако компонентите на аналита са оцветени, те дават съответните цветни петна върху хроматограмата. За да се открият неоцветени компоненти на аналита, трябва да се разработи хроматограмата. Разработването на хроматограма и откриването на компонентите на пробата може да се извърши по различни методи и зависи от състава на анализираните смеси. Проявата може да се извърши:

- използване на UV осветление. Методът е приложим за откриване на вещества, способни да излъчват собствено лъчение (луминесцират) във видимия диапазон на дължината на вълната под въздействието на UV радиация;

- чрез проявяващи реактиви. Например, наличието на аминокиселини в анализираната смес може да бъде открито с помощта на нинхидрин. Изсушената хроматограма се потапя в 0,2% разтвор на нинхидрин в ацетон, след което се изсушава. Петна, съответстващи на различни компоненти на сместа, придобиват визуален и, като правило, цвят, специфичен за всяко вещество;

- използване на йод. В този случай откритата хроматограма се въвежда в съд, на дъното на който има йодни кристали. Йодните пари се адсорбират по-силно върху петната, правейки петната видими. Йодът е неспецифичен проявяващ реагент. С помощта на специфични реактиви е възможно не само да се определи броят на компонентите на сместа, но и да се идентифицират отделените вещества по цвета на петната.

Хартиената и тънкослойна хроматография най-често се извършват в така наречения възходящ вариант, описан по-горе. Доста често, за да се подобри качеството на хроматограмите, е необходимо да се използват по-сложни варианти на планарна хроматография, например низходяща, кръгова, двуизмерна. При извършване на низходяща хартиена или тънкослойна хроматография аналитът се нанася върху началната линия на плоча или хартиена лента, разположена отгоре, а елуентът се подава не отдолу, а отгоре. Положителният ефект от подобряването на разделянето се дължи на приноса на гравитацията на компонентите към процеса на разделяне.

Както възходящата, така и низходящата хроматография могат да се извършват в едномерна и двумерна версия. За разлика от процеса на едномерно разделяне в плосък слой, описан по-горе, при двумерното хроматографско разделяне пробата, която ще се анализира, първо се разделя в един разтворител, след което се разделя в посока, перпендикулярна на първата, като се използва друг разтворител, като се върти първата хроматограма с 90 o C.

При извършване на кръгова хроматография аналитът се нанася като капка в средата на плоча или лист хроматографска хартия. Тук също се добавят един или повече разтворители на капки. Това води до това, че получената хроматограма е набор от радиални петна.

Положението на петната (зоните), които образуват отделените компоненти на аналита върху плоска хроматограма, се характеризира с относителната скорост на движение на компонентите в тънък слой Р фи. Експериментално стойността Р фиопределена като съотношение на разстоянието Л азпремина аз-ти компонент, към разстоянието Лпреминат от разтворителя от началната линия до предната линия (фиг. 1.10):

величина Р физависи от естеството на съответния компонент на анализираната проба, естеството на неподвижната фаза, нейната дебелина, естеството и качеството на подвижната фаза, метода на прилагане на пробата и други фактори, но винаги Р фи 1.

величина Р фивсъщност е идентичен с времето на задържане на веществото или неговия обем на задържане, което характеризира скоростта на преминаване на веществото през хроматографска колона и може да се използва за качествена идентификация на компонентите на анализираната проба и диаметъра на петното е идентичен с височината или площта на хроматографския пик и следователно до известна степен отразява количественото съдържание на веществото.

В най-простия случай количественото определяне на състава на анализираната проба може да се оцени визуално чрез интензитета на собствения цвят на петната или интензитета на флуоресцентното сияние на получените петна по време на UV детекция. За тези цели широко се използва елуиране на хроматографски петна. В този случай петното, получено върху хроматограмата, внимателно се изрязва или изстъргва, третира се с подходящ разтворител и полученият разтвор се изследва с подходящ физикохимичен метод. Можете също да използвате метода на теглото, при който съответното петно ​​се изрязва от хроматограмата и се претегля. Количеството на веществото се определя от разликата в грамажа на чиста хартия със същата площ и хартия с веществото.

Хартия (BH ) И тънкослойна хроматография (TLC ) според механизма на разделяне принадлежат към разделителна хроматография . При метода BH носителят е спец хроматографска хартия с определени свойства. Стационарна фаза водата се адсорбира върху повърхността и порите на хартията (до 20%), подвижният е органичен разтворител, смесим или несмесим с вода, водни или електролитни разтвори.

Механизъм На хартия е доста сложно. В стационарната фаза веществото може да се задържи не само поради разтваряне във вода, адсорбирана от хартия, но и адсорбирам директно от целулоза. Отпечатано на хартия споделени компоненти преминават в подвижната фаза и се движат през капилярите на хартията с различни скорости в съответствие с междуфазов коефициент на разпределение всеки от тях. Първо хроматография част от веществото от хартията отива в подвижна фаза и продължете напред. Когато органичният разтворител достигне част от хартията, която не съдържа разтвореното вещество, това се случва отново. преразпределение : от органичната фаза веществото преминава във водната фаза, сорбирано върху хартия. Тъй като компонентите имат различни афинитет към сорбента , когато елуентът се движи, се получава разделяне: някои вещества се задържат в началото на пътя, други се движат по-нататък. Тук те се комбинират термодинамика (установяване на равновесно разпределение на веществата между фазите) и кинетичен (движение на компоненти с различни скорости) аспекти на разделянето. В резултат на това всеки компонент се концентрира върху определена област от хартиения лист: зони на отделни компоненти На хроматограма . Използването на хроматография върху хартия има редица съществени недостатъци: зависимостта на процеса на разделяне от състава и свойствата на хартията, промени във водното съдържание в порите на хартията при промяна на условията на съхранение, много ниска скорост на хроматография ( до няколко дни) и ниска възпроизводимост на резултатите. Тези недостатъци сериозно засягат разпространението на хартиената хроматография като хроматографски метод.

IN TLC метод процесът на разделяне на смес от вещества се извършва в тънък слой сорбент , отложен върху инертен твърд субстрат, и се осигурява от движение подвижна фаза (разтворител) през сорбента под влияние капилярни сили . отмеханизъм за разделяне диференцират разделителна, адсорбционна и йонообменна хроматография . Разделянето на компонентите възниква в тези случаи или в резултат на техния различен коефициент на разпределение между двете течни фази ( разделителна хроматография ), или поради различната адсорбираемост на съединенията от сорбента ( адсорбционна хроматография ). Адсорбционният метод се основава на различна степен на сорбция-десорбция на отделените компоненти върху неподвижната фаза. Адсорбция извършено за сметка на сили на Ван дер Ваалс , което е в основата физическа адсорбция , полимолекулен (образуване на няколко слоя адсорбат върху повърхността на адсорбента) и хемосорбция (химично взаимодействие на адсорбент и адсорбат).

В случай на използване на такива сорбенти за TLC като двуалуминиев оксид или силициев гел играят роля при раздялата разпространение , така адсорбция върху развитата активна повърхност на сорбента (150–750 m 2 /g). Разпределение компонентите на сместа се срещат между водата на повърхността на носителя (напр адсорбенти , Как двуалуминиев оксид , нишесте , целулоза , кизелгур - И вода форма стационарна фаза ), и разтворителят, движещ се през тази неподвижна фаза ( подвижна фаза ). Компонентът на сместа, който е по-разтворим във вода, се движи по-бавно от този, който е по-разтворим в подвижната фаза.

Адсорбция се проявява в това, че между носител , например алуминиев оксид, и се установяват компонентите на сместа адсорбционни равновесия – всеки компонент има своя собствена, резултатът от която е различни скорости на движение компоненти на сместа. Могат да се разграничат два крайни случая:

а) концентрацията на веществото върху адсорбента е нула. Веществото се разтваря напълно в подвижната фаза и се отвежда от нея (движи се заедно с предна част на разтворителя ).

б) веществото е напълно адсорбирано, не взаимодейства с разтворителя и остава в началото.

На практика с умел подбор на разтворител и адсорбент разпространение съединения се намират между тези крайни случаи, а веществото постепенно прехвърлен от един сорбентен слой в друг поради едновременно протичащи процеси сорбция И десорбция .

Разтворителят, преминаващ през сорбента, се нарича елуент , процес на придвижване на вещество заедно с елуента  елуиране . Докато течността се движи по плочата, сместа от вещества се разделя поради действието на силите адсорбция , разпространение , йонен обмен или комбинация от всички тези фактори. В резултат на това отделете хроматографски зони компоненти на сместа, т.е. Оказва се хроматограма .

Правилен подбор сорбент И елуент определя ефективността на разделяне на сместа. Подвижността на тестваното вещество зависи от неговия афинитет към сорбента и сила на елуиране (полярност) на елуента. С увеличаването на полярността на съединението, неговият афинитет към полярния сорбент също се увеличава. Чрез увеличаване на степента на адсорбция силициев гел органичните съединения са подредени в редица: въглеводороди<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь за силикагел елуентите могат да бъдат подредени в ред на увеличаване на „полярността“ ( капацитет на елуиране ) и образуват серия от разтворители ( елуотропна серия ) в съответствие с експериментални данни: алкани>бензен>хлороформ>диетилов етер>етилов ацетат>C2-C4 алкохоли>вода>ацетон>оцетна киселина>метанол. Така полярното съединение, алкохолът, е доста силно адсорбирано върху силикагел и следователно се движи слабо под въздействието на неполярен разтворител като хексан и остава близо до началната линия. На свой ред, неполярният ароматен въглеводород бифенил е значително по-подвижен в хексан, но дори и тук, за да се постигне Р f около 0,5 е необходим по-полярен апротонен елуент - метиленхлорид. Сила на елуента регулирайте с помощта на смеси от разтворители, които са съседни елуотропна серия с различна полярност.

Понастоящем в TLC се използват главно следните: сорбенти : за разделяне липофилни вещества  силициев гел , двуалуминиев оксид , ацетилирана целулоза , полиамиди ; за раздяла хидрофилни вещества  целулоза , целулозни йонообменници , кизелгур , полиамиди . Най-важната характеристика на сорбента е неговата дейност , т.е. способност сорб (задръжте) компонентите на сместа, които трябва да се разделят. В чужбина произвеждат редица компании силициев гел , кизелгур И двуалуминиев оксид с добавяне на 5% гипс, който се използва за закрепване на сорбентния слой при самостоятелно изработване на плочи.

Най-разпространеният сорбент е силициев гел - хидратирана силициева киселина, образувана от действието на минерални киселини върху Na 2 SiO 3 и изсушаване на получения зол. След смилането на зола се използва фракция с определен размер на зърното (посочен на плочата, обикновено 5-20 микрона). Силициев гел е полярен сорбент с OH групи като активни центрове. Лесно адсорбира вода на повърхността и образува водородни връзки.

Алуминий е слабоосновен адсорбент и се използва главно за разделяне на слабо основни и неутрални съединения. Недостатъкът на плочите от алуминиев оксид е задължителното активиране на повърхността преди употреба в пещ при високи температури (100-150 o C) и ниската адсорбционна способност на слоя в сравнение със силикагела.

Диатомит - адсорбент, получен от природни минерали - диатомични пръсти. Сорбентът има хидрофилни свойства и по-нисък адсорбционен капацитет на слоя в сравнение със силикагела.

целулоза: тънкослойните плочи, покрити с целулоза, са много ефективни за разделяне на сложни органични молекули. Адсорбентът се състои основно от целулозни перли с диаметър до 50 микрона, фиксирани към носител с нишесте. Както при хартиената хроматография, издигането на фронта на разтворителя става много бавно.

Хроматографски анализ изпълнени върху промишлени плочи, произведени в Чешката република " Силуфол » (« Силуфол "), изработени от алуминиево фолио, понякога подсилено с картон, и " Силупласт » изработени от пластмаса, покрита със слой сорбенти - силикагел LS 5-40 със свързващо вещество нишесте или гипс (до 10%), или алуминиев оксид с и без добавка на флуоресцентни индикатори. записи " Силуфол » имат висока скорост на елуиране, но се характеризират с ниска способност за разделяне и ниска чувствителност. По време на съхранение те са чувствителни към условия (влажност, температура, агресивна среда и др.). Някои фирми доставят хроматографски плаки със слой от сорбент с различна (обикновено до 0,25 mm), но строго постоянна дебелина (силикагел, целулоза, йонообменна смола), върху стъкло и подложки от алуминиево фолио, пластмаса, импрегниран фибростъкло.

чинии « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) се произвеждат в Русия на полимерна основа (полиетилен терефталат, клас P) или алуминиев субстрат (клас AF) с нанесен работен слой микрофракциониран силикагел сорбент класове STX-1A и STX-1VE (произведени в СССР като фракциониран силикагел KSKG) с дебелина 90-120 микрона (до 200 микрона), фиксирани със специално свързващо вещество - силициев диоксид сол . Когато се използва зол на силициева киселина (силициев зол) като свързващо вещество, което след нагряване се превръща в силикагел, получените TLC плочи се състоят от два компонента: слой силикагел и субстрат. Равномерността на дебелината на слоя сорбент върху една плоча е ±5 µm. Пример за обозначение: “Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)” - високоефективни TLC плаки върху алуминиева подложка, с луминофор, 10x10 cm.

Ако използвате стъклен субстрат (клас C), тогава такива плочи са за многократна употреба и са химически устойчиви. Тяхната химическа устойчивост се определя от химическата устойчивост на силикагела. В резултат на това плочите за TLC могат да бъдат многократно третирани с агресивни реагенти, например гореща смес от хром, което премахва ограниченията върху използването на корелиращи реагенти за откриване на петна и модифициране на сорбента и позволява многократно (до 30 пъти или повече). ) регенериране на плочите с хромна смес. Стъклените плочи могат да бъдат нарязани до необходимите размери. Механичната якост на сорбентния слой може да се регулира, осигурявайки, от една страна, транспортиране и многократна обработка на плочите и, от друга страна, възможността за екстракция на адсорбиращите слоеве с отделени вещества за последващо излугване на отделни съединения от сорбент и по-нататъшното им изследване чрез инструментални методи (IR и UV спектрометрия, рентгеноструктурни методи, NMR и др.).

Плочите се различават по размера на фракциите (разпределението на частиците) на силикагела, който изгражда слоя. На аналитични плочи (клас А) фракцията е 5-17 микрона, на високопроизводителни плочи (клас В) - 8-12 микрона. По-тясното разпределение повишава ефективността на плочите, т.е. петната от отделените вещества стават по-компактни (с по-малък размер) и следователно се разделят по-добре, когато фронтът на елуента измине по-късо разстояние. При руските вафли аналитичните и високопроизводителните слоеве не се различават много, за разлика от вафлите от Merck (Германия). Плаките с висока ефективност трябва да се използват, ако веществата не могат да бъдат разделени на аналитичните плаки. Плочите от всички модификации се произвеждат с фосфор (UV клас) с възбуждане 254 nm. Срокът на годност е неограничен, чинии " Sorbfil » широко тествани при анализа на производни на аминокиселини, пестициди, липиди, антибиотици.

Провежда се методът TLC идентификация на качеството компоненти. количествено определяне за TLC също е възможно, това изисква прилагане на точното количество вещество и допълнителни денситометрични изследвания с ясен запис на интензитета на петната. Най-често срещаният е полуколичествен метод . Базира се на визуално сравнение размерът и интензитетът на петно ​​от компонент със съответните характеристики на поредица от петна от едно и също вещество с различна концентрация ( стандартни референтни разтвори ). При използване на проба в количество от 1-5 μg този прост метод осигурява точност на определяне на съдържанието на компонента от около 5-10%. Често, за да се определят компонентите в проба, е необходимо да се извърши подготовка на пробата, за да се получи смес, съдържаща анализираните съединения. Подготовката на пробата се основава на екстракцията на лекарства от пробата с органични разтворители ( н-хексан, петролев етер, диетилов етер, хлороформ), пречистване на екстракта и последваща хроматография в тънък слой алуминиев оксид или силикагел.

Има няколко варианта за TLC и HD, които се различават по начина доставка на разтворители . В зависимост от посоката на движение на подвижната фаза има:

а)възходяща хроматография - подвижната фаза се излива на дъното на разделителната камера, хартията (плочата) се поставя вертикално;

б)низходяща хроматография  подвижната фаза се подава отгоре и се движи надолу по сорбентния слой на плочата или хартията;

V)радиална хроматография  хоризонтално движение на фронта на разтворителя: подвижната фаза се довежда до центъра на хартиения диск (плоча), където се нанася сместа, която трябва да се раздели.

Най-често срещаният е елуиране нагоре (хроматография). Отпред елуент докато се движите отдолу нагоре. Изборът на разтворител (подвижна фаза) се определя от природата на сорбента и свойствата на веществата, които се разделят.

Хроматографско разделяне чрез BCh и TLC методи се извършват в разделителна камера с припокрит капак. Количествена мярка за скоростта на пренос на вещество при използване на определен адсорбент и разтворител е R стойност f (от английски задържане фактор – коефициент на забавяне, този параметър е аналогичен на времето на задържане). Позиция зони на хроматографирания компонент определени по размер коефициент Р f , равно на отношението на скоростта на движение на неговата зона към скоростта на движение на фронта на разтворителя. величина Р f винаги е по-малко от едно и не зависи от дължината на хроматограмата. По сумата Р f се влияят от различни фактори. Така при ниски температури веществата се движат по-бавно; замърсяване с разтворител, нехомогенност на адсорбента, чужди йони в анализирания разтвор могат да променят стойността Р f до 10%. В избраната система аналитите трябва да имат различни стойности Р f и се разпределят по цялата дължина на хроматограмата. Желателно е стойностите Р f беше в диапазона 0,05-0,85.

На практика стойността Р f изчислено като съотношение на разстоянието л изминат от веществото до разстоянието Л преминали през разтворителя:

Р f = л/л (6.1 )

Обикновено за изчисление изберете спот център (Фиг. 1). величина Р f зависи от много фактори: вид хроматографска хартия (неговата порьозност, плътност, дебелина, степен на хидратация) и сорбент (размер на зърното, естество на групите на повърхността, дебелина на слоя, неговата влажност, естество на веществото, състав на подвижната фаза), експериментални условия (температура, време за хроматография и др.). Ако всички хроматографски параметри са постоянни, стойността Р f се определя само от индивидуалните свойства на всеки компонент.

Ориз. 1. Определяне на стойностите на хроматограмата Rf за компоненти АИ IN,

степен на тяхното разделение рупии и броя на теоретичните табели н .

Ефективността на HD и TLC също зависи от селективност и чувствителност реакции, използвани за откриване на компонентите на анализираната смес. Обикновено се използват реагенти, които образуват оцветени съединения - проявители - с определяните компоненти. За по надежден идентифициране на споделени компоненти Приложи " свидетели » решения стандартни вещества (в същия разтворител като пробата), чието присъствие се очаква в пробата. Стандартно вещество прилага се върху стартовата линия до анализираната проба и се хроматографира при същите условия. На практика често се използва относителна стойност:

Р f отн = Р f х / Р f стойка (6.2)

Където Р f стойка също се изчислява по формула (6.1). Ефективност хроматографско разделяне характеризират брой еквивалентни теоретични табели и тях височина . По този начин, в метода TLC броят на еквивалентните теоретични плаки н Аза компонент Асместа за разделяне се изчислява по формулата:

н А = 16 (л О.А. / а (А )) 2 (6.3)

Стойности л О.А. И А (А ) определен, както е показано на фиг. 6.1. Тогава височината на еквивалентната теоретична плоча н А е:

з А = л О.А. /Н = а (А ) 2 / 16 л О.А. . (6.4)

Раздялата е практически възможна, ако Р f (А)  Р f (IN)  0,1 .

За характеризиране на разделянето на два компонента АИ INизползване степен (критерий) на разделяне Rs :

рупии =  л/ (а (А) / 2 + а (Б) / 2)= 2  л/ (а (А) + а (Б)) (6.5)

Където  л  разстояние между центровете на компонентните точки АИ IN;

А (А) И А (IN)  диаметри на петна АИ INвърху хроматограмата (фиг. 6.1). Колкото повече рупии , толкова по-ясно са разделени компонентните петна АИ INна хроматограмата. Условия хроматография избрани така, че стойността рупии се различава от нула и едно, оптималната стойност рупии е 0,3  0,7. За ставка селективност на разделяне два компонента АИ INизползване фактор на разделяне α :

α = л б / л А (6.6)

Ако α = 1, тогава компонентите АИ INне са разделени.

(главно междумолекулни) на фазовия интерфейс. Като метод за анализ HPLC е част от група методи, които поради сложността на изследваните обекти включват предварително разделяне на оригиналната сложна смес на относително прости. След това получените прости смеси се анализират с помощта на конвенционални физикохимични методи или специални методи, разработени за хроматография.

Методът HPLC се използва широко в области като химия, нефтохимия, биология, биотехнологии, медицина, хранително-вкусова промишленост, опазване на околната среда, фармацевтично производство и много други.

Според механизма на разделяне на анализираните или разделени вещества, HPLC се разделя на адсорбция, разпределение, йонообмен, изключване, лиганд обмен и други.

Трябва да се има предвид, че в практическата работа разделянето често става не чрез един, а чрез няколко механизма едновременно. По този начин разделянето на изключването може да бъде усложнено от адсорбционни ефекти, адсорбционното разделяне чрез ефекти на разпределение и обратно. Освен това, колкото по-голяма е разликата между веществата в дадена проба по отношение на степен на йонизация, основност или киселинност, молекулно тегло, поляризуемост и други параметри, толкова по-голяма е вероятността за различен механизъм на разделяне на такива вещества.

Нормална фаза HPLC

Стационарната фаза е по-полярна от подвижната фаза, поради което неполярният разтворител преобладава в елуента:

• Хексан:изопропанол = 95:5 (за вещества с ниска полярност)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (за среднополярни вещества)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (за силно полярни вещества)

HPLC с обърната фаза

Стационарната фаза е по-малко полярна от подвижната фаза, така че елуентът почти винаги съдържа вода. В този случай винаги е възможно да се осигури пълно разтваряне на BAS в подвижната фаза, почти винаги е възможно да се използва UV откриване, почти всички подвижни фази са взаимно смесими, може да се използва градиентно елуиране, колоната може бързо да се преработи -еквилибриран, колоната може да се регенерира.

Обичайните елуенти за обратнофазова HPLC са:

• Ацетонитрил: вода
• Метанол: вода
• Изопропанол: вода

Матрици за HPLC

Матриците, използвани в HPLC, са неорганични съединения като силикагел или алуминиев оксид, или органични полимери като полистирен (омрежен с дивинилбензен) или полиметакрилат. Силикагелът, разбира се, вече е общоприет.

Основни характеристики на матрицата:

• Размер на частиците (µm);
• Размер на вътрешните пори (Å, nm).

Приготвяне на силикагел за HPLC:

1. Формоване на микросфери от полисилициева киселина;
2. Изсушаване на частици силикагел;
3. Разделяне на въздуха.

Сорбент частици:

• Редовен (сферичен): по-висока устойчивост на натиск, по-висока цена;
• Несферични: по-ниска устойчивост на натиск.

Размерът на порите в HPLC е един от най-важните параметри. Колкото по-малък е размерът на порите, толкова по-лоша е тяхната пропускливост за молекулите на елуираните вещества. И следователно, толкова по-лош е сорбционният капацитет на сорбентите. Колкото по-големи са порите, толкова по-малка е, първо, механичната стабилност на частиците на сорбента и, второ, колкото по-малка е сорбционната повърхност, следователно, толкова по-лоша е ефективността.

Ваксинации в стационарна фаза

Нормална фаза HPLC:

• Стационарна фаза с присаждане на пропилнитрил (нитрил);
• Стационарна фаза с присаждане на пропиламин (амин).

HPLC с обърната фаза:

• Стационарна фаза с присаждане на алкил;
• Стационарна фаза с алкилсилилно присаждане.

End-capping е защитата на неприсадени участъци от сорбента чрез допълнително присаждане с „малки“ молекули. Хидрофобно крайно затваряне (C1, C2): по-висока селективност, по-лоша омокряемост; хидрофилно крайно затваряне (диол): по-ниска селективност, по-висока омокряемост.

Детектори за HPLC

• UV
• Диодна матрица
• Флуоресцентни
• Електрохимия
• Рефрактометричен
• Масово селективно

Връзки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

• Хроматография
• Разпределителна хроматография

Вижте какво е "" в други речници:

високоефективна Течна хроматография- - [A.S. Goldberg. Англо-руски енергиен речник. 2006] Теми: енергия като цяло EN високоефективна течна хроматография HPLC ... Ръководство за технически преводач

високоефективна Течна хроматография- Терминът високоефективна течна хроматография Терминът на английски високоефективна течна хроматография Синоними Съкращения HPLC, HPLC Сродни термини адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фулерен, ендоедрален, хроматография... ...

ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ- течна хроматография, при която за повишаване на ефективността на разделяне носителят (елуент) под налягане (повече от 3x107 Pa) се изпомпва през колони, напълнени със сорбент с частици с малък диаметър (до 1 μm), и перфузионни филтри са също се използва......

ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ- вид хроматография, при която течността (елуент) служи като подвижна фаза и неподвижна. сорбент, телевизор носител с течност или гел, нанесен върху повърхността му. Извършва се в колона, пълна със сорбент (колонна хроматография) върху плоска... ... Естествени науки. енциклопедичен речник

Хроматография- [κρώμα (υrum) цвят] процес, основан на неравномерната способност на отделните компоненти на сместа (течни или газообразни) да останат на повърхността на адсорбента както при абсорбирането им от носещия поток, така и когато ... ... Геоложка енциклопедия

Хроматография- (от други гръцки ... Уикипедия

хроматография- Терминът хроматография Терминът на английски chromatography Синоними Съкращения Сродни термини високоефективна течна хроматография, клатрат, лаборатория върху чип, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, ензим, фулерен, ендоедрален... ... Енциклопедичен речник по нанотехнологии

ЙОННООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ- течна хроматография на базата на разг. способност на отделените йони за йонообмен с фиксирани. йони на сорбента, образувани в резултат на дисоциация на йоногенните групи на последния. Катионообменниците се използват за разделяне на катиони, за... ... Химическа енциклопедия

HPLC- високоефективна Течна хроматография… Речник на руските съкращения

HPLC- Високоефективната течна хроматография (HPLC) е един от ефективните методи за разделяне на сложни смеси от вещества, широко използван както в аналитичната химия, така и в химичните технологии. В основата на хроматографското разделяне е участието ... Wikipedia

Книги

• Практическа високоефективна течна хроматография, Veronica R. Mayer. Представяме на читателя 5-то издание на книгата, допълнено със съвременни методи и оборудване. Много са подобрени в книгата и са добавени голям брой препратки. Тези места в текста, където...

При високоефективната течна хроматография (HPLC) естеството на процесите, протичащи в хроматографската колона, обикновено е идентично с процесите в газовата хроматография. Единствената разлика е в използването на течност като неподвижна фаза. Поради високата плътност на течните подвижни фази и високата устойчивост на колоните, газовата и течната хроматография се различават значително в инструментариума.

В HPLC като подвижни фази обикновено се използват чисти разтворители или смеси от тях.

За да се създаде поток от чист разтворител (или смеси от разтворители), наречен елуент в течната хроматография, се използват помпи, включени в хидравличната система на хроматографа.

Адсорбционната хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността за взаимодействие с адсорбционните центрове на различните молекули на пробата води до тяхното разделяне на зони по време на движение с подвижната фаза по протежение на колоната. Постиганото в този случай зоново разделяне на компонентите зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Най-широко използваните в HPLC са силикагелните адсорбенти с различни обеми, повърхностни площи и диаметри на порите. Алуминиевият оксид и други адсорбенти се използват много по-рядко. Основната причина за това:

Недостатъчна механична якост, която не позволява опаковане и използване при високи налягания, характерни за HPLC;

силикагелът, в сравнение с алуминиевия оксид, има по-широк диапазон на порьозност, повърхностна площ и диаметър на порите; Значително по-голямата каталитична активност на алуминиевия оксид води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

Детектори за HPLC

Високоефективната течна хроматография (HPLC) се използва за откриване на полярни нелетливи вещества, които по някаква причина не могат да бъдат превърнати във форма, подходяща за газова хроматография, дори под формата на производни. Такива вещества, по-специално, включват сулфонови киселини, водоразтворими багрила и някои пестициди, например производни на фенил-урея.

Детектори:

UV детектор на диодна матрица. „Матрица“ от фотодиоди (повече от двеста от тях) постоянно регистрира сигнали в UV и видимите области на спектъра, като по този начин осигурява запис на UV-B спектрите в режим на сканиране. Това ви позволява непрекъснато да записвате, при висока чувствителност, неизкривени спектри на компоненти, бързо преминаващи през специална клетка.

В сравнение с откриването на една дължина на вълната, което не предоставя информация за пикова чистота, способността за сравняване на пълни спектри на диоден масив осигурява много по-висока степен на увереност в резултата от идентификацията.

Флуоресцентен детектор. Голямата популярност на флуоресцентните детектори се дължи на тяхната много висока селективност и чувствителност, както и на факта, че много замърсители на околната среда флуоресцират (напр. полиароматни въглеводороди).

Електрохимичен детектор се използва за откриване на вещества, които лесно се окисляват или редуцират: феноли, меркаптани, амини, ароматни нитро и халогенни производни, алдехиди, кетони, бензидини.

Хроматографското разделяне на смес на колона поради бавния напредък на PF отнема много време. За да се ускори процесът, хроматографията се извършва под налягане. Този метод се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC)

Модернизацията на оборудването, използвано в класическата течна колонна хроматография, я превърна в един от най-обещаващите и модерни методи за анализ. Високоефективната течна хроматография е удобен метод за разделяне, препаративно изолиране и качествен и количествен анализ на нелетливи термолабилни съединения както с ниско, така и с високо молекулно тегло.

В зависимост от вида на използвания сорбент, този метод използва 2 варианта на хроматография: върху полярен сорбент, използващ неполярен елуент (опция с директна фаза) и върху неполярен сорбент, използващ полярен елуент - така наречената обратнофазова висока -ефективна течна хроматография (RPHPLC).

По време на прехода от елуент към елуент, равновесието при HPLC условия се установява многократно по-бързо, отколкото при условия на полярни сорбенти и неводни PFs. В резултат на това, както и на удобството при работа с водни и водно-алкохолни елуенти, OFVLC сега придоби голяма популярност. Повечето HPLC анализи се извършват с помощта на този метод.

Детектори. Изходът на отделен компонент от колоната се записва с помощта на детектор. За регистрация можете да използвате промяна във всеки аналитичен сигнал, идващ от подвижната фаза и свързан с естеството и количеството на компонента на сместа. Течната хроматография използва аналитични сигнали като абсорбция на светлина или излъчване на светлина от изходния разтвор (фотометрични и флуориметрични детектори), индекс на пречупване (рефрактометрични детектори), потенциал и електрическа проводимост (електрохимични детектори) и др.

Постоянно засичаният сигнал се записва от записващо устройство. Хроматограмата е поредица от детекторни сигнали, записани на записваща лента, генерирани, когато отделни компоненти на смес напуснат колоната. Ако сместа се раздели, на външната хроматограма се виждат отделни пикове. Позицията на пика в хроматограмата се използва за идентифициране на веществото, височината или площта на пика - за целите на количественото определяне.

Приложение

HPLC се използва най-широко в следните области на химичния анализ (обектите на анализ, при които HPLC практически няма конкуренция, са подчертани):

· Контрол на качеството на храните - тонизиращи и ароматизиращи добавки, алдехиди, кетони, витамини, захари, оцветители, консерванти, хормонални препарати, антибиотици, триазин, карбамат и други пестициди, микотоксини, нитрозамини, полициклични ароматни въглеводороди и др.

· Опазване на околната среда - феноли, органични нитросъединения, моно- и полициклични ароматни въглеводороди, редица пестициди, основни аниони и катиони.

· Криминалистика – лекарства, органични експлозиви и багрила, мощни фармацевтични продукти.

· Фармацевтична индустрия - стероидни хормони, почти всички продукти на органичния синтез, антибиотици, полимерни препарати, витамини, протеинови препарати.

· Медицина - изброените биохимични и лекарствени вещества и техните метаболити в биологични течности (аминокиселини, пурини и пиримидини, стероидни хормони, липиди) при диагностициране на заболявания, определяне на скоростта на елиминиране на лекарствата от организма с цел индивидуалната им дозировка.

· Селско стопанство - определяне на нитрати и фосфати в почвите за определяне на необходимото количество внесени торове, определяне на хранителната стойност на фуражите (аминокиселини и витамини), анализ на пестициди в почвата, водата и земеделската продукция.

· Биохимия, биоорганична химия, генно инженерство, биотехнологии - захари, липиди, стероиди, протеини, аминокиселини, нуклеозиди и техните производни, витамини, пептиди, олигонуклеотиди, порфирини и др.

· Органична химия - всички стабилни продукти на органичния синтез, багрила, термолабилни съединения, нелетливи съединения; неорганична химия (почти всички разтворими съединения под формата на йони и комплексни съединения).

· контрол на качеството и безопасността на храни, алкохолни и безалкохолни напитки, питейна вода, битова химия, парфюми на всички етапи от тяхното производство;

· определяне на характера на замърсяването на мястото на техногенна катастрофа или извънредна ситуация;

· откриване и анализ на наркотични, силнодействащи, отровни и взривоопасни вещества;

· определяне на наличието на вредни вещества (полициклични и други ароматни въглеводороди, феноли, пестициди, органични багрила, йони на тежки, алкални и алкалоземни метали) в течни отпадъчни води, емисии във въздуха и твърди отпадъци от предприятия и в живи организми;

· мониторинг на процеси на органичен синтез, рафиниране на нефт и въглища, биохимични и микробиологични производства;

анализ на качеството на почвата за торене, наличието на пестициди и хербициди в почвата, водата и продуктите, както и хранителната стойност на фуража; комплексни изследователски аналитични задачи; получаване на микроколичества свръхчисти вещества.



Течна хроматография

Течна хроматографияе вид хроматография, при която подвижна фаза, наречен елуент, е течност. Стационарна фазаМоже би твърд сорбент, твърд носител с течност, отложена на повърхността муили гел.

Разграничете колоненИ тънък слойтечна хроматография. При колонния вариант част от отделената смес от вещества преминава през колона, пълна с неподвижна фаза в поток от елуент, който се движи под налягане или под въздействието на гравитацията. При тънкослойна хроматография елуентът се движи под действието на капилярни сили по плосък слой сорбент, нанесен върху стъклена плоча или метално фолио, по протежение на порест полимерен филм или по лента от специална хроматографска хартия. Разработен е и метод за тънкослойна течна хроматография под налягане, при който елуентът се изпомпва през слой от сорбент, поставен между плочи.

Има такива видове течна хроматография като аналитичен(за анализ на смеси от вещества) и препаративна(за изолиране на чисти компоненти).

Разграничете течна хроматография (LC)в класическия му вариант, осъществен с атмосферно налягане, И висока скорост), извършено в високо кръвно налягане. Високоефективната течна хроматография (HPLC) използва колони с диаметър до 5 mm, плътно напълнени със сорбент с малки частици (3-10 µm). За да изпомпвате елуента през колоната, приложете налягане до 3,107 Pa. Този тип хроматография се нарича хроматография под високо налягане. Преминаването на елуента през колона под високо налягане ви позволява драстично да увеличите скоростта на анализа и значително да увеличите ефективността на разделяне поради използването на фино диспергиран сорбент.

HPLC опцииса микроколонна хроматографиявърху колони с малък диаметър, напълнени със сорбент и капилярна хроматографиявърху кухи и напълнени със сорбент капилярни колони. Понастоящем методът HPLC позволява изолиране, количествен и качествен анализ на сложни смеси от органични съединения.

Течната хроматография е най-важният физико-химичен изследователски метод в химията, биологията, биохимията, медицината и биотехнологиите. Използва се за:

· изследване на метаболитните процеси в живите организми на лекарства;

· диагностика в медицината;

· анализ на продукти от химичен и нефтохимичен синтез, междинни продукти, багрила, горива, смазочни материали, масла, отпадъчни води;

· изследване на сорбционни изотерми от разтвор, кинетика и селективност на химичните процеси;

· освобождаване от отговорност

· анализ и разделяне на смеси, тяхното пречистване и изолиране на много биологични вещества от тях, като аминокиселини, протеини, ензими, вируси, нуклеинови киселини, въглехидрати, липиди, хормони.

В химията на високомолекулните съединения и при производството на полимери течната хроматография се използва за анализ на качеството на мономерите, изследване на разпределението на молекулното тегло и разпределението по тип функционалност на олигомери и полимери, което е необходимо за контрол на продукта.

Течната хроматография се използва и в парфюмерията, хранително-вкусовата промишленост, за анализ на замърсяването на околната среда и в криминалистиката.

Методът на високоефективната течна хроматография (HPLC) е разработен и въведен в средата на 70-те години на 20 век. Тогава се появяват първите течни хроматографи.

Течната хроматография е оптималният метод за анализиране на химически и термично нестабилни молекули, вещества с високо молекулно тегло и намалена летливост. Това може да се обясни със специалната роля на подвижната фаза в LC, за разлика от газовата хроматография: елуентът изпълнява не само транспортна функция.

2. Основни понятия и класификация на методите за течна хроматография.

от механизъм на задържане на отделените вещества от неподвижната фаза LCразличавам:

седиментна хроматография, въз основа на различната разтворимост на утайките, които се образуват при взаимодействието на компонентите на анализираната смес с утаителя. Предимството на метода е, че получените зони по сорбента имат резки граници, съдържат утайки само от едно вещество и често са разделени от зони на чист сорбент. Този метод обаче все още не е намерил широко приложение.

· адсорбционна хроматография , при които разделянето се извършва в резултат на взаимодействието на отделяното вещество с адсорбенткато алуминиев оксид или силикагел, като на повърхността активни полярни центрове. Разтворител(елуент) - неполярна течност.

Ориз. Схема за разделяне на смес от вещества с помощта на адсорбционна хроматография

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Механизмът на сорбция се състои от специфично взаимодействие между полярната повърхност на сорбента и полярните (или способни на поляризация) участъци на молекулите на анализирания компонент (фиг.). Взаимодействието възниква поради взаимодействието донор-акцептор или образуването на водородни връзки.

Ориз. Схема на адсорбционна течна хроматография

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Ориз. . Разделителна хроматография с присадена фаза (версия с нормална фаза).

http://www. хемнет. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

При нормална фазаВъв версията за разделителна течна хроматография, заместени алкилхлоросилани, съдържащи полярни групи, като нитрил, аминогрупа и т.н., се използват като повърхностни модификатори на силикагел (присадени фази) (фиг.). Използването на присадени фази дава възможност за фино контролиране на сорбционните свойства на повърхността на неподвижната фаза и постигане на висока ефективност на разделяне.

Обърната фазатечната хроматография се основава на разпределението на компонентите на сместа между полярен елуент и неполярни групи (дълги алкилови вериги), присадени върху повърхността на сорбента (фиг.). По-рядко използван е вариант на течна хроматография с отложени фази, когато течна неподвижна фаза се отлага върху неподвижен носител.

Ориз. . Разпределителна хроматография с присадена фаза (версия с обърната фаза). http://www. хемнет. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Разделителната течна хроматография също включва екстракционна течност хроматография, в който неподвижната фаза е органичен екстрагент, отложен върху твърд носител, а подвижната фаза е воден разтвор на съединенията, които се разделят. Като екстрагенти се използват например феноли, триалкилфосфати, амини, кватернерни амониеви основи, както и съдържащи сяра органофосфорни съединения. Екстракционната течна хроматография се използва за разделяне и концентриране на неорганични съединения, например йони на алкални метали, актиниди и други елементи с подобни свойства, в процесите на преработка на отработено ядрено гориво.

йонообменна хроматография,който се основава на обратим стехиометричен обмен на йони, съдържащи се в анализирания разтвор, с подвижни йони, включени в състава йонити.В зависимост от знака на заряда на йонизиращите групи йонообменниците се делят на катионни обменнициИ анионобменници.Също така има амфотерни йонообменници –амфолити, които могат едновременно да обменят както катиони, така и аниони. Йонообменната хроматография се използва само за разделяне на заредени частици. Разделянето се основава на способността на йонообменната смола да задържа различни йони с различна сила. Йонитсе състои от полимерна матрица и активни групи, свързани с нея, които са способни на йонен обмен. Катионитима киселинни или слабо киселинни свойства, тъй като съдържа групи: - SO3H, –CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 и други, в които водородните йони са подвижни. Анионобменнициимат основни или слабо основни свойства и съдържат групи: = NH2, - NH2, –NR3+, -OH и др. Разделянето на йони се регулира чрез избор на оптимални стойности на pH на елуента и неговата йонна сила. Схематично йонообменът може да бъде представен чрез реакциите:

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (катионен обмен)

R-OH + Na+ + Cl - → R-Cl + Na+ + OH - (анионен обмен)

Йонообменниците трябва да отговарят на следните изисквания: да са химически стабилни в различни среди, механично здрави в сухо и особено набъбнало състояние, да имат висока абсорбционна способност и способност за добра регенерация.

При йонообменна (йонна) хроматография, отделените аниони (катиони) се откриват като киселини (съответстващи основи) от високочувствителен кондуктометричен детектор, където високоефективните колони са пълни с повърхностноактивна йонна смола с нисък капацитет.

хроматография на йонни двойки, което може да се разглежда като комбинация от адсорбционна и йонообменна хроматография. Методът се основава на извличането на йонни вещества - прехвърлянето им от водната фаза в органичната фаза под формата на йонни двойки. За да направите това, към подвижната фаза се добавя противойон, който е способен селективно да реагира с анализираните компоненти, превръщайки ги в комплексни съединения с образуването на йонна двойка. Основните предимства на тази опция са, че киселинни, основни и неутрални вещества могат да бъдат анализирани едновременно.

лигандообменна хроматографиябазиран на различни способности на отделените съединения да образуват комплекси с катиони на преходни метали– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 и др. - и фиксиращи групи (лиганди) на неподвижната фаза. Част от координационната сфера на металните йони е заета от водни молекули или други слаби лиганди, които могат да бъдат изместени от молекули на отделяните съединения. Този тип хроматография се използва за разделяне на оптични изомери.

хроматография с изключване на размера(сито, гел-проникване, гел-филтрация), при които се основава разделянето разлики в молекулните размери.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Ориз. Схема на гел проникваща хроматография

афинитетна хроматография(биоспецифичен), основан на факта, че много биологично активни макромолекули, например ензими, могат специфично да се свържат с определен реагент. Реагентът се фиксира към носител (често агароза), след което се промива със сместа за анализ. Само желаната макромолекула се задържа върху полимера (фиг.).

Ориз. Схема на афинитетна хроматография

http://www. хемнет. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

След това се отстранява от полимера чрез преминаване на разтвор на съединение, което има още по-голям афинитет към макромолекулата. Такава хроматография е особено ефективна в биотехнологиите и биомедицината за изолиране на ензими, протеини и хормони.

В зависимост за метода на движение на материятаРазграничават се следните видове течна хроматография: развитие, фронталноИ репресивен.
Най-често се използва манифестивенвариант, при който част от сместа, която трябва да се раздели, се въвежда в колоната в потока на елуента. Изходът на компонентите на сместа от колоната се записва на хроматограмата под формата на пикове. (ориз.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Ориз. Схема на разработване на хроматографски вариант

Височинаили пикова площхарактеризира концентрация на компоненти, А Държани обеми – висококачествен състав на сместа. Идентифицирането на компонентите обикновено се извършва чрез съвпадение на времето на задържане със стандартни вещества; използват се също химични или физикохимични методи.

При челенВъв варианта (фиг.) през колоната, която играе ролята на подвижна фаза, непрекъснато се пропуска смес от веществата, които се разделят. В резултат на това е възможно да се получи в чиста форма само веществото, което е най-малко сорбирано в колоната.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Ориз. Схема на опцията за фронтална хроматография

Хроматограмата в този случай представлява стъпки, чиято височина е пропорционална на концентрациите на компонентите; задържаните обеми се определят от времето на задържане на компонентите. При диференциране на такава хроматограма се получава картина, подобна на тази, получена в развиващата се версия.

IN репресивенВ този случай компонентите на сместа, въведени в колоната, се изместват от елуента, който се адсорбира по-силно от всеки компонент. В резултат на това се получават съседни една на друга фракции на отделените вещества.Редът на отделяне на компонентите се определя от силата на взаимодействието им с повърхността на сорбента (фиг.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Ориз. Схема на заместваща хроматография

3. Основни хроматографски величини и тяхното определяне.

Когато се разделят вещества с помощта на течна хроматография, могат да се използват опции за развитие, фронтално и изместване, както е посочено по-горе. Най-често се използва вариант на проявяване, при който част от сместа, която трябва да се раздели, се въвежда в колоната в потока на елуента. Изходът на компонентите на сместа от колоната се записва на хроматограмата под формата на пикове. От хроматограмата (фиг.) определете:

времена на задържане на несорбиращи (t0), отделени компоненти (tR1, tR2, tR3 и др.); ширина на основите на пика (tw1, tw2 и т.н.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

б) коригиран обем на задържане на компонента ,

Където t"R -коригирано време на задържане на компонента;

° С) коефициент на капацитет на колона по отношение на даден компонент ;

д) ефективност на колонатахарактеризира брой еквивалентни теоретични табели

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

е) разрешение https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Коефициент на капацитет к" има значително влияние върху стойността Р S: при смяна к" от 0 до 10 (оптимални граници) Р S се увеличава значително. Смисъл к"се определя от удвоената повърхност на сорбента и неговото количество в колоната, както и константата на адсорбционното равновесие (константата на Хенри).

Коефициент на селективност αсе определя от разликата в адсорбционните равновесни константи на двата разделени компонента. С увеличаване на α (от 1 до ~5) Р S нараства рязко, с по-нататъшно увеличаване на α - се променя малко. Селективността на колоната зависи от фактори като химическата структура на повърхността на сорбента, състава на елуента, температурата на колоната и структурата на съединенията, които се разделят. Тъй като сорбцията на хроматографирани вещества в течната хроматография се определя от двойното взаимодействие на трите основни компонента на системата - сорбента, разделяните вещества и елуента, промяната на състава на елуента е удобен начин за оптимизиране на процеса на разделяне .

Ефективност на колонатазависи от размера на частиците и структурата на порите на адсорбента, от равномерността на опаковане на колоната, вискозитета на елуента и скоростта на пренос на маса. Удължаването на колоната не винаги води до подобрено разделяне, тъй като съпротивлението на колоната се увеличава, налягането на елуента на входа и времето на експеримента се увеличават, а чувствителността и точността на анализа намаляват поради разширяването на пика на анализирания компонент. Ако , тогава пиковете на двете вещества в хроматограмата са разделени почти напълно. С растеж Р S времето за отделяне се увеличава. При РС < 1 - раздялата е незадоволителна. При препаративната хроматография, поради въвеждането на относително големи количества отделени вещества, колоната работи с претоварване. В този случай коефициентът на капацитет намалява, височината, еквивалентна на теоретичната плоча, се увеличава, което води до намаляване на разделителната способност.

4. Адсорбенти

Хроматографското разделяне на смес ще бъде ефективно, ако адсорбентът и разтворителят (елуент) са правилно избрани.

Адсорбентът не трябва да взаимодейства химически с отделените компоненти или да проявява каталитичен ефект върху разтворителя. Също така е необходимо адсорбентът да бъде селективен по отношение на компонентите на сместа. Правилно избраният адсорбент трябва да има максимална абсорбционна способност.

Разграничете полярен (хидрофилен)И неполярни (хидрофобни) адсорбенти. Трябва да се помни, че адсорбционният афинитет на полярните вещества към полярните сорбенти е много по-висок, отколкото при неполярните.

Като адсорбенти се използват алуминиев оксид, активен въглен, силикагел, зеолити, целулоза и някои минерали.

Алуминиев оксидAl2O3 – амфотерен адсорбент.(Фиг.) На него смесите могат да се разделят вещества в полярни, така в неполярни разтворители. Неутрален алуминиев оксид обикновено се използва за хроматография от неводни разтвори на наситени въглеводороди, алдехиди, алкохоли, феноли, кетони и етери.

Ориз. Алуминиев оксид за хроматография

http://изображения. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активността на Al2O3 зависи от съдържанието на влага. Безводният алуминиев оксид има най-висока активност. Условно се приема като едно. Ако е необходимо, може да се приготви алуминиев оксид с различно съдържание на влага чрез смесване на прясно приготвен алуминиев оксид с вода (скала на Брокман).

Зависимост на активността на алуминиевия оксид от съдържанието на влага

Например, Al2O3 с активност 1,5-2 се използва за разделяне на въглеводороди; за разделяне на алкохоли и кетони – 2-3,5.

Специфичната повърхност на алуминиевия оксид е 230-380 m2/g.

Силициев гел(хидроксилиран или химически модифициран) е изсушен желатинообразен силициев диоксид, който се получава от пренаситени разтвори на силициева киселина ( н SiO2 м H2O) при pH > 5-6. (фиг.) Твърд хидрофилен сорбент.

Ориз. Силициев гел

http://www. силициев гел. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Размерът на частиците на силикагела в аналитични колони е 3-10 микрона, в препаративни колони - 20-70 микрона. Малкият размер на частиците увеличава скоростта на пренос на маса и подобрява ефективността на колоната. Съвременните аналитични колони са с дължина 10-25 cm. Те са пълни със силикагел с размер на частиците 5 микрона и ви позволяват да разделяте сложни смеси от 20-30 компонента. Тъй като размерът на частиците намалява до 3-5 микрона, ефективността на колоната се увеличава, но нейната устойчивост също се увеличава. Така че, за да се постигне скорост на потока на елуента от 0,5-2,0 ml/min, е необходимо налягане от (1-3)·107 Pa. Силикагелът може да издържи на такава разлика в налягането, докато гранулите на полимерните сорбенти са по-еластични и деформируеми. Напоследък са разработени механично здрави полимерни сорбенти с макропореста структура с плътна мрежа, които по своята ефективност са близки до силикагелите. Формата на частиците на сорбента с размер от 10 µm и повече не оказва голямо влияние върху ефективността на колоната, но се предпочитат сферичните сорбенти, които осигуряват по-пропусклива опаковка (фиг.)

Ориз. Сферичен силикагел

http://изображения. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Вътрешната структура на частица силикагел е система от комуникационни канали. За течна хроматография се използват сорбенти с диаметър на порите 6-25 nm. Разделянето чрез течна хроматография се извършва главно върху силикагелове, модифицирани чрез реакцията на алкил и арил хлоросилани или алкил етокси силани със силанолни групи на повърхността. С помощта на такива реакции се присаждат групи C8H17-, C18H37- или C6H5- (за получаване на сорбенти с хидрофобизирана повърхност), нитрилни, хидроксилни групи и др. (фиг.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Ориз. Структура на модифициран силикагел

Силикагелиизползвани в хроматографията за разделяне на смеси от петролни продукти, вис мастни киселини, техните естери, ароматни амини, нитро производни органични съединения. Силициев гел – хидрофилен сорбент, лесно се намокря с вода. Поради това не може да се използва за сорбция от водни разтвори. Активността на силикагела зависи от съдържанието на вода в него: колкото по-малко вода съдържа, толкова по-голяма е активността (скалата на Брокман).

Зависимост на активността на силикагела от съдържанието на влага

Специфичната повърхност на силикагелите е 500-600 m2/g.

Активни въглениса форма на въглерод, която, когато се обработи, става изключително пореста и придобива много голяма повърхностна площ, достъпна за адсорбция или химични реакции (Фиг.) Те имат специфична повърхност от 1300-1700 m2/g.

Ориз. Активен въглен

http://e-каталог. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Основно влияние върху структурата на порите на активните въглища оказват изходните материали за тяхното производство. Активните въглени на базата на кокосови черупки се характеризират с по-голям дял микропори (до 2 nm), докато тези на базата на въглища се характеризират с по-голям дял на мезопори (2-50 nm). Голяма част от макропорите е характерна за активния въглен на дървесна основа (повече от 50 nm). Микропорите са особено подходящи за адсорбция на молекули с малък размер, докато мезопорите са особено подходящи за адсорбция на по-големи органични молекули.

Зеолити (молекулярни сита)– порести кристални алумосиликати на алкални и алкалоземни метали от естествен и синтетичен произход. (ориз.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Ориз. Зеолити

http://www. зеолит spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/палец. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Известни са четири типа зеолити (A, X, Y, M), които имат различни кристални структури. В зависимост от катиона зеолитите се обозначават по следния начин: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Свойства на зеолититее това порите на кристалите са с размери от порядъка на 0,4-1 nm, сравними с размера на молекулитемного течни или газообразни вещества. Ако молекулите на дадено вещество са в състояние да проникнат в тези пори, тогава в порите на зеолитните кристали възниква адсорбция. По-големите молекули на веществото не се адсорбират. Чрез избор на зеолити с различни размери на порите, смесите от различни вещества могат да бъдат ясно разделени.

Специфичната повърхност на зеолитите е 750-800 m2/g.

При избора на адсорбент е необходимо да се вземе предвид структурата на веществата и тяхната разтворимост. Например, наситените въглеводороди се адсорбират слабо, докато ненаситените въглеводороди (имат двойни връзки) се адсорбират по-добре. Функционалните групи повишават адсорбционната способност на дадено вещество.

5. Елуенти

При избора на разтворител (елуент) трябва да вземете предвид естеството на адсорбента и свойствата на веществата в сместа, която трябва да се раздели. Елуентите трябва да разтварят добре всички компоненти на хроматографираната смес, да имат нисък вискозитет, да осигуряват необходимото ниво на селективност, да бъдат евтини, нетоксични, инертни и съвместими с методите за откриване (например бензолът не може да се използва като елуент с UV детектор).

В нормалнофазовата хроматография обикновено се използват въглеводороди (хексан, хептан, изооктан, циклохексан) с добавяне на малки количества хлороформ CHCl3, изо-пропанол, изо-C3H7OH, диизопропилов етер; при обратнофазова хроматография - смес от вода с ацетонитрил CH3CN, метанол CH3OH, етанол C2H5OH, диоксан, тетрахидрофуран, диметилформамид. За да се изолират отделни компоненти на смес, разделени по време на хроматография, те често се промиват (елуират) последователно. За тази цел се използват разтворители с различна десорбционна способност. Разтворителите са подредени в низходящ ред на десорбираща способност в полярните адсорбенти - елуотропни серии на Трапе. Ако компонентите на разделяната смес имат сходни стойности к" (коефициент на капацитет на колоната спрямо даден компонент), след което се хроматографира с един елуент. Ако отделните компоненти на сместа са силно задържани от сорбента, се използва серия от елуенти с нарастваща сила.

Елуотропна серия от разтворители

6. Оборудване за течна хроматография

В съвременната течна хроматография се използват инструменти с различна степен на сложност - от най-простите системи до хроматографи от висок клас.
Съвременният течен хроматограф включва: контейнери за елуенти, помпи за високо налягане, дозатор, хроматографска колона, детектор, записващо устройство, система за управление и математическа обработка на резултатите.

На фиг. представена е блокова схема на течен хроматограф, съдържаща минимално необходимия набор от компоненти, под една или друга форма, присъстващи във всяка хроматографска система.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Ориз. Схема на течен хроматограф: 1 - резервоар за подвижната фаза, 2 - помпа, 3 - инжектор, 4 - колона, 5 - термостат, 6 - детектори, 7 - записваща система, 8 - компютър.

Резервоар за съхранениеза подвижната фаза, трябва да има достатъчен капацитет за анализ и устройство за обезгазяване на разтворителяза предотвратяване образуването на мехурчета от газове, разтворени в елуента в колоната и детектора.

помпапредназначени за създаване на постоянен поток от разтворител. Неговият дизайн се определя основно от работното налягане в системата. За работа в диапазона 10-500 MPa се използват бутални (шприцови) помпи. Недостатъкът им е необходимостта от периодични спирания за напълване с елуент. За прости системи с ниско работно налягане от 1-5 MPa се използват евтини перисталтични помпи. Елуентите влизат в помпата през филтър, който задържа прахови частици (повече от 0,2 микрона). Понякога през елуентите се пропуска малък поток от хелий, за да се отстрани разтвореният въздух и да се предотврати образуването на мехурчета в детектора (особено в случай на водни и полярни елуенти). В аналитичните хроматографи се използват бутални помпи със система за обратна връзка за подаване на елуента към колоната, което прави възможно изглаждането на пулсациите на потока в рамките на 1-2% и осигурява обемни скорости на потока от 0,1 до 25 ml/min при налягания до ~ 3,107 Pa. При микроколонната хроматография обемните скорости на потока на елуента са много по-ниски - 10-1000 µl/min. В случай на градиентно елуиране се използват няколко помпи, които се управляват от програматор и доставят 2-3 компонента на елуента в смесителната камера, оставяйки общия дебит постоянен. За въвеждане на проба в колона под високо налягане без спиране на потока се използват специални микродозиращи кранове, свързани към контур с известен обем за изследваната проба от разтвора. Разработени са системи за дозиране с автоматично вземане на проби и инжектиране на проби с помощта на микродозиращи кранове или спринцовки.

Инжекторосигурява инжектиране на проба от смесразделени компоненти в колона с доста висока възпроизводимост. Обикновените системи за инжектиране на проби със спиране на потока изискват спиране на помпата и поради това са по-малко удобни от пипетите с контур, разработени от Reodyne.

Колониза HPLC най-често се изработват от полирана тръба от неръждаема стомана с дължина 10-25 cm и вътрешен диаметър 3-5 mm.

Ориз. Хроматографски колони за течна хроматография

Също така се използва стъклени говорители, поставен в метален корпус; в микроколонна хроматография - опаковани метални високоговорителис вътрешен диаметър 1,0-1,5 mm, опаковани стъклени микроколонис диаметър 70-150 микрона и кухи капилярни колонидиаметър 10-100 микрона; в препаративната хроматография - колони с диаметър от 2 до 10 cm или повече. За равномерно и плътно запълване на колоните със сорбент се използва методът на опаковане на суспензията. Приготвя се суспензия от сорбент и подходяща органична течност, която се подава под налягане до 5·107 Ра в колоната. За определяне на отделените компоненти, напускащи колонаизползване детектори. Постоянност на температуратапредоставени термостат.

Детекториза течна хроматография имат проточна клетка, в която се извършва непрекъснато измерване на някои свойства на течащия елуент. Трябва да са много чувствителни. За повишаване на чувствителността на детектора понякога се използва дериватизация на компонентите на сместа след колоната. За тази цел с потока на елуента се въвеждат реагенти, които, взаимодействайки с отделените вещества, образуват производни с по-изразени свойства, например по-силно абсорбират в UV или видимата област на спектъра или имат по-голяма флуоресцентна способност. Понякога дериватизацията се извършва преди хроматографския анализ и производните се разделят, а не изходните материали. Най-популярните видове детекториобщо предназначение са рефрактометри, измерване индекс на пречупване, И спектрофотометрични детектори, определящ оптична плътност на разтворителяпри фиксирана дължина на вълната (обикновено в ултравиолетовата област). ДА СЕ предимства на рефрактометрите(И недостатъци на спектрофотометрите) трябва да бъдат приписани ниска чувствителност към типа, който се определя връзки, които може да не съдържат хромофорни групи. От друга страна, използването на рефрактометри е ограничено до изократични системи (с постоянен състав на елуента), така че използването на градиент на разтворителя в този случай е невъзможно.

Диференциален "href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">диференциален усилвател и рекордер.Желателно е също да има интегратор, което ви позволява да изчислите относителните площи на получените пикове. В сложни хроматографски системи се използва интерфейсен блок, свързвайки хроматографа към персонален компютър, който не само събира и обработва информация, но също така контролира устройството, изчислява количествените характеристики и в някои случаи качествения състав на смесите. Микропроцесоросигурява автоматично инжектиране на проби, промяна от определена програма за състава на елуентас градиентно елуиране, поддържане температура на колоната.

Брукер“.Ориз. Течен хроматограф Джаско

Въпроси за самопроверка

Какво е течна хроматография? Назовете неговите видове и области на приложение. Списък заосновни хроматографски величини и тяхното определение Какви видове течна хроматография съществуват в зависимост от механизма на задържане на отделените вещества от неподвижната фаза на LC? Какви видове хроматография съществуват в зависимост от метода на преместване на веществото? Какви вещества се използват като адсорбенти? Каква е разликата? Какво служи като течна подвижна фаза - елуент? Изисквания към разтворителите. Каква е разликата между разделителната хроматография и адсорбционната хроматография? Избройте основните части на веригата на течен хроматограф и тяхното предназначение.

Списък на използваната литература

1 "Течна хроматография в медицината"

http://дневник. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 „Въведение в методите за високоефективна течна хроматография“

http://www. хемнет. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 "Течна хроматография"

http://e-science. ru/index/?id=1540

4 "Хроматография"

http://belchem. хората ru/chromatography1.html