Почти всички биохимични реакции са ензимни. Ензими(биокатализатори) са протеинови вещества, активирани от метални катиони. Известни са около 2000 различни ензима, като около 150 от тях са изолирани, някои от които се използват като лекарства. Трипсин и химотрипсин се използват за лечение на бронхит и пневмония; пепсин - за лечение на гастрит; плазмин - за лечение на инфаркт; Панкреатин – за лечение на панкреаса. Ензимите се различават от конвенционалните катализатори: (а) по по-висока каталитична активност; (б) висока специфичност, т.е. селективност на действието.
Механизмът на едносубстратна ензимна реакция може да бъде представен чрез следната диаграма:
където Е е ензим,
S - субстрат,
ES - ензимно-субстратен комплекс,
P е реакционният продукт.
Характеристиката на първия етап от ензимната реакция е Константа на Михаелис (K M). K M е реципрочната стойност на равновесната константа:
Константата на Михаелис (K M) характеризира стабилността на ензим-субстратния комплекс (ES). Колкото по-ниска е константата на Михаелис (K M), толкова по-стабилен е комплексът.
Скоростта на ензимната реакция е равна на скоростта на нейния ограничаващ скоростта етап:
където k 2 е константата на скоростта, наречена брой оборотиили молекулярната активност на ензима.
молекулярна ензимна активност(k 2) е равен на броя на субстратните молекули, подложени на трансформации под въздействието на една ензимна молекула за 1 минута при 25 0 C. Тази константа приема стойности в диапазона: 1·10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .
За уреаза, която ускорява хидролизата на урея, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; за аденозин трифосфатаза, която ускорява хидролизата на АТФ, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; за каталаза, която ускорява разлагането на H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.
Кинетичното уравнение на ензимната реакция във формата, в която е дадено по-горе, обаче е практически невъзможно да се използва поради невъзможността за експериментално определяне на концентрацията на ензимно-субстратния комплекс (). Изразено чрез други количества, които лесно се определят експериментално, получаваме кинетичното уравнение на ензимните реакции,Наречен по уравнението на Михаелис-Ментен (1913):
,
където произведението k 2 [E] total е постоянна стойност, която се обозначава (максимална скорост).
Съответно: 
Нека разгледаме специални случаи на уравнението на Михаелис-Ментен.
1) Следователно при ниска концентрация на субстрат K M >> [S].
което съответства на кинетичното уравнение на реакция от първи ред.
2) При висока концентрация на субстрат K m<< [S], поэтому
което съответства на кинетичното уравнение на реакцията от нулев ред.
По този начин, при ниска концентрация на субстрата, скоростта на ензимната реакция се увеличава с увеличаване на съдържанието на субстрата в системата, а при висока концентрация на субстрата кинетичната крива достига плато (скоростта на реакцията не зависи от концентрацията на субстрата) (фиг. 30).
Фигура 30. - Кинетична крива на ензимна реакция
Ако [S] = K M, тогава
което ви позволява да определите графично константата на Михаелис K m (фиг. 31).
Фигура 31. - Графично определение на константата на Михаелис
Активността на ензимите се влияе от: (а) температура, (б) киселинност на средата, (в) наличие на инхибитори. Ефектът на температурата върху скоростта на ензимната реакция е разгледан в глава 9.3.
Влиянието на киселинността на средата върху скоростта на ензимната реакция е представено на фигура 32. Максималната ензимна активност съответства на оптималната стойност на pH (pH opt).
Фигура 32. - Ефект на киселинността на разтвора върху ензимната активност
За повечето ензими оптималните стойности на pH съвпадат с физиологичните стойности (7,3 - 7,4). Има обаче ензими, чието нормално функциониране изисква силно кисела (пепсин - 1,5 - 2,5) или достатъчно алкална среда (аргиназа - 9,5 - 9,9).
Ензимни инхибитори- това са вещества, които заемат част от активните центрове на ензимните молекули, в резултат на което скоростта на ензимната реакция намалява. Като инхибитори действат катиони на тежки метали, органични киселини и други съединения.
Лекция 11
Атомна структура
Има две дефиниции на понятието „атом“. атоме най-малката частица от химичен елемент, която запазва своите химични свойства.
атоме електрически неутрална микросистема, състояща се от положително заредена сърцевина и отрицателно заредена електронна обвивка.
Учението за атома е преминало през дълъг път на развитие. Основните етапи в развитието на атомизма включват:
1) натурфилософски етап - периодът на формиране на концепцията за атомната структура на материята, непотвърдена от експеримента (5 век пр. н. е. - 16 век сл. н. е.);
2) етапът на формиране на хипотезата за атома като най-малката частица от химичен елемент (XVIII-XIX век);
3) етапът на създаване на физически модели, които отразяват сложността на структурата на атома и позволяват да се опишат неговите свойства (началото на 20 век)
4) съвременният етап на атомизма се нарича квантовомеханичен. Квантова механикае дял от физиката, който изучава движението на елементарните частици.
ПЛАН
11.1. Строеж на ядрото. Изотопи.
11.2. Квантовомеханичен модел на електронната обвивка на атома.
11.3. Физикохимични характеристики на атомите.
Строеж на ядрото. Изотопи
Атомно ядрое положително заредена частица, състояща се от протони, неутрони и някои други елементарни частици.
Общоприето е, че основните елементарни частици на ядрото са протоните и неутроните. Протон (p) –е елементарна частица, чиято относителна атомна маса е 1 amu и нейният относителен заряд е +1. Неутрон (n) –Това е елементарна частица, която няма електрически заряд и чиято маса е равна на масата на протона.
99,95% от масата на атома е концентрирана в ядрото. Между елементарните частици съществуват специални ядрени сили на разширение, които значително надвишават силите на електростатичното отблъскване.
Основната характеристика на атома е зарежданенеговият ядки, равен на броя на протоните и съвпадащ с атомния номер на елемента в периодичната таблица на химичните елементи. Съвкупност (вид) от атоми с еднакъв ядрен заряд се нарича химичен елемент. В природата се срещат елементи с номера от 1 до 92.
Изотопи- това са атоми на един и същи химичен елемент, съдържащи еднакъв брой протони и различен брой неутрони в ядрото.
където масовото число (A) е масата на ядрото, z е зарядът на ядрото.
Всеки химичен елемент е смес от изотопи. По правило името на изотопите съвпада с името на химичния елемент. Въпреки това са въведени специални имена за изотопите на водорода. Химичният елемент водород е представен от три изотопа:
Число p Число n
Протиум N 1 0
Деутерий D 1 1
Тритий Т 1 2
Изотопите на даден химичен елемент могат да бъдат както стабилни, така и радиоактивни. Радиоактивните изотопи съдържат ядра, които спонтанно се разпадат, освобождавайки частици и енергия. Стабилността на ядрото се определя от съотношението му неутрон-протон.
Попадайки в организма, радионуклидите нарушават най-важните биохимични процеси, намаляват имунитета и обричат организма на заболяване. Тялото се предпазва от въздействието на радиацията, като избирателно абсорбира елементи от околната среда. Стабилните изотопи имат приоритет пред радиоактивните изотопи. С други думи, стабилните изотопи блокират натрупването на радиоактивни изотопи в живите организми (Таблица 8).
Книгата на С. Шанън „Хранене в атомната епоха“ предоставя следните данни. Ако се приеме блокираща доза от ~100 mg стабилен изотоп йод не по-късно от 2 часа след навлизането на I-131 в тялото, усвояването на радиоактивен йод в щитовидната жлеза ще бъде намалено с 90%.
Радиоизотопите се използват в медицината
за диагностика на някои заболявания,
· за лечение на всички форми на рак,
· за патофизиологични изследвания.
Таблица 8 - Блокиращ ефект на стабилни изотопи
Ензимната кинетика изучава скоростта на реакциите, катализирани от ензими, в зависимост от различни условия (концентрация, температура, рН и др.) на тяхното взаимодействие със субстрата.
Ензимите обаче са протеини, които са чувствителни към влиянието на различни външни влияния. Следователно, когато изучават скоростта на ензимните реакции, те отчитат главно концентрациите на реагиращите вещества и се опитват да сведат до минимум влиянието на температурата, pH на околната среда, активаторите, инхибиторите и други фактори и да създадат стандартни условия. Първо, това е pH стойността на околната среда, която е оптимална за даден ензим. Второ, препоръчва се да се поддържа температура от 25°C, където е възможно. На трето място се постига пълно насищане на ензима със субстрата. Тази точка е особено важна, тъй като при ниски концентрации на субстрата не всички ензимни молекули участват в реакцията (фиг. 6.5, А), което означава, че резултатът ще бъде далеч от максимално възможния. Най-голямата мощност на катализираната реакция при равни други условия се постига, ако всяка ензимна молекула участва в трансформацията, т.е. при висока концентрация на ензимно-субстратния комплекс (фиг. 6.5, V).Ако концентрацията на субстрата не гарантира пълно насищане на ензима (фиг. 6.5, b), тогава скоростта на реакцията не достига максималната си стойност.
Ориз. 65.
А -при ниска концентрация на субстрата; 6 - с недостатъчна концентрация на субстрата; V -когато ензимът е напълно наситен със субстрат
Скоростта на ензимната реакция, измерена при горните условия и пълното насищане на ензима със субстрата, се нарича максимална скорост на ензимната реакция (V).
Скоростта на ензимната реакция, определена, когато ензимът не е напълно наситен със субстрата, се обозначава v.
Ензимната катализа може да се опрости чрез следната диаграма:
където F е ензим; S - субстрат; FS - ензим-субстратен комплекс.
Всеки етап от този процес се характеризира с определена скорост. Единицата за измерване на скоростта на ензимна реакция е броят молове субстрат, преобразувани за единица време(същата като скоростта на нормална реакция).
Взаимодействието на ензима със субстрата води до образуването на ензимно-субстратен комплекс, но този процес е обратим. Скоростите на правата и обратната реакция зависят от концентрациите на реагентите и се описват със съответните уравнения:
В състояние на равновесие уравнението (6.3) е валидно, тъй като скоростите на правата и обратната реакция са равни.
Замествайки стойностите на скоростта на предните (6.1) и обратните (6.2) реакции в уравнение (6.3), получаваме равенството:
Състоянието на равновесие се характеризира с подходящ равновесна константа K p,равно на отношението на константите на правата и обратната реакция (6.5). Реципрочната стойност на равновесната константа се нарича константа на субстрата Ks,или константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат:
От уравнение (6.6) става ясно, че субстратната константа намалява при високи концентрации на ензим-субстратния комплекс, т.е. с голяма стабилност. Следователно, субстратната константа характеризира афинитета на ензима и субстрата и съотношението на константите на скоростта за образуване и дисоциация на ензим-субстратния комплекс.
Феноменът на насищане на ензима със субстрат е изследван от Леонор Михаелис и Мод Мептен. Въз основа на математическа обработка на резултатите те извеждат уравнение (6.7), което получава имената си, от което става ясно, че при висока концентрация на субстрата и ниска стойност на константата на субстрата скоростта на ензимната реакция клони към максимума . Това уравнение обаче е ограничено, тъй като не взема предвид всички параметри:
Ензим-субстратният комплекс по време на реакцията може да претърпи трансформации в различни посоки:
- дисоциират на изходни вещества;
- се превръща в продукт, от който ензимът се отделя непроменен.
Следователно, за да се опише цялостното действие на ензимния процес, концепцията константи на Михаелис Kt,което изразява връзката между скоростните константи на всичките три реакции на ензимна катализа (6.8). Ако двата члена се разделят на константата на скоростта на реакцията за образуване на ензимно-субстратния комплекс, получаваме израз (6.9):
Важно следствие следва от уравнение (6.9): константата на Михаелис винаги е по-голяма от константата на субстрата с количеството k 2 /k v
Числено K tравна на концентрацията на субстрата, при която скоростта на реакцията е половината от максималната възможна скорост и съответства на насищането на ензима със субстрата, както на фиг. 6.5, b.Тъй като на практика не винаги е възможно да се постигне пълно насищане на ензима със субстрата, то именно K tизползвани за сравнителна характеристика на кинетичните характеристики на ензимите.
Скоростта на ензимната реакция, когато ензимът не е напълно наситен със субстрата (6.10), зависи от концентрацията на ензим-субстратния комплекс. Коефициентът на пропорционалност е константата на реакцията за освобождаване на ензима и продукта, тъй като това променя концентрацията на ензим-субстратния комплекс:
След трансформации, като се вземат предвид горните зависимости, скоростта на ензимната реакция, когато ензимът не е напълно наситен със субстрата, се описва с уравнение (6.11), т.е. зависи от концентрациите на ензима, субстрата и техния афинитет K s:
Графичната зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата не е линейна. Както е очевидно от фиг. 6.6, с увеличаване на концентрацията на субстрата се наблюдава повишаване на ензимната активност. Въпреки това, когато се постигне максимално насищане на ензима със субстрата, скоростта на ензимната реакция става максимална. Следователно факторът, ограничаващ скоростта на реакцията, е образуването на ензимно-субстратен комплекс.
Практиката показва, че концентрациите на субстрата, като правило, се изразяват в стойности, много по-малки от единица (10 6 -10 3 mol). Доста е трудно да се работи с такива количества в изчисленията. Ето защо G. Lineweaver и D. Burke предложиха да изразят графичната зависимост на скоростта на ензимната реакция не в директни координати, а в обратни. Те изхождат от предположението, че за равни количества техните обратни също са равни:
Ориз. 6.6.
След трансформиране на израз (6.13) получаваме израз, наречен Уравнение на Лайнуивър-Бърк (6.14):
Графичната зависимост на уравнението на Lineweaver-Burk е линейна (фиг. 6.7). Кинетичните характеристики на ензима се определят, както следва:
- сегментът, отсечен върху ординатната ос, е равен на 1/V;
- сегментът, отсечен по абсцисната ос, е равен на -1 /Към t.
Ориз. 6.7.
Смята се, че методът на Lineweaver-Burk позволява да се определи максималната скорост на реакция по-точно, отколкото в преките координати. Ценна информация относно ензимното инхибиране също може да бъде извлечена от тази графика.
Има и други начини за трансформиране на уравнението на Михаелис-Ментен. Графичните зависимости се използват за изследване на влиянието на различни външни въздействия върху ензимния процес.
Този дял от ензимологията изучава влиянието на различни фактори върху скоростта на ензимната реакция. Като се има предвид общото уравнение за ензимна катализа на обратимата реакция на превръщане на един субстрат в един продукт (1),
Трябва да се назоват основните фактори, влияещи върху скоростта на ензимната реакция: концентрация на субстрат [S], концентрация на ензим [E] и концентрация на реакционния продукт [P].
Взаимодействието на някои ензими с техния субстрат може да се опише чрез хиперболична крива на зависимостта на скоростта на ензимната реакция V от концентрацията на субстрата [S] (фиг. 19):
Фиг. 19. Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата.
На тази крива могат да се разграничат три участъка, които могат да се обяснят с разпоредбите на механизма на взаимодействие на ензима със субстрата: OA - участък на пряко пропорционална зависимост на V от [S], активните центрове на ензима постепенно се запълват със субстратни молекули с образуването на нестабилен комплекс ES; участък AB - криволинейна зависимост на V от [S], все още не е постигнато пълно насищане на активните центрове на ензима със субстратни молекули. Комплексът ES е нестабилен преди да достигне преходното състояние; вероятността за обратна дисоциация до E и S е все още висока; сечение BC - зависимостта се описва с уравнение от нулев ред, сечението е успоредно на оста [S], постигнато е пълно насищане на активните ензими със субстратни молекули, V=V max.
Характерната форма на кривата се описва математически от уравнението на Бригс-Халдейн:
V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),
където Km е константата на Михаелис-Ментен, числено равна на концентрацията на субстрата, при която скоростта на ензимната реакция е равна на половината V max.
Колкото по-ниско е K m на ензима, толкова по-висок е афинитетът на ензима към субстрата, толкова по-бързо се достига преходно състояние за субстрата и той се превръща в реакционен продукт. Намирането на стойности на Km за всеки специфичен за групата ензимен субстрат е важно за определяне на биологичната роля на този ензим в клетката.
За повечето ензими е невъзможно да се построи хиперболична крива (фиг. 19).В този случай се използва методът на двойните реципрочни величини (Lineweaver-Burk), т.е. е начертана графична зависимост на 1/[V] от 1/[S] (фиг. 20). Методът за конструиране на такива криви в експеримент е много удобен при изследване на ефекта на различни видове инхибитори върху ензимната активност (виж по-нататък в текста).
Фиг.20. Графика на 1/[V] спрямо 1/[S] (метод на Lineweaver-Burk),
където y е граничната част - и x е граничната част - 
, тангенс на ъгъл α - .
Зависимост на скоростта на ензимната реакция V от концентрацията на ензима [E].
Тази графична зависимост (фиг. 21) се разглежда при оптимална температура и pH на средата, при концентрации на субстрата, значително по-високи от концентрацията на насищане на активните центрове на ензима.
Ориз. 21. Влиянието на концентрацията на ензима върху скоростта на ензимната реакция.
Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на кофактор или коензим.За комплексните ензими трябва да се има предвид, че дефицитът на коензимни форми на витамини в случай на хиповитаминоза и нарушение на приема на метални йони в тялото задължително води до намаляване на концентрацията на съответните ензими, необходими за протичането на на метаболитните процеси. Следователно трябва да се заключи, че активността на ензима е в пряка зависимост от концентрацията на кофактора или коензима.
Влиянието на концентрацията на продукта върху скоростта на ензимната реакция.За обратими реакции, протичащи в човешкото тяло, трябва да се има предвид, че продуктите от директната реакция могат да бъдат използвани от ензима като субстрати за обратната реакция. Следователно посоката на потока и моментът на достигане на Vmax зависят от съотношението на концентрациите на изходните субстрати и реакционните продукти. Например, активността на аланин аминотрансферазата, която катализира трансформацията:
Аланин + Алфа-кетоглутарат ↔ Пируват + Глутамат
зависи в клетката от съотношението на концентрация:
[аланин + алфа-кетоглутарат] / [пируват + глутамат].
МЕХАНИЗЪМ НА ДЕЙСТВИЕ НА ЕНЗИМА. ТЕОРИИ ЗА ЕНЗИМНАТА КАТАЛИЗА
Ензимите, подобно на непротеиновите катализатори, увеличават скоростта на химичната реакция поради способността им да намаляват енергията на активиране на тази реакция. Енергията на активиране на ензимната реакция се изчислява като разликата между енергийната стойност в системата на протичащата реакция, която е достигнала преходното състояние, и енергията, определена в началото на реакцията (вижте графичната зависимост на фиг. 22).
Ориз. 22. Графична зависимост на енергийното състояние на химична реакция без ензим (1) и в присъствието на ензим (2) от времето на реакцията.
Работата на V. Henry и по-специално на L. Michaelis, M. Menten върху изучаването на механизма на моносубстратните обратими ензимни реакции направи възможно постулирането, че ензим Е първо обратимо и сравнително бързо се комбинира със своя субстрат S, за да образува ензим- субстратен комплекс (ES):
E+S<=>ES (1)
Образуването на ES се дължи на водородни връзки, електростатични, хидрофобни взаимодействия, в някои случаи ковалентни, координационни връзки между страничните радикали на аминокиселинните остатъци на активния център и функционалните групи на субстрата. При сложните ензими функцията за контакт със субстрата може да се изпълнява и от небелтъчната част на структурата.
След това комплексът ензим-субстрат се разпада във втора, по-бавна, обратима реакция, за да се получи реакционен продукт P и свободен ензим E:
ES<=>ЕП<=>E+P (2)
Понастоящем, благодарение на работата на гореспоменатите учени, както и на Keilin D., Chance B., Koshland D. (теорията за „индуцирана кореспонденция“), има теоретични положения за четири основни точки в механизма на действие на ензим върху субстрат, които определят способността на ензимите да ускоряват химичните реакции:
1. Ориентация и подход . Ензимът е в състояние да свърже субстратна молекула по такъв начин, че връзката, атакувана от ензима, е не само разположена в непосредствена близост до каталитичната група, но и правилно ориентирана по отношение на нея. Вероятността ES комплексът да достигне преходното състояние чрез ориентация и близост е значително увеличена.
2. Стрес и напрежение : индуцирана кореспонденция. Прикрепването на субстрат може да причини конформационни промени в ензимната молекула, което води до напрежение в структурата на активния център, а също така до известна степен деформира свързания субстрат, като по този начин улеснява постигането на преходно състояние от ES комплекса. Между молекулите E и S възниква така нареченото индуцирано съответствие.
КИНЕТИКА НА ЕНЗИМНИТЕ РЕАКЦИИ
Vfr се определя от количеството вещество, което се преобразува за единица време. V на тези реакции зависи от влиянието на външни фактори (температура, pH, излагане на природни и чужди съединения и др.).
Vfr е мярка за каталитична активност и се нарича просто ензимна активност.
Ензимната активност може да се измери само индиректно:
1) по количеството преобразувани S;
2) увеличаване на концентрацията Р за единица време.
За да изразите концентрацията на ензима, използвайте:
а) мерната единица на ензимите е количеството ензим, което катализира превръщането на 1 µmol S на минута. [µmol/min];
б) 1 катал (котка) - количеството ензими, способни да предизвикат превръщането на 1 мол S в P за 1 секунда. [mol/s].
1 котка = 6×107E; 1E = 16,67 (n котка)
За да изразите ензимната активност, използвайте:
а) специфичната активност на ензимите е броят на ензимите на 1 mg или броят на кат. на 1 кг протеин;
б) молекулна активност или номер на оборот е броят на молекулите S, които претърпяват преобразуване с една молекула E за 1 минута.
Една молекула еритроцитна каталаза разгражда 5 × 106 молекули H2O2 за 1 минута.
Специфика на ензимното действие
Понятията E S комплекс и ACP са тясно свързани със специалното свойство на ензимите - тяхната специфичност. Според степента на специфичност (в низходящ ред) има:
I. Стереохимична субстратна специфичност – в този случай ензимите катализират само 1 форма на S (1 изомер). Например фумарат хидратазата катализира само превръщането на фумаровата киселина, но не катализира превръщането на нейния изомер, малеиновата киселина.
II. Абсолютна субстратна специфичност - E се преобразува само с 1S. Например уреазата превръща само уреята.
III. Абсолютна група S специфичност. Ензимите действат върху група подобни S-b. Например алкохолът DG преобразува не само етанол, но и други алифатни алкохоли.
IV. Относителна група S специфичност. Ензимът не действа върху група от S молекули, а върху определени връзки на определени S групи. Например пепсинът и трипсинът са специфични за пептидните връзки в различни протеини.
V. Относителна S специфичност. Ензимът катализира, превръщайки се в S-b, принадлежащи към различни групи химични съединения. Например, ензимът цитохром-450 катализира реакции на хидроксилиране на до 7000 различни S-b. Това е най-малко специфичната ензимна система.
Има две теории за обяснение на ензимната специфичност.
Хипотезата на E. Fisher е хипотезата за „ключа и ключалката“ или хипотезата за „шаблона“. Според Фишер, ензимът е твърда структура, ACP на която е точна „отливка“ на S. Ако S пасва на E като ключ към ключалка, тогава реакцията ще се случи. Ако S е леко променен ("ключ"), тогава той не съответства на ACF ("ключалка") и реакцията става невъзможна. Въпреки че това обяснение е логично, хипотезата на Фишър не обяснява на какво тогава се основава абсолютната и относителната групова специфичност. Например, цитохром-450 се комбинира с толкова голям брой S-b, различни по структура.
Тези външни противоречия се обясняват с хипотезата на Кошланд или хипотезата за принудителното съответствие. Според Koshland ензимната молекула не е „твърда“, а гъвкава, структурата и конфигурацията на ензима и неговия ACP започват да се променят в момента, в който ензимът се прикрепи към S или други лиганди. По време на образуването на E-S комплекс, в допълнение към геометричната комплементарност, възниква и електростатична комплементарност, която възниква поради сдвояването на противоположно заредени молекули E и S. В действителност очевидно се осъществяват и двата варианта на добавяне.
Хипотезата на Koshland ни позволява да обясним защо се случва трансформацията на близки аналози на S-in. Ако „фалшивият“ субстрат (квази-S) се различава от естествения и ACP приеме конформация, близка до истинския субстрат, тогава подреждането на каталитичните групи в такъв E-S комплекс ще позволи реакцията да настъпи. Ензимът изглежда не забелязва тази „измама“, въпреки че реакцията не протича толкова бързо, колкото при истинския субстрат. Ако конфигурацията на квази-субстрата не позволява правилното позициониране на каталитичната група, тогава в този случай реакцията няма да протече. Тези. ако обхватът на конформационните пренареждания е ограничен до едно единствено възможно, тогава ензимът е силно специфичен и ако възможностите за ACP пренареждане са големи, тогава ензимът работи и върху квази-субстрати.
Зависимост на Vfr от pH на средата
Всеки ензим има свое собствено оптимално pH, при което Vfr е максимално. Отклонението на pH в една или друга посока води до намаляване на ензимната активност. Повечето ензими имат pH ~7,0, тоест съвпада с физиологичните стойности на pH.
При оптимална стойност на pH функционалните групи на ACP и самият S са в най-предпочитаната форма за свързване. Някои ензими имат оптимално рН, което рязко се различава от физиологичните стойности, пепсинът е 100% активен при рН = 1,5-2,5; аргиназа - при pH = 10.
Зависимост на Vfr от температурата
С повишаване на температурата на околната среда Vfr се увеличава, достигайки оптимални стойности от ~ 20-40ºС за повечето ензими.
Термолабилността на ензимите е свързана с тяхната протеинова структура: когато температурата се повиши до 40-50ºC и повече, те денатурират.
За някои ензими денатурацията настъпва при 0ºC.
За всякакви химични реакции, с повишаване на температурата на всеки 10ºC, V на реакцията се увеличава 2-3 пъти, за ензимните реакции този коефициент е по-нисък - 2 или дори по-малко. Изключение: термостабилният ензим аденимат циклаза може да издържи на температури от 100ºC, а ензимът каталаза е активен при 0ºC.
Зависимост на Vfr от концентрацията. С.
Механизмът на действие на ензимите се описва с уравнението на Михаелис-Ментен. Зависимостта на Vfr от [S] може да се установи графично.
а) според кривата на Михаелис: колкото по-малък е Km, толкова по-голям е Vm и толкова по-голям е афинитетът на E към S.
Vmax съответства на състоянието на пълно насищане на ензима S-vol.
в разтвора има излишък от Е (3 mol S, 5 mol E) това е мястото на насищане на ензима S-об.
б) реципрочен метод на Lainciver-Burk, където зависимостта на Vfr от [S] се изчислява в реципрочни величини.
Регулиране на ензимната активност.
Ензимите са катализатори с контролирана активност, така че Vfr може да се контролира чрез ензими. Регулирането на активността може да се извърши чрез взаимодействие на ензими с различни биологични компоненти или чужди съединения (лекарства, отрови), които се наричат модификатори. Ако в присъствието на модификатор Vfr се увеличава, тогава такива модификатори се наричат активатори, а ако намаляват, те се наричат инхибитори.
Активиране на ензими.
Има няколко вида ензимно активиране.
1. Активиране чрез въздействие върху субединиците на ензимните молекули. Някои ензими имат SN под формата на 2 субединици: каталитична и регулаторна. При запис на аварийна ситуация ACF се скрива.
Например, много ензими в тялото се произвеждат като проензими или зимогени, тоест в неактивно състояние. При необходимост се активират определен брой от тях. Например неактивният трипсиноген се превръща в активен трипсин от ензима ентерокиназа.
2. Йоните влияят върху активирането на ензимите:
а) катиони - ефектът им е по-специфичен от анионите. Самите катиони могат да действат като простетични групи в ензимите (Fe в цитохрома) или чрез присъствието си да повлияят на ензима, като го активират. Например карбоанхидразата се активира в присъствието на Zn+2.
б) аниони - действат по-слабо специфично и обикновено засягат 2-ри стадий на д.ф. – разпадане на комплекса ЕС. Понякога обаче анионите са директни активатори на ензими. Например Cl– активира неактивния пепсиноген и го превръща в активен пепсин.
3. Активиране чрез защита на ензимите от инактивиращото влияние на различни влияния. Съдържа специфични вещества, които предотвратяват негативните ефекти върху ензимите.
Ензимно инхибиране.
Веществата, които причиняват частично или пълно инхибиране на ензимите, се наричат инхибитори (I). Инхибиторите имат свойството да се свързват плътно с ензима. На тази основа се разграничава инхибирането: обратимо и необратимо.
При обратимо инхибиране I и E взаимодействат. Ако инхибиторът по някакъв начин се неутрализира (например чрез диализа), тогава активността на Е се възстановява. Ако това не може да се постигне, тогава говорим за необратимо инхибиране.
Обратимо инхибиране
състезателен несъстезателен
Конкурентното инхибиране може да бъде причинено от вещества със структура, подобна на тази на истинския S.
I и S се конкурират за ACP и комплексът с ензима образува съединението, което има повече молекули. Или I, или S се свързва с ензима; за такова инхибиране е валидно уравнението: .
По време на конкурентно инхибиране НИКОГА не се образува троичен E S I комплекс, по което този тип инхибиране се различава от другите.
Например DG сукцинат е включен във фермите. CTK системи. Неговият естествен S е сукцинат. Инхибиторите могат да бъдат оксалоацетат, малонат (квази-субстрати).
Когато е в излишък, инхибиторът се свързва в поляризирани групи към ACP сукцинат DG.
При конкурентно инхибиране Vmax никога не се променя, но Km го прави. Наклонът на кривите при наличие на I се увеличава, в резултат на което се увеличава Km
Въз основа на резултатите от експеримента, използващ кривата на Михаелис-Ментен, е възможно да се установи конкурентният характер на I (чрез увеличаване на Km и стабилност на Vmax). Природата на тази крива също показва, че процесът е обратим, т.е. чрез увеличаване на [S] времето за достигане на Vmax може да бъде намалено.
Методът на конкурентното инхибиране намери широко приложение в медицинската практика.
Пара-аминобензоената киселина и сулфонамидът имат подобна структура. Бактериалната клетка използва p-ABA, за да синтезира фолиева киселина, която е компонент на бактериалните ензими. S/a блокира действието на ензимите, които синтезират фолиева киселина, в резултат на което растежът на бактериите спира.
Неконкурентното инхибиране е обратимо инхибиране, когато I взаимодейства не с ACP, а с други функционални групи ензими, т.е. в този случай I няма структурно сходство с S. Добавянето на такъв инхибитор намалява активността на ензима, а не неговия афинитет към S, тоест инхибиторът не променя Km, но намалява макс. Vfr.
При този тип инхибиране се образуват неактивни комплекси с ниска дисоциация E I или E I S. Например действието на HCN, други химични съединения, които свързват Me йони или други функционални групи в ензимната молекула.
Смесено инхибиране (или частично неконкурентен тип) - намаляването на Vmax се комбинира с повишаване на Km.
В този случай се образува E I S комплекс, а S в него претърпява бавна каталитична трансформация.
Субстратното инхибиране е намаляване на Vfr със значително увеличение на [S]. Първоначално, с увеличаване на [S], Vfr нараства, достигайки своя максимум, но с по-нататъшно увеличаване на [S], Vfr започва да пада.
Механизмът на инхибиторния ефект на излишния S е разнообразен. Най-често това е взаимодействието на междинните съединения E S с една или повече молекули на S, което води до образуването на неактивно съединение, след което
има комплекс, който не произвежда реакционни продукти.
Методи за регулиране на ензимната активност
В живия организъм едновременно протичат реакции на синтез, разлагане и взаимно преобразуване на хиляди различни вещества. Всички тези много реакции се регулират в тялото чрез различни механизми, най-важните от които са:
а) регулиране от типа обратна връзка; обикновено характерни за реакциите на синтез. Натрупването на реакционни продукти над допустимото ниво има силен инхибиращ ефект върху първия етап на процеса:
б) алостерична регулация на ензимната активност - характерна само за специална група ензими със СН, които имат регулаторни центрове за свързване на алостеричните ефектори. Отрицателните ефектори инхибират превръщането на S и действат като алостерични инхибитори. Положителните ефектори, напротив, ускоряват Vfr, поради което се класифицират като алостерични активатори.
Механизмът на действие на алостеричните инхибитори върху даден ензим е да променят ACP на този ензим. Намаляването на Vfr е или следствие от увеличаване на Km, или резултат от намаляване на Vmax при същите насищащи концентрации на S. Алостеричните активатори, напротив, улесняват превръщането на S в ACP, което е придружено от или намаляване на Km или увеличение на Vmax.
Компартментализацията е явление, при което мембраните се използват за пространствено разделяне
а) ензим от неговия S (например лизомни ензими от веществата, върху които действат в цитоплазмата);
б) процеси, които са взаимно несъвместими едновременно. Синтезът на мастни киселини се извършва в разтворимата част на цитоплазмата, а разграждането на мастните киселини - в митохондриите.
Кинетика на ензимните реакции. Този дял от ензимологията изучава влиянието на химични и физични фактори върху скоростта на ензимните реакции. През 1913 г. Михаелис и Ментен създават теорията за ензимната кинетика, основана на факта, че ензимът (E) взаимодейства със субстрата (S), за да образува междинен ензим-субстратен комплекс (ES), който по-нататък се разлага на ензима и продукт на реакцията съгласно уравнението:
Всеки етап на взаимодействие между субстрата и ензима се характеризира със свои собствени скоростни константи. Съотношението на сумата от константите на скоростта на разграждане на ензим-субстратния комплекс към константата на скоростта на образуване на ензим-субстратния комплекс се нарича константа на Михаелис (Km). Те определят афинитета на ензима към субстрата. Колкото по-ниска е константата на Михаелис, толкова по-висок е афинитетът на ензима към субстрата, толкова по-висока е скоростта на реакцията, която катализира. Въз основа на стойността на Km каталитичните реакции могат да бъдат разделени на бързи (Km 106 mol/l или по-малко) и бавни (Km 102 до 106).
Скоростта на ензимната реакция зависи от температурата, реакционната среда, концентрацията на реагентите, количеството на ензима и други фактори.
1. Нека разгледаме зависимостта на скоростта на реакцията от количеството на ензима. При наличие на излишък от субстрат, скоростта на реакцията е пропорционална на количеството ензим, но с излишък от ензим, увеличението на скоростта на реакцията ще намалее, тъй като вече няма да има достатъчно субстрат.
2. Скоростта на химичните реакции е пропорционална на концентрацията на реагиращите вещества (закон за масовото действие). Този закон важи и за ензимните реакции, но с известни ограничения. При постоянно
При големи количества от ензима скоростта на реакцията наистина е пропорционална на концентрацията на субстрата, но само в областта на ниските концентрации. При високи концентрации на субстрата ензимът се насища със субстрата, т.е. идва момент, когато всички ензимни молекули вече са включени в каталитичния процес и няма да има увеличение на скоростта на реакцията. Скоростта на реакцията достига максимално ниво (Vmax) и след това вече не зависи от концентрацията на субстрата. Зависимостта на скоростта на реакцията от концентрацията на субстрата трябва да се определи в тази част от кривата, която е под Vmax. Технически е по-лесно да се определи не максималната скорост, а ½ Vmax. Този параметър е основната характеристика на ензимната реакция и дава възможност да се определи константата на Михаелис (Km).
Km (константа на Михаелис) е концентрацията на субстрата, при която скоростта на ензимната реакция е половината от максималната. От това извеждаме уравнението на Михаелис-Ментен за скоростта на ензимната реакция.
