Твърдофазовият синтез или твърдофазната технология, която често се нарича керамична технология, е най-разпространената при производството на неорганични материали за различни отрасли на науката и индустрията. Те включват ядрено гориво, материали за космически технологии, радиоелектроника, приборостроене, катализатори, огнеупорни материали, високотемпературни свръхпроводници, полупроводници, сегнетоелектрици и пиезоелектрици, магнити, различни композити и много други.

Твърдофазовият синтез се основава на химични реакции, при които поне един от реагентите присъства под формата на твърдо вещество. Такива реакции се наричат ​​хетерогенни или твърдофазни. Взаимодействието в твърда фаза, за разлика от реакциите в течна или газообразна среда, се състои от два основни процеса: самата химическа реакция и пренасянето на вещество в реакционната зона.

Реакциите в твърда фаза, включващи кристални компоненти, се характеризират с ограничена подвижност на техните атоми или йони и сложна зависимост от много фактори. Те включват химическата структура и свързаната реактивност на реагиращите твърди вещества, природата и концентрацията на дефектите, състоянието на повърхността и морфологията на реакционната зона, контактната зона на взаимодействащите реагенти, предварителното механохимично активиране и редица други. Всичко по-горе определя сложността на механизмите на хетерогенните реакции. Изследването на хетерогенните реакции се основава на химията на твърдото тяло, химическата физика и физикохимията на повърхността на твърдите тела, на законите на термодинамиката и кинетиката.

Често механизмът на твърдофазните реакции се преценява само въз основа на това, че експерименталните данни за степента на взаимодействие като функция на времето се описват най-добре от специфичен кинетичен модел и съответното кинетично уравнение. Този подход може да доведе до неправилни заключения.

Процесите в материали в твърда фаза имат редица важни разлики от процесите в течности или газове. Тези разлики са свързани преди всичко със значително (с няколко порядъка) по-ниска скорост на дифузия в твърди вещества, което предотвратява осредняването на концентрацията на компонентите в системата и по този начин води до пространствена локализация на протичащите процеси. Пространствената локализация, от своя страна, води до факта, че както специфичната скорост на процеса (или коефициентът на дифузия), така и геометрията на реакционната зона допринасят за наблюдаваната кинетика на процесите. Такива характеристики на процесите в твърда фаза, определени от геометрични фактори, се наричат ​​топохимични. Освен това, тъй като обсъжданите трансформации са пространствено локализирани, тяхната скорост може да се определи както от самите процеси на фазовата граница (контрол на реакцията), така и от скоростта на доставяне на който и да е от компонентите към тази граница или отстраняване на продукта ( s) (контрол на дифузията). Тези случаи за прости системи, за които са изпълнени предположенията на модела, могат да бъдат идентифицирани в експеримента чрез вида на времевата зависимост на степента на трансформация. Друга особеност на фазовите трансформации в твърдите тела е свързана с факта, че образуването на ядро ​​на нова фаза в твърда матрица предизвиква появата на еластични напрежения в последната, чиято енергия в някои случаи трябва да се вземе предвид при разглеждане термодинамиката на тези трансформации.

Голям брой фактори, влияещи върху кинетиката на твърдофазните процеси и микроструктурата на получените материали, също определят множеството видове класификация на тези процеси. По този начин, когато се разглежда стабилността на система по отношение на флуктуации от различни видове, хетерогенни (в случай на системи, които са стабилни на малки флуктуации в заетия обем и нестабилни на големи) и хомогенни (в случай на системи, които са неустойчиви на малки флуктуации) се разграничават процеси. За хетерогенни процеси като пример можем да цитираме трансформации, които възникват чрез механизма на образуване и растеж на ядра; за хомогенни процеси могат да се цитират някои преходи ред-разстройство и спинодално разлагане на твърди разтвори.

Необходимо е да се разграничи хетерогенното и хомогенното зародишене в случай на хетерогенни процеси от хетерогенните и хомогенни процеси. Хетерогенната нуклеация се отнася до образуването на ядра при структурни дефекти (включително точкови дислокационни дефекти и фазови граници); хомогенна нуклеация - образуване на ядра в бездефектен обем на твърдата фаза.

Анализирайки продукта от твърдофазната трансформация, се разграничават еднофазни и многофазни ядра. При многофазните ядра продуктът на процеса е многофазна колония с характерна микроструктура, определена от повърхностната енергия на границата на получените фази; процеси от този тип се наричат ​​периодични, за разлика от непрекъснатите процеси в случай на образуване и растеж на еднофазни ядра.

Друг метод за класифициране на твърдофазните трансформации се основава на сравнение на състава на началната фаза и състава на реакционния продукт. Ако те съвпадат, се говори за недифузионни процеси, а при промяна на състава - за дифузионни процеси. Освен това от недифузионните процеси е полезно да се разграничат кооперативните процеси (например мартензитна трансформация), които възникват чрез едновременно леко движение на атоми в голям обем на началната фаза.

Фазовите трансформации без дифузия могат да се различават по вида на термодинамичните характеристики, които се променят по време на процеса.

Трансформациите от първи вид са процеси, при които производните на химичния потенциал се променят по отношение на температурата или налягането. Това предполага рязка промяна по време на фазовия преход на такива термодинамични параметри като ентропия, обем, енталпия и вътрешна енергия. По време на трансформации от втори вид първите производни на химичния потенциал по отношение на интензивните параметри не се променят, но производните от по-високи порядъци (започвайки от втория) се променят. При тези процеси при непрекъсната ентропия и обем на системата има рязка промяна на величините, изразени чрез вторите производни на енергията на Гибс: топлинен капацитет, коефициент на топлинно разширение, свиваемост и др.

Реакциите в твърда фаза между две фази (контакти между три или повече фази са малко вероятни и съответните процеси могат да бъдат представени като комбинации от няколко двуфазни реакции) са дифузионни процеси и могат да бъдат хетерогенни или хомогенни, както с хетерогенно, така и с хомогенно зараждане . Хомогенни процеси и процеси с хомогенна нуклеация при такива реакции са възможни, например, в случай на образуване на метастабилен твърд разтвор с последващото му разлагане (така наречените вътрешни реакции). Пример за такива процеси е вътрешното окисление.

Условието за термодинамично равновесие по време на твърдофазова трансформация, както при всяка друга химична трансформация, е равенството на химичните потенциали на компонентите в изходните вещества и продуктите на реакцията. Когато две твърди фази взаимодействат, посоченото равенство на химичните потенциали може да се реализира по различни начини: 1) преразпределение на компонентите в началните фази с образуването на твърди разтвори; 2) образуването на нови фази с различна кристална структура (което всъщност обикновено се нарича твърдофазова реакция) и тъй като химическият потенциал на компонента в различните фази на многофазна система не зависи от количеството на всяка фаза равновесието може да се постигне само с пълна трансформация на началните фази. Най-надеждната информация за механизма на твърдофазните реакции се получава чрез комплексно използване, което позволява едновременно наблюдение на няколко параметъра на реагиращата система, включително фазов състав, топлинни ефекти, промени в масата и др.

Термодинамичната теория на реакциите в твърда фаза е предложена от Вагнер и по-късно разработена от Шмалцрид, използвайки примера на реакциите на добавяне.

Към днешна дата няма единна класификация на голямо разнообразие от хетерогенни реакции. Това се дължи на трудността при избора на критерий като основа за такава универсална класификация. Според химичните критерии реакциите се разделят на реакции на окисление, редукция, разлагане, комбиниране, обмен и др. Наред с посочения критерий, той се използва широко като основен критерий за агрегатното състояние на реагентите:

Характерна особеност на всички хетерогенни реакции е наличието и локализирането на границата на реакционната зона. Реакционната зона, обикновено с малка дебелина, разделя две области от пространството, заети от вещества с различен състав и с различни свойства. Причините за образуването на реакционна зона обикновено се разделят на две групи: относителна бавност на дифузионните процеси и химични причини. Последната група се дължи на високата реактивност на атоми или молекули, разположени на повърхността на твърд реагент или на границата между две съществуващи фази. Известно е, че повърхността на твърдо или течно вещество има свойства, различни от обемните свойства на компактна проба. Това прави свойствата на фазовия интерфейс специфични. Тук настъпва значително преструктуриране на кристалната опаковка, напрежението между две кристални решетки намалява и настъпва промяна в химичния състав.

Тъй като преносът на маса се осъществява чрез дифузия и дифузионната подвижност на твърдите частици зависи от дефектността на тяхната структура, може да се очаква значително влияние на дефектите върху механизма и кинетиката на реакциите в твърда фаза. Този етап предшества химичния етап на трансформация на реагиращите вещества на междинната повърхност. По този начин кинетиката на хетерогенните реакции се определя както от естеството на самата химическа реакция, така и от метода на доставяне на веществото в реакционната зона. В съответствие с отбелязаното, скоростта на реакцията ще бъде ограничена от химичния етап (химическа кинетика) или дифузия (кинетика на дифузия). Това явление се наблюдава в действителност.

Според Вагнер дифузията и следователно реакцията в твърдите тела се извършва главно поради подвижността на йони и електрони, причинена от неравновесното състояние на решетката. Различни решетъчни йони се движат през него с различни скорости. По-специално, подвижността на анионите в по-голямата част от случаите е незначителна в сравнение с подвижността на катионите. Следователно дифузията и съответно реакцията в твърдите вещества се извършва поради движението на катиони. В този случай дифузията на различни катиони може да протича в една и съща посока или един към друг. С катиони с различни заряди електрическата неутралност на системата се поддържа поради движението на електроните. Поради разликата в скоростите на движение на различно заредените катиони в системата възниква електрически потенциал. В резултат скоростта на движение на по-подвижните йони намалява и обратното, на по-малко подвижните? се увеличава. По този начин полученият електрически потенциал регулира скоростите на дифузия на йони. Последният и скоростта на целия процес на трансформация на твърдата фаза, определен от него, могат да бъдат изчислени на базата на електронна проводимост и преносни числа. Очевидно е, че насочената дифузия на йони е възможна само в електрическо поле или при наличие на концентрационен градиент в системата.

При синтезиране на вещества в твърдо състояние често е необходимо да се контролира не само химичният (елементен и фазов) състав на получения продукт, но и неговата микроструктурна организация. Това се дължи на силната зависимост както на химичните (например, активност в реакции в твърда фаза), така и на много физични (магнитни, електрически, оптични и т.н.) свойства от характеристиките на структурната организация на твърдо вещество на различни йерархични нива. Първото от тези нива включва елементарния състав на твърдо вещество и метода на относителното разположение на атомите на елементите в пространството - кристалната структура (или характеристиките на непосредствената координационна среда на атомите в аморфни твърди тела), както и състава и концентрацията на точкови дефекти. Като следващо ниво на структурата на твърдото тяло можем да разгледаме разпределението на разширените дефекти в кристала, което определя размерите на областите, в които (коригирани за наличието на точкови дефекти) се наблюдава транслационна симетрия в подреждането на атомите. Такива области могат да се считат за идеални микрокристали и се наричат ​​области на кохерентно разсейване. Говорейки за области на кохерентно разсейване, трябва да се помни, че в общия случай те не са еквивалентни на компактните частици, които образуват твърдофазен материал, който може да съдържа значителен брой разширени дефекти и, следователно, области на кохерентно разсейване. Съвпадението на области на кохерентно разсейване с частици (които в този случай се наричат ​​еднодомейни) обикновено се наблюдава само при достатъчно малки (по-малко от 100 nm) размери на последните. Последващите структурни нива могат да бъдат свързани с формата и разпределението на размера на частиците, образуващи прахообразния или керамичния материал, тяхното агрегиране, агрегиране на първични агрегати и др.

Различните приложения на твърдофазни материали имат различни, често противоположни изисквания за структурните характеристики, изброени по-горе, и следователно изискват различни синтетични методи. Следователно е по-правилно да се говори за методи за синтез не на твърдофазни вещества, а на твърдофазни материали и във всеки случай да се избере метод на синтез, като се вземе предвид областта на последващото приложение на получения продукт.

Като цяло, методите за синтез на материали в твърда фаза могат да бъдат класифицирани според разстоянието им от термодинамично равновесните условия за протичане на използваните химични процеси. В съответствие с общите закони, при условия, съответстващи на състояние, което е максимално отдалечено от равновесното състояние, се наблюдава значителен излишък на скоростта на нуклеация над скоростта на растеж на образуваните ядра, което очевидно води до производството на най-разпръснатите продукт. Ако процесът се извършва близо до термодинамично равновесие, растежът на вече образуваните ядра става по-бързо от образуването на нови, което от своя страна прави възможно получаването на грубокристални (в пределния случай монокристални) материали. Скоростта на растеж на кристалите до голяма степен се определя от концентрацията на разширени (неравновесни) дефекти в тях.

Комбинаторният синтез може да се извърши не само в разтвор (синтез в течна фаза), но и на повърхността на твърда, химически инертна фаза. В този случай първото изходно вещество е химически "свързано" с функционални групи на повърхността на полимерния носител (най-често се използва естерна или амидна връзка) и се третира с разтвор на второто изходно вещество, което се приема в значителни количества. излишък, така че реакцията да продължи до завършване. Има известно удобство в тази форма на реакция, тъй като техниката за изолиране на продуктите е опростена: полимерът (обикновено под формата на гранули) просто се филтрира, старателно се измива, за да се отстрани останалия реагент, и целевото съединение се отцепва химически от то.

В органичната химия няма нито една реакция, която на практика да осигурява количествени добиви на целевите продукти във всеки случай. Единственото изключение е очевидно пълното изгаряне на органични вещества в кислород при високи температури до CO 2 и H 2 O. Следователно пречистването на целевия продукт винаги е незаменима и често най-трудната и отнемаща време задача. Особено предизвикателна задача е изолирането на продукти от пептидния синтез, например разделянето на сложна смес от полипептиди. Следователно в пептидния синтез най-разпространен е методът за синтез върху твърд полимерен субстрат, разработен в началото на 60-те години на 20 век от R.B. Merifield.

Полимерният носител в метода Merrifield е гранулиран омрежен полистирен, съдържащ хлорометилови групи в бензенови ядра, които са линкери, които свързват опората с първия аминокиселинен остатък на полипептида. Тези групи превръщат полимера във функционален аналог на бензил хлорида и му придават способността лесно да образува естерни връзки, когато реагира с карбоксилатни аниони. Кондензацията на такава смола с N-защитени аминокиселини води до образуването на съответните бензилови естери. Отстраняването на N-защитата произвежда С-защитено производно на първата аминокиселина, ковалентно свързана с полимера. Аминоацилирането на освободената аминогрупа с N-защитено производно на втората аминокиселина, последвано от отстраняване на N-защитата, води до подобно дипептидно производно, също свързано с полимера:

Такъв двуетапен цикъл (депротекция - аминоацилиране) може по принцип да се повтори толкова пъти, колкото е необходимо за изграждане на полипептидна верига с дадена дължина.

По-нататъшното развитие на идеите на Merifield беше насочено преди всичко към търсенето и създаването на нови полимерни материали за субстрати, разработването на методи за разделяне на продуктите и създаването на автоматизирани инсталации за целия цикъл на синтез на полипептиди.

Ефективността на метода на Мерифийлд се доказва от успешния синтез на редица естествени полипептиди, по-специално инсулин. Неговите предимства бяха особено ясно демонстрирани на примера на синтеза на ензима рибонуклеаза. Например, с цената на значителни усилия в продължение на няколко години, Hirschman и 22 сътрудници синтезираха ензима рибонуклеаза (124 аминокиселинни остатъка), използвайки традиционните методи на течна фаза. Почти едновременно същият протеин беше получен чрез автоматизиран твърдофазов синтез. Във втория случай синтез, включващ общо 11 931 различни операции, включително 369 химични реакции, беше завършен от двама участници (Gatte и Merrifield) само за няколко месеца.

Идеите на Мерифийлд послужиха като основа за създаването на различни методи за комбинаторен синтез на библиотеки от полипептиди с различни структури.

Така през 1982 г. беше предложена оригинална стратегия за многоетапен паралелен синтез на пептиди върху твърдата фаза, известна като „метод на разделяне“ ( разделяне- разделяне, разделяне) или метода “смеси и раздели” (фиг. 3). Същността му е следната. Да кажем, че от три аминокиселини (A, B и C) трябва да получите всички възможни комбинации от трипептиди. За да направите това, гранулите от твърдия полимерен носител (Р) се разделят на три равни части и се третират с разтвор на една от аминокиселините. В този случай всички аминокиселини се свързват химически към повърхността на полимера с една от техните функционални групи. Получените три вида полимери се смесват старателно и сместа отново се разделя на три части. Всяка порция, съдържаща трите аминокиселини в равни количества, след това се третира отново с една от същите три аминокиселини, за да се получат девет дипептида (три смеси от три продукта). Друго смесване, разделяне на три равни части и обработка с аминокиселини дава желаните 27 трипептида (три смеси от девет продукта) само в девет стъпки, докато получаването им поотделно би изисквало синтез от 27 × 3 = 81 стъпки.

„Биолог. списание Армения, 1 (65), 2013 ТВЪРДОФАЗЕН СИНТЕЗ НА КАРДИОАКТИВЕН ПЕПТИД, ИЗОЛИРАН ОТ ПРЕДСЪРДИЕ НА СВИНЕ G.S. CHAILYAN Институт по биохимия на името на. Бунятян NAS RA..."

Експериментални и теоретични статии

Експериментални и теоретични статии

Биолог. списание Армения, 1 (65), 2013

ТВЪРДОФАЗЕН СИНТЕЗ НА КАРДИОАКТИВЕН ПЕПТИД,

ИЗОЛИРАН ОТ СВИНСКИ АТРИЙ

Г.С. ЧАЙЛИАН

Институт по биохимия на името на. Бунятян NAS RA

[имейл защитен].

За да продължат изследванията, акад. Галоян, проведохме серия от експерименти за изолиране, пречистване и определяне на биологичната ориентация на новоизолирани пептидни съединения от предсърдията и ушните части на сърцето на прасето. За провеждане на биотестове беше необходимо да се получат препаративни количества от тестовите проби. За да направим това, ние използвахме метода на твърдофазния синтез на пептиди с неговата по-нататъшна модификация. Чистотата и идентичността на синтезираните лекарства бяха проверени чрез високоефективна течна хроматография и масспектрален анализ.

Твърдофазов синтез – fmoc-аминокиселини – HPLC – фенилизотиоцианат – масспектрален анализ:

fmoc- – – За по-нататъшни изследвания, установени от Galoyan, бяха проведени серия от експерименти за изолиране, пречистване и определяне на биологичната посока на пептиди, изолирани от предсърдия на свине. За извършване на биотестовете е необходимо подготвителното количество проби. Използван е модифициран метод за твърдофазен пептиден синтез. Чистотата и идентичността на синтезирания пептид се определят чрез HPLC и мас-спектрален анализ.

Твърдофазов синтез – високоефективна течна хроматография – масспектрометрия – fmoc-аминокиселини – кардиопептиди – предсърдия В продължение на много години в Института по биохимия на Националната академия на науките на Република Армения в отдела по биохимия на неврохормоните, акад. Галоян и колегите му изследвали регулаторните пътища и механизмите на действие на неврохормоните на хипоталамуса върху различни процеси в тялото.

Потвърждаването на идеята за взаимосвързаното, взаимозависимо, интегрално функциониране на такава система като хипоталамус - хипофизна жлеза - надбъбречни жлези беше повратна точка в ендокринологията. Попълване на тази концепция ТВЪРДОФАЗЕН СИНТЕЗ НА КАРДИОАКТИВЕН ПЕПТИД, ИЗЛУЧЕН ОТ СВИНСКОТО ПРЕДСЪРДИЕ на триадата, предложена от Галоян по отношение на взаимодействието хипоталамус - хипофизна жлеза

– сърце, е огромно научно постижение. Впоследствие е открита нова целева тъкан - сърцето, демонстрирана е способността на този орган да контролира функционирането на специфични пептиди, както и съществуването на механизъм за обратна връзка между хипоталамуса и сърцето чрез тези пептиди.

Откриването на кардиоактивни съединения - неврохормони K, C, G и редица други в хипоталамуса на различни животни послужи като начало на работа не само за изучаване на молекулярните механизми на действие на тези неврохормони, но и за търсене на подобни съединения в сърцето. Основата за цялостно изследване на биохимичните и физикохимичните свойства на кардиоактивните вещества са данни за наличието на 2 кардиоактивни съединения в сърдечния мускул. Установено е участието на неврохормон “С” в регулацията на гликолитичните процеси и нивото на цикличните нуклеотиди чрез инхибиране на PDE cAMP, cAMP-зависима протеин киназа и др. Доказано е, че това съединение има ниско молекулно тегло и е класифицирано като гликопептид.

В лабораторията по аналитична хроматография и пептиден синтез извършихме работа по изолирането и пречистването на пептидни съединения от предсърдията и аурикуларните зони на сърцето на прасето. При разделянето на пептидни фракции чрез препаративна HPLC ние изолирахме и пречистихме 20 съединения с пептидна природа до хомогенно състояние. За да се определи биологичната посока, всички лекарства бяха тествани за промени в компонентите на ЕКГ при плъхове. Експерименталните резултати показват, че 7 съединения имат различни влияния върху определени ЕКГ компоненти.

Пептид № 7 показва най-голяма активност при промяна на амплитудата на R компонента, продължителността на QRS комплекса, амплитудата на S и други параметри.

За да се изследват биологичните механизми на действие на това лекарство, стана необходимо да има голям брой тестови проби. Поради факта, че процесът на изолиране и пречистване на биологични продукти е изключително неефективен, трудоемък, отнема много време и не може да осигури добра възпроизводимост, химическият синтез на това лекарство стана изключително спешен. Анализирайки световната литература в областта на химичния синтез на пептиди, стигнахме до извода, че най-оптималният метод за нас е твърдофазният метод на синтез с използване на fmoc-защитени аминокиселини. Открит през 1984 г., твърдофазният пептиден синтез има много предимства пред конвенционалния синтез по отношение на ефективност, както и удобна обработка и пречистване.

Използвайки няколко различни метода: хидролиза на това лекарство, модификация на аминокиселини с фенил изотиоцианат, получихме аминокиселинния състав на пептид №7. Използвайки данни от масспектрален и NMR анализи и разграждане на Edmond, ние успяхме да получим не само аминокиселинния състав, но и аминокиселинната последователност на пептид № 7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Един ефективен процес на твърдофазен синтез до голяма степен зависи от правилния избор на различни условия за неговото прилагане, като избора на смола, разтворител и кинетика на синтеза. Тези променливи влияят на степента на набъбване на смолата и нейната връзка с аминокиселините, броя на местата на свързване, което в крайна сметка засяга синтеза на пептида като цяло. Ние адаптирахме процеса на синтез на твърда фаза към нашите изследвани пептиди, като взехме предвид особеностите на тяхната аминокиселинна последователност.

Г.С. CHAILIAN Материали и методи. Всички използвани реактиви, разтворители, смоли са от Advanced Chem Techcompany. Използвахме fmoc групи за защита на N-краищата на аминокиселините по време на синтеза и диметилформамид (DMF) като разтворител по време на синтеза. Използвахме киселинно-лабилна 2-хлоротритилова смола като носител. Отстраняването на защитата на fmoc групите се извършва с помощта на разтвор на пиперидин в DMF.

Много важно в процеса на синтез е поставянето на първата аминокиселина върху смолата. Два грама 2Cl-Trt смола се изсипват в спринцовка от 10 ml. DMF се изтегля в спринцовка и смолата се оставя да набъбне за 15 минути. След това DMF се измива. След това разтвор на първата аминокиселина (fmoc-Pro) и реакционен активатор (DIPEA) се изтегля в спринцовката в съотношение 1RESIN/1.2FMOC-PRO/4DIPEA. Реакцията за добавяне на първата аминокиселина отне 3 часа.Много важно условие за синтеза е липсата на свободни линкери след добавянето на първата аминокиселина, така че смолата, след свързване с първата аминокиселина, се третира със смес от метилен, DIPEA (диизопропилетиламин) и DMF в съотношение 80DMF/15MEOH/5DIPEA за блокиране на евентуално оставащи свободни краища. След това DMF смолата се промива 5 пъти за 5 минути. След това аминокиселините се деблокират с 30% разтвор на пипедин в DMF 8 пъти в продължение на 5 минути. След това смолата се промива с DMF 5 пъти за 5 минути. Този цикъл се повтаря през целия пептиден синтез. След всяка стъпка на добавяне на аминокиселина и деблокиране, напредъкът на реакцията се наблюдава чрез теста на Кайзер, който представлява реакцията на нинхидрин със свободна аминогрупа за образуване на характерен тъмносин цвят. Благодарение на този тест стана възможно поетапно наблюдение на реакциите на свързване и деблокиране на аминокиселините.

Пречистването и контролът на синтезирания пептид No. 7 се извършва на 2-компонентна препаративна HPLC система от Waters (САЩ). За инжектиране на пробата беше използван инжектор Rheodyne с 500 μL обем на цикъла. Откриването се извършва в диапазона 190-360 nm. Използвахме колона Symmetry Si-100 C18 (4.6x250 mm) за HPLC с обърната фаза. Скоростта на потока е 50 ml/min. Използвана е градиентна елуентна система H2O/ACN/TFA (98/2/0.1)/(0.100.0.1). Време за анализ 15 мин. Повторната хроматография се извършва на Knauer HPLC аналитична система. Използвана е колона XbridgeC18 (2.6x150 mm). Откриването се извършва при 214 nm.

За потвърждаване на получените данни синтезираното лекарство е подложено на масспектрален анализ в CSU "Аналитична спектрометрия".

Резултати и дискусия. Данните, получени от хроматограмата, показват, че чистотата на синтезирания пептид № 7 след пречистване е повече от 99,6% (фиг. 1).

–  –  –

Проведохме сравнителен хроматографски анализ на нативен пептид № 7 върху X-bridgeC18 колона при същите условия като неговия синтезиран аналог. Резултатите от сравнението са представени (фиг. 2).

ТВЪРДОФАЗЕН СИНТЕЗ НА КАРДИОАКТИВЕН ПЕПТИД, ИЗОЛИРАН ОТ ПРЕДСЪРДИЕ НА СВИНЕ

–  –  –

Ориз. 4. Спектрограми на синтезирани (А) и нативни (Б) лекарства.

Г.С. CHAILIAN Както може да се види от сравнението на хроматограмите, синтезираният аналог и естественият пептид № 7 са идентични по маса и време на освобождаване, което показва идентичността на техните структури и аминокиселинна последователност. По този начин, използвайки метода на твърдофазния пептиден синтез и като вземем предвид структурните особености на изследвания пептид, успяхме да получим хомогенен и идентичен на нативния пептид, състоящ се от 9 аминокиселини. В бъдеще, разполагайки с достатъчно количество от лекарството, планираме да проведем серия от биотестове, за да идентифицираме не само начините, по които този пептид регулира сърдечната дейност, но и механизмите на действие върху други органи и системи.

ЛИТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапионян Р.М., Галоян А.А. Откриване и идентифициране на нов 1 в сърцето на бик.

кардиоактивни протеини. Въпрос пчелен мед. Химия, 37, 2, p. 56-58, 1991.

Срапионян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Изолиране и характеризиране 2.

кардиоактивен триптичен фрагмент от протеина носител на неврохормона "С". Неврохимия, 2, 3, p. 263-271, 1983 г.

Срапионян, Р.М. Мисирян, С.С. Разделяне на нискомолекулни коронарно активни съединения 3.

сърдечен мускул, използвайки комбинация от методи за гел филтрация и електрофореза с полиакриламиден гел. Биолог. списание Армения, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапионян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Разпределение на кардиоактивни протеинови комплекси в сърцето на различни животни. Биолог. списание Армения, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Галоян А. Регулирането на невросекрецията и хормоните на хипоталамо-неврохипофизарната система, СССР, 1963 г.

6. Галоян А.А. Биохимия на нови кардиоактивни хормони и имуномодулатори на функционалната система Невросекреторен хипоталамус, ендокринно сърце. Science Publ. стр. 240, 1997 г.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Наръчник по неврохимия и молекулярна невробиология, 3-то издание, Springer Publishers, 500 стр., 2008 г.

8. Galoyan A.A., Мозъчни невросекреторни цитокини: имунен отговор и невронно оцеляване, VIII, 188 стр., 2004 г.

9. Галоян А.А., Срапионян Р.М. Пречистване на коронародилаторни протеини, изолирани от хипоталамуса. Докл. акад. НаукАрм.ССР, 42, 4, с. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March’s advanced organic chemistry. Публикувано от John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133, 2007 г.

–  –  –

Подобни произведения:

„ОБЩНОСТНО ИЗДАТЕЛСТВО „НАУКА“ Москва 1979 г. UDC 581.55:56.017 Плотников В. В. Еволюция на структурата на растителните съобщества. М.: Наука, стр. 1979, 276 За съвременния метал...”

„Новини на музейния фонд на името на. А. А. Браунер № 2 том I 2004 г. Известия на музейния фонд им. "

Изобретението се отнася до твърдофазов метод за синтез на пептид с формула H-D--Nal--Thr-NH2, който използва както Boc-защитени, така и Fmoc-защитени аминокиселини и хлорометилирана полистиролова смола. 10 заплата летя.

Област на техниката, към която се отнася изобретението

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на пептид, съдържащ три или повече аминокиселинни остатъка, имащ N-крайна аминокиселина, предпоследна аминокиселина, съседна на N-крайната аминокиселина, и С-крайна аминокиселина.

Предишен чл

Пептидният синтез в твърда фаза е въведен през 1963 г., за да се преодолеят много от проблемите на междинните етапи на пречистване, свързани с пептидния синтез в разтвор (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2-ро издание, 1984 г.). При синтез на твърда фаза, аминокиселините се сглобяват (напр. конкатенирани) в пептид с произволна желана последователност, докато единият край на веригата (напр. С-краят) е прикрепен към неразтворим носител. След като желаната последователност е сглобена върху подложката (подложката), пептидът след това се освобождава (т.е. разцепва се) от подложката. Две стандартни защитни групи за а-амино групите на свързващите аминокиселини са Boc, която се отстранява със силна киселина, и Fmoc, която се отстранява с основа. Настоящото изобретение предоставя удобен метод за производство на пептиди, използвайки комбинация от двете от тези а-амино защити в единичен синтез върху евтина хлорометилирана полистиролова смола.

Когато се разработва пептиден синтез в твърда фаза, като се използва някоя от гореспоменатите схеми за защита на α-аминогрупи, важно е всички реактивни „странични групи“ на съставните аминокиселини на пептида да бъдат защитени от нежелани химични реакции по време на сглобяването на веригата. Също така е желателно химичните групи, избрани за защита на различните странични групи, да не бъдат отстранени от реагентите, използвани за премахване на защитата на а-амино групите. Трето, важно е свързването на нарастващата пептидна верига с частицата на смолата да е устойчиво на реагентите, използвани в процеса на сглобяване на веригата, за да се премахне всякакъв тип защита на аминогрупата. В случай на схема за защита на α-амино група, използваща Fmoc, защитата на страничната група трябва да е устойчива на алкалните реагенти, използвани за отстраняване на Fmoc. На практика тези защитни групи на страничната верига обикновено се отстраняват със слабо киселинни реагенти, след като сглобяването на пептидната верига е завършено. Ако се използва схемата за защита на α-амино, използваща Вос, защитата на страничната група трябва да бъде устойчива на слабо киселинния реагент, използван за отстраняване на Вос групата във всеки цикъл. На практика тези защитни групи на страничната верига в а-амино защитната схема с Вос обикновено се отстраняват с безводен HF след завършване на сглобяването на пептидната верига. По този начин, на практика, групите, обикновено използвани за защита на страничните вериги в схемата за защита на -амино групата с Fmoc, са нестабилни при условията, използвани за премахване на защитата на -амино групите с Вос. Следователно, двата типа схеми за защита на α-аминогрупите по време на сглобяването на пептидната верига в твърдофазния пептиден синтез не се комбинират. В допълнение, въпреки че най-евтината полимерна смола, използвана в пептидния синтез (хлорометилиран полистирол или "смола Merifield") се използва широко заедно с аминокиселини, защитени от Boc групи, литературата заключава, че тя не е приложима в случай на защита на α-амино групи от Fmoc групи поради неговата нестабилност при алкални условия (виж Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2-ро издание, 1984). Настоящото изобретение е насочено към метод за комбиниране както на Вос-защитени, така и на Fmoc-защитени аминокиселини върху Merifield смола по време на твърдофазния синтез на определени пептиди.

Известно е, че Lanreotide®, който е аналог на соматостатин, инхибира освобождаването на растежен хормон и също инхибира инсулина, глюкагона и екзокринната панкреатична секреция.

Патент на САЩ No. 4,853,371 разкрива и претендира Lanreotide®, процес за неговото получаване и метод за инхибиране на секрецията на растежен хормон, инсулин, глюкагон и екзокринна панкреатична секреция.

Патент на САЩ No. 5,147,856 разкрива използването на Lanreotide® за лечение на рестеноза.

Патент на САЩ No. 5,411,943 разкрива използването на Lanreotide® за лечение на хепатома.

Патент на САЩ No. 5,073,541 разкрива използването на Lanreotide® за лечение на рак на белия дроб.

Заявка за патент на САЩ No. 08/089410, подадена на 9 юли 1993 г., разкрива използването на Lanreotide® за лечение на меланома.

Патент на САЩ No. 5,504,069 разкрива използването на Lanreotide® за инхибиране на ускорен растеж на солиден тумор.

Заявка за патент на САЩ № 08/854941, подадена на 13 май 1997 г., разкрива използването на Lanreotide® за загуба на телесно тегло.

Заявка за патент на САЩ № 08/854943, подадена на 13 май 1997 г., разкрива използването на Lanreotide® за лечение на инсулинова резистентност и синдром X.

Патент на САЩ No. 5,688,418 разкрива използването на Lanreotide® за удължаване жизнеспособността на клетките на панкреаса.

РСТ заявка No. PCT/US 97/14154 разкрива използването на Lanreotide® за лечение на фиброза.

Заявка за патент на САЩ No. 08/855311, подадена на 13 май 1997 г., разкрива използването на Lanreotide® за лечение на хиперлипидемия.

Заявка за патент на САЩ No. 08/440061, подадена на 12 май 1995 г., разкрива използването на Lanreotide® за лечение на хиперамилинемия.

Заявка за патент на САЩ No. 08/852221, подадена на 7 май 1997 г., разкрива използването на Lanreotide® за лечение на хиперпролактинемия и пролактиноми.

Същността на изобретението

Настоящото изобретение осигурява метод за получаване на пептид, съдържащ три или повече аминокиселинни остатъка, имащ N-крайна аминокиселина, предпоследна аминокиселина, съседна на N-крайната аминокиселина, и С-крайна аминокиселина, като методът включва следните стъпки:

(a) прикрепване на първа аминокиселина към твърда опорна смола чрез естерна връзка за образуване на първи присъединителен продукт, което включва (i) взаимодействие на воден разтвор на цезиев карбонат с алкохолен разтвор на първата аминокиселина за образуване на цезиева сол от първата аминокиселина, (ii) получаване на несъдържаща разтворител цезиева сол на първата аминокиселина, (iii) взаимодействие на твърдата подложка от смола с цезиевата сол на първата аминокиселина в сух (безводен) полярен апротонен разтворител до образуват първи добавен продукт,

където първата аминокиселина съответства на С-терминалната аминокиселина на пептида, аминогрупата на нестраничната верига (главната) верига на първата аминокиселина е блокирана от Вос и първата аминокиселина няма функционална група в страничната верига, за която се изисква защита, и твърдата носеща смола е хлорометилирана полистиролова смола;

(b) премахване на защитата (деблокиране) на Вос от първия добавен продукт с киселина за образуване на депротектиран първи добавен продукт;

(c) по избор, добавяне на допълнителна аминокиселина към освободения първи добавен продукт, което включва реакция на следващата аминокиселина с освободения първи добавен продукт в органичен разтворител, съдържащ реагент за пептидно удължаване, за да се получи блокиран (защитен) следващ добавен продукт, където следващата аминокиселина има в главната верига аминогрупа, блокирана от Вос, и ако следващата аминокиселина има една или повече функционални групи на страничната верига, тогава функционалните групи на страничната верига не изискват защита, или функционалните групи на страничната верига имат защитни групи, които са устойчиви на киселинните или алкални реагенти, използвани за отстраняване на защитата, съответно Boc и Fmoc;

(d) премахване на защитата на Вос от блокирания следващ добавен продукт, което включва реакция на блокирания следващ добавен продукт с киселина за получаване на деблокирания следващ добавен продукт;

(e) по желание, повтаряне на етапи (c) и (d), като във всеки цикъл се образува освободеният продукт от (X+1)-тото следващо добавяне, където X е броят на необходимото повторение на цикъла;

(e) добавяне на допълнителна аминокиселина към освободения първи добавен продукт от етап (b) или, по избор, към освободения (X+1)-ти следващ добавен продукт от етап (e), което включва реакция на следващата аминокиселина със споменатия първи добавен продукт или със споменатия неблокиран (X+1)-ти следващ добавен продукт в органичен разтворител, съдържащ реагент за удължаване на пептида, за да се получи блокиран (защитен) следващ добавен продукт, където следващата аминокиселина има Fmoc-блокиран скелет амино група, при условие че ако следващата аминокиселина има една или повече функционални групи в страничната верига, тогава функционалните групи в страничната верига не изискват защита, или функционалните групи в страничната верига имат защитни групи, които са устойчиви на алкални реагенти, използвани за премахване на защитата на Fmoc;

(g) премахване на защитата на Fmoc от блокирания следващ добавен продукт, което включва реакция на блокирания следващ добавен продукт с първичен или вторичен амин за получаване на деблокирания следващ добавен продукт;

(h) по избор, повтаряне на стъпки (e) и (g), и във всеки цикъл се формира деблокираният продукт на (X+1)-то следващо добавяне, където X е броят на необходимото повторение на цикъла, докато предпоследният е включен в пептида и деблокирана аминокиселина;

(i) добавяне на N-терминална аминокиселина към деблокирания продукт на (X+1)-тото следващо добавяне, което включва реакция на N-терминалната аминокиселина с деблокирания продукт на (X+1)-тото следващо добавяне в органичен разтворител, съдържащ реагент за пептидно удължаване, произвеждащ блокиран завършващ продукт, където N-терминалната аминокиселина има основна амино група, блокирана от Вос или Fmoc;

(j) премахване на защитата на затворения адуктор с киселина в случая на Вос или основа в случая на Fmoc за образуване на завършен пептиден продукт върху смолата;

(j) ако завършеният продукт от пептидна смола съдържа функционални групи на страничната верига, тогава, по избор, премахване на защитата на функционалните групи на страничната верига на завършения продукт от пептидна смола, което включва взаимодействие на завършения продукт от пептидна смола с подходящи депротектиращи реагенти за получаване на завършената пептидна смола продукт пептиден продукт върху депротектирана смола; И

(к) разцепване на пептида от твърдата подложка от смола в рамките на завършения пептиден продукт от смола или завършения пептиден продукт от смола с отстранена защита, за да се произведе пептид, което включва взаимодействие на завършения пептиден продукт от смола или отстранен от защитата завършен пептиден продукт от смола с амоняк, първичен амин или вторичен амин, докато разцепването на пептида от смолата е по същество пълно;

при условие, че етапи (e) и (g) в пептидния синтез трябва да се извършат поне веднъж.

Предпочитан е методът съгласно настоящото изобретение, където амонякът, първичният амин или вторичният амин в етап (l) е в разтворител, съдържащ алкохол и, по избор, апротонен полярен разтворител,

Предпочитан е методът съгласно настоящото изобретение, където стъпка (k) допълнително включва следните стъпки:

утаяване на разцепения пептид от разтворителя;

разделяне чрез филтруване на твърдата подложка от смола и утаения пептид и

екстрахиране на пептида с киселинен разтвор за изолиране на пептида.

Предпочитан е методът съгласно настоящото изобретение, където първата аминокиселина е Boc-L-Thr.

Предпочитан е методът от настоящото изобретение, при който първата аминокиселина е цезиева сол на Boc-L-Thr, като се получава Boc-L-Thr смола като първи добавен продукт, а депротектираният първи добавен продукт е H-L-Thr смола .

Предпочитан е методът съгласно настоящото изобретение, където киселината, използвана за отстраняване на Вос защитната група в етап (i) е трифлуорооцетна киселина (TFA).

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е метод, при който органичният разтворител е метилен хлорид, хлороформ или диметилформамид и реагентът за пептидно удължаване е диизопропил карбодиимид, дициклохексил карбодиимид или N-етил-N"-(3-диметил-аминопропил )карбодиимид.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е метод, включващ извършване на етапи (e) и (g) шест пъти след образуването на деблокирания първи добавен продукт с формула H-L-Thr-смола, където следващите аминокиселини са добавени в реда: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L- Cys(Acm) за образуване на продукта H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е метод, включващ добавяне на Boc-D-Nal към H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys( Acm) -Tnr смола съгласно етап (c) за получаване на Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Act)-Thr смола.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, включва едновременно отстраняване на групата Вос, защитаваща D- -Nal, групата O-t-Bu, защитаваща Tyr, и групата Вос, защитаваща Lys в Boc-D- -Nal-Cys(Acm )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr смола съгласно етап (i), за получаване на пълен пептиден продукт върху смолата с формула H-D- -Nal -Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, включва отстраняване на пептида H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твърдата смола чрез извършване на H-D- Nal-Cys реакция (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смоли с амоняк в разтворител, съдържащ алкохол и, по избор, апротонен полярен разтворител, до почти пълно елиминиране, за да се получи H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е методът, при който алкохолът е метанол и полярният апротонен разтворител е диметилформамид.

Предпочитаният метод от непосредствено предходния метод включва едновременно отстраняване на Cys-защитните Acm групи и циклизиране на получените депротектирани Cys остатъци в получения пептиден продукт с формула H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 чрез взаимодействие на H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 с разтвор на йод в алкохол до почти пълно премахване на защитата и циклизиране за получаване на H-D--Nal--Thr-NH2.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е методът, при който пептидът е H-D-Nal--Thr-NH2.

Предпочитан метод, свързан с непосредствено предходния метод, е методът, при който пептидът е аналог на соматостатин.

Термините, използвани в описанието на настоящото изобретение, са дефинирани както следва:

"първа аминокиселина": обхваща всяка аминокиселина, в която аминогрупата в главната верига (не в страничната верига) е защитена от Вос, който е наличен в търговската мрежа или може да бъде синтезиран съгласно методи, известни на специалиста в областта art, например Boc-L-Thr;

"първи добавен продукт": описва продукт, който е прикрепен към твърда подложка от смола, която е резултат от добавянето на първа аминокиселина към твърдата подложка от смола, например Boc-L-Thr-смола;

"депротектиран първи добавен продукт": описва продукт, получен в резултат на премахването или премахването на Вос група от първия добавен продукт - например, H-L-Thr смола, където "Н" представлява наличния основен амино водород, получен в резултат на етапа на премахване на защитата ;

"следваща аминокиселина": описва всяка аминокиселина, в която аминогрупата в главната верига е защитена от Вос или Fmoc, която е достъпна в търговската мрежа или може да бъде синтезирана съгласно методи, известни на специалиста в областта. Тъй като стъпка (c) и стъпка (e) могат да бъдат част от повтарящ се цикъл, където стъпката се изпълнява повече от веднъж, всеки път, когато се изпълнява стъпка (c) или стъпка (e), „следващата аминокиселина“ може да бъде независимо избрана от групата на известни или възможни синтезирани аминокиселини, в които аминогрупата в главната верига е защитена от Вос или Fmoc;

„(X+1)-ти следващ добавен блокиран продукт“: описва продукта, прикрепен към твърдата поддържаща смола, който е резултат от комбинацията на следващата аминокиселина с „неблокирания следващ добавен продукт“. Тъй като етапи (c) и (d) и етапи (e) и (g) могат да бъдат част от повтарящ се цикъл, където могат да бъдат добавени допълнителни аминокиселини, терминът "блокиран продукт от (X+1)-то следващо добавяне" се отнася към продукта, получен в резултат на всеки от предходните цикли на присъединяване;

„деблокиран продукт на (X+1)-то следващо добавяне“: описва продукта, получен в резултат на премахването на групата Fmoc от „блокирания продукт на (X+1)-то следващо добавяне“;

„завършен пептиден продукт върху смола“: описва пептиден продукт, прикрепен към твърда подложка от смола, след като N-терминалната аминокиселина е била прикрепена към пептидната верига и след като основната аминогрупа на N-терминалната аминокиселина е била депротектирана или депротектирана , но който все още има някакви защитни групи върху функционалните групи на страничните вериги, които не са отстранени чрез реакцията, която премахва защитната група от главната верига на N-терминалната аминокиселина; И

„завършен пептиден продукт върху депротектирана смола“: описва пептиден продукт, прикрепен към твърда подложка от смола, където всички функционални групи на страничната верига на аминокиселината са отстранени или депротектирани.

Примери за киселини, които могат да се използват за премахване на защитата на Вос са трифлуорооцетна киселина (TFA), метансулфонова киселина и органични разтвори, съдържащи НС1.

Примери за първични и вторични амини, които могат да се използват за премахване на защитата на Fmoc са 4-(аминометил)пиперидин, пиперидин, диетиламин, DBU и трис(2-аминоетил)амин.

Примери за ненуклеофилни бази, които могат да се използват за неутрализиране на TFA соли на освободени амино групи (RNH 3 + CF 3 COO -, тези соли трябва да бъдат превърнати в „свободни“ амини (NH 2) преди или по време на добавянето на следващия амино киселина, в противен случай добавянето няма да се осъществи) са диизопропилетиламин (DIEA) и триетиламин (TEA).

Примери за органични разтворители, които могат да се използват в реакции на присъединяване на аминокиселини, включват метиленхлорид, хлороформ, дихлороетан, диметилформамид, диетилацетамид, тетрахидрофуран, етилацетат, 1-метил-2-пиролидон, ацетонитрил или комбинация от тези разтворители.

Примери за агенти за пептидно удължаване включват заместени карбодиимиди като: диизопропил-карбодиимид, дициклохексил-карбодиимид или N-етил-N"-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

Карбоксилните групи и аминогрупите, които участват в образуването на пептидната амидна връзка, се наричат ​​съответно карбоксилна група или аминогрупа "нестранична верига". От друга страна, всички аминокиселинни функционални групи, които не участват в образуването на пептидната амидна връзка, се наричат ​​функционални групи на "странична верига".

Терминът "основно стабилна група" се отнася до защитни групи, използвани за защита на функционални групи на аминокиселини, които (1) са основно стабилни, например не могат да бъдат отстранени от основи като 4-(аминоетил)пиперидин, пиперидин или трис(2). -аминоетил)амин, които са основи, обикновено използвани за отстраняване на Fmoc защитната група, и (2) могат да бъдат отстранени с киселина като трифлуорооцетна киселина или друг метод като каталитично хидрогениране.

Символите "Fmoc" и "Boc" се използват тук и в придружаващата формула за обозначаване съответно на 9-флуоренил-метоксикарбонил и tert-бутилоксикарбонил.

Методът, описан по-горе, може да се приложи за получаването на пептиди, за предпочитане аналози на соматостатин, като Lanreotide® октапептид, който има следната формула: H-D--Nal--Thr-NH2. Ако трябва да се синтезира H-D--Nal--Thr-NH2, стабилните на основата защитни групи, използвани за защита на функционалните групи на страничната верига Cys, Lys и Tyr, могат да бъдат съответно ацетамидометил (Acm), Вос и терт-бутил. Acm се предпочита за Cys.

Под аналог на соматостатин се има предвид пептид, който проявява биологична активност, подобна (т.е. агонист) или противоположна (т.е. антагонист) на тази на соматостатин.

Във формулата H-D- -Nal--Thr-NH2 всеки от обичайните трибуквени символи на аминокиселина (напр. Lys) се отнася до структурен остатък на аминокиселината. Например, символът Lys в горната формула представлява -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Символът D- -Nal- представлява аминокиселинния остатък D-2-нафтилаланил. Скобите показват дисулфидна връзка, свързваща свободните тиоли на два Cys остатъка в пептида, което показва, че аминокиселините на пептида в скобите образуват цикъл.

Въз основа на описанието, дадено тук, специалистът в областта ще може да използва напълно настоящото изобретение.

Освен ако не е определено друго, всички технически и научни термини, използвани тук, имат същото значение, както обикновено се разбира от специалистите в областта, към която се отнася настоящото изобретение. В допълнение, всички публикации, патентни заявки, патенти и други препратки, цитирани тук, са включени тук чрез препратка.

Пептидът може да бъде получен в съответствие с метода от настоящото изобретение съгласно следната процедура.

Разтвор на 0,5 моларен еквивалент цезиев карбонат във вода се добавя бавно към разтвор на 1 моларен еквивалент на Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA), където AA 1 съответства на С-терминалната аминокиселина, разтворена в алкохол, за предпочитане метанол. Получената смес се разбърква за около 1 час при стайна температура, след което целият алкохол и цялата вода се отстраняват при понижено налягане, за да се получи сух прах от цезиева сол Вос-АА1. Смола Merifield, 1,0 еквивалент (хлорометилиран полистирен, 200-400 меша, включване на хлорни йони 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky или Polymer Laboratories, Church Stretton, Англия) се промива с хлориран разтворител, за предпочитане дихлорометан (DCM), алкохол, за предпочитане метанол, и полярен апротонен разтворител, за предпочитане диметилформамид (DMF). Цезиевата сол Boc-AA 1 на прах се разтваря в безводен (сух) полярен апротонен разтворител, за предпочитане DMF, и разтворът се комбинира с предварително измитата смола. Суспензията се разбърква внимателно при приблизително 45°-65°С, за предпочитане при 50°-60°С, за приблизително 48 до 106 часа, за предпочитане 85 до 90 часа, в инертна атмосфера като азот. Смолата се отделя чрез филтруване и се промива обилно с полярен апротонен разтворител, за предпочитане DMF, вода и накрая с алкохол като МеОН. Смолата Boc-AA 1 се суши при понижено налягане.

Смолата Vos-AA 1 се въвежда в стъклен реактор с филтърно дъно, направено от голямо поресто стопено стъкло. Смолата се промива с хлориран разтворител като DCM, деблокира се с органична киселина, за предпочитане 25% TFA в DCM, промива се за кратко с хлориран разтвор като DCM и алкохол като МеОН, неутрализира се с органична основа, за предпочитане триетиламин в DCM, и се промива отново с DCM и полярен апротонен разтворител като DMF, като се получава депротектирана АА 1 смола.

Всеки желан брой аминокиселини след това по избор се добавя към депротектираната АА 1 смола. Ако следващата аминокиселина има -амино група с Fmoc защита (Fmoc-AA x), тогава групата на страничната верига или не изисква защита (например Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe или Fmoc-Thr) или страничната верига защитава с устойчива на база група. Моларен излишък от Fmoc-AA x (където x е номерът на аминокиселинната позиция в пептида, измерен от С-края) се свързва за приблизително 60 минути към депротектираната AA 1 смола, като се използва реагент за пептидно удължаване като диизопропилкарбодиимид (DIC ), в DCM/DMF смес. Добавената смола се промива с DMF, алкохол и DCM за получаване на Fmoc-AA х -AA1 смола. Прикрепването може да се тества с помощта на метода на Кайзер нинхидрин. След това смолата Fmoc-AA x -AA 1 се промива веднъж с DMF и след това се деблокира с разтвор на основа в органичен разтворител като пиперидин в DMF, за да се получи смола AA x -AA 1. След това смолата АА х -АА 1 се промива с DMF, последвано от няколко промивания както с алкохол, като МеОН, така и с DCM. След това смолата АА х -АА 1 се промива веднъж с DMF за около 3 минути, три пъти с изопропанол, за предпочитане всеки път за около 2 минути, и три пъти с DCM, за предпочитане всеки път за около 2 минути. След това смолата е готова за по-нататъшно прикрепване или на Fmoc защитена аминокиселина, както е описано по-горе, или на Вос защитена аминокиселина, както е описано по-долу.

По същия начин, ако всяка следваща аминокиселина, която трябва да бъде прикрепена към депротектираната АА1-смола, е избрана да има защитена Вос-амино група (Вос-АА x), тогава или групата на страничната верига не изисква защита (това може да бъде Вос- Gly, Boc-Ala, Boc-Phe или Boc-Thr), или страничната верига трябва да бъде защитена от група, която е устойчива на отстраняване както от киселина, така и от основа - това може да бъде Boc-Cys(Acm). Ако е избран Boc-AA x, той се добавя, като се използват същите реагенти и разтворители, както в случая, описан по-горе за Fmoc-аминокиселини, и пълнотата (завършването) на добавянето може да се провери чрез метода на Kaiser ninhydrin. Смолата Boc-AA x -AA1 след това се депротектира с киселинен разтвор в органичен разтворител като TFA в DCM, за да се получи CF3CO - H + -AA x -AA1 смола. След това тази смола се промива няколко пъти с хлорирани разтворители като DCM, алкохол като MeOH и се неутрализира с ненуклеофилна основа като триетиламин в DCM, последвано от още няколко измивания с хлориран разтворител като DCM, което дава AA x -AA 1 - смола След това смолата е готова за по-нататъшно прикрепване на Вос или Fmoc защитена аминокиселина, както е описано по-горе.

В зависимост от желаната пептидна последователност и вида на използваната а-амино-защитена аминокиселина (или Fmoc-защитена, или Вос-защитена), се използва подходяща комбинация от процедурите на свързване, описани по-горе, в зависимост от това коя аминокиселина трябва да заеме позиция на страничната верига в пептидната последователност, имаща защитна група, която може да бъде отстранена или с основа, необходима за отстраняване на Fmoc от -амино групата, или с киселина, необходима за отстраняване на Вос от -амино групата. Такава защитена аминокиселина може да бъде N--Boc-N"- -Fmoc-лизин или N--Fmoc-N"--Boc-лизин. Ако това е така, всички защитни групи, избрани за а-амино групите на следващите аминокиселини, до N-терминалната аминокиселина, трябва да бъдат съвместими със защитната странична група, избрана за тази позиция. Това означава, че защитните групи на страничната верига трябва да са устойчиви на депротектиращия агент, използван за премахване на защитата на а-амино групите на следващите аминокиселини. За N-терминална аминокиселина или Boc, или Fmoc могат да се използват като защита на -амино групата, тъй като премахването на защитата на N-терминалната аминокиселина може едновременно да премахне защитата на някои от защитените странични вериги, без нежелано да повлияе на стратегията за пептиден синтез, тъй като не аминокиселините остават се добавят.

Завършената пептидна верига, която все още е прикрепена към смолата, трябва да бъде премахната и освободена. За да се отстранят всички стабилни на база защитни групи и N-терминалната блокираща група на аминокиселината, ако е приложимо, пептидът върху смолата се третира с киселина в органичен разтворител като TFA в DCM. За да се отстранят всички киселинно стабилни защитни групи и N-терминалната аминокиселинна блокираща група, ако е приложимо, пептидът върху смолата се третира с органична основа като пиперидин в DMF. Алтернативно, киселинно стабилните групи могат да се запазят, докато не бъдат отстранени чрез последващо разцепване на пептида с амоняк или аминова основа. Депротектираният пептид върху смолата след това се промива с хлориран разтворител като DCM, алкохол като МеОН и се суши до постоянно тегло при понижено налягане.

Пептидът се отцепва от смолата и С-краят се превръща в амид чрез суспендиране на пептида върху смолата в смес 3:1 MeOH/DMF. Суспензията се охлажда до температура под приблизително 10°C в азотна атмосфера и безводен газ амоняк се въвежда под повърхността на разтворителя, докато разтворът се насити с него, докато температурата се поддържа под приблизително 10°C. Суспензията се разбърква внимателно в продължение на приблизително 24 часа, като същевременно се оставя температурата да се повиши до приблизително 20°C. Степента на завършване на реакцията се проверява чрез изчезването на междинния метилов етер върху HPLC при подходящи условия в зависимост от вида на пептида. Реакционната смес се охлажда и се добавя необходимото количество безводен амоняк, докато HPLC площта на пика, съответстваща на метиловия естер, е по-малка от 10% от площта на пика на желания продукт. Суспензията се охлажда до температура под приблизително 10°С и разбъркването продължава цяла нощ, за да се утаи пептидът. Утайката и смолата се отделят чрез филтруване и се промиват със студен МеОН. Утайката и смолата се сушат при понижено налягане и продуктът се екстрахира от смолата с воден разтвор на оцетна киселина.

Ако пептидът съдържа защитени Cys остатъци в неговата последователност, тиоловите групи могат да бъдат депротектирани и остатъците могат да бъдат циклизирани съгласно следната процедура. Пептидът, съдържащ Acm-защитени Cys групи, се разтваря във воден разтвор на оцетна киселина в азотна атмосфера. Разтворът се разбърква бързо и се добавя разтвор на йод в алкохол на една порция. Сместа се разбърква и пълнотата на отстраняването на защитата се проверява с HPLC. След това реакцията се спира чрез титруване с 2% разтвор на натриев тиосулфат, докато цветът на разтвора изчезне. Суровата смес се пречиства чрез препаративна хроматография върху С8 патрон с градиент на ацетонитрил в 0.1 амониев ацетатен буфер, обезсолява се върху С8 патрон с градиент на ацетонитрил в 0.25 N оцетна киселина и се лиофилизира за получаване на целевия пептид.

Пример за изпълнение на изобретението

Следващият пример е даден, за да илюстрира метода на настоящото изобретение и не трябва да се тълкува като ограничаващ неговия обхват.

Пример 1. H2-D- -Nal--Thr-NH2

A) Boc-L-Thr-смола

Разтвор от 2,58 g цезиев карбонат в 2,5 ml вода се добавя бавно към разтвор от 3,48 g Boc-L-треонин (Bachem California, Torrance, Калифорния), разтворен в 7 ml метанол. Получената смес се разбърква в продължение на приблизително 1 час при стайна температура, след което целият метанол и цялата вода се отстраняват при понижено налягане, за да се получи прах от суха Цезиева сол на Вос-L-треонин. 10 g смола Merifield (хлорометилиран полистирен, 200-400 меша, включване на хлор 1,3 mEq/g, Advanced ChemTech, Луисвил, Кентъки) се промива с дихлорометан (DCM), метанол (MeOH) и диметилформамид (DMF) (всеки 2 пъти 70 ml). Цезиевата сол Boc-L-треонин на прах се разтваря в 60 ml сух DMF и разтворът се комбинира със смолата, промита както по-горе. Суспензията се разбърква внимателно при температура приблизително 50°-60°С за приблизително 85 до 90 часа в азотна атмосфера. Смолата се отделя чрез филтруване и се промива обилно с DMF, дейонизирана вода и накрая с МеОН. Вос-треониновата смола се изсушава при понижено налягане при приблизително 40°С. Включването на треонин беше 0,85 ± 0,15 meq/g суха смола.

B) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола

2.0 g Вос-треонинова смола от етап (А) се добавя към 50 ml стъклен реактор с дъно на филтър от разтопено стъкло с големи пори (натоварване 1.74 mmol). Смолата се промива 2 пъти с DCM (20 ml), всеки път за приблизително 5 минути, деблокира се с 25% TFA в DCM (30 ml) - първия път за приблизително 2 минути и втория път за приблизително 25 минути, промива се 3 пъти за приблизително 2 минути с DCM (20 ml), изопропанол (20 ml) и DCM (20 ml), неутрализира се два пъти за около 5 минути с 10% триетиламин в DCM (20 ml), промива се 3 пъти за приблизително 2 минути с DCM и се изплаква веднъж с DMF (20 ml) за приблизително 5 min.

Към деблокираната смола се добавят 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 eq.) Fmoc-L-цистеин ​​(Acm) (Bachem, СА) и 683 μl (4,35 mmol, 2,5 eq.) диизопропил-карбодиимид (DIC) в 14 ml от 2:1 смес от DCM/DMF за приблизително 1 час.След свързване, смолата се промива 1 път за около 3 минути с DMF (20 ml), 3 пъти за около 2 минути с изопропанол и 3 пъти за около 2 минути DXM (20 ml). Свързването се тества по метода на Кайзер нихидрин.

След свързването, смолата се промива веднъж с DMF и след това се деблокира с разтвор на пиперидин в DMF. След това деблокираната смола с добавката се промива с DMF и няколко пъти едновременно с МеОН и DCM. Добавената смола се промива 1 път за около 3 минути с DMF (20 ml), 3 пъти за около 2 минути с изопропанол (20 ml) и 3 пъти с DCM (20 ml) за около 2 минути всеки път. Свързването се тества по метода на Кайзер нинхидрин.

Всяка от следните защитени аминокиселини беше свързана към промитата смола с помощта на DIC в DMF/DCM и депротектирана, както е описано по-горе в следната последователност: Fmoc-L-валин, Fmoc-L-лизин (Вос), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин (O-t-Bu) и Fmoc-L-цистеин (Acm) (всички от Bachem California), Boc-D-2-нафтилаланин (Synthech, Albany, OR).

Завършената пептидна верига беше деблокирана и депротектирана два пъти със 75:20:5 DCM/TFA/анизол (30 ml) за около 2 минути и около 25 минути, промита 3 пъти за около 2 минути всеки път с DCM (20 ml), изопропанол (10 ml) и DCM (20 ml), неутрализира се 2 пъти за около 5 минути с 10% триетиламин в DCM (20 ml) и се промива 3 пъти за около 2 минути с DCM (20 ml) и МеОН (20 ml). Смолата се суши при понижено налягане. Сухото тегло е 3.91 g (103% от теоретичния добив).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

2.93 g от заредената с пептид смола от етап (В) (1.3 mmol-eq) се суспендира в 50 ml смес 3:1 MeOH/DMF. Суспензията се охлажда до температура под приблизително 10°С в азотна атмосфера и сух амонячен газ се продухва, докато разтворът се насити с него, докато температурата се поддържа под приблизително 10°С. Суспензията се разбърква внимателно в продължение на приблизително 24 часа, оставяйки температурата да се повиши до приблизително 20°С. Степента на завършване на реакцията се проверява чрез изчезването на междинното съединение метилов етер с помощта на HPLC (VYDAC® сорбент, размер на зърното 5 μm, размер на порите 100 Å, C18, елуиране при изократични условия 26% CH3CN в 0,1% TFA, скорост 1 ml/min, запис при 220 mm; при тези условия времето на забавяне Rt е ~ 14 min за метиловия естер и ~ 9,3 min за амидния продукт). Реакционната смес се охлажда и се добавя излишък от безводен амоняк, докато пиковата площ на HPLC, съответстваща на метиловия естер, стане по-малка от 10% от пиковата площ на желания продукт. Суспензията се охлажда до температура под приблизително 10°С и разбъркването продължава цяла нощ, за да се утаи пептидът. Утайката и смолата се отделят чрез филтруване и се промиват с 15 ml студен МеОН. Утайката и смолата се сушат при понижено налягане и продуктът се екстрахира от смолата с 50% воден разтвор на оцетна киселина (3 порции от 30 ml). HPLC анализът показва наличието на 870 mg (0.70 mmol) от продукта от заглавието в сместа (96% чистота в изократна HPLC система).

D) H-D- -Nal--Thr-NH2

500 mg (0.40 mmol) от пептида от етап (В) се разтварят в 300 ml 4% оцетна киселина и се нагряват до приблизително 55°С под азотна атмосфера. Разтворът се разбърква бързо и на една порция се добавя 2% w/v разтвор на йод в 7.7 mL МеОН (0.60 mmol). Сместа се разбърква в продължение на приблизително 15 минути, след което реакцията се спира чрез титруване с 2% разтвор на натриев тиосулфат, докато цветът изчезне (~ 2 ml). Сместа се охлажда до стайна температура и се филтрува. Сместа се пречиства чрез препаративна хроматография на C8 колона (YMC, Inc., Wilmington, NC) с градиент на ацетонитрил в 0.1 М амониев ацетат, обезсолена на C8 YMC колона с градиент на ацетонитрил в 0.25 N оцетна киселина и лиофилизиран, за да се получат 350 mg целеви пептид с 99% чистота.

Въз основа на горното описание, специалистът в областта може лесно да установи основните характеристики на настоящото изобретение и, без да се отклонява от духа и обхвата му, да направи различни промени и модификации на изобретението, за да го адаптира към различни приложения и условия. По този начин други изпълнения на изобретението също са обхванати от претенциите.

ИСК

1. Метод за получаване на пептид с формула H-D- -Nal--Thr-NH2, където споменатият метод включва следните етапи:

(a) прикрепване на първа аминокиселина към твърда опорна смола чрез естерна връзка за образуване на „първи добавен продукт“, което включва (i) взаимодействие на воден разтвор на цезиев карбонат с алкохолен разтвор на първата аминокиселина за образуване на цезиева сол на първата аминокиселина, (ii) получаване на несъдържаща разтворител цезиева сол на първата аминокиселина, (iii) взаимодействие на твърдата подложка от смола с цезиевата сол на първата аминокиселина в безводен полярен апротонен разтворител до образуване „първодобавен продукт“,

където първата аминокиселина е Boc-L-Thr, която съответства на С-терминалната аминокиселина на пептида, и твърдата поддържаща смола е хлорометилирана полистиролова смола;

(b) премахване на защитата на Вос от първия добавен продукт с киселина, за да се образува "депротектиран първи добавен продукт";

(c) по избор, добавяне към „освободения първи добавен продукт“ на „следваща аминокиселина“, което включва реакция на „следващата аминокиселина“ с „освободения първи добавен продукт“ в органичен разтворител, съдържащ реагент за пептидно удължаване, за да се получи "блокиран продукт от следващото добавяне", където "следващата аминокиселина" има Вос-затворена аминогрупа в главната верига и ако тази "следваща аминокиселина" има една или повече функционални групи в страничната верига, тогава функционалната групите в страничната верига не изискват защита или тези функционални групи в страничната верига имат защитни групи, които са стабилни спрямо киселинни или алкални реагенти, използвани за премахване на защитата, Вос и Fmoc, съответно;

(d) премахване на защитата на Вос на "блокирания следващ добавен продукт", което включва реакция на "блокирания следващ добавен продукт" с киселина за получаване на "деблокиран следващ добавен продукт";

(e) по избор, повтаряне на етапи (c) и (d), като всеки цикъл произвежда "деблокиран продукт от (X+1)-то следващо добавяне", където X означава броя на желаните повторения на циклите;

(f) добавяне на „следващата аминокиселина“ към „деблокирания продукт с първо добавяне“ от стъпка (b) или, по избор, към „(X+1)-ия следващ добавен деблокиран продукт“ от стъпка (e), което включва пренасяне извън реакцията „следваща аминокиселина" със споменатия „неблокиран продукт от първото добавяне" или със споменатия „(X+1)-ти следващ добавен неблокиран продукт" в органичен разтворител, съдържащ реагент за пептидно удължаване, за да се получи „блокиран продукт със следващо добавяне", където "следващата аминокиселина" има Fmoc-затворена аминогрупа на основната верига, при условие че ако тази "следваща аминокиселина" има една или повече функционални групи на страничната верига, тогава функционалните групи на страничната верига не изискват защита или функционалната странична верига групите имат защитни групи, които са устойчиви на алкални реагенти, използвани за премахване на защитата на Fmoc;

(g) премахване на защитата на Fmoc "блокирано следващо добавяне", което включва реакция на "блокираното следващо добавяне" с първичен или вторичен амин за получаване на "деблокирано следващо добавяне";

(h) по избор, повтаряне на стъпки (e) и (g), като всеки цикъл произвежда „деблокиран продукт от (X+1)-то следващо добавяне“, където X е желаният брой повторения на цикъла, докато се включи в освобождава се пептидът и предпоследната аминокиселина;

(i) добавяне на N-крайна аминокиселина към "освободения продукт от (X+1)-тото последващо добавяне", което включва реакция на N-крайната аминокиселина с "освободения продукт от (X+1)- следващо добавяне" в органичен разтворител, съдържащ реагент за пептидно удължаване за получаване на "блокиран присъединителен продукт", където "N-терминалната аминокиселина" има основна амино група, блокирана от Вос или Fmoc;

(j) премахване на защитата на затворения свързващ продукт Вос или Fmoc чрез взаимодействие на затворения свързващ продукт с киселина в случая на Вос или основа в случая на Fmoc за образуване на затворения пептиден продукт върху смолата;

(k) ако „завършеният продукт от пептидна смола“ съдържа функционални групи на страничната верига, тогава, по избор, премахване на защитата на функционалните групи на страничната верига на „продукта от завършената пептидна смола“, което включва взаимодействие на „продукта от завършената пептидна смола“ с подходящи реагенти за премахване на защитата да се произведе „пълен пептиден продукт върху депротектирана смола“; И

(к) разцепване на пептид от твърда подложка от смола в „завършен продукт от пептидна смола“ или „смола от завършен депротектиран пептиден продукт“ за получаване на пептид, което включва реакция на „завършения пептиден продукт върху смола“ или „завършен пептиден продукт върху смола.” депротектирана смола с амоняк, първичен амин или вторичен амин, докато пептидът бъде значително отстранен от смолата;

при условие, че етапи (e) и (g) в синтеза на пептида се извършват шест пъти след образуването на "деблокирания първи добавен продукт" с формула H-L-Thr-смола, където следващите аминокиселини се добавят в ред: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm ), за да се образува продуктът H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

2. Методът съгласно претенция 1, където амонякът, първичният амин или вторичният амин в етап (k) е в разтворител, съдържащ алкохол и, по избор, апротонен полярен разтворител.

3. Метод съгласно претенция 1, където стъпка (k) допълнително включва следните стъпки:

(i) утаяване на разцепения пептид от разтворителя;

(ii) разделяне чрез филтруване на твърдата подложка от смола и утаения пептид; и

(iii) екстрахиране на пептида с киселинен разтвор за изолиране на пептида.

4. Методът съгласно всяка една от претенции 1 до 3, където първата аминокиселина е цезиева сол на Boc-L-Thr, даваща смола Boc-L-Thr като първи добавен продукт и „деблокираното първо добавяне продукт” е H-L-Thr -смола.

5. Методът съгласно претенция 4, където киселината, използвана за отстраняване на Вос защитната група в етап(и) е трифлуорооцетна киселина (TFA).

6. Методът съгласно претенция 5, където органичният разтворител е метиленхлорид, хлороформ или диметилформамид, а реагентът за увеличаване на пептида е диизопропил-карбодиимид, дициклохексил-карбодиимид или N-етил-N"-(3-диметил-аминопропил )карбодиимид.

7. Методът съгласно претенция 6, включващ добавянето на Boc-D- -Nal към H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)- Thr-смола съгласно етап (i) за получаване на Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr смола.

8. Методът съгласно претенция 7, включващ едновременно отстраняване на групата Вос, блокираща D--Nal, групата O-t-Bu, защитаваща Tyr, и групата Вос, защитаваща Lys в Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола, съгласно етап(и) за получаване на пълен пептиден продукт върху смолата с формула H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

9. Методът съгласно претенция 8, включващ разцепване на пептида H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твърдата смола чрез провеждане на реакцията H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смоли с амоняк в разтворител, съдържащ алкохол и, по избор, апротонен полярен разтворител, до по същество пълно елиминиране, за да се получи H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

10. Метод съгласно претенция 9, където алкохолът е метанол и полярният апротонен разтворител е диметилформамид.

11. Методът съгласно претенция 10, включващ едновременно отстраняване на Acm групи, защитаващи Cys, и циклизиране на получените депротектирани Cys остатъци в "пълен продукт от пептидна смола" с формула H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr -D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 чрез взаимодействие на H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 с разтвор на йод в алкохол до по същество пълно премахване на защитата и циклизиране за получаване на H-D--Nal--Thr-NH2.

Синтезът на пептиди в твърда фаза е предложен от R. B. Merrifield от университета Рокфелер (Нобелова награда 1984). Този метод се основава на сглобяването на пептид върху неразтворима полимерна подложка чрез последователно добавяне на аминокиселинни остатъци със защитени α-амино и странични групи. Планът беше да се сглоби пептидната верига на етапи, като веригата беше прикрепена в единия край към твърда опора по време на синтеза. В резултат на това изолирането и пречистването на междинни продукти и целеви пептидни производни беше просто въпрос на филтриране и щателно измиване на твърдия полимер, за да се отстранят всички излишни реагенти и странични продукти, останали в разтвора.

Терминът твърда фаза по-скоро се отнася до физическите характеристики на веществото върху носителя, тъй като химическата реакция върху полимерния носител протича в една фаза - в разтвор. В подходящ разтворител полимерът набъбва, превръщайки се в гел с нисък вискозитет, но силно структуриран (омрежени полимери) или се разтваря (в случай на неомрежени полимери) и процесът на синтез протича на ултрамикрохетерогенно ниво , в почти хомогенна система.

Твърдофазовият органичен синтез изисква полимерна основа - смола. С, към който е прикрепен линкерът Л. На първия етап към линкера е прикрепена субстратна молекула А.Молекула Аобездвижва се (т.е. престава да бъде подвижен), но запазва способността си да реагира с друг реагент IN(етап 2).

Продукт ABостава върху смолата, позволявайки й да бъде отделена от излишния реагент IN(и странични продукти) чрез обикновено измиване. (Можете да добавяте все повече и повече нови реагенти, като последователно усложнявате оригиналния субстрат А, основното е, че линкерът остава непроменен в тези реакции). Бифункционален линкер Лсе подбира така, че връзката му със смолата Сбеше по-издръжлив, отколкото със субстрата А. След това на последния етап целевото съединение ABможе да се отдели от смолата чрез прекъсване на връзката му към линкера. Ясно е, че връзката Л-ABтрябва да се разцепи при меки условия, без да се повреди самата връзка (свързване А-IN), нито контакт на линкера със смолата (свързване Л-С).

Така, в идеалния случай, чрез измиване на смолата след всяка стъпка и разцепване на връзката с носителя, се получава чисто вещество. Естествено е да се вярва, че използването на голям излишък от реагенти и последващото отделяне от смолата в много случаи прави възможно изместването на химичното равновесие към образуването на целевия продукт и намаляване на времето за синтез. Недостатъците на органичния синтез в твърда фаза включват необходимостта от използване на сравнително голям излишък (2-30 еквивалента) от реагенти, трудности при идентифициране на междинни синтезни продукти, както и относително високата цена на модифицираните полимерни подложки, която се определя от цена на линкера.

Въведен от Merrifield в практиката на органичния синтез, хлорометилираният полистирол (омрежен с малко количество дивинилбензен), така наречената смола Merrifield, е най-достъпният от полимерните носители.

Методика и основни етапи на твърдофазов пептиден синтез

Посочената задача изисква въвеждането на полимерен носител с присадена аминокиселина в реакция с хетероцикъл, активиран за заместване. Нека разгледаме по-подробно методологичния аспект на получаването на имобилизирани аминокиселини върху полимерни носители.

сцена1. Имобилизиране на N-защитена аминокиселина върху полимерен носител.

Първата стъпка от нашата схема е имобилизирането на аминокиселината върху полимерен носител. За да се избегнат странични процеси като образуването на олигопептиди, аминокиселината първо се защитава. Обикновено се използват N-защитени аминокиселини и получената връзка между аминокиселината и носителя е от амиден или естерен тип.

Най-често използваните защити на аминогрупи в твърдофазния органичен синтез са защитни групи от карбаматен тип, tert-бутоксикарбонил (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонил защита (Fmoc), X е защитената група:

Трябва да се отбележи, че изборът на защитна група се определя от вида на използваната полимерна подложка. Условията за имобилизиране на защитени аминокиселини са различни за различните видове полимерни носители. Извършва се имобилизация на Boc-аминокиселини върху смола Merrifield, която е хлорометилиран полистирен на мястопод формата на цезиеви соли чрез добавяне на суспензия от цезиев карбонат в диметилфталат (DMF) и каталитични количества калиев йодид. Излишъкът на реагентите спрямо количеството на носителя се избира индивидуално във всеки случай и възлиза на 1,5-4 еквивалента.

Имобилизирането на Fmoc аминокиселини върху Wang полимерна подложка (X=O) за образуване на естерен линкер от бензилов тип се извършва чрез карбодиимиден метод, като се използва диизопропилкарбодиимид (DIC) в присъствието на 4-(диметиламино)пиридин (DMAP) като катализатор. Реакцията на имобилизация със пространствено незатруднени аминокиселини протича при стайна температура. Имобилизирането на стерично възпрепятствани аминокиселини изисква реакция при 40-60 °C в продължение на 2 дни и многократно имобилизиране (Схема 1). - аминокиселини върху полимерния носител на Rink (X=NH) с образуването на амиден линкер от бензхидрилен тип се извършва в присъствието на реагента на Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси) трис-(диметиламино)фосфониев хексафлуорофосфат (BOP), диизопропилетиламин база (DIEA) и 1-хидроксибензотриазол (HOBt), като катализатор. Реакцията протича при стайна температура в продължение на 2 часа за пространствено незатруднени аминокиселини и 4-6 часа за пространствено затруднени аминокиселини.

Етап 2.Депротекция на защитена аминокиселина върху полимерен носител

На втория етап, който планираме (след обездвижване на защитената аминокиселина), е необходимо да се премахне защитната група, за да се активира аминогрупата. Методите за премахване на Boc и Fmoc защитата са различни. Отстраняването на Вос защитата на аминокиселините върху смолата Merrifield се извършва с 50% трифлуорооцетна киселина в дихлорометан за половин час, при тези условия линкерът Merrifield остава непокътнат.

След премахване на защитата, смолата се промива с разтвор на триетиламин за отстраняване на трифлуороцетната киселина. Отстраняването на Fmoc защитата на аминокиселините върху Wang (X=O) и Rink (X=NH) носители се извършва с 20% разтвор на пиперидин в DMF за 40-50 минути.

Значително намаляване на масата на смолата след отстраняване на Fmoc защитата може да послужи като основа за гравиметрично определяне на степента на имобилизация на защитените аминокиселини в първия етап на твърдофазния синтез. Препоръчва се смолата да се третира последователно с разтвор на пиперидин в диметилфталат - първо за 5-10 минути, след това за 30 минути в пресен разтвор. След отстраняване на защитата, смолата се измива поне 4 пъти с диметилфталат, за да се отстранят продуктите от разрушаването на Fmoc защитата. Проследяването на хода на реакцията на ацилиране върху носителя или премахването на защитната функция от аминогрупата е възможно с помощта на теста на Кайзер.

Етап 3.Нуклеофилно заместване в хетероцикли, включващо аминокиселина, имобилизирана върху носител

Следващата стъпка, която сме планирали за практическо прилагане, е да проведем реакцията на ароматно нуклеофилно заместване; Присадената аминокиселина служи като нуклеофил, а активираният хетероцикъл е в разтвор. Повечето реакции на нуклеофилно заместване в носители не се различават по изпълнение от реакциите в течната фаза. Все пак трябва да се има предвид, че температурата на процеса не трябва да надвишава 120 °C, над която полистироловата основа на носителя започва да се разрушава. При условията на реакцията, проведена върху подложката, линкерът също трябва да бъде запазен.

Когато се избират подходящи активирани хетероциклични субстрати, трябва да се вземе предвид природата на напускащата група в хетероцикъла.

Етап 4.Отстраняване на целевото съединение от полимерни носители

Повечето линкери в твърдофазния органичен синтез се разцепват в кисела среда. Киселинната устойчивост на линкерите намалява рязко при преминаване от смола Merrifield към смола Wang и Rink. Линкерът Rink се разцепва при по-меки условия (10-20% CF3COOH), отколкото линкерът Wang (50% CF3COOH). Смолата Merrifield е пасивна при тези условия и за нейното разцепване се използва трансестерификация в разтвор на NaOMe/MeOH, което води до образуването на киселинен естер.

Нека си припомним още веднъж, че природата на линкера определя вида на крайната функция в получената молекула, отстранена от субстрата. Смолата на Уанг произвежда киселини, а смолата на Ринк произвежда амиди.

Предимства на тази схема на твърдофазен пептиден синтез:

1. Различни изходни съединения могат да бъдат свързани към отделни гранули. Тези перли след това се смесват, така че всички изходни съединения да могат да реагират с реагента в един експеримент. В резултат на това се образуват реакционни продукти върху отделни гранули. В повечето случаи смесването на изходните материали в традиционната течна химия обикновено води до неуспехи - полимеризация или смолизиране на продуктите. Експериментите върху твърди субстрати изключват тези ефекти.

2. Тъй като изходните материали и продукти са свързани с твърдата подложка, излишните реагенти и несвързаните с подложката продукти могат лесно да бъдат измити от полимерната твърда подложка.

3. Могат да се използват големи излишъци от реагенти за завършване на реакцията (повече от 99%), тъй като тези излишъци лесно се отделят.

4. Чрез използване на ниски обеми на зареждане (по-малко от 0,8 mmol на грам субстрат), нежеланите странични реакции могат да бъдат елиминирани.

5. Междинните продукти в реакционната смес са свързани с гранулите и не е необходимо да се пречистват.

6. Индивидуалните полимерни гранули могат да бъдат разделени в края на експеримента и по този начин да се получат индивидуални продукти.

7. Полимерният субстрат може да бъде регенериран в случаите, когато са избрани условията на разрушаване и са избрани подходящите анкерни групи - линкери.

8. Възможна е автоматизация на твърдофазния синтез.

Необходимите условия за провеждане на синтез в твърда фаза, в допълнение към наличието на неразтворим полимерен носител, който е инертен при условията на реакция, са:

Наличието на анкер или линкер е химическа функция, която осигурява връзката на субстрата с нанесеното съединение. Той трябва да бъде ковалентно свързан със смолата. Котвата също трябва да бъде реактивна функционална група, за да могат субстратите да взаимодействат с нея.

Връзката, образувана между субстрата и линкера, трябва да бъде стабилна при условията на реакцията.

Трябва да има начини за прекъсване на връзката на продукта или междинния продукт към линкера.