24.11.202227.05.2017

] обаче дефинирането на антиоксидантите като химични съединения не дава пълна картина на защитните свойства на обекта, който се изследва: те се определят не само от количеството на конкретен антиоксидант, но и от активността на всеки от тях. Антиоксидантната активност или антиоксидантната активност, AOA, е константата на скоростта на реакцията на антиоксидант със свободен радикал (kInH). Методът на хемилуминесценцията (CL) ви позволява да определите общото количество радикали, които свързват антиоксиданти в проба (общ антиоксидантен капацитет, TAU), а когато използвате метода за математическо моделиране на кинетиката на CL, също скоростта на образуване и реакция на радикалите с антиоксиданти, тоест AOA [, ,].

Най-честата модификация на хемилуминесцентния метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет се основава на използването на луминол като хемилуминесцентен активатор [, , ,]. Проба се поставя в хемилуминометърна кювета с добавяне на луминол, водороден пероксид и съединение, способно да образува радикали в резултат на спонтанно разлагане (термолиза), например 2,2'-азобис-(2-амидинопропан) дихидрохлорид (ABAP). ): ABAP → 2R. В присъствието на молекулярен кислород алкиловият радикал R образува пероксилния радикал ROO: R + O 2 → ROO. След това пероксилният радикал окислява хемилуминесцентната сонда луминол (LH 2) и се образува луминолният радикал (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. От LH, чрез образуването на междинни вещества (луминол хидропероксид и луминол ендопероксид), се образува молекула на крайния продукт от окислението на луминол, аминофталова киселина, в електронно възбудено състояние, която излъчва фотон и в резултат на това се наблюдава хемилуминесценция . Интензитетът на CL е пропорционален на скоростта на производство на фотони, а тя от своя страна е пропорционална на стационарната концентрация на LH в системата. Взаимодействайки с радикалите, антиоксидантите прекъсват описаната верига от трансформации и предотвратяват образуването на фотон.

Съединенията, податливи на термолиза, не са единственият възможен източник на радикали при анализиране на антиоксидантния капацитет на проба с помощта на хемилуминесцентния метод. Алтернативи са системите пероксидаза от хрян–водороден прекис [, ], хемин–водороден прекис, цитохром с–кардиолипин–водороден пероксид и др. Реакционната схема за окисление на луминол от пероксидази е разгледана в работата на Cormier et al. .

Кинетичните криви на CL за тези системи отразяват два етапа на реакцията: етап на увеличаване на интензитета на CL и етап на плато или постепенно намаляване на луминесценцията, когато интензитетът на CL е или постоянен, или бавно намалява. Работата описва два подхода за измерване на общия антиоксидантен капацитет, които вземат предвид тази характеристика на кривите. Методът TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) се основава на измерване на латентния период на CL τ и може да се използва за определяне на антиоксиданти като Trolox или аскорбинова киселина: те се характеризират с висока константа на скоростта на реакция с радикали и поради тази причина могат да бъдат наречени силни антиоксиданти. През латентния период настъпва пълното им окисление. Методът TAR (обща антиоксидантна реактивност) измерва степента на потушаване на хемилуминесценцията рв платото или максимума на хемилуминесцентната крива: формула, където I е интензитетът на хемилуминесценцията без антиоксидант, а I 1 е интензитетът на CL в присъствието на антиоксидант. Този метод се използва, ако системата съдържа предимно слаби антиоксиданти с ниски константи на скоростта на взаимодействие с радикалите - много по-ниски в сравнение с константата на луминола.

Действието на антиоксидантите се характеризира не само с показатели τ И р. Както може да се види от произведенията [,], ефектът на антиоксиданти като пикочна киселина в системата хемин-H 2 O 2 -луминол или токоферол, рутин и кверцетин в системата на цитохрома с–кардиолипин–H 2 O 2 –луминол, характеризиращ се с промяна в максималната скорост на нарастване на CL ( vmax). Както показват резултатите от математическото моделиране на кинетиката, стойностите на константите на скоростта на взаимодействие на тези антиоксиданти с радикалите са близки до стойността на луминолната константа, поради което такива антиоксиданти могат да се нарекат антиоксиданти със средна сила.

Ако изследваният материал, по-специално растителните суровини, съдържаше само един вид антиоксиданти, тогава тяхното съдържание може да се характеризира с един от трите показателя, изброени по-горе ( τ , рили vmax). Но растителните материали съдържат смес от антиоксиданти с различна сила. За да решат този проблем, някои автори [ , , , ] използват промяната в светлинната сума на хемилуминесценцията за определено време ∆S, изчислена по формулата , където ∆ S 0и ∆ S S- CL светлинни суми за дадено време Tсъответно в контролните и опитните проби. Времето трябва да е достатъчно за окисляването на всички антиоксиданти в системата, т.е. CL кривата на тестовата проба да достигне нивото на CL кривата на контролната проба. Последното предполага, че изследователите трябва не само да записват светлинната сума на сиянието, но и да записват кривата на кинетиката на CL за достатъчно дълго време, което не винаги се прави.

Тъй като всички измерени показатели зависят от устройството и условията на измерване, антиоксидантният ефект на веществото в изследваната система обикновено се сравнява с ефекта на антиоксидант, взет като стандарт, например Trolox [,].

Системата пероксидаза от хрян – водороден пероксид е използвана за анализиране на общия антиоксидантен капацитет на растителните материали от много автори. В работите [ , ] латентният период на CL (TRAP метод) е използван за оценка на количеството антиоксиданти в пробите, а в работите [ , , ] - площта под кривата на развитие на CL. Изброените трудове обаче не дават ясна обосновка за избора на един или друг параметър за оценка на OAU.

Целта на изследването беше да се определи как съотношението на различните видове антиоксиданти влияе на TOA и да се модифицира хемилуминесцентният метод по такъв начин, че да може по-точно да се определи TOA в растителни материали. За целта си поставихме няколко задачи. Първо, сравнете кинетиката на CL на изследваните обекти с кинетиката на стандартни антиоксиданти от три вида (силен, среден и слаб), за да разберете кой тип антиоксиданти имат основен принос към OAU на изследваните обекти. Второ, изчислете OAE на изследваните обекти чрез измерване на намаляването на светлинната сума на CL под въздействието на тези обекти в сравнение с ефекта на антиоксиданта, който осигурява най-голям принос към OAE.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Обект на изследването бяха промишлени проби от глог, офика и шипка, произведени от JSC Krasnogorskleksredstva (Русия), както и малинови плодове, събрани от авторите в Московска област при естествени условия на растеж и изсушени при температура 60–80 ° C докато спрат да отделят сок и да се деформират при натиск.

Реагентите за анализиране на антиоксидантния капацитет по хемилуминесцентния метод са: KH 2 PO 4, 20 mM буферен разтвор (рН 7,4); пероксидаза от корени на хрян (активност 112 единици/mg, М = 44 173,9), 1 mM воден разтвор; луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, М = 177.11), 1 mM воден разтвор; водороден пероксид (Н202, М = 34.01), 1 mM воден разтвор; разтвори на антиоксиданти (аскорбинова киселина, кверцетин, токоферол). Всички реагенти са произведени от Sigma Aldrich (САЩ).

Отвари от плодове на глог, офика и шипка и инфузия от плодове на малина са приготвени по методите на Държавната фармакопея на СССР, изложени в общата фармакопейна статия „Настойки и отвари“.

Определянето на общия антиоксидантен капацитет се извършва чрез записване на хемилуминесценция на хемилуминометър Lum-100 (DISoft, Русия) с помощта на софтуер PowerGraph 3.3. За определяне на OAE в растителни материали се използват 40 μl луминол в концентрация 1 mM, 40 μl пероксидаза от хрян в концентрация 0,1 μM, от 10 до 50 μl отвара или инфузия (в зависимост от концентрацията) и фосфатен буфер в необходимото количество се поставят в кюветата на устройството, за да се доведе общият обем на пробата до 1 ml. Кюветата беше инсталирана в устройството и CL беше записан, като се наблюдава фоновият сигнал. След 48 s запис на фоновия сигнал, към кюветата се добавят 100 μl H2O2 в концентрация 1 mM и CL записът продължава 10 минути. Приготвени са четири проби с различни концентрации на всеки растителен обект. CL също беше записан за разтвори на аскорбинова киселина, кверцетин и токоферол при пет различни концентрации за всеки антиоксидант. Впоследствие OAU на пробите от отвари и запарки се преизчислява към кверцетин.

Концентрациите на луминол, пероксидаза от хрян и водороден пероксид са избрани така, че да се определи антиоксидантният капацитет на водни екстракти от лечебни растителни материали за приемливо време (не повече от 10 минути). През това време кривите на хемилуминесценцията на антиоксидантите аскорбат и флавоноида кверцетин (основните антиоксиданти на растителните материали) достигат плато, което показва пълното унищожаване на антиоксидантите в системата. Разрежданията на изследваните проби и концентрациите на разтвори на стандартни антиоксиданти (посочени в надписите към фигурите) са подбрани по такъв начин, че всички CL кинетични криви да бъдат измерени при една и съща чувствителност на уреда.

Антиоксидантният капацитет се изчислява от промяната в площта (∆ С) под кинетичната крива на хемилуминесценция (светлинна сума) при добавяне на вещество, съдържащо антиоксидант. За целта изчислихме S 0за система без антиоксидант и извади площта от нея S S, характеризираща системата, към която е добавен антиоксидантът. Стойност ∆ Сзависи от чувствителността на хемилуминометъра и условията на измерване. Съотношение ∆ S/C V(Където ° С- концентрация на изследвания биологичен материал в кюветата, g/l, и V- обем на кюветата, l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от изследвания материал, т.е. растителни суровини.

Антиоксидантният капацитет ∆ се изчислява по подобен начин S Aразтвор на стандартен антиоксидант, например кверцетин, поставен в същия обем на реакционната смес. Съотношение ∆ S A / C A V(Където C A- тегловна концентрация на антиоксиданта в кюветата, g/l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g антиоксидант.

За всеки от стандартните антиоксиданти беше записан сигналът от разтвори с няколко концентрации, за да се гарантира, че изчисленията са в линейна връзка и получените резултати са възпроизводими. Наистина се получава линейна зависимост (∆ S A = k A C A) сигнал от концентрацията, от която е изчислен стехиометричният коефициент к А. Съгласно критерия на Фишер, получените стойности за стандартни антиоксиданти к Астатистически значими с вероятност 0,975. След това сигналът от четири концентрации беше записан за всяка от четирите растителни проби и за всички проби беше получена линейна зависимост на сигнала от концентрацията (∆ С = k·C), от който е изчислен стехиометричният коефициент к. С вероятност от 0,975 (тест на Фишер), стойностите k, получени за растителни проби, са статистически значими. Общият антиоксидантен капацитет на растителния материал по отношение на масата на стандартния антиоксидант (mg%) се намира с помощта на формулата.

Стойностите бяха представени като средно аритметично ± стандартно отклонение (M ± δ) при p

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Изследване на кинетиката на хемилуминесценцията в присъствието на натриев аскорбат (фиг. 1. Ефект на натриев аскорбат върху кинетиката на хемилуминесценцията" data-note="Концентрации на системните компоненти: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден прекис - 100 µM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0.05 µM; 3 - 0.10 µM; 4 - 0.15 µM; 5 - 0.2 µM; 6 - 0.25 µM натриев аскорбат.">Фиг. 1) показва, че за този антиоксидант е характеризиращ се с латентен период, когато CL е почти напълно потиснат.Продължителността му е пропорционална на количеството антиоксидант в системата.В същото време нито наклонът на CL кривите, нито интензитетът на CL на платото се променят.Това се обяснява поради факта, че аскорбиновата киселина е силен антиоксидант, който прихваща всички радикали, образувани в системата, включително луминолови радикали, и CL не се развива, докато целият аскорбат не се окисли.

Други изследователи също показаха, че резултатите от химичния анализ и стойността на TAU, определена чрез хемилуминесцентния метод, често не съвпадат. В работата общият антиоксидантен капацитет, определен в системата пероксидаза-луминол-водороден пероксид, корелира със съдържанието на тритерпенови съединения. Въпреки това, в работата на същите автори, в която обект на изследване е друго растение, те не наблюдават корелация на OAE със съдържанието на която и да е група вещества, включително флавоноиди.

Такива несъответствия са свързани с поне три фактора. На първо място, важна е активността на антиоксидантите, т.е. скоростта на тяхното взаимодействие с радикалите, която е различна за различните антиоксиданти, включени в растителната проба. Според Измайлов константите на скоростта на съответните реакции за мексидол, токоферол и кверцетин корелират като 0,04:2:60. Второ, всяка антиоксидантна молекула, влизайки в химическа реакция, може да прихване различен брой радикали. Според работата, кверцетинът, пикочната и аскорбиновата киселина прихващат съответно 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикала на реагирала антиоксидантна молекула (използвана е системата хемин-Н 2 О 2 -луминол). Трето, резултатите от изследването могат да бъдат повлияни от наличието на пероксидазна активност в самите растителни проби, както в работата, както и от наличието на калций в пробите, което, както е показано в работата, е в състояние да увеличи активността на пероксидазата от хрян при определени условия. Това обикновено причинява по-висок интензитет на CL на платото, отколкото на контролните криви, което ние обаче не наблюдавахме.

Първият фактор рязко ограничава използването на такъв параметър като промяна в светлинната сума, тъй като времето за измерване на хемилуминесценцията трябва да бъде по-дълго от времето за консумация на всички антиоксиданти в тестовата проба. Настъпването на този момент може да се прецени само чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. В допълнение, приносът на слабите антиоксиданти към TAU е рязко подценен, тъй като времето за пълното им окисление е многократно по-дълго от допустимата продължителност на измерване (10–20 минути).

Стехиометричният коефициент на антиоксиданта е още по-важен. Броят на радикалите нприхванато от него е равно на , където ρ е стехиометричният коефициент, а ∆ м- промяна в концентрацията на антиоксиданта по време на измерването, в нашия случай - първоначалната концентрация на тестваното вещество в пробата.

Разликата в светлинната сума на луминесценция в отсъствието на антиоксидант и в негово присъствие е пропорционална н. Общият брой на прихванатите радикали е , където ρ iе стехиометричният коефициент на специфичен антиоксидант, и m i- концентрацията му по време на измерване. Общият брой на прихванатите радикали очевидно не е равен на общото количество антиоксиданти, тъй като коефициентите ρ iне само не са равни на единица, но и се различават значително за различните антиоксиданти.

величина не пропорционална на разликата в светлинните суми, измерени за определено време между проба, съдържаща антиоксидант, и контролна проба, несъдържаща антиоксиданти: С = k n, Където к- коефициент, постоянен при едни и същи условия на измерване.

Методът, разгледан в статията, ни позволява да определим общия антиоксидантен капацитет, докато химичният анализ ни позволява да определим общото съдържание на антиоксиданти в продукта. Следователно хемилуминесцентният метод изглежда по-информативен от химичните анализи.

Условията, които избрахме за оценка на общия антиоксидантен капацитет на растителните суровини чрез записване на кинетиката на хемилуминесценцията в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол (концентрации на компонентите - съответно 4 nM, 100 µM и 40 µM; 20 mM фосфат буфер, рН 7,4), осигурява окисляването на силни антиоксиданти (аскорбинова киселина) и средно силни антиоксиданти (кверцетин) за 10 минути. Тази продължителност на измерване е удобна и осигурява необходимото качество на измерване.

Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти (отвари от плодове на офика, шипка, глог и инфузия на малинови плодове) основните антиоксиданти са антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди, и слаба сила (токоферол и др.). Въз основа на намаляването на хемилуминесцентната светлинна сума е изчислен общият антиоксидантен капацитет за изследваните обекти. Сравнението на получените стойности на TAU с резултатите от химичния анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения, могат да се различават по способността си ефективно да защитават тялото от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, които съдържат смес от различни антиоксиданти. В същото време се характеризира с простота и ниска цена на изследването. Комбинацията от измерване на кинетиката на хемилуминесценцията с математическо моделиране на реакциите не само ще автоматизира процеса на определяне на TAU, но и ще определи приноса на отделните групи антиоксиданти към индикатора.

Ключови думи

свободен радикал/антиоксидант/ антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция/ луминол / свободен радикал / антиоксидант / антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция / луминол

анотация научна статия по химически науки, автор на научната работа - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

Лечебните растителни суровини са един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Сред методите за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентния анализ. В тази работа беше използвано за оценка общ антиоксидантен капацитет(OAE) отвари от плодове на офика, шипка и глог и инфузия от плодове на малина. Кинетиката беше записана в експеримента хемилуминесценцияв система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемът на компонентите на системата в пробата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерените антиоксиданти (кверцетин) бяха напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен е и е обоснован метод за изчисляване на OAE, базиран на промени в светлинната сума хемилуминесценцияпри наличие на растителни проби. Кинетичен анализ хемилуминесценцияпоказа, че изследваните обекти са доминирани от антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди, и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на OAE за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по вид, могат да се различават по способността си да защитават организма от вредното въздействие на свободните радикали. . Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Свързани теми научни трудове по химически науки, автор на научната работа - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

2016 / Георгий Владимиров, Сергунова Е.В., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А.
Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с използване на 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан)
2012 / Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Антиоксидантен ефект на дихидрокверцетин и рутин при пероксидазни реакции, катализирани от цитохром с
2008 / Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Оценка на окислителния и антиоксидантния капацитет на биологичните субстрати чрез хемилуминесценция, индуцирана от реакцията на Fenton
2016 / Пискарев Игор Михайлович, И.П. Иванова
Определяне на съдържанието на липохидропероксиди в серумните липопротеини с помощта на системата микропероксидаза-луминол
2011 / Теселкин Юрий Олегович, Бабенкова Ирина Владимировна
Антиоксидантни изследователски методи
2004 / Хасанов В.В., Рижова Г.Л., Малцева Е.В.
Антиоксидантна активност на растения, използвани в етномедицината на Тува
2012 / Чехани Н.Р., Теселкин Ю.О., Павлова Л.А., Козин С.В., Любицки О.Б.
Изследване на антиоксидантните свойства на Фоспренил в различни биологични тестови системи
2017 / А. В. Санин, А. Н. Наровлянски, А. В. Пронин, Т. Н. Кожевникова, В. Ю. Санина, А. Д. Агафонова
Влиянието на различни дози полихлорирани бифенили върху състоянието на спонтанна и имуноглобулин-индуцирана луминол-зависима хемилуминесценция на цяла кръв
2016 / Габдулхакова И.Р., Каюмова А.Ф., Самоходова О.В.
Оценка на системата на липидната пероксидация на антиоксидантната защита при деца с есенциална артериална хипертония чрез спектрофотометрични и хемилуминесцентни методи
2014 / Натяганова Лариса Викторовна, Гаврилова Оксана Александровна, Колесникова Лариса Романовна

Хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствен растителен материал

Лечебната растителна суровина е един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Хемилуминесцентният анализ е един от често срещаните методи за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни материали. В нашата работа хемилуминесцентният анализ беше използван за определяне на общия антиоксидантен капацитет (TAC) на плодови отвари от планинска пепел, роза и глог, както и инфузия на малинови плодове. Експериментите установяват кинетиката на хемилуминесценцията на система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемите на компонентите на системата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и антиоксидантите със средна сила (кверцетин) бяха напълно окислени по време на измерването (10 минути). Предложен и обоснован е метод за изчисляване на TAC, базиран на промените в хемилуминесцентната светлинна сума в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти преобладават антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди и слаби антиоксиданти (токоферол и други). Сравнението на изчислените стойности на TAC за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показаха, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различно съотношение на антиоксиданти по видове, могат да варират в способността си да защитават тялото срещу вредното въздействие на свободните радикали. . Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Текст на научна работа на тема “Хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебни растителни суровини”

хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебни растителни материали

Г. К. Владимиров1^, Е. В. Сергунова2, Д. Ю. Измайлов1, Ю. А. Владимиров1

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет "М. В. Ломоносов", Москва

2 Катедра по фармакогнозия, Факултет по фармация,

Първи Московски държавен медицински университет на името на I.M. Сеченов, Москва

Лечебните растителни суровини са един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Сред методите за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентния анализ. В тази работа той беше използван за оценка на общия антиоксидантен капацитет (TAC) на отвари от плодове на офика, шипка и глог и инфузия на плодове от малина. В експеримента кинетиката на хемилуминесценцията е записана в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемът на компонентите на системата в пробата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерените антиоксиданти (кверцетин) бяха напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен и обоснован е метод за изчисляване на OAE, базиран на промените в светлинната сума на хемилуминесценцията в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти преобладават антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на OAE за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по вид, могат да се различават по способността си да защитават организма от вредното въздействие на свободните радикали. . Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Ключови думи: свободен радикал, антиоксидант, антиоксидантна активност, общ антиоксидантен капацитет, хемилуминесценция, луминол

Финансиране: работата е подкрепена от Руската научна фондация, грант № 14-15-00375.

Ex3 За кореспонденция: Георгий Константинович Владимиров

119192, Москва, Ломоносовски пр-т, 31, сграда 5; [имейл защитен]

Статията е получена: 10.03.2016 г. Статията е приета за публикуване: 18.03.2016 г.

хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствен растителен материал

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия

2 Катедра по фармакогнозия, Факултет по фармация,

Първият Московски държавен медицински университет "Сеченов", Москва, Русия

Финансиране: тази работа беше подкрепена от Руската научна фондация, грант №. 14-15-00375.

Благодарности: авторите благодарят на Андрей Алексеев от Московския държавен университет „Ломоносов“ за съдействието му при провеждането на експеримента. Адрес за кореспонденция: Георгий Владимиров

Ломоносовски проспект, д. 31, к. 5, Москва, Русия, 119192; ур [имейл защитен]Получено: 10.03.2016 г. Прието: 18.03.2016 г.

Свободните радикали, образувани в организма, нарушават структурата на клетъчните мембрани, което от своя страна води до развитието на различни патологични състояния. Разрушителните окислителни ефекти на радикалите се предотвратяват от антиоксидантната защитна система на организма, в която важна роля играят съединенията с ниско молекулно тегло - прехващачи на радикали (капани). Един от източниците на антиоксиданти са лечебните растителни суровини, както и лекарствата на тяхна основа, изследването на антиоксидантния потенциал на които спомага за повишаване на техния превантивен и терапевтичен ефект.

Основните методи за определяне на антиоксиданти се обсъждат в произведенията, но определението на антиоксидантите като химични съединения не дава пълна картина на защитните свойства на обекта, който се изследва: те се определят не само от количеството на конкретен антиоксидант, но и но и от дейността на всеки от тях. Антиоксидантната активност или антиоксидантната активност, AOA, е константата на скоростта на реакцията на антиоксидант със свободен радикал (kInH). Методът на хемилуминесценцията (CL) дава възможност да се определи общото количество радикали, които свързват антиоксидантите в пробата (общ антиоксидантен капацитет, TCA), а когато се използва методът на математическото моделиране на кинетиката на CL, също и скоростта на образуване и реакция на радикали с антиоксиданти, тоест AOA.

Най-честата модификация на хемилуминесцентния метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет се основава на използването на луминол като хемилуминесцентен активатор. Проба с добавка на луминол, водороден пероксид и съединение, способно да образува радикали в резултат на спонтанно разлагане (термолиза), например 2,2"-азобис-(2-амидинопропан) дихидрохлорид (ABAP):

В присъствието на молекулярен кислород алкиловият радикал R^ образува пероксилния радикал ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv От LH, чрез образуването на междинни вещества (луминол хидропероксид и луминол ендопероксид), се образува молекула на крайния продукт на окисление на луминол, аминофталова киселина, в електронно възбудено състояние, което излъчва фотон , като в резултат се наблюдава хемилуминесценция . Интензитетът на CL е пропорционален на скоростта на производство на фотони, а тя от своя страна е пропорционална на стационарната концентрация на LH в системата. Взаимодействайки с радикалите, антиоксидантите прекъсват описаната верига от трансформации и предотвратяват образуването на фотон.

Съединенията, податливи на термолиза, не са единственият възможен източник на радикали при анализиране на антиоксидантния капацитет на проба с помощта на хемилуминесцентния метод. Алтернативи са пероксидаза от хрян-водороден пероксид, хемин-водороден пероксид, цитохром с-кардиолипин-водороден пероксид и т.н. Реакционната схема за окисление на луминол от пероксидази се обсъжда в работата на Cormier et al. .

Интензитетът на CL е или постоянен, или бавно намалява. Работата описва два подхода за измерване на общия антиоксидантен капацитет, които вземат предвид тази характеристика на кривите. Методът TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) се основава на измерване на латентния период на CL t и може да се използва за определяне на антиоксиданти като Trolox или аскорбинова киселина: те се характеризират с висока константа на скоростта на реакция с радикали и поради тази причина могат да бъдат наречени силни антиоксиданти. През латентния период настъпва пълното им окисление. Методът TAR (обща антиоксидантна реактивност) се използва за измерване на степента на потушаване на хемилуминесценцията q на платото или максимума на хемилуминесцентната крива:

където I е интензитетът на хемилуминесценция без антиоксидант, а 11 е интензитетът на CL в присъствието на антиоксидант. Този метод се използва, ако системата съдържа предимно слаби антиоксиданти с ниски константи на скоростта на взаимодействие с радикалите - много по-ниски в сравнение с константата на луминола.

Действието на антиоксидантите се характеризира не само с показателите t и c. Както може да се види от произведенията, ефектът на антиоксиданти като пикочна киселина в системата хемин-H2O2-луминол или токоферол, рутин и кверцетин в системата на цитохром c-кардиолипин-H2O2-луминол се характеризира с промяна в максималната скорост на увеличение на CL (utx). Както показват резултатите от математическото моделиране на кинетиката, стойностите на константите на скоростта на взаимодействие на тези антиоксиданти с радикалите са близки до стойността на луминолната константа, поради което такива антиоксиданти могат да се нарекат антиоксиданти със средна сила.

DE = DE0 - DE,

където DE0 и DE5 са светлинните суми на CL за дадено време? съответно в контролните и опитните проби. Времето трябва да е достатъчно за окисляването на всички антиоксиданти в системата, т.е. CL кривата на тестовата проба да достигне нивото на CL кривата на контролната проба. Последното предполага, че изследователите трябва не само да записват светлинната сума на сиянието, но и да записват кривата на кинетиката на CL за достатъчно дълго време, което не винаги се прави.

Тъй като всички измерени параметри зависят от устройството и условията на измерване, антиоксидантният ефект на веществото в изследваната система обикновено се сравнява с ефекта на стандартен антиоксидант, например Trolox.

Системата хрян пероксидаза-водороден пероксид е използвана за анализиране на общия антиоксидантен капацитет на растителни материали от много автори. За да се оцени количеството антиоксиданти в пробите, е използван латентният период на CL (метод TRAP) и в работата е използвана площта под кривата на развитие на CL. Изброените трудове обаче не дават ясна обосновка

изборът на един или друг параметър за оценка на OAU.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Обект на изследването бяха промишлени проби от глог, офика и шипка, произведени от JSC Krasnogorskleksredstva (Русия), както и малинови плодове, събрани от авторите в района на Москва при естествени условия на растеж и изсушени при температура 60-80 ° C докато спрат да отделят сок и да се деформират при натиск.

Реагентите за анализ на антиоксидантния капацитет по хемилуминесцентния метод са: KH2PO4, 20 mM буферен разтвор (pH 7.4); пероксидаза от корени на хрян (активност 112 единици/mg, М = 44 173,9), 1 mM воден разтвор; луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, М = 177.11), 1 mM воден разтвор; водороден пероксид (H2O2, М = 34.01), 1 mM воден разтвор; разтвори на антиоксиданти (аскорбинова киселина, кверцетин, токоферол). Всички реагенти са произведени от Sigma Aldrich (САЩ).

Определянето на общия антиоксидантен капацитет се извършва чрез записване на хемилуминесценция на хемилуминометър Lum-100 (DISoft, Русия) с помощта на софтуер PowerGraph 3.3. За определяне на OAE в растителни материали се използват 40 μl луминол в концентрация 1 mM, 40 μl пероксидаза от хрян в концентрация 0,1 μM, от 10 до 50 μl отвара или инфузия (в зависимост от концентрацията) и фосфатен буфер в необходимото количество се поставят в кюветата на устройството, за да се доведе общият обем на пробата до 1 ml. Кюветата беше инсталирана в устройството и CL беше записан, като се наблюдава фоновият сигнал. След 48 s запис на фоновия сигнал, към кюветата се добавят 100 μl H2O2 в концентрация 1 mM и CL записът продължава 10 минути. Приготвени са четири проби с различни концентрации на всеки растителен обект. CL също беше записан за разтвори на аскорбинова киселина, кверцетин и токоферол при пет различни концентрации за всеки от антиоксидантите. Впоследствие OAU на пробите от отвари и запарки се преизчислява към кверцетин.

достигна плато, което показва пълното унищожаване на антиоксидантите в системата. Разрежданията на изследваните проби и концентрациите на разтвори на стандартни антиоксиданти (посочени в надписите към фигурите) са избрани по такъв начин, че всички CL кинетични криви да бъдат измерени при една и съща чувствителност на устройството.

Антиоксидантният капацитет се изчислява от промяната в площта (AS) под кинетичната крива на хемилуминесценция (светлинна сума) при добавяне на вещество, съдържащо антиоксидант. За да направим това, изчислихме S0 за система без антиоксидант и извадихме от него площта SS, която характеризира системата, към която е добавен антиоксидантът. Стойността на AS зависи от чувствителността на хемилуминометъра и условията на измерване. Съотношението AS/C ■ V (където C е концентрацията на изследвания биологичен материал в кюветата, g/l, а V е обемът на кюветата, l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от изследвания материал, растителни суровини.

По подобен начин изчислихме антиоксидантния капацитет ASa на разтвор на стандартен антиоксидант, например кверцетин, поставен в същия обем на реакционната смес. Съотношението AS/CÄ ■ V (където CA е тегловната концентрация на антиоксиданта в кюветата, g/l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g антиоксидант.

За всеки от стандартните антиоксиданти беше записан сигналът от разтвори с няколко концентрации, за да се гарантира, че изчисленията са в линейна връзка и получените резултати са възпроизводими. Наистина се получава линейна зависимост (ASa = kA ■ CA) на сигнала от концентрацията, от която се изчислява стехиометричният коефициент kA. Съгласно критерия на Fisher стойностите на kA, получени за стандартни антиоксиданти, са статистически значими с вероятност от 0,975. След това сигналът от четири концентрации беше записан за всяка от четирите растителни проби и за всички проби беше получена линейна зависимост на сигнала от концентрацията (AS = k ■ C), от която беше изчислен стехиометричният коефициент k. С вероятност от 0,975 (тест на Фишер), стойностите k, получени за растителни проби, са статистически значими. Общият антиоксидантен капацитет на растителния материал по отношение на масата на стандартния антиоксидант (mg%) се намира с помощта на формулата

OAE = k ■ 105. k

Стойностите бяха представени като средно аритметично ± стандартно отклонение (M ± 5) при p<0,05.

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Изследване на кинетиката на хемилуминесценцията в присъствието на натриев аскорбат (фиг. 1) показа, че този антиоксидант се характеризира с латентен период, когато CL е почти напълно потиснат. Продължителността му е пропорционална на количеството антиоксидант в системата. В този случай нито наклонът на кривите на CL, нито интензитетът на CL върху платото се променят. Това се обяснява с факта, че аскорбиновата киселина е силен антиоксидант, който прихваща всички радикали, образувани в системата, включително луминоловите радикали, и CL не се развива, докато целият аскорбат не се окисли.

Ефектът на токоферола (фиг. 2) се проявява чрез намаляване на интензитета на CL на платото, което е типично за слабите антиоксиданти, въпреки че токоферолът се счита за един от най-активните.

мощни антиоксиданти. Може би това несъответствие се дължи на факта, че в нашия експеримент свободните радикали са били във воден разтвор, докато ефектът на токоферола обикновено се изследва в неполярна среда. В проучване, където източникът на радикали е комплекс от цитохром с с кардиолипин и реакцията с луминол се извършва в този комплекс, токоферолът има свойствата на антиоксидант със средна сила.

След изследване на ефекта на различни концентрации на кверцетин върху нашата система (фиг. 3) и сравняване на кинетичните криви за него и натриев аскорбат и токоферол, може да се отбележи, че основният ефект на кверцетин се проявява в промяна на наклона на скоростта на развитие на CL, което е типично за антиоксидантите със средна сила.

Кривите на CL за всички изследвани отвари (Фиг. 4) наподобяват кривите за кверцетин с леко намаляване на интензитета на CL в края, т.е.

Време, мин

Ориз. 1. Ефект на натриевия аскорбат върху кинетиката на хемилуминесценцията

Концентрации на системните компоненти: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 µM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0.05 цМ; 3 - 0.10 цМ; 4 - 0.15 цМ; 5 - 0.2 цМ; 6 - 0,25 µM натриев аскорбат.

плато. Както е показано в работата, това поведение е типично за антиоксиданти със средна сила, които в нашия случай включват полифеноли - флавоноиди и танини. За инфузия на малинови плодове (фиг. 4, D) има забележимо намаляване на хемилуминесценцията на ниво плато, което е типично за слаби антиоксиданти, като токоферол в този случай. По отношение на кверцетин и токоферол малиновата инфузия съдържа 4,7 ± 0,9 µmol/g кверцетин и 11,9 ± 0,8 µmol/g токоферол.

При сравняване на хемилуминесцентни криви, получени за различни концентрации на четирите изследвани водни екстракта от растителни материали, беше показано, че приносът на средни и слаби антиоксиданти към общия антиоксидантен капацитет на пробите намалява в следните серии: инфузия на малинови плодове (фиг. 4 , Г), отвара от шипка (фиг. 4, Б), отвара от плодове на офика (фиг. 4, А), отвара от плодове на глог (фиг. 4, Б). Стойностите на AS въз основа на концентрацията C на изследваното вещество в кюветата и стойностите на общия антиоксидантен капацитет по отношение на кверцетин са показани в таблицата.

ОБСЪЖДАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Получените по време на експериментите данни и изчислените въз основа на тях стойности на OAE на изследваните обекти бяха сравнени със съдържанието на основните антиоксиданти в тях, определено с помощта на химични методи за анализ. Въпреки факта, че положителната корелация между общото количество антиоксиданти и TAU в различни обекти е неоспорима, все още има забележими разлики между тези показатели. Например, ако вземем сумата от съдържанието на флавоноиди, танини и аскорбинова киселина, тогава тя се оказва по-голяма от изчислената TAU за всички изследвани обекти, с изключение на отвара от плодовете на глог (таблица).

Други изследователи също показаха, че резултатите от химичния анализ и стойността на TAU, определена чрез хемилуминесцентния метод, често не съвпадат. По време на работа се определя общият антиоксидантен капацитет

46 Време, мин

Аз" "ч чи----.

Ориз. 2. Ефект на токоферол върху кинетиката на хемилуминесценцията

Концентрации на системните компоненти: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 µM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0.01 цМ; 3 - 0.025 цМ; 4 - 0.06 цМ; 5 - 0.1 цМ; 6 - 0,2 µM токоферол.

46 Време, мин

Ориз. 3. Ефект на кверцетин върху кинетиката на хемилуминесценцията. Концентрации на компонентите на системата: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 µM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0.02 цМ; 3 - 0.03 цМ; 4 - 0.04 цМ; 5 - 0.05 цМ; 6 - 0,06 µM кверцетин.

Време, мин

46 Време, мин

120 I 100 80\60 40 20

46 Време, мин

Ориз. 4. Ефект върху кинетиката на хемилуминесценцията на отвари от плодове на офика (А), глог (Б), шипка (В) и инфузия на малинови плодове (D) Концентрации на компонентите на системата: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 µM. (А) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l отвара от плодове на офика. (B) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l отвара от плодовете на глог. (B) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l отвара от шипки. (D) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l запарка от плодове на малина.

в системата пероксидаза-луминол-водороден пероксид корелира със съдържанието на тритерпенови съединения. Въпреки това, в работата на същите автори, в която обект на изследване е друго растение, те не наблюдават корелация на OAE със съдържанието на която и да е група вещества, включително флавоноиди.

Такива несъответствия са свързани с поне три фактора. На първо място, важна е активността на антиоксидантите, т.е. скоростта на тяхното взаимодействие с радикалите, която е различна за различните антиоксиданти, включени в растителната проба. Според Измайлов константите на скоростта на съответните реакции за мексидол, токоферол и кверцетин корелират като 0,04:2:60. Второ, всяка антиоксидантна молекула, влизайки в химическа реакция, може да прихване различен брой радикали. Според работата, кверцетинът, пикочната и аскорбиновата киселина са прихванали съответно 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикала на реагирала антиоксидантна молекула (използвана е системата хемин-H2O2-луминол). Трето, резултатите от изследването могат да бъдат повлияни от наличието на пероксидазна активност в самите растителни проби, както в работата, както и от наличието на калций в пробите, което, както е показано в работата, е в състояние да увеличи активността на пероксидазата от хрян при определени условия. Това обикновено води до повече

по-висок интензитет на CL на платото, отколкото на контролните криви, което ние обаче не наблюдавахме.

Първият фактор рязко ограничава използването на такъв параметър като промяна в светлинната сума, тъй като времето за измерване на хемилуминесценцията трябва да бъде по-дълго от времето за консумация на всички антиоксиданти в тестовата проба. Настъпването на този момент може да се прецени само чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. В допълнение, приносът на слабите антиоксиданти към OAU е рязко подценен, тъй като времето за пълното им окисляване е многократно по-дълго от допустимата продължителност на измерване (10-20 минути).

Стехиометричният коефициент на антиоксиданта е още по-важен. Броят на прихванатите от него радикали n е равен на

където p е стехиометричният коефициент, а Am е промяната в концентрацията на антиоксиданта по време на измерването, в нашия случай първоначалната концентрация на тестваното вещество в тестовата проба.

Разликата в светлинната сума на луминесценцията в отсъствието на антиоксиданта и в негово присъствие е пропорционална на n.Общият брой на прихванатите радикали е равен на n = Y.p. м,

където е стехиометричният коефициент на определен антиоксидант, а m е концентрацията му по време на измерване

Обект на изследване Флавоноиди, mg%* Танини, mg%* Аскорбинова киселина, mg%* AS/C ■ 10-8, произв. единици TAU, mg% кверцетин

Отвара от плодовете на офика 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Отвара от шипка 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Отвара от плодове на глог 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Настойка от сушени плодове от малина 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Забележка: * - литературни данни, . AS - изменение на светлинната сума за пробата, отн. единици, С - концентрация на пробата в кюветата, g/l. Изчислените стойности са надеждни на стр<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Рения. Общият брой на прихванатите радикали със сигурност не е равен на общото количество антиоксиданти, тъй като коефициентите на pt не само не са равни на единица, но и се различават значително за различните антиоксиданти.

Стойността на n е пропорционална на разликата в светлинните суми, измерени за определено време между проба, съдържаща антиоксидант, и контролна проба, несъдържаща антиоксиданти:

където k е коефициент, който е постоянен при едни и същи условия на измерване.

Ние избрахме условията за оценка на общия антиоксидантен капацитет на растителните суровини чрез записване на кинетиката на хемилуминесценцията в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол (концентрации на компонентите - съответно 4 nM, 100 µM и 40 µM; 20 mM фосфат буфер, pH 7,4 ),

осигурява окисление на силни антиоксиданти (аскорбинова киселина) и антиоксиданти със средна сила (кверцетин) за 10 минути. Тази продължителност на измерване е удобна и осигурява необходимото качество на измерване.

Литература

1. Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Свободните радикали като участници в регулаторни и патологични процеси. В: Григориев А.И., Владимиров Ю.А., редактори. Основни науки – медицина. Biophys. пчелен мед. технолог. М.: МАКС Прес; 2015 г. том 1. стр. 38-71.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В. Методи за изследване на антиоксиданти. Chem. раст. сурови материали. 2004 г.; (3): 63-75.

4. Василиев Р. Ф., Кънчева В. Д., Федорова Г. Ф., Бутовска Д. И., Трофимов А. В. Антиоксидантна активност на халконите. Хемилуминесцентно определяне на реактивността и квантово-химично изчисляване на енергиите и структурите на реагентите и междинните съединения. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51 (4): 533-41.

6. Федорова Г. Ф., Трофимов А. В., Василев Р. Ф., Вепринцев Т. Л. Перокси-

радикално медиирана хемилуминесценция: механично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Arkivoc. 2007 г.; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуцирана хемилуминесценция на луминол. J Agric Food Chem. 3 декември 2003 г.; 51 (25): 7481-8.

9. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободни радикали и клетъчна хемилуминесценция. Успехи биол. хим. 2009 г.; 49: 341-88.

10. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю. Кинетичната хемилуминесценция като метод за изследване на реакциите на свободните радикали. Биофизика. 2011 г.; 56 (6): 1081-90.

11. Измайлов Д. Ю., Демин Е. М., Владимиров Ю. А. Определяне на антиоксидантна активност чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминолова луминесценция, индуцирана от 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Безплатно

Radic Res Commun. 1992 г.; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Относно използването на охлаждането на луминесценцията на луминол за оценка на активността на SOD. Free Radic Biol Med. юни 1994 г.; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Оценка на общия антиоксидантен потенциал (TRAP) и общата антиоксидантна реактивност от усилени с луминол хемилуминесцентни измервания. Free Radic Biol Med. 1995 февруари; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма на луминисцентна пероксидация на луминол чрез техники на спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243 (18): 4706-14.

21. Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с помощта на 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан). Вестн. МГУ. Сер. 2. Хим. 2012; 53 (3): 187-93.

24. Министерството на здравеопазването на СССР Държавна фармакопея на СССР XI изд. Vol. 2 „Общи методи за анализ. Лечебни растителни суровини." М.: Медицина; 1987. p. 147-8.

25. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Корнюшина М. А. Изследване на препарати за екстракция на шипка. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6.

26. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Аврач А. С. Изследване на плодовете на глог с различни методи за консервиране и водна екстракция. Аптека. 2010 г.; (5): 16-8.

27. Аврач А. С., Сергунова Е. В., Куксова Я. В. Биологично активни вещества от плодове и водни екстракти от обикновена малина. Аптека. 2014 г.; (1): 8-10.

28. Аврах А. С., Самилина И. А., Сергунова Е. В. Изследване на биологично активни вещества от плодове на глог - суровини за приготвяне на хомеопатични матрични тинктури. В сб. научен тр. по материали от XXIV Москва. международни хомеопат. конф. “Развитие на хомеопатичния метод в съвременната медицина”; 24-25 януари 2014 г.; Москва. М.; 2014. стр. 146-7.

29. Сергунова Е. В., Сорокина А. А. Изследване на състава на биологично активни вещества в лекарствени растителни суровини с различни методи на консервиране. В сб. тези по материали от ХХ рос. национален конгр. „Човекът и лекарството”; 15-19 април 2013 г.; Москва. М.: ЕКООнис; 2013. стр. 184-90.

30. Александрова Е. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Изследване на пероксидазната активност в екстракти от коренища и корени на хрян и неговата устойчивост на различни влияния. Вестн. Московски държавен университет. сер. 2. Chem. 2006 г.; 47 (5): 350-2.

1. Проскурнина Е. В., Владимиров ЮА. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. В: Grigor'ev AI, Vladimirov YuA, редактори. Фундаментални науки - медицина. Биофизически медицински технологии. Москва: МАКС Прес; 2015. v. 1. стр. 38-71. Руски.

2. Chanda S, Dave R. In vitro модели за оценка на антиоксидантната активност и някои лечебни растения, притежаващи антиоксидантни свойства: Общ преглед. Afr J Microbiol Res. 2009 декември; 3 (13): 981-96.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В. Методи на изследване на антиоксидантите. Химия Растителя Сырья. 2004; (3): 63-75. Руски.

4. Васил"ев RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti и kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51 (4): 533-41. Руски.

5. Славова-Казакова А. К., Ангелова С. Е., Вепринцев Т. Л., Денев П., Фабри Д., Детори М. А. и др. Антиоксидантен потенциал на съединения, свързани с куркумин, изследван чрез кинетика на хемилуминесценция, ефективност на прекъсване на веригата, активност на почистване (ORAC) и DFT изчисления. Beilstein J Org Chem. 2015 11 август; 11: 1398-411.

6. Федорова Г.Ф., Трофимов А.В., Василев Р.Ф., Вепринцев Т.Л. Хемилуминесценция, медиирана от перокси-радикали: механично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF. Лесен хемилуминесцентен анализ за антиоксидантни свойства на растителни липиди: основи и илюстративни примери. Analyst. 2009 Oct; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуциран луминол

9. Владимиров ЮА, Проскурнина Е.В. Svobodnye radikaly i kletochnaya hemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009 г.; 49: 341-88. Руски.

10. Владимиров ЮА, Проскурнина ЕВ, Измайлов ДЮ. Kineticheskaya hemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Биофизика. 2011 г.; 56 (6): 1081-90. Руски.

11. Измайлов ДЮ, Демин Е.М., Владимиров ЮА. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki hemilyuminestsen-tsii. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7 (2): 70-6. Руски.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминолова луминесценция, индуцирана от 2,2"-Азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Видима хемилуминесценция, свързана с реакцията между метхемоглобин или оксихемоглобин с водороден пероксид. Photochem Photobiol. 1994 ноември; 60 (5): 405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro оценка на антиоксидантната активност на липозомните флавоноли чрез системата HRP-H2O2-luminol. J Microencapsul. 2011 г.; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма

на луминисцентната пероксидация на луминол чрез техники на спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Фитохимични характеристики, дейности за отстраняване на свободните радикали и неврозащита на пет екстракта от лечебни растения. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med. 2012 г.; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10 август.

19. Chang CL, Lin CS. Фитохимичен състав, антиоксидантна активност и невропротективен ефект на екстракти от Terminalia chebula Retzius. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med. 2012 г.; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5 юли.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Оценка на антиоксидантната активност на различни флавоноиди по метода на хемилуминесценцията. AAPS PharmSci. 2003 г.; 5 (2): 111-5.

21. Алексеев AV, Проскурнина EV, Владимиров ЮА. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi hemilyuminestsentsii s pol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Химически бюлетин на Московския университет. 2012 г.; 53 (3): 187-93. Руски.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Приложение на оптимизиран хемилуминесцентен анализ за определяне на антиоксидантния капацитет на билкови екстракти. Луминесценция. 2012 ноември-декември; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Общи антиоксиданти с ниско молекулно тегло като обобщен параметър, количествено определени в биологични проби чрез анализ за инхибиране на хемилуминесценцията. Nat Protoc. 2010 септември; 5 (10): 1627-34.

24. Министерство на здравеопазването на СССР. Государсвенная фармакопея на СССР. 11-то изд. бр. 2. "Общи методи на анализ."

Лекарственное растение "ное сырье". Москва: Медлцина; 1987. С. 147-8. Руски.

25. Сергунова Е.В., Сорокина А.А., Корнюшина М.А. Изучение екстрактионных препаратов шиповника. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6. Руски.

26. Сергунова EV, Сорокина AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konzervatsii i vodnykh izvlechenii. Фармация. 2010 г.; (5): 16-8. Руски.

27. Аврач А.С., Сергунова Е.В., Куксова Я.В. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov и vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Фармация. 2014 г.; (1): 8-10. Руски.

28. Аврач AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - sir"ya za pripravleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Доклади на 14-та Московска международна хомеопатична конференция "Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi meditine"; 2014, 24-25 януари; Москва. М .; 2014. p. 146- 7. руски.

29. Сергунова Е.В., Сорокина А.А. Izuchenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom sir"e razlichnykh sposobov konservatsii. Сборник на 20-ия Руски национален конгрес "Человек и лекарство"; 2013 април 1519 г.; Москва. Москва: ЕкООнис; 2013. стр. 184-90. Руски.

30. Александрова EYu, Орлова MA, Neiman PL. Изучение пероксидазной активности в екстрактах от корневища и корней хрена и ее стабилност към различни въздействия. Химически бюлетин на Московския университет. 2006; 47 (5): 350-2. Руски.

1 Болшакова Л.С. 1Милентьев В.Н. 2Санников Д.П. 3Казмин В.М. 2

1 Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "Орловски държавен институт по икономика и търговия"

2 Федерална държавна бюджетна институция „Център за химизация и селскостопанска радиология „Орловски“

3 Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "Държавен университет - учебно-научен и производствен комплекс"

Изследвана е възможността за използване на хемилуминесценция за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества. Предложеният метод се основава на хемилуминесценцията на луминол в алкална среда, чийто интензитет зависи от количеството пероксиди в хемилуминесцентната проба. Хемилуминесценцията се записва с помощта на разработена инсталация, съдържаща дозираща помпа, светлоустойчива камера, стъклен вакуумен фотоумножител и компютърна система. За да се подобри хемилуминесценцията, към луминола се добавя разтвор на калиев железен сулфид. Промените в интензитета на хемилуминесценцията се записват в момента на въвеждане на анализираната проба в разтвора на луминол. Като анализирана проба е използван екстракт от глухарче, получен чрез суха нискотемпературна дестилация. Съдържа фенолни съединения, известни със своята висока антиоксидантна активност. Установено е, че хемилуминесцентният метод може да се използва за определяне на антиоксидантните свойства на различни хранителни съединения.

Библиографска връзка

Паничкин А.В., Болшакова Л.С., Милентьев В.Н., Санников Д.П., Казмин В.М. ИЗПОЛЗВАНЕ НА ХЕМИЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ ЗА ОЦЕНКА НА АНТИОКСИДАНТНИТЕ СВОЙСТВА НА ХРАНИТЕЛНИТЕ ВЕЩЕСТВА // Рационално хранене, хранителни добавки и биостимуланти. – 2014. – № 6. – С. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (дата на достъп: 17.12.2019 г.). Предлагаме на вашето внимание списания, издадени от издателство "Академия за естествени науки"

дипломна работа

1.4 Методи за изследване на антиоксиданти

антиоксидантната активност се класифицира: според методите за регистриране на проявената АОА (обемни, фотометрични, хемилуминесцентни, флуоресцентни, електрохимични); по вид източник на окисление; по вид на съединението, което се окислява; чрез метода на измерване на окисленото съединение.

Но най-известните методи за определяне на антиоксидантната активност са:

1 TEAC (еквивалентен на тролокс антиоксидантен капацитет): методът се основава на следната реакция:

Метмиоглобин + H 2 O 2 > Ферилглобин + ABTS > ABTS * + AO.

Методът Trolox equivalents (TEAC) се основава на способността на антиоксидантите да редуцират 2,2-азинобис радикалните катиони (ABTS) и по този начин да инхибират абсорбцията в дълговълновата област на спектъра (600 nm). Съществен недостатък на метода е двуетапната реакция за получаване на радикала. Това удължава времето за анализ и може да увеличи разсейването на резултатите, въпреки факта, че за анализа се използва стандартизиран набор от реагенти.

2 FRAP (желязо-редуцираща антиоксидантна сила): методът се основава на следната реакция:

Fe(III)-трипиридитриазин+AO>Fe(II)-трипиридилтриазин.

Желязо редуциращ/антиоксидантен капацитет (FRAP). Реакцията, използвана тук, е редукция на Fe(III)-трипиридилтриазин до Fe(II)-трипиридилтриазин. Този метод обаче не може да определи определянето на някои антиоксиданти, като глутатион. Този метод позволява директно определяне на антиоксиданти с ниско молекулно тегло. При ниско рН редукцията на комплекса Fe(III)-трипиридилтриазин до комплекса Fe(II) се придружава от появата на интензивен син цвят. Измерванията се основават на способността на антиоксидантите да потискат окислителния ефект на реакционните видове, генерирани в реакционната смес. Този метод е прост, бърз и евтин за изпълнение.

3 ORAC (капацитет на абсорбция на кислородни радикали): методът се основава на следната реакция:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Определяне на абсорбционния капацитет на кислородни радикали (ORAC). При този метод се записва флуоресценцията на субстрат (фикоеритрин или флуоресцеин), която възниква в резултат на взаимодействието му с ROS. Ако тестовата проба съдържа антиоксиданти, тогава се наблюдава намаляване на флуоресценцията в сравнение с контролната проба. Този метод първоначално е разработен от д-р Гуохуа Као в Националния институт по стареене през 1992 г. През 1996 г. д-р Као се обединява с д-р Роналд Прайър в съвместна група в Центъра за изследване на стареенето на USDA, където полуавтоматизираният метод е създадено.

4 TRAP (антиоксидантен параметър за общо улавяне на радикали): методът се основава на следната реакция:

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Този метод се възползва от способността на антиоксидантите да взаимодействат с пероксилния радикал 2,2-азобис(2-амидинопропан) дихидрохлорид (AAPH). Модификациите на TRAP се състоят в методи за запис на аналитичния сигнал. Най-често на последния етап от анализа перокси радикалът AAPH взаимодейства с луминесцентен (луминол), флуоресцентен (дихлорофлуоресцеин диацетат, DCFH-DA) или друг оптически активен субстрат.

Водоразтворимото производно на витамин Е Trolox (6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси киселина) се използва като стандарт за методите TEAC, ORAC и TRAP.

Напоследък се е увеличил интересът към използването на електрохимични методи за оценка на антиоксидантната активност. Тези методи имат висока чувствителност и бърз анализ.

Оценката на антиоксидантната активност на някои хранителни продукти се извършва чрез потенциометричен метод, основан на използването на свойството на антиоксидантните вещества да участват в окислително-възстановителни реакции поради енолни (-OH) и сулфхидрилни (-SH) групи.

Определянето на антиоксидантните свойства на разтворите се основава на химичното взаимодействие на антиоксидантите с медиаторната система, което води до промяна в нейния редокс потенциал. Електрохимичната клетка е контейнер, съдържащ K-Na-фосфатен буферен разтвор, Fe(III)/Fe(II) медиаторна система и сложен електрод преди измерване на редокс потенциала. Антиоксидантната активност се оценява в g-eq/l.

Амперометричният метод за определяне на антиоксидантната активност се основава на измерване на електрическия ток, който възниква по време на окисляването на тестваното вещество върху повърхността на работния електрод, който е под определен потенциал. Чувствителността на амперометричния метод се определя както от естеството на работния електрод, така и от потенциала, приложен към него. Границата на откриване на амперометричния детектор на полифеноли и флавоноиди е на ниво нано-пикограм; при такива ниски концентрации има по-малка вероятност за взаимно влияние на различни антиоксиданти, когато те присъстват заедно, по-специално проявата на феномена на синергия . Недостатъците на метода включват неговата специфичност: при тези условия не могат да бъдат анализирани антиоксиданти, които сами по себе си се окисляват или редуцират в областта на потенциалите за електроредукция на кислород. Предимствата на метода включват неговата скорост, простата и чувствителност.

Метод на галваностатична кулонометрия с използване на електрически генерирани оксиданти – методът е приложим за анализ на мастноразтворими антиоксиданти.

Разработени са различни методи за определяне на аскорбинова киселина:

амперометричен метод, използващ алуминиев електрод, модифициран с филм от никелов (II) хексацианоферат чрез просто потапяне в разтвор;

метод за спектрофотометрично и визуално тестово определяне на аскорбинова киселина в твърда фаза, като се използва ксерогел от силициева киселина, модифициран с реактив Wawele и мед (II) като индикаторен прах;

хемилуминесцентното определяне на аскорбинова киселина може да се извърши чрез метода на поточна инжекция, като се използва хемилуминесцентната реакция на родамин В с церий (IV) в среда на сярна киселина.

определяне на аскорбинова киселина в границите 10 -8 -10 -3 g/cm 3 чрез анодна волтаметрия във водни и водно-органични среди.

Най-често срещаният е методът FRAP, тъй като е бърз и високочувствителен. През последните няколко десетилетия са разработени голям брой разновидности на методи за определяне на антиоксидантната активност с помощта на метода FRAP (Таблица 1).

Таблица 1 Развитие на метода FRAP и приложението му за определяне на антиоксидантната активност на различни обекти

	Обекти на анализ	Бележки
	Кръвна плазма	t=4мин. Изследвани са стехиометрията на реакцията и адитивността.
	Чай, вино	Определяне на AOA поради полифеноли
		Бяха сравнени стойностите на AOA на различни сортове чай
Пулидо, Браво, Саура-Каликсто	Моделни решения	t=30мин. Разкрито е влиянието на неводен разтворител
	растения
	Кръв, тъкан	PIA метод. Тествано е влиянието на чужди вещества.
Фирузи, Лакана, Петручи и др.	Моделни решения	Чувствителността на определяне на различни АО е изследвана като функция на тяхната структура и редокс потенциал.
Каталинич, Милош,	Различни вина
Темердашев, Цюпко и др.	Моделни смеси
Логинова, Коновалова	Лекарства Лекарства	Метод на тестване
Темердашев, Цюпко и др.	Сухи червени вина	Корелация на AOA с други показатели за качество на виното
Продължение на таблица 1
	Моделни смеси	Изследвана е чувствителността на определяне на различни АО
Вершинин, Власова, Цюпко	Моделни смеси	Установено е, че сигналът не е адитивен, когато липсва окислител
Анисимович, Дейнека и др.	Моделни решения	Предложени са кинетични параметри за оценка на AOA.

Бележки: Конвенционално обозначени: FIA-поточен инжекционен анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2,-дипиридил, PHEN-o-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоксилна киселина, FZ-ферозин, AA-аскорбинова киселина, CT-катехол, t - време на експозиция, мин.

Взаимодействие между протеини и полиелектролити във водни разтвори

Използват се различни аналитични методи за характеризиране на протеин-полиелектролитни комплекси. Инструменталните методи предоставят информация за структурни и оптични свойства, а също така определят динамиката и характера на свързването на PEC...

Ефект на d-метални съединения върху скоростта на дисоциация на водна молекула в биполярна мембрана

В процеса на синтезиране на нови BPM трябва да се обърне голямо внимание на изучаването на свойствата на получените проби за последващ избор на условия за синтез, които осигуряват подобряване на електрохимичните характеристики на синтезираните мембрани ...

Дизайнерски наркотици и синтетични канабиноиди

Откриването на синтетични канабиноиди в растителни смеси може да се извърши чрез различни физикохимични методи, като хроматография-масспектрометрия, газова хроматография, тънкослойна хроматография и високоефективна течна хроматография...

Разработване на метод за определяне на флавоноиди в лечебни растителни суровини

Синтез и фармакологични свойства на хинолинони-2

Обект на изследване: Хинолинон-2. Метод на изследване: С помощта на компютърната програма "Marvin JS" е създадена структурата на веществото. След това тя беше изпратена на сайта „http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php“ за по-нататъшно проучване...

Термоспектрален метод за изследване на продукти от изпаряване на епоксидни полимери

Технология за производство на високо пречистен хитозан от черупки на ракообразни

Определяне на молекулното тегло на хитозана Молекулното тегло на хитозана се определя вискозиметрично, като се използва стандартен метод. Разтвори с концентрация 0,05 и 0,5 g/dL се приготвят чрез разтваряне на проба от полимерен прах в ацетатен буфер (0...

Физикогеографска характеристика на територията на природния парк

1 Милентьев В.Н. 2Санников Д.П. 3Казмин В.М. 2

2 Федерална държавна бюджетна институция „Център за химизация и селскостопанска радиология „Орловски“

хемилуминесценция

антиоксидантна активност

пероксиди

хранителни вещества

1. Василиев R.F. Химическо сияние // Химия и химици, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (дата на достъп: 22.08.13).

2. Владимиров Ю.А. Свободни радикали и антиоксиданти // Вестн. RAMS. – 1998. – № 7. – С. 43–51.

3. Кондрашова Е.А. Хемилуминесценцията като най-чувствителен метод за ензимен имуноанализ и неговото приложение // Клинична лабораторна диагностика. – 1999. – № 9. – С. 32.

4. Любимов, Г.Ю. Хемилуминесцентен анализ // Имунология. – 1991. – № 1. – С. 40–49.

5. Маянски A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Реактивна хемилуминесценция в системата за фагоцитоза // Микробиология. – 1987. – № 1. – С. 109–115.

6. Шерстнев М.П. Калций-зависими и калций-независими пътища за генериране на клетъчна хемилуминесценция // Въпроси на хемилуминесценцията. – 1991. – № 2. – С. 1–4.

Днес хемилуминесценцията представлява голяма област на науката, разположена на границата между химия, физика и биология. При хемилуминесценцията се получава директно преобразуване на химическата енергия в енергията на електромагнитните вибрации, т.е. в света Използвайки хемилуминесценция, можете да разберете как протича реакцията, какъв е нейният механизъм, какво е необходимо за ефективното и ефикасно изпълнение на технологичните процеси. Ако технологичният процес на производство на химически продукт е придружен от хемилуминесценция, тогава неговата интензивност може да служи като мярка за скоростта на процеса: колкото по-бърза е реакцията, толкова по-ярка е светлината. По време на реакцията на хемилуминесценция се получават богати на енергия продукти, които след това освобождават енергия чрез излъчване на светлина, т.е. химическата енергия се преобразува в енергия на електромагнитно излъчване.

Целта на изследването е да се изследва възможността за използване на хемилуминесценция за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества.

Резултати от изследването и дискусия

Проблемът за оценка на антиоксидантната активност на хранителните вещества е много актуален. Използването на термина „антиоксидантна активност“, за да се покаже полезността на определен продукт, често се извършва без никаква химическа или биохимична аргументация. По правило антиоксидантната активност на всяко вещество означава ефективността на намаляване на пероксидното число. Самата концепция за пероксидното число също не разкрива напълно неговата химическа същност, тъй като не съответства напълно на кинетиката и термодинамиката на етапите на метаболизма на конкретен хранителен продукт. В допълнение, тази стойност се използва за характеризиране на липидите под формата на мазнини. Процесите на окисляване и образуването на пероксиди в тялото обаче се случват не само при консумация на мазнини, но и при други храни. С други думи, може да се каже, че съдържанието на пероксид в конкретен продукт е „претеглено“ на един вид скала, където „референтното тегло“ е единицата за концентрация в кисела среда на йодидния йон, окислен от пероксиди, като в резултат на което се образува молекулен йод:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Когато молекулният йод се титрува с разтвор, съдържащ натриев тиосулфат, се установява неговата концентрация и следователно се определя количеството на окисляващите йодидни йони, т.е. пероксидни съединения, което всъщност се нарича пероксидно число. Определянето на пероксидното число с помощта на този вид „претегляне“ се основава на реакцията, показана на фиг. 1.

Ориз. 1. Определяне на пероксидно число с помощта на натриев тиосулфат

Така концентрацията на пероксиди се определя от уравнението

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

където ϒ е коефициентът на корелация между концентрацията на молекулен йод и концентрацията на пероксиди.

Методът, който предлагаме за определяне на пероксидите в продуктите, се основава на хемилуминесценцията на луминол (C[lm]) в алкална среда, чийто интензитет (Ichl) зависи от концентрацията на пероксиди (C[-O-O-]) в хемилуминесцентна проба:

МХП = Ϧхл ω, (4)

където Ϧhl е квантовият добив на хемилуминесценция; ω - скорост на реакция с пероксиди:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

където khl е константата на скоростта на реакцията или при:

C[lm] khl Ϧkhl = K, (6)

IHL = K C[ -O-O-]. (7).

Количеството пероксиди (-O-O-) се определя от светлинната сума (S):

Стойността на S зависи от степента на пълно изразходване на пероксида в хемилуминесцентната реакция.

За определяне на константата K се построява калибровъчна крива за зависимостта на светлинната сума S от концентрацията на пероксида, която се установява чрез титруване:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Като пероксиди се използва водороден прекис H2O2.

След това данните, получени от уравнение (3) и (9), се сравняват. Въз основа на сравнението на ϒ и K се прави заключение за съответствието на реакционните механизми, които са в основата на определянето на пероксиди по тези методи. Беше разкрито, че в този диапазон от концентрации на пероксид ϒ и K действително се съгласуват помежду си и следователно могат да се използват за определяне на пероксидното число.

Хемилуминесценция се наблюдава в алкална среда, съдържаща луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, H2L). Записано е с помощта на хемилуминесцентна настройка, включваща стъклен вакуумен фотоумножител. Фотоумножителят се захранва от високоволтов токоизправител (7), свързан към блок (9), който усилва сигнала на фотоумножителя, който се записва на дисплея на компютърния монитор (5).

Ориз. 2. Регистрация на хемилуминесценция на анализирания продукт: 1 - дозираща помпа; 2 - светлоустойчива камера; 3 - огледало; 4 - кювета; 5 - компютърна система; 6 - фотоумножител; 7 - токоизправител за високо напрежение; 8 - устройство, което ви позволява да определите спектралната област на хемилуминесцентното лъчение; 9 - блок, който усилва сигнала на фотоумножителя

Необходима е дозираща помпа (1) за въвеждане на анализираната проба в кювета (4), съдържаща хемилуминесцентен разтвор на луминол. Този дозатор действа като смесител за инжектираната проба с хемилуминесцентен разтвор. За да се увеличи скоростта на реакцията и интензитета на хемилуминесценцията, към луминола се добавя разтвор на калиев железен сулфид. Смесването се извършва от въздушни мехурчета, получени чрез изпомпване на въздух през течността на разтвора. Огледалото (3), разположено в светонепроницаемата камера (2), служи за по-добро светлоулавяне на хемилуминесцентното лъчение, падащо върху фотокатода на фотоумножителя (6), монтиран в светонепроницаемата камера. Дозаторът ви позволява да въведете необходимите течни компоненти в кюветата, без да отваряте светлонепроницаемата камера (2) по време на експерименти. В този случай тези течности влизат в кюветата (4) през стъклени или пластмасови тръби. Компютърната система позволява да се запише зависимостта на интензитета на светене I от времето t, тоест кинетиката на хемилуминесценцията:

Компютърната система отразява константите на нарастване и спадане във функцията I = f(t), които са свързани с константите на скоростта на реакциите, предизвикващи хемилуминесценция, тоест с тяхната кинетика. В хемилуминесцентната камера е включено устройство (8), което позволява да се определи спектралната област на хемилуминесцентното лъчение, т.е. зависимостта:

I = f1(λ). (единадесет)

Този блок е дисковидна касета, в която са монтирани гранични филтри. Смяната на филтрите се извършва чрез завъртане на дисковата касета спрямо хоризонталната ос, свързваща центровете на равнината на филтрите и равнината на фотокатода на фотоумножителя.

Процесът на измерване се извършва, както следва:

1. Установява се реакцията на фотоумножителя на промени в захранващото му напрежение и на промени в интензитета на еталонния светлинен източник, който пада върху неговия катод.

2. Кюветата се напълва с разтвор на луминол в алкална среда.

3. Дозаторът се пълни с анализираната проба.

4. Записва се зависимостта на интензитета на хемилуминесценцията от времето t. Наблюденията на хемилуминесценцията се извършват до момента t1, в който промяната на I1 спрямо времето t е минимална: I1 = f1(t).

5. Част от анализирания разтвор се подава с помощта на дозатор.

6. Наблюдава се хемилуминесценция на анализираната проба, чиято кинетика е I = f(t).

На фиг. Фигура 3 показва графика на зависимостта на функциите (I1 = f1(t)), свързани с графиката (I = f(t)), след въвеждането на анализирания разтвор.

Както се вижда от фиг. 3, интензитетът на хемилуминесценцията на луминола се променя: рязкото покачване е последвано от рязко намаляване на луминесценцията след добавяне на анализираната проба.

Тъй като увеличаването на хемилуминесценцията по време на окисляването на луминола е свързано с образуването на пероксиди, намаляването на интензивността на хемилуминесценцията след въвеждането на анализираната проба показва намаляване на тяхното количество. Следователно можем да говорим за наличие на антиоксидантна активност в съединенията, включени в анализираната проба.

Трябва да се отбележи, че анализираната проба е екстракт от глухарче, получен чрез суха нискотемпературна дестилация, който съдържа фенолни съединения, известни с високата си антиоксидантна активност.

Ориз. 3. Графика на функционалната зависимост (I1 = f1(t)), съчетана с графиката (I = f(t)), след въвеждането на анализирания разтвор

В допълнение, експериментът установи, че с помощта на хемилуминесценция е възможно да се определи количеството пероксиди в ултра-разредени системи, което е важно за оценка на началото на окисляването на продуктите, например по време на съхранение.

По този начин проучванията показват, че методът за определяне на пероксиди в продукти, базиран на хемилуминесценцията на луминол в алкална среда, позволява да се оцени антиоксидантната активност на хранителните вещества и може да се използва за установяване на антиоксидантните свойства на различни хранителни съединения. .

Рецензенти:

Литвинова Е.В., доктор на техническите науки, професор в катедрата по технология, организация и хигиена на храните, Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "ОрелГИЕТ", Орел;

Ковалева О.А., доктор на биологичните науки, директор на института, Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "Орловски държавен аграрен университет", Орел.

Творбата е получена в редакцията на 08.11.2013 г.

Библиографска връзка

Паничкин А.В., Болшакова Л.С., Милентьев В.Н., Санников Д.П., Казмин В.М. ИЗПОЛЗВАНЕ НА ХЕМИЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ ЗА ОЦЕНКА НА АНТИОКСИДАНТНИТЕ СВОЙСТВА НА ХРАНИТЕЛНИТЕ ВЕЩЕСТВА // Фундаментални изследвания. – 2013. – No 10-11. – С. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (дата на достъп: 17.12.2019 г.). Предлагаме на вашето внимание списания, издадени от издателство "Академия за естествени науки"

анотация научна статия по химически науки, автор на научната работа - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

Свързани теми научни трудове по химически науки, автор на научната работа - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

Хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствен растителен материал

Текст на научна работа на тема “Хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебни растителни суровини”

Библиографска връзка

1.4 Методи за изследване на антиоксиданти

Библиографска връзка

Функции на клетъчните органели

Алгоритъм за писане на есе по социални науки

Чернобил в мемоарите на очевидци Страшни истории за Чернобил