Разделяне на протеини от нискомолекулни примеси
Метод на мембранно сито (диализа)
Използва се диализна мембрана, която е полимер и има пори с определен размер. Малките молекули (примеси с ниско молекулно тегло) преминават през порите в мембраната, а големите молекули (протеините) се задържат. По този начин протеините се отмиват от примеси.
Разделяне на протеини по молекулно тегло
Гел хроматография
Хроматографската колона е пълна с гел гранули (Sephadex), който има пори с определен размер. Към колоната се добавя смес от протеини. Протеините, чийто размер е по-малък от размера на порите на Sephadex, се задържат в колоната, тъй като са „заседнали“ в порите, докато останалите свободно излизат от колоната. Размерът на протеина зависи от неговото молекулно тегло.
Ултрацентрофугиране
Този метод се основава на различни скорости на утаяване (утаяване) на протеинови молекули в разтвори с различни градиенти на плътност (буфер от захароза или цезиев хлорид).
Електрофореза
Този метод се основава на различни скорости на миграция на протеини и пептиди в електрическо поле в зависимост от заряда.
Като носители за електрофореза могат да служат гелове, целулозен ацетат и агар. Молекулите, които се отделят, се движат в гела в зависимост от техния размер: тези, които са големи, ще се забавят, докато преминават през порите на гела. По-малките молекули ще срещнат по-малко съпротивление и следователно ще се движат по-бързо. В резултат на това след електрофореза големите молекули ще бъдат по-близо до началото, отколкото по-малките.
Електрофорезата може да се използва за разделяне на протеини по молекулно тегло. За тази цел се използва PAGE електрофореза в присъствието на натриев додецил сулфат (SDS-Na).
DDS-Na е дифилно вещество и съдържа заредена група и хидрофобна. Протеините се свързват с SDS-Na с техните хидрофобни радикали и в процеса се денатурират. По този начин протеините са подредени по форма и заряд. След това мобилността на протеина по време на електрофореза зависи само от неговото молекулно тегло.
изсоляване: утаяване със соли на алкални, алкалоземни метали (натриев хлорид, магнезиев сулфат), амониев сулфат; първичната структура на протеина не е нарушена;
отлагане: използване на водоотстраняващи вещества: алкохол или ацетон при ниски температури (около –20 С).
Когато се използват тези методи, протеините губят своята хидратираща обвивка и се утаяват в разтвора.
Денатурация- нарушение на пространствената структура на протеините (първичната структура на молекулата се запазва). Тя може да бъде обратима (структурата на протеина се възстановява след отстраняване на денатуриращия агент) или необратима (пространствената структура на молекулата не се възстановява, например, когато протеините се утаяват с концентрирани минерални киселини, соли на тежки метали).
Методи за разделяне на протеини Разделяне на протеини от нискомолекулни примеси
Диализа
Използва се специална полимерна мембрана, която има пори с определен размер. Малките молекули (примеси с ниско молекулно тегло) преминават през порите в мембраната, а големите молекули (протеините) се задържат. По този начин протеините се измиват от примеси.
Разделяне на протеини по молекулно тегло
Гел хроматография
Хроматографската колона е пълна с гел гранули (Sephadex), който има пори с определен размер. Към колоната се добавя смес от протеини. Протеините, чийто размер е по-малък от размера на порите на Sephadex, се задържат в колоната, тъй като са „заседнали“ в порите, докато останалите свободно излизат от колоната (фиг. 2.1). Размерът на протеина зависи от неговото молекулно тегло.
Ориз. 2.1.Разделяне на протеини чрез гел филтрация
Ултрацентрофугиране
Този метод се основава на различни скорости на утаяване (утаяване) на протеинови молекули в разтвори с различни градиенти на плътност (буфер от захароза или цезиев хлорид) (фиг. 2.2).
Ориз. 2.2.Разделяне на протеини чрез ултрацентрофугиране
Електрофореза
Този метод се основава на различни скорости на миграция на протеини и пептиди в електрическо поле в зависимост от заряда.
Като носители за електрофореза могат да служат гелове, целулозен ацетат и агар. Отделените молекули се движат в гела в зависимост от техния размер: тези, които са по-големи, ще се забавят, докато преминават през порите на гела. По-малките молекули ще срещнат по-малко съпротивление и следователно ще се движат по-бързо. В резултат на това след електрофореза по-големите молекули ще бъдат по-близо до началото, отколкото по-малките (фиг. 2.3).
Ориз. 2.3. Разделяне на протеини чрез гел електрофореза
Електрофорезата може да се използва и за разделяне на протеини по молекулно тегло.За това те използват PAGE електрофореза в присъствието на натриев додецил сулфат (SDS-Na).
Изолиране на отделни протеини
Афинитетна хроматография
Методът се основава на способността на протеините да се свързват силно с различни молекули чрез нековалентни връзки. Използва се за изолиране и пречистване на ензими, имуноглобулини и рецепторни протеини.
Молекулите на веществата (лиганди), към които специфично се свързват определени протеини, се свързват ковалентно с частици от инертно вещество. Протеинова смес се добавя към колоната и желаният протеин се прикрепя здраво към лиганда. Останалите протеини напускат колоната свободно. След това задържаният протеин може да бъде измит от колоната с помощта на буферен разтвор, съдържащ свободния лиганд. Този изключително чувствителен метод позволява много малки количества протеин да бъдат изолирани в чиста форма от клетъчен екстракт, съдържащ стотици други протеини.
Изоелектрично фокусиране
Методът се основава на различни IET стойности на протеини. Протеините се разделят чрез електрофореза върху плоча с амфолин (това е вещество, в което предварително се образува рН градиент в диапазона от 3 до 10). По време на електрофореза протеините се разделят според тяхната IET стойност (при IET зарядът на протеина ще бъде нула и той няма да се движи в електрическото поле).
2D електрофореза
Това е комбинация от изоелектрично фокусиране и електрофореза с SDS-Na. Първо се извършва електрофореза в хоризонтална посока върху плоча с амфолин. Протеините се разделят според заряда (IET). След това плаката се обработва с разтвор на SDS-Na и се извършва електрофореза във вертикална посока. Протеините се разделят въз основа на молекулното тегло.
Имуноелектрофореза (Western blot)
Аналитичен метод, използван за идентифициране на специфични протеини в проба (Фигура 2.4).
Изолиране на протеини от биологичен материал.
Разделяне на протеини по молекулно тегло чрез електрофореза в PAGE с SDS-Na.
Прехвърляне на протеини от гела в полимерна плоча за улесняване на по-нататъшната работа.
Третиране на плочата с разтвор на неспецифичен протеин за запълване на останалите пори.
Така след този етап се получава пластинка, чиито пори съдържат отделени протеини, а пространството между тях е запълнено с неспецифичен протеин. Сега трябва да определим дали сред протеините има този, който търсим, който е отговорен за някакво заболяване. За откриване се използва лечение с антитела. Първичните антитела са антитела към интересуващия ни протеин. Вторични антитела означават антитела срещу първични антитела. Към вторичните антитела се добавя допълнителен специален етикет (т.нар. молекулярна сонда), за да могат след това да се визуализират резултатите. Като етикет се използва радиоактивен фосфат или ензим, плътно свързан с вторично антитяло. Свързването първо с първични и след това с вторични антитела има две цели: стандартизиране на метода и подобряване на резултатите.
Третиране с разтвор на първични антитела свързването става на мястото на плаката, където се намира антигенът (желаният протеин).
Отстраняване на несвързани антитела (промиване).
Третиране с разтвор на белязани вторични антитела за последващо развитие.
Отстраняване на несвързани вторични антитела (промиване).
Ориз. 2.4. Имуноелектрофореза (Western blot)
Ако желаният протеин присъства в биологичния материал, върху плаката се появява лента, показваща свързването на този протеин със съответните антитела.
Изследването на физикохимичните свойства, химичния състав и структура е възможно само чрез изследване на пречистен протеинов препарат. За изолиране и фракциониране на отделни протеини се използват: изсоляване, утаяване с органични разтворители, гел филтрация, електрофореза, йонообменна хроматография, афинитетна хроматография.
Осоляване на протеинивъз основа на зависимостта на разтворимостта на протеина от свойствата на средата. Протеините са по-малко разтворими в дестилирана вода, отколкото в слаби солеви разтвори, тъй като ниските концентрации на йони поддържат техните хидратационни черупки. Но при високи концентрации на сол, протеиновите молекули губят хидратиращите си обвивки, агрегират и се образува утайка. След като солта бъде отстранена, протеините се връщат в разтвор, запазвайки естествените си свойства и конформация.
Промените в разтворимостта при различни концентрации на сол и pH се използват за изолиране на отделни протеини. Най-често за изсоляване на протеини се използват разтвори на амониев сулфат с различни концентрации.
Утаяването на протеини от разтвор без тяхната денатурация се извършва с помощта на дехидрогениращи агенти - органични разтворители (етанол, ацетон).
Гел филтрацияоснован на разделянето на протеините според размера и формата на молекулата. Разделянето се извършва в хроматографски колони, напълнени с порести гел гранули (сефадекс, агароза) в буферен разтвор с определена рН стойност. Гел гранулите са пропускливи за протеини благодарение на вътрешни канали (пори) с определен среден диаметър, чийто размер зависи от вида на гела (Sephadex G-25, G-200 и др.). Протеиновата смес се добавя към колоната и след това се измива (елуира) с буферен разтвор с определена стойност на pH. Големите протеинови молекули не проникват в порите на гела и се движат с висока скорост заедно с разтворителя. Малки молекули на примес с ниско молекулно тегло (сол) или друг протеин се задържат от гранулите на гела и се измиват от колоната по-бавно (фиг. 1.29). На изхода на колоната разтворът (елуат) се събира под формата на отделни фракции.
Ориз. 1.29. Разделяне на протеини чрез гел филтрация
Електрофорезасе основава на свойството на заредените протеинови молекули да се движат в електрическо поле със скорост, пропорционална на общия им заряд. Протеините, които имат общ отрицателен заряд при дадена стойност на рН, се движат към анода, а положителният заряд се движи към катода. Електрофорезата се извършва върху различни среди: хартия, нишестен гел, полиакриламиден гел и др. Скоростта на движение зависи от заряда, масата и формата на протеиновите молекули. След завършване на електрофорезата протеиновите зони на носителя се оцветяват със специални багрила (фиг. 1.30, А).
Разделителната способност на електрофорезата в гел е по-висока, отколкото на хартия, така че при електрофореза на кръвни серумни протеини на хартия се изолират 5 фракции (албумин, α 1 -, α 2 -, β-, γ-глобулини) и в полиакриламиден гел - до 18 фракции ( Фиг. 1.30, B).
Ориз. 1.30. Електроферограма на протеини в кръвния серум на здрав човек
А- електроферограма на кръвни серумни протеини на хартия;
б- количеството на плазмените протеини от различни фракции.
I - γ-глобулини; II - β-глобулини; III - a 2 -глобулини;
IV - a 1 -глобулини; V - албумини
Йонообменна хроматографиявъз основа на разделянето на протеини, които се различават по общ заряд. Разтвор на протеин с определена стойност на pH преминава през хроматографска колона, пълна с твърд порест сорбент, като част от протеините се задържат в резултат на електростатично взаимодействие. Йонообменните вещества се използват като сорбенти: анионобменници (съдържащи катионни групи) за изолиране на киселинни протеини; катионни обменници (съдържащи анионни групи) за изолиране на основни протеини.
При преминаване на протеин през колона силата на свързването му с йонообменника зависи от големината на заряда, противоположен на заряда на сорбента. Протеините, адсорбирани върху йонообменен сорбент, се елуират с буферни разтвори с различни концентрации на сол и рН, като се получават различни протеинови фракции.
Афинитетна хроматографиясе основава на специфичността на свързване на протеина към лиганда, прикрепен към твърдата подложка. Като лиганди се използват ензимни субстрати, простетични групи от холопротеини, антигени и др. При преминаване на смес от протеини през колоната само комплементарният протеин се прикрепя към лиганда (фиг. 1.31, А), всички останали излизат заедно с разтвора. Адсорбираният протеин се елуира с разтвор с различна стойност на рН (фиг. 1.31, Б). Този метод е много специфичен и позволява получаването на високо пречистени протеинови препарати.
Изолирането и пречистването на протеин обикновено се извършва в няколко стъпки, като се използват различни методи. Последователността от стъпки е избрана емпирично и може да варира за различните протеини. Високата степен на пречистване на протеините е много важна както при използването им като лекарства (хормона инсулин и др.), така и при диагностицирането на различни заболявания чрез промяна на протеиновия състав на тъканите, кръвта, слюнката и др.
Наборът от протеини в клетките на различните органи на възрастен човек е индивидуален и се поддържа относително постоянен през целия живот. Специализираните тъкани могат да съдържат специфични протеини, като хемоглобин в червените кръвни клетки, актин и миозин в мускулите, родопсин в ретината и различни видове колаген в костите и съединителните тъкани. Някои протеини се намират в много тъкани, но в различни количества. Промени в избрания състав
Ориз. 1.31. Разделяне на протеини чрез афинитетна хроматография
А- свързване на изолирания протеин със специфичен лиганд, прикрепен към неутрален носител; б- получаване на разтвор на индивидуален протеин
протеини на тъкани и кръв са възможни и са свързани предимно с диетата, състава на храната и физическата активност на човек.
При заболявания протеиновият състав на кръвта и тъканните клетки може да се промени значително; често се развива дефицит на всеки протеин или намаляване на неговата активност - протеинопатия.Следователно, определянето на изразени промени в протеиновия състав на кръвта и тъканите се използва за диагностициране на различни заболявания в клинични проучвания.
След извличане на смес от протеини от биологичен материал, тя се разделя на отделни протеинови фракции. Разработени са няколко метода за фракциониране на протеини, базирани на различни физикохимични свойства на протеините.
– утаяване на протеини в изоелектричната точка – методът се основава на свойството на протеините да се утаяват в изоелектричната точка поради неутрализиране на заряда на протеиновата молекула. За всеки протеин стойността на изоелектричната точка е строго индивидуална, така че този метод позволява да се изолират отделни протеини (за повече информация относно метода вижте лабораторна работа № 3 в курса „Биохимия“).
– протеиново фракциониране чрез метод на изсоляване – въз основа на различната разтворимост на протеини в концентрирани разтвори на неутрални соли, в зависимост от молекулното тегло (за повече информация относно метода вижте лабораторна работа № 3 в курса „Биохимия“).
– електрофоретичен метод на разделяне протеини на фракции - описани в раздела физикохимични свойства на протеините.
В допълнение към методите, представени по-горе, те се използват широко за разделяне на протеини на фракции. хроматографски методи . Най-често се използва колонна хроматография.
Особеността на този метод е, че смес от молекули на различни протеини и пептиди преминава през колона, съдържаща твърд порест материал (матрица). В резултат на взаимодействие с матрицата различни протеини преминават през колоната с различна скорост. След като протеините достигнат дъното на колоната в определена последователност, те се събират на отделни фракции в епруветки.
Маркирайте три основни типаколонна хроматография:
– йонен обмен – за протеинова хроматография се използват йонообменници на базата на целулоза или други хидрофилни полимери, например диетиламиноетилцелулоза (DEAE-целулоза), съдържаща катионни групи (отрицателен заряд) или съдържаща карбоксиметилцелулоза (CM-целулоза), съдържаща аминогрупи (положителен заряд) :
Колкото по-силно е свързването на протеините с DEAE-целулозата, толкова по-голям е броят на карбоксилните групи в протеиновата молекула. Протеините, адсорбирани към DEAE целулоза, могат да бъдат промити (елуирани) от колоната с разтвори на нарастващи концентрации на натриев хлорид. Слабо свързаните протеини се елуират първи и с увеличаването на концентрацията на сол други протеини се елуират в реда на увеличаване на афинитета към DEAE-целулозата.
CM целулозата се използва по подобен начин, но афинитетът на протеините към нея е правопропорционален на броя на аминогрупите в протеиновата молекула.
За да се отстрани свързаният протеин, pH на елуента също се променя.
– гел филтрационна хроматография – има второто име „метод на молекулярно сито“. Сефадекс (полизахарид декстран, обработен с епихлорид хидрин) се използва като сита. Зърната на сефадекс набъбват във вода и образуват гел. Набъбналите гранули имат пори с определен диаметър.
Разделянето се основава на факта, че зърната на Sephadex (порите на гранулите) са непропускливи или ограничено пропускливи за вещества с голямо молекулно тегло, а малките молекули свободно дифундират (проникват) в порите на зърната.
Гелообразна маса от набъбнал сефадекс се поставя в стъклена колона (епруветка), върху повърхността на гела се нанася слой протеинов разтвор (фиг. 12, а) и след това през него преминава буферен разтвор (елуираща течност). колоната. Протеините преминават по колоната между гранулите толкова по-бавно, колкото по-ниско е тяхното молекулно тегло, тъй като протеиновите молекули с още по-ниско молекулно тегло дифундират по-лесно в гранулите (в порите) (фиг. 12).
Ориз. 12. Фракциониране на протеин чрез гел филтрация
Протеините се отмиват (елуират) от колоната в низходящ ред на молекулното тегло. Следователно първо се елуират големи протеинови молекули (фиг. 12, b), които не дифундират в зърната, след това малки молекули и накрая нискомолекулни примеси.
Този метод се използва не само за фракциониране на протеини по молекулно тегло, но и за пречистването им от нискомолекулни примеси.
– афинитетна хроматография – или афинитетна хроматография. Принципът на метода е, че селективното взаимодействие на протеините се осъществява със специфични вещества - лиганди, прикрепени към носители (фиг. 13).
Като носител се използва сефароза, активирана с цианоген бромид. Лиганди от различен произход са прикрепени към Sepharose - субстрат, или антиген, или рецептор, който ще свърже афинитетно само един протеин от сместа:
– субстрат → ензим;
– антиген → антитяло;
– хормон → рецептор за даден хормон.
Други протеини, които не са свързани с лиганда, се отстраняват чрез промиване на колоната.
Ориз. 13. Механизъм на афинитетна хроматография
Отстраняването на афинитетно свързан протеин от колоната се извършва с помощта на буферен разтвор (елуент). В буфера се въвежда детергент, който отслабва връзките между протеина и лиганда, или през колоната се пропуска разтвор с висока концентрация на свободен лиганд. В този случай протеинът се свързва по-лесно със свободния лиганд и се отмива (елуира) от колоната.
Лабораторна работа № 8
ЕЛЕКТРОФОРЕЗНО РАЗДЕЛЯНЕ НА БЕЛТЪЦИ
Методът се основава на факта, че протеиновите молекули имат електрически заряд, чиято величина и знак се определят от аминокиселинния състав на протеина, pH и йонната сила на средата. Под въздействието на външно електрическо поле заредените молекули се движат в разтвора към противоположно заредения полюс. Скоростта на движение на белтъчните частици е пропорционална на големината на техния заряд и обратно пропорционална на размера на частиците и степента на тяхната хидратация.
В момента е широко разпространена така наречената „зонална електрофореза“ - електрофореза върху твърд носител (върху хартиени ленти, агар, нишесте, акриламид), импрегниран с буферен разтвор с желаната стойност на рН. Позицията на протеините върху хартия или гел се определя чрез фиксиране и последващо оцветяване с едно или друго багрило (обикновено бромофенолно синьо, амидно черно или кумаси синьо). Количеството протеин във всяка фракция може приблизително да се определи от интензитета на цвета на свързаното багрило. Това определение не дава строго количествено съотношение на протеиновите фракции, тъй като количеството багрило, свързано с различни протеини, не е еднакво.
ЕЛЕКТРОФОРЕЗА HA ХАРТИЯ
Разделянето на анализираната смес става върху определени видове хроматографска хартия, импрегнирана с буферен разтвор в устройства за електрофореза. Протеините се разделят при напрежение до 500 V.
Камерата за електрофореза се състои от плексигласова вана и капак, монтиран към нея (1). Ваната има 2 електродни отделения (2), всяко от които е разделено с надлъжна преграда (3) в две отделения, комуникиращи помежду си. Bo вътрешните отделения на отделенията спускат електродите, а краищата на хартиените ленти във външните отделения (4), чиято основна част е поставена върху хоризонтална плоча с шипове (5), разположена в централната част на камерата. Между хоризонталната плоча и външното отделение на електродните отделения има пръчки (6),
Фиг.2. Схема на устройството за електрофореза с ниско напрежение
през които се хвърлят хартиени ленти и които служат за поддържането им. Под горния капак на камерата има плоча от плексиглас с големи кръгли отвори (7), върху която отгоре се поставят листове филтърна хартия, напоени с дестилирана вода и прегънати 4-5 пъти. Тези листове спомагат за увеличаване на херметичността на камерата и в резултат на това намаляват изпарението на течност от електроферограмите по време на електрофореза.
Използвайки хартиена електрофореза, учениците са помолени да отделят протеини от кръвен серум. Чрез този метод кръвният серум може да бъде разделен на 5 - 9 фракции и да се определи относителното съдържание на протеин във всяка от тях. Разделянето се извършва в буферен разтвор (pH 8,6 - 8,9) с градиент на потенциала 3 - 5 V/cm (120 - 350 V за ленти с дължина 40 - 45 cm) при стайна температура. Токът не трябва да надвишава 0,1 - 0,3 mA за всеки сантиметър от напречното сечение на хартиената лента. Увеличаването на силата на тока повече от 2 пъти е неприемливо, тъй като това ще доведе до прекомерно нагряване, значително увеличаване на изпарението и Vв крайна сметка - изгаряне на хартия
Реактиви:
1. Буферен разтвор. Може да се използва:
а) веронално-медикален буфер (pH 8,6): разтворете 10,32 gmedinal (натриева сол на veronal) в 300 ml дестилирана вода, добавете 1,84 gveronal, загрейте с разбъркване на водна баня до разтваряне и добавете вода до 1 литър;
б) веронал-ацетатен буфер (рН 8,6): 4,3 веронал, 0,95 натриев хидроксид и 3,24 натриев ацетат се разтварят в 300 ml дестилирана вода. Добавете 30 ml 0,1 М разтвор на HCl към разтвора и добавете вода до 1 литър;
c) Tris буфер (рН 8,9): 60,5 g Tris, 6 етилендиаминтетраоцетна и 4,6 g борна киселина се разтварят в 1 дестилирана вода.
2. Разтвори за оцветяване на електроферограми:
а) киселинно синьо-черно багрило (подобно на амидно черно 10 B) - 0,2 g смес: оцетна киселина (ледена) - 100 ml + метилов алкохол - 900 ml;
б) бромофенолово синьо - 0,5 g, живачен хлорид - 10 g, оцетна киселина (ледена) - 20 ml, дестилирана вода - 980 ml;
в) бромофенол синьо - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O - 50 g, оцетна киселина (ледена) 50 ml, дестилирана вода - 900 ml.
3. Разтвори за измиване на електроферограми от багрило, което не е свързано с протеина, и фиксиране на багрилото върху протеина:
а) оцетна киселина - 2% разтвор;
б) натриев ацетат - 2% разтвор, приготвен с 10% разтвор на оцетна киселина.
4. Разтвори за елуиране на оцветени продукти от електроферограми:
а) за извличане на бромофенол синьо -0,01 М разтвор на NaOH;
б) за извличане на киселото синьо-черно багрило -0,1 М разтвор на NaOH.
Оборудване: епруветки; кювети, спектрофотометър, уред за електрофореза, хроматографска хартия: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM и др.
Получаване на кръвен серум. 2 - 3 ml кръв се изтеглят в суха центрофужна епруветка и се оставят за 1/2 - 1 ч. С помощта на тънка стъклена пръчица внимателно оградете стените на епруветката, за да отделите съсирека от тях, центрофугирайте и изсипете серума в чиста тръба.
Подготовка на камерата.Електродните отделения се пълнят с буферен разтвор до същото ниво (за да се избегне преливане на буфера), приблизително 800 ml във всяко отделение. Bo вътрешните части на електродните отделения потапят електродите. Върху лист хроматографска хартия (18x45 cm) (когато използвате тънки видове хартия, по-добре е да нанесете проби на отделни ленти с ширина 4-5 cm) на разстояние 15 cm от една от тесните му страни, използвайте обикновен мек молив (графитът предотвратява разпръскването на течност), за да очертаете местата за нанасяне на проби. Те представляват правоъгълници (2 х 0,3 cm), чиито големи страни са перпендикулярни на дължината на хартиената лента. Разстоянието между началните зони и краищата на електроферограмата е 2 см. Електроферограмата се импрегнира с буфера, в който ще се извършва електрофорезата. За да направите това, той се изтегля през кювета с буферен разтвор. Краищата на хартиените ленти (6-8 см) не се мокрят. Излишният буфер се отстранява чрез попиване на лентите между два или три листа филтърна хартия. Мократа електроферограма се поставя в камерата върху централната хоризонтална плоча (5), а краищата се спускат във външните отделения на електродните отделения.Уредът се затваря плътно с капак, под който има листове филтърна хартия, навлажнени с вода.
Провеждане на електрофореза.След като хартиените ленти са напълно наситени с буферния разтвор, проби от 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg протеин) серум се нанасят върху маркираните зони с помощта на 0,1 ml пипета. Камерата се затваря с капак и се пуска ток. Продължителността на електрофорезата е 22 - 24 часа при напрежение 200 - 300 V
Фиксиране и оцветяване на електроферограми.В края на електрофорезата изключете тока и незабавно отстранете електроферограмите от устройството. Поставят се на специална поставка и се сушат на въздух на течение, след това в пещ при 105 ºC за 20 минути за фиксиране на белтъците върху хартия, след което се поставят в емайлирана кювета, напълват се с багрило и се оставят за 2 - 3 минути. часове или повече. Багрилото се отцежда и електроферограмите се измиват от излишъка му, като се заливат 3-4 пъти с 2% разтвор на оцетна киселина, всеки път за 5-10 минути. Участъците от хартия, които не съдържат протеин, трябва да бъдат напълно без боя. За фиксиране на оцветените продукти електроферограмите се напълват с 2% разтвор на натриев ацетат в продължение на 2 минути и се сушат на въздух под вакуум.
Определяне на съотношението на отделните протеинови фракции.При pH 8,6 серумните протеини са отрицателно заредени и се движат в електрическото поле към анода. Фракцията, която се движи най-бързо към анода, е албумин, последван от α 1 -, α 2 -, β- и γ-глобулини (виж Фиг. 3) . Участъци от хартиени ленти, върху които са се появили белтъчни петна, се разделят с напречни линии с обикновен молив на ивици с ширина 3-5 mm и се нарязват по тези линии. Всяка лента се раздробява и се поставя в отделна номерирана епруветка, напълва се с 3 ml 0,01 М разтвор на NaOH, оставя се за един час, за да се отстрани боята от хартията, след което се определя стойността на оптичната плътност за всеки разтвор на фотоколориметър ( спектрофотометър) при 612 nm.
Ориз. 3. Електроферограма на човешки кръвен серум и крива на разпределение на протеинови фракции
Паралелно се обработва контролна проба. За него се изрязва лента от неоцветените участъци на електроферограмата.
Въз основа на получените данни върху електроферограмата се начертава крива на разпределение на оцветените продукти.По абсцисната ос се отбелязват номерата на тръбите, а по ординатната ос - съответната стойност на оптичната плътност (виж фиг.3). . Изчислява се процентът на протеиновите фракции в кръвния серум. За да направите това, начертаната крива се разделя според минимумите на няколко секции, съответстващи на отделните фракции. Размерът на площта на всяка секция е пропорционален на количеството боя, комбинирано с протеина на дадена фракция. Съотношението между тези площи се изчислява по тегло (теглото на секциите хартия е пропорционално на тяхната площ), като цялата площ се приема за 100%. Ако имате денситометър, съотношението на протеиновите фракции в кръвния серум може да се определи от денситограма.
След предварително определяне на съдържанието на протеин в суроватката, количеството му се изчислява за всяка фракция.
