Peaaegu kõik biokeemilised reaktsioonid on ensümaatilised. Ensüümid(biokatalüsaatorid) on metalli katioonide poolt aktiveeritud valkained. Teada on umbes 2000 erinevat ensüümi ja neist on eraldatud umbes 150, millest osa kasutatakse ravimitena. Trüpsiini ja kümotrüpsiini kasutatakse bronhiidi ja kopsupõletiku raviks; pepsiin - gastriidi raviks; plasmiin - südameinfarkti raviks; Pankreatiin – kõhunäärme raviks. Ensüümid erinevad tavalistest katalüsaatoritest: a) suurema katalüütilise aktiivsuse poolest; b) kõrge spetsiifilisus, s.o. tegevuse selektiivsus.
Ühe substraadi ensümaatilise reaktsiooni mehhanismi saab kujutada järgmise diagrammiga:
kus E on ensüüm,
S - substraat,
ES - ensüüm-substraadi kompleks,
P on reaktsiooni produkt.
Ensümaatilise reaktsiooni esimese etapi tunnuseks on Michaelise konstant (K M). K M on tasakaalukonstandi pöördväärtus:
Michaelise konstant (K M) iseloomustab ensüümi-substraadi kompleksi (ES) stabiilsust. Mida madalam on Michaelise konstant (K M), seda stabiilsem on kompleks.
Ensümaatilise reaktsiooni kiirus on võrdne selle kiirust piirava etapi kiirusega:
kus k 2 on kiiruskonstant, nn pöörete arv või ensüümi molekulaarne aktiivsus.
molekulaarse ensüümi aktiivsus(k 2) on võrdne substraadi molekulide arvuga, mis läbivad transformatsioone ühe ensüümmolekuli mõjul 1 minuti jooksul temperatuuril 25 0 C. See konstant võtab väärtused vahemikus: 1,10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .
Ureaas, mis kiirendab uurea hüdrolüüsi, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; adenosiintrifosfataasi puhul, mis kiirendab ATP hüdrolüüsi, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; katalaasi jaoks, mis kiirendab H 2 O 2 lagunemist, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.
Ensümaatilise reaktsiooni kineetilist võrrandit ülaltoodud kujul on aga praktiliselt võimatu kasutada, kuna ensüümi-substraadi kompleksi kontsentratsiooni ei ole võimalik eksperimentaalselt määrata (). Väljendatuna muudes kogustes, mida on lihtne katseliselt määrata, saame ensümaatiliste reaktsioonide kineetilise võrrandi, helistas Michaelis-Menteni võrrandi järgi (1913):
,
kus korrutis k 2 [E] summa on konstantne väärtus, mida tähistatakse (maksimaalne kiirus).
Vastavalt: 
Vaatleme Michaelise-Menteni võrrandi erijuhtumeid.
1) Madala substraadi kontsentratsiooni korral K M >> [S], seega
mis vastab esimest järku reaktsiooni kineetilisele võrrandile.
2) Kõrge substraadi kontsentratsiooniga K m<< [S], поэтому
mis vastab nulljärku reaktsiooni kineetilisele võrrandile.
Seega suureneb substraadi madala kontsentratsiooni korral ensümaatilise reaktsiooni kiirus koos substraadi sisalduse suurenemisega süsteemis ja kõrge substraadi kontsentratsiooni korral jõuab kineetiline kõver platoole (reaktsiooni kiirus ei sõltu substraadi kontsentratsioonist) (joonis fig. . 30).
Joonis 30. - Ensümaatilise reaktsiooni kineetiline kõver
Kui [S] = K M, siis
mis võimaldab graafiliselt määrata Michaelise konstandi K m (joonis 31).
Joonis 31. - Michaelise konstandi graafiline määratlus
Ensüümide aktiivsust mõjutavad: (a) temperatuur, (b) söötme happesus, (c) inhibiitorite olemasolu. Temperatuuri mõju ensümaatilise reaktsiooni kiirusele käsitletakse peatükis 9.3.
Söötme happesuse mõju ensümaatilise reaktsiooni kiirusele on toodud joonisel 32. Maksimaalne ensüümi aktiivsus vastab optimaalsele pH väärtusele (pH opt).
Joonis 32. – Lahuse happesuse mõju ensüümi aktiivsusele
Enamiku ensüümide puhul langevad optimaalsed pH väärtused kokku füsioloogiliste väärtustega (7,3–7,4). Siiski on ensüüme, mille normaalseks toimimiseks on vaja tugevalt happelist (pepsiin - 1,5 - 2,5) või piisavalt aluselist keskkonda (arginaas - 9,5 - 9,9).
Ensüümi inhibiitorid- need on ained, mis hõivavad osa ensüümmolekulide aktiivsetest keskustest, mille tulemusena ensümaatilise reaktsiooni kiirus väheneb. Raskmetallide katioonid, orgaanilised happed ja muud ühendid toimivad inhibiitoritena.
11. loeng
Aatomi struktuur
Mõistel "aatom" on kaks definitsiooni. Atom on keemilise elemendi väikseim osake, mis säilitab oma keemilised omadused.
Atom on elektriliselt neutraalne mikrosüsteem, mis koosneb positiivselt laetud südamikust ja negatiivselt laetud elektronkihist.
Aatomiõpetus on läbinud pika arengutee. Atomismi arengu peamised etapid on järgmised:
1) loodusfilosoofiline staadium - aine aatomistruktuuri kontseptsiooni kujunemise periood, mida ei ole eksperimentaalselt kinnitatud (5. sajand eKr – 16. sajand pKr);
2) hüpoteesi kujunemise staadium aatomist kui keemilise elemendi väikseimast osakesest (XVIII-XIX sajand);
3) füüsikaliste mudelite loomise etapp, mis peegeldab aatomi ehituse keerukust ja võimaldab kirjeldada selle omadusi (20. sajandi algus)
4) atomismi tänapäevast staadiumi nimetatakse kvantmehaaniliseks. Kvantmehaanika on füüsika haru, mis uurib elementaarosakeste liikumist.
PLAAN
11.1. Tuuma ehitus. Isotoobid.
11.2. Aatomi elektronkihi kvantmehaaniline mudel.
11.3. Aatomite füüsikalis-keemilised omadused.
Tuuma ehitus. Isotoobid
Aatomituum on positiivselt laetud osake, mis koosneb prootonitest, neutronitest ja mõnedest teistest elementaarosakestest.
Üldtunnustatud seisukoht on, et tuuma peamised elementaarosakesed on prootonid ja neutronid. prooton (p) – on elementaarosake, mille suhteline aatommass on 1 amu ja suhteline laeng + 1. Neutron (n) – See on elementaarosake, millel puudub elektrilaeng ja mille mass on võrdne prootoni massiga.
99,95% aatomi massist on koondunud tuumas. Elementaarosakeste vahel on spetsiaalsed tuuma pikendusjõud, mis oluliselt ületavad elektrostaatilise tõukejõu.
Aatomi põhiomadus on tasu tema tuumad, võrdne prootonite arvuga ja ühtib elemendi aatomnumbriga keemiliste elementide perioodilisustabelis. Nimetatakse ühesuguse tuumalaenguga aatomite hulka (tüüpi). keemiline element. Looduses leidub elemente numbritega 1 kuni 92.
Isotoobid- need on sama keemilise elemendi aatomid, mis sisaldavad tuumas sama arvu prootoneid ja erinevat arvu neutroneid.
kus massiarv (A) on tuuma mass, z on tuuma laeng.
Iga keemiline element on isotoopide segu. Reeglina langeb isotoopide nimetus kokku keemilise elemendi nimetusega. Vesiniku isotoopide jaoks on aga kasutusele võetud erinimetused. Keemiline element vesinik on esindatud kolme isotoobiga:
Arv p Arv n
Protium N 1 0
Deuteerium D 1 1
Triitium T 1 2
Keemilise elemendi isotoobid võivad olla nii stabiilsed kui ka radioaktiivsed. Radioaktiivsed isotoobid sisaldavad tuumasid, mis lagunevad spontaanselt, vabastades osakesed ja energia. Tuuma stabiilsuse määrab selle neutron-prootoni suhe.
Organismi sattudes häirivad radionukliidid kõige olulisemad biokeemilised protsessid, vähendavad immuunsust ja määravad keha haigustele. Keha kaitseb end kiirguse mõjude eest, absorbeerides valikuliselt keskkonnast elemente. Stabiilsed isotoobid on radioaktiivsete isotoopide ees prioriteetsed. Teisisõnu, stabiilsed isotoobid blokeerivad radioaktiivsete isotoopide akumuleerumist elusorganismides (tabel 8).
S. Shannoni raamat “Nutrition in the Atomic Age” annab järgmised andmed. Kui võtta stabiilse isotoobi joodi blokeeriv annus ~100 mg hiljemalt 2 tundi pärast I-131 organismi sattumist, väheneb radiojoodi omastamine kilpnäärmes 90%.
Radioisotoope kasutatakse meditsiinis
teatud haiguste diagnoosimiseks,
· kõigi vähivormide raviks,
· patofüsioloogilisteks uuringuteks.
Tabel 8 – Stabiilsete isotoopide blokeeriv toime
Ensüümi kineetika uurib ensüümide poolt katalüüsitavate reaktsioonide kiirust sõltuvalt erinevatest tingimustest (kontsentratsioon, temperatuur, pH jne) nende interaktsioonil substraadiga.
Ensüümid on aga valgud, mis on tundlikud erinevate välismõjude mõjule. Seetõttu võetakse ensümaatiliste reaktsioonide kiiruse uurimisel arvesse peamiselt reageerivate ainete kontsentratsioone ning püütakse minimeerida temperatuuri, keskkonna pH, aktivaatorite, inhibiitorite ja muude tegurite mõju ning luua standardtingimused. Esiteks on see selle ensüümi söötme optimaalne pH väärtus. Teiseks soovitatakse võimalusel hoida temperatuuri 25°C. Kolmandaks saavutatakse ensüümi täielik küllastumine substraadiga. See punkt on eriti oluline, kuna substraadi madala kontsentratsiooni korral ei osale reaktsioonis kõik ensüümi molekulid (joonis 6.5, A), mis tähendab, et tulemus on maksimaalsest võimalikust kaugel. Katalüüsitud reaktsiooni suurim võimsus, kui muud tegurid on võrdsed, saavutatakse siis, kui iga ensüümi molekul osaleb transformatsioonis, s.o. ensüümi-substraadi kompleksi kõrge kontsentratsiooniga (joonis 6.5, V). Kui substraadi kontsentratsioon ei taga ensüümi täielikku küllastumist (joonis 6.5, b), siis ei saavuta kulgeva reaktsiooni kiirus maksimaalset väärtust.
Riis. 65.
A - madala substraadi kontsentratsiooniga; 6 - substraadi ebapiisava kontsentratsiooniga; V - kui ensüüm on substraadiga täielikult küllastunud
Ülaltoodud tingimustes mõõdetud ensümaatilise reaktsiooni kiirust ja ensüümi täielikku küllastumist substraadiga nimetatakse ensümaatilise reaktsiooni maksimaalne kiirus (V).
Tähistatakse ensümaatilise reaktsiooni kiirust, mis määratakse siis, kui ensüüm ei ole substraadiga täielikult küllastunud. v.
Ensüümkatalüüsi saab lihtsustada järgmise diagrammi abil:
kus F on ensüüm; S - substraat; FS - ensüümi-substraadi kompleks.
Selle protsessi iga etappi iseloomustab teatud kiirus. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse mõõtühik on substraadi moolide arv, mis on muundatud ajaühikus(sama kui tavalise reaktsiooni kiirus).
Ensüümi interaktsioon substraadiga viib ensüümi-substraadi kompleksi moodustumiseni, kuid see protsess on pöörduv. Edasi- ja tagasireaktsioonide kiirused sõltuvad reagentide kontsentratsioonist ja neid kirjeldatakse vastavate võrranditega:
Tasakaaluseisundis kehtib võrrand (6.3), kuna päri- ja tagasireaktsiooni kiirused on võrdsed.
Asendades edasi- (6.1) ja vastupidise (6.2) reaktsiooni kiiruse väärtused võrrandisse (6.3), saame võrdsuse:
Tasakaaluseisundit iseloomustab vastav tasakaalukonstant K p, võrdne otse- ja pöördreaktsioonide konstantide suhtega (6.5). Tasakaalukostandi pöördväärtust nimetatakse substraadi konstant K s , või ensüümi-substraadi kompleksi dissotsiatsioonikonstant:
Võrrandist (6.6) selgub, et substraadi konstant väheneb ensüümi-substraadi kompleksi suurte kontsentratsioonide korral, s.o. suure stabiilsusega. Järelikult iseloomustab substraadi konstant ensüümi ja substraadi afiinsust ning ensüümi-substraadi kompleksi moodustumise ja dissotsiatsiooni kiiruskonstantide suhet.
Ensüümi substraadiga küllastumise nähtust uurisid Leonor Michaelis ja Maud Mepten. Tulemuste matemaatilise töötluse põhjal tuletasid nad oma nime saanud võrrandi (6.7), millest on selge, et substraadi kõrge kontsentratsiooni ja madala substraadikonstandi väärtuse korral kaldub ensümaatilise reaktsiooni kiirus maksimumini. . See võrrand on aga piiratud, kuna see ei võta arvesse kõiki parameetreid:
Ensüüm-substraadi kompleks võib reaktsiooni ajal muutuda erinevates suundades:
- dissotsieeruvad lähteaineteks;
- muunduvad tooteks, millest ensüüm eraldub muutumatul kujul.
Seetõttu kirjeldada ensümaatilise protsessi üldist tegevust, mõistet Michaelise konstandid K t, mis väljendab ensümaatilise katalüüsi kõigi kolme reaktsiooni kiiruskonstantide vahelist seost (6.8). Kui mõlemad liikmed jagada ensüümi-substraadi kompleksi moodustumise reaktsioonikiiruse konstandiga, saame avaldise (6.9):
Võrrandist (6.9) tuleneb oluline tagajärg: Michaelise konstant on alati summa võrra suurem kui substraadi konstant k 2 /k v
Numbriliselt K t võrdne substraadi kontsentratsiooniga, mille juures reaktsioonikiirus on pool maksimaalsest võimalikust kiirusest ja vastab ensüümi küllastumisele substraadiga, nagu joonisel fig. 6,5, b. Kuna praktikas ei ole alati võimalik saavutada ensüümi täielikku küllastumist substraadiga, siis just K t kasutatakse ensüümide kineetiliste omaduste võrdlevaks iseloomustamiseks.
Ensümaatilise reaktsiooni kiirus, kui ensüüm ei ole substraadiga täielikult küllastunud (6.10), sõltub ensüümi-substraadi kompleksi kontsentratsioonist. Proportsionaalsuskoefitsient on ensüümi ja produkti vabanemise reaktsioonikonstant, kuna see muudab ensüümi-substraadi kompleksi kontsentratsiooni:
Pärast transformatsioone, võttes arvesse ülaltoodud sõltuvusi, kirjeldatakse ensümaatilise reaktsiooni kiirust, kui ensüüm ei ole substraadiga täielikult küllastunud, võrrandiga (6.11), s.o. sõltub ensüümi, substraadi kontsentratsioonist ja nende afiinsusest K s:
Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse graafiline sõltuvus substraadi kontsentratsioonist ei ole lineaarne. Nagu jooniselt fig. 6.6, substraadi kontsentratsiooni suurenemisega täheldatakse ensüümi aktiivsuse suurenemist. Kui aga saavutatakse ensüümi maksimaalne küllastumine substraadiga, muutub ensümaatilise reaktsiooni kiirus maksimaalseks. Seetõttu on reaktsiooni kiirust piiravaks teguriks ensüümi-substraadi kompleksi moodustumine.
Praktika on näidanud, et substraadi kontsentratsioone väljendatakse reeglina väärtustes, mis on palju väiksemad kui ühik (10 6–10 3 mol). Selliste kogustega on arvutustes üsna raske opereerida. Seetõttu tegid G. Lineweaver ja D. Burke ettepaneku väljendada ensümaatilise reaktsiooni kiiruse graafilist sõltuvust mitte otsestes, vaid pöördkoordinaatides. Nad lähtusid eeldusest, et võrdsete koguste korral on ka nende pöördväärtused võrdsed:
Riis. 6.6.
Pärast avaldise (6.13) teisendamist saame avaldise nimega Lineweaveri-Burki võrrand (6.14):
Lineweaveri-Burki võrrandi graafiline sõltuvus on lineaarne (joonis 6.7). Ensüümi kineetilised omadused määratakse järgmiselt:
- ordinaatteljel ära lõigatud segment on võrdne 1/V;
- abstsissteljelt ära lõigatud segment on võrdne -1-ga /To t.
Riis. 6.7.
Arvatakse, et Lineweaver-Burki meetod võimaldab määrata maksimaalse reaktsioonikiiruse täpsemalt kui otsestes koordinaatides. Sellelt graafikult saab koguda ka väärtuslikku teavet ensüümi inhibeerimise kohta.
Michaelise-Menteni võrrandi teisendamiseks on ka teisi viise. Graafilisi sõltuvusi kasutatakse erinevate välismõjude mõju uurimiseks ensümaatilisele protsessile.
See ensümoloogia haru uurib erinevate tegurite mõju ensümaatilise reaktsiooni kiirusele. Arvestades ühe substraadi üheks produktiks muundamise pöörduva reaktsiooni ensümaatilise katalüüsi üldvõrrandit (1),
Peamised ensümaatilise reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid tuleks nimetada: substraadi kontsentratsioon [S], ensüümi kontsentratsioon [E] ja reaktsiooniprodukti kontsentratsioon [P].
Mõnede ensüümide koostoimet nende substraadiga saab kirjeldada hüperboolse kõveraga, mis näitab ensümaatilise reaktsiooni kiiruse V sõltuvust substraadi kontsentratsioonist [S] (joonis 19):
Joonis 19. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus substraadi kontsentratsioonist.
Sellel kõveral saab eristada kolme sektsiooni, mida saab seletada ensüümi ja substraadi interaktsiooni mehhanismi sätetega: OA - V otseselt proportsionaalse sõltuvuse lõik [S]-st, ensüümi aktiivsetest keskustest. täidetakse järk-järgult substraadi molekulidega, moodustades ebastabiilse kompleksi ES; lõik AB - V kõverjooneline sõltuvus [S]-st, ensüümi aktiivsete tsentrite täielik küllastumine substraadi molekulidega ei ole veel saavutatud. ES-kompleks on enne üleminekuolekusse jõudmist ebastabiilne, pöörddissotsiatsiooni tõenäosus E ja S suhtes on endiselt suur; lõik BC - sõltuvust kirjeldatakse nulljärku võrrandiga, lõik on paralleelne [S] teljega, on saavutatud aktiivsete ensüümide täielik küllastumine substraadi molekulidega, V=V max.
Kõvera iseloomulikku kuju kirjeldab matemaatiliselt Briggsi-Haldane'i võrrand:
V=V max ● [S]/Km + [S] (2),
kus Km on Michaelis-Menteni konstant, mis on arvuliselt võrdne substraadi kontsentratsiooniga, mille juures ensümaatilise reaktsiooni kiirus on võrdne poole V max.
Mida madalam on ensüümi K m, seda suurem on ensüümi afiinsus substraadi suhtes, seda kiiremini saavutatakse substraadi üleminekuseisund ja see muutub reaktsioonisaaduseks. Iga rühmaspetsiifilise ensüümi substraadi Km väärtuste leidmine on oluline selle ensüümi bioloogilise rolli määramisel rakus.
Enamiku ensüümide puhul on võimatu koostada hüperboolset kõverat (joonis 19) Sel juhul kasutatakse topeltpöördumiste meetodit (Lineweaver-Burk), s.o. joonistatakse 1/[V] graafiline sõltuvus 1/[S]-st (joonis 20). Selliste kõverate konstrueerimise meetod katses on väga mugav, kui uuritakse erinevat tüüpi inhibiitorite mõju ensüümi aktiivsusele (vt tekstist lähemalt).
Joonis 20. Graafik 1/[V] versus 1/[S] (Lineweaver-Burki meetod),
kus y on lõikelõik - ja x on lõikelõik - 
, nurga α - puutuja.
Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse V sõltuvus ensüümi kontsentratsioonist [E].
Seda graafilist sõltuvust (joonis 21) arvestatakse keskkonna optimaalse temperatuuri ja pH juures, substraadi kontsentratsioonidel, mis on oluliselt kõrgemad kui ensüümi aktiivsete tsentrite küllastuskontsentratsioon.
Riis. 21. Ensüümide kontsentratsiooni mõju ensümaatilise reaktsiooni kiirusele.
Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus kofaktori või koensüümi kontsentratsioonist. Komplekssete ensüümide puhul tuleb arvestada, et vitamiinide koensüümvormide vaegus hüpovitaminoosi korral ja metalliioonide kehasse sisenemise rikkumine viib tingimata vastavate ensüümide kontsentratsiooni vähenemiseni, mis on vajalikud kursuse jaoks. ainevahetusprotsessidest. Seetõttu tuleks järeldada, et ensüümi aktiivsus sõltub otseselt kofaktori ehk koensüümi kontsentratsioonist.
Toote kontsentratsiooni mõju ensümaatilise reaktsiooni kiirusele. Inimkehas toimuvate pöörduvate reaktsioonide puhul tuleb arvestada, et otsereaktsiooni saadusi saab ensüüm kasutada pöördreaktsiooni substraatidena. Seetõttu sõltuvad voolu suund ja Vmax saavutamise hetk algsete substraatide ja reaktsioonisaaduste kontsentratsioonide suhtest. Näiteks alaniini aminotransferaasi aktiivsus, mis katalüüsib transformatsiooni:
Alaniin + alfa-ketoglutaraat ↔ püruvaat + glutamaat
oleneb rakus kontsentratsioonisuhtest:
[alaniin + alfa-ketoglutaraat] / [püruvaat + glutamaat].
ENSÜÜMI TOIMIMISMEHHANISM. ENSÜÜMKATALÜÜSI TEOORIAD
Ensüümid, nagu ka mittevalgulised katalüsaatorid, suurendavad keemilise reaktsiooni kiirust tänu nende võimele alandada selle reaktsiooni aktiveerimisenergiat. Ensümaatilise reaktsiooni aktivatsioonienergia arvutatakse üleminekuseisundisse jõudnud toimuva reaktsiooni süsteemis oleva energiaväärtuse ja reaktsiooni alguses määratud energia erinevusena (vt graafilist sõltuvust joonisel 22).
Riis. 22. Ensüümita (1) ja ensüümi (2) juuresolekul toimuva keemilise reaktsiooni energeetilise oleku graafiline sõltuvus reaktsiooni ajast.
V. Henry ja eelkõige L. Michaelise, M. Menteni tööd monosubstraadi pöörduvate ensümaatiliste reaktsioonide mehhanismi uurimisel võimaldasid oletada, et ensüüm E ühineb kõigepealt pöörduvalt ja suhteliselt kiiresti oma substraadiga S, moodustades ensüüm-substraadi kompleks (ES):
E+S<=>ES (1)
ES moodustumine toimub vesiniksidemete, elektrostaatiliste, hüdrofoobsete interaktsioonide, mõnel juhul kovalentsete koordinatsioonisidemete tõttu aktiivse tsentri aminohappejääkide külgradikaalide ja substraadi funktsionaalrühmade vahel. Komplekssetes ensüümides võib substraadiga kokkupuute funktsiooni täita ka struktuuri mittevalguline osa.
Ensüüm-substraadi kompleks laguneb seejärel teises, aeglasemas, pöörduvas reaktsioonis, saades reaktsiooniprodukti P ja vaba ensüümi E:
ES<=>EP<=>E + P (2)
Praegu on tänu ülalnimetatud teadlaste, aga ka Keilin D., Chance B., Koshland D. tööle (indutseeritud kirjavahetuse teooria) olemas teoreetilised sätted toimemehhanismi nelja põhipunkti kohta. ensüümi substraadil, mis määravad ensüümide võime kiirendada keemilisi reaktsioone:
1. Orienteerumine ja lähenemine . Ensüüm on võimeline siduma substraadi molekuli nii, et ensüümi poolt rünnatav side ei asu mitte ainult katalüütilise rühma vahetus läheduses, vaid on ka selle suhtes õigesti orienteeritud. Tõenäosus, et ES-kompleks jõuab orientatsiooni ja läheduse kaudu üleminekuolekusse, suureneb oluliselt.
2. Stress ja pinge : indutseeritud kirjavahetus. Substraadi kinnitumine võib põhjustada ensüümi molekulis konformatsioonilisi muutusi, mis põhjustavad pingeid aktiivse tsentri struktuuris ning samuti mõnevõrra deformeerivad seotud substraati, hõlbustades seeläbi ES-kompleksi üleminekuseisundi saavutamist. Molekulide E ja S vahel tekib nn indutseeritud vastavus.
ENSÜMATIIVSETE REAKTSIOONIDE KINETIKA
Vfr määratakse aine koguse järgi, mis muundatakse ajaühikus. Nende reaktsioonide V aste sõltub välistegurite mõjust (temperatuur, pH, kokkupuude looduslike ja võõrühenditega jne).
Vfr on katalüütilise aktiivsuse mõõt ja seda nimetatakse lihtsalt ensüümi aktiivsuseks.
Ensüümi aktiivsust saab mõõta ainult kaudselt:
1) konverteeritud S koguse järgi;
2) kontsentratsiooni P tõus ajaühikus.
Ensüümide kontsentratsiooni väljendamiseks kasutage:
a) ensüümide mõõtühik on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 µmol S muundamist minutis. [µmol/min];
b) 1 katal (cat) - ensüümide kogus, mis on võimeline muutma 1 mooli S-i 1 sekundi jooksul P-ks. [mol/s].
1 kass \u003d 6 × 107E; 1E = 16,67 (n kat)
Ensüümide aktiivsuse väljendamiseks kasutage:
a) ensüümide eriaktiivsus on ensüümide arv 1 mg kohta või kasside arv. 1 kg valgu kohta;
b) molekulaarne aktiivsus ehk käibearv on molekulide S arv, mis muunduvad ühe molekuli E võrra 1 minutis.
Üks erütrotsüütide katalaasi molekul lagundab 1 minuti jooksul 5 × 106 H2O2 molekuli.
Ensüümi toime spetsiifilisus
ES-kompleksi ja ACP mõiste on tihedalt seotud ensüümide erilise omadusega – nende spetsiifilisusega. Vastavalt spetsiifilisuse astmele (kahanevas järjekorras) on:
I. Stereokeemiline substraadi spetsiifilisus – sel juhul katalüüsivad ensüümid ainult 1 S vormi (1 isomeer). Näiteks fumaraathüdrataas katalüüsib ainult fumaarhappe muundumist, kuid ei katalüüsi selle isomeeri, maleiinhappe muundamist.
II. Absoluutne substraadi spetsiifilisus – E muundab ainult 1S. Näiteks muundab ureaas ainult uureat.
III. Absoluutne rühma S spetsiifilisus. Ensüümid toimivad sarnaste S-b rühmadele. Näiteks alkoholi DG muundab mitte ainult etanooli, vaid ka teisi alifaatseid alkohole.
IV. Suhtelise rühma S spetsiifilisus. Ensüüm ei toimi mitte S-molekulide rühmale, vaid teatud S-rühmade teatud sidemetele. Näiteks pepsiin ja trüpsiin on spetsiifilised erinevate valkude peptiidsidemetele.
V. Suhteline S spetsiifilisus. Ensüüm katalüüsib, muutudes erinevatesse keemiliste ühendite rühmadesse kuuluvaks S-b-ks. Näiteks ensüüm tsütokroom-450 katalüüsib kuni 7000 erineva S-b hüdroksüülimisreaktsioone. See on kõige vähem spetsiifiline ensüümsüsteem.
Ensüümide spetsiifilisuse selgitamiseks on kaks teooriat.
E. Fisheri hüpotees on „võtme ja luku“ hüpotees või „malli“ hüpotees. Fischeri sõnul on ensüüm jäik struktuur, mille ACP on täpne S. Kui S sobib E-ga nagu luku võti, siis tekib reaktsioon. Kui S on veidi muudetud ("võti"), siis see ei vasta ACF-ile ("lukk") ja reaktsioon muutub võimatuks. Kuigi see seletus on loogiline, ei selgita Fisheri hüpotees, millel siis põhinevad absoluutne ja suhteline rühmaspetsiifilisus. Näiteks tsütokroom-450 kombineerib nii suure hulga S-b, erineva struktuuriga.
Neid väliseid vastuolusid selgitab Koshlandi hüpotees ehk sunnitud vastavuse hüpotees. Koshlandi sõnul ei ole ensüümi molekul "jäik", vaid paindlik, ensüümi ja selle ACP struktuur ja konfiguratsioon hakkavad muutuma hetkest, mil ensüüm kinnitub S-i või muude ligandide külge. E-S kompleksi tekkimisel tekib lisaks geomeetrilisele komplementaarsusele ka elektrostaatiline komplementaarsus, mis tekib vastaslaenguga molekulide E ja S paaristumise tõttu. Tegelikkuses toimuvad ilmselt mõlemad liitmise variandid.
Koshlandi hüpotees võimaldab meil selgitada, miks S-in lähedaste analoogide transformatsioon toimub. Kui "vale" substraat (kvaasi-S) erineb looduslikust ja ACP omandab tõelise substraadi lähedase konformatsiooni, võimaldab katalüütiliste rühmade paigutus sellises E-S kompleksis reaktsiooni toimuda. Näib, et ensüüm ei märka seda "pettust", kuigi reaktsioon ei kulge nii kiiresti kui tõelise substraadiga. Kui kvaasisubstraadi konfiguratsioon ei võimalda katalüütilise rühma õiget positsioneerimist, siis sel juhul reaktsioon ei toimu. Need. kui konformatsiooniliste ümberkorralduste hulk on piiratud ühe võimaliku ühega, siis on ensüüm ülispetsiifiline ja kui ACP ümberkorraldamise võimalused on suured, siis toimib ensüüm ka kvaasi-substraatidel.
Vfr sõltuvus pH keskkonnast
Igal ensüümil on oma optimaalne pH, mille juures Vfr on maksimaalne. PH hälve ühes või teises suunas viib ensüümi aktiivsuse vähenemiseni. Enamiku ensüümide pH on ~7,0, see tähendab, et see langeb kokku füsioloogiliste pH väärtustega.
Optimaalse pH väärtuse korral on ACP ja S enda funktsionaalrühmad sidumiseks kõige eelistatumal kujul. Mõnel ensüümil on optimaalne pH, mis erineb järsult füsioloogilistest väärtustest, pepsiin on 100% aktiivne pH = 1,5-2,5 juures; arginaas – pH = 10 juures.
Vfr sõltuvus temperatuurist
Keskkonnatemperatuuri tõustes suureneb Vfr, saavutades enamiku ensüümide jaoks optimaalsed väärtused ~ 20-40ºС.
Ensüümide termolabiilsus on seotud nende valgu struktuuriga: kui temperatuur tõuseb 40-50ºC ja kõrgemale, denatureeritakse.
Mõnede ensüümide puhul toimub denaturatsioon temperatuuril 0 °C.
Mis tahes keemiliste reaktsioonide korral, kui temperatuur tõuseb iga 10 ° C võrra, suureneb reaktsiooni V 2-3 korda; ensümaatiliste reaktsioonide korral on see koefitsient madalam - 2 või isegi vähem. Erand: termostabiilne ensüüm adenümaattsüklaas talub 100 ºC temperatuuri ja ensüüm katalaas on aktiivne 0 ºC juures.
Vfr sõltuvus kontsentratsioonist. S.
Ensüümide toimemehhanismi kirjeldab Michaelis-Menteni võrrand. Saate graafiliselt määrata Vfr sõltuvuse [S]-st.
a) Michaelise kõvera järgi: mida väiksem Km, seda suurem on Vm ja seda suurem on E afiinsus S suhtes.
Vmax vastab ensüümi S mahu täieliku küllastumise olekule.
lahuses on liig E (3 mol S, 5 mol E) ensüümi S mahu küllastumise koht.
b) Lainciver-Burki vastastikune meetod, kus Vfr sõltuvus [S]-st arvutatakse pöördsuurustes.
Ensüümide aktiivsuse reguleerimine.
Ensüümid on kontrollitud aktiivsusega katalüsaatorid, seega saab Vfr-i kontrollida ensüümide kaudu. Aktiivsuse reguleerimine võib toimuda ensüümide interaktsiooni kaudu erinevate bioloogiliste komponentide või võõrühenditega (ravimid, mürgid), mida nimetatakse modifikaatoriteks. Kui modifikaatori juuresolekul Vfr suureneb, nimetatakse selliseid modifikaatoreid aktivaatoriteks ja kui see väheneb, siis inhibiitoriteks.
Ensüümide aktiveerimine.
Ensüümide aktiveerimist on mitut tüüpi.
1. Aktiveerimine ensüümmolekulide subühikutele toimides. Mõnel ensüümil on SN kahe allüksuse kujul: katalüütiline ja reguleeriv. CW salvestamisel on ACF peidetud.
Näiteks toodetakse paljusid ensüüme kehas proensüümide või sümogeenidena, st mitteaktiivses olekus. Vajadusel aktiveeritakse teatud arv neist. Näiteks inaktiivne trüpsinogeen muudetakse ensüümi enterokinaasi toimel aktiivseks trüpsiiniks.
2. Ioonid mõjutavad ensüümide aktiveerimist:
a) katioonid – nende toime on spetsiifilisem kui anioonid. Katioonid ise võivad toimida proteesrühmadena ensüümides (Fe tsütokroomis) või oma olemasoluga mõjutada ensüümi, aktiveerides seda. Näiteks karboanhüdraas aktiveerub Zn+2 juuresolekul.
b) anioonid - toimivad vähem spetsiifiliselt ja mõjutavad tavaliselt d.f. 2. etappi. – ES kompleksi lagunemine. Mõnikord on anioonid aga ensüümide otsesed aktivaatorid. Näiteks Cl– aktiveerib mitteaktiivse pepsinogeeni ja muudab selle aktiivseks pepsiiniks.
3. Aktiveerimine kaitstes ensüüme erinevate mõjude inaktiveeriva mõju eest. Varustatud spetsiifiliste ainetega, mis takistavad negatiivset mõju ensüümidele.
Ensüümi pärssimine.
Aineid, mis põhjustavad ensüümide osalist või täielikku inhibeerimist, nimetatakse inhibiitoriteks (I). Inhibiitoritel on omadus seostuda tihedalt ensüümiga. Selle põhjal eristatakse inhibeerimist: pöörduv ja pöördumatu.
Pöörduva inhibeerimise korral interakteeruvad I ja E. Kui inhibiitor kuidagi neutraliseeritakse (näiteks dialüüsiga), siis E aktiivsus taastub. Kui seda ei ole võimalik saavutada, siis räägime pöördumatust pärssimisest.
Pöörduv inhibeerimine
konkurentsivõimeline mittekonkureeriv
Konkurentsi inhibeerimist võivad põhjustada ained, mille struktuur sarnaneb tõelise S omaga.
I ja S võistlevad ACP pärast ning kompleks ensüümiga moodustab ühendi, millel on rohkem molekule. Ensüümiga seondub kas I või S; sellise inhibeerimise korral kehtib võrrand: .
Konkurentsi inhibeerimise käigus ei moodustu MITTE KUNAGI kolmekomponentset E S I kompleksi, mistõttu seda tüüpi inhibeerimine erineb teistest.
Näiteks suktsinaadi peadirektoraat kuulub farmidesse. CTC süsteemid. Selle looduslik S on suktsinaat. Inhibiitorid võivad olla oksaloatsetaat, malonaat (kvaasi-substraadid).
Kui inhibiitor on liias, seondub see polariseeritud rühmadena ACP suktsinaadi DG-ga.
Võistleva inhibeerimise korral ei muutu Vmax kunagi, kuid Km muutub. Kõverate kalle I juuresolekul suureneb, mille tulemusena Km suureneb
Michaelis-Menteni kõverat kasutava katse tulemuste põhjal on võimalik kindlaks teha I konkureeriv olemus (suurendades Km ja Vmax stabiilsust). Selle kõvera olemus näitab ka, et protsess on pöörduv, st suurendades [S], saab Vmax-i saavutamise aega vähendada.
Konkurentsi pärssimise meetod on leidnud laialdast rakendust meditsiinipraktikas.
Para-aminobensoehappel ja sulfoonamiidil on sarnane struktuur. Bakterirakk kasutab p-ABA-d foolhappe sünteesimiseks, mis on bakteriensüümide komponent. S/a blokeerib foolhapet sünteesivate ensüümide toimet, mistõttu bakterite kasv peatub.
Mittekonkureeriv inhibeerimine on pöörduv inhibeerimine, kui ma ei interakteeru mitte ACP-ga, vaid teiste ensüümide funktsionaalsete rühmadega, see tähendab, et antud juhul ei ole mul struktuurilist sarnasust S-ga. Sellise inhibiitori lisamine vähendab ensüümi aktiivsust. ja mitte selle afiinsus S suhtes, see tähendab, et inhibiitor ei muuda Km, vaid vähendab max. Vfr.
Seda tüüpi inhibeerimisega tekivad inaktiivsed madala dissotsiatsiooniga kompleksid E I või E I S. Näiteks HCN, teiste keemiliste ühendite toime, mis seovad Me ioone või muid ensüümi molekulis olevaid funktsionaalrühmi.
Segatud inhibeerimine (või osaliselt mittekonkureeriv tüüp) - Vmax vähenemine kombineeritakse Km suurenemisega.
Sel juhul moodustub E I S kompleks ja selles sisalduv S läbib aeglase katalüütilise transformatsiooni.
Substraadi inhibeerimine on Vfr vähenemine koos [S] olulise suurenemisega. Esialgu [S] suurenemisega Vfr suureneb, saavutades maksimumi, kuid [S] edasise suurenemisega hakkab Vfr langema.
Liigse S inhibeeriva toime mehhanism on mitmekesine. Enamasti on see vaheühendite ES interaktsioon ühe või mitme S molekuliga, mille tulemusena moodustub inaktiivne ühend,
on kompleks, mis ei tooda reaktsiooniprodukte.
Ensüümide aktiivsuse reguleerimise meetodid
Elusorganismis toimuvad samaaegselt tuhandete erinevate ainete sünteesi-, lagunemis- ja vastastikuse muundamise reaktsioonid. Kõiki neid paljusid reaktsioone reguleeritakse kehas erinevate mehhanismide kaudu, millest olulisemad on:
a) tagasiside tüüpi regulatsioon; iseloomulik sünteesireaktsioonidele. Reaktsiooniproduktide kogunemine üle lubatud taseme avaldab protsessi esimesele etapile tugevat pärssivat toimet:
b) ensüümi aktiivsuse allosteeriline regulatsioon - iseloomulik ainult spetsiaalsele SN-ga ensüümide rühmale, millel on allosteeriliste efektorite sidumiseks reguleerivad keskused. Negatiivsed efektorid pärsivad S konversiooni ja toimivad allosteeriliste inhibiitoritena. Positiivsed efektorid, vastupidi, kiirendavad Vfr-i, seetõttu klassifitseeritakse need allosteerilisteks aktivaatoriteks.
Allosteeriliste inhibiitorite toimemehhanism ensüümile seisneb selle ensüümi ACP muutmises. Vfr vähenemine on kas Km suurenemise või Vmax vähenemise tagajärg samade S küllastuskontsentratsioonide korral. Allosteerilised aktivaatorid, vastupidi, hõlbustavad S muundumist ACP-ks, millega kaasneb kas Km vähenemine või Vmax suurenemine.
Kompartmentaliseerimine on nähtus, mille puhul kasutatakse membraane ruumiliseks eraldamiseks
a) ensüüm oma S-st (näiteks lüsomaalsed ensüümid ainetest, millele nad tsütoplasmas toimivad);
b) protsessid, mis on samal ajal vastastikku kokkusobimatud. Rasvhapete süntees toimub tsütoplasma lahustuvas osas ja rasvhapete lagunemine toimub mitokondrites.
Ensümaatiliste reaktsioonide kineetika. See ensümoloogia haru uurib keemiliste ja füüsikaliste tegurite mõju ensümaatiliste reaktsioonide kiirusele. 1913. aastal lõid Michaelis ja Menten ensümaatilise kineetika teooria, mis põhineb asjaolul, et ensüüm (E) interakteerub substraadiga (S), moodustades vahepealse ensüümi-substraadi kompleksi (ES), mis laguneb edasi ensüümiks ja reaktsiooniprodukt vastavalt võrrandile:
Substraadi ja ensüümi vahelise interaktsiooni iga etappi iseloomustavad oma kiiruskonstandid. Ensüüm-substraadi kompleksi lagunemise kiiruskonstantide summa ja ensüüm-substraadi kompleksi moodustumise kiiruskonstandi suhet nimetatakse Michaelise konstandiks (Km). Need määravad ensüümi afiinsuse substraadi suhtes. Mida madalam on Michaelise konstant, seda suurem on ensüümi afiinsus substraadi suhtes, seda suurem on reaktsiooni kiirus, mida see katalüüsib. Km väärtuse põhjal võib katalüütilised reaktsioonid jagada kiireteks (Km 106 mol/l või vähem) ja aeglasteks (Km 102 kuni 106).
Ensümaatilise reaktsiooni kiirus sõltub temperatuurist, reaktsioonikeskkonnast, reagentide kontsentratsioonist, ensüümi kogusest ja muudest teguritest.
1. Vaatleme reaktsioonikiiruse sõltuvust ensüümi kogusest. Kui substraati on liiga palju, on reaktsiooni kiirus võrdeline ensüümi kogusega, kuid ensüümi ülemäärase koguse korral reaktsioonikiiruse suurenemine väheneb, kuna substraati pole enam piisavalt.
2. Keemiliste reaktsioonide kiirus on võrdeline reageerivate ainete kontsentratsiooniga (massimõju seadus). See seadus kehtib ka ensümaatiliste reaktsioonide kohta, kuid teatud piirangutega. Pidevalt
Ensüümi suurtes kogustes on reaktsiooni kiirus tõepoolest proportsionaalne substraadi kontsentratsiooniga, kuid ainult madalate kontsentratsioonide piirkonnas. Substraadi kõrge kontsentratsiooni korral küllastub ensüüm substraadiga, see tähendab, et saabub hetk, mil kõik ensüümi molekulid on juba katalüütilises protsessis osalenud ja reaktsioonikiirus ei suurene. Reaktsioonikiirus saavutab maksimumtaseme (Vmax) ja ei sõltu seejärel enam substraadi kontsentratsioonist. Reaktsioonikiiruse sõltuvus substraadi kontsentratsioonist tuleks määrata kõvera selles osas, mis on alla Vmax. Tehniliselt on lihtsam määrata mitte maksimaalset kiirust, vaid ½ Vmax. See parameeter on ensümaatilise reaktsiooni peamine omadus ja võimaldab määrata Michaelise konstandi (Km).
Km (Michaelisi konstant) on substraadi kontsentratsioon, mille juures ensümaatilise reaktsiooni kiirus on pool maksimumist. Sellest tuletame ensümaatilise reaktsiooni kiiruse Michaelise-Menteni võrrandi.
