Valkude eraldamine madala molekulmassiga lisanditest
Membraansõela meetod (dialüüs)
Kasutatakse dialüüsimembraani, mis on polümeer ja millel on teatud suurusega poorid. Väikesed molekulid (madala molekulmassiga lisandid) läbivad membraanis olevaid poore ja suured molekulid (valgud) jäävad alles. Nii pestakse valgud lisanditest ära.
Valkude eraldamine molekulmassi järgi
Geelkromatograafia
Kromatograafia kolonn on täidetud geelgraanulitega (Sephadex), millel on teatud suurusega poorid. Kolonnile lisatakse valkude segu. Valgud, mille suurus on väiksem kui Sephadexi pooride suurus, jäävad kolonni, kuna need on pooridesse kinni jäänud, ülejäänud aga väljuvad kolonnist vabalt. Valgu suurus sõltub selle molekulmassist.
Ultratsentrifuugimine
See meetod põhineb erineva tihedusgradiendiga lahustes (sahharoosipuhver või tseesiumkloriid) valkude molekulide settimise (sadestamise) kiirustel.
Elektroforees
See meetod põhineb erinevatel valkude ja peptiidide migratsiooni kiirustel elektriväljas sõltuvalt laengust.
Geelid, tselluloosatsetaat ja agar võivad olla elektroforeesi kandjateks. Eraldatavad molekulid liiguvad geelis olenevalt nende suurusest: suured molekulid liiguvad geeli pooride kaudu edasi. Väiksemad molekulid puutuvad kokku vähem vastupanuga ja liiguvad seetõttu kiiremini. Selle tulemusena on suured molekulid pärast elektroforeesi alguspunktile lähemal kui väiksemad.
Elektroforeesi saab kasutada valkude eraldamiseks molekulmassi järgi. Selleks kasutatakse PAGE elektroforeesi naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS-Na) juuresolekul.
DDS-Na on difiilne aine ja sisaldab laetud rühma ja hüdrofoobset rühma. Valgud seonduvad hüdrofoobsete radikaalidega SDS-Na-ga ja denatureeritakse. Sel viisil on valgud kuju ja laengu poolest joondatud. Pärast seda sõltub valgu liikuvus elektroforeesi ajal ainult selle molekulmassist.
väljasoolamine: sadestamine leelissoolade, leelismuldmetallide (naatriumkloriid, magneesiumsulfaat), ammooniumsulfaadiga; valgu esmane struktuur ei ole häiritud;
ladestumine: vett eemaldavate ainete kasutamine: alkohol või atsetoon madalal temperatuuril (umbes –20 С).
Nende meetodite kasutamisel kaotavad valgud oma hüdratatsioonikihi ja sadestuvad lahuses.
Denatureerimine- valkude ruumilise struktuuri rikkumine (säilitatakse molekuli esmane struktuur). See võib olla pöörduv (valgu struktuur taastub pärast denatureeriva aine eemaldamist) või pöördumatu (molekuli ruumiline struktuur ei taastu, näiteks valkude sadestamisel kontsentreeritud mineraalhapete, raskmetallide sooladega).
Valkude eraldamise meetodid Valkude eraldamine madala molekulmassiga lisanditest
Dialüüs
Kasutatakse spetsiaalset polümeermembraani, millel on teatud suurusega poorid. Väikesed molekulid (madala molekulmassiga lisandid) läbivad membraanis olevaid poore ja suured molekulid (valgud) jäävad alles. Seega pestakse valgud lisanditest ära.
Valkude eraldamine molekulmassi järgi
Geelkromatograafia
Kromatograafia kolonn on täidetud geelgraanulitega (Sephadex), millel on teatud suurusega poorid. Kolonnile lisatakse valkude segu. Valgud, mille suurus on väiksem kui Sephadexi pooride suurus, jäävad kolonni, kuna need on pooridesse kinni jäänud, ülejäänud aga väljuvad kolonnist vabalt (joonis 2.1). Valgu suurus sõltub selle molekulmassist.
Riis. 2.1. Valkude eraldamine geelfiltrimisega
Ultratsentrifuugimine
See meetod põhineb erineva tihedusgradiendiga lahustes (sahharoosipuhver või tseesiumkloriid) valgu molekulide settimise (sadestamise) erinevatel kiirustel (joonis 2.2).
Riis. 2.2. Valkude eraldamine ultratsentrifuugimisega
Elektroforees
See meetod põhineb erinevatel valkude ja peptiidide migratsiooni kiirustel elektriväljas sõltuvalt laengust.
Geelid, tselluloosatsetaat ja agar võivad olla elektroforeesi kandjateks. Eraldatud molekulid liiguvad geelis olenevalt nende suurusest: suuremad molekulid jäävad geeli pooride läbimisel edasi. Väiksemad molekulid puutuvad kokku vähem vastupanuga ja liiguvad seetõttu kiiremini. Selle tulemusena on suuremad molekulid pärast elektroforeesi alguspunktile lähemal kui väiksemad (joonis 2.3).
Riis. 2.3. Valkude eraldamine geelelektroforeesiga
Elektroforeesi saab kasutada ka valkude eraldamiseks molekulmassi järgi. Selle kasutuse jaoks PAGE elektroforees naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS-Na) juuresolekul.
Üksikute valkude eraldamine
Afiinsuskromatograafia
Meetod põhineb valkude võimel mittekovalentsete sidemete kaudu tugevalt seostuda erinevate molekulidega. Kasutatakse ensüümide, immunoglobuliinide ja retseptorvalkude eraldamiseks ja puhastamiseks.
Ainete (ligandide) molekulid, millega teatud valgud spetsiifiliselt seonduvad, on kovalentselt ühendatud inertse aine osakestega. Valgu segu lisatakse kolonni ja soovitud valk kinnitatakse kindlalt ligandi külge. Ülejäänud valgud lahkuvad kolonnist vabalt. Säilinud valgu saab seejärel kolonnist välja pesta, kasutades vaba ligandi sisaldavat puhverlahust. See ülitundlik meetod võimaldab eraldada väga väikeses koguses valku puhtal kujul sadu teisi valke sisaldavast rakuekstraktist.
Isoelektriline teravustamine
Meetod põhineb valkude erinevatel IET väärtustel. Valgud eraldatakse elektroforeesiga plaadil amfoliiniga (see on aine, mille pH-gradient on vahemikus 3 kuni 10). Elektroforeesi käigus eraldatakse valgud nende IET väärtuse järgi (IET-s on valgu laeng null ja see ei liigu elektriväljas).
2D elektroforees
See on isoelektrilise teravustamise ja elektroforeesi kombinatsioon SDS-Na-ga. Elektroforees viiakse esmalt läbi horisontaalsuunas amfoliiniga plaadil. Valgud eraldatakse laengu järgi (IET). Seejärel töödeldakse plaati SDS-Na lahusega ja elektroforees viiakse läbi vertikaalsuunas. Valgud eraldatakse molekulmassi alusel.
Immunoelektroforees (Western blot)
Analüütiline meetod, mida kasutatakse konkreetsete valkude tuvastamiseks proovis (joonis 2.4).
Valkude eraldamine bioloogilisest materjalist.
Valkude eraldamine molekulmassi järgi elektroforeesiga PAGE-s koos SDS-Na-ga.
Valkude ülekandmine geelist polümeerplaadile, et hõlbustada edasist tööd.
Plaadi töötlemine mittespetsiifilise valgu lahusega, et täita ülejäänud poorid.
Nii saadakse pärast seda etappi plaat, mille poorid sisaldavad eraldatud valke ja nendevaheline ruum täidetakse mittespetsiifilise valguga. Nüüd peame kindlaks tegema, kas nende valkude hulgas on see, mida me otsime ja mis põhjustab mõne haiguse. Avastamiseks kasutatakse antikehade ravi. Primaarsed antikehad on huvipakkuva valgu vastased antikehad. Sekundaarsed antikehad tähendavad primaarsete antikehade vastaseid antikehi. Sekundaarsetele antikehadele lisatakse täiendav spetsiaalne märgis (nn molekulaarsond), et tulemusi saaks seejärel visualiseerida. Märgisena kasutatakse radioaktiivset fosfaati või ensüümi, mis on tihedalt seotud sekundaarse antikehaga. Seondumisel esmalt primaarsete ja seejärel sekundaarsete antikehadega on kaks eesmärki: meetodi standardimine ja tulemuste parandamine.
Primaarsete antikehade lahusega töötlemine seondumine toimub plaadi kohas, kus asub antigeen (soovitav valk).
Seondumata antikehade eemaldamine (pesemine).
Töötlemine märgistatud sekundaarsete antikehade lahusega edasiseks arendamiseks.
Seondumata sekundaarsete antikehade eemaldamine (pesemine).
Riis. 2.4. Immunoelektroforees (Western blot)
Kui soovitud valk on bioloogilises materjalis, ilmub plaadile riba, mis näitab selle valgu seondumist vastavate antikehadega.
Füüsikalis-keemiliste omaduste, keemilise koostise ja struktuuri uurimine on võimalik ainult puhastatud valgupreparaati uurides. Üksikute valkude eraldamiseks ja fraktsioneerimiseks kasutatakse järgmist: väljasoolamine, sadestamine orgaaniliste lahustitega, geelfiltreerimine, elektroforees, ioonvahetuskromatograafia, afiinsuskromatograafia.
Valkude väljasoolamine põhineb valkude lahustuvuse sõltuvusel söötme omadustest. Valgud lahustuvad destilleeritud vees vähem kui nõrkades soolalahustes, kuna madalad ioonikontsentratsioonid säilitavad nende hüdratatsioonikestad. Kuid kõrge soolasisalduse korral kaotavad valgumolekulid oma hüdratatsioonikestad, agregaadid ja moodustub sade. Pärast soola eemaldamist naasevad valgud lahusesse, säilitades oma loomulikud omadused ja konformatsiooni.
Üksikute valkude eraldamiseks kasutatakse lahustuvuse muutusi erinevate soolade kontsentratsioonide ja pH juures. Kõige sagedamini kasutatakse valkude väljasoolamiseks erineva kontsentratsiooniga ammooniumsulfaadi lahuseid.
Valkude sadestamine lahusest ilma nende denatureerimiseta toimub dehüdrogeenivate ainete - orgaaniliste lahustite (etanool, atsetoon) abil.
Geelfiltreerimine põhineb valkude eraldamisel molekuli suuruse ja kuju järgi. Eraldamine viiakse läbi kromatograafilistes kolonnides, mis on täidetud poorsete geelgraanulitega (Sephadex, agaroos) kindla pH väärtusega puhverlahuses. Geeligraanulid on valkudele läbilaskvad tänu teatud keskmise läbimõõduga sisekanalitele (pooridele), mille suurus sõltub geeli tüübist (Sephadex G-25, G-200 jne). Valgu segu lisatakse kolonni ja seejärel pestakse välja (elueeritakse) teatud pH väärtusega puhverlahusega. Suured valgumolekulid ei tungi geeli pooridesse ja liiguvad koos lahustiga suurel kiirusel. Madala molekulmassiga lisandi (soola) või muu valgu väikesed molekulid jäävad geeligraanulitesse kinni ja pestakse kolonnist aeglasemalt välja (joonis 1.29). Kolonni väljalaskeava juures kogutakse lahus (eluaat) eraldi fraktsioonidena.
Riis. 1.29. Valkude eraldamine geelfiltrimisega
Elektroforees põhineb laetud valgu molekulide omadusel liikuda elektriväljas nende kogulaenguga võrdelise kiirusega. Valgud, millel on antud pH väärtusel negatiivne kogulaeng, liiguvad anoodi poole ja positiivne laeng katoodi poole. Elektroforees viiakse läbi erinevatel kandjatel: paber, tärklisegeel, polüakrüülamiidgeel jne. Liikumiskiirus sõltub valgumolekulide laengust, massist ja kujust. Pärast elektroforeesi lõppu värvitakse kandjal olevad valgutsoonid spetsiaalsete värvainetega (joonis 1.30, A).
Elektroforeesi lahutusvõime geelis on kõrgem kui paberil, nii et vereseerumi valkude elektroforeesil paberil eraldatakse 5 fraktsiooni (albumiin, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globuliinid) ja polüakrüülamiidgeelis - kuni 18 fraktsiooni ( joon. 1.30, B).
Riis. 1.30. Terve inimese vereseerumi valkude elektroferogramm
A- vereseerumi valkude elektroferogramm paberil;
B- erinevate fraktsioonide plasmavalkude hulk.
I - y-globuliinid; II - β-globuliinid; III - a2-globuliinid;
IV - a1-globuliinid; V - albumiinid
Ioonivahetuskromatograafia põhineb kogulaengu poolest erinevate valkude eraldamisel. Teatud pH väärtusega valgulahus lastakse läbi tahke poorse sorbendiga täidetud kromatograafilise kolonni, samas kui osa valke jääb elektrostaatilise interaktsiooni tulemusena alles. Sorbentidena kasutatakse ioonivahetusaineid: anioonvahetajaid (sisaldavad katioonrühmi) happeliste valkude eraldamiseks; katioonivahetid (sisaldavad anioonseid rühmi) oluliste valkude eraldamiseks.
Valgu läbimisel kolonnist sõltub selle ioonivahetiga seondumise tugevus sorbendi laengule vastupidise laengu suurusest. Ioonivahetussorbendile adsorbeeritud valgud elueeritakse erineva soolakontsentratsiooni ja pH-ga puhverlahustega, saades erinevad valgufraktsioonid.
Afiinsuskromatograafia põhineb valgu seondumisspetsiifilisusel tahkele kandjale kinnitatud ligandiga. Ligandidena kasutatakse ensüümi substraate, holoproteiinide proteesrühmi, antigeene jne. Valkude segu kolonnist läbilaskmisel kinnitub ligandi külge ainult komplementaarne valk (joonis 1.31, A), kõik ülejäänud väljuvad koos lahusega. Adsorbeeritud valk elueeritakse erineva pH väärtusega lahusega (joonis 1.31, B). See meetod on väga spetsiifiline ja võimaldab saada kõrgelt puhastatud valgupreparaate.
Valkude eraldamine ja puhastamine toimub tavaliselt mitmes etapis, kasutades erinevaid meetodeid. Etappide järjestus valitakse empiiriliselt ja see võib erinevate valkude puhul erineda. Valgu kõrge puhastusaste on väga oluline nii ravimitena kasutamisel (hormooninsuliin jne) kui ka erinevate haiguste diagnoosimisel kudede, vere, sülje jm valgukoostise muutmise kaudu.
Täiskasvanu erinevate organite rakkude valkude kogum on individuaalne ja seda hoitakse kogu elu jooksul suhteliselt konstantsena. Spetsiaalsed kuded võivad sisaldada spetsiifilisi valke, nagu hemoglobiin punastes verelibledes, aktiin ja müosiin lihastes, rodopsiin võrkkestas ning erinevat tüüpi kollageeni luu- ja sidekudedes. Mõnda valku leidub paljudes kudedes, kuid erinevates kogustes. Valitud kompositsioon muutub
Riis. 1.31. Valkude eraldamine afiinsuskromatograafia abil
A- eraldatud valgu seondumine spetsiifilise ligandiga, mis on seotud neutraalse kandjaga; B- üksiku valgu lahuse saamine
kudede ja vere valgud on võimalikud ning on seotud eelkõige toitumise, toidu koostise ja inimese kehalise aktiivsusega.
Haiguste korral võib vere- ja koerakkude valgukoostis oluliselt muutuda, sageli tekib mis tahes valgu puudus või selle aktiivsuse langus - proteinopaatia. Seetõttu kasutatakse kliinilistes uuringutes erinevate haiguste diagnoosimiseks vere ja kudede valgu koostise väljendunud muutuste määramist.
Pärast valkude segu ekstraheerimist bioloogilisest materjalist eraldatakse see üksikuteks valgufraktsioonideks. Valkude erinevatel füüsikalis-keemilistel omadustel põhinevaid valkude fraktsioneerimismeetodeid on välja töötatud mitu.
– valkude sadestumine isoelektrilises punktis – meetod põhineb valkude omadusel sadestuda isoelektrilises punktis valgu molekuli laengu neutraliseerimise tõttu. Iga valgu puhul on isoelektrilise punkti väärtus rangelt individuaalne, seega võimaldab see meetod üksikuid valke eraldada (vt meetodi kohta lisateavet “Biokeemia” kursuse laboritööst nr 3).
– valgu fraktsioneerimine väljasoolamise meetodil – lähtudes valkude erinevast lahustuvusest neutraalsete soolade kontsentreeritud lahustes, olenevalt molekulmassist (vt meetodi kohta lisateavet “Biokeemia” kursuse laboritööst nr 3).
– elektroforeetiline eraldamise meetod valgud fraktsioonideks – kirjeldatud peatükis valkude füüsikalis-keemilised omadused.
Lisaks ülaltoodud meetoditele kasutatakse neid laialdaselt valkude fraktsioonideks eraldamiseks. kromatograafilised meetodid . Kõige sagedamini kasutatakse kolonnkromatograafiat.
Selle meetodi eripära on see, et erinevate valkude ja peptiidide molekulide segu juhitakse läbi kolonni, mis sisaldab tahket poorset materjali (maatriksit). Maatriksiga interaktsiooni tulemusena läbivad erinevad valgud kolonni erineva kiirusega. Pärast seda, kui valgud jõuavad teatud järjestuses kolonni põhja, kogutakse need eraldi fraktsioonidena katseklaasidesse.
Tõstke esile kolm peamist tüüpi kolonnkromatograafia:
– ioonivahetus – valkkromatograafias kasutatakse tselluloosil või muudel hüdrofiilsetel polümeeridel põhinevaid ioonivahetiid, näiteks dietüülaminoetüültselluloosi (DEAE-tselluloos), mis sisaldab katioonseid rühmi (negatiivne laeng) või sisaldab karboksümetüültselluloosi (CM-tselluloos), mis sisaldab amiinrühmi (positiivne laeng) :
Mida tugevam on valkude seondumine DEAE-tselluloosiga, seda suurem on karboksüülrühmade arv valgu molekulis. DEAE tselluloosile adsorbeeritud valke saab kolonnist pesta (elueerida) naatriumkloriidi suureneva kontsentratsiooniga lahustega. Esmalt elueeritakse lõdvalt seotud valgud ja kui soola kontsentratsioon suureneb, elueeritakse teised valgud, et suurendada afiinsust DEAE-tselluloosi suhtes.
CM-tselluloosi kasutatakse sarnaselt, kuid valkude afiinsus selle suhtes on otseselt võrdeline aminorühmade arvuga valgu molekulis.
Seotud valgu eemaldamiseks muudetakse ka eluendi pH-d.
– geelfiltratsioonkromatograafia – omab teist nimetust “molekulaarsõelmeetod”. Sõeluna kasutatakse Sephadexi (polüsahhariiddekstraani, mida on töödeldud epikloriidhüdriiniga). Sephadexi terad paisuvad vees ja moodustavad geeli. Paisunud graanulitel on teatud läbimõõduga poorid.
Eraldamisel lähtutakse sellest, et Sephadexi terad (graanulite poorid) on suure molekulmassiga ainetele mitteläbilaskvad või piiratud läbilaskvad ning väikesed molekulid difundeeruvad (tungivad) vabalt terade pooridesse.
Paisunud Sephadexi geelitaoline mass asetatakse klaaskolonni (tuubi), geeli pinnale kantakse kiht valgulahust (joonis 12, a) ja seejärel lastakse läbi puhverlahus (elueeriv vedelik). veergu. Valgud liiguvad graanulite vahelt mööda kolonni, mida aeglasemalt, seda madalam on nende molekulmass, kuna veelgi väiksema molekulmassiga valgumolekulid difundeeruvad kergemini graanulitesse (pooridesse) (joonis 12).
Riis. 12. Valkude fraktsioneerimine geelfiltrimisega
Valgud pestakse (elueeritakse) kolonnist välja molekulmassi kahanevas järjekorras. Järelikult elueeritakse esmalt suured valgumolekulid (joonis 12, b), mis ei difundeeru teradesse, seejärel väikesed molekulid ja viimasena madalmolekulaarsed lisandid.
Seda meetodit ei kasutata mitte ainult valkude fraktsioneerimiseks molekulmassi järgi, vaid ka nende puhastamiseks madala molekulmassiga lisanditest.
– afiinsuskromatograafia – või afiinsuskromatograafia. Meetodi põhimõte seisneb selles, et valkude selektiivne interaktsioon toimub spetsiifiliste ainetega – kandjate külge kinnitatud ligandidega (joonis 13).
Kandjana kasutatakse tsüaanbromiidiga aktiveeritud Sepharose'i. Sepharose'ile - substraadile või antigeenile või retseptorile - on kinnitatud erineva päritoluga ligandid, mis seovad afiinsusega segust ainult ühte valku:
– substraat → ensüüm;
– antigeen → antikeha;
– hormoon → antud hormooni retseptor.
Teised valgud, mis ei ole ligandiga seotud, eemaldatakse kolonni pesemisega.
Riis. 13. Afiinsuskromatograafia mehhanism
Afiinsusega seotud valgu eemaldamine kolonnist viiakse läbi puhverlahuse (eluendi) abil. Puhvrisse viiakse detergent, mis nõrgendab sidemeid valgu ja ligandi vahel, või lastakse kolonnist läbi kõrge vaba ligandi kontsentratsiooniga lahus. Sel juhul seondub valk kergemini vaba ligandiga ja pestakse (elueeritakse) kolonnist välja.
Laboritöö nr 8
VALKUDE ELEKTROFOREETILINE ERALDAMINE
Meetod põhineb sellel, et valgumolekulidel on elektrilaeng, mille suuruse ja märgi määrab valgu aminohappeline koostis, pH ja keskkonna ioontugevus. Välise elektrivälja mõjul liiguvad laetud molekulid lahuses vastupidiselt laetud pooluse suunas. Valguosakeste liikumiskiirus on võrdeline nende laengu suurusega ja pöördvõrdeline osakeste suuruse ja hüdratatsiooniastmega.
Praegu on laialt levinud niinimetatud "tsoonielektroforees" - elektroforees tahkel kandjal (paberiribadel, agar, tärklis, akrüülamiid), mis on immutatud soovitud pH väärtusega puhverlahusega. Valkude asukoht paberil või geelil määratakse fikseerimise ja seejärel ühe või teise värvainega (tavaliselt bromofenoolsinise, amiidmusta või Coomassie sinisega) värvimise teel. Valgu kogust igas fraktsioonis saab ligikaudselt määrata seotud värvaine värvi intensiivsusega. See määratlus ei anna valgufraktsioonide rangelt kvantitatiivset suhet, kuna erinevate valkude poolt seotud värvaine kogus ei ole sama.
ELEKTROFOREES HA PABER
Analüüsitud segu eraldamine toimub teatud tüüpi kromatograafilisel paberil, mis on immutatud elektroforeesiseadmetes puhverlahusega. Valgud eraldatakse pingetel kuni 500 V.
Elektroforeesikamber koosneb pleksiklaasist vannist ja sellele paigaldatud kaanest (1). Vannis on 2 elektroodi sektsiooni (2), millest igaüks on jagatud pikisuunalise vaheseinaga (3) kahte kambrisse, mis suhtlevad omavahel. Sektsioonide sisemised sektsioonid langetavad elektroodid ja paberiribade otsad välimistesse sektsioonidesse (4), mille põhiosa asetatakse naelu (5) horisontaalsele plaadile, mis asub kambri keskosas. Horisontaalse plaadi ja elektroodilahtrite välimise sektsiooni vahel on pulgad (6),
Joonis 2. Madalpinge elektroforeesi seadmeskeem
millest läbi visatakse paberiribad ja mis neid toetavad. Kambri ülemise katte all on pleksiklaasist suurte ümarate aukudega plaat (7), mille peale asetatakse destilleeritud vees leotatud ja 4-5 korda volditud filterpaberi lehed. Need lehed aitavad suurendada kambri tihedust ja selle tulemusel vähendada elektroforeesi ajal elektroferogrammide vedeliku aurustumist.
Paberelektroforeesi abil palutakse õpilastel eraldada vereseerumi valgud. Seda meetodit kasutades saab vereseerumi jagada 5-9 fraktsiooniks ning määrata igaühe suhtelise valgusisalduse. Eraldamine viiakse läbi toatemperatuuril puhverlahuses (pH 8,6–8,9), mille potentsiaalne gradient on 3–5 V/cm (120–350 V 40–45 cm pikkuste ribade puhul). Vool ei tohiks ületada 0,1–0,3 mA pabeririba ristlõike iga sentimeetri kohta. Voolutugevuse suurendamine rohkem kui 2 korda on vastuvõetamatu, kuna see põhjustab liigset kuumenemist, aurustumise märkimisväärset suurenemist ja V lõpuks - paberi põletamine
Reaktiivid:
1. Puhverlahus. Võib kasutada:
a) veronal-medinaali puhver (pH 8,6): lahustada 10,32 gmedinaali (veronaali naatriumsool) 300 ml destilleeritud vees, lisada 1,84 gveronaali, kuumutada segades veevannis lahustumiseni ja lisada vett 1 liitrini;
b) veronal-atsetaatpuhver (pH 8,6): 4,3 veronaali, 0,95 ui naatriumhüdroksiidi ja 3,24 ui naatriumatsetaati lahustatakse 300 ml destilleeritud vees. Lisage lahusele 30 ml 0,1 M HCl lahust ja lisage vesi 1 liitrini;
c) Tris-puhver (pH 8,9): 60,5 g Tris, 6 etüleendiamiintetraäädikhape ja 4,6 g boorhapet lahustatakse 1 destilleeritud vees.
2. Elektroferogrammide värvimise lahendused:
a) happeline sinimust värvaine (sarnane amiidmust 10 B) -0,2 g segu: äädikhape (jää-) - 100 ml + metüülalkohol - 900 ml;
b) bromofenoolsinine -0,5 g, elavhõbekloriid -10 g, äädikhape (jää-) - 20 ml, destilleeritud vesi - 980 ml;
c) bromofenoolsinine - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O -50 g, äädikhape (jää-) 50 ml, destilleeritud vesi - 900 ml.
3. Lahused elektroferogrammide pesemiseks valguga mitteseostunud värvainest ja värvaine valgule kinnitamiseks:
a) äädikhape - 2% lahus;
b) naatriumatsetaat - 2% lahus, mis on valmistatud 10% äädikhappe lahusega.
4. Lahused elektroferogrammide värviliste saaduste elueerimiseks:
a) ekstraheerida bromofenoolsinise -0,01 M NaOH lahus;
b) happelise sinakasmusta värvaine -0,1 M NaOH lahus ekstraheerimiseks.
Varustus: katseklaasid; küvetid, spektrofotomeeter, elektroforeesiseade, kromatograafiline paber: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM jne.
Vereseerumi saamine. Kuiva tsentrifuugitorusse tõmmatakse 2–3 ml verd ja jäetakse seisma 1/2–1 tunniks. Kasutades õhukese klaaspulgaga, tehke ettevaatlikult ringi toru seinad, et tromb neist eraldaks, tsentrifuugige ja valage seerum puhas toru.
Kaamera ettevalmistamine. Elektroodikambrid täidetakse puhverlahusega samale tasemele (puhvri ülevoolu vältimiseks), igas kambris ligikaudu 800 ml. Elektroodikambrite sisemised osad asetavad elektroodid vee alla. Kromatograafilise paberi lehel (18x45 cm) (õhukeste paberitüüpide kasutamisel on parem kanda proovid eraldi 4–5 cm laiustele ribadele) 15 cm kaugusel ühest selle kitsast küljest kasutage lihtsat pehmet paberit. pliiats (grafiit takistab vedeliku levikut), et joonistada proovide pealekandmise kohad. Need on ristkülikud (2 x 0,3 cm), mille suured küljed on pabeririba pikkusega risti. Elektroferogrammi algustsoonide ja servade vaheline kaugus on 2 cm. Elektroferogramm on immutatud puhvriga, milles toimub elektroforees. Selleks tõmmatakse see läbi puhverlahusega küveti. Paberiribade (6-8 cm) otsad ei ole märjaks. Liigne puhver eemaldatakse, kuivatades ribad kahe või kolme filterpaberi lehe vahel. Märg elektroferogramm asetatakse kambrisse tsentraalsele horisontaalplaadile (5), mille otsad lastakse elektroodilahtrite välimistesse lahtritesse Seade on tihedalt suletud kaanega, mille all on niisutatud filterpaberi lehed. vesi.
Elektroforeesi läbiviimine. Pärast seda, kui paberiribad on puhverlahusega täielikult küllastunud, kantakse märgitud aladele 0,1 ml pipetiga 0,01–0,02 ml (1–2 mg valku) seerumiproove. Kamber suletakse kaanega ja vool lülitatakse sisse. Elektroforeesi kestus on 22-24 tundi pingel 200-300 V
Elektroferogrammide fikseerimine ja värvimine. Elektroforeesi lõpus lülitage vool välja ja eemaldage kohe seadmest elektroferogrammid. Need asetatakse spetsiaalsele alusele ja kuivatatakse õhu käes tõmbe all, seejärel 20 minutit ahjus temperatuuril 105 ºC, et valgud paberile kinnituksid, seejärel asetatakse need emailküvetti, täidetakse värvainega ja jäetakse 2–3. tundi või rohkem. Värv nõrutatakse ja elektroferogramme pestakse selle ülejäägist, valades 3-4 korda 2% äädikhappe lahusega, iga kord 5-10 minutit. Paberipinnad, mis ei sisalda valku, peavad olema täiesti värvivabad. Värviliste toodete fikseerimiseks täidetakse elektroferogrammid 2 minutiks 2% naatriumatsetaadi lahusega ja kuivatatakse õhu käes.
Üksikute valgufraktsioonide vahekorra määramine. pH 8,6 juures on seerumivalgud negatiivselt laetud ja liiguvad elektriväljas anoodi poole. Kõige kiiremini anoodile liikuv fraktsioon on albumiin, millele järgnevad α 1 -, α 2 -, β- ja γ-globuliinid (vt joonis 3). . Paberlintide osad, millele on tekkinud valguplekid, jagatakse ristjoontega lihtsa pliiatsiga 3-5 mm laiusteks ribadeks ja lõigatakse mööda neid jooni. Iga riba purustatakse ja asetatakse eraldi nummerdatud katseklaasi, täidetakse 3 ml 0,01 M NaOH lahusega, jäetakse tund aega paberilt värvi eemaldamiseks ning seejärel leitakse iga lahuse optilise tiheduse väärtus fotokolorimeetril ( spektrofotomeeter) 612 nm juures.
Riis. 3. Inimese vereseerumi elektroferogramm ja valgufraktsioonide jaotuskõver
Paralleelselt töödeldakse kontrollproovi. Selle jaoks lõigatakse elektroferogrammi värvimata aladest välja riba.
Saadud andmete põhjal kantakse elektroferogrammile värviliste produktide jaotuskõver, mille abstsissteljele on märgitud torude numbrid, ordinaatteljel aga vastav optilise tiheduse väärtus (vt joon. 3). . Arvutatakse valgufraktsioonide protsent vereseerumis. Selleks jagatakse tõmmatud kõver vastavalt miinimumidele mitmeks osaks, mis vastavad üksikutele murdosadele. Iga sektsiooni pindala suurus on võrdeline antud fraktsiooni valguga kombineeritud värvi kogusega. Nende pindalade suhe arvutatakse massi järgi (paberilõikude kaal on võrdeline nende pindalaga), kogu pindala on 100%. Kui teil on densitomeeter, saab densitogrammi järgi määrata valgufraktsioonide suhte vereseerumis.
Olles eelnevalt määranud vadaku valgusisalduse, arvutatakse selle kogus iga fraktsiooni kohta.
