Репарація ДНК

Загальні відомості

Агенти, що пошкоджують ДНК

Випромінювання

1. іонізуюча радіація (гама промені, рентгенівські промені)

2. Ультрафіолетове випромінювання (особливо ~260 нм, саме в цій галузі відбувається максимальне поглинання ДНК)

Активні радикали кисню, що утворюються під час нормального клітинного дихання в різних біохімічних шляхах.
Хімічні речовини довкілля.

Багато вуглеводнів.

Хімікати, що використовуються в протипухлинній хіміотерапії.

Типи ушкоджень ДНК

1. Усі чотири підстави ДНК (A, T, C, G) можуть бути ковалентно модифіковані в різних положеннях.
Найчастіше - це втрата аміногрупи (дезамінування) - у разі C перетворюється на U.
Неправильне включення основ, що відбувається через помилки в роботі ДНК полімераз при реплікації.
Найчастіше відбувається включення урацилу замість тиміну.
Порушення структури.
У ДНК можуть відбуватися розриви. Розриви можуть бути одноланцюжковими, або можуть розірватися обидва ланцюги ДНК.

Іонізуюча радіація може бути найчастішою причиною таких розривів.
Між сусідніми основами може утворитися ковалентний зв'язок, причому зв'язок може утворитися між сусідніми основами в одному ланцюгу або між двома ланцюгами ДНК.
типи пошкодження ДНК
зміна однієї підстави
апуринізація
заміна З на У
заміна А на гіпоксантин
алкілювання основи
вставка або делеція нуклеотиду
вбудовування аналогічної основи
зміна двох підстав
утворення тімінових димерів
поперечний зв'язок з біфункіональним алкілувальним агентом
руйнування ланцюга
іонізуюче випромінювання
радіоактивне руйнування елементів кістяка
поперечні зв'язки
між основами однієї нитки або двох паралельних ниток
між ДНК та білковими молекулами, наприклад гістонами

Репарація пошкоджених основ

Пошкоджені підстави можуть бути виправлені різними шляхами:
Пряме хімічне виправлення ушкоджень.

Ексцизійна репарація (ER), при якій пошкоджена основа видаляється та замінюється на нову. Є три моделі ексцизійної репарації, у кожній із яких використовується свій власний набір ферментів.
Ексцизійна репарація основ (BER).
Ексцизійна репарація нуклеотидів (NER).
Місметч репарація (MMR).

Пряме виправлення пошкоджень.

Найчастіша причина точкових мутацій у людини – це спонтанне додавання метильної групи – один із типів алкілування. Такі модифікації виправляються ферментами званими глікозилазами, що виправляють помилку без руйнування ланцюга ДНК.

Деякі препарати, що використовуються в хіміотерапії, також ушкоджують ДНК шляхом алкілування.
Проблема репарації полягає в тому, що обмеженим набором ферментів і механізмів клітина повинна впоратися з багатьма ушкодженнями викликаними різними хімічними і фізичними агентами.

Ексцизійна репарація основ (BER)

Основні ключові події:

1. Видалення пошкодженої основи (відбувається ~ 20,000 разів на день у кожній клітині людського тіла) ДНК глікозиламіми. У людини є принаймні 8 генів, що кодують різні ДНК глікозилази, кожна з яких розпізнають свій набір пошкоджень основ.
2. Видалення дезоксирибофосфату призводить до утворення порожнечі ДНК.
3. Заміна правильним нуклеотидом. Ця функція людини виконується ДНК полімеразою бетта.
4. Лігування розриву ланцюга. Є два ферменти, обидва потребують АТФ.

Ексцизійна репарація нуклеотидів (NER)

NER відрізняється від BER кількома шляхами.
Використання різних ферментних систем.
Навіть якщо помилка в одному нуклеотиді, видаляється відразу безліч нуклеотидів у районі ушкодження.

Основні ключові події NER:
1.Пошкодження розпізнається одним або декількома факторами, що зв'язуються з місцем ушкодження.
2. ДНК розкручується у місці ушкодження. У цьому процесі беруть участь
різні транскрипційні фактори IIH, TFIIH, (які також працюють при нормальній транскрипції).
3. Розріз ДНК відбувається з 3" і 5"-кінця від пошкодження, в результаті чого видаляється фрагмент ДНК, що містить пошкоджений нуклеотид.
4. Новий ланцюг ДНК добудовується за матрицею неушкодженого ланцюга ДНК полімеразами дельта або епсілон.
5. Лігази зшивають знову синтезований кінець ланцюга.

Пігментна ксеродерма (XP)
XP рідкісне спадкове захворювання людини, що проявляється в ураженні шкіри при опроміненні світлом, що в кінцевому підсумку призводить до розвитку раку шкіри і загибелі хворого.
Хвороба виникає через мутації в генах репарації, що беруть участь в NER. Наприклад:
XPA кодує білок, що зв'язується з місцем ушкодження і допомагає складанню репаруючого комплексу.
XPB та XPD, які є частинами транскрипційного фактора TFIIH. Деякі мутації в XPB і XPD можуть бути причиною передчасного старіння.
XPF розрізає ланцюг ДНК з 5" кінця від пошкодження.

XPG розрізає ланцюг із 3”-кінця.

Місметч репарація (MMR)

Місметч репарація виправляє помилково вбудовані непошкоджені основи, які не утворюють нормальне Уотсон-Криківське спаровування (AT, CG). Такі помилки відбуваються під час роботи ДНК полімерази під час реплікації.
У місметч репарації беруть участь ферменти залучені як у BER, так і NER репарацію, так і спеціалізовані ферменти.
Синтез ДНК при місметч репарації здійснюється ДНК полімеразами дельта або епсілон.
Система місметч репарації бере участь у збільшенні точності рекомбінації при мейозі.

Репарація розривів ДНК

Іонізуюча радіація та деякі хімічні речовини здатні розірвати один або два ланцюги ДНК.
Одноланцюгові розриви (SSB)
Розриви одного з ланцюгів ДНК часто виправляються ферментами беруть участь у BER репарації.
Дволанцюгові розриви (DSB)
Є два механізми, які здатні усунути дволанцюжкових розривів ДНК:
Пряме з'єднання зламаних кінців. Цей процес вимагає спеціальних
ферментів, які пізнають і пов'язують розірвані кінці з подальшим зшиванням. Якщо розірвана ДНК має тупі кінці та з'єднання двох фрагментів ДНК відбувається випадково, то така репарація називається NHEJ. Білок Ku необхідний для NHEJ. Ku - гетеродимерна субодиниця, що складається з двох білків Ku70 та Ku80.
Помилки, що виникають при прямому приєднанні, можуть бути причиною транслокацій.
Полінуклеотидлігаза- Відновив. одночіп. розриви ДНК

Гомологічна рекомбінація

Гомологічна рекомбінація здатна відновлювати поламані кінці хромосом, використовуючи ДНК не пошкодженої сестринської хроматиди, доступної після подвоєння хромосом.
Гени необхідні для гомологічної рекомбінації – BRCA-1 та BRCA-2.

Конверсія гена
Донором нового гена може бути:
гомологічна хромосома (під час мейозу)
систрінська хроматида (так само під час мейозу)
дуплікований ген тієї ж хромосоми (під час мітозу)

Виправлення помилок за рахунок 3'-5' екзонуклеазної активності полімерази при реплікації (тільки у прокаріотів) (мутація E.coli mutD-мутатор-змін. -субодиниці ДНК-пол.III)
Тімінові димери, фермент фотоліазу ген-phr (у нижчих еукаріотів)
Видалення приєднаних алкільних та метильних груп - O-6-метилгуанінтрансфераза (ген ada)-видаляє О-6-метилгуанін
ексцизійна нар. підстав [Е.coli] [людина | впізнавання ушкодж. XPA-білком в асоціації з RPA залучається ф-р транскр. TFIIH (P52, Р34, Р44, Р62, XPB-XPD-геліказн. акт-ть) | ERCC1-XPF, XPG – нуклеази, надрізають ДНК по обидва боки від ушкоджень. | ДНК-полімераза-і допоможуть. білки RFC і PCNA забудовують пролом]
нар. азотистих осн.-глікозилаза видаляє осн.
AP-сайт (апуриновий, апіримідиновий) | AP-ендонуклеаза упізнає пролом, розріз. 5'-ДНК
постреплікативна нар. (ПРР)
SOS-р. білки з'єдн. з ДНК-полімеразою, доч. ДНК будується навпроти пошкоджень. ДНК

Скорочення.
BER - Base Excision Repair

NER - Nucleotide Excision Repair
MMR - Mismatch Repair
NHEJ - Nonhomologous End-Joining

Місметч репарація

У процесі реплакації, внаслідок помилок полімерази, можуть вбудовуватися некомпліментарні нуклеотиди, що може призвести до мутацій у дочірньому ланцюзі ДНК. Неспарені основи впізнаються ферментами місметч репарації та здійснюють заміну помилково спарених нуклеотидів.

Ферменти даної системи забезпечують гомологічну рекомбінацію, і навіть затримку клітинного циклу у відповідь пошкодження ДНК.
Система репарації помилково спарених нуклеотидів у E. coli, що використовує білки MutHLS, розпізнає та репарує всі некомплементарні пари основ за винятком C-C. Крім того, ця система репарує невеликі вставки в один із ланцюгів ДНК, що утворюються в результаті помилок реплікації, довжина яких не перевищує чотирьох нуклеотидів.
Зазвичай у E. coli ДНК метильована Dam-метилазоюпо сайтам GATC. Однак після завершення реплікації дочірній ланцюг ДНК деякий час залишається неметильованим.
Ця система може бути реконструйована in vitro з використанням
ДНК з одним метильованим ланцюгом як субстрат, до якого додаються очищені білки MutH, MutL, MutS, UvrD (хеліказу II), холофермент ДНК-полімерази III, ДНК-лігаза, білок SSB, а також одна з екзонуклеаз: ExoI, ExoVII або RecJ . Процес репарації ініціюється внесенням одноланцюгового розриву в неметильований ланцюг поблизу частково метильованого сайту GATC з подальшим гідролізом ланцюга ДНК і заповненням одноланцюгового пролому, що утворюється. При цьому білок MutS зв'язується з помилково спареними нуклеотидами. У білка MutL не виявлено ферментативної активності, хоча він взаємодіє з MutS і необхідний для активації MutH – ендонуклеази, яка здійснює одноланцюжковий розрив ДНК. Таким чином, комплекс MutS-MutL, зібраний на ділянці ДНК з помилково спареним нуклеотидом, стимулює ендонуклеазну активність MutH. Безклітинна система не вимагає присутності MutH за наявності в ДНК-субстраті одноланцюжкового розриву. MutHLS-система репарації може
використовувати частково метильовані послідовності GATC, розташовані вище та нижче пошкодженої ділянки ДНК. При цьому в
вирізання помилково включеного нуклеотиду крім хелікази II бере участь одна з екзонуклеаз: ExoI (3'-екзо), ExoVII (3'- та 5'-екзо) або RecJ (5'-екзо) залежно від розташування GATC-сайту по відношенню до нуклеотиду, що коригується. Слідом за вирізанням нуклеотиду одноланцюжковий пролом, що утворився, заповнюється холоферментом ДНК-полімерази III у присутності SSB-білка і ДНК-лігази. Слід підкреслити, що використання білка MutH і Dam-метилази для розпізнавання дочірнього ланцюга ДНК, що реплікується, є унікальною властивістю грамнегативних бактерій. У грампозитивних бактерій немає метилювання ланцюгів ДНК з метою маркування. Якщо сайти GATC повністю метильовані, MutHLS-система репарації E. coli змінює помилково спарені нуклеотиди в обох ланцюгах ДНК з однаковою ефективністю.
У E. coli існують принаймні ще два специфічні
шляхи репарації помилково спарених нуклеотидів. Система VSP (very short patchrepair pathway) репарує некомплементарні пари GT, замінюючи їх на GC. Вважається, що такі пари утворюються в результаті дезамінування 5-метилцитозину в сайтах, де залишки метиловані Dcm-метилазою. З більш низькою ефективністю ця система замінює пари G-U на G-C. Інша MutY-залежна система репарації специфічно ліквідує наслідки окисних ушкоджень гуаніну. Якщо dGTP окислюється з утворенням 8-оксо-dGTP, білок MutT розщеплює останній, запобігаючи його включенню до ДНК. Якщо ж він все-таки включається навпроти залишку, то Fpg-глікозилаза (MutM) видаляє цю модифіковану основу. У тому випадку, коли 8-оксо-G залишається у складі ДНК, у наступному раунді реплікації він спарюється з А, і в результаті може відбутися трансверсія G-C>T-A. У цьому випадку білок MutY діє як ДНК-глікозилаза, що видаляє залишок A з некоректної пари, і як AP-ліаза, що вносить одноланцюжковий
розрив по сусідству з AP-сайтом. Далі йдуть процеси, що вже розглянуті вище у зв'язку з функціонуванням системи репарації BER. Послідовність реакцій за участю MutY також репарує некомплементарні пари AG і AC з утворенням відповідно пар CG і GC. Репарація помилково спарених основ у еукаріотів відбувається при
Участь комплексу білків, подібного до системи MutHLS бактерій. Білок GTBP людини є гомологом бактеріального білка MutS, а у дріжджів у відповідній ролі виступає білок Msh6. Розпізнавання помилково спарених нуклеотидів у людини здійснюється гетеродимером MSH2-GTBP. Гомологами MutL у клітинах S. cerevisiae є білки MLH1 та PMS2, які також існують у вигляді гетеродимерних комплексів. Мутації в генах, що кодують ці білки у людини, супроводжуються формуванням мутаторного фенотипу та розвитком спадкового неполіпозного раку кишечника (синдром HNPCC – hereditary nonpolyposis colon cancer).

Пряма репарація

Існують два основні шляхи репарації алкілованих основ: ексцезійна репарація основ (BER) та пряма репарація пошкоджених основ. При BER DNA-глікозилази вищеплюють цитотоксичні алкільовані основи в DNA на першому етапі з утворенням AP-сайту і подальшим його процесуванням. У разі прямої репарації реалізуються два способи: репарація алкілтрасферазами або окислення алкільної групи, в обох випадках відбувається регенерація неушкоджених. Якщо протікає репарація алкілтрасферазами (у ссавців тільки O 6 -алкілгуанін репарується цим шляхом), то O 6 -алкілгуанінтрансфераза (AGT) переносить метильну або етильну групу з O 6 -алкілгуаніну на один із власних залишків цистеїну. Алкільований внаслідок власної активності білок інактивується, але може служити регулятором активності свого гена та кількох інших. На відміну від суїцидних O 6 -метилгуанінтрансфераз, спрямовано деметилюють високомутагенне та токсичне
пошкодження O 6 -метилгуанін, AlkB з E. coli та його людські аналоги hABH2 і hABH3 окислює метильні групи 1-метиладеніну (1-meA) та 3-метилцитозину (3-meC) в DNA для регенерації немодифікованих основ аденіну та цитозину.

O 6 -алкілгуанінтрансфераза

O 6 -алкілгуанінтрансферазна активність виявлена ​​у більшості організмів і перешкоджає мутагенної дії O 6 -алкілгуаніну. AGT перетворює O 6 -алкілгуанін на гуанін, переміщуючи алкільну групу з DNA на реакційний залишок цистеїну в білку в ході незворотної реакції.

Таке ковалентне приєднання алкільної групи до залишку цистеїну інактивує фермент. Тому AGT - суїцидний фермент, який піддається протеолітичній деградації після однієї
реакції трансалкілування. Структурні дослідження дозволяють виявити, що активний центр AGT розташований в об'ємі ферменту на певній відстані від зв'язувальної ділянки DNA. Вважається, що фермент "працює" за механізмом "перевертання нуклеотиду", щоб щільно зблизити основу субстрату та нуклеофільний активний центр AGT.

Важливість AGT у захисті ссавців від токсичного та мутагенного ефектів алкілуючих агентів була продемонстрована на мишах. Трансгенні миші з надмірною експресією AGT виявляють значно нижчий рівень виникнення пухлин у відповідь на дію метилюючого агента - N-метил-N-нітрозосечовини, в той час як миші з дефіцитом AGT виявлялися набагато сприйнятливішими до ініціювання пухлини і токсичних ефектів цього агента. порівняно з немутантними мишами. AGT - важливий фермент у протипухлинній терапії, оскільки він перешкоджає цитотоксичним ефектам протипухлинних агентів класу хлороетилнітрозосечовини (CENU), наприклад
BCNU (N,N-біс(2-хлороетил)N-нітрозосечовина) або темозоломід. Було показано, що кількість, в якій є AGT в пухлинах, в основному визначає наскільки сприятливим виявиться результат протипухлинної терапії з використанням CENU. CENU спочатку взаємодіє з O 6 -карбонільною групою гуаніну з утворенням сполуки 4 , яке згодом перетворюється на N 1 ,O 6 -етаногуанін 5 . З'єднання 5 перегрупується протягом кількох годин на фізіологічно активний ICL 6 . AGT перешкоджає освіті 6 при взаємодії з 4 або 5 , відновлюючи гуанін або формуючи DNA-білковий аддукт. 8 . Експериментально отримано підтвердження утворення аддукту 8 але він був виділений в занадто малій кількості для його детального опису. При біохімічному дослідженні цієї проблеми було введено N 1 ,O 6 -етаноксантин
9 як стабільний аналог 5 у DNA. Етаноксантин 9 реагує з AGT з утворенням стабільного DNA-білкового продукту 7 . Цей підхід дозволив формувати ковалентно пов'язаний AGT-DNA аддукт. 10 у великій кількості, який може бути використаний для визначення структури AGT, пов'язаного з DNA. Взаємодія AGT та алкілуючої терапії призвела до пошуку інгібіторів AGT, які можуть бути використані в терапії раку в поєднанні з алкілуючі агенти. До теперішнього часу створені інгібітори, головним чином, похідні гуаніну із заступниками O 6 -позиції. O 6 -бензилгуанін 2 був виявлений типовий інгібітор AGT, з яким порівнюють нові молекули. Ефективність O6-BzG у посиленні цитотоксичності CENU продемонстрована на моделях тварин. Лімітуючим чинником цього терапевтичного підходу є токсичність здорових органів, частково для кісткового мозку. Деякі
групи вчених спрямовані обійти цю проблему шляхом генерування ATG-варіанту, стійкого до пригнічення O 6 -BzG, що може бути використане для захисту кісткового мозку за допомогою генного перенесення.

Оксидоредуктази AlkB, hABH2 та hABH3

Ще один шлях прямої репарації алкілованих основ - окислення алкільної групи з регенерацією неушкодженої азотистої основи. Фермент AlkB у Escherichia coli та два людські аналоги hABH2 та hABH3 спрямовано деметилюють 1-метиладенін та 3-метилцитозин у DNA. Але на відміну від AGT, ці ферменти мають субстратну специфічність, спрямовану на поверхню пар основ G:C і A:T. Пошкодження 1-алкіладенін
і 3-метилцитозин формуються, коли аденін і цитозин знаходяться в одноланцюжковій структурі (у період реплікації або транскрипції) і є субстратами для AlkB, hABH2 і hABH3. Вони окислюють метильні групи 1-метиладеніну (1-meA) і 3-метилцитозину (3-meC) у DNA для регенерації азотистих основ аденіну та цитозину. Було також показано, що AlkB захищає від токсичного пошкодження - аддукту з етильною групою і перетворює 1-етиладенін на аденін в DNA, що продукує в результаті реакції ацетальдегід. Таким чином репаруються пошкодження відомого мутагену та канцерогену етиленоксиду, що ендогенно утворюється в ході метаболізму етилену, а також широко застосовується як фумігант для стерилізації. Аддукти з гідроксиетилом, що генеруються етиленоксидом, виявлені в DNA клітини. Інші малі алкілуючі епоксиди також задіяні у великій кількості у хімічному виробництві. Було показано, що AlkB знижує токсичні ефекти DNA-пошкоджуючих агентів, що генерують гідроксиетильний,
пропильний та гідроксипропільний аддукти. AlkB репарує алкільовані трифосфати 1-me-dATP активно, але неефективно. Передбачалося, що ця здатність може знижувати рівень вбудовування трифосфатів алкілованих при синтезі DNA; до того ж фрагмент Кленова DNA полімерази I у E. coli може використовувати 1-me-dATP як попередник для синтезу DNA in vitro. Людські ферменти hABH2 і hABH3 також деметилювали 1-метиладенінові залишки в полі(dA), вони були неефективними на коротких субстратах. Таким чином, hABH3 володів дуже низькою активністю на трімері d(Tp1-meApT), тоді як у hABH2 активності не було виявлено.

AlkB та його людські аналоги є частиною -кетоглутарат/Fe(II)-залежної суперродини діоксигеназ, і в процесі репарації протікає спільно декарбоксилювання -кетоглутарата і окисне деметилювання пошкодженої основи. Ушкодження 1-meA і 3-meC формуються в основному в одноланцюжковій DNA і імовірно
виникають в реплікативної вилці і в генах, що активно транскрибуються, де вони можуть заблокувати DNA- і RNA-полімерази. Насправді AlkB, hABH2 та hABH3 репарують ці пошкодження в одноланцюжковій DNA, але також протікає репарація олігонуклеотидів, відпалених з комплементарним ланцюгом після алкілування. Ефективність репарації 1-метиладеніну AlkB не залежить від полінуклеотидної структури, але необхідна наявність нуклеотид-5"-фосфатної групи. Також людські ферменти hABH2 і hABH3 деметилювали залишки 1-метиладеніну в полі(dA), вони були неефективні на коротких субстратах. , пошкодження, що містять позитивний заряд (рибонуклеозиди 1-meA і 3-meC мають відповідно pKa= 9.3 і 9.6) краще репарувалися, ніж незаряджені підстави (1-meG і 3-meT). ступеня 3-meT) репарувалися AlkB, то формальний позитивний заряд основи не є необхідною умовою для функціонування AlkB.
поки неясно, чи залежить цей результат від того, що позитивно заряджені основи краще розпізнаються за допомогою електростатичних взаємодій з AlkB або позитивно заряджені основи просто роблять DNA кращою групою, що йде після гідроксилювання метильної групи.

Скорочення:

• AGT - алкілгуанін трансфераза
• BER - ексцезійна репарація основ
• DNA - дезоксирибонуклеїнова кислота
• RNA - рибонуклеїнова кислота
• BCNU - N,N-біс(2-хлороетил)N-нітрозосечовина
• CENU - хлороетилнітрозосечовина
• O 6 -BzG - O 6 -бензилгуанін
• 1-meA - 1-метиладенін
• 1-meG - 1-метилгуанін
• 3-meC - 3-метилцитозин
• 3-meT - 3-метилтимін

Література:

» Orlando D. Scharer (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42, 2946-2974
» James C. Delaney і John M. Essigmann Mutagenesis, genotoxicity, і реагування на 1-methyladenine, 3-alkylcytosines, 1-methylguanine, і 3-methylthymine в alkB Escherichia coli
» Pertti Koivisto, Tod Duncan, Tomas Lindahl, і Barbara Sedgwick Мінімальний Methylated Substrate and Extended Substrate Range of Escherichia coli AlkB Protein, a 1-Methyladenine-DNA Dioxygenase*
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T. & Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. SCI. USA 99, 16660-16665. 5. Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., et. al. (2003) Nature 421, 859-863.
» Hollis, T., Lau, A., та Ellenberger, T. (2000) Mutat. Res. 460, 201-210
» Daniels, D. S., та Tainer, J. A. (2000) Mutat. Res. 460, 151-163
» Trewick, SC, Henshaw, TF, Hausinger, RP, Lindahl, T., і Sedgwick, B. (2002) Nature 419, 174-178
» Falnes, P. O., Johansen, R. F., і Seeberg, E. (2002) Nature 419, 178-181
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T., і Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. SCI. U. S. A. 99, 16660-16665
» Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., і Krokan , H. E. (2003) Nature 421, 859-863
» Aravind, L., і Koonin, E. V. (2001) Genome Biology 2, 0007.1-0007.8
» Bodell, W. J., і Singer, B. (1979) Biochemistry 18, 2860-2863
» Boiteux, S., і Laval, J. (1982) Biochimie (Paris) 64, 637-641
» Larson, K., Sahm, J., Shenkar, R., і Strauss, B. (1985) Mutat. Res. 150, 77-84
» Dinglay, S., Trewick, S. C., Lindahl, T., і Sedgwick, B. (2000) Genes Dev. 14, 2097-2105

Репарація розривів ДНК

Фотореактивація

Абсорбція енергії УФ-випромінювання молекулами ДНК призводить до утворення різних типів ушкоджень. Хоча одно- і дволанцюжкові розриви, а також ДНК-білкові зшивки можуть виникати, більшість індукованих УФ-випромінюванням пошкоджень припадає на модифікацію азотистих основ, з утворенням циклобутан піримідинових димерів (CPD) і піримідин-піримідонових фотопродуктів (6-4PP), як найбільш найпоширеніших типів фотоушкоджень.

Піримідинові димери є інгібіторами і для реплікації, і для транскрипції, що уповільнює ріст і призводить до мутагенезу в процесі реплікації ДНК, якщо такі пошкодження залишаються невідрепарованими.

Для видалення індукованих світлом ушкоджень у ДНК у багатьох організмів застосовуються ферменти, що специфічно зв'язуються з CPD (CPD-фотоліаза) або з 6-4PP (6-4PP-фотоліази) і виправляють ці пошкодження. CPD-фотоліази виявлені в бактеріях, грибах, рослинах, безхребетних і в багатьох хребетних, 6-4PP-фотоліази виявлені, поки, тільки в Drosophila, шовковому шовкопряді, Xenopus laevis і в гримучих зміях, але не в Escherichia coli або дріжджів. У людей не виявлено фотоліазу. Фотоліази містять FAD як каталітичний кофактор і додатковий хромофор як світлозбиральна антена.

Додаткові хромофори - це або 5,10-метенілтетрагідрофолат (MTHF), або 8-гідрокси-5-деазорібофлавін (8-HDF), з максимумами поглинань на довжинах хвиль 380 і 440 нм, відповідно. Кристалічні структури CPD-фотоліаз E.coli та Anacystis nidulans підтверджують, що для зв'язування з ДНК ферменти повертають піримідиновий димер з дуплексу в поглиблення, що містить каталітичний кофактор. Потім циклобутанове кільце розщеплюється під час перенесення, індукованого світлом електрона. CPD-фотоліази селективно розпізнають CPD, подібно до ДНК-зв'язуючих білків. Біле світло або UV-B-випромінювання індукують експресію CPD-фотоліаз. На відміну від CPD-фотоліазу, 6-4PP-фотоліаза стабільно експресується і не регулюється ні білим світлом, ні UV-B-випромінюванням.

Схематичне зображення фотореактивації у хроматині. Октамери гітонів блакитного кольору, ДНК – чорного. Фотоліаза зв'язується з циклобутан-піримідиновими димерами (CPD), повертає піримідиновий димер і регенерує природні піримідини в ході залежної від освітлення реакції. Фотоліаза переважно репарує CPD лінкетної ДНК. Репарація в нуклеосомах уповільнена і, ймовірно, полегшується динамічними властивостями нуклеосом, що переміщують ушкодження ДНК область лінкерної ДНК.

Клас CDP-специфічних фотоліаз із мікроорганізмів, визначений як клас I фотоліаз, був першим охарактеризованим представником сімейства фотоліаз. Близькоспоріднений клас специфічних фотоліаз до 6-4-фотопродуктів був виявлений нещодавно, представники цього сімейства були знайдені в Drosophila melanogaster, Xenopus laevis і Arabidopsis thaliana. Криптохроми, що є фоторецепторами на фіолетову частину світлового спектра виявлені в рослинах та інших організмах, також є близькими до класу I фотоліаз.

Дальнороднішим сімейством CPD-фотоліаз, назване класом II фотоліаз було ідентифіковано в ряді видів, включаючи тварин, Archaebacterium, Eubacterium і вищих рослин. Було показано, що всі охарактеризовані фотоліази містять відновлений FAD і більшість містять вторинні хромофори залежно від виду або MTHF або 8-HDF. Подібний механізм реакції був запропонований обох класів CPD-фотоліаз. Хромофор MTHF або 8-HDF подібний до антени, яка абсорбує фіолетове світло і витрачає поглинену енергію на регенерацію FADH-.

Склад кофактора рослинної фотоліази не до кінця досліджений, хоча, нещодавно було показано, що CPD-фотоліази з Arabidopsis, що містили тільки FADH, мали ферментативну активність.

Література:

» Fritz Thoma, Light and dark in chromatin repair: repair of UV-induced DNA lesions by photolyase and nucleotide excision repair, Institut fur Zellbiologie, ETH-Zurich, Honggerberg, CH-8093 Zurich, Switzerland
» Characterization of Arabidopsis photolyase enzymes and analysis of their role in protection from ultraviolet-B radiation, Wanda M. Waterworth 1, Qing Jiang, Christopher E. West, M. Nikaido and Clifford M. Bray

Історія відкриття

Однониткове та двониткове пошкодження ДНК

Початок вивчення репарації було покладено роботами А. Келнера (США), який виявив явище фотореактивації (ФР) - зменшення пошкодження біологічних об'єктів, що викликається ультрафіолетовими (УФ) променями, при подальшому впливі яскравим видимим світлом ( світлова репарація).

Ексцизійна репарація

Постеплікативна репарація була відкрита у клітинах E.Coli, що не здатні вичавлювати тімінові димери. Це єдиний тип репарації, який має етапу впізнавання ушкодження.

Примітки

Wikimedia Foundation. 2010 .

Дивитись що таке "Репарація ДНК" в інших словниках:

Відновлення дефектів ДНК, що виникли в результаті мутації або рекомбінації. Здійснюється системою репаративних ферментів, одні з яких встановлюють місце пошкодження, ін його «вирізають», треті синтезують пошкоджені ділянки, четверті ... ... Словник мікробіології

репарація днк- - Виправлення «помилок» в первинній структурі ДНК в результаті дії спеціальних репаративних ферментів … Короткий словник біохімічних термінів

репарація ДНК- - Тематики біотехнології EN DNA repair ... Довідник технічного перекладача

репарація ДНК- DNR reparacija statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis DNR struktūros atsikūrimas po pažeidimo. atitikmenys: англ. DNA repair rus. репарація ДНК … Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

РЕПАРАЦІЯ ДНК- відновлення початкової структури в молекулі ДНК, тобто. правильної послідовності нуклеотидів. Терміни та визначення, що використовуються в селекції, генетиці та відтворенні сільськогосподарських тварин

ДНК репарація- * ДНК репарація * DNA repair ферментативна корекція помилок у нуклеотидній послідовності молекули ДНК. Механізми ДНК захищають генетичну інформацію організму від пошкоджень, що викликаються мутагенами навколишнього середовища (напр., ультрафіолет, ...

ДНК-залежна ДНК-полімераза ДНКполімераза- ДНК залежна ДНК полімераза, ДНКполімераза * ДНК залежна ДНК полімераза, ДНК полімераза * DNA dependent DNA polymerase or DNA polymerase фермент, що каталізує полімеризацію (див.) дезоксирибонуклеозидних трифосфатів у полімерну ... Генетика. Енциклопедичний словник

- (Від позднелат. reparatio відновлення), властиве всім клітинам живих організмів відновлення початкової (нативної) структури ДНК у разі її порушення. Пошкодження структури ДНК може призвести до блокування реплікації ДНК (летальний… Хімічна енциклопедія

Репарація: Репарація ДНК здатність клітин виправляти хімічні пошкодження та розриви у молекулах ДНК. Репарації форма матеріальної відповідальності суб'єкта міжнародного права за шкоду, заподіяну внаслідок скоєного ним міжнародного права.

Система виявлення та репарації вставок, пропусків та помилкових спарювань нуклеотидів, що виникають у процесі реплікації та рекомбінації ДНК, а також у результаті деяких типів пошкоджень ДНК Сам факт помилкового спарювання не дозволяє… … Вікіпедія

Книги

• Метилювання ДНК у рослин. Механізми та біологічна роль, Б. Ф. Ванюшин. Справжнє читання одного з піонерів і відомих світових лідерів у вивченні метилювання ДНК у різних організмів ґрунтовно викладає сьогоднішній стан загальнобіологічної проблеми,...

Пошкоджених при нормальному біосинтезі ДНК у клітині або внаслідок дії фізичних чи хімічних реагентів. Здійснюється спеціальними ферментними системами клітини. Ряд спадкових хвороб (напр., пігментна ксеродерма) пов'язані з порушеннями систем репарації.

Історія відкриття

Початок вивчення репарації було покладено роботами Альберта Кельнера (США), який у 1948 році виявив явище фотореактивації - зменшення пошкодження біологічних об'єктів, що викликається ультрафіолетовими (УФ) променями, при подальшому впливі яскравим видимим світлом ( світлова репарація).

Р. Сетлоу, К. Руперт (США) та інші невдовзі встановили, що фотореактивація - фотохімічний процес, що протікає за участю спеціального ферменту і призводить до розщеплення димерів тиміну, що утворилися в ДНК під час поглинання УФ-кванту.

Пізніше при вивченні генетичного контролю чутливості бактерій до УФ-світла та іонізуючих випромінювань було виявлено темна репарація- властивість клітин ліквідувати пошкодження ДНК без участі видимого світла. Механізм темнової репарації опромінених УФ-світлом бактеріальних клітин був передбачений А. П. Говард-Фландерсом та експериментально підтверджений у 1964 році Ф. Ханавальтом та Д. Петіджоном (США). Було показано, що у бактерій після опромінення відбувається вирізання пошкоджених ділянок ДНК із зміненими нуклеотидами та ресинтез ДНК у пробілах, що утворилися.

Системи репарації існують у мікроорганізмів , а й у клітинах тварин і людини , в яких вони вивчаються на культурах тканин . Відома спадкова недуга людини - пігментна ксеродерма, при якій порушена репарація.

Джерела пошкодження ДНК

Основні типи пошкодження ДНК

Влаштування системи репарації

Кожна із систем репарації включає такі компоненти:

• ДНК-хеліказа - фермент, що «пізнає» хімічно змінені ділянки в ланцюзі і здійснює розрив ланцюга поблизу пошкодження;
• ДНКаза (дезоксирибонуклеаза) - фермент, що "розрізає" 1 ланцюжок ДНК (послідовність нуклеотидів) за фосфодіефірним зв'язком і видаляє пошкоджену ділянку: екзонуклеаза працює на кінцеві нуклеотиди 3' або 5', ендонуклеаза - на нуклеотиди;
• ДНК-полімераза - фермент, що синтезує відповідну ділянку ланцюга ДНК замість видаленого;
• ДНК-лігаза - фермент, що замикає останній зв'язок у полімерному ланцюзі і тим самим відновлює її безперервність.

Типи репарації

Пряма репарація

Пряма репарація - найбільш простий шлях усунення пошкоджень у ДНК, в якому зазвичай задіяні специфічні ферменти, здатні швидко (як правило, в одну стадію) усувають відповідне ушкодження, відновлюючи вихідну структуру нуклеотидів. Так діє, наприклад, O6-метилгуанін-ДНК-метилтрансфераза, яка знімає метильну групу з азотистої основи на один із власних залишків цистеїну.

Ексцизійна репарація

Ексцизійна репарація (англ. excision - вирізання) включає видалення пошкоджених азотистих основ з ДНК і подальше відновлення нормальної структури молекули комплементарної ланцюга. Ферментативна система видаляє коротку однониткову послідовність двониткової ДНК, що містить помилково спарені або пошкоджені підстави, і заміщає їх шляхом синтезу послідовності, комплементарної нитки, що залишилася.

Ексцизійна репарація є найпоширенішим способом репарації модифікованих основ ДНК. Вона базується на розпізнаванні модифікованої основи різними глікозилазами, що розщеплюють N-глікозидний зв'язок цієї основи з сахарофосфатним кістяком молекули ДНК. При цьому існують глікозилази, що специфічно розпізнають присутність у ДНК певних модифікованих основ (оксиметилурацилу, гіпоксантину, 5-метилурацилу, 3-метиладеніну, 7-метилгуаніну тощо). Для багатьох глікозилаз до теперішнього часу описаний поліморфізм, пов'язаний із заміною одного з нуклеотидів кодуючої послідовності гена. Для ряду ізоформ цих ферментів було встановлено асоціацію з підвищеним ризиком виникнення онкологічних захворювань [Chen, 2003].

Висока стабільність ДНК забезпечується не тільки консервативністю її структури та високою точністю реплікації, але й наявністю у клітинах усіх живих організмів спеціальних систем. репарації, що усувають з ДНК ушкодження, що виникають в ній.

Дія різних хімічних речовин, іонізуючої радіації і ультрафіолетового випромінювання може викликати такі порушення структури ДНК:

· Пошкодження одиночних основ (дезамінування, що веде до перетворення цитозину на урацил, аденіну на гіпоксантин; алкілування основ; включення аналогів основ, інсерції та делеції нуклеотидів);

· Пошкодження пари основ (утворення тімінових димерів);

· Розриви ланцюгів (поодинокі та подвійні);

· утворення перехресних зв'язків між основами, а також зшивання ДНК-білок.

Деякі із зазначених порушень можуть і спонтанно, тобто. без участі будь-яких ушкоджуючих факторів.

Будь-який тип ушкоджень призводить до порушення вторинної структури ДНК, що є причиною часткового або повного блокування реплікації. Такі порушення конформації і є мішенню для систем репарації. Процес відновлення структури ДНК заснований на тому, що генетична інформація представлена ​​в ДНК двома копіями - по одному в кожному з ланцюгів подвійної спіралі. Завдяки цьому пошкодження в одному з ланцюгів може бути видалено репараційним ферментом, а ця ділянка ланцюга ресинтезована у своєму нормальному вигляді за рахунок інформації, що міститься в неушкодженому ланцюгу.

В даний час виявлено три основні механізми репарації ДНК: фотореактивація, ексцизійна та постреплікативна репарація. Останні два типи називаються також темновою репарацією.

Фотореактиваціяполягає у розщепленні ферментом фотоліазою, що активується видимим світлом, тімінових димерів, що виникають у ДНК під дією ультрафіолетового випромінювання.

Ексцизійнарепарація полягає у розпізнаванні пошкодження ДНК, вирізанні пошкодженої ділянки, ресинтезі ДНК по матриці інтактного ланцюжка з відновленням безперервності ланцюга ДНК. Такий спосіб називають також репарацією на кшталт вищеплення – заміщення, чи більш образно механізм «ріж – латай». Ексцизійна репарація є багатоетапним процесом і полягає в:

1) «впізнанні» ушкодження;

2) надрізання одного ланцюга ДНК поблизу пошкодження (інцизії);

3) видалення пошкодженої ділянки (ексцизії);

4) ресинтезі ДНК дома віддаленої ділянки;

5) відновлення безперервності репарованого ланцюга за рахунок утворення фосфодіефірних зв'язків між нуклеотидами
(Рис 6.2)

Мал. 6.2 Схема ексцизійної репарації

Репарація починається з приєднання ДНК-N-глікозилазидо пошкодженої основи. Існує безліч ДНК-N-глікозилазу, специфічних до різних модифікованих підстав. Ферменти гідролітично розщеплюють N-глікозидний зв'язок між зміненою основою та дезоксирибозою, це призводить до утворення АП (апуринового-апіримідинового) сайту в ланцюзі ДНК (перший етап). Репарація АП-сайту може відбуватися за участю лише ДНК-інсертази, яка приєднує до дезоксирибози основу відповідно до правила комплементарності. В цьому випадку немає потреби розрізати ланцюг ДНК, вирізати неправильний нуклеотид та репарувати розрив. При більш складних порушеннях структури ДНК потрібна участь всього комплексу ферментів, що беруть участь у репарації (Рис. 6.2): АП-ендонуклеазарозпізнає АП-сайт та розрізає біля нього ланцюг ДНК (II етап). Як тільки в ланцюзі виникає розрив, у роботу вступає АП-екзонуклеазаяка видаляє фрагмент ДНК, що містить помилку (III етап) ДНК-полімераза bзабудовує пролом, що виник, за принципом комплементарності (IV етап). ДНК-лігазаз'єднує 3¢-кінець знову синтезованого фрагмента з основним ланцюгом і завершує репарацію пошкодження (V етап).

Постреплікативнарепарація включається у випадках, коли ексцизійна не справляється з усуненням всіх пошкоджень ДНК до її реплікації. У цьому випадку відтворення пошкоджених молекул призводить до появи ДНК з однонитковими пробілами, а нативна структура відновлюється при рекомбінації.

Вроджені дефекти системи репарації є причиною таких спадкових захворювань, як пігментна ксеродерма, атаксія-телеангіектазія, трихотіодистрофія, прогерія.

РЕПАРАЦІЯ ДНК

Системи репарації

2 Ексцизійна репарація. Приклади та види

3 Репарація помилок реплікації ДНК

4 Рекомбінантна (постреплікативна) репарація у бактерій

5 SOS-репарація

Системи репарації ДНК досить консервативні в еволюції від бактерій до людини та найбільш вивчені у Е. coli.

Відомі два типи репарації:пряма та ексцизійна

Пряма репарація

Пряма репарація - найпростіший шлях усунення пошкоджень у ДНК, у якому зазвичай задіяні специфічні ферменти, здатні швидко (зазвичай, одну стадію) усувати відповідне ушкодження, відновлюючи вихідну структуру нуклеотидів.

1. Так діє, наприклад,О6-метилгуанін-ДНК-метилтрансфераза

(фермент – самогубець), яка знімає мітильну групу з азотистої основи на один із власних залишків цистеїну

У Е. coli може за 1 хв синтезуватися до 100 молекул цього білка. Аналогічний за функціями білок вищих еукаріотів, очевидно, відіграє важливу роль у захисті від раку, що викликається внутрішніми та зовнішніми факторами алкілу.

ДНК-інсертаза

2. ДНК-інсертазами

фотоліаза

3. Тімінові димери "розшиваються" шляхом прямий репарацциза участюфотоліаз, що здійснюють відповідне фотохімічне перетворення. ДНК-фотоліази є групою ферментів, що активуються світлом, з довжиною хвилі 300 - 600 нм (видима область), для чого в їх структурі є особливий світлочутливий центр.

Вони широко поширені в природі та виявлені у бактерій, дріжджів, комах, рептилій, земноводних та людини. Ці ферменти потребують різноманітних кофакторів (FADH, тетрагідрофолієва кислота та ін.), що беруть участь у фотохімічній активації ферменту. Фотоліаза Е. coli є білок з молекулярною масою 35 кДа, міцно пов'язаний з олігорибонуклеотидом довжиною 10-15 нуклеотидівнеобхідним для активності ферменту.

Приклади прямої репарації

1. Метильована основа O 6- mG диметилюється ферментом метилтрансферазуО6-метилгуанін-ДНК-метилтрансфераза (фермент – самогубець), яка переносить мітильну групу на один із своїх залишків

цистеїну

2. АР-сайти можуть репаруватися шляхом прямої вставки пуринів за участю ферментів, які називаютьсяДНК-інсертазами(Від англ. insert-вставляти).

СХЕМА ПРИКЛАДУ ПРЯМОЇ РЕПАРАЦІЇ ПОШКОДЖЕНЬ У ДНК – метильована основа O6- mGдемітується ферментом метилтрансферазою, який переносить метильну групу на один зі своїх залишків амінокислоти цистеїну.

3. Фотоліаза приєднується до тімінового димеру і після опромінення цього комплексу видимим світлом (300-600 нм) димер розшивається.

СХЕМА ПРИКЛАДУ ПРЯМОЇ РЕПАРАЦІЇ ПОШКОДЖЕНЬ У ДНК – Фотоліаза

приєднується до тімінового димеру і після опромінення видимим спектром світла цей димер розшивається.

Ексцизійна репарація

(Від англ. excision - Вирізання).

ВИЗНАЧЕННЯ

Ексцизійна репарація включає видаленняпошкоджених азотистих основ з ДНК та подальше відновленнянормальної структури молекули.

МЕХАНІЗМ

В ексцизійній репарації зазвичай беруть участь кілька ферментів, а сам процес торкається

не тільки пошкоджений ,

але й сусідні з ним нуклеотиди .

УМОВИ

Для ексцизійної репарації необхідний другий (комплементарний) ланцюг ДНК. Загальна спрощена схема ексцизійної репарації представлена ​​рис. 171.

ЕТАПИ

Першим етапом ексцизійної репарації є вирізання аномальних азотистих основ. Його каталізують групаДНК-N-Глікозилаз- ферменти, що розщеплюють глікозидний зв'язок між дезоксирибозою та азотистою основою.

ВАЖЛИВЕ ЗАУВАЖЕННЯ:

УлюдиниДНК-N-глікозилазимають високу субстратну специфічність: різні ферменти цього сімейства розпізнають і вирізають різні аномальні основи(8-оксогуанін, урацил, метилпурини та ін).

УбактерійДНК-N-глікозилазитакої субстратної специфічності не має

ЗАГАЛЬНІ ФЕРМЕНТИ ЕКСЦИЗІЙНОЇ РЕПАРАЦІЇ

НАЗВА	ФУНКЦІЯ	МЕХАНІЗМ
ДНК-N-глікозилази	вирізання аномальних азотистих основ	розщеплює глікозидний зв'язок між дезоксирибозою та азотистою основою
АР-ендонуклеаза	створює умови для роботи наступного ферменту - екзонуклеази	розриває цукро-фосфатний кістяк молекули ДНК в АР-сайті
екзонуклеаза	вищеплює кілька нуклеотидів	послідовно відщеплює кілька нуклеотидів від пошкодженої ділянки одного ланцюга ДНК

КОНКРЕТНІ НАСЛІДНІ КРОКИ ЦЬОГО МЕХАНІЗУ:

Внаслідок дії ДНК- N-Глікозилазутворюється АР-сайт, який атакується ферментом АР-ендонуклеазою. Вона розриває цукро-фосфатний кістяк молекули ДНК в АР-сайті і тим самим створює умови для роботи наступного ферменту. екзонуклеазияка послідовно відщеплює кілька нуклеотидів від пошкодженої ділянки одного ланцюга ДНК

У клітинах бактерій звільнене місце заповнюється відповідними нуклеотидами за участю ДНК-полімерази I, що орієнтується на другий (комплементарний) ланцюг ДНК.

Оскільки ДНК-полімераза I здатна подовжувати З"-кінець одного з ланцюгів у місці розриву в дволанцюгової ДНК і видаляти нуклеотиди з 5"-кінця того ж розриву,

тобто. здійснювати "нік-трансляцію" , цей фермент відіграє ключову роль у репарації ДНК. Остаточне зшивання репарованих ділянок здійснює ДНК-лігаза.

У клітинах еукаріотів (ссавців)

Ексцизійна репарація ДНК у клітинах ссавців супроводжується різким сплеском активності ще одного ферменту.полі АDР-рибозо-полімерази . При цьому відбувається ADP-рибозилювання білків хроматину(гістонів та негістонових білків), що веде до послаблення їх зв'язку з ДНК та відкриває доступ ферментам репарації.

Донором ADP-рибозиу цих реакціях виступаєNAD+, запаси якого сильно виснажуються при ексцизійній репарації ушкоджень, що викликаються рентгенівським опроміненням:

Негативно заряджені залишки ADP-рибозиіз внутрішнього складу молекули NAD+приєднуються через радикалглутаміновийкислоти або фосфосеринудо білків хроматину, що веде до нейтралізації позитивних зарядів цих білків та послаблення їхнього контакту з ДНК.

ЩО ПРЕДСТАВЛЯЄ СЕБЕ ГРУПА ФЕРМЕНТІВ

ДНК – глікозилази

розщеплює глікозидний зв'язок між дезоксирибозою та азотистою основою

що призводить до вирізування аномальних азотистих основ

ДНК – глікозилази , що беруть участь у усуненні окисних ушкоджень ДНК у клітинах прокаріот та еукаріот, Дуже різноманітні і відрізняються за субстратною специфічністю, просторовою структурою та способами взаємодії з ДНК.

До найбільш вивчених ДНК-глікозилазів відносяться:

ендонуклеаза III(EndoIII),

форм амідо піримідин-ДНК-глікозилазу (Fpg),

Mut Tі

Mut Yкишкової палички.

Ендонуклеаза IIIЕ. coli "дізнається" і специфічно вищеплює з ДНК окислені піримідинові основи.

Цей фермент являє собою мономерний глобулярний білок, що складається з 211 амінокислотнихзалишків (мол. маса 23,4 кДа). Ген, що кодує Endo III, секвенований, встановлена ​​його нуклеотидна послідовність. Endo III є залізосерний білок [(4 Fe -4 S )2+-білок], що володіє елементом надвторинної структуритипу "грецький ключ" (спіраль - шпилька - спіраль), службовцям для зв'язування з ДНК. Ферменти з аналогічною субстратною специфічністю та подібною амінокислотною послідовністю виділені також з клітин бика та людини.

Форм амідо піридин-ДНК-глікозилазу Е. coli "дізнається" і вищеплює з ДНК окислені гетероциклічні основи пуринового ряду .

СХЕМА ЕКЦИЗІЙНОЇ РЕПАРАЦІЇ СТАДІЯ 1

ДНКN

СХЕМА ЕКЦИЗІЙНОЇ РЕПАРАЦІЇ

1 ДНКNглікозидаза видаляє пошкоджену основу

АР ендонуклеазу вносить розрив у ДНК

2 Екзонуклеаза видаляє ряд нуклеотидів

3 ДНК полімераза заповнює звільнену ділянку комплементарними

мононуклеотидами

ДНК лігаза зшиває репарований ланцюг ДНК

Mut T- невеликий білок з молекулярною масою 15 кДа, що має нуклеозидтрифосфатазну активність, який переважно гідролізує dGTP до dGMP та пірофосфату.

Біологічна роль Mut T полягає у запобіганні освіті під час реплікації неканонічних парА:Gі А: 8-oxo-G.

Такі пари можуть з'являтися у разі, коли окислена форма

dGTP (8-oxo-dGTP)стає субстратомДНК-полімерази.

Mut Tгідролізує 8-oxo-dGTPу 10 разів швидше, ніж dGTP.

Це робить 8-oxo-dGTPнайкращим субстратомMutTта пояснює його функціональну роль.

Mut Yявляє собою специфічну аденін-ДНК-глікозилазу, що розщеплює N-глікозидний зв'язок між аденіном та дезоксирибозою. аденозину,утворює неканонічну пару з гуаніном.

Функціональна роль цього ферменту полягає у запобіганні мутації

T:A - G:A шляхом відщеплення непошкодженого залишку аденіназ пари основ A: 8-oxo-G.

Нуклеотидна ексцизійна репарація

(АТФ-залежний механізм видалення пошкоджень із ДНК)

Останнім часом в ексцизійній репарації особливу увагу приділяють АТР-залежний механізм видалення пошкоджень з ДНК. Цей вид ексцизійної репарації отримав назву нуклеотидна ексцизійна репарація (Nucleotide excision repair; NER).

Вона включає ДВА ЕТАПУ :

1. видалення з ДНКолігонуклеотидних фрагментів , що містять ушкодження, та

Ексінуклеаза

2. подальшу реконструкцію ланцюга ДНК за участю комплексу ферментів (нуклеаз, ДНК-полімерази, ДНК-лігази та ін).

Видалення фрагмента ДНК відбувається по обидва боки пошкодженогонуклеотиду. Довжина олігонуклеотидних фрагментів, що видаляються, відрізняється у прокаріотів і еукаріотів.

Видалення фрагмента ДНК у прокаріотів

Так, у Е. coli, Ст subtilus, Micrococcus luteus вирізається фрагмент довжиною 12-13 нуклеотидів,

Видалення фрагмента ДНК у еукаріотів

а у дріжджів, земноводних та людини - фрагмент, що складається з 24-32 нуклеотидів.

Ексінуклеаза- Фермент, що видаляє фрагменти ДНК

Вищеплення фрагмента ДНК здійснюється ферментомексінуклеазою(Excinuclease). У Е. coli цей фермент складається з 3 різних протомерів -

uvrA

uvr В

uvr З

кожен із яких виконує певну функцію під час ексцизійного вищеплення фрагмента ДНК. Назва цих білків дано за першими буквами слів"ultra violet repair".

Протомір uvr Амає АТРазну активність, зв'язується з ДНК у вигляді димера, здійснюючи

первинне розпізнавання пошкодження та

зв'язуванняuvr В

Протомір uvr Вмає:

1 . Латентною АТР-азною та латентною хеліказною активністю, необхідною для зміни конформацій та розплітання подвійної спіралі ДНК;

2. Ендонуклеазний активністю, розщеплюючи міжнуклеотидний (фосфодіефірний) зв'язок з бокуЗ"-кінцявищеплюваного фрагмента.

Протомір uvr Сдіє як ендонуклеаза, що вносить розрив у репарований ланцюг ДНК з5"-кінцяфрагмента, що вирізується.

Таким чином, протоміриuvr A, uvr, uvr Свзаємодіють із ДНК у певній послідовності, здійснюючи АТР-залежну реакціювищеплення олігонуклеотидного фрагмента з репарованого ланцюга ДНК.

Пролом, що утворився, в молекулі ДНК реставрується за участю ДНК-полімерази I і ДНК-лігази. Модель ексцизійної репарації за участю перерахованих вище ферментів представлена ​​на рис. 172.

Ексцизійні репарації у людини

Ексцизійні репарації у людини також мають АТФ – залежний характер і включаютьтри основні етапи :

впізнавання пошкодження,

подвійне розрізання ланцюга ДНК,

відновний синтез та

лігування репарованого ланцюга.

Однак, в ексцизійній репарації ДНК людини беруть участь

25 різних поліпептидів ,

16 з яких беруть участь у вищепленні олігонуклеотидного фрагмента, будучи протомірамиексінуклеази,

а решта 9 здійснюють синтез ділянки молекули, що репарується.

У репараційній системі ДНК у людини дуже важливу роль виконують білки транскрипції.

РНК-полімераза II і

TF ПН- один із шести основних факторів транскрипції еукаріот.

Слід зазначити, що ексцизійна репарація у прокаріотів, як і у еукаріотів, залежить від функціонального стану ДНК:

транскрибована ДНК репарується швидше,

чим транскрипційно неактивна.

Цей феномен пояснюється такими факторами:

структурою хроматину,

гомологією ланцюгів ділянок ДНК, що транскрибуються,

ефектом ушкодження ланцюгів та його впливом на РНК-полімеразу.

ВАЖЛИВЕ ЗАУВАЖЕННЯ:

КОДИРУЮЧИЙ ЛАНЦЮГ ДНК (ланцюг зберігання інформації)

МАТРИЧНИЙ ЛАНЦЮГ ДНК (з нього відбувається списування інформації)

Відомо, що такі великі ушкодження, як утворення тімінових димерів, блокують транскрипцію як у бактерій, так і у людини, якщо вони відбуваються на матричного ланцюгаДНК (пошкодження на кодуючоюланцюги не впливаютьна транскрипційний комплекс). РНК-полімераза зупиняється у місці пошкодження ДНК та блокує роботу транскрипційного комплексу.

Транскрипційно-репараційний фактор зчеплення (TRCF) .

У Е. coli посилення репарації при транскрипції опосередковується одним спеціальним білком.транскрипційно-репараційним фактором зчеплення (TRCF) .

Цей білок сприяє :

1. від'єднання РНК-полімерази від ДНК

2. одночасно стимулює утворення комплексу білків,

Здійснюють репарацію пошкодженої ділянки.

Після закінчення репарації РНК-полімераза встає місце і транскрипція триває (див. рис.).

Отже, загальна схема ексцизійної репарації

1. ДНК-N -глікозилаза видаляє пошкоджену основу

2. АР-ендонуклеаза вносить розрив у ланцюг ДНК

3. Екзонуклеаза видаляє низку нуклеотидів

4. ДНК-полімераза заповнює звільнену ділянку

Комплементарними нуклеотидами

5. ДНК лігаза зшиває репарований ланцюг ДНК

Репарація помилок реплікації ДНК

шляхом метилювання

Помилки парування азотистих основ під час реплікації ДНК відбуваються досить часто (у бактерій один раз на 10 тис. нуклеотидів), внаслідок якиху дочірній ланцюг ДНК включаються некомплементарні нуклеотиди материнського ланцюга нуклеотиди -місметчі(англ. mismatch н е відповідати).

Незважаючи на те щоДНК-полімераза Iпрокаріот має здатність до самокорекції, її зусилля щодо усунення помилково приєднаних нуклеотидів. іноді виявляються недостатніі тоді в ДНК залишаються деякі неправильні (некомплементарні) пари.

У цьому випадку репарація відбувається з використанням певної системи, пов'язаної зметилюванням ДНК . Дія цієї системи репарації полягає в тому, що після реплікації через певний час (кілька хвилин) ДНК піддається метилюванню.

У Є. coli метилюєтьсяв основному аденін з освітою

N6-метил-аденіну (N6-mA).

До цього моменту знову синтезована(Дочірня)ланцюг залишається неметильованим.

Якщо в такому ланцюгу є неспарені нуклеотиди, то він піддається репарації: Таким чиномметилювання мітить ДНК та

включає систему виправлення помилок реплікації.

У цій системі репарації дізнаються особливі структури:

послідовністьG-N6-mA-T-Сі наступназа нею деформація

у подвійній спіралі у місці відсутності комплементарності (рис. нижче).

Усунення неспарених нуклеотидів у напівметильованоюмолекулі ДНК бере участь досить складний комплекс ферментів репарації, який сканує поверхню молекули ДНК,вирізає ділянку дочірнього ланцюга , що вдається до місметчам, а потім створює умови для забудовування

його необхідними (комплементарними) нуклеотидами.

Різні компоненти цього комплексу мають різні активностінуклеазний,

хеліказний,

Атразний,

необхідними для внесення розривів у ДНК і вищеплення нуклеотидів, розплітання подвійної спіралі ДНК та енергетичного забезпечення руху комплексу вздовж репарованої частини молекули.

Подібний за структурою та функціями комплекс ферментів репарації виявлено і в людини.

Рекомбінантна (постреплікативна) репарація

У тих випадках, коли з тих чи інших причин вищерозглянуті системи репарації виявляються порушеними, у ланцюгах ДНК можуть утворюватися проломи (недорепаровані ділянки), що мають іноді дуже суттєві розміри, Що загрожує порушенням системи реплікації і може призвести до загибелі клітин.

У цьому випадку клітина може використовувати для репарації однієї молекули ДНК іншу отриману після реплікації молекулу ДНК, тобто залучити для цієї мети механізмрекомбінації.

У бактерій

У бактерій у рекомбінантній репарації бере участьбілок Rec А. Він зв'язується з одноланцюжковою ділянкою ДНК і залучає його до рекомбінації згомологічними ділянками неушкоджених ланцюгів іншої молекули ДНК .

В результаті і розірвана (що містить проломи), і непошкоджена ланцюга молекули ДНК, що репарується, виявляються спаренимиз неушкодженими комплементарними ділянками ДНК, що відкриває можливість репарації шляхом охарактеризованих вище систем.

При цьому можуть відбуватися вирізанняпевного фрагмента та

заповненняз його допомогою проломи в дефектному ланцюзі.

Прогалини і розриви в ланцюгах ДНК, що виникають при цьому, заповнюються за участюДНК-полімерази I та ДНК-лігази .

SOS-репарація

Існування цієї системи вперше постулював М. Радман у 1974 р. Він же дав назву цьому механізму, включивши до нього міжнародний сигнал лиха "SOS" (врятуйте наші душі).

Ця система включається тоді, коли пошкоджень у ДНК стає настільки багато, що загрожує життю клітини. У цьому випадку відбувається індукція активності різноманітної групи генів, що задіяні в різних клітинних процесах, пов'язаних з репарацією ДНК.

Включення тих чи інших генів, що визначаються кількістю пошкоджень у ДНК, призводить до різних за значимістю клітинних відповідей (починаючи зі стандартної репарації пошкодженихнуклеотидів та закінчуючи придушеннямклітинного поділу).

Найбільш вивченаSOS-репараціяу Е. coli, головними учасниками якої є білки, що кодуються генами Rec AіLex А.

Перший з них є поліфункціональнимбілок Rec A, що бере участь

в рекомбінації ДНК, а також

в регуляції транскрипції генів фага лямбда, що вражає Е. coli,

а другий (Білок Lex А)є репресоромтранскрипції великої групи генів, призначених для репарації ДНКбактерій. При його інгібуванні чи дозволі репарація активується.

Зв'язування Rec А з Lex Анаводить до розщеплення останньогоі відповідно до активації генів репарації.

У свою чергу, індукція SOS-системи бактерії служить дляфага лямбда сигналом небезпекиі призводить до того, що профаг перемикається з пасивного на активний (літичний) шляхіснування, викликаючи цим загибель клітини-господаря.

SOS-система репарації виявлена ​​не тільки у бактерій, а й у тварин та людини.

Гени, задіяні в SOS-репарації ушкоджень ДНК

Гени	Наслідки активації гена
uvr А, В, С, D	Репарація пошкоджень вторинної структури ДНК
Rec А	Стреплікативна репарація, індукції SOS-системи
lex А	Вимкнення SOS-системи
rec N, ruv	Репарація двониткових розривів
	Забезпечення рекомбінаційної репарації
umu С, D	Мутагенез, спричинений змінами властивостей ДНК-полімерази
sul А	Пригнічення клітинного поділу

Висновок

Виправлення пошкоджень у ДНК тісно пов'язане з іншими фундаментальними молекулярно-генетичними процесами: реплікацією, транскрипцією та рекомбінацією.Всі ці процеси виявляються переплетенимиу загальну систему взаємодій, що обслуговується великою кількістю різноманітних білків, багато з яких є поліфункціональними молекулами, задіяними в контролю реалізації генетичної інформаціїу клітинах про- та еукаріотів. Водночас очевидно, що природа "не скупиться"на елементах контролю, створюючи найскладніші системи корекції тих пошкоджень у ДНК, які несуть небезпекудля організму та особливо для його потомства. З іншого боку, у тих випадках, коли репараційних можливостей недостатньо для збереження генетичного статусу організму, настає необхідність програмованої клітинної смерті –апоптоз..

СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЇ ЕКСЦИЗІЙНОЇ РЕПАРАЦІЇ У E. COLIЗ УЧАСТЬЮ ЕКСІНУКЛЕАЗИ

1. ТРАНСКРИПЦІЙНО НЕЗАЛЕЖНИЙ МЕХАНІЗМ

2. ТРАНСКРИПЦІЙНО ЗАЛЕЖНИЙ МЕХАНІЗМ

3. ЗАГАЛЬНИЙ ЕТАП РЕПАРАЦІЇ

УМОВНІ ПОЗНАЧЕННЯ

А – білокuvr А

Б - білокuvr У

С - білокuvr З

маленький чорний трикутник – знак вказує на місце пошкодження

СХЕМА РЕПАРАЦІЇ, ПОВ'ЯЗАНА З МЕТИЛЮВАННЯМ ДНК