], однак визначення антиоксидантів як хімічних сполук не дає повного уявлення про захисні властивості об'єкта, що вивчається: вони обумовлюються не тільки кількістю того чи іншого антиоксиданту, але також активністю кожного з них. Активність антиоксиданту, або антиоксидантна активність, АОА - це константа швидкості реакції антиоксиданту з вільним радикалом (kInH). Метод хемілюмінесценції (ХЛ) дозволяє визначати загальну кількість радикалів, яку зв'язують антиоксиданти у зразку (загальну антиоксидантну ємність, ОАЕ), а при використанні методу математичного моделювання кінетики ХЛ також швидкість утворення і реакції радикалів з антиоксидантами, тобто АОА [ , , ].

Найбільш поширена модифікація хемілюмінесцентного методу визначення загальної антиоксидантної ємності заснована на застосуванні люмінолу як активатора хемілюмінесценції [ , , , ]. У кювету хемілюмінометра поміщають зразок з додаванням люмінолу, пероксиду водню і сполуки, здатної утворювати радикали в результаті спонтанного розпаду (термолізу), наприклад 2,2'-азобіс-(2-амідинопропан) дигідрохлориду (АБАП): АБАП → 2R . У присутності молекулярного кисню алкільний радикал R утворює пероксильний радикал ROO: R+O2 → ROO. Далі пероксильний радикал окислює хемілюмінесцентний зонд люмінол (LH 2) і утворюється радикал люмінолу (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . З LH через утворення проміжних речовин (гідропероксиду люмінолу та ендопероксиду люмінолу) утворюється молекула кінцевого продукту окислення люмінолу, амінофталевої кислоти, в електронно-збудженому стані, яка висвічує фотон, і в результаті спостерігається хемілюмінесценція. Інтенсивність ХЛ пропорційна швидкості утворення фотонів, а вона, у свою чергу, пропорційна стаціонарній концентрації LH у системі. Взаємодіючи з радикалами, антиоксиданти переривають описаний ланцюжок перетворень і перешкоджають утворенню фотона.

Сполуки, схильні до термолізу, - не єдине можливе джерело радикалів при аналізі антиоксидантної ємності зразка хемілюмінесцентним методом. Альтернативами є системи пероксидазу хрону-перекис водню [ , ], гемін-пероксид водню , цитохром з-кардіоліпін-пероксид водню та ін. Схема реакцій окислення люмінолу пероксидазами розглянута в роботі Cormier і співавт. .

Кінетичні криві ХЛ цих систем відбивають дві стадії реакції: стадію збільшення інтенсивності ХЛ і стадію плато чи поступового спаду світіння, коли інтенсивність ХЛ або постійна, або повільно знижується. У роботі описано два підходи до вимірювання загальної антиоксидантної ємності, що враховують цю особливість кривих. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) ґрунтується на вимірюванні латентного періоду ХЛ τ і може бути використаний для визначення таких антиоксидантів як тролокс або аскорбінова кислота: вони характеризуються високим значенням константи швидкості реакції з радикалами і з цієї причини можуть бути названі сильними антиоксидантами. Протягом латентного періоду відбувається повне окислення. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) вимірюють ступінь гасіння хемілюмінесценції qна плато або в максимумі хемілюмінесцентної кривої: формула , де I - інтенсивність хемілюмінесценції без антиоксиданту, а I 1 - інтенсивність ХЛ у присутності антиоксиданту. Цей метод використовується, якщо в системі присутні переважно слабкі антиоксиданти з низькими константами швидкості взаємодії з радикалами - набагато нижчими порівняно з константою люмінолу.

Дія антиоксидантів характеризують не лише показниками τ і q. Як видно з робіт [ , ], дія таких антиоксидантів, як сечова кислота в системі гемін-H 2 O 2 -люмінол або токоферол, рутин і кверцетин у системі цитохром з-кардіоліпін-H 2 O 2 -люмінол, характеризується зміною максимальної швидкості наростання ХЛ ( v max). Як показують результати математичного моделювання кінетики, значення констант швидкості взаємодії цих антиоксидантів з радикалами близькі до значення константи люмінолу, тому антиоксиданти можуть бути названі антиоксидантами середньої сили .

Якби матеріал, що вивчається, зокрема рослинна сировина, містив тільки один тип антиоксидантів, то їх вміст можна було б характеризувати одним з трьох перерахованих вище показників ( τ , qабо v max). Але в рослинній сировині міститься суміш антиоксидантів різної сили. Щоб вирішити цю проблему, деякі автори [ , , , ] використали зміну світлосуми хемілюмінесценції за певний час ∆S, розраховане за формулою , де ∆ S 0та ∆ S S- світлосуми ХЛ за заданий час tу контрольному та досліджуваному зразках відповідно. Час має бути достатнім для окислення всіх антиоксидантів у системі, тобто для виходу кривої ХЛ досліджуваного зразка на рівень кривої ХЛ контрольного зразка. Останнє передбачає, що дослідники повинні не тільки реєструвати світлосуму світіння, а й записувати криву кінетики ХЛ протягом досить тривалого часу, що роблять далеко не завжди.

Оскільки всі показники, що вимірюються, залежать від приладу та умов вимірювання, антиоксидантний ефект речовини в досліджуваній системі зазвичай порівнюють з ефектом антиоксиданту, прийнятого за стандарт, наприклад тролоксу [ , ].

Система пероксидаза хрону-пероксид водню застосовувалася для аналізу загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини багатьма авторами. У роботах [ , ] з метою оцінки кількості антиоксидантів у зразках використовували латентний період ХЛ (метод TRAP), а роботах [ , , ] - площа під кривою розвитку ХЛ. Однак у перерахованих роботах немає чіткого обгрунтування вибору тієї чи іншої параметра з метою оцінки ОАЕ.

Метою дослідження було визначити, як співвідношення антиоксидантів різного типу впливає на ОАЕ, і модифікувати метод хемілюмінесценції таким чином, щоб точніше визначати ОАЕ в рослинній сировині. Для цього ми поставили собі кілька завдань. По-перше, порівняти кінетику ХЛ досліджуваних об'єктів з кінетикою стандартних антиоксидантів трьох типів (сильного, середнього та слабкого), щоб зрозуміти, антиоксиданти якого типу роблять основний внесок в ОАЕ досліджуваних об'єктів. По-друге, розрахувати ОАЕ об'єктів, що досліджуються, вимірявши зменшення світлосуми ХЛ під дією цих об'єктів у порівнянні з дією антиоксиданту, що забезпечує найбільший внесок в ОАЕ.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Об'єктами дослідження були промислові зразки плодів глоду, горобини та шипшини виробництва АТ «Красногорсклексредства» (Росія), а також плоди малини, зібрані авторами на території Московської області в умовах природного зростання і висушені при температурі 60–80 °С до припинення виділення ними соку деформації при натисканні.

Реактивами для аналізу антиоксидантної ємності хемілюмінесцентним методом були: КH 2 PO 4 , 20 мМ буферний розчин (рН 7,4); пероксидаза з коріння хрону (активність 112 од./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водний розчин; люмінол (5-аміно-1,2,3,4-тетрагідро-1,4-фталазиндіон, гідразид 3-амінофталевої кислоти, М = 177,11), 1 мМ водний розчин; пероксид водню (Н 2 Про 2 М = 34,01), 1 мМ водний розчин; розчини антиоксидантів (аскорбінової кислоти, кверцетину, токоферолу) Всі реагенти – виробництва фірми Sigma Aldrich (США).

Відвари плодів глоду, горобини та шипшини та настій плодів малини готували за методикою Державної фармакопеї СРСР, викладеної у загальній фармакопейній статті «Настої та відвари».

Визначення загальної антиоксидантної ємності проводили шляхом реєстрації хемілюмінесценції на хемілюмінометрі Lum-100 (ДІСофт, Росія) з використанням програмного забезпечення PowerGraph 3.3. Для визначення ОАЕ в рослинній сировині в кювету приладу поміщали 40 мкл люмінолу в концентрації 1 мМ, 40 мкл пероксидази хрону в концентрації 0,1 мкМ, від 10 до 50 мкл відвару або настою (залежно від концентрації) та фосфатний буфер у кількості доведення загального обсягу проби до 1 мл. Кювету встановлювали у прилад та реєстрували ХЛ, спостерігаючи фоновий сигнал. Після закінчення 48 з реєстрації фонового сигналу в кювету вносили 100 мкл Н 2 Про 2 концентрації 1 мМ і продовжували реєстрацію ХЛ протягом 10 хв. Готували по чотири проби з різною концентрацією кожного з рослинних об'єктів. Реєстрували також ХЛ для розчинів аскорбінової кислоти, кверцетину та токоферолу у п'яти різних концентраціях для кожного з антиоксидантів. Надалі ОАЕ зразків відварів та настою перераховували на кверцетин.

Концентрації люмінолу, пероксидази хрону та перекису водню були підібрані так, щоб визначати антиоксидантну ємність водних витягів з лікарської рослинної сировини за прийнятний час (не більше 10 хв). За цей час криві хемілюмінесценції для антиоксидантів аскорбату та флавоноїду кверцетину (основні антиоксиданти рослинної сировини) виходили на плато, що вказувало на повне руйнування антиоксидантів у системі. Розведення досліджуваних зразків та концентрації розчинів стандартних антиоксидантів (вказані у підписах до малюнків) підбирали таким чином, щоб усі кінетичні криві ХЛ були виміряні за однієї і тієї ж чутливості приладу.

Антиоксидантну ємність розраховували щодо зміни площі (∆ S) під кінетичною кривою хемілюмінесценції (світлосуми) при додаванні речовини, що містить антиоксидант. Для цього підраховували S 0для системи без антиоксиданту та вичитали з неї площу S S, Що характеризує систему, до якої був доданий антиоксидант. Величина ∆ Sзалежить від чутливості хемілюмінометра та умов вимірювання. Відношення ∆ S/C · V(де C- концентрація досліджуваного біологічного матеріалу в кюветі, г/л, та V- обсяг кювети, л) виражає антиоксидантну ємність 1 г матеріалу, що вивчається, тобто рослинної сировини.

Аналогічно розраховували антиоксидантну ємність ∆ S Aрозчину стандартного антиоксиданту, наприклад, кверцетину, поміщеного в той же обсяг реакційної суміші. Відношення ∆ S A / C A · V(де C A- вагова концентрація антиоксиданту в кюветі, г/л) виражає антиоксидантну ємність 1 г антиоксиданту.

Для кожного зі стандартних антиоксидантів реєстрували сигнал від розчинів декількох концентрацій, щоб переконатися, що розрахунки ведуться в межах лінійної залежності, а отримані результати відтворюються. Справді, було отримано лінійну залежність (∆ S A = k A · C A) сигналу від концентрації, за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт k A. За критерієм Фішера отримані для стандартних антиоксидантів значення k Aстатистично значущі з ймовірністю 0,975. Далі реєстрували сигнал від чотирьох концентрацій для кожного з чотирьох рослинних зразків і для всіх зразків отримали лінійну залежність сигналу від концентрації (∆ S = k · C), за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт k. З ймовірністю 0,975 (критерій Фішера) отримані для рослинних зразків значення статистично значущі. Загальну антиоксидантну ємність рослинного матеріалу у перерахунку на масу стандартного антиоксиданту (мг%) знаходили за формулою .

Значення були представлені як середнє арифметичне ± середньоквадратичне відхилення (M ± δ) при p

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Вивчення кінетики хемілюмінесценції в присутності аскорбату натрію (Рис. 1. Вплив аскорбату натрію на кінетику хемілюмінесценції) data-note="Концентрації компонентів системи: люмінол - 40 мкМ, пероксидаза хрону -1 контрольний зразок; 2 - 0,05 мкМ; 3 - 0,10 мкМ; 4 - 0,15 мкМ; 5 - 0,2 мкМ; 6 - 0,25 мкМ аскорбату натрію.">рис. антиоксиданту характерний латентний період, коли ХЛ практично повністю пригнічена, його тривалість пропорційна кількості антиоксиданту в системі, при цьому не змінюється ні нахил кривих ХЛ, ні інтенсивність ХЛ на плато. в системі, у тому числі радикали люмінолу, і ХЛ не розвивається доти, доки не окислиться весь аскорбат.

Іншими дослідниками також показано, що результати хімічного аналізу та значення ОАЕ, визначене хемілюмінесцентним методом, часто не збігаються. У роботі загальна антиоксидантна ємність, визначена в системі пероксидазу-люмінол-перекис водню, корелювала з вмістом тритерпенових сполук. Однак у роботі тих самих авторів, у якій об'єктом дослідження була інша рослина, не спостерігали кореляції ОАЕ із вмістом будь-якої групи речовин, у тому числі флавоноїдів.

Подібні розбіжності пов'язані щонайменше із трьома чинниками. По-перше, має значення активність антиоксидантів, тобто швидкість їх взаємодії з радикалами, яка різна для різних антиоксидантів, що входять до складу рослинного зразка. За даними Ізмайлова, константи швидкості відповідних реакцій для мексидолу, токоферолу та кверцетину співвідносяться як 0,04:2:60. По-друге, кожна молекула антиоксиданту, вступаючи в хімічну реакцію, може перехопити різну кількість радикалів. За даними роботи , кверцетин, сечова і аскорбінова кислоти перехоплювали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 і 0,5 ± 0,2 радикалів на одну молекулу антиоксиданту, що прореагувала відповідно (використовувалася система гемін-H 2 O 2 -люмінол). По-третє, на результати дослідження могло вплинути наявність пероксидазної активності у самих рослинних зразків, як у роботі, а також наявність у зразках кальцію, який, як це показано в роботі, здатний у певних умовах підвищувати активність пероксидази хрону. Зазвичай це зумовлює вищу інтенсивність ХЛ на плато, ніж контрольних кривих, чого ми, проте, не спостерігали.

Перший фактор різко обмежує застосування такого параметра, як зміна світлосуми, так як час вимірювання хемілюмінесценції має бути більшим за час витрачання всіх антиоксидантів у досліджуваному зразку. Про настання цього моменту можна судити лише вимірюваючи кінетику хемілюмінесценції. Крім того, внесок слабких антиоксидантів в ОАЕ різко занижений, оскільки час їхнього повного окислення значно перевищує прийнятну тривалість вимірювання (10–20 хв).

Ще більше значення має стехіометричний коефіцієнт антиоксиданту. Кількість радикалів n, що перехоплюється ним, і де ρ - стехіометричний коефіцієнт, а ∆ m- Зміна концентрації антиоксиданту за час вимірювання, в нашому випадку - вихідна концентрація досліджуваної речовини в дослідній пробі.

Різниця в світлосумі свічення без антиоксиданту і в його присутності пропорційна n. Сумарна кількість перехоплених радикалів дорівнює де ρ i- стехіометричний коефіцієнт конкретного антиоксиданту, а m i- Його концентрація під час вимірювання. Сумарна кількість перехоплених радикалів явно не дорівнює сумарній кількості антиоксидантів, оскільки коефіцієнти ρ iне тільки не рівні одиниці, а й суттєво відрізняються для різних антиоксидантів.

Величина nпропорційна різниці світлосум, виміряних за певний час між зразком, що містить антиоксидант, і контрольним зразком, що не містить антиоксидантів: S = k · n, де k- Коефіцієнт, постійний за однакових умов вимірювання.

Розглянутий у статті метод дозволяє визначити загальну антиоксидантну ємність, тоді як хімічний аналіз дозволяє визначити сумарний вміст антиоксидантів продукту. Тому метод хемілюмінесценції представляється інформативнішим за хімічні аналізи.

Підібрані нами умови оцінки загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини методом реєстрації кінетики хемілюмінесценції в системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу (концентрації компонентів - 4 нМ, 100 мкМ і 40 мкМ4, 2, 2; забезпечили окислення сильних антиоксидантів (аскорбінова кислота) та антиоксидантів середньої сили (кверцетин) за 10 хв. Така тривалість вимірювання зручна та забезпечує необхідну якість вимірювань.

Аналіз кінетики хемілюмінесценції показав, що у вивчених об'єктах (відварах плодів горобини, шипшини, глоду та настої плодів малини) основними антиоксидантами є антиоксиданти середньої сили, у тому числі флавоноїди, і слабкої сили (токоферол та ін). На основі зменшення світлосуми хемілюмінесценції було розраховано загальну антиоксидантну ємність для вивчених об'єктів. Порівняння отриманих значень ОАЕ з результатами хімічного аналізу показало, що продукти, що містять однакову кількість антиоксидантів з різним їх співвідношенням, можуть відрізнятися за своєю здатністю ефективно захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, у яких міститься суміш різних антиоксидантів. При цьому вона відрізняється простотою та невисокою вартістю дослідження. Поєднання вимірювання кінетики хемілюмінесценції з математичним моделюванням реакцій дозволить не лише автоматизувати процес визначення ОАЕ, а й визначати внесок окремих груп антиоксидантів у показник.

Ключові слова

вільний радикал/антиоксидант/ антиоксидантна активність / загальна антиоксидантна ємність / хемілюмінесценція/ люмінол / free radical / antioxidant / antioxidant activity / total antioxidant capacity / chemiluminescence / luminol

Анотація наукової статті з хімічних наук, автор наукової роботи - Георгій Костянтинович Володимиров, Є. В. Сергунова, Д. Ю. Ізмайлов, Ю. А. Володимиров

Лікарська рослинна сировина є одним із джерел антиоксидантів для організму людини. Серед методів визначення вмісту антиоксидантів у рослинних об'єктах поширений метод хемілюмінесцентного аналізу. У цій роботі він був використаний для оцінки загальної антиоксидантної ємності(ОАЕ) відварів плодів горобини, шипшини та глоду і настою плодів малини. У досвіді реєстрували кінетику хемілюмінесценціїв системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу. Концентрації та обсяг компонентів системи у пробі були підібрані так, щоб сильні антиоксиданти (аскорбінова кислота) та антиоксиданти середньої сили (кверцетин) повністю окислювалися за час вимірювання (10 хв). Запропоновано та обґрунтовано спосіб розрахунку ОАЕ на основі зміни світлосуми хемілюмінесценціїу присутності рослинних зразків. Аналіз кінетики хемілюмінесценціїпоказав, що у вивчених об'єктах переважають антиоксиданти середньої сили, зокрема флавоноїди, і слабкі антиоксиданти (токоферол та інших.). Зіставлення розрахованих значень ОАЕ для об'єктів, що вивчаються, і даних їх хімічного аналізу показало, що продукти, що містять одну і ту ж кількість антиоксидантів з різним їх співвідношенням за типами, можуть відрізнятися по здатності захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, містять суміш антиоксидантів різних типів.

Схожі теми наукових праць з хімічних наук, автор наукової роботи – Георгій Костянтинович Володимиров, Є. В. Сергунова, Д. Ю. Ізмайлов, Ю. А. Володимиров

• 2016 / Джорджій Владимиров, Сергунова Е.В., Ізмайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А.

• Визначення антиоксидантів методом активованої хемілюмінесценції з використанням 2,2"-азо-біс(2-амідинопропану)

  2012 / Алексєєв А.В., Проскурніна О.В., Володимиров Ю.А.

• Антиоксидантна дія дигідрокверцетину та рутину в пероксидазних реакціях, що каталізуються цитохромом з

  2008 / Дьомін Є.М., Проскурніна Є.В., Володимиров Ю.А.

• Оцінка окисної та антиоксидантної здатності біологічних субстратів з хемілюмінесценції, індукованої реакцією Фентона

  2016 / Піскарьов Ігор Михайлович, І.П. Іванова

• Визначення вмісту ліпогідропероксидів у ліпопротеїнах сироватки крові з використанням системи мікропероксидазу-люмінол.

  2011 / Теселкін Юрій Олегович, Бабенкова Ірина Володимирівна

• Методи дослідження антиоксидантів

  2004 / Хасанов Ст Ст, Рижова Г. Л., Мальцева Є. Ст.

• Антиоксидантна активність рослин, що використовуються в етномедицине Туви

  2012 / Чехані Н.Р., Теселкін Ю.О., Павлова Л.А., Козін С.В., Любицький О.Б.

• Вивчення антиоксидантних властивостей Фоспренілу у різних біологічних тест-системах

  2017 / О. В. Санін, О. М. Наровлянський, О. В. Пронін, Т. Н. Кожевнікова, В. Ю. Саніна, О. Д. Агафонова

• Вплив різних доз поліхлорованих біфенілів на стан спонтанної та індукованої імуноглобуліном люмінолзалежної хемілюмінесценції цільної крові

  2016 / Габдулхакова І.Р., Каюмова О.Ф., Самоходова О.В.

• Оцінка системи ліпопероксидації антиоксидантного захисту у дітей з есенціальною артеріальною гіпертензією методами спектро-фотометрії та хемілюмінесценції

  2014 / Натяганова Лариса Вікторівна, Гаврилова Оксана Олександрівна, Колесникова Лариса Романівна

Хімічна чутливість визначення повної антиоксидантної здатності в медичному матеріалі

p align="justify"> Medicinal plant material is one of sources antioxidants for human body. Chemiluminescence analysis є одним з загальних методів визначення вмісту антиоксидантів в матеріалах матеріалу. У нашій роботі, хімічнаluminescence analysis була використана для визначення повної антиоксидантної сили (TAC) з резиденції муки, rose і hawthorn, як добре, як raspberry fruit infusion. Експерименти встановлені кінетиками хімічноїluminescence від системи, що містять консерадичну периксидазу, хлоридний oxide і luminol. Концентрації і розміри компонентів системи були схожі на те, що сильні антиоксиданти (ascorbic acid) і antioxidants average force (quercetin) були повністю oxidized під час вимірювання (10 хвилин). Метод методу TAC калькуляції ґрунтується на змінах в хімічних лампах світлового sum v presence of plant samples був підтверджений і підпорядкований. Analysis of chemiluminescence kinetics доведено, що антиоксиданти послідовності сили домінують в об'єктах, що містяться, включаючи flavonoids і weak antioxidants (tocopherol and others). Порівняння оцінених TAC-відповідей для об'єктів під час випробування і їх хімічної аналітики дані показують, що продукція складається з самої суми антиоксидантів з різними ratios antioxidants відповідно до типів м'якої варіації в їхній здатності до захисту тіла проти radical effects. Технологія описана є промішування одного для вивчення структури об'єктів, що містить змішувачі різних типів антиоксидантів.

Текст наукової роботи на тему «Хемілюмінесцентна методика визначення загальної антиоксидантної ємності у лікарській рослинній сировині»

хемілюмінесцентна методика визначення загальної антиоксидантної ємності в лікарській рослинній сировині

Г. К. Володимиров1 ^, Є. В. Сергунова2, Д. Ю. Ізмайлов1, Ю. А. Володимиров1

1 Кафедра медичної біофізики, факультет фундаментальної медицини, Московський державний університет імені М. В. Ломоносова, Москва

2 Кафедра фармакогнозії, фармацевтичний факультет,

Перший Московський державний медичний університет імені І. М. Сєченова, Москва

Лікарська рослинна сировина є одним із джерел антиоксидантів для організму людини. Серед методів визначення вмісту антиоксидантів у рослинних об'єктах поширений метод хемілю-мінесцентного аналізу. У цій роботі він був використаний для оцінки загальної антиоксидантної ємності (ОАЕ) відварів плодів горобини, шипшини та глоду та настою плодів малини. У досвіді реєстрували кінетику хемілюмінесценції в системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу. Концентрації та обсяг компонентів системи у пробі були підібрані так, щоб сильні антиоксиданти (аскорбінова кислота) та антиоксиданти середньої сили (кверцетин) повністю окислювалися за час вимірювання (10 хв). Запропоновано та обґрунтовано спосіб розрахунку ОАЕ на основі зміни світлосуми хемілюмінесценції у присутності рослинних зразків. Аналіз кінетики хемілюмінесценції показав, що у вивчених об'єктах переважають антиоксиданти середньої сили, у тому числі флавоноїди, та слабкі антиоксиданти (токоферол та ін.). Зіставлення розрахованих значень ОАЕ для об'єктів, що вивчаються, і даних їх хімічного аналізу показало, що продукти, що містять одну і ту ж кількість антиоксидантів з різним їх співвідношенням за типами, можуть відрізнятися по здатності захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, містять суміш антиоксидантів різних типів.

Ключові слова: вільний радикал, антиоксидант, антиоксидантна активність, загальна антиоксидантна ємність, хемілюмінесценція, люмінол

Фінансування: роботу виконано за підтримки Російського наукового фонду, грант № 14-15-00375.

ЕхЗ Для кореспонденції: Георгій Костянтинович Володимиров

119192, м Москва, Ломоносівський пр-т, д. 31, к. 5; [email protected]

Статтю отримано: 10.03.2016 Статтю прийнято до друку: 18.03.2016

хімічна визначальна величина загальної антиоксидантної здатності в медичному матеріалі

1 Department of Medical Biophysics, Faculty of Fundamental Medicine, Ломоносов, Moscow State University, Moscow, Russia

2 Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy,

The First Sechenov Moscow State Medical University, Москва, Росія

p align="justify"> Medicinal plant material is one of sources antioxidants for human body. Chemiluminescence analysis є одним з загальних методів визначення вмісту антиоксидантів в матеріалах матеріалу. У нашій роботі, хімічнаluminescence analysis була використана для визначення повної антиоксидантної сили (TAC) з резиденції муки, rose і hawthorn, як добре, як raspberry fruit infusion. Експерименти встановлюються кінетиками хімічноїluminescence системи, що полягають в консервативному кисневому peroxidase, hydrogen peroxide and luminol. Концентрації і розміри компонентів системи були схожі на те, що сильні антиоксиданти (ascorbic acid) і antioxidants average force (quercetin) були повністю oxidized під час вимірювання (10 хвилин). Метод методу TAC калькуляції ґрунтується на змінах в хімічних лампах світлового sum v presence of plant samples був підтверджений і підпорядкований. Analysis of chemiluminescence kinetics доведено, що антиоксиданти послідовності сили домінують в об'єктах, що містяться, включаючи flavonoids і weak antioxidants (tocopherol and others). Порівняння оцінених TAC-відповідей для об'єктів під час випробування і їх хімічної аналітики дані показують, що продукція складається з самої суми антиоксидантів з різними ratios antioxidants відповідно до типів м'якої варіації в їхній здатності до захисту тіла проти radical effects. Технологія описана є промішування одного для вивчення структури об'єктів, що містить змішувачі різних типів антиоксидантів.

Ключові слова: free radical, antioxidant, antioxidant activity, total antioxidant capacity, chemiluminescence, luminol

Funding: ця робота була підтримана Russian Science Foundation, grant no. 14-15-00375.

Посилання: акторів, які мають Andrey Alekseev від Ломоносова Москву State University для своєї допомоги в школі. Correspondence повинна бути addressed: Georgiy Vladimirov

Ломоновський проспект, d. 31, k. 5, Moscow, Russia, 119192; ur [email protected] Received: 10.03.2016 Accepted: 18.03.2016

Вільні радикали, що утворюються в організмі, порушують структуру мембран клітин, що, своєю чергою, веде до розвитку різних патологічних станів. Руйнівне окисне вплив радикалів попереджає система антиоксидантного захисту організму, в якій важливу роль відіграють низькомолекулярні сполуки – перехоплювачі (пастки) радикалів. Одним із джерел антиоксидантів є лікарська рослинна сировина, а також препарати на її основі, вивчення антиоксидантного потенціалу яких допомагає підвищити їх профілактико-терапевтичний ефект.

Основні методики визначення антиоксидантів розглянуті в роботах, проте визначення антиокси-дантів як хімічних сполук не дає повного уявлення про захисні властивості об'єкта, що вивчається: вони обумовлюються не тільки кількістю того чи іншого антиоксиданту, але також активністю кожного з них. Активність антиоксиданту, або антиоксидантна активність, АОА - це константа швидкості реакції антиоксиданту з вільним радикалом (kInH). Метод хемілюмінесценції (ХЛ) дозволяє визначати загальну кількість радикалів, яке пов'язують антиоксиданти у зразку (загальну антиоксидантну ємність, ОАЕ), а при використанні методу математичного моделювання кінетики ХЛ - також швидкість утворення і реакції радикалів з антиокси-дантами, тобто АОА.

Найбільш поширена модифікація хемілюмінесцентного методу визначення загальної антиоксидантної ємності заснована на застосуванні люмінолу в якості активатора хемілюмінесценції. У кювету хемілю-мінометра поміщають зразок з додаванням люмінолу, пероксиду водню та сполуки, здатної утворювати радикали в результаті спонтанного розпаду (термолізу), наприклад 2,2"-азобіс-(2-амідинопропан) дигідрохлориду (АБАП):

У присутності молекулярного кисню алкільний радикал R ^ утворює пероксильний радикал ROO ^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv З LH через утворення проміжних речовин (гід-ропероксиду люмінолу та ендопероксиду люмінолу) утворюється молекула кінцевого продукту окислення люміно-лу, амінофталевої кислоти, в електронно-збудженому стані, яка висвічує фотон, . Інтенсивність ХЛ пропорційна швидкості утворення фотонів, а вона, у свою чергу, пропорційна стаціонарній концентрації LH у системі. Взаємодіючи з радикалами, антиоксиданти переривають описаний ланцюжок перетворень і перешкоджають утворенню фотона.

Сполуки, схильні до термолізу, - не єдине можливе джерело радикалів при аналізі антиоксидантної ємності зразка хемілюмінесцентним методом. Альтернативами є системи пероксидазу хрону-перекис водню, гемін-пероксид водню, цитохром с-кардіоліпін-пероксид водню та ін. Схема реакцій окиснення люмінолу пероксидазами розглянута в роботі Cormier та співавт. .

Кінетичні криві ХЛ для цих систем відображають дві стадії реакції: стадію збільшення інтенсивності ХЛ та стадію плато або поступового спаду свічення, коли

інтенсивність ХЛ або постійна, або повільно знижується. У роботі описано два підходи до вимірювання загальної антиоксидантної ємності, що враховують цю особливість кривих. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) заснований на вимірюванні латентного періоду ХЛ т і може бути використаний для визначення таких антиоксидантів, як тролокс або аскорбінова кислота: вони характеризуються високим значенням константи швидкості реакції з радикалами і тому можуть бути названі сильними антиоксидантами . Протягом латентного періоду відбувається повне окислення. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) вимірюють ступінь гасіння хемілюмінесценції q на плато або в максимумі хемілю-мінесцентної кривої:

де I - інтенсивність хемілюмінесценції без антиоксиданту, а 11 - інтенсивність ХЛ у присутності антиоксиданту. Цей метод використовується, якщо в системі присутні переважно слабкі антиоксиданти з низькими константами швидкості взаємодії з радикалами - набагато нижчими порівняно з константою люмінолу.

Дія антиоксидантів характеризують як показниками т і ц. Як видно з робіт дія таких антиоксидантів, як сечова кислота в системі гемін-Н202-люмінол або токоферол, рутин і кверцетин в системі цитохром с-кардіоліпін-Н202-люмінол, характеризується зміною максимальної швидкості наростання ХЛ (утх). Як показують результати математичного моделювання кінетики, значення констант швидкості взаємодії цих антиоксидантів з радикалами близькі до значення константи люмінолу, тому антиоксиданти можуть бути названі антиоксидантами середньої сили .

Якби матеріал, що вивчається, зокрема рослинна сировина, містив тільки один тип антиоксидантів, то їх вміст можна було б характеризувати одним з трьох перерахованих вище показників (т, ц або V). Але в рослинній сировині міститься суміш антиоксидантів різної сили. Щоб вирішити цю проблему, деякі автори використали зміну світлосуми хемілюмінесценції за певний час ДЕ, розраховану за формулою

ДЕ = ДЕ0 - ДЕ,

де ДЕ0 та ДЕ5 - світлосуми ХЛ за заданий час? у контрольному та досліджуваному зразках відповідно. Час має бути достатнім для окислення всіх антиоксидантів у системі, тобто для виходу кривої ХЛ досліджуваного зразка на рівень кривої ХЛ контрольного зразка. Останнє передбачає, що дослідники повинні не тільки реєструвати світлосуму світіння, а й записувати криву кінетики ХЛ протягом досить тривалого часу, що роблять далеко не завжди.

Оскільки всі показники, що вимірюються, залежать від приладу та умов вимірювання, антиоксидантний ефект речовини в досліджуваній системі зазвичай порівнюють з ефектом антиоксиданту, прийнятого за стандарт, наприклад тролоксу .

Система пероксидаза хрону-пероксид водню застосовувалася для аналізу загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини багатьма авторами. У роботах з оцінки кількості антиоксидантів у зразках використовували латентний період ХЛ (метод TRAP), а роботах - площа під кривою розвитку ХЛ. Однак у перерахованих роботах не дано чіткого обґрунтова-

вання вибору того чи іншого параметра для оцінки ОАЕ.

Метою дослідження було визначити, як співвідношення антиоксидантів різного типу впливає на ОАЕ, і модифікувати метод хемілюмінесценції таким чином, щоб точніше визначати ОАЕ в рослинній сировині. Для цього ми поставили собі кілька завдань. По-перше, порівняти кінетику ХЛ досліджуваних об'єктів з кінетикою стандартних антиоксидантів трьох типів (сильного, середнього та слабкого), щоб зрозуміти, антиоксиданти якого типу роблять основний внесок в ОАЕ досліджуваних об'єктів. По-друге, розрахувати ОАЕ досліджуваних об'єктів, вимірявши зменшення світлосуми ХЛ під дією цих об'єктів у порівнянні з дією антиоксиданту, що забезпечує найбільший внесок в ОАЕ.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Об'єктами дослідження були промислові зразки плодів глоду, горобини та шипшини виробництва АТ «Красногорсклексредства» (Росія), а також плоди малини, зібрані авторами на території Московської області в умовах природного зростання і висушені при температурі 60-80 ° С до припинення виділення ними соку деформації при натисканні.

Реактивами для аналізу антиоксидантної ємності хемілюмінесцентним методом були: KH2PO4, 20 мМ буферний розчин (рН 7,4); пероксидаза з коріння хрону (активність 112 од./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водний розчин; люмінол (5-аміно-1,2,3,4-тетрагідро-1,4-фталазиндіон, гідразид 3-амінофталевої кислоти, М = 177,11), 1 мМ водний розчин; пероксид водню (Н2О2, М = 34,01), 1 мМ водний розчин; розчини антиоксидантів (аскорбінової кислоти, кверцетину, токоферолу) Всі реагенти – виробництва фірми Sigma Aldrich (США).

Відвари плодів глоду, горобини та шипшини та настій плодів малини готували за методикою Державної фармакопеї СРСР, викладеної у загальній фармакопейній статті «Настої та відвари».

Визначення загальної антиоксидантної ємності проводили шляхом реєстрації хемілюмінесценції на хемі-люмінометрі Lum-100 (ДІСофт, Росія) з використанням програмного забезпечення PowerGraph 3.3. Для визначення ОАЕ в рослинній сировині в кювету приладу поміщали 40 мкл люмінолу в концентрації 1 мМ, 40 мкл пероксидази хрону в концентрації 0,1 мкМ, від 10 до 50 мкл відвару або настою (залежно від концентрації) та фосфатний буфер у кількості доведення загального обсягу проби до 1 мл. Кювету встановлювали у прилад та реєстрували ХЛ, спостерігаючи фоновий сигнал. Після закінчення 48 з реєстрації фонового сигналу в кювету вносили 100 мкл Н2О2 концентрації 1 мМ і продовжували реєстрацію ХЛ протягом 10 хв. Готували по чотири проби з різною концентрацією кожного з рослинних об'єктів. Реєстрували також ХЛ для розчинів аскорбінової кислоти, кверцетину та токоферолу в п'яти різних концентраціях для кожного з антиоксидантів. Надалі ОАЕ зразків відварів та настою перераховували на кверцетин.

Концентрації люмінолу, пероксидази хрону та перекису водню були підібрані так, щоб визначати антиоксидантну ємність водних витягів з лікарської рослинної сировини за прийнятний час (не більше 10 хв). За цей час криві хемілюмінесценції для антиоксидантів аскорбату та флавоноїду кверцетину (основні антиоксиданти рослинної сировини)

виходили на плато, що вказувало на повну руйнацію антиоксидантів у системі. Розведення досліджуваних зразків та концентрації розчинів стандартних антиокси-дантів (вказані у підписах до малюнків) підбирали таким чином, щоб усі кінетичні криві ХЛ були виміряні за однієї і тієї ж чутливості приладу.

Антиоксидантну ємність розраховували щодо зміни площі (AS) під кінетичною кривою хемілюмінесценції (світлосуми) при додаванні речовини, що містить антиоксидант. Для цього підраховували S0 для системи без антиоксиданту і віднімали з неї площу SS, що характеризує систему, до якої був доданий антиоксидант. Величина AS залежить від чутливості хемілюмінометра і умов вимірювання. Відношення AS/C ■ V (де C - концентрація досліджуваного біологічного матеріалу в кюветі, г/л, і V - об'єм кювети, л) виражає антиоксидантну ємність 1 г матеріалу, що вивчається, тобто рослинної сировини.

Аналогічним чином розраховували антиоксидантну ємність ASa розчину стандартного антиоксиданту, наприклад кверцетину, поміщеного в той же обсяг реакційної суміші. Відношення AS/CÄ V (де CA - вагова концентрація антиоксиданту в кюветі, г/л) виражає антиоксидантну ємність 1 г антиоксиданту.

Для кожного зі стандартних антиоксидантів реєстрували сигнал від розчинів декількох концентрацій, щоб переконатися, що розрахунки ведуться в межах лінійної залежності, а отримані результати відтворюються. Справді, була отримана лінійна залежність (ASa = kA CA) сигналу від концентрації, за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт kA. За критерієм Фішера, отримані для стандартних антиоксидантів значення kA статистично значущі з ймовірністю 0,975. Далі реєстрували сигнал від чотирьох концентрацій для кожного з чотирьох зразків рослин, і для всіх зразків отримали лінійну залежність сигналу від концентрації (AS = k ■ C), за якою розрахували стехіометричний коефіцієнт k. З ймовірністю 0,975 (критерій Фішера) отримані для рослинних зразків значення статистично значущі. Загальну антиоксидантну ємність рослинного матеріалу в перерахунку на масу стандартного антиоксиданту (мг%) знаходили за формулою

ОАЕ = k ■ 105. k

Значення були представлені як середнє арифметичне ± середньоквадратичне відхилення (M ± 5) при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Вивчення кінетики хемілюмінесценції у присутності аскорбату натрію (рис. 1) показало, що для цього антиоксиданту характерний латентний період, коли ХЛ практично повністю пригнічена. Його тривалість пропорційна кількості антиоксиданту у системі. При цьому не змінюється нахил кривих ХЛ, ні інтенсивність ХЛ на плато. Це пояснюється тим, що аскорбінова кислота - сильний антиоксидант, що перехоплює всі радикали, що утворюються в системі, у тому числі радикали люмінолу, і ХЛ не розвивається доти, доки не окислиться весь аскорбат.

Дія токоферолу (рис. 2) виявлялося зниженням інтенсивності ХЛ на плато, що характерно для слабких антиоксидантів, хоча токоферол вважається одним з самих

сильних антиоксидантів. Можливо, така невідповідність пов'язана з тим, що у нашому досвіді вільні радикали перебували у водному розчині, тоді як зазвичай дію токоферолу вивчають у неполярних середовищах. В роботі, де джерелом радикалів служив комплекс цитохрому з кардіоліпіном і реакція з люмінолом протікала в межах цього комплексу, токоферол мав властивості антиоксиданту середньої сили.

Вивчивши дію різних концентрацій кверцетину на нашу систему (рис. 3) і порівнявши кінетичні криві для нього та аскорбату натрію та токоферолу, можна відзначити, що основна дія кверцетину проявляється у зміні кута нахилу кривих, тобто швидкості розвитку ХЛ, що типово для антиоксидантів середньої сили

Криві ХЛ для всіх відварів (рис. 4) нагадують криві для кверцетину з незначним зниженням інтенсивності ХЛ в кінці, тобто при виході на

Час, хв

Мал. 1. Вплив аскорбату натрію на кінетику хемілюмінесценції

Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,05 мкМ; 3 – 0,10 мкМ; 4 – 0,15 мкМ; 5 – 0,2 мкМ; 6 – 0,25 мкМ аскорбату натрію.

плато. Як показано в роботі, така поведінка характерна для антиоксидантів середньої сили, до яких у нашому випадку можна віднести поліфеноли - флавоно-іди та дубильні речовини. Для настою з плодів малини (рис. 4, Г) помітно зниження хемілюмінесценції на рівні плато, що характерно для слабких антиоксидантів, яким у даному випадку є токоферол. У перерахунку на кверцетин та токоферол у настої плодів малини міститься 4,7±0,9 мкмоль/г кверцетину та 11,9±0,8 мкмоль/г токоферолу.

При порівнянні кривих хемілюмінесценції, отриманих для різних концентрацій чотирьох досліджуваних водних витягів з рослинної сировини, показано, що внесок середніх і слабких антиоксидантів у загальну антиоксидантну ємність зразків знижувався в ряду: настій плодів малини (рис. 4, Г), відвар плід 4, В), відвар плодів горобини (рис. 4, А), відвар плодів глоду (рис. 4, Б). Значення AS у розрахунку концентрацію З досліджуваного речовини в кюветі і значення загальної антиоксидантної ємності у перерахунку на кверцетин наведені у таблиці.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Отримані в ході експериментів дані та розраховані на їх основі величини ОАЕ об'єктів, що вивчаються, були зіставлені з вмістом в них основних антиокси-дантів, визначених за допомогою хімічних методів аналізу . Незважаючи на те, що позитивна кореляція між сумарною кількістю антиоксидантів і ОАЕ в різних об'єктах безсумнівна, все ж між цими показниками є помітні відмінності. Наприклад, якщо взяти суму вмісту флавоноїдів, дубильних речовин і аскорбінової кислоти, то вона виявляється більшою за розраховану ОАЕ для всіх об'єктів, що вивчаються, крім відвару плодів глоду (таблиця).

Іншими дослідниками також показано, що результати хімічного аналізу та значення ОАЕ, визначене хемілюмінесцентним методом, часто не збігаються. У роботі загальна антиоксидантна ємність, визначена

46 Час, хв

I" " ч чи----.

Мал. 2. Вплив токоферолу на кінетику хемілюмінесценції

Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,01 мкМ; 3 – 0,025 мкМ; 4 – 0,06 мкМ; 5 – 0,1 мкМ; 6 – 0,2 мкМ токоферолу.

46 Час, хв

Мал. 3. Вплив кверцетину на кінетику хемілюмінесценції Концентрації компонентів системи: люмінол – 40 мкМ, пероксидаза хрону – 4 нМ, пероксид водню – 100 мкМ. Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,02 мкМ; 3 – 0,03 мкМ; 4 – 0,04 мкМ; 5 – 0,05 мкМ; 6 – 0,06 мкМ кверцетину.

Час, хв

46 Час, хв

46 Час, хв

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Час, хв

Мал. 4. Вплив відварів плодів горобини (А), глоду (Б), шипшини (В) та настою з плодів малини (Г) на кінетику хемілюмінесценції Концентрації компонентів системи: люмінол - 40 мкМ, пероксидаза хрону - 0 нМ, пероксидаза хрону - 0 нМ, . (А) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,002 г/л; 3 – 0,004 г/л; 4 – 0,006 г/л; 5 - 0,008 г/л відвару плодів горобини. (Б) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,005 г/л; 3 – 0,0075 г/л; 4 – 0,01 г/л; 5 - 0,0125 г/л відвару плодів глоду. (В) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,001 г/л; 3 – 0,0015 г/л; 4 – 0,002 г/л; 5 - 0,0025 г/л відвару плодів шипшини. (Г) Криві: 1 – контрольний зразок; 2 – 0,001 г/л; 3 – 0,003 г/л; 4 – 0,004 г/л; 5 – 0,005 г/л настою плодів малини.

у системі пероксидаза-люмінол-перекис водню корелювала із вмістом тритерпенових сполук. Однак у роботі тих самих авторів, у якій об'єктом дослідження була інша рослина, не спостерігали кореляції ОАЕ із вмістом будь-якої групи речовин, у тому числі флавоноїдів.

Подібні розбіжності пов'язані щонайменше із трьома чинниками. По-перше, має значення активність антиоксидантів, тобто швидкість їх взаємодії з радикалами, яка різна для різних антиоксидантів, що входять до складу рослинного зразка. За даними Ізмайлова, константи швидкості відповідних реакцій для мексидолу, токоферолу та кверцетину співвідносяться як 0,04:2:60. По-друге, кожна молекула антиоксиданту, вступаючи в хімічну реакцію, може перехопити різну кількість радикалів. За даними роботи , кверцетин, сечова і аскорбінова кислоти перехоплювали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 і 0,5 ± 0,2 радикалів на одну молекулу антиоксиданту, що прореагувала відповідно (використовувалася система гемін-Н202-люмінол). . По-третє, на результати дослідження могло вплинути наявність пероксидазної активності у самих рослинних зразків, як у роботі, а також наявність у зразках кальцію, який, як це показано в роботі, здатний у певних умовах підвищувати активність пероксидази хрону. Зазвичай це обумовлює більш ви-

соку інтенсивність ХЛ на плато, ніж контрольних кривих, чого ми, проте, не спостерігали.

Перший фактор різко обмежує застосування такого параметра, як зміна світлосуми, так як час вимірювання хемілюмінесценції має бути більшим за час витрачання всіх антиоксидантів у досліджуваному зразку. Про настання цього моменту можна судити лише вимірюваючи кінетику хемілюмінесценції. Крім того, внесок слабких антиоксидантів в ОАЕ різко занижений, оскільки час їхнього повного окислення значно перевищує прийнятну тривалість вимірювання (10-20 хв).

Ще більше значення має стехіометричний коефіцієнт антиоксиданту. Кількість радикалів п, що їх перехоплює, дорівнює

де р – стехіометричний коефіцієнт, а Am – зміна концентрації антиоксиданту за час вимірювання, у нашому випадку – вихідна концентрація досліджуваної речовини в дослідній пробі.

Різниця в світлосумі свічення без антиоксиданту і в його присутності пропорційна п. Сумарна кількість перехоплених радикалів дорівнює п = Y.p. m,

де - стехіометричний коефіцієнт конкретного антиоксиданту, а m - його концентрація під час змі-

Об'єкт дослідження Флавоноїди, мг%* Дубильні речовини, мг%* Аскорбінова кислота, мг%* AS/C ■ 10-8, ум. од. ОАЕ, мг% кверцетину

Відвар плодів горобини 8,87±0,01 210,00±10,00 0,67±0,02 7,13±0,96 56,53±7,61

Відвар плодів шипшини 4,66±0,04 850,00±20,00 3,70±0,12 16,60±3,40 131,63±27,26

Відвар плодів глоду 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Настій висушених плодів малини 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Примітка: * - Літературні дані, . AS – зміна світлосуми для зразка, отн. од., C - концентрація зразка у кюветі, г/л. Розраховані значення достовірні при p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

ренія. Сумарна кількість перехоплених радикалів явно не дорівнює сумарній кількості антиоксидантів, оскільки коефіцієнти pt не тільки не рівні одиниці, але і суттєво відрізняються для різних антиоксидантів.

Величина n пропорційна різниці світлосум, виміряних за певний час між зразком, що містить антиоксидант, і контрольним зразком, що не містить антиоксидантів:

де k - Коефіцієнт, постійний за однакових умов вимірювання.

Розглянутий у статті метод дозволяє визначити загальну антиоксидантну ємність, тоді як хімічний аналіз дозволяє визначити сумарний вміст антиоксидантів у продукті. Тому метод хемілюмінесценції представляється інформативнішим за хімічні аналізи.

Підібрані нами умови оцінки загальної антиоксидантної ємності рослинної сировини методом реєстрації кінетики хемілюмінесценції в системі, що складається з пероксидази хрону, перекису водню та люмінолу (концентрації компонентів - 4 нМ, 100 мкМ і 40 мкМ ф 4, 40 мкМ 4, 40 мкМ 4 , відповідно; ),

забезпечили окислення сильних антиоксидантів (аскорбінова кислота) та антиоксидантів середньої сили (квер-цетин) за 10 хв. Така тривалість вимірювання зручна та забезпечує необхідну якість вимірювань.

Аналіз кінетики хемілюмінесценції показав, що в вивчених об'єктах (відварах плодів горобини, шипшини, глоду і настої плодів малини) основними антиоксидантами є антиоксиданти середньої сили, в тому числі флавоноїди, і слабкої сили (токоферол та ін). На основі зменшення світлосуми хемілюмінесценції було розраховано загальну антиоксидантну ємність для вивчених об'єктів. Порівняння отриманих значень ОАЕ з результатами хімічного аналізу показало, що продукти, що містять однакову кількість антиоксідантів з різним їх співвідношенням, можуть відрізнятися за своєю здатністю ефективно захищати організм від шкідливого впливу вільних радикалів. Описана методика перспективна вивчення рослинних об'єктів, у яких міститься суміш різних антиоксидантів. При цьому вона відрізняється простотою та невисокою вартістю дослідження. Поєднання вимірювання кінетики хемілюмінесценції з математичним моделюванням реакцій дозволить не лише автоматизувати процес визначення ОАЕ, а й визначати внесок окремих груп антиоксидантів у показник.

Література

1. Проскурніна Є. В., Володимиров Ю. А. Вільні радикали як учасники регуляторних та патологічних процесів. У СБ: Григор'єв А. І., Володимиров Ю. А., редактори. Фундаментальні науки – медицині. Біофіз. мед. технол. М: МАКС Прес; 2015. т. 1. с. 38-71.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Мальцева Є. В. Методи дослідження антиоксидантів. Хім. росл. сировини. 2004; (3): 63-75.

4. Васильєв Р. Ф., К'нчева В. Д., Федорова Г. Ф., Б'товська Д. І., Трофімов А. В. Антиоксидантна активність халконів. Хе-мілюмінесцентне визначення реакційної здатності та квантово-хімічний розрахунок енергій та будови реагентів та інтермедіатів. Кінетика та каталіз. 2010; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

radical-mediated chemiluminescence: механічна diversity і fundamentals for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Визначення антирадііческой сили по H2O2-hemin-індукованої luminol chemiluminescence. J Agric Food Chem. 2003 р. Dec 3; 51 (25): 7481-8.

9. Володимиров Ю. А., Проскурніна Є. В. Вільні радикали та клітинна хемілюмінесценція. Успіхи біол. хім. 2009; 49: 341-88.

10. Володимиров Ю. А., Проскурніна Є. В., Ізмайлов Д. Ю. Кінетична хемілюмінесценція як метод вивчення реакцій вільних радикалів. Біофізика. 2011; 56 (6): 1081-90.

11. Ізмайлов Д. Ю., Дьомін Є. М., Володимиров Ю. А. Визначення активності антиоксидантів методом вимірювання кінетики хемілюмінесценції. Фотобіологія та фотомедицина. 2011; 7(2): 70-6.

12. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescence induced 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane) thermolysis. Free

Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. На основі використання керуючого світлового освітленнявимірює діяльність SOD. Free Radic Biol Med. 1994 р. Jun; 16(6): 833-7.

15. Lissi ЕА, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Визначення загальної антиоксидантної потреби (TRAP) і повної антиоксидантної реакції від luminol-enhanced chemiluminescence measurements. Free Radic Biol Med. 1995 р. Feb; 18(2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. На investigation of mechanism of luminescent peroxidation luminol by stopped flow techniques. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

21. Алексєєв А. В., Проскурніна Є. В., Володимиров Ю. А. Визначення антиоксидантів методом активованої хемілюмінесценції з використанням 2,2"-азо-біс(2-амідинопро-пана). Вестн. МГУ. Сер. 2. Хім.2012, 53 (3): 187-93.

24. Міністерство охорони здоров'я СРСР Державна фармакопея СРСР XI вид. Вип. 2 «Загальні методи аналізу. Лікарська рослинна сировина». М: Медицина; 1987. с. 147-8.

25. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А., Корнюшина М. А. Вивчення екстракційних препаратів шипшини. Фармація. 2012; (2): 14-6.

26. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А., Аврач А. С. Вивчення плодів глоду різних способів консервації та водних витягів. Фармація. 2010; (5): 16-8.

27. Аврач А. З., Сергунова Є. У., Куксова Я. У. Біологічно активні речовини плодів і водних витягів малини звичайної. Фармація. 2014; (1): 8-10.

28. Аврач А. С., Самиліна І. А., Сергунова Є. В. Вивчення біологічно активних речовин плодів глоду - сировини для приготування настоянок гомеопатичних матричних. У сб. наук. тр. за матеріалами XXIV Моск. міжнар. гомеопат. конф. «Розвиток гомеопатичного методу у сучасній медицині»; 24-25 січня 2014 р.; Москва. М.; 2014. с. 146-7.

29. Сергунова Є. В., Сорокіна А. А. Вивчення складу біологічно активних речовин у лікарській рослинній сировині різних способів консервації. У сб. тез за матеріалами ХХ Росс. нац. конгр. «Людина та ліки»; 15-19 квітня 2013 р.; Москва. М.: ЕкООніс; 2013. с. 184-90.

30. Александрова Є. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Вивчення пероксидазної активності в екстрактах з кореневища та коренів хрону та її стабільності до різних впливів. Вестн. МДУ. Сер. 2. Хім. 2006; 47 (5): 350-2.

1. Проkurnina EV, Vladimirov YuA. Свободние radikaly як uchastniki regulatornyh і patologicheskikhch protsessov. У: Грігор "Ев AI, Владимиров ЮА, editors. Fundamental"nye nauki - meditsine. Біофізичні медичні технології. Москва: MAKS Press; 2015. v. 1. p. 38-71. Російська.

2. Chanda S, Dave R. In vitro моделі для антиоксидантної активності дії і деякі медичні рослини, що посідають antioxidant properties: An overview. Afr J Microbiol Res. 2009 Dec; 3(13): 981-96.

3. Хасанов В.В., Рижова Г.Л., Мальцева ЕВ. Методи дослідження антиоксидантів.

4. Васил"єв RF, К"нчева ВД, Федорова ГФ, Б"товська ДИ, Трофімов А.В. Кемільюменістентное заподіяння реакціонної здатності і квантово-хіміческій розраховують енергію і строенія реагентів і intermediatov. Kinetics and catalysis. 2010; 51 (4): 533-41. Російська.

5. Славова-Казакова АК, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioxidant потенційний curcumin-related compounds studied chemiluminescence kinetics, chain-breaking efficiencies, scavenging activity (ORAC) і DFT calculations. Beilstein J Org Chem. 2015 Aug 11; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-radical-mediated хімічнаluminescence: механічна diversity і fundamentals for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil"ev RF. Facile chemiluminescence assay for antioxidative properties of vegetable lipids: fundamentals and illustrative examples. Analyst. 2009 Oct; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Evaluation of antiradical capacity H2O2-hemin-induced luminol

9. Владимиров ЮА, Прокурніна ЕВ. Свободние radikaly і клеточна khemilyuminestentstia. Usp Biol Khim. 2009; 49: 341-88. Російська.

10. Владимиров ЮА, Проскуриніна ЕВ, Ізмалев ДЮ. Кінетіческая кеміліумінсценція як метод вивчення реакції slobodних radikalov. Biophysics. 2011; 56 (6): 1081-90. Російська.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Оподілення активності антиоксідантов методом ісмеренія кінетики кемілюмінестсен-ціі. Fotobiologiya i fotomeditsina. 2011; 7(2): 70-6. Російська.

12. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescence induced by 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropane) thermolysis. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Лісі ЕА, Pascual C, Del Castillo MD. На основі використання керуючого світлового освітленнявимірює діяльність SOD. Free Radic Biol Med. 1994 р. Jun; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Висока хімічна освіта поєднана з реакцією між methemoglobin або oxyhemoglobin with hydrogen peroxide. Photochem Photobiol. 1994 Nov; 60(5): 405-11.

15. Ліссі EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Визначення загальної антиоксидантної потреби (TRAP) і повної антиоксидантної реакції від luminol-enhanced chemiluminescence measurements. Free Radic Biol Med. 1995 р. Feb; 18(2): 153-8.

16. Landi-Librandi AP, Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro оцінка антиоксидантної діяльності liposomal flavonols до HRP-H2O2-luminol system. J Microencapsul. 2011; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. An investigation of the mechanism

of luminescent peroxidation of luminol by stopped flow techniques. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Фітохімічні особливості, безкоштовні регулярні шпильки діяльності, і невтікання фізики медичних робіт extracts. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011 Aug 10.

19. Chang CL, Lin CS. Фітохімічна композиція, антиоксидантна діяльність, і нейропротекційний ефект terminula chebula Retzius extracts. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 Jul 5.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Зміна антиоксидантної діяльності різних flavonoids до хімічноїluminescence метод. AAPS PharmSci. 2003; 5(2): 111-5.

21. Алексєєв А.В., Проkurnina EV, Vladimirov YuA. Запобігання антиоксідантам методом активованої кеміліумінецентності з іспол"зуванням 2,2"-азо-біс(2-амідінопропан). Moscow University Chemistry Bulletin. 2012; 53 (3): 187-93. Російська.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Application of optimized chemiluminescence assay for determination of antioxidant capacity of herbal extracts. Luminescence. 2012 Nov-Dec; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Обов'язкове low-molecular-weight antioxidants як загальний показник, що відноситься до біологічних прикладів згідно з хімічноюluminescence inhibition assay. Nat Protoc. 2010 Sep; 5(10): 1627-34.

24. Міністерство zdravookhraneniya SSSR. Государсвенная фармакопея SSSR. 11th ed. Iss. 2. "Обшчі методи аналізу.

Лікарственний растітель "ное сір'е". Москва: Medltsina; 1987. p. 147-8.

25. Сергунова EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Ізучення екстракційних preparatov shipovnika. Фармакокінетика. 2012; (2): 14-6. Російська.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Вивчення плодів боярішника различных способів консервації і водних ізвлеченні. Фарматія. 2010; (5): 16-8. Російська.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Біологіческіе активні вещества плодів і водних ізвлеченіі maliny obyknovennoy. Фарматія. 2014; (1): 8-10. Російська.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Ізучення біологічно активних величеств plodov boyaryshnika - syr"ya для приготування насток gomeopaticheskikh matrichnykh. w. M.;2014. p. 146- 7. Російська.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Ізучення складу біологічно активних вежств в лікарственном растітельном сирі ралічних способів консервації. Proceedings of the 20th Russian National Congress "Chelovek i lekarstvo"; 2013 Apr 1519; Москва. Москва: EkOOnis; 2013. p. 184-90. Російська.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Ізучення пероксідазной активності в екстрактах з корневіша і корнеї хрена і її стабільності до розрахункових вантажівок. Moscow University Chemistry Bulletin.

1 Большакова Л.С. 1Мілентьєв В.М. 2Санніков Д.П. 3Казьмін В.М. 2

1 ФДБОУ ВПО «Орлівський державний інститут економіки та торгівлі»

2 ФДБУ «Центр хімізації та сільськогосподарської радіології «Орловський»

3 ФДБОУ ВПО «Державний університет – навчально-науково-виробничий комплекс»

Досліджено можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин. Пропонований спосіб заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, інтенсивність якого залежить від кількості пероксидів у хемілюмінесцентній пробі. Хемілюмінесценцію реєстрували за допомогою розробленої установки, що містить насос-дозатор, світлонепроникну камеру, скляний вакуумний фотоумножитель, комп'ютерну систему. Для посилення хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Зміни інтенсивності хемілюмінесценції фіксували в момент введення проби, що аналізується, в розчин люмінолу. Як аналізовану пробу використовували екстракт кульбаби, отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки. До його складу входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю. Встановлено, що метод хемілюмінесценції може бути використаний визначення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

Досліджено можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин. Пропонований спосіб заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, інтенсивність якого залежить від кількості пероксидів у хемілюмінесцентній пробі. Хемілюмінесценцію реєстрували за допомогою розробленої установки, що містить насос-дозатор, світлонепроникну камеру, скляний вакуумний фотоумножитель, комп'ютерну систему. Для посилення хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Зміни інтенсивності хемілюмінесценції фіксували в момент введення проби, що аналізується, в розчин люмінолу. Як аналізовану пробу використовували екстракт кульбаби, отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки. До його складу входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю. Встановлено, що метод хемілюмінесценції може бути використаний визначення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

Бібліографічне посилання

Паничкін А.В., Большакова Л.С., Мілентьєв В.М., Санніков Д.П., Казьмін В.М. ВИКОРИСТАННЯ ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНЦІЇ ДЛЯ ОЦІНКИ АНТИОКСИДАНТНИХ ВЛАСТИВИЙ ХАРЧОВИХ РЕЧОВИН // Раціональне харчування, харчові добавки та біостимулятори. - 2014. - № 6. - С. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (дата звернення: 17.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»

дипломна робота

1.4 Методи дослідження антиоксидантів

антиоксидантної активності класифікуються: за способами реєстрації АОА, що проявляється (волюмометричні, фотометричні, хемілюмінесцентні, флуоресцентні, електрохімічні); за типом джерела окислення; за типом окислюваної сполуки; за способом вимірювання окисленої сполуки.

Однак найбільш відомими методами визначення антиоксидантної активності є:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод заснований на наступній реакції:

Метміоглобін + Н 2 Про 2 >Феррілглобін +ABTS>ABTS*+АТ.

Метод визначення еквівалентів Тролоксу (TEAC) заснований на здатності антиоксидантів відновлювати радикальні катіони 2,2-азинобісу (ABTS) і тим самим інгібувати поглинання в довгохвильовій частині спектру (600 нм). Істотним недоліком методу є двоступінчаста реакція одержання радикалу. Це подовжує час проведення аналізу та може збільшити розкид результатів, незважаючи на те, що для аналізу використовують стандартизований набір реактивів.

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод заснований на наступній реакції:

Fe(III)-Трипіридитріазин+АТ>Fe(II)-Трипіриділтріазин.

Залізовідновлююча/антиоксидантна здатність (FRAP). Тут використовується реакція відновлення Fe(III)-трипіридилтріазину до Fe(II)-трипіридилтриазину. Однак цим методом неможливе визначення деяких антиоксидантів, наприклад глутатіону. Цей метод дозволяє пряме визначення низькомолекулярних антиоксидантів. При низьких рН відновлення Fe(III)-трипіридилтріазинового комплексу в Fe(II)-комплекс супроводжується появою інтенсивно блакитного забарвлення. Вимірювання засновані на здатності антиоксидантів пригнічувати окисний ефект реакційних частинок, що генеруються в реакційній суміші. Цей метод відрізняється простотою, швидкістю та невеликими витратами при виконанні.

3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод заснований на наступній реакції:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люмінол.

Визначає здатність абсорбувати кисневі радикали (ORAC). У цьому методі реєструють флуоресценцію субстрату (фікоеритрину або флуоресцеїну), яка виникає внаслідок його взаємодії з АФК. Якщо в досліджуваному зразку є антиоксиданти, спостерігають зменшення флуоресценції в порівнянні з контрольним зразком . Спочатку цей метод був розроблений доктором Гохуа Као в Національному інституті старіння в 1992 р. В 1996 доктор Као об'єднався з доктором Рональдом Прайером в спільну групу в Дослідницькому центрі старіння USDA, де був створений напівавтоматичний метод.

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter): метод заснований на наступній реакції:

AAPH+AO>AAPH* + ФО (ФЕ).

У цьому методі використовують здатність антиоксидантів взаємодіяти з пероксильним радикалом 2,2-азобіс(2-амідинопропан) дигідрохлорид (ААРН). Модифікації TRAP полягають у способах реєстрації аналітичного сигналу. Найчастіше на завершальній стадії аналізу перокси-радикал ААРН взаємодіє з люмінісцентним (люмінол), флуоресцентним (дихлорфлюоресцин-діацетат, DCFH-DA) або іншим оптично активним субстратом.

Як стандарт для методів TEAC, ORAC і TRAP використовують водорозчинне похідне вітаміну Е - Trolox (6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

Останнім часом з метою оцінки антиоксидантної активності зріс інтерес застосування електрохімічних методів. Ці методи мають високу чутливість, швидкість аналізу.

Оцінку антиоксидантної активності деяких харчових продуктів проводять методом потенціометрії, заснованому на використання властивості речовин-антиоксидантів брати участь в окисно-відновних реакціях за рахунок єнольних (ОН) і сульфгідрильних (SH) груп.

Визначення антиоксидантних властивостей розчинів засноване на хімічній взаємодії антиоксидантів з медіаторною системою, що призводить до зміни її окисно-відновного потенціалу. Електрохімічний осередок є ємністю, що містить K-Na-фостфатний буферний розчин, медіаторну систему Fe(III)/Fe(II) і комплексний електрод до вимірювання окисно-відновного потенціалу. Антиоксидантну активність оцінюють у г-екв/л.

Амперометричний метод визначення антиоксидантної активності заснований на вимірюванні електричного струму, що виникає при окисленні досліджуваної речовини на поверхні робочого електрода, що знаходиться під певним потенціалом. Чутливість амперометричного способу визначається як природою робочого електрода, і потенціалом, прикладеному щодо нього. Межа виявлення амперометричного детектора поліфенолів, флавоноїдів на рівні нано-пікограмів, при таких малих концентраціях менша ймовірність взаємного впливу різних антиоксидантів за їхньої спільної присутності, зокрема прояв явища синергізму. До недоліків способу можна віднести його специфічність: у цих умовах не можуть бути проаналізовані антиоксиданти, які самі окислюються або відновлюються в галузі потенціалів відновлення кисню. До переваг способу можна віднести його експресність, простату і чутливість.

Метод гальваностатичної кулонометрії за допомогою електрогенерованих окислювачів - метод застосовний для аналізу жиророзчинних антиоксидантів.

Розроблено різні способи визначення аскорбінової кислоти:

амперометричний спосіб з використанням алюмінієвого електрода, модифікованого плівкою гексаціаноферату нікелю (II), методом простого занурення в розчин;

спосіб твердофазно-спектрофотометричного та візуального тест-визначення аскорбінової кислоти з використанням як індикаторного порошку ксерогелю кремнієвої кислоти, модифікованого реактивом Вавелі та міддю (II);

хемілюмінесцентне визначення аскорбінової кислоти можна провести проточно-інжекційним методом з хемілюмінесцентної реакції родаміну В з церієм (IV) у сірчанокислому середовищі.

визначення аскорбінової кислоти в діапазоні 10 -8 -10 -3 г/см 3 методом анодної вольтамперометрії у водних та водно-органічних середовищах.

Найбільш поширеним є метод FRAP, оскільки він експресний, високочутливий. За останні кілька десятиліть було розроблено велику кількість різновидів методик визначення антиоксидантної активності методом FRAP (таблиця 1).

Таблиця 1 Розвиток методу FRAP та його застосування для визначення антиоксидантної активності різних об'єктів

				Об'єкти аналізу	Примітки
				Плазма крові	t=4хв. Вивчено стехіометрію реакції та адитивність.
				Чай, вино	Визначення АОА, обумовленої поліфенолами
					Порівняно значення АОА різних сортів чаю
Pulido, Bravo, Saura-Calixto				Модельні розчини	t=30хв. Виявлено вплив неводного розчинника
				Рослини
				Кров, тканини	Метод ПІА. Перевірено вплив сторонніх речовин.
Firuzi,Lacanna, Petrucci e.a.				Модельні розчини	Вивчено чутливість визначення різних АТ як функція їх структури та редокс-потенціалу.
Katalinic, Milos,				Різні вина
Темердашев, Цюпко та ін.				Модельні суміші
Логінова, Коновалова				ліки. Препарати	Тест-метод
Темердашев, Цюпко та ін.				Червоні сухі вина	Кореляція АОА з іншими показниками якості вин
Продовження таблиці 1
				Модельні суміші	Вивчено чутливість визначення різних АТ
Вершинін, Власова, Цюпко				Модельні суміші	Виявлено неадитивність сигналу при нестачі окислювача
Анісімович, Дейнека та ін.				Модельні розчини	Запропоновано кінетичні параметри оцінки АОА.

Примітки: умовно позначено: ПІА-проточно-інжекційний аналіз, TPTZ-трипіридилтріазин, DIP-2,2,-дипіридил, PHEN-о-фенантролін, DPA-піридиндикарбонова кислота, FZ-ферозин, АК-аскорбінова кислота, КТ-катехол -час експозиції, хв.

Взаємодія між білками та поліелектролітами у водних розчинах

Для характеристики білок-поліелектролітних комплексів використовують різні методи аналізу. Інструментальні методи дають інформацію щодо структурних та оптичних властивостей, а також визначають динаміку та характер зв'язування ПЕК.

Вплив сполук d-металів на швидкість дисоціації молекули води у біполярній мембрані

У процесі синтезу нових БПМ велика увага має бути приділена дослідженню властивостей отриманих зразків для подальшого вибору умов синтезу, що забезпечують поліпшення електрохімічних характеристик мембран, що синтезуються.

Дизайнерські наркотики та синтетичні канабіноїди

Виявлення синтетичних каннабіноїдів у рослинних сумішах може бути здійснено різними фізико-хімічними методами, такими як хромато-мас-спектрометрія, газова, тонкошарова та високоефективна рідинна хроматографії.

Розробка методики визначення флавоноїдів у лікарській рослинній сировині

Синтез та фармакологічні властивості хінолінонів-2

Об'єкт дослідження: Хінолінон-2. Метод дослідження: За допомогою комп'ютерної програми Marvin JS, була створена структура речовини. Далі її відправили сайт «http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php» для подальшого дослідження...

Термоспектральний метод дослідження продуктів випаровування епоксидного полімеру

Технологія отримання високоочищеного хітозану з ракоподібних панцирів

Визначення молекулярної маси хітозану Молекулярну масу хітозану визначали віскозиметрично за стандартною методикою. Розчини концентрації 0,05 та 0,5 г/дл готували розчиненням навішування порошку полімеру в ацетатному буфері (0...

Фізико-географічна характеристика території природного парку

1 Мілентьєв В.М. 2Санніков Д.П. 3Казьмін В.М. 2

1 ФДБОУ ВПО «Орлівський державний інститут економіки та торгівлі»

2 ФДБУ «Центр хімізації та сільськогосподарської радіології «Орловський»

3 ФДБОУ ВПО «Державний університет – навчально-науково-виробничий комплекс»

Досліджено можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин. Пропонований спосіб заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, інтенсивність якого залежить від кількості пероксидів у хемілюмінесцентній пробі. Хемілюмінесценцію реєстрували за допомогою розробленої установки, що містить насос-дозатор, світлонепроникну камеру, скляний вакуумний фотоумножитель, комп'ютерну систему. Для посилення хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Зміни інтенсивності хемілюмінесценції фіксували в момент введення проби, що аналізується, в розчин люмінолу. Як аналізовану пробу використовували екстракт кульбаби, отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки. До його складу входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю. Встановлено, що метод хемілюмінесценції може бути використаний визначення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

хемілюмінесценція

антиоксидантна активність

пероксиди

харчові речовини

1. Васильєв Р.Ф. Хімічне світіння // Хімія та хіміки, 21.01.10. - URL: http://chemistry-chemists.com. (Дата звернення: 22.08.13).

2. Володимиров Ю.А. Вільні радикали та антиоксиданти // Вестн. РАМН. - 1998. - № 7. - С. 43-51.

3. Кондрашова Є.А. Хемілюмінесценція як найбільш чутливий метод імуноферментного аналізу та його застосування // Клінічна лабораторна діагностика. - 1999. - № 9. - С. 32.

4. Любимов, Г.Ю. Хемілюмінесцентний аналіз // Імунологія. - 1991. - № 1. - С. 40-49.

5. Маянський А.М., Невмятуллін А.Л., Чеботар І.В. Реактивна хемілюмінесценція у системі фагоцитозу // Мікробіологія. - 1987. - № 1. - С. 109-115.

6. Шерстнєв М.П. Кальційзалежний та кальційнезалежний шляхи генерації хемілюмінесценції клітин // Питання хемілюмінесценції. - 1991. - № 2. - С. 1-4.

На сьогоднішній день хемілюмінесценція представляє велику галузь науки, що знаходиться на стику між хімією, фізикою та біологією. При хемілюмінесценції відбувається пряме перетворення хімічної енергії на енергію електромагнітних коливань, тобто. у світ. Використовуючи хемілюмінесценцію, можна дізнатися про те, як протікає реакція, який її механізм, що необхідно для ефективного та раціонального проведення технологічних процесів. Якщо технологічний процес отримання будь-якого хімічного продукту супроводжується хемілюмінесценцією, то її інтенсивність може бути мірою швидкості процесу: чим швидше йде реакція, тим яскравіше свічення. У результаті реакції хемілюмінесценції виходять багаті енергією продукти, які потім віддають енергію, випромінюючи світло, т. е. хімічна енергія перетворюється на енергію електромагнітного випромінювання .

Мета дослідження – вивчити можливість використання хемілюмінесценції для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин.

Результати дослідження та їх обговорення

Проблема оцінки антиоксидантної активності харчових речовин є дуже актуальною. Використання терміна «антиоксидантна активність» для того, щоб показати корисність того чи іншого продукту, часто робиться без будь-якої хімічної та біохімічної аргументації. Як правило, під антиоксидантною активністю будь-якої речовини мається на увазі ефективність зниження величини перекисного числа. Саме поняття перекисного числа також зовсім розкриває свою хімічну суть, оскільки цілком відповідає кінетиці і термодинаміці стадій метаболізму тієї чи іншої харчового продукту. До того ж ця величина використовується для характеристики ліпідів у формі жирів. Однак процеси окислення та формування перекисів в організмі відбуваються не тільки при вживанні жирів, а й інших продуктів. Іншими словами, вміст перекису в тому чи іншому продукті можна сказати «зважується» на своєрідних вагах, де «еталонною вагою» є одиниця концентрації в кислому середовищі йодид іону, окисленого перекисами, внаслідок чого утворюється молекулярний йод:

I- - е → I; (1)

I+I → I20. (2)

При титруванні молекулярного йоду розчином, що містить тіосульфат натрію, встановлюється його концентрація і, отже, визначається кількість окислювачів іодіонів, тобто. перекисних сполук, що і називається перекисним числом . Визначення перекисного числа за допомогою такого роду зважування засноване на реакції, наведеній на рис. 1.

Мал. 1. Визначення перекисного числа за допомогою натрію тіосульфату

Таким чином, концентрація пероксидів визначається з рівняння

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

де - коефіцієнт кореляції між концентрацією молекулярного йоду і концентрацією пероксидів.

Пропонований нами спосіб визначення пероксидів у продуктах заснований на хемілюмінесценції люмінолу (C[лм]) у лужному середовищі, інтенсивність (Iхл) якої залежить від концентрації пероксидів (C[-O-O-]), в хемілюмінесцентній пробі:

IХЛ. = Ϧхл ω, (4)

де хл - квантовий вихід хемілюмінесценції; ω - швидкість реакції за участю пероксидів:

kхлC[-O-O-] C[лм] = ω, (5)

де kхл - константа швидкості реакції або при:

C[лм] kхл Ϧхл = К, (6)

IХЛ = До C [-O-O-]. (7).

Кількість пероксидів (-O-O-) визначається світлосумою (S):

Розмір S залежить від ступеня повноти витрачання перекису в хемілюмінесцентній реакції.

Для визначення константи До будується крива калібрувальної залежності світлосуми S від концентрації перекису, яку встановлюють титруванням:

S = f(С[-O-O-]). (9)

Як пероксиди використовується перекис водню Н2О2.

Потім порівнюються дані, отримані з рівняння (3) та (9). З порівняння ϒ і До робиться висновок про узгодження механізмів реакцій, які у основі визначення пероксидів зазначеними методами. Виявлено, що в цьому інтервалі концентрацій пероксидів ϒ і До дійсно узгоджуються один з одним і тому можна використовувати їх для визначення перекисного числа .

Хемілюмінесценцію спостерігали в лужному середовищі, що містить люмінол (5-аміно-1,2,3,4-тетрагідро-1,4-фталазиндіон, гідразид 3-амінофталевої кислоти, H2L). Реєстрували її за допомогою хемілюмінесцентної установки, що включає скляний вакуумний фотоумножитель. Живлення фотопомножувача здійснюється за допомогою високовольтного випрямляча (7), сполученого з блоком (9), що підсилює сигнал фотопомножувача, який реєструється на моніторі комп'ютера (5).

Мал. 2. Реєстрація хемілюмінесценції аналізованого продукту: 1 – насос-дозатор; 2 - світлонепроникна камера; 3 – дзеркало; 4 – кювета; 5 – комп'ютерна система; 6 – фотопомножувач; 7 - високовольтний випрямляч; 8 - пристрій, що дозволяє визначати спектральну область хемінілюмінесцентного випромінювання; 9 - блок, що посилює сигнал фотопомножувача

Насос-дозатор (1) необхідний для введення проби, що аналізується, в кювету (4), що містить хемілюмінісцентний розчин люмінолу. Даний дозатор виконує роль перемішувача проби з хемілюмінесцентним розчином. Для посилення швидкості реакції та інтенсивності хемілюмінесценції до люмінолу додавали розчин залізосинєродистого калію. Перемішування проводиться бульбашками повітря, отриманими під час прокачування насосом повітря через рідину розчину. Дзеркало (3), що знаходиться у світлонепроникній камері (2), служить для кращого світлозбору хемілюмінесцентного випромінювання, що падає на фотокатод фотопомножувача (6), вмонтованого у світлонепроникну камеру. Дозатор дозволяє вводити потрібні компоненти рідини в кювету, не відкриваючи світлонепроникну камеру (2) під час дослідів. При цьому зазначені рідини надходять у кювету (4) скляним або пластмасовим трубкам. Комп'ютерна система дозволяє реєструвати залежність інтенсивності світіння I від часу t, тобто кінетику хемінілюмісценції:

p align="justify"> Комп'ютерна система відображає константи наростання і спаду в функції I = f(t), які сполучаються з константами швидкостей реакцій, що зумовлюють хемілюмінесценцію, тобто з їх кінетиками. У хемілюмінесцентну камеру включається пристрій (8), що дозволяє визначати спектральну область хемілюмінесцентного випромінювання, тобто залежність:

I = f1(?). (11)

Цей блок є касетою у вигляді диска, в яку вмонтовані граничні світлофільтри. Зміна світлофільтрів здійснюється поворотом касети диска щодо горизонтальної осі, що з'єднує центри площини світлофільтрів та площини фотокатода фотопомножувача.

Процес вимірювання здійснюється наступним чином:

1. Встановлюється реакція фотопомножувача на зміни напруги його живлення та зміну інтенсивності еталонного джерела світла, що падає на його катод.

2. Виконується заповнення кювети розчином люмінолу в лужному середовищі.

3. Здійснюється заповнення дозатора аналізованою пробою.

4. Реєструється залежність інтенсивності хемілюмінесценції від часу t. Спостереження за хемілюмінесценцією здійснюється до часу t1, у якому зміна I1 від часу t мінімально: I1 = f1(t).

5. Подається за допомогою дозатора порція розчину, що аналізується.

6. Спостерігається хемілюмінесценція аналізованої проби, кінетика якої I = f(t).

На рис. 3 представлений графік залежності функцій (I1 = f1(t)), пов'язаний із графіком (I = f(t)), після введення аналізованого розчину.

Як видно із рис. 3, інтенсивність хемілюмінесценції люмінолу змінюється: за різким підйомом слід різкий спад світіння після додавання проби, що аналізується.

Оскільки посилення хемілюмінесценції при окисленні люмінолу пов'язане з утворенням пероксидів, зниження інтенсивності хемілюмінесценції після введення аналізованої проби свідчить про зменшення їх кількості . Отже, можна говорити про наявність антиоксидантної активності сполук, що входять до складу аналізованої проби.

Необхідно відзначити, що як аналізована проба використовувався отриманий шляхом сухої низькотемпературної перегонки екстракт кульбаби, до складу якого входять фенольні сполуки, відомі своєю високою антиоксидантною активністю.

Мал. 3. Графік залежності функцій (I1 = f1(t)), пов'язаний з графіком (I = f(t)), після введення аналізованого розчину

Крім того, в ході експерименту встановлено, що за допомогою хемілюмінесценції можна визначати кількість пероксидів у надрозведених системах, що важливо для оцінки початку окислення продуктів, наприклад, у процесі їх зберігання.

Таким чином, проведені дослідження показали, що спосіб визначення пероксидів у продуктах, заснований на хемілюмінесценції люмінолу в лужному середовищі, дозволяє оцінити антиоксидантну активність харчових речовин і може бути використаний для встановлення антиоксидантних властивостей різних харчових сполук.

Рецензенти:

Литвинова О.В., д.т.н., професор кафедри технології, організації та гігієни харчування, ФДБОУ ВПО «ОрелДІЕТ», м. Орел;

Ковальова О.А., д.б.н., директор ІНІІЦ, ФДБОУ ВПО «Орлівський державний аграрний університет», м. Орел.

Робота надійшла до редакції 08.11.2013.

Бібліографічне посилання

Паничкін А.В., Большакова Л.С., Мілентьєв В.М., Санніков Д.П., Казьмін В.М. ВИКОРИСТАННЯ ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНЦІЇ ДЛЯ ОЦІНКИ АНТИОКСИДАНТНИХ ВЛАСТИВИЙ ХАРЧОВИХ РЕЧОВИН // Фундаментальні дослідження. - 2013. - № 10-11. - С. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (дата звернення: 17.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»