Відділення білків від низькомолекулярних домішок
Метод мембранних сит (діаліз)
Використовують діалізну мембрану, яка є полімером та має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а великі (білки) затримуються. Таким чином, білки відмивають від домішок.
Поділ білків за молекулярною масою
Гель-хроматографія
Хроматографічну колонку заповнюють гранулами гелю (сефадекс), що має пори певної величини. У колонку вносять суміш білків. Білки, розмір яких менший, ніж розмір пір сефадекса, затримуються в колонці, оскільки «застрягають» у порах, а інші вільно виходять із колонки. Розмір білка залежить з його молекулярної маси.
Ультрацентрифугування
Цей метод ґрунтується на різній швидкості седиментації (осадження) білкових молекул у розчинах з різним градієнтом щільності (сахарозний буфер або хлорид цезію).
Електрофорез
Даний метод ґрунтується на різній швидкості міграції білків та пептидів в електричному полі залежно від заряду.
Носіями для електрофорезу можуть бути гелі, ацетатцелюлоза, агар. Молекули, що розділяються, рухаються в гелі в залежності від розміру: ті з них, які мають великі розміри, будуть затримуватися при проходженні через пори гелю. Найменші молекули зустрічатимуть менший опір і, відповідно, рухатимуться швидше. В результаті, після проведення електрофорезу, великі молекули будуть ближче до старту, ніж менші.
Методом електрофорезу можна розділити білки за молекулярною масою. Для цього використовують електрофорез у ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (ДДS-Na).
ДДС-Na є дифільною речовиною і містить заряджену групу та гідрофобну. Білки зв'язуються із ДДС-Na своїми гідрофобними радикалами і при цьому денатурують. Таким чином, білки вирівнюються за формою та зарядом. Після цього рухливість білка при електрофорез залежить тільки від його молекулярної маси.
висолення: осадження солями лужних, лужноземельних металів (хлорид натрію, сульфат магнію), сульфатом амонію; у своїй не порушується первинна структура білка;
осадження: використання водовіднімних речовин: спирт або ацетон за низьких температур (близько –20 С).
При використанні цих методів білки позбавляються гідратної оболонки та випадають в осад у розчині.
Денатурація- Порушення просторової структури білків (первинна структура молекули зберігається). Може бути оборотна (структура білка відновлюється після усунення агента, що денатурує) або незворотна (просторова структура молекули не відновлюється, наприклад, при осадженні білків мінеральними концентрованими кислотами, солями важких металів).
Методи поділу білків Відділення білків від низькомолекулярних домішок
Діаліз
Використовують спеціальну полімерну мембрану, яка має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а великі (білки) затримуються. Таким чином, білки відмивають від домішок.
Поділ білків за молекулярною масою
Гель-хроматографія
Хроматографічну колонку заповнюють гранулами гелю (сефадекс), що має пори певної величини. У колонку вносять суміш білків. Білки, розмір яких менший, ніж розмір пір сефадекса, затримуються в колонці, оскільки «застрягають» у порах, а інші вільно виходять із колонки (рис. 2.1). Розмір білка залежить з його молекулярної маси.
Мал. 2.1.Поділ білків методом гель-фільтрації
Ультрацентрифугування
Цей метод ґрунтується на різній швидкості седиментації (осадження) білкових молекул у розчинах з різним градієнтом щільності (сахарозний буфер або хлорид цезію) (рис. 2.2).
Мал. 2.2.Поділ білків методом ультрацентрифугування
Електрофорез
Даний метод ґрунтується на різній швидкості міграції білків та пептидів в електричному полі залежно від заряду.
Носіями для електрофорезу можуть бути гелі, ацетатцелюлоза, агар. Молекули, що розділяються, рухаються в гелі залежно від розміру: ті з них, які мають більші розміри, будуть затримуватися при проходженні через пори гелю. Найменші молекули зустрічатимуть менший опір і, відповідно, рухатимуться швидше. В результаті, після проведення електрофорезу, більші молекули будуть ближче до старту, ніж менші (рис. 2.3).
Мал. 2.3. Поділ білків методом електрофорезу в гелі
Методом електрофорезу можна розділити білки і молекулярної масі.Для цього використовують електрофорез у ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (ДДS-Na).
Виділення індивідуальних білків
Афінна хроматографія
Метод заснований на здатності білків міцно зв'язуватися з різними нековалентними молекулами зв'язками. Використовується для виділення та очищення ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків.
Молекули речовин (ліганди), з якими зв'язуються специфічно певні білки, ковалентно з'єднують з частинками інертної речовини. Суміш білків вносять у колонку, і білок, що шукається, міцно приєднується до ліганду. Інші білки вільно виходять із колонки. Затриманий білок можна вимити з колонки за допомогою буферного розчину, що містить у вільному стані ліганд. Цей високочутливий метод дозволяє виділити в чистому вигляді дуже малі кількості білка клітинного екстракту, що містить сотні інших білків.
Ізоелектрофокусування
Метод заснований на різній величині ІЕТ білків. Білки розділяють методом електрофорезу на пластині з амфоліном (це речовина, у якої заздалегідь сформовано градієнт pH в діапазоні від 3 до 10). При електрофорезі білки поділяються відповідно до значення їх ІЕТ (в ІЕТ заряд білка дорівнюватиме нулю, і він не пересуватися в електричному полі).
Двовимірний електрофорез
Є поєднанням ізоелектрофокусування і електрофорезу з ДДС-Na. Проводять спочатку електрофорез у горизонтальному напрямку на пластині з амфоліном. Білки поділяються залежно від заряду (ІЕТ). Потім обробляють пластину розчином ДДС-Na та проводять електрофорез у вертикальному напрямку. Білки поділяються залежно від молекулярної маси.
Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)
Аналітичний метод, який використовується визначення специфічних білків у зразку (рис 2.4).
Виділення білків із біологічного матеріалу.
Поділ білків за молекулярною масою методом електрофорезу в ПААГ із ДДС-Na.
Перенесення білків із гелю на полімерну пластину з метою полегшення подальших робіт.
Обробка пластини розчином неспецифічного білка для заповнення пір, що залишилися.
Таким чином, після цього етапу отримана пластинка, у порах якої містяться розділені білки, а простір між ними заповнений неспецифічним білком. Тепер треба виявити, чи серед білків є шуканий, відповідальний за якесь захворювання. Для виявлення використовують обробку антитілами. Під первинними антитілами розуміють антитіла до білка. Під вторинними антитілами розуміють антитіла до первинних антитіл. До складу вторинних антитіл додатково вводять спеціальну мітку (т.зв. молекулярний зонд), щоб потім можна було візуалізувати результати. Як мітки використовуються радіоактивний фосфат або фермент, що міцно пов'язані з вторинним антитілом. Зв'язування спочатку з первинними, а потім із вторинними антитілами переслідує дві мети: стандартизація методу та покращення результатів.
Обробка розчином первинних антитіл зв'язування відбувається там пластини, де є антиген (шуканий білок).
Видалення антитіл, що не зв'язалися (промивання).
Обробка розчином мічених вторинних антитіл для подальшого прояву.
Видалення вторинних антитіл (промивання), що не зв'язалися.
Мал. 2.4. Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)
У разі присутності білка в біологічному матеріалі – на платівці з'являється смуга, що свідчить про зв'язування цього білка з відповідними антитілами.
Вивчення фізико-хімічних властивостей, хімічного складу та структури можливе лише при дослідженні очищеного білкового препарату. Для виділення та фракціонування індивідуальних білків використовуються: висолювання, осадження органічними розчинниками, гельфільтрація, електрофорез, іонообмінна хроматографія, афінна хроматографія.
Висолення білківзасноване на залежності розчинності білка від властивостей середовища. У дистильованій воді протеїни розчиняються гірше, ніж у слабких розчинах солей, оскільки низькі концентрації іонів підтримують гідратні оболонки. Але при високих концентраціях солі молекули білка втрачають гідратні оболонки, агрегують та утворюється осад. Після видалення солі білки знову переходять у розчин, зберігаючи нативні властивості та конформацію.
Зміна розчинності при різних концентраціях солі та рН середовища використовується виділення індивідуальних білків. Найчастіше для висолювання білків використовують розчини сульфату амонію різної концентрації.
Осадження білків із розчину без їхньої денатурації здійснюють за допомогою дегідруючих агентів - органічних розчинників (етанол, ацетон).
Гель-фільтраціязаснована на поділі білків за величиною та формою молекули. Розподіл проводять у хроматографічних колонках, заповнених гранулами пористого гелю (сефадекса, агарози), буферному розчині з певним значенням рН. Гранули гелю проникні для білків завдяки внутрішнім каналам (порам) з певним середнім діаметром розмір якого залежить від типу гелю (сефадекс G-25, G-200 і т.д.). Суміш білків вносять у колонку і потім вимивають (елююють) буферним розчином із певним значенням рН. Великі молекули білка не проникають у пори гелю та переміщаються з високою швидкістю разом із розчинником. Дрібні молекули низькомолекулярної домішки (солі) або іншого білка утримуються гранулами гелю та вимиваються з колонки повільніше (рис. 1.29). На виході колонки розчин (елюат) збирають як окремих фракцій.
Мал. 1.29. Поділ білків методом гель-фільтрації
Електрофореззаснований на властивості заряджених молекул білка переміщатися в електричному полі зі швидкістю, пропорційною їх сумарному заряду. Білки, що мають при даному значенні рН сумарний негативний заряд, рухаються до анода, а позитивний - до катода. Електрофорез проводять на різних носіях: папері, крохмальному гелі, поліакриламідному гелі та ін. Швидкість переміщення залежить від заряду, маси та форми молекул білка. Після завершення електрофорезу зони білків на носії фарбують спеціальними фарбниками (рис. 1.30, А).
Роздільна здатність електрофорезу в гелі вище, ніж на папері, так при електрофорезі білків сироватки крові на папері виділяють 5 фракцій (альбуміни, α 1 -, α 2 -, β-, γ-глобуліни), а в поліакриламідному гелі - до 18 фракцій ( рис.1.30, Б).
Мал. 1.30. Електрофореграма білків сироватки крові здорової людини
А- електрофореграма білків сироватки крові на папері;
Б- Кількість білків плазми різних фракцій.
I - γ-глобуліни; II - β-глобуліни; III - а 2-глобуліни;
IV - а 1-глобуліни; V - альбуміни
Іонообмінна хроматографіязаснована на поділі білків, що відрізняються сумарним зарядом. Розчин білка з певним значенням рН пропускають через хроматографічну колонку, заповнену пористим твердим сорбентом, при цьому частина білків затримується в результаті електростатичної взаємодії. Як сорбент використовують іонообмінні речовини: аніонообмінники (які містять катіонні групи) для виділення кислих білків; катіонообмінники (що містять аніонні групи) виділення основних білків.
При пропусканні білка через колонку міцність зв'язування з іонообмінником залежить від величини заряду, протилежного заряду сорбенту. Адсорбовані на іонообмінному сорбенті білки елююють буферними розчинами з різною концентрацією солі та рН, отримуючи різні фракції білків.
Афінна хроматографіязаснована на специфічності зв'язування білка з лігандом, приєднаним до твердого носія. Як ліганд використовуються субстрати ферментів, простетичні групи холопротеїнів, антигени і т.д. При пропусканні через колонку суміші білків до ліганду приєднується лише комплементарний протеїн (рис. 1.31, А), решта виходять разом із розчином. Адсорбований білок елююється розчином з іншим значенням рН (рис. 131 Б). Цей метод є високоспецифічним і дозволяє отримувати білкові препарати високого ступеня очищення.
Виділення та очищення білка зазвичай проходять у кілька стадій з використанням різних методів. Послідовність стадій підбирається емпіричним шляхом і може бути різною для різних протеїнів. Високий ступінь очищення білків дуже важливий як при використанні їх як лікарських препаратів (гормон інсулін і т.д.), так і при діагностиці різних захворювань щодо зміни білкового складу тканин, крові, слини та ін.
Набір білків у клітинах різних органів дорослої людини індивідуальний та підтримується відносно постійним протягом життя. Спеціалізовані тканини можуть містити специфічні білки, наприклад гемоглобін в еритроцитах, актин та міозин у м'язах, родопсин у сітківці ока, різні типи колагену у кістковій та сполучній тканинах. Деякі білки містяться у багатьох тканинах, але у різних кількостях. Окремі зміни складу
Мал. 1.31. Поділ білків методом афінної хроматографії
А- зв'язування білка, що виділяється, зі специфічним лігандом, приєднаним до нейтрального носія; Б- одержання розчину індивідуального білка
білків тканин і крові можливі і пов'язані насамперед із режимом харчування, складом їжі, фізичною активністю людини.
При захворюваннях білковий склад крові та клітин тканин може суттєво змінюватися, часто розвивається недостатність будь-якого білка або зниження його активності. протеїнопатія.Тому визначення виражених змін білкового складу крові та тканин використовується для діагностики різних захворювань у клінічних дослідженнях.
Після екстракції суміші білків із біологічного матеріалу проводять її поділ на індивідуальні фракції білків. Розроблено кілька методів фракціонування білків, що ґрунтуються на різних фізико-хімічних властивостях білків.
– осадження білків у ізоелектричній точці - В основі методу лежить властивість білків в ізоелектричній точці випадати в осад внаслідок нейтралізації заряду білкової молекули. Для кожного білка значення ізоелектричної точки суворо індивідуальне, тому даним методом можливе виділення індивідуальних білків (докладніше про метод див. лабораторну роботу №3 у курсі «Біохімія»).
– фракціонування білків методом висолювання – ґрунтується на різній розчинності білків у концентрованих розчинах нейтральних солей, залежно від молекулярної маси (докладніше про метод див. лабораторну роботу №3 у курсі «Біохімія»).
– метод електрофоретичного поділу білків на фракції – описаний розділ фізико-хімічні властивості білків.
Крім наведених вище методів для поділу білків на фракції широко використовують хроматографічні методи . Найчастіше використовують колонкову хроматографію.
Особливістю даного методу є те, що суміш молекул різних білків і пептидів пропускають через колонку, що містить пористий твердий матеріал (матрикс). Внаслідок взаємодії з матриксом різні білки проходять через колонку з різною швидкістю. Після того, як білки досягнуть у певній послідовності дна колонки, їх збирають окремими фракціями в пробірки.
Виділяють три основні видиколонкової хроматографії:
– іонообмінна - для хроматографії білків застосовують іонообмінники на основі целюлози або інших гідрофільних полімерів, наприклад, діетиламіноетилцелюлозу (ДЕАЕ-целюлоза), що містить катіонні групи (негативний заряд) або містить карбоксиметилцелюлозу (КМ-целюлоза): містить
Міцність зв'язування білків з ДЕАЕ-целюлозою тим вища, що більше в молекулі білка карбоксильних груп. Білки, адсорбовані на ДЕАЕ-целюлозі, можна змити (елюювати) з колонки розчинами із зростаючою концентрацією хлориду натрію. Спочатку елююються слабозв'язані білки, а зі збільшенням концентрації солі та інші білки, в порядку зростання їх спорідненості до ДЕАЕ-целюлози.
Аналогічно застосовують і КМ-целюлозу, але спорідненість білків до неї прямо пропорційно числу аміногруп у молекулі білка.
Для зняття зв'язаного білка також змінюють рН елюентів.
– хроматографія гель-фільтрацією - має другу назву "метод молекулярних сит". Як сит використовують сефадекс (полісахарид декстран, оброблений епіхлоридгідрин). Зерна сефадекса набухають у воді та утворюють гель. Набряклі гранули мають пори певного діаметра.
Поділ заснований на тому, що зерна сефадекса (пори гранул) непроникні або обмежено проникні для речовин з великою молекулярною масою, а невеликі молекули вільно дифундують (проникають) у пори зерен.
Гелеподібну масу набряклого сефадекса поміщають у скляну колонку (трубку), на поверхні гелю наносять шар білкового розчину (рис. 12 а) і потім через колонку пропускають буферний розчин (елюююча рідина). Білки проходять вздовж колонки між гранулами тим повільніше, чим менша їхня молекулярна маса, оскільки молекули білків із ще меншою молекулярною масою легше дифундують всередину гранул (в пори) (рис. 12).
Мал. 12. Фракціонування білків методом гель-фільтрації
Білки вимиваються (елююються) з колонки в порядку зменшення молекулярної маси. Отже, першими елююються великі білкові молекули (рис. 12 б), які не дифундують в зерна, потім дрібні молекули і в останню чергу низькомолекулярні домішки.
Цей метод застосовують як для фракціонування білків по молекулярної масі, а й у очищення їхню відмінність від низькомолекулярних домішок.
– афінна хроматографія - або хроматографія за спорідненістю. Принцип методу у тому, що відбувається вибіркове взаємодія білків зі специфічними речовинами – лігандами, закріпленими на носіях (рис. 13).
Як носій використовують активовану бромціаном сефарозу. До сефарози приєднують ліганди різного походження – субстрат, або антиген, або рецептор, які афінно зв'язуватимуть лише один білок із суміші:
– субстрат → фермент;
- Антиген → антитіло;
– гормон → рецептор цього гормону.
Інші білки, які не зв'язалися з лігандом, видаляються шляхом промивання колонки.
Мал. 13. Механізм афінної хроматографії
Зняття з колонки афінно закріпленого білка здійснюється за допомогою буферного розчину (елюенти). До складу буфера вводять детергент, який послаблює зв'язки між білком та лігандом, або через колонку пропускають розчин з високою концентрацією вільного ліганду. В цьому випадку білок легше зв'язується з вільним лігандом і вимивається (елююється) колонки.
Лабораторна робота №8
ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНИЙ РОЗДІЛ БІЛКІВ
Метод заснований на тому, що молекули білка мають електричний заряд, величина і знак якого визначаються амінокислотним складом білка, pH та іонною силою навколишнього середовища. Під впливом зовнішнього електричного поля заряджені молекули пересуваються у розчині протилежно зарядженому полюсу. Швидкість переміщення білкових частинок пропорційна величині їх заряду і обернено пропорційна розміру частинок та ступеня їх гідратації.
Широке поширення нині отримав так званий «зональний електрофорез» - електрофорез на твердому носії (на паперових смугах, агарі, крохмалі, акриламіді), просоченому буферним розчином з потрібним значенням pH. Положення білків на папері або гелі визначають шляхом фіксації та подальшого фарбування їх тим чи іншим барвником (зазвичай бромфеноловим синім, амідовим чорним або кумассі синім). Кількість білка у кожній фракції можна орієнтовно визначати за інтенсивністю забарвлення зв'язаного барвника. Таке визначення не дає строго кількісного співвідношення білкових фракцій, оскільки кількість барвника, що зв'язується різними білками, неоднакова.
ЕЛЕКТРОФОРЕЗ HA ПАПЕРУ
Поділ аналізованої суміші відбувається на певних сортах хроматографічного паперу, просоченого буферним розчином, у приладах для електрофорезу. Білки поділяють при напрузі до 500 В.
Камера для електрофорезу складається з плексигласової ванни і кришкою, що до неї пригнана. (1). В ванні є 2 електродних відсіки (2), кожен з яких розділений поздовжньою перегородкою (3) на два відділення, сполучені між собою. Bo внутрішні відділення відсіків опускають електроди, а зовнішні - кінці паперових смуг (4), основну частину яких розташовують на горизонтальній пластинці з шипами (5), що знаходиться в центральній частині камери. Між горизонтальною пластинкою та зовнішнім відділенням електродних відсіків є палички. (6),
Рис.2. Схема приладу для низьковольтного електрофорезу
через які перекидаються паперові смужки і які служать їхнього підтримування. Під верхньою кришкою камери знаходиться зроблена з плексигласу пластинка з великими круглими отворами (7), на яку зверху кладуться змочені в дистильованій воді, складені в 4 - 5 разів листи фільтрувального паперу. Ці листи сприяють збільшенню герметичності камери і, як наслідок, - зменшенню випаровування рідини з електрофореграм у процесі електрофорезу.
Електрофорез на папері студентам пропонується провести поділ білків сироватки крові. Цим методом сироватку крові можна розділити на 5 – 9 фракцій та визначити відносний вміст білка в кожній з них. Поділ проводять у буферному розчині (pH 8,6 - 8,9) при градієнті потенціалу 3 - 5 В/см (120 - 350 B для смуг довжиною 40 - 45 см) при кімнатній температурі. Сила струму має перевищувати 0,1 - 0,3 мА за кожен сантиметр поперечного перерізу паперової смуги. Збільшення сили струму більш ніж у 2 рази неприпустимо, тому що при цьому відбувається надмірне нагрівання, значне збільшення випаровування взрештою - прогорання паперу
Реактиви:
1. Буферний розчин. Можна використовувати:
а) веронал-медіналовий буфер (pH 8,6): в 300 мл дистильованої води розчиняють10,32 гмединалу (натрієва сіль вероналу), додають1,84 гвероналу, нагрівають при помішуванні на водяній бані до розчинення і доводять водою до 1 л;
б) веронал-ацетатний буфер (pH 8,6): у 300 мл дистильованої води розчиняють 4,3 гвероналу, 0,95 гедкого натру та 3,24 гуксуснокислого натрію. До розчину доливають 30 мл 0,1 M розчину HCl і доводять водою до 1 л;
в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистильованої води розчиняють 60,5 гтрису, 6 етилендіамінтетраоцтової та 4,6 гборної кислоти.
2. Розчини для фарбування електрофореграм:
а) кислий синьо-чорний барвник (аналогічний амідовому чорному 10 Б) -0,2 г суміші: оцтова кислота (крижана) - 100 мл + метиловий спирт - 900 мл;
б) бромфеноловий синій -0,5 г, сулема -10 г, оцтова кислота (крижана) - 20 мл, дистильована вода - 980 мл;
в) бромфеноловий синій - 0,1 г, ZnSO 4 ·7H 2 O -50 г, оцтова кислота (крижана) 50 мл, дистильована вода - 900 мл.
3. Розчини для відмивання електрофореграм від фарби, що не зв'язалася з білком, і закріплення барвника на білку:
а) оцтова кислота - 2% розчин;
б) оцтовокислий натрій - 2% розчин, приготовлений на 10% розчині оцтової кислоти.
4. Розчини для елюції пофарбованих продуктів з електрофореграмами:
а) для вилучення бромфенолового синього -0,01 M розчин NaOH;
б) для вилучення кислого синьо-чорного барвника -0,1 M розчин NaOH.
Обладнання: пробірки; кювети, спектрофотометр, прилад для електрофорезу, хроматографічний папір: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM та ін.
Одержання сироватки крові. 2 - 3 мл крові набирають у суху центрифужну пробірку і залишають на 1/2 - 1 ч. Тонкою скляною паличкою обережно обводять стінки пробірки для відокремлення від них згустку, центрифугують і зливають сироватку в чисту пробірку.
Підготовка камери.Відсіки для електродів наповнюють буферним розчином до однакового рівня (щоб уникнути перетікання буфера), приблизно по 800 мл у кожен відсік. Bo внутрішні частини електродних відсіків занурюють електроди. На аркуші хроматографічного паперу (18x45 см) (при використанні тонких сортів паперу зразки краще наносити на окремі смужки шириною 4 -5 см) на відстані 15 см від одного з його вузьких сторін простим м'яким олівцем (графіт перешкоджає розтіканню рідини) окреслюють місця для нанесення проб. Вони є прямокутниками (2 х0,3 см), великі сторони яких розташовують перпендикулярно довжині паперової смуги. Відстань між стартовими зонами та краями електрофореграми -2 см. Електрофореграму просочують буфером, в якому проходитиме електрофорез. Для цього її простягають через кювету з буферним розчином. Кінці паперових смуг (6-8 см) не змочують. Від надлишку буфера звільняються, промокаючи смуги між двома-трьома аркушами фільтрувального паперу. Вологу електрофореграму поміщають у камеру на центральну горизонтальну пластинку (5), а кінці опускають у зовнішні відділення електродних відсіків. Прилад щільно закривають кришкою, під якою знаходяться змочені водою листи фільтрувального паперу.
Проведення електрофорезу.Після того, як паперові смуги повністю просочуються буферним розчином, на зазначені ділянки за допомогою піпетки об'ємом 0,1 мл наносять проби: 0,01 - 0,02 мл (1 - 2 мг білка) сироватки. Камеру закривають кришкою та включають струм. Тривалість електрофорезу становить 22 - 24 год при напрузі 200 - 300 B
Фіксація та фарбування електрофореграм.Після закінчення електрофорезу вимикають струм і відразу виймають електрофореграми з приладу. Їх розташовують на спеціальній підставці і підсушують на повітрі під тягою, потім - в сушильній шафі при 105 ºC протягом 20 хв для фіксації білків на папері, після чого поміщають в емальовану кювету, заливають барвником і залишають на 2 - 3 год. Барвник зливають і електрофореграми відмивають від його надлишку, заливаючи 3 - 4 рази 2% розчином оцтової кислоти, щоразу на 5 - 10 хв. Ділянки паперу, які не містять білка, повинні бути повністю звільнені від барвника. Для закріплення пофарбованих продуктів електрофореграми на 2 хв заливають 2% розчином оцтовокислого натрію і сушать на повітрі під тягою.
Визначення співвідношення окремих фракцій білка.При pH 8,6 білки сироватки крові заряджені негативно та переміщаються в електричному полі до анода. Найшвидше до анода рухається фракція, альбумінів, потім йдуть α 1 -, α 2 -, β - і γ-глобуліни (див. рис. 3) . Ділянки паперових стрічок, на яких виявилися плями білків, ділять поперечними лініями простим олівцем на смужки шириною 3 -5 мм і розрізають цим лініям. Кожну смужку подрібнюють і поміщають в окрему пронумеровану пробірку, заливають 3 мл0,01 M розчину NaOH, залишають на годину для отримання фарби з паперу, а потім знаходять для кожного розчину значення оптичної щільності на фотоколориметрі (спектрофотометрі) при 612 нм.
Мал. 3. Електрофореграма сироватки крові людини та крива розподілу білкових фракцій
Паралельно обробляють контрольну пробу. Для неї вирізають смужку із незабарвлених ділянок електрофореграми.
На підставі отриманих даних будують криву розподілу забарвлених продуктів на електрофореграмі Ha осі абсцис відзначають номери пробірок, на осі ординат - відповідне значення оптичної щільності . Розраховують відсоткове співвідношення білкових фракцій у сироватці крові. Для цього викреслену криву ділять щонайменше на ряд ділянок, що відповідають окремим фракціям. Розмір площі кожної ділянки пропорційна кількості фарби, що з'єдналася з білком цієї фракції. Співвідношення між цими площами обчислюють за вагою (вага ділянок паперу пропорційна їх площі), всю площу приймають за 100%. За наявності денситометра співвідношення білкових фракцій у сироватці можна визначити з денситограммы.
Попередньо визначаючи вміст білка у сироватці, розраховують його кількість для кожної фракції.
