], men definitionen av antioxidanter som kemiska föreningar ger inte en fullständig bild av de skyddande egenskaperna hos föremålet som studeras: de bestäms inte bara av mängden av en eller annan antioxidant, utan också av aktiviteten hos var och en av dem . Antioxidantaktivitet, eller antioxidantaktivitet, AOA, är hastighetskonstanten för reaktionen mellan en antioxidant och en fri radikal (kInH). Kemiluminescensmetoden (CL) gör det möjligt att bestämma den totala mängden radikaler som antioxidanter binder i provet (total antioxidantkapacitet, TAU), och när man använder metoden för matematisk modellering av CL-kinetik, även hastigheten för bildning och reaktion av radikaler med antioxidanter, dvs AOA [ , , ].

Den vanligaste modifieringen av kemiluminescensmetoden för att bestämma den totala antioxidantkapaciteten är baserad på användningen av luminol som en kemiluminescensaktivator [ , , , ]. Ett prov placeras i kemiluminometerns kyvett med tillsats av luminol, väteperoxid och en förening som kan generera radikaler som ett resultat av spontan sönderdelning (termolys), till exempel 2,2'-azobis-(2-amidinopropan) dihydroklorid (ABAP): ABAP → 2R. I närvaro av molekylärt syre bildar alkylradikalen R en peroxylradikal ROO : R + O 2 → ROO . Vidare oxiderar peroxylradikalen den kemiluminescerande sonden luminol (LH2), och luminolradikalen (LH) bildas: ROO + LH2 → ROOH + LH. Från LH, genom bildandet av mellanprodukter (luminolhydroperoxid och luminolendoperoxid), bildas en molekyl av slutprodukten av luminoloxidation, aminoftalsyra, i ett elektroniskt exciterat tillstånd, som avger en foton, och som ett resultat observeras kemiluminescens. . CL-intensiteten är proportionell mot fotonproduktionshastigheten, som i sin tur är proportionell mot den stationära LH-koncentrationen i systemet. Genom att interagera med radikaler avbryter antioxidanter den beskrivna kedjan av transformationer och förhindrar bildandet av en foton.

Föreningar som utsätts för termolys är inte den enda möjliga källan till radikaler vid analys av antioxidantkapaciteten hos ett prov med kemiluminescensmetoden. Alternativ är system pepparrotsperoxidas–väteperoxid [ , ], hemin–väteperoxid, cytokrom Med–kardiolipin–väteperoxid, etc. Reaktionsschemat för luminoloxidation av peroxidaser beaktas i arbetet av Cormier et al. .

De kinetiska CL-kurvorna för dessa system återspeglar två steg av reaktionen: steget med en ökning av CL-intensiteten och stadiet av en platå eller en gradvis minskning av luminescens, när CL-intensiteten antingen är konstant eller långsamt minskar. Uppsatsen beskriver två metoder för att mäta den totala antioxidantkapaciteten som tar hänsyn till denna egenskap hos kurvorna. TRAP-metoden (Total Reactive Antioxidant Potential) är baserad på mätning av den latenta perioden av CL τ och kan användas för att bestämma antioxidanter som trolox eller askorbinsyra: de kännetecknas av ett högt värde på reaktionshastighetskonstanten med radikaler och kan av denna anledning kallas starka antioxidanter. Under den latenta perioden sker deras fullständiga oxidation. TAR-metoden (Total Antioxidant Reactivity) mäter graden av släckning av kemiluminescens q vid platån eller vid maximum av den kemiluminescerande kurvan: formel , där I är intensiteten av kemiluminescens utan en antioxidant, och I 1 är intensiteten av CL i närvaro av en antioxidant. Denna metod används om systemet innehåller övervägande svaga antioxidanter med låga hastighetskonstanter för interaktion med radikaler - mycket lägre jämfört med luminolkonstanten.

Verkan av antioxidanter kännetecknas inte bara av indikatorer τ Och q. Som framgår av [ , ], effekten av sådana antioxidanter som urinsyra i hemin-H2O2-luminol- eller tokoferolsystemet, rutin och quercetin i cytokrom Med–kardiolipin–H 2 O 2 –luminol, kännetecknad av en förändring i den maximala hastigheten för CL-ökning ( vmax). Som resultaten av matematisk modellering av kinetik visar, är värdena för hastighetskonstanterna för interaktionen mellan dessa antioxidanter och radikaler nära värdet på luminolkonstanten, därför kan sådana antioxidanter kallas medelstarka antioxidanter.

Om det studerade materialet, i synnerhet växtråvaror, endast innehöll en typ av antioxidanter, skulle deras innehåll kunna karakteriseras av en av de tre indikatorerna som anges ovan ( τ , q eller vmax). Men växtråvaror innehåller en blandning av antioxidanter av olika styrka. För att lösa detta problem använde vissa författare [ , , , ] förändringen i kemiluminescensljussumman över en viss tid ∆S, beräknad med formeln , där ∆ S0 och ∆ S S- CL-ljussummor för en given tid t i kontroll- respektive testproven. Tiden bör vara tillräcklig för oxidation av alla antioxidanter i systemet, det vill säga för att CL-kurvan för testprovet ska nå nivån för CL-kurvan för kontrollprovet. Det senare föreslår att forskare inte bara ska registrera luminescensljussumman, utan också registrera CL-kinetikkurvan under tillräckligt lång tid, vilket inte alltid görs.

Eftersom alla uppmätta indikatorer beror på enheten och mätförhållandena, jämförs vanligtvis antioxidanteffekten av ett ämne i systemet som studeras med effekten av en antioxidant som standard, till exempel Trolox [ , ].

Pepparrotsperoxidas-väteperoxidsystemet har använts för att analysera den totala antioxidantkapaciteten hos växtmaterial av många författare. I verk [ , ] användes den latenta perioden för CL (TRAP-metoden) för att uppskatta mängden antioxidanter i prover, och i verk [ , , ] användes arean under CL-utvecklingskurvan. De listade verken ger dock ingen tydlig motivering för att välja en eller annan parameter för att uppskatta TAU.

Syftet med studien var att fastställa hur förhållandet mellan antioxidanter av olika slag påverkar TAU, och att modifiera kemiluminescensmetoden på ett sådant sätt att man mer exakt kan bestämma TAU i växtmaterial. För att göra detta har vi satt oss flera uppgifter. Först, att jämföra CL-kinetiken för de studerade objekten med kinetiken för standardantioxidanter av tre typer (stark, medium och svag) för att förstå vilken typ av antioxidanter som utgör det huvudsakliga bidraget till TAE för de studerade objekten. För det andra, att beräkna RAE för de studerade objekten genom att mäta minskningen av CL-ljussumman under verkan av dessa objekt i jämförelse med verkan av antioxidanten, som ger det största bidraget till TAC.

MATERIAL OCH METODER

Syftet med studien var industriella prover av hagtorn, bergsaska och vildrosfrukter producerade av Krasnogorsklesredstva JSC (Ryssland), samt hallonfrukter som samlats in av författarna i Moskva-regionen under naturliga tillväxtförhållanden och torkade vid en temperatur av 60 grader. –80 ° C tills de slutar extrahera juice och tryckdeformationer.

Reagenserna för analys av antioxidantkapacitet med kemiluminescensmetoden var: KH2P04, 20 mM buffertlösning (pH 7,4); peroxidas från pepparrotsrötter (aktivitet 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM vattenlösning; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazindion, 3-aminoftalsyrahydrazid, M=177,11), 1 mM vattenlösning; väteperoxid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vattenlösning; lösningar av antioxidanter (askorbinsyra, quercetin, tokoferol). Alla reagenser tillverkades av Sigma Aldrich (USA).

Avkok av hagtorn, bergaska och vilda rosfrukter och en infusion av hallonfrukter bereddes enligt metodiken i USSR:s statliga farmakopé, som anges i den allmänna farmakopéartikeln "Infusioner och dekokter".

Den totala antioxidantkapaciteten bestämdes genom att registrera kemiluminescens på en Lum-100 kemiluminometer (DISoft, Ryssland) med användning av PowerGraph 3.3-programvara. För att bestämma TAU i växtråmaterial, 40 µl luminol i en koncentration av 1 mM, 40 µl pepparrotsperoxidas vid en koncentration av 0,1 µM, från 10 till 50 µl av ett avkok eller infusion (beroende på koncentrationen) och fosfatbuffert i den mängd som krävs för att få den totala provvolymen till 1 ml. Kyvetten installerades i anordningen och CL registrerades, iakttagande av bakgrundssignalen. Efter 48 sekunders registrering av bakgrundssignalen tillsattes 100 µl H2O2 i en koncentration av 1 mM till kyvetten och CL-registreringen fortsatte i 10 minuter. Fyra prover preparerades med olika koncentrationer av vart och ett av växtobjekten. CL registrerades också för lösningar av askorbinsyra, quercetin och tokoferol vid fem olika koncentrationer för var och en av antioxidanterna. Därefter omräknades TAU för proverna av dekokter och infusioner för quercetin.

Koncentrationerna av luminol, pepparrotsperoxidas och väteperoxid valdes för att bestämma antioxidantkapaciteten hos vattenhaltiga extrakt från medicinska växtmaterial inom en rimlig tid (inte mer än 10 minuter). Under denna tid nådde kemiluminescenskurvorna för antioxidanterna askorbat och flavonoiden quercetin (de viktigaste antioxidanterna i växtmaterial) en platå, vilket indikerade den fullständiga förstörelsen av antioxidanter i systemet. Spädningarna av de studerade proverna och koncentrationerna av lösningar av standardantioxidanter (anges i bildtexterna till figurerna) valdes så att alla CL-kinetiska kurvor mättes med samma instrumentkänslighet.

Antioxidantkapaciteten beräknades från areaförändringen (∆ S) under den kinetiska kurvan för kemiluminescens (ljussumma) med tillsats av ett ämne som innehåller en antioxidant. För detta räknade vi S0 för systemet utan antioxidant och subtraherade från det området S S kännetecknar systemet till vilket antioxidanten tillsattes. ∆ värde S beror på kemiluminometerns känslighet och mätförhållanden. Förhållande ∆ S/C V(Var C- koncentration av det studerade biologiska materialet i kyvetten, g/l, och V- kyvettvolym, l) uttrycker antioxidantkapaciteten hos 1 g av det studerade materialet, d.v.s. växtmaterial.

Antioxidantkapaciteten ∆ S A en lösning av en standardantioxidant, såsom quercetin, placerad i samma volym av reaktionsblandningen. Förhållande ∆ S A /C A V(Var C A- viktkoncentration av antioxidanten i kyvetten, g/l) uttrycker antioxidantkapaciteten på 1 g av antioxidanten.

För var och en av standardantioxidanterna registrerades en signal från lösningar med flera koncentrationer för att säkerställa att beräkningarna utförs inom gränserna för ett linjärt samband och att de erhållna resultaten är reproducerbara. I själva verket erhölls ett linjärt beroende (∆ S A = k A C A) signal från koncentrationen från vilken den stökiometriska koefficienten beräknades kA. Enligt Fisher-kriteriet är de erhållna värdena för standardantioxidanter kA statistiskt signifikant med en sannolikhet på 0,975. Därefter registrerades signalen från fyra koncentrationer för vart och ett av de fyra växtproverna, och för alla prover ett linjärt beroende av signalen på koncentration (∆ S = k C), som användes för att beräkna den stökiometriska koefficienten k. Med en sannolikhet på 0,975 (Fischers test) är k-värdena som erhålls för växtprover statistiskt signifikanta. Den totala antioxidantkapaciteten hos växtmaterialet i form av vikten av standardantioxidanten (mg%) hittades med formeln .

Värden presenterades som aritmetiskt medelvärde ± standardavvikelse (M ± δ) vid p

STUDIENS RESULTAT

Studie av kemiluminescenskinetik i närvaro av natriumaskorbat (Fig. 1. Inverkan av natriumaskorbat på kemiluminescenskinetik" data-note="Koncentrationer av systemkomponenter: luminol - 40 µM, pepparrotsperoxidas - 4 nM, väteperoxid - 100 µM. Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM natriumaskorbat. antioxidant kännetecknas av en latent period när CL är nästan helt undertryckt är proportionell mot mängden antioxidant i systemet. Samtidigt förändras varken CL-kurvornas lutning eller intensiteten av CL på platån. Detta beror på att askorbinsyra är en stark antioxidant som fångar upp alla radikaler bildas i systemet, inklusive luminolradikaler, och CL utvecklas inte förrän allt askorbat är oxiderat.

Andra forskare har också visat att resultaten av kemisk analys och TAU-värdet som bestämts med kemiluminescensmetoden ofta inte stämmer överens. I arbetet korrelerade den totala antioxidantkapaciteten bestämd i peroxidas–luminol–väteperoxidsystemet med innehållet av triterpenföreningar. Men i samma författares arbete, där en annan växt var föremål för studien, observerades ingen korrelation mellan TAU och innehållet av någon grupp av ämnen, inklusive flavonoider.

Dessa avvikelser är relaterade till minst tre faktorer. För det första är aktiviteten hos antioxidanter viktig, det vill säga hastigheten för deras interaktion med radikaler, vilket är olika för olika antioxidanter som utgör växtprovet. Enligt Izmailov är hastighetskonstanterna för motsvarande reaktioner för mexidol, tokoferol och quercetin relaterade till 0,04: 2: 60. För det andra kan varje antioxidantmolekyl, som går in i en kemisk reaktion, fånga upp ett annat antal radikaler. Enligt arbetet fångade quercetin, urin och askorbinsyror 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 respektive 0,5 ± 0,2 radikaler per reagerad antioxidantmolekyl (hemin-H 2 O 2-systemet användes – luminol). För det tredje kan resultaten av studien påverkas av närvaron av peroxidasaktivitet i själva växtproverna, som i arbetet, såväl som närvaron av kalcium i proverna, vilket, som visas i arbetet, kan öka aktiviteten av pepparrotsperoxidas under vissa förhållanden. Detta orsakar vanligtvis en högre CL-intensitet på platån än på kontrollkurvorna, vilket vi dock inte observerade.

Den första faktorn begränsar kraftigt användningen av en sådan parameter som en förändring av ljussumman, eftersom tiden för kemiluminescensmätning bör vara längre än tiden för konsumtion av alla antioxidanter i testprovet. Tillvägagångssättet för detta ögonblick kan endast bedömas genom att mäta kemiluminescenskinetiken. Dessutom är bidraget från svaga antioxidanter till OAE kraftigt underskattat, eftersom tiden för deras fullständiga oxidation är många gånger längre än den acceptabla mättiden (10–20 min).

Ännu större betydelse är den stökiometriska koefficienten för antioxidanten. Antal radikaler n, fångad av den, är lika med , där ρ - stökiometrisk koefficient, och ∆ m- förändring i koncentrationen av antioxidanten under mätningen, i vårt fall - den initiala koncentrationen av testämnet i testprovet.

Skillnaden i ljussumman av glöden i frånvaro av en antioxidant och i dess närvaro är proportionell mot n. Det totala antalet avlyssnade radikaler är , där ρiär den stökiometriska koefficienten för en viss antioxidant, och m jag- dess koncentration under mätningen. Det totala antalet fångade radikaler är uppenbarligen inte lika med den totala mängden antioxidanter, eftersom koefficienterna ρiär inte bara inte lika med enhet, utan skiljer sig också avsevärt för olika antioxidanter.

Värde när proportionell mot skillnaden i ljussummor uppmätt under en viss tid mellan ett prov som innehåller en antioxidant och ett kontrollprov som inte innehåller några antioxidanter: S = k n, Var k- koefficientkonstant under samma mätförhållanden.

Metoden som behandlas i artikeln gör det möjligt att bestämma den totala antioxidantkapaciteten, medan kemisk analys gör det möjligt att bestämma det totala innehållet av antioxidanter i produkten. Därför verkar kemiluminescensmetoden vara mer informativ än kemiska analyser.

Villkoren vi valde för att bedöma den totala antioxidantkapaciteten hos växtråvaror genom att registrera kinetiken för kemiluminescens i ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol (koncentrationer av komponenter - 4 nM, 100 μM respektive 40 μM; 20 mM; fosfatbuffert, pH 7,4), säkerställde oxidation av starka antioxidanter (askorbinsyra) och måttliga antioxidanter (quercetin) på 10 min. Denna mättid är bekväm och säkerställer den erforderliga kvaliteten på mätningarna.

En analys av kemiluminescenskinetiken visade att i de studerade föremålen (avkok av rönn, vildros, hagtornsfrukter och hallonfruktinfusion) är de viktigaste antioxidanterna medelstarka antioxidanter, inklusive flavonoider, och svagstyrka antioxidanter (tokoferol, etc.). ). Baserat på minskningen av kemiluminescensljussumman, beräknades den totala antioxidantkapaciteten för de studerade objekten. Jämförelse av de erhållna TAU-värdena med resultaten av kemisk analys visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika förhållanden kan skilja sig åt i deras förmåga att effektivt skydda kroppen från de skadliga effekterna av fria radikaler. Den beskrivna tekniken är lovande för att studera växtföremål som innehåller en blandning av olika antioxidanter. Samtidigt kännetecknas det av enkelhet och låg kostnad för forskning. Att kombinera mätningen av kemiluminescenskinetik med matematisk modellering av reaktioner gör det inte bara möjligt att automatisera processen för att bestämma TAU, utan också att bestämma bidraget från enskilda grupper av antioxidanter till indikatorn.

Nyckelord

fria radikaler/antioxidant/ antioxidant aktivitet / total antioxidantkapacitet / kemiluminescens/ luminol / fria radikaler / antioxidant / antioxidantaktivitet / total antioxidantkapacitet / kemiluminescens / luminol

anteckning vetenskaplig artikel om kemiska vetenskaper, författare till vetenskaplig artikel - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Medicinalväxtmaterial är en av källorna till antioxidanter för människokroppen. Bland metoderna för att bestämma innehållet av antioxidanter i växtföremål är metoden för kemiluminescensanalys utbredd. I föreliggande arbete användes det för att uppskatta total antioxidantkapacitet(OAU) avkok av rönn, vildros och hagtorn och infusion av hallonfrukter. Kinetiken registrerades i experimentet kemiluminescens i ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol. Koncentrationerna och volymerna av systemkomponenterna i provet valdes så att starka antioxidanter (askorbinsyra) och måttligt starka antioxidanter (quercetin) oxiderades fullständigt under mättiden (10 min). En metod för att beräkna TAU baserat på en förändring av lättsumman föreslås och motiveras. kemiluminescens i närvaro av växtprover. Kinetisk analys kemiluminescens visade att i de studerade föremålen dominerar antioxidanter av medelstyrka, inklusive flavonoider, och svaga antioxidanter (tokoferol etc.). Jämförelse av de beräknade TAU-värdena för de studerade föremålen och data från deras kemiska analys visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika förhållanden efter typ kan skilja sig åt i deras förmåga att skydda kroppen från de skadliga effekterna av fria radikaler. Den beskrivna tekniken är lovande för studiet av växtföremål som innehåller en blandning av antioxidanter av olika slag.

Relaterade ämnen vetenskapliga artiklar i kemiska vetenskaper, författare till vetenskapliga artiklar - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

• 2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.

• Bestämning av antioxidanter genom aktiverad kemiluminescens med 2,2"-azo-bis(2-amidinopropan)

  2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Antioxidantverkan av dihydroquercetin och rutin i peroxidasreaktioner katalyserade av cytokrom c

  2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Utvärdering av den oxidativa och antioxidativa kapaciteten hos biologiska substrat genom kemiluminescens inducerad av Fenton-reaktionen

  2016 / Piskarev Igor Mikhailovich, I.P. Ivanova

• Bestämning av innehållet av lipohydroperoxider i blodserumlipoproteiner med hjälp av mikroperoxidas-luminolsystemet

  2011 / Teselkin Yuri Olegovich, Babenkova Irina Vladimirovna

• Metoder för studier av antioxidanter

  2004 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V.

• Antioxidantaktivitet hos växter som används i etnomedicin av Tuva

  2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.

• Studie av Fosprenils antioxidantegenskaper i olika biologiska testsystem

  2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova

• Inverkan av olika doser av polyklorerade bifenyler på tillståndet av spontan och immunglobulin-inducerad luminolberoende kemiluminescens i helblod

  2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samohodova O.V.

• Utvärdering av lipidperoxidationssystemet för antioxidantskydd hos barn med essentiell arteriell hypertoni med hjälp av spektrofotometri och kemiluminescensmetoder

  2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Kemiluminescerande bestämning av total antioxidantkapacitet i medicinalväxtmaterial

Medicinalväxtmaterial är en av källorna till antioxidanter för människokroppen. Kemiluminescensanalys är en av de vanliga metoderna för att bestämma innehållet av antioxidanter i växtmaterial. I vårt arbete användes kemiluminescensanalys för att bestämma den totala antioxidantkapaciteten (TAC) för fruktavkok av bergaska, ros och hagtorn, såväl som hallonfruktinfusion. Experiment etablerade kinetiken för kemiluminescensen av ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol. Koncentrationer och volymer av komponenter i systemet valdes så att starka antioxidanter (askorbinsyra) och antioxidanter med medelkraft (quercetin) oxiderades fullständigt under mätningen (10 minuter). En metod för TAC-beräkning baserad på förändringar i kemiluminescensljussumman i närvaro av växtprover föreslogs och underbyggdes. Analys av kemiluminescenskinetik visade att antioxidanter med medelkraft dominerar i de studerade föremålen, inklusive flavonoider och svaga antioxidanter (tokoferol och andra). Jämförelse av de beräknade TAC-värdena för föremålen som studeras och deras kemiska analysdata visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika kvoter av antioxidanter efter typ kan variera i deras förmåga att skydda kroppen mot de skadliga effekterna av fria radikaler . Tekniken som beskrivs är lovande för studier av växtföremål som innehåller en blandning av olika typer av antioxidanter.

Texten till det vetenskapliga arbetet på ämnet "Kemiluminescerande metod för att bestämma den totala antioxidantkapaciteten i medicinska växtmaterial"

Kemiluminescerande metod för bestämning av total antioxidantkapacitet i medicinska växtmaterial

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Institutionen för medicinsk biofysik, fakulteten för grundläggande medicin, Lomonosov Moscow State University, Moskva

2 Institutionen för farmakognosi, Farmaceutiska fakulteten,

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moskva

Medicinalväxtmaterial är en av källorna till antioxidanter för människokroppen. Bland metoderna för att bestämma innehållet av antioxidanter i växtföremål är metoden för kemiluminescensanalys utbredd. I det aktuella arbetet användes det för att bedöma den totala antioxidantkapaciteten (TOA) hos avkok av rönn, vildros och hagtorn och hallonfruktinfusion. I experimentet registrerades kinetiken för kemiluminescens i ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol. Koncentrationerna och volymerna av systemkomponenterna i provet valdes så att starka antioxidanter (askorbinsyra) och måttligt starka antioxidanter (quercetin) oxiderades fullständigt under mättiden (10 min). En metod för att beräkna RAE baserat på förändringen i kemiluminescensljussumman i närvaro av växtprover föreslås och underbyggs. En analys av kemiluminescenskinetiken visade att måttligt starka antioxidanter, inklusive flavonoider, och svaga antioxidanter (tokoferol, etc.) dominerar i de studerade objekten. Jämförelse av de beräknade TAU-värdena för de studerade föremålen och data från deras kemiska analys visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika förhållanden efter typ kan skilja sig åt i deras förmåga att skydda kroppen från de skadliga effekterna av fria radikaler. Den beskrivna tekniken är lovande för studiet av växtföremål som innehåller en blandning av antioxidanter av olika slag.

Nyckelord: fria radikaler, antioxidant, antioxidantaktivitet, total antioxidantkapacitet, kemiluminescens, luminol

Finansiering: Detta arbete stöddes av Russian Science Foundation, anslag nr 14-15-00375.

Ex3 Korrespondens bör tas upp: Georgy Konstantinovich Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovsky pr-t, 31, byggnad 5; [e-postskyddad]

Artikel mottagen: 03/10/2016 Artikel accepterad för publicering: 03/18/2016

kemiluminescerande bestämning av total antioxidantkapacitet i medicinalväxtmaterial

1 Institutionen för medicinsk biofysik, fakulteten för grundläggande medicin, Lomonosov Moscow State University, Moskva, Ryssland

2 Institutionen för farmakognosi, Farmaceutiska fakulteten,

Det första Sechenov Moscow State Medical University, Moskva, Ryssland

Medicinalväxtmaterial är en av källorna till antioxidanter för människokroppen. Kemiluminescensanalys är en av de vanliga metoderna för att bestämma innehållet av antioxidanter i växtmaterial. I vårt arbete användes kemiluminescensanalys för att bestämma den totala antioxidantkapaciteten (TAC) för fruktavkok av bergaska, ros och hagtorn, såväl som hallonfruktinfusion. Experiment etablerade kinetiken för kemiluminescensen av ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol. Koncentrationer och volymer av komponenter i systemet valdes så att starka antioxidanter (askorbinsyra) och antioxidanter med medelkraft (quercetin) oxiderades fullständigt under mätningen (10 minuter). En metod för TAC-beräkning baserad på förändringar i kemiluminescensljussumman i närvaro av växtprover föreslogs och underbyggdes. Analys av kemiluminescenskinetik visade att antioxidanter med medelkraft dominerar i de studerade föremålen, inklusive flavonoider och svaga antioxidanter (tokoferol och andra). Jämförelse av de beräknade TAC-värdena för föremålen som studeras och deras kemiska analysdata visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika kvoter av antioxidanter efter typ kan variera i deras förmåga att skydda kroppen mot de skadliga effekterna av fria radikaler . Tekniken som beskrivs är lovande för studier av växtföremål som innehåller en blandning av olika typer av antioxidanter.

Nyckelord: fria radikaler, antioxidant, antioxidantaktivitet, total antioxidantkapacitet, kemiluminescens, luminol

Finansiering: detta arbete stöddes av Russian Science Foundation, anslag nr. 14-15-00375.

Tack: författarna tackar Andrey Alekseev från Lomonosov Moscow State University för hans hjälp med att genomföra experimentet. Korrespondens bör tas upp: George Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, k. 5, Moskva, Ryssland, 119192; ur [e-postskyddad] Mottaget: 2016-10-03 Godkänd: 2016-03-18

Fria radikaler som genereras i kroppen stör strukturen av cellmembranen, vilket i sin tur leder till utvecklingen av olika patologiska tillstånd. Den destruktiva oxidativa effekten av radikaler förhindras av kroppens antioxidantförsvarssystem, där lågmolekylära föreningar - radikalfångare (fällor) spelar en viktig roll. En av källorna till antioxidanter är medicinska växtråvaror, såväl som preparat baserade på det, vars studie av antioxidantpotentialen hjälper till att öka deras förebyggande och terapeutiska effekt.

De viktigaste metoderna för att bestämma antioxidanter övervägs i verken, men definitionen av antioxidanter som kemiska föreningar ger inte en fullständig bild av de skyddande egenskaperna hos föremålet som studeras: de bestäms inte bara av mängden av en eller annan antioxidant , men också av var och en av dems aktivitet. Antioxidantaktivitet, eller antioxidantaktivitet, AOA, är hastighetskonstanten för reaktionen mellan en antioxidant och en fri radikal (kInH). Kemiluminescensmetoden (CL) gör det möjligt att bestämma den totala mängden radikaler som antioxidanter binder i provet (total antioxidantkapacitet, TAU), och när man använder metoden för matematisk modellering av CL-kinetik, även hastigheten för bildning och reaktion av radikaler med antioxidanter, det vill säga AOA.

Den vanligaste modifieringen av kemiluminescensmetoden för att bestämma den totala antioxidantkapaciteten är baserad på användningen av luminol som en kemiluminescensaktivator. Ett prov med tillsats av luminol, väteperoxid och en förening som kan generera radikaler som ett resultat av spontan sönderdelning (termolys), till exempel 2,2"-azobis-(2-amidinopropan) dihydroklorid (ABAP) placeras i kemiluminometerns cell:

I närvaro av molekylärt syre bildar alkylradikalen R^ en peroxylradikal ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Från LH, genom bildning av mellanliggande ämnen (luminolhydroperoxid och luminolendoperoxid), bildas en molekyl av slutprodukten av luminoloxidationen, aminoftalsyra, i ett elektroniskt exciterat tillstånd, som avger en foton och som ett resultat observeras kemiluminescens. CL-intensiteten är proportionell mot fotonproduktionshastigheten, som i sin tur är proportionell mot den stationära LH-koncentrationen i systemet. Genom att interagera med radikaler avbryter antioxidanter den beskrivna kedjan av transformationer och förhindrar bildandet av en foton.

Föreningar som utsätts för termolys är inte den enda möjliga källan till radikaler vid analys av antioxidantkapaciteten hos ett prov med kemiluminescensmetoden. Alternativ är system pepparrotsperoxidas-väteperoxid, hemin-väteperoxid, cytokrom c-kardiolipin-väteperoxid, etc. Schemat för reaktioner av luminoloxidation av peroxidaser beaktas i arbetet av Cormier et al. .

CL kinetiska kurvor för dessa system återspeglar två steg av reaktionen: steget med en ökning av CL-intensiteten och stadiet av en platå eller en gradvis minskning av luminescens, när

CL-intensiteten är antingen konstant eller långsamt avtagande. Uppsatsen beskriver två metoder för att mäta den totala antioxidantkapaciteten som tar hänsyn till denna egenskap hos kurvorna. TRAP-metoden (Total Reactive Antioxidant Potential) är baserad på att mäta CL-latensperioden t och kan användas för att bestämma antioxidanter som trolox eller askorbinsyra: de kännetecknas av en hög reaktionshastighetskonstant med radikaler och kan av denna anledning kallas starka antioxidanter.. Under den latenta perioden sker deras fullständiga oxidation. TAR-metoden (Total Antioxidant Reactivity) mäter graden av kemiluminescenssläckning q på platån eller vid maximum av kemiluminescenskurvan:

där I är intensiteten av kemiluminescens utan en antioxidant, och 11 är intensiteten av CL i närvaro av en antioxidant. Denna metod används om systemet innehåller övervägande svaga antioxidanter med låga hastighetskonstanter för interaktion med radikaler - mycket lägre jämfört med luminolkonstanten.

Effekten av antioxidanter kännetecknas inte bara av indikatorer för t och c. Som framgår av arbetet kännetecknas verkan av sådana antioxidanter som urinsyra i hemin-H202-luminolsystemet eller tokoferol, rutin och quercetin i cytokrom c-kardiolipin-H202-luminolsystemet av en förändring i den maximala hastigheten av CL-ökning (utx). Som resultaten av matematisk modellering av kinetik visar, är värdena för hastighetskonstanterna för interaktionen mellan dessa antioxidanter och radikaler nära värdet på luminolkonstanten, därför kan sådana antioxidanter kallas medelstarka antioxidanter.

Om materialet som studeras, i synnerhet växtråvaror, endast innehöll en typ av antioxidanter, skulle deras innehåll kunna karakteriseras av en av de tre indikatorerna ovan (m, q eller V). Men växtråvaror innehåller en blandning av antioxidanter av olika styrka. För att lösa detta problem använde vissa författare förändringen i kemiluminescensljussumman över en viss DE-tid, beräknad med formeln

DE = DE0 - DE,

där DE0 och DE5 är CL-ljussummor för en given tid? i kontroll- respektive testproven. Tiden bör vara tillräcklig för oxidation av alla antioxidanter i systemet, det vill säga för att CL-kurvan för testprovet ska nå nivån för CL-kurvan för kontrollprovet. Det senare föreslår att forskare inte bara ska registrera luminescensljussumman, utan också registrera CL-kinetikkurvan under tillräckligt lång tid, vilket inte alltid görs.

Eftersom alla uppmätta indikatorer beror på instrument och mätförhållanden, jämförs vanligtvis antioxidanteffekten av ett ämne i systemet som studeras med effekten av en antioxidant som standard, till exempel Trolox.

Systemet pepparrotsperoxidas-väteperoxid användes för att analysera den totala antioxidantkapaciteten hos växtmaterial av många författare. I verken, för att uppskatta mängden antioxidanter i proverna, användes CL latent period (TRAP-metoden) och i verken användes arean under CL-utvecklingskurvan. Dessa verk ger dock ingen tydlig motivering för

valet av en eller annan parameter för att uppskatta OAU.

Syftet med studien var att fastställa hur förhållandet mellan antioxidanter av olika slag påverkar TAU, och att modifiera kemiluminescensmetoden på ett sådant sätt att man mer exakt kan bestämma TAU i växtmaterial. För att göra detta har vi satt oss flera uppgifter. Först, att jämföra CL-kinetiken för de studerade objekten med kinetiken för standardantioxidanter av tre typer (stark, medium och svag) för att förstå vilken typ av antioxidanter som utgör det huvudsakliga bidraget till TAE för de studerade objekten. För det andra, att beräkna TAE för de studerade objekten genom att mäta minskningen av CL-ljussumman under verkan av dessa objekt i jämförelse med verkan av antioxidanten, som ger det största bidraget till TAE.

MATERIAL OCH METODER

Syftet med studien var industriella prover av hagtorn, bergsaska och vildrosfrukter producerade av Krasnogorsklesredstva JSC (Ryssland), samt hallonfrukter som samlats in av författarna i Moskva-regionen under naturliga tillväxtförhållanden och torkade vid en temperatur av 60 grader. -80 ° C tills de slutar isolera juice och tryckdeformationer.

Reagensen för analys av antioxidantkapacitet med kemiluminescensmetoden var: KH2PO4, 20 mM buffertlösning (pH 7,4); peroxidas från pepparrotsrötter (aktivitet 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM vattenlösning; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazindion, 3-aminoftalsyrahydrazid, M=177,11), 1 mM vattenlösning; väteperoxid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vattenlösning; lösningar av antioxidanter (askorbinsyra, quercetin, tokoferol). Alla reagenser tillverkades av Sigma Aldrich (USA).

Avkok av hagtorn, bergaska och vilda rosfrukter och en infusion av hallonfrukter bereddes enligt metodiken i USSR:s statliga farmakopé, som anges i den allmänna farmakopéartikeln "Infusioner och dekokter".

Den totala antioxidantkapaciteten bestämdes genom att registrera kemiluminescens på en Lum-100 kemi-luminometer (DISoft, Ryssland) med användning av PowerGraph 3.3-programvara. För att bestämma TAU i växtråmaterial, 40 µl luminol i en koncentration av 1 mM, 40 µl pepparrotsperoxidas vid en koncentration av 0,1 µM, från 10 till 50 µl av ett avkok eller infusion (beroende på koncentrationen) och fosfatbuffert i den mängd som krävs för att få den totala provvolymen till 1 ml. Kyvetten installerades i anordningen och CL registrerades, iakttagande av bakgrundssignalen. Efter 48 s registrering av bakgrundssignalen tillsattes 100 μl H2O2 i en koncentration av 1 mM till kyvetten och CL-registreringen fortsatte i 10 minuter. Fyra prover preparerades med olika koncentrationer av vart och ett av växtobjekten. CL registrerades också för lösningar av askorbinsyra, quercetin och tokoferol vid fem olika koncentrationer för var och en av antioxidanterna. Därefter omräknades TAU för proverna av dekokter och infusioner för quercetin.

Koncentrationerna av luminol, pepparrotsperoxidas och väteperoxid valdes för att bestämma antioxidantkapaciteten hos vattenhaltiga extrakt från medicinska växtmaterial inom en rimlig tid (inte mer än 10 minuter). Under denna tid kurvor kemiluminescensen för antioxidanterna askorbat och flavonoiden quercetin (de viktigaste antioxidanterna i växtmaterial)

nått en platå, vilket indikerade den fullständiga förstörelsen av antioxidanter i systemet. Spädningarna av de studerade proverna och koncentrationerna av lösningar av standardantioxidanter (anges i bildtexterna till figurerna) valdes på ett sådant sätt att alla CL kinetiska kurvor mättes med samma instrumentkänslighet.

Antioxidantkapaciteten beräknades från förändringen i arean (AS) under den kinetiska kemiluminescenskurvan (ljussumma) vid tillsats av ett ämne innehållande en antioxidant. För att göra detta beräknade vi S0 för systemet utan antioxidant och subtraherade från det området SS, som kännetecknar systemet som antioxidanten tillsattes. AS-värdet beror på kemiluminometerns känslighet och mätförhållandena. Förhållandet AS/C ■ V (där C är koncentrationen av det studerade biologiska materialet i kyvetten, g/l, och V är kyvettens volym, l) uttrycker antioxidantkapaciteten hos 1 g av det studerade materialet, d.v.s. , växtmaterial.

Antioxidantkapaciteten ASa för en lösning av en standardantioxidant, till exempel quercetin, placerad i samma volym av reaktionsblandningen beräknades på liknande sätt. Förhållandet AS/CÄ ■ V (där CA är viktkoncentrationen av antioxidanten i kyvetten, g/l) uttrycker antioxidantkapaciteten för 1 g av antioxidanten.

För var och en av standardantioxidanterna registrerades en signal från lösningar med flera koncentrationer för att säkerställa att beräkningarna utförs inom gränserna för ett linjärt samband och att de erhållna resultaten är reproducerbara. I själva verket erhölls ett linjärt beroende (ASa = kA ■ CA) för signalen på koncentration, från vilket den stökiometriska koefficienten kA beräknades. Enligt Fisher-kriteriet är kA-värdena som erhålls för standardantioxidanter statistiskt signifikanta med en sannolikhet på 0,975. Därefter registrerades signalen från fyra koncentrationer för vart och ett av de fyra växtproverna, och för alla prover erhölls ett linjärt beroende av signalen på koncentration (AS = k ■ C), från vilket den stökiometriska koefficienten k beräknades. Med en sannolikhet på 0,975 (Fischers test) är k-värdena som erhålls för växtprover statistiskt signifikanta. Den totala antioxidantkapaciteten hos växtmaterialet i form av vikten av standardantioxidanten (mg%) hittades med formeln

OAE = k ■ 105. k

Värden presenterades som aritmetiskt medelvärde ± standardavvikelse (M ± 5) vid p<0,05.

STUDIENS RESULTAT

Studien av kemiluminescenskinetik i närvaro av natriumaskorbat (fig. 1) visade att denna antioxidant kännetecknas av en latent period, då CL nästan helt undertrycks. Dess varaktighet är proportionell mot mängden antioxidant i systemet. I detta fall ändras varken CL-kurvornas lutning eller CL-intensiteten på platån. Detta förklaras av att askorbinsyra är en stark antioxidant som fångar upp alla radikaler som bildas i systemet, inklusive luminolradikaler, och CL utvecklas inte förrän allt askorbat är oxiderat.

Verkan av tokoferol (fig. 2) manifesterades av en minskning av intensiteten av CL på en platå, vilket är typiskt för svaga antioxidanter, även om tokoferol anses vara en av de mest

kraftfulla antioxidanter. Kanske beror denna diskrepans på att i vårt experiment fanns fria radikaler i en vattenlösning, medan effekten av tokoferol vanligtvis studeras i opolära medier. I arbetet, där komplexet av cytokrom c med kardiolipin fungerade som en källa till radikaler och reaktionen med luminol fortsatte inom detta komplex, hade tokoferol egenskaperna hos en antioxidant med medelstyrka.

Efter att ha studerat effekten av olika koncentrationer av quercetin på vårt system (fig. 3) och jämföra de kinetiska kurvorna för det och natriumaskorbat och tokoferol, kan det noteras att den huvudsakliga effekten av quercetin manifesteras i en förändring i lutningen av kurvor, dvs. utvecklingshastigheten för CL, vilket är typiskt för måttliga antioxidanter.

CL-kurvorna för alla studerade dekokter (fig. 4) liknar kurvorna för quercetin med en liten minskning av CL-intensiteten i slutet, dvs.

Tid, min

Ris. 1. Effekt av natriumaskorbat på kemiluminescenskinetik

Koncentrationerna av systemkomponenterna: luminol - 40 μM, pepparrotsperoxidas - 4 nM, väteperoxid - 100 μM. Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,05 μM; 3 - 0,10 μM; 4 - 0,15 μM; 5 - 0,2 μM; 6 - 0,25 μM natriumaskorbat.

platå. Som visas i arbetet är detta beteende typiskt för antioxidanter med medelstyrka, som i vårt fall inkluderar polyfenoler - flavonoider och tanniner. För en infusion av hallonfrukter (Fig. 4, D) märks en minskning av kemiluminescensen på platånivån, vilket är typiskt för svaga antioxidanter, som i detta fall är tokoferol. När det gäller quercetin och tokoferol innehåller hallonfruktinfusion 4,7 ± 0,9 µmol/g quercetin och 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferol.

När man jämförde kemiluminescenskurvorna som erhölls för olika koncentrationer av de fyra studerade vattenhaltiga extrakten från växtmaterial visade det sig att bidraget från medelstora och svaga antioxidanter till provernas totala antioxidantkapacitet minskade i följande ordning: hallonfruktinfusion (Fig. 4, D), nyponfruktavkok (fig. 4, C), ett avkok av rönnfrukter (fig. 4, A), ett avkok av hagtornsfrukter (fig. 4, B). AS-värdena i form av koncentrationen C av det studerade ämnet i kyvetten och värdena för den totala antioxidantkapaciteten i termer av quercetin visas i tabellen.

DISKUSSIONEN AV RESULTATEN

Data som erhölls under experimenten och TAU-värdena för de studerade objekten beräknade på grundval av dem jämfördes med innehållet av de viktigaste antioxidanterna i dem, bestämda med kemiska analysmetoder. Trots det faktum att en positiv korrelation mellan den totala mängden antioxidanter och TAU i olika objekt är obestridlig, finns det märkbara skillnader mellan dessa indikatorer. Om vi ​​till exempel tar summan av innehållet av flavonoider, tanniner och askorbinsyra, visar det sig vara mer än den beräknade TAU för alla studerade objekt, förutom avkoket av hagtornsfrukter (tabell).

Andra forskare har också visat att resultaten av kemisk analys och TAU-värdet som bestämts med kemiluminescensmetoden ofta inte stämmer överens. I arbetet bestämdes den totala antioxidantkapaciteten

46 Tid, min

Jag" "h chi----.

Ris. 2. Effekt av tokoferol på kemiluminescenskinetik

Koncentrationerna av systemkomponenterna: luminol - 40 μM, pepparrotsperoxidas - 4 nM, väteperoxid - 100 μM. Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,01 μM; 3 - 0,025 μM; 4 - 0,06 μM; 5 - 0,1 μM; 6 - 0,2 μM tokoferol.

46 Tid, min

Ris. Fig. 3. Effekt av quercetin på kemiluminescenskinetik Koncentrationer av systemkomponenter: luminol - 40 μM, pepparrotsperoxidas - 4 nM, väteperoxid - 100 μM. Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,02 μM; 3 - 0,03 μM; 4 - 0,04 μM; 5 - 0,05 μM; 6 - 0,06 μM quercetin.

Tid, min

46 Tid, min

46 Tid, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Tid, min

Ris. Fig. 4. Inverkan av avkok av rönnfrukter (A), hagtorn (B), vildros (C) och hallonfruktinfusion (D) på kemiluminescenskinetiken. (A) Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,002 g/1; 3 - 0,004 g/1; 4 - 0,006 g/1; 5 - 0,008 g/l avkok av rönnfrukter. (B) Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l avkok av hagtornsfrukter. (C) Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l avkok av nypon. (D) Kurvor: 1 - kontrollprov; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infusion av hallon.

i systemet peroxidas-luminol-väteperoxid korrelerad med innehållet av triterpenföreningar. Men i samma författares arbete, där en annan växt var föremål för studien, observerades ingen korrelation mellan TAU och innehållet av någon grupp av ämnen, inklusive flavonoider.

Dessa avvikelser är relaterade till minst tre faktorer. För det första är aktiviteten hos antioxidanter viktig, det vill säga hastigheten för deras interaktion med radikaler, vilket är olika för olika antioxidanter som utgör växtprovet. Enligt Izmailov är hastighetskonstanterna för motsvarande reaktioner för mexidol, tokoferol och quercetin relaterade till 0,04: 2: 60. För det andra kan varje antioxidantmolekyl, som går in i en kemisk reaktion, fånga upp ett annat antal radikaler. Enligt arbetet fångade quercetin, urinsyra och askorbinsyror 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 respektive 0,5 ± 0,2 radikaler per reagerad antioxidantmolekyl (gemin-H202-luminolsystem användes). För det tredje kan resultaten av studien påverkas av närvaron av peroxidasaktivitet i själva växtproverna, som i arbetet, såväl som närvaron av kalcium i proverna, vilket, som visas i arbetet, kan öka aktiviteten av pepparrotsperoxidas under vissa förhållanden. Detta resulterar oftast i mer

högre CL-intensitet på platån än på kontrollkurvorna, vilket vi dock inte observerade.

Den första faktorn begränsar kraftigt användningen av en sådan parameter som en förändring av ljussumman, eftersom tiden för kemiluminescensmätning bör vara längre än tiden för konsumtion av alla antioxidanter i testprovet. Tillvägagångssättet för detta ögonblick kan endast bedömas genom att mäta kemiluminescenskinetiken. Dessutom är bidraget från svaga antioxidanter till OAE kraftigt underskattat, eftersom tiden för deras fullständiga oxidation är många gånger längre än den acceptabla mättiden (10–20 min).

Ännu större betydelse är den stökiometriska koefficienten för antioxidanten. Antalet radikaler n som fångas upp av dem är lika med

där p är den stökiometriska koefficienten och Am är förändringen i antioxidantkoncentrationen under mätningen, i vårt fall den initiala koncentrationen av testämnet i testprovet.

Skillnaden i ljussumman av luminescensen i frånvaro av en antioxidant och i dess närvaro är proportionell mot n. Det totala antalet fångade radikaler är n = Y.p. m,

där är den stökiometriska koefficienten för en viss antioxidant, och m är dess koncentration under förändringen

Studieobjekt Flavonoider, mg%* Tanniner, mg%* Askorbinsyra, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. enheter OAU, mg% quercetin

Avkok av rönnfrukter 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Avkok av nypon 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Avkok av hagtornsfrukter 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infusion av torkade hallon 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Obs: * - litteraturdata, . AS - förändring av ljussumman för provet, rel. enheter, C - koncentration av provet i kyvetten, g/l. De beräknade värdena är tillförlitliga på sid<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

renium. Det totala antalet fångade radikaler är uppenbarligen inte lika med den totala mängden antioxidanter, eftersom koefficienterna pt inte bara inte är lika med enhet, utan också skiljer sig väsentligt för olika antioxidanter.

Värdet på n är proportionellt mot skillnaden i ljussummor mätt under en viss tid mellan ett prov som innehåller en antioxidant och ett kontrollprov som inte innehåller några antioxidanter:

där k är en koefficient som är konstant under samma mätförhållanden.

Metoden som behandlas i artikeln gör det möjligt att bestämma den totala antioxidantkapaciteten, medan kemisk analys gör det möjligt att bestämma det totala innehållet av antioxidanter i produkten. Därför verkar kemiluminescensmetoden vara mer informativ än kemiska analyser.

De förhållanden vi har valt för att bedöma den totala antioxidantkapaciteten hos växtråmaterial genom att registrera kinetiken för kemiluminescens i ett system bestående av pepparrotsperoxidas, väteperoxid och luminol (komponentkoncentrationerna är 4 nM, 100 μM respektive 40 μM; 20 mM fosfatbuffert, pH 7,4),

säkerställde oxidation av starka antioxidanter (askorbinsyra) och måttliga antioxidanter (quercetin) på 10 min. Denna mättid är bekväm och säkerställer den erforderliga kvaliteten på mätningarna.

En analys av kemiluminescenskinetiken visade att i de studerade föremålen (avkok av rönn, vildros, hagtornsfrukter och hallonfruktinfusion) är de viktigaste antioxidanterna medelstarka antioxidanter, inklusive flavonoider, och svagstyrka antioxidanter (tokoferol, etc.). ). Baserat på minskningen av kemiluminescensljussumman, beräknades den totala antioxidantkapaciteten för de studerade objekten. Jämförelse av de erhållna TAU-värdena med resultaten av kemisk analys visade att produkter som innehåller samma mängd antioxidanter med olika förhållanden kan skilja sig åt i deras förmåga att effektivt skydda kroppen från de skadliga effekterna av fria radikaler. Den beskrivna tekniken är lovande för att studera växtföremål som innehåller en blandning av olika antioxidanter. Samtidigt kännetecknas det av enkelhet och låg kostnad för forskning. Att kombinera mätningen av kemiluminescenskinetik med matematisk modellering av reaktioner gör det inte bara möjligt att automatisera processen för att bestämma TAU, utan också att bestämma bidraget från enskilda grupper av antioxidanter till indikatorn.

Litteratur

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Fria radikaler som deltagare i regulatoriska och patologiska processer. I: Grigoriev A. I., Vladimirov Yu. A., redaktörer. Grundläggande vetenskaper - medicin. Biophys. honung. technol. Moskva: MAKS Press; 2015. vol. 1. sid. 38-71.

3. Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V. Metoder för studier av antioxidanter. Chem. rast. råmaterial. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Batovska D. I., Trofimov A. V. Antioxidantaktivitet av chalcones. Kemiluminescerande bestämning av reaktivitet och kvantkemisk beräkning av energier och strukturer hos reagenser och intermediärer. Kinetik och katalys. 2010; 51(4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil "ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

radikalmedierad kemiluminescens: mekanistisk mångfald och grunder för antioxidantanalys. Arkivoc. 2007; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Utvärdering av antiradikal kapacitet genom H2O2-hemin-inducerad luminolkemiluminescens. J Agric Food Chem. 2003 3 dec; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Fria radikaler och cellulär kemiluminescens. Framgång biol. chem. 2009; 49:341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinetisk kemiluminescens som en metod för att studera fria radikaler reaktioner. Biofysik. 2011; 56(6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Bestämning av antioxidantaktivitet genom att mäta kemiluminescenskinetik. Fotobiologi och fotomedicin. 2011; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminolluminescens inducerad av 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolys. Gratis

Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Om användningen av släckning av luminolluminescens för att utvärdera SOD-aktivitet. Free Radic Biol Med. 1994 juni; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Utvärdering av total antioxidantpotential (TRAP) och total antioxidantreaktivitet från luminolförstärkta kemiluminescensmätningar. Free Radic Biol Med. feb 1995; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. En undersökning av mekanismen för den luminiscerande peroxidationen av luminol med tekniker för stoppat flöde. J Biol Chem. 1968 25 september; 243(18): 4706-14.

21. Alekseev A. V., Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Bestämning av antioxidanter genom aktiverad kemiluminescens med användning av 2,2'-azo-bis(2-amidinopropan). Bulletin of Moscow State University. Ser. 2. Khim. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Sovjetunionens hälsoministerium Statliga farmakopén för USSR XI utg. Problem. 2 ”Allmänna analysmetoder. Medicinalväxtmaterial". M.: Medicin; 1987. sid. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Studie av nyponextraktberedningar. Apotek. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Studie av hagtornsfrukt på olika sätt för konservering och vattenutvinning. Apotek. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Biologiskt aktiva substanser av frukt och vattenextrakt av vanliga hallon. Apotek. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Studie av biologiskt aktiva substanser av hagtornsfrukter - råvaror för framställning av homeopatiska matrix-tinkturer. På lör. vetenskaplig tr. Baserat på material från XXIV Mosk. intl. homeopat. konf. "Utveckling av den homeopatiska metoden i modern medicin"; 24-25 januari 2014; Moskva. M.; 2014. sid. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Studie av sammansättningen av biologiskt aktiva substanser i medicinska växtråvaror av olika konserveringsmetoder. På lör. sammandrag baserade på XX Ross. nat. kongr. "Människa och medicin"; 15-19 april 2013; Moskva. Moskva: EkoOnis; 2013. sid. 184-90.

30. Alexandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Studie av peroxidasaktivitet i extrakt från pepparrotsrhizomer och rötter och dess stabilitet mot olika influenser. Vestn. Moscow State University. Ser. 2. Chem. 2006; 47(5):350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Gratis radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. I: Grigor "ev AI, Vladimirov YuA, redaktörer. Fundamental" nya nauki - meditsine. Biofizicheskie meditsinskie tehnologii. Moskva: MAKS Press; 2015.v. 1. sid. 38-71. ryska.

2. Chanda S, Dave R. In vitro-modeller för utvärdering av antioxidantaktivitet och några medicinalväxter som har antioxidantegenskaper: En översikt. Afr J Microbiol Res. dec 2009; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel "nogo Syr" ja. 2004; (3): 63-75. Ryska.

4. Vasil "ev RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinetik och katalys. 2010; 51(4): 533-41. ryska.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioxidantpotentialen hos curcuminrelaterade föreningar studeras genom kemiluminescenskinetik, kedjebrytande effektivitet, rensningsaktivitet (ORAC) och DFT-beräkningar. Beilstein J Org Chem. 2015 11 aug; 11:1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Peroxiradikal-medierad kemiluminescens: mekanistisk mångfald och grunder för antioxidantanalys Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF. Enkel kemiluminescensanalys för antioxidativa egenskaper hos vegetabiliska lipider: grunder och illustrativa exempel Analytiker 2009 okt; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Utvärdering av antiradikal kapacitet av H2O2-hemin-inducerad luminol

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Gratis radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49:341-88. ryska.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya som metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. biofysik. 2011; 56(6): 1081-90. ryska.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologi och fotomeditsina. 2011; 7(2):70-6. ryska.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminolluminescens inducerad av 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolys. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Om användningen av släckning av luminolluminescens för att utvärdera SOD-aktivitet. Free Radic Biol Med. 1994 juni; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Synlig kemiluminescens associerad med reaktionen mellan methemoglobin eller oxihemoglobin med väteperoxid. Photochem Photobiol. nov 1994; 60(5):405-11.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Utvärdering av total antioxidantpotential (TRAP) och total antioxidantreaktivitet från luminolförstärkta kemiluminescensmätningar. Free Radic Biol Med. feb 1995; 18(2):153-8.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro-utvärdering av antioxidantaktiviteten hos liposomala flavonoler genom HRP-H2O2-luminolsystemet. J Microencapsul. 2011; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. En undersökning av mekanismen

av den luminiscerande peroxidationen av luminol genom tekniker med stoppat flöde. J Biol Chem. 1968 25 september; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fytokemiska egenskaper, fria radikaler och neuroskydd av fem medicinska växtextrakt. Evid-baserat komplement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011 10 augusti.

19. Chang CL, Lin CS. Fytokemisk sammansättning, antioxidantaktivitet och neuroprotektiv effekt av Terminalia chebula Retzius-extrakt. Evid-baserat komplement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 5 juli.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Utvärdering av antioxidantaktiviteten hos olika flavonoider med kemiluminescensmetoden. AAPS PharmSci. 2003; 5(2):111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Moscow University Chemistry Bulletin. 2012; 53(3): 187-93. ryska.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Tillämpning av optimerad kemiluminescensanalys för bestämning av antioxidantkapaciteten hos örtextrakt. Luminescens. 2012 nov-dec; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Totalt antal lågmolekylära antioxidanter som en sammanfattningsparameter, kvantifierade i biologiska prover genom en. Nat-protokoll. 2010 sep; 5(10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11:e uppl. Iss. 2. "Obshchie-metodanalys.

Lekarstvennoe rastitel "noe syr" e", Moskva: Medltsina, 1987, s. 147-8. Ryska.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie extraktsionnykh preparatov shipovnika. Apotek. 2012; (2): 14-6. ryska.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsia. 2010; (5): 16-8. ryska.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsia. 2014; (1): 8-10. ryska.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Proceedings of the 14th Moscow International Homeopathic Conference "Razvitie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi 2014.01"; Moscow meditsine 24-45, 0; s. 146- 7 ryska.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr" e razlichnykh sposobov konservatsii. Handlingar från den 20:e ryska nationalkongressen "Chelovek i lekarstvo"; 2013 apr 1519; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. sid. 184-90. ryska.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v extraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Moscow University Chemistry Bulletin. 2006; 47 (5): 350-2. Russian.

1 Bolshakova L.S. 1Milentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Oryol State Institute of Economics and Trade

2 Federal State Budget Institution "Center for Chemicalization and Agricultural Radiology "Orlovsky"

3 Federal State Budgetary Educational Institute of Higher Professional Education "State University - Educational, Scientific and Industrial Complex"

Möjligheten att använda kemiluminescens för att bedöma antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen studerades. Den föreslagna metoden är baserad på kemiluminescensen av luminol i ett alkaliskt medium, vars intensitet beror på mängden peroxider i det kemiluminescerande provet. Kemiluminescens registrerades med användning av en utvecklad uppsättning innehållande en doseringspump, en ljustät kammare, ett glasvakuumfotomultiplikatorrör och ett datorsystem. För att öka kemiluminescensen sattes en lösning av kaliumferricyanid till luminol. Förändringar i intensiteten av kemiluminescens registrerades i ögonblicket för införandet av det analyserade provet i luminollösningen. Maskrosextrakt erhållet genom torr lågtemperaturdestillation användes som det analyserade provet. Den innehåller fenolföreningar kända för sin höga antioxidantaktivitet. Det har fastställts att kemiluminescensmetoden kan användas för att bestämma antioxidantegenskaperna hos olika livsmedelsföreningar.

Möjligheten att använda kemiluminescens för att bedöma antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen studerades. Den föreslagna metoden är baserad på kemiluminescensen av luminol i ett alkaliskt medium, vars intensitet beror på mängden peroxider i det kemiluminescerande provet. Kemiluminescens registrerades med användning av en utvecklad uppsättning innehållande en doseringspump, en ljustät kammare, ett glasvakuumfotomultiplikatorrör och ett datorsystem. För att öka kemiluminescensen sattes en lösning av kaliumferricyanid till luminol. Förändringar i intensiteten av kemiluminescens registrerades i ögonblicket för införandet av det analyserade provet i luminollösningen. Maskrosextrakt erhållet genom torr lågtemperaturdestillation användes som det analyserade provet. Den innehåller fenolföreningar kända för sin höga antioxidantaktivitet. Det har fastställts att kemiluminescensmetoden kan användas för att bestämma antioxidantegenskaperna hos olika livsmedelsföreningar.

Bibliografisk länk

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. ANVÄNDNING AV KEMILUMINESCENS FÖR UTVÄRDERING AV NÄRINGSÄNDERNAS ANTIOXIDANTEGENSKAPER // Rationell näring, livsmedelstillsatser och biostimulanter. - 2014. - Nr 6. - P. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (åtkomstdatum: 12/17/2019). Vi uppmärksammar dig på tidskrifterna utgivna av förlaget "Academy of Natural History"

examensarbete

1.4 Forskningsmetoder för antioxidanter

antioxidantaktivitet klassificeras: enligt metoderna för registrering av den manifesterade AOA (volumetrisk, fotometrisk, kemiluminescerande, fluorescerande, elektrokemisk); efter typ av oxidationskälla; efter typ av oxiderad förening; enligt metoden för att mäta den oxiderade föreningen.

De mest välkända metoderna för att bestämma antioxidantaktivitet är dock:

1 TEAC (trolox ekvivalent antioxidantkapacitet): metoden är baserad på följande reaktion:

Metmyoglobin + H2O2 > Ferrylglobin + ABTS > ABTS * + AO.

Trolox Equivalence Method (TEAC) är baserad på antioxidanters förmåga att reducera 2,2-azinobis radikalkatjoner (ABTS) och därigenom hämma absorptionen i den långa våglängdsdelen av spektrumet (600 nm). En betydande nackdel med metoden är reaktionen i två steg för att erhålla en radikal. Detta förlänger analystiden och kan öka spridningen av resultat, trots att en standardiserad uppsättning reagenser används för analys.

2 FRAP (järnreducerande antioxidantkraft): metoden är baserad på följande reaktion:

Fe(III)-Tripyridyltriazin+AO>Fe(II)-Tripyridyltriazin.

Järnreducerande/antioxidantkapacitet (FRAP). Här används reduktionsreaktionen av Fe(III)-tripyridyltriazin till Fe(II)-tripyridyltriazin. Denna metod kan dock inte bestämma vissa antioxidanter, såsom glutation. Denna metod tillåter direkt bestämning av lågmolekylära antioxidanter. Vid lågt pH åtföljs reduktionen av Fe(III)-tripyridyltriazinkomplexet till Fe(II)-komplexet av uppkomsten av en intensiv blå färg. Mätningarna baseras på antioxidanternas förmåga att undertrycka den oxidativa effekten av reaktionspartiklarna som genereras i reaktionsblandningen. Denna metod är enkel, snabb och låg kostnad i utförande.

3 ORAC (syreradikalabsorbanskapacitet): metoden är baserad på följande reaktion:

Fe (II) + H2O2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminol.

Bestämning av förmågan att absorbera syreradikaler (ORAC). I denna metod registreras fluorescensen av substratet (fykoerytrin eller fluorescein), vilket uppstår som ett resultat av dess interaktion med ROS. Om det finns antioxidanter i testprovet observeras en minskning av fluorescens jämfört med kontrollprovet. Denna metod utvecklades ursprungligen av Dr. Guohua Cao vid National Institute of Aging 1992. 1996 gick Dr. Cao tillsammans med Dr. Ronald Pryer i en gemensam grupp vid USDA Research Center for Aging, där en halvautomatiserad metod var tagit fram.

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter): metoden är baserad på följande reaktion:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Denna metod använder antioxidanters förmåga att interagera med peroxylradikalen 2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroklorid (AAPH). TRAP-modifieringar består av metoder för att registrera en analytisk signal. Oftast, i det sista steget av analysen, interagerar AAPH-peroxiradikalen med ett självlysande (luminol), fluorescerande (diklorfluorescindiacetat, DCFH-DA) eller annat optiskt aktivt substrat.

Det vattenlösliga vitamin E-derivatet Trolox (6-hydroxi-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboxisyra) används som standard för TEAC-, ORAC- och TRAP-metoderna.

På senare tid har intresset för användningen av elektrokemiska metoder ökat för utvärdering av antioxidantaktivitet. Dessa metoder är mycket känsliga och snabba analyser.

Utvärderingen av antioxidantaktiviteten hos vissa livsmedelsprodukter utförs med potentiometrimetoden, baserad på användningen av egenskaperna hos antioxidantämnen för att delta i redoxreaktioner på grund av enol (-OH) och sulfhydryl (-SH) grupper.

Bestämningen av lösningarnas antioxidantegenskaper baseras på antioxidanters kemiska interaktion med mediatorsystemet, vilket leder till en förändring av dess redoxpotential. Den elektrokemiska cellen är en behållare som innehåller en K-Na-fosfatbuffertlösning, ett Fe(III)/Fe(II)-mediatorsystem och en komplex elektrod innan redoxpotentialen mäts. Antioxidantaktiviteten uppskattas i g-ekv/l.

Den amperometriska metoden för att bestämma antioxidantaktivitet är baserad på att mäta den elektriska ström som uppstår under oxidationen av testämnet på ytan av arbetselektroden, som är under en viss potential. Känsligheten för den amperometriska metoden bestäms både av typen av arbetselektroden och av den potential som appliceras på den. Detektionsgränsen för den amperometriska detektorn av polyfenoler, flavonoider är på nivån av nano-picogram, vid så låga koncentrationer finns det en lägre sannolikhet för ömsesidig påverkan av olika antioxidanter i deras gemensamma närvaro, i synnerhet manifestationen av fenomenet synergism . Nackdelarna med metoden inkluderar dess specificitet: under dessa förhållanden kan antioxidanter som själva oxideras eller reduceras i området för inte analyseras. Fördelarna med metoden inkluderar dess snabbhet, prostata och känslighet.

Galvanostatisk kulometrimetod med elektrogenererade oxidanter - metoden är tillämpbar för analys av fettlösliga antioxidanter.

Olika metoder har utvecklats för bestämning av askorbinsyra:

en amperometrisk metod som använder en aluminiumelektrod modifierad med en film av nickel(II)hexacyanoferrat genom en enkel lösningsdoppningsmetod;

en metod för fastfasspektrofotometrisk och visuell testbestämning av askorbinsyra med användning av kiselsyraxerogel modifierad med Wawels reagens och koppar (II) som ett indikatorpulver;

kemiluminescensbestämning av askorbinsyra kan utföras med flödesinjektionsmetoden enligt den kemiluminescerande reaktionen av rhodamin B med cerium (IV) i ett svavelsyramedium.

bestämning av askorbinsyra i intervallet 10-8-10-3 g/cm3 genom anodisk voltammetri i vattenhaltiga och vattenhaltiga-organiska medier.

Den vanligaste är FRAP-metoden, eftersom den är uttrycklig, högkänslig. Under de senaste decennierna har ett stort antal olika metoder för att bestämma antioxidantaktivitet med FRAP-metoden utvecklats (tabell 1).

Tabell 1 Utveckling av FRAP-metoden och dess tillämpning för att bestämma antioxidantaktiviteten hos olika föremål

				Analysobjekt	Anteckningar
				blodplasma	t=4min. Reaktionsstökiometrin och additiviteten studerades.
				Te, vin	Bestämning av AOA på grund av polyfenoler
					AOA-värden för olika typer av te jämförs
Pulido, Bravo, Saura-Calixto				Modelllösningar	t=30 min. Inverkan av icke-vattenhaltigt lösningsmedel avslöjades
				Växter
				blod, vävnad	PIA-metod. Inverkan av främmande ämnen kontrollerades.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.				Modelllösningar	Känsligheten för bestämning av olika AOs som en funktion av deras struktur och redoxpotential studerades.
Katalinic, Milos,				Olika viner
Temerdashev, Tsyupko och andra.				Modellblandningar
Loginova, Konovalova				Mediciner. Förberedelser	testmetod
Temerdashev, Tsyupko och andra.				Röda torra viner	Korrelation av AOA med andra indikatorer på vinkvalitet
Tabell 1 fortsatte
				Modellblandningar	Känsligheten för bestämning av olika AO
Vershinin, Vlasova, Tsyupko				Modellblandningar	Signalens icke-additivitet med brist på oxidationsmedel avslöjades
Anisimovich, Deineka och andra.				Modelllösningar	Kinetiska parametrar för AOA-uppskattning föreslås.

Noteringar: konventionellt märkt: PIA-flödes-injektionsanalys, TPTZ-tripyridyltriazin, DIP-2,2, -dipyridyl, PHEN-o-fenantrolin, DPA-pyridindikarboxylsyra, FZ-ferrozin, AA-askorbinsyra, CT-katekol, t - exponeringstid, min.

Interaktion mellan proteiner och polyelektrolyter i vattenlösningar

Olika analysmetoder används för att karakterisera protein-polyelektrolytkomplex. Instrumentella metoder ger information om strukturella och optiska egenskaper, samt bestämmer dynamiken och naturen hos PEC-bindning...

Effekt av d-metallföreningar på dissociationshastigheten för en vattenmolekyl i ett bipolärt membran

I processen att syntetisera nya BPM bör mycket uppmärksamhet ägnas åt att studera egenskaperna hos de erhållna proverna för det efterföljande valet av syntesförhållanden som säkerställer förbättringen av de elektrokemiska egenskaperna hos de syntetiserade membranen ...

Designerdroger och syntetiska cannabinoider

Detekteringen av syntetiska cannabinoider i växtblandningar kan utföras med olika fysikalisk-kemiska metoder, såsom kromatografi-masspektrometri, gas, tunnskikts- och högpresterande vätskekromatografi ...

Utveckling av en metod för att bestämma flavonoider i medicinalväxtmaterial

Syntes och farmakologiska egenskaper hos kinolinoner-2

Studieobjekt: Kinolinon-2. Forskningsmetod: Med hjälp av datorprogrammet "Marvin JS" skapades ämnets struktur. Därefter skickades hon till webbplatsen "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" för vidare utredning...

Termospektral metod för att studera produkterna från avdunstning av en epoxipolymer

Teknik för att erhålla högrenat kitosan från kräftdjursskal

Bestämning av kitosans molekylvikt Molekylvikten för kitosan bestämdes viskometriskt enligt standardmetoden. Lösningar med en koncentration av 0,05 och 0,5 g/dl framställdes genom att lösa en uppvägd del av polymerpulvret i en acetatbuffert (0...

Fysiska och geografiska egenskaper hos naturparkens territorium

1 Milentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Oryol State Institute of Economics and Trade

2 Federal State Budget Institution "Center for Chemicalization and Agricultural Radiology "Orlovsky"

3 Federal State Budgetary Educational Institute of Higher Professional Education "State University - Educational, Scientific and Industrial Complex"

Möjligheten att använda kemiluminescens för att bedöma antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen studerades. Den föreslagna metoden är baserad på kemiluminescensen av luminol i ett alkaliskt medium, vars intensitet beror på mängden peroxider i det kemiluminescerande provet. Kemiluminescens registrerades med användning av en utvecklad uppsättning innehållande en doseringspump, en ljustät kammare, ett glasvakuumfotomultiplikatorrör och ett datorsystem. För att öka kemiluminescensen sattes en lösning av kaliumferricyanid till luminol. Förändringar i intensiteten av kemiluminescens registrerades i ögonblicket för införandet av det analyserade provet i luminollösningen. Maskrosextrakt erhållet genom torr lågtemperaturdestillation användes som det analyserade provet. Den innehåller fenolföreningar kända för sin höga antioxidantaktivitet. Det har fastställts att kemiluminescensmetoden kan användas för att bestämma antioxidantegenskaperna hos olika livsmedelsföreningar.

kemiluminescens

antioxidant aktivitet

peroxider

näringsämnen

1. Vasiliev R.F. Kemisk glöd // Kemi och kemister, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (tillträdesdatum: 22.08.13).

2. Vladimirov Yu.A. Fria radikaler och antioxidanter // Vestn. RAMN. - 1998. - Nr 7. - S. 43–51.

3. Kondrashova E.A. Kemiluminescens som den mest känsliga metoden för enzymimmunanalys och dess tillämpning Klinisk laboratoriediagnostik. - 1999. - Nr 9. - P. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Kemiluminescensanalys // Immunologi. - 1991. - Nr 1. - S. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktiv kemiluminescens i fagocytossystemet // Mikrobiologi. - 1987. - Nr 1. - S. 109–115.

6. Sherstnev M.P. Kalciumberoende och kalciumoberoende vägar för generering av cellkemiluminescens.Kemiluminescensproblem. - 1991. - Nr 2. - S. 1–4.

Idag är kemiluminescens ett stort vetenskapsområde som ligger i gränssnittet mellan kemi, fysik och biologi. Med kemiluminescens sker en direkt omvandling av kemisk energi till energin av elektromagnetiska svängningar, d.v.s. in i världen. Med hjälp av kemiluminescens kan man lära sig hur reaktionen fortskrider, vad är dess mekanism, vilket är nödvändigt för ett effektivt och rationellt genomförande av tekniska processer. Om den tekniska processen för att erhålla någon kemisk produkt åtföljs av kemiluminescens, kan dess intensitet tjäna som ett mått på processens hastighet: ju snabbare reaktionen är, desto ljusare blir glöden. Under kemiluminescensreaktionen erhålls energirika produkter som sedan avger energi genom att sända ut ljus, det vill säga att kemisk energi omvandlas till elektromagnetisk strålningsenergi.

Syftet med studien var att undersöka möjligheten att använda kemiluminescens för att bedöma antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen.

Forskningsresultat och diskussion

Problemet med att bedöma antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen är mycket relevant. Användningen av termen "antioxidantaktivitet" för att visa användbarheten av en viss produkt görs ofta utan några kemiska och biokemiska argument. Som regel hänvisar antioxidantaktiviteten hos något ämne till effektiviteten av att minska peroxidvärdet. Själva begreppet peroxidvärde avslöjar inte heller helt dess kemiska väsen, eftersom det inte helt motsvarar kinetiken och termodynamiken i stadierna av metabolism av en viss livsmedelsprodukt. Dessutom används detta värde för att karakterisera lipider i form av fetter. Emellertid sker oxidationsprocesserna och bildandet av peroxider i kroppen inte bara med användning av fetter, utan också med andra produkter. Med andra ord kan innehållet av peroxid i en viss produkt sägas vara "vägt" på en sorts våg, där "referensvikten" är en koncentrationsenhet i en sur miljö av jodidjonen oxiderad av peroxider, som ett resultat av vilket molekylärt jod bildas:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

När molekylärt jod titreras med en lösning innehållande natriumtiosulfat fastställs dess koncentration och följaktligen bestäms mängden oxidationsmedel av jodidjoner, dvs. peroxidföreningar, som egentligen kallas peroxidtal. Bestämning av peroxidvärdet med denna typ av "vägning" baseras på reaktionen som visas i fig. 1.

Ris. 1. Bestämning av peroxidtal med hjälp av natriumtiosulfat

Således bestäms koncentrationen av peroxider från ekvationen

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

där ϒ är korrelationskoefficienten mellan koncentrationen av molekylärt jod och koncentrationen av peroxider.

Den föreslagna metoden för att bestämma peroxider i produkter är baserad på kemiluminescensen av luminol (C[lm]) i ett alkaliskt medium, vars intensitet (Ichl) beror på koncentrationen av peroxider (C[-O-O-]), i en kemiluminescerande prov:

IHL. = Ϧchl ω, (4)

där Ϧchl är kvantutbytet av kemiluminescens; ω - reaktionshastighet som involverar peroxider:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

där kchl är reaktionshastighetskonstanten eller vid:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

Mängden peroxider (-O-O-) bestäms av ljussumman (S):

Värdet på S beror på graden av fullständighet av peroxidförbrukningen i den kemiluminescerande reaktionen.

För att bestämma konstanten K konstrueras en kalibreringskurva för beroendet av ljussumman S på koncentrationen av peroxid, som bestäms genom titrering:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Väteperoxid H2O2 används som peroxider.

Därefter jämförs data erhållna från ekvation (3) och (9). Baserat på jämförelsen av ϒ och K dras en slutsats om överensstämmelsen mellan de reaktionsmekanismer som ligger till grund för bestämning av peroxider med dessa metoder. Det visade sig att i detta intervall av peroxidkoncentrationer ϒ och K verkligen överensstämmer med varandra och därför kan de användas för att bestämma peroxidvärdet.

Kemiluminescens observerades i ett alkaliskt medium innehållande luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazindion, 3-aminoftalsyrahydrazid, H2L). Det registrerades med användning av en kemiluminescerande uppsättning, inklusive en glasvakuumfotomultiplikator. Fotomultiplikatorn drivs av en högspänningslikriktare (7) kopplad till ett block (9) som förstärker fotomultiplikatorsignalen, som registreras på datorskärmens display (5).

Ris. 2. Registrering av kemiluminescens för den analyserade produkten: 1 - doseringspump; 2 - ljustät kammare; 3 - spegel; 4 - kyvett; 5 - datorsystem; 6 - fotomultiplikator; 7 - högspänningslikriktare; 8 - en enhet som låter dig bestämma spektralområdet för kemiluminescerande strålning; 9 - blockförstärkning av fotomultiplikatorsignalen

En doseringspump (1) krävs för att införa det analyserade provet i en kyvett (4) innehållande en kemiluminiscerande lösning av luminol. Denna dispenser fungerar som en omrörare för det injicerade provet med en kemiluminiscerande lösning. För att öka reaktionshastigheten och intensiteten av kemiluminescens sattes en lösning av kaliumferricyanid till luminol. Blandning utförs av luftbubblor erhållna genom att pumpa luft genom lösningsvätskan med en pump. Spegeln (3) placerad i den ljustäta kammaren (2) tjänar till bättre ljusuppsamling av kemiluminescerande strålning som infaller på fotokatoden hos fotomultiplikatorn (6) monterad i den ljustäta kammaren. Dispensern låter dig föra in önskade komponenter av vätskan i kyvetten utan att öppna den ljustäta kammaren (2) under experimenten. I detta fall kommer dessa vätskor in i kyvetten (4) genom glas- eller plaströr. Datorsystemet låter dig registrera beroendet av luminescensintensiteten I på tiden t, det vill säga kemiluminescenskinetiken:

Datorsystemet reflekterar stignings- och fallkonstanterna i funktionen I = f(t), som är konjugerade med hastighetskonstanterna för reaktionerna som orsakar kemiluminescens, det vill säga med deras kinetik. En anordning (8) ingår i den kemiluminescerande kammaren, som gör det möjligt att bestämma spektralområdet för kemiluminescerande strålning, det vill säga beroendet:

I = fl(λ). (elva)

Detta block är en kassett i form av en skiva, i vilken gränsfilter är monterade. Bytet av ljusfilter utförs genom att vrida skivkassetten runt den horisontella axeln som förbinder mitten av ljusfiltrens plan och planet för fotokatoden hos fotomultiplikatorn.

Mätningsprocessen utförs enligt följande:

1. Fotomultiplikatorns svar på förändringar i dess matningsspänning och på förändringar i intensiteten hos referensljuskällan som faller på dess katod ställs in.

2. Kyvetten fylls med en lösning av luminol i ett alkaliskt medium.

3. Dispensern fylls med det analyserade provet.

4. Beroendet av kemiluminescensintensiteten av tiden t registreras. Kemiluminescens övervakas fram till tidpunkten t1, vid vilken förändringen i I1 från tidpunkten t är minimal: I1 = fl(t).

5. En del av den analyserade lösningen matas med en dispenser.

6. Kemiluminescens av det analyserade provet observeras, vars kinetik är I = f(t).

På fig. Figur 3 visar en graf över funktionernas beroende (I1 = f1(t)), konjugerad med en graf (I = f(t)), efter införandet av den analyserade lösningen.

Som framgår av fig. 3, intensiteten av kemiluminescens av luminol ändras: en kraftig ökning följs av en kraftig minskning av luminescens efter tillsats av det analyserade provet.

Eftersom förstärkningen av kemiluminescens under oxidationen av luminol är associerad med bildningen av peroxider, indikerar minskningen av intensiteten av kemiluminescens efter införandet av det analyserade provet en minskning av deras antal. Därför kan vi tala om närvaron av antioxidantaktivitet i föreningarna som utgör det analyserade provet.

Det bör noteras att maskrosextraktet erhållet genom torr lågtemperaturdestillation, som innehåller fenolföreningar kända för sin höga antioxidantaktivitet, användes som det analyserade provet.

Ris. Fig. 3. Beroendegraf för funktioner (I1 = f1(t)), konjugerad med grafen (I = f(t)), efter införandet av den analyserade lösningen

Dessutom fann man under experimentet att med användning av kemiluminescens är det möjligt att bestämma mängden peroxider i superutspädda system, vilket är viktigt för att bedöma början av oxidation av produkter, till exempel under deras lagring.

De genomförda studierna har således visat att metoden för att bestämma peroxider i produkter, baserad på kemiluminescensen av luminol i ett alkaliskt medium, gör det möjligt att utvärdera antioxidantaktiviteten hos livsmedelsämnen och kan användas för att fastställa antioxidantegenskaperna hos olika livsmedel. föreningar.

Recensenter:

Litvinova E.V., doktor i tekniska vetenskaper, professor vid institutionen för teknik, organisation och livsmedelshygien, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., Doctor of Biological Sciences, Director of INITs, FSBEI HPE "Oryol State Agrarian University", Orel.

Verket togs emot av redaktionen den 8 november 2013.

Bibliografisk länk

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. ANVÄNDNING AV KEMILUMINESCENS FÖR UTVÄRDERING AV NÄRINGSÄNDERNAS ANTIOXIDANTEGENSKAPER // Grundforskning. - 2013. - Nr 10-11. – S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (åtkomstdatum: 12/17/2019). Vi uppmärksammar dig på tidskrifterna utgivna av förlaget "Academy of Natural History"