Ilm-fan va sanoatning turli sohalari uchun noorganik materiallar ishlab chiqarishda ko'pincha keramika texnologiyasi deb ataladigan qattiq fazali sintez yoki qattiq fazali texnologiya eng keng tarqalgan. Bularga yadro yoqilgʻisi, kosmik texnika uchun materiallar, radioelektronika, priborsozlik, katalizatorlar, oʻtga chidamli moddalar, yuqori haroratli oʻta oʻtkazgichlar, yarimoʻtkazgichlar, ferroelektriklar va pyezoelektriklar, magnitlar, turli kompozitlar va boshqa koʻplab mahsulotlar kiradi.
Qattiq fazali sintez kimyoviy reaktsiyalarga asoslangan bo'lib, unda reaktivlardan kamida bittasi qattiq modda shaklida mavjud. Bunday reaksiyalar geterogen yoki qattiq faza deb ataladi. Qattiq fazali o'zaro ta'sir, suyuq yoki gazsimon muhitdagi reaktsiyalardan farqli o'laroq, ikkita asosiy jarayondan iborat: kimyoviy reaktsiyaning o'zi va moddaning reaktsiya zonasiga o'tishi.
Kristalli komponentlar ishtirokidagi qattiq fazali reaksiyalar ularning atomlari yoki ionlarining harakatchanligi cheklanganligi va ko'plab omillarga murakkab bog'liqligi bilan tavsiflanadi. Bularga reaksiyaga kirishuvchi qattiq moddalarning kimyoviy tuzilishi va ular bilan bogʻliq reaktivligi, nuqsonlarning tabiati va kontsentratsiyasi, reaksiya zonasining yuzasi va morfologiyasi holati, oʻzaro taʼsir etuvchi reagentlarning aloqa sohasi, dastlabki mexanokimyoviy faollashuv va bir qator omillar kiradi. boshqalar. Yuqorida aytilganlarning barchasi heterojen reaktsiyalar mexanizmlarining murakkabligini aniqlaydi. Geterogen reaksiyalarni oʻrganish qattiq jismlar kimyosi, kimyoviy fizika va qattiq jismlar sirtining fizik kimyosi, termodinamika va kinetika qonunlariga asoslanadi.
Ko'pincha qattiq fazali reaktsiyalar mexanizmi faqat vaqt funktsiyasi sifatida o'zaro ta'sir darajasi to'g'risidagi eksperimental ma'lumotlar ma'lum bir kinetik model va mos keladigan kinetik tenglama bilan eng yaxshi tavsiflanganligi asosida baholanadi. Bunday yondashuv noto'g'ri xulosalarga olib kelishi mumkin.
Qattiq fazali materiallardagi jarayonlar suyuqlik yoki gazlardagi jarayonlardan bir qator muhim farqlarga ega. Bu farqlar, birinchi navbatda, qattiq jismlarda sezilarli darajada (bir necha darajali) diffuziya tezligining pastligi bilan bog'liq bo'lib, bu tizimdagi tarkibiy qismlarning kontsentratsiyasining o'rtacha hisoblanishiga to'sqinlik qiladi va shu bilan sodir bo'layotgan jarayonlarning fazoviy lokalizatsiyasiga olib keladi. Fazoviy lokalizatsiya, o'z navbatida, jarayonning o'ziga xos tezligi (yoki diffuziya koeffitsienti) ham, reaktsiya zonasining geometriyasi ham jarayonlarning kuzatilgan kinetikasiga hissa qo'shishiga olib keladi. Geometrik omillar bilan aniqlangan qattiq fazali jarayonlarning bunday xususiyatlari topokimyoviy deb ataladi. Bundan tashqari, muhokama qilinayotgan o'zgarishlar fazoviy ravishda lokalizatsiya qilinganligi sababli, ularning tezligi jarayonlarning o'zi fazalar chegarasida (reaktsiya nazorati) va har qanday tarkibiy qismlarni ushbu chegaraga etkazib berish yoki mahsulotni olib tashlash tezligi bilan aniqlanishi mumkin. s) (diffuziyani boshqarish). Model farazlari qondiriladigan oddiy tizimlar uchun bu holatlar tajribada transformatsiya darajasining vaqtga bog'liqligi turi bo'yicha aniqlanishi mumkin. Qattiq jismlardagi fazaviy o'zgarishlarning yana bir xususiyati qattiq matritsada yangi faza yadrosining hosil bo'lishi ikkinchisida elastik kuchlanishlarning paydo bo'lishiga olib kelishi bilan bog'liq bo'lib, ba'zi hollarda ularning energiyasini ko'rib chiqishda hisobga olinishi kerak. bu o'zgarishlarning termodinamiği.
Qattiq fazali jarayonlarning kinetikasiga va hosil bo'ladigan materiallarning mikro tuzilishiga ta'sir qiluvchi ko'plab omillar ham ushbu jarayonlarning tasniflash turlarining ko'pligini belgilaydi. Shunday qilib, tizimning har xil turdagi tebranishlarga nisbatan barqarorligini ko'rib chiqishda, heterojen (egalli hajmdagi kichik tebranishlarga barqaror va katta bo'lmagan tizimlar uchun) va bir hil (tizimlar uchun) kichik tebranishlarga beqaror) jarayonlari farqlanadi. Geterogen jarayonlar uchun, misol tariqasida, yadrolarning hosil bo'lish va o'sish mexanizmi orqali sodir bo'ladigan transformatsiyalarni, bir jinsli jarayonlar uchun ba'zi tartibli o'tishlarni va qattiq eritmalarning spinodal parchalanishini keltirish mumkin.
Geterogen jarayonlarda geterogen va bir jinsli yadrolanishni geterogen va bir jinsli jarayonlardan farqlash kerak. Geterogen yadrolanish strukturaviy nuqsonlarda (jumladan, nuqta dislokatsiyasi nuqsonlari va faza chegaralari) yadrolarning shakllanishini anglatadi; bir jinsli yadrolanish - qattiq fazaning nuqsonsiz hajmida yadrolarning hosil bo'lishi.
Qattiq fazali transformatsiya mahsulotini tahlil qilib, bir fazali va ko'p fazali yadrolar ajralib turadi. Ko'p fazali yadrolar bo'lsa, jarayonning mahsuloti hosil bo'lgan fazalar chegarasining sirt energiyasi bilan belgilanadigan xarakterli mikro tuzilishga ega bo'lgan ko'p fazali koloniyadir; bir fazali yadrolarning hosil bo'lishi va o'sishi holatidagi uzluksiz jarayonlardan farqli o'laroq, bu turdagi jarayonlar intervalgacha deyiladi.
Qattiq fazali transformatsiyalarni tasniflashning yana bir usuli boshlang'ich faza tarkibini va reaktsiya mahsuloti tarkibini taqqoslashga asoslangan. Agar ular bir-biriga to'g'ri kelsa, ular diffuziya bo'lmagan jarayonlar haqida gapirishadi va agar tarkib o'zgarsa, ular diffuziya jarayonlari haqida gapiradilar. Bundan tashqari, diffuziya bo'lmagan jarayonlardan boshlang'ich fazaning katta hajmida atomlarning bir vaqtning o'zida engil harakati orqali sodir bo'ladigan kooperativ jarayonlarni (masalan, martensit transformatsiyasini) ajratish foydalidir.
Diffuziyasiz fazali transformatsiyalar jarayon davomida o'zgarib turadigan termodinamik xarakteristikalar turiga ko'ra farq qilishi mumkin.
Birinchi turdagi transformatsiyalar kimyoviy potentsial hosilalari harorat yoki bosimga nisbatan o'zgargan jarayonlardir. Bu entropiya, hajm, entalpiya va ichki energiya kabi termodinamik parametrlarning fazaviy o'tish davrida keskin o'zgarishlarni nazarda tutadi. Ikkinchi turdagi transformatsiyalar paytida kimyoviy potentsialning intensiv parametrlarga nisbatan birinchi hosilalari o'zgarmaydi, lekin yuqori darajali hosilalar (ikkinchisidan boshlab) o'zgaradi. Ushbu jarayonlarda tizimning uzluksiz entropiyasi va hajmi bilan Gibbs energiyasining ikkinchi hosilalari orqali ifodalangan miqdorlarning keskin o'zgarishi kuzatiladi: issiqlik sig'imi, issiqlik kengayish koeffitsienti, siqilish va boshqalar.
Ikki faza o'rtasidagi qattiq fazali reaktsiyalar (uch yoki undan ko'p fazalar o'rtasidagi aloqalar dargumon va mos keladigan jarayonlar bir nechta ikki fazali reaktsiyalarning kombinatsiyasi sifatida ifodalanishi mumkin) diffuziya jarayonlari bo'lib, geterogen yoki bir hil bo'lishi mumkin, ham heterojen, ham bir hil yadrolanish bilan. . Bunday reaktsiyalarda bir hil jarayonlar va bir hil yadrolanish jarayonlari, masalan, uning keyingi parchalanishi bilan metastabil qattiq eritma hosil bo'lganda (ichki reaktsiyalar deb ataladi) mumkin. Bunday jarayonlarga misol ichki oksidlanishdir.
Qattiq fazali transformatsiyada termodinamik muvozanatning sharti, boshqa kimyoviy transformatsiyalar singari, boshlang'ich moddalar va reaktsiya mahsulotlaridagi komponentlarning kimyoviy potentsiallarining tengligidir. Ikki qattiq faza o'zaro ta'sirlashganda, kimyoviy potentsiallarning ko'rsatilgan tengligi turli yo'llar bilan amalga oshirilishi mumkin: 1) qattiq eritmalar hosil bo'lishi bilan boshlang'ich fazalardagi komponentlarni qayta taqsimlash; 2) boshqa kristall tuzilishga ega bo'lgan yangi fazalarning shakllanishi (bu odatda qattiq fazali reaktsiya deb ataladi) va ko'p fazali tizimning turli fazalarida komponentning kimyoviy potentsiali miqdoriga bog'liq emas. Har bir fazaning muvozanatiga faqat dastlabki fazalarni to'liq o'zgartirish bilan erishish mumkin. Qattiq fazali reaktsiyalar mexanizmi haqida eng ishonchli ma'lumotlar kompleks foydalanish orqali olinadi, bu bir vaqtning o'zida reaksiyaga kirishuvchi tizimning bir nechta parametrlarini, shu jumladan fazalar tarkibini, issiqlik effektlarini, massa o'zgarishlarini va boshqalarni kuzatish imkonini beradi.
Qattiq fazali reaksiyalarning termodinamik nazariyasini Vagner taklif qilgan, keyinchalik Shmalzrid tomonidan qoʻshilish reaksiyalari misolida ishlab chiqilgan.
Bugungi kunga qadar turli xil heterojen reaktsiyalarning yagona tasnifi mavjud emas. Bu shunday universal tasniflash uchun asos sifatida mezonni tanlash qiyinligi bilan bog'liq. Kimyoviy mezonlarga ko'ra reaksiyalar oksidlanish, qaytarilish, parchalanish, birikma, almashish va hokazo reaksiyalarga bo'linadi.Ko'rsatilgan mezon bilan bir qatorda u reaktivlarning fizik holatining asosiy mezoni sifatida keng qo'llaniladi:
Barcha heterojen reaktsiyalarning o'ziga xos xususiyati - reaktsiya zonasining interfeysida mavjudligi va lokalizatsiyasi. Odatda kichik qalinlikdagi reaktsiya zonasi turli xil tarkibdagi va turli xil xususiyatlarga ega bo'lgan moddalar egallagan bo'shliqning ikkita maydonini ajratib turadi. Reaksiya zonasining paydo bo'lish sabablari odatda ikki guruhga bo'linadi: diffuziya jarayonlarining nisbiy sekinligi va kimyoviy sabablar. Oxirgi guruh qattiq reagent yuzasida yoki mavjud ikki faza orasidagi interfeysda joylashgan atomlar yoki molekulalarning yuqori reaktivligi bilan bog'liq. Ma'lumki, qattiq yoki suyuq moddaning yuzasi ixcham namunaning massaviy xususiyatlaridan farq qiladigan xususiyatlarga ega. Bu faza interfeysining xususiyatlarini o'ziga xos qiladi. Aynan shu erda kristalli qadoqlashning sezilarli darajada qayta tuzilishi sodir bo'ladi, ikkita kristall panjara o'rtasidagi kuchlanish pasayadi va kimyoviy tarkibning o'zgarishi sodir bo'ladi.
Massa almashinuvi diffuziya orqali sodir bo'lganligi sababli va qattiq zarralarning diffuziya harakatchanligi uning tuzilishining nuqsonliligiga bog'liq bo'lganligi sababli, qattiq fazali reaktsiyalarning mexanizmi va kinetikasiga nuqsonlarning sezilarli ta'sirini kutish mumkin. Bu bosqich interfasial interfeysda reaksiyaga kirishuvchi moddalarning o'zgarishining kimyoviy bosqichidan oldin sodir bo'ladi. Shunday qilib, geterogen reaksiyalarning kinetikasi ham kimyoviy reaksiyaning tabiati, ham moddani reaksiya zonasiga etkazish usuli bilan belgilanadi. Belgilanganlarga muvofiq, reaktsiya tezligi kimyoviy bosqich (kimyoviy kinetika) yoki diffuziya (diffuziya kinetikasi) bilan chegaralanadi. Bu hodisa haqiqatda kuzatiladi.
Vagnerning fikricha, qattiq jismlarda diffuziya va shunga mos ravishda reaksiya asosan panjaraning muvozanatsiz holatidan kelib chiqqan ionlar va elektronlarning harakatchanligi hisobiga amalga oshiriladi. Turli panjara ionlari u orqali turli tezlikda harakatlanadi. Xususan, aksariyat hollarda anionlarning harakatchanligi kationlarning harakatchanligiga nisbatan ahamiyatsiz. Shuning uchun qattiq jismlarda diffuziya va shunga mos ravishda reaksiya kationlar harakati hisobiga amalga oshiriladi. Bunda farqli kationlarning diffuziyasi bir yo'nalishda yoki bir-biriga qarab borishi mumkin. Turli zaryadli kationlar bilan elektronlar harakati tufayli tizimning elektr neytralligi saqlanib qoladi. Tizimda har xil zaryadlangan kationlarning harakat tezligidagi farq tufayli elektr potentsiali paydo bo'ladi. Natijada, ko'proq harakatlanuvchi ionlarning harakat tezligi pasayadi va aksincha, kamroq mobil ionlar uchunmi? ortadi. Shunday qilib, hosil bo'lgan elektr potentsiali ionlarning diffuziya tezligini tartibga soladi. Ikkinchisi va u tomonidan aniqlangan butun qattiq fazali transformatsiya jarayonining tezligi elektron o'tkazuvchanlik va uzatish raqamlari asosida hisoblanishi mumkin. Ko'rinib turibdiki, ionlarning yo'naltirilgan tarqalishi faqat elektr maydonida yoki tizimda konsentratsiya gradienti mavjud bo'lganda mumkin.
Qattiq holatda moddalarni sintez qilishda ko'pincha hosil bo'lgan mahsulotning nafaqat kimyoviy (elementar va fazali) tarkibini, balki uning mikrostrukturaviy tashkil etilishini ham nazorat qilish kerak. Buning sababi ham kimyoviy (masalan, qattiq fazali reaksiyalardagi faollik), ham ko‘pgina fizik (magnit, elektr, optik va boshqalar) xossalarning turli ierarxik darajadagi qattiq jismning strukturaviy tashkil etilishi xususiyatlariga kuchli bog‘liqligidir. Bu darajalarning birinchisi qattiq jismning elementar tarkibini va elementlar atomlarining fazoda nisbiy joylashish usulini - kristall tuzilishini (yoki amorf qattiq jismlardagi atomlarning bevosita koordinatsion muhitining xususiyatlari), shuningdek tarkibi va kontsentratsiyasini o'z ichiga oladi. nuqta nuqsonlari. Qattiq tana tuzilishining keyingi darajasi sifatida biz kristalldagi kengaytirilgan nuqsonlarning taqsimlanishini ko'rib chiqishimiz mumkin, bu esa atomlarning joylashuvida translyatsion simmetriya kuzatilgan (nuqta nuqsonlari mavjudligi uchun sozlangan) mintaqalarning o'lchamlarini belgilaydi. Bunday hududlarni mukammal mikrokristallar deb hisoblash mumkin va ular kogerent tarqalish mintaqalari deb ataladi. Kogerent tarqalish hududlari haqida gapirganda, umumiy holatda ular qattiq fazali materialni tashkil etuvchi ixcham zarrachalarga ekvivalent emasligini unutmaslik kerak, ular sezilarli miqdordagi kengaytirilgan nuqsonlarni va shunga mos ravishda kogerent tarqalish hududlarini o'z ichiga olishi mumkin. Kogerent tarqalish mintaqalarining zarrachalar bilan mos kelishi (bu holda ular bitta domen deb ataladi) odatda faqat ikkinchisining etarlicha kichik (100 nm dan kam) o'lchamlari uchun kuzatiladi. Keyinchalik strukturaviy darajalar chang yoki keramik materialni tashkil etuvchi zarrachalarning shakli va o'lchamlari, ularning yig'ilishi, birlamchi agregatlarning yig'ilishi va boshqalar bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Qattiq fazali materiallarning turli xil ilovalari yuqorida sanab o'tilgan strukturaviy xarakteristikalar uchun turli xil, ko'pincha qarama-qarshi talablarga ega va shuning uchun turli xil sintetik usullarni talab qiladi. Shuning uchun qattiq fazali moddalarni emas, balki qattiq fazali materiallarni sintez qilish usullari haqida gapirish va har bir holatda hosil bo'lgan mahsulotni keyingi qo'llash sohasini hisobga olgan holda sintez usulini tanlash to'g'riroq.
Umuman olganda, qattiq fazali materiallarni sintez qilish usullarini ishlatiladigan kimyoviy jarayonlarning sodir bo'lishi uchun termodinamik muvozanat sharoitlaridan uzoqligiga qarab tasniflash mumkin. Umumiy qonunlarga ko'ra, muvozanat holatidan maksimal darajada uzoqda bo'lgan holatga mos keladigan sharoitlarda, hosil bo'lgan yadrolarning o'sish tezligidan yadrolanish tezligining sezilarli darajada oshishi kuzatiladi, bu aniq eng ko'p tarqalgan yadro hosil bo'lishiga olib keladi. mahsulot. Agar jarayon termodinamik muvozanat yaqinida amalga oshirilsa, allaqachon hosil bo'lgan yadrolarning o'sishi yangilarining paydo bo'lishiga qaraganda tezroq sodir bo'ladi, bu esa o'z navbatida qo'pol kristalli (chegaraviy holatda, bir kristalli) materiallarni olish imkonini beradi. Kristallarning o'sish tezligi asosan ulardagi kengaytirilgan (muvozanatsiz) nuqsonlarning kontsentratsiyasi bilan belgilanadi.
Kombinator sintez faqat eritmada (suyuq fazali sintez) emas, balki qattiq, kimyoviy inert faza yuzasida ham amalga oshirilishi mumkin. Bunday holda, birinchi boshlang'ich modda polimer tashuvchisi yuzasidagi funktsional guruhlarga kimyoviy jihatdan "bog'lanadi" (ko'pincha ester yoki amid bog'i ishlatiladi) va ikkinchi boshlang'ich moddaning eritmasi bilan ishlov beriladi, bu esa sezilarli darajada olinadi. ortiqcha bo'lib, reaktsiya tugagunga qadar davom etadi. Ushbu reaktsiya shaklida ma'lum bir qulaylik mavjud, chunki mahsulotlarni izolyatsiya qilish texnikasi soddalashtirilgan: polimer (odatda granulalar shaklida) oddiygina filtrlanadi, qolgan reagentlarni olib tashlash uchun yaxshilab yuviladi va maqsadli birikma kimyoviy yo'l bilan ajraladi. bu.
Organik kimyoda amalda har qanday holatda ham maqsadli mahsulotlarning miqdoriy hosildorligini ta'minlaydigan yagona reaktsiya mavjud emas. Faqat istisno, aftidan, CO 2 va H 2 O. yuqori haroratlarda kislorod organik moddalar to'liq yonishi Shuning uchun maqsadli mahsulotni tozalash har doim ajralmas va ko'pincha eng qiyin va vaqt talab qiladigan vazifadir. Ayniqsa, qiyin vazifa - peptid sintezi mahsulotlarini izolyatsiya qilish, masalan, polipeptidlarning murakkab aralashmasini ajratish. Shuning uchun peptid sintezida 20-asrning 60-yillari boshida R.B.Merifild tomonidan ishlab chiqilgan qattiq polimer substratda sintez qilish usuli eng keng tarqalgan.
Merrifild usulida polimer tashuvchisi benzol yadrolarida xlorometil guruhlarini o'z ichiga olgan donador o'zaro bog'langan polistirol bo'lib, ular polipeptidning birinchi aminokislota qoldig'i bilan qo'llab-quvvatlovchi bog'lovchilardir. Bu guruhlar polimerni benzilxloridning funksional analogiga aylantiradi va unga karboksilat anionlari bilan reaksiyaga kirishganda oson ester aloqalarini hosil qilish qobiliyatini beradi. Bunday qatronning N-himoyalangan aminokislotalar bilan kondensatsiyasi mos keladigan benzil efirlarning hosil bo'lishiga olib keladi. N-himoyani olib tashlash polimerga kovalent bog'langan birinchi aminokislotalarning C-himoyalangan lotini hosil qiladi. Chiqarilgan aminokislotalarning N-himoyalangan hosilasi bilan ikkinchi aminokislota bilan aminoatsillanishi, so'ngra N-himoyaning olib tashlanishi natijasida polimerga o'xshash dipeptid hosilasi ham bog'lanadi:
Bunday ikki bosqichli sikl (deprotektsiya - aminoatsilatsiya), qoida tariqasida, ma'lum uzunlikdagi polipeptid zanjirini qurish uchun qancha kerak bo'lsa, shuncha takrorlanishi mumkin.
Merifild g'oyalarini yanada rivojlantirish, birinchi navbatda, substratlar uchun yangi polimer materiallarini izlash va yaratish, mahsulotlarni ajratish usullarini ishlab chiqish va polipeptid sintezining butun tsikli uchun avtomatlashtirilgan qurilmalarni yaratishga qaratilgan edi.
Merifild usulining samaradorligi bir qator tabiiy polipeptidlarning, xususan, insulinning muvaffaqiyatli sintezi bilan namoyon bo'ldi. Uning afzalliklari ayniqsa ribonukleaza fermenti sintezi misolida yaqqol namoyon bo'ldi. Misol uchun, bir necha yil davomida katta kuch sarflagan holda, Hirshman va 22 hamkori an'anaviy suyuqlik-faza usullaridan foydalangan holda ribonukleaza fermentini (124 ta aminokislota qoldig'i) sintez qilishdi. Deyarli bir vaqtning o'zida bir xil protein avtomatlashtirilgan qattiq fazali sintez orqali olingan. Ikkinchi holda, jami 11 931 xil operatsiyalarni, shu jumladan 369 kimyoviy reaktsiyani o'z ichiga olgan sintez ikki ishtirokchi (Gatte va Merrifild) tomonidan bir necha oy ichida yakunlandi.
Merrifildning g'oyalari turli tuzilishdagi polipeptidlar kutubxonalarini kombinatsion sintez qilishning turli usullarini yaratish uchun asos bo'lib xizmat qildi.
Shunday qilib, 1982 yilda "bo'linish usuli" deb nomlanuvchi qattiq fazada peptidlarni ko'p bosqichli parallel sintez qilish uchun original strategiya taklif qilindi ( Split- bo'lish, ajratish) yoki "aralash va bo'lish" usuli (3-rasm). Uning mohiyati quyidagicha. Aytaylik, uchta aminokislotadan (A, B va C) siz barcha mumkin bo'lgan tripeptid birikmalarini olishingiz kerak. Buning uchun qattiq polimer tashuvchining (P) granulalari uchta teng qismga bo'linadi va aminokislotalardan birining eritmasi bilan ishlov beriladi. Bunday holda, barcha aminokislotalar o'zlarining funktsional guruhlaridan biri bilan polimer yuzasiga kimyoviy bog'lanadi. Olingan uch turdagi polimerlar yaxshilab aralashtiriladi va aralashma yana uch qismga bo'linadi. Barcha uchta aminokislotalarni teng miqdorda o'z ichiga olgan har bir qism to'qqiz dipeptid (uchta mahsulotning uchta aralashmasi) hosil qilish uchun bir xil uchta aminokislotadan biri bilan qayta ishlanadi. Yana bir aralashtirish, uchta teng qismga bo'lish va aminokislotalar bilan ishlov berish to'qqiz bosqichda kerakli 27 tripeptidni (to'qqizta mahsulotning uchta aralashmasi) beradi, holbuki ularni alohida olish 27 × 3 = 81 bosqichli sintezni talab qiladi.
"Biolog. jurnali Armaniston, 1 (65), 2013 PIG ATRIUMDAN IZOLALANGAN KARDIOAKTİV PEPTIDNING SOLID-FAZA SINTEZI G.S. CHAILYAN nomidagi biokimyo instituti. Bunyatyan NAS RA...”
Eksperimental va nazariy maqolalar
Eksperimental va nazariy maqolalar
Biolog. jurnali Armaniston, 1 (65), 2013 yil
kardioaktiv peptidlarning qattiq fazali sintezi,
CHUQQAT ATRIADAN IZOLALANGAN
G.S. CHAILIAN
nomidagi Biokimyo instituti. Bunyatyan NAS RA
[elektron pochta himoyalangan].
Ilmiy izlanishlarni davom ettirish maqsadida akademik. Galoyan, biz cho'chqa qalbining atrium va aurikulyar qismlaridan yangi izolyatsiya qilingan peptid birikmalarini ajratib olish, tozalash va biologik yo'nalishini aniqlash uchun bir qator tajribalar o'tkazdik. Biotestlarni o'tkazish uchun sinov namunalarining tayyor miqdorini olish kerak edi. Buning uchun peptidlarni keyingi modifikatsiyasi bilan qattiq fazali sintez usulidan foydalandik. Sintezlangan dorilarning sofligi va identifikatori yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi va massa spektral tahlili bilan tekshirildi.
Qattiq fazali sintez - fmoc-aminokislotalar - HPLC - fenilizotiyosiyanat - massa spektral tahlili:
fmoc- – – Galoyan tomonidan o'rnatilgan keyingi tadqiqotlar uchun cho'chqa atriyalaridan ajratilgan peptidlarni izolyatsiyalash, tozalash va biologik yo'nalishini aniqlash bo'yicha bir qator tajribalar o'tkazildi. Biotestlarni o'tkazish uchun namunalarning tayyor miqdori talab qilinadi. Qattiq fazali peptid sintezining o'zgartirilgan usuli qo'llanildi. Sintezlangan peptidning tozaligi va identifikatori HPLC va mass-spektral tahlil bilan aniqlandi.
Qattiq faza sintezi – yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi – mass-spektrometriya – fmoc-aminokislotalar – kardiopeptidlar – atria. Uzoq yillar davomida Armaniston Respublikasi Milliy Fanlar Akademiyasi Biokimyo institutida neyrogormonlar biokimyosi bo‘limida akad. Galoyan va uning hamkasblari gipotalamus neyrogormonlarining organizmdagi turli jarayonlarga ta'sir qilishning tartibga solish yo'llari va mexanizmlarini o'rgandilar.
Gipotalamus - gipofiz bezi - buyrak usti bezlari kabi tizimning o'zaro bog'liqligi, o'zaro bog'liqligi, yaxlit ishlashi haqidagi g'oyaning tasdiqlanishi endokrinologiyada burilish nuqtasi bo'ldi. Ushbu kontseptsiyani to'ldirish Galoyan tomonidan gipotalamus - gipofiz bezining o'zaro ta'siri to'g'risida ilgari surgan triadaning cho'chqa atriumidan ajratilgan KARDIOAKTİV PEPTIDNING QATTIQ FAZA SINTEZI.
– yurak – bu ulkan ilmiy yutuq. Keyinchalik, yangi maqsadli to'qima - yurak kashf qilindi, bu organning o'ziga xos peptidlar faoliyatini nazorat qilish qobiliyati, shuningdek, ushbu peptidlar orqali gipotalamus va yurak o'rtasida qayta aloqa mexanizmi mavjudligi ko'rsatildi.
Turli hayvonlarning gipotalamusida kardioaktiv birikmalar - K, C, G neyrogormonlari va bir qator boshqalarining kashf etilishi nafaqat ushbu neyrogormonlarning molekulyar ta'sir mexanizmlarini o'rganish, balki shunga o'xshash birikmalarni izlash bo'yicha ishlarning boshlanishi bo'ldi. yurakda. Kardioaktiv printsiplarning biokimyoviy va fizik-kimyoviy xususiyatlarini har tomonlama o'rganish uchun asos yurak mushaklarida 2 ta kardioaktiv birikma mavjudligi haqidagi ma'lumotlar edi. PDE cAMP, cAMPga bog'liq protein kinaz va boshqalarni inhibe qilish orqali glikolitik jarayonlarni va siklik nukleotidlar darajasini tartibga solishda "C" neyrohormonining ishtiroki aniqlandi. Ushbu birikmaning past molekulyar og'irligi va glikopeptid sifatida tasniflanganligi ko'rsatilgan.
Analitik xromatografiya va peptid sintezi laboratoriyasida biz cho'chqa yuragi atrium va aurikulyar zonalardan peptid birikmalarini ajratish va tozalash ishlarini olib bordik. Peptid fraktsiyalarini preparativ HPLC bilan ajratishda biz peptid tabiatining 20 ta birikmasini bir hil holatga ajratib, tozaladik. Biologik yo'nalishni aniqlash uchun barcha dorilar kalamushlarda EKG tarkibiy qismlarining o'zgarishi uchun sinovdan o'tkazildi. Eksperimental natijalar shuni ko'rsatdiki, 7 ta birikma EKGning ma'lum tarkibiy qismlariga turli xil ta'sir ko'rsatadi.
7-sonli peptid R komponentining amplitudasini, QRS kompleksining davomiyligini, S amplitudasini va boshqa parametrlarni o'zgartirishda eng katta faollikni ko'rsatdi.
Ushbu preparatning biologik ta'sir mexanizmlarini o'rganish uchun juda ko'p miqdordagi sinov namunalariga ega bo'lish kerak bo'ldi. Biologik mahsulotlarni ajratib olish va tozalash jarayoni juda samarasiz, ko'p mehnat talab qiladigan, ko'p vaqt talab qiladigan va yaxshi takrorlanuvchanlikni ta'minlay olmasligi sababli, ushbu preparatning kimyoviy sintezi juda dolzarb bo'lib qoldi. Peptidlarning kimyoviy sintezi sohasidagi jahon adabiyotini tahlil qilib, biz uchun eng maqbul usul fmoc bilan himoyalangan aminokislotalar yordamida qattiq fazali sintez usuli degan xulosaga keldik. 1984 yilda kashf etilgan Qattiq fazali peptid sintezi samaradorlik, shuningdek, qulay ishlov berish va tozalash bo'yicha an'anaviy sintezdan ko'p afzalliklarga ega.
Bir nechta turli usullardan foydalangan holda: bu preparatning gidrolizi, aminokislotalarni fenil izotiyosiyanat bilan o'zgartirish, biz 7-sonli peptidning aminokislota tarkibini oldik. Mass-spektral va NMR tahlillari va Edmond degradatsiyasidan olingan ma'lumotlardan foydalanib, biz nafaqat aminokislotalar tarkibini, balki №7 peptidning aminokislotalar ketma-ketligini ham olishga muvaffaq bo'ldik.
Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Qattiq fazali sintezning samarali jarayoni ko‘p jihatdan uni amalga oshirish uchun turli shart-sharoitlarni to‘g‘ri tanlashga bog‘liq, masalan, qatron, erituvchi va sintez kinetikasini tanlash. Bu o'zgaruvchilar qatronning shishish darajasiga va uning aminokislotalar bilan bog'lanishiga, bog'lanish joylari soniga ta'sir qiladi, natijada peptid sinteziga ta'sir qiladi. Biz qattiq fazali sintez jarayonini o'rganilgan peptidlarimizga, ularning aminokislotalar ketma-ketligining o'ziga xos xususiyatlarini hisobga olgan holda moslashtirdik.
G.S. CHAILIAN Materiallar va usullar. Ishlatilgan barcha reagentlar, erituvchilar, qatronlar Advanced Chem Techcompany kompaniyasidan. Biz sintez paytida aminokislotalarning N-termini va sintez davomida hal qiluvchi sifatida dimetilformamidni (DMF) himoya qilish uchun fmoc guruhlaridan foydalandik. Biz tayanch sifatida kislotaga chidamli 2-xlorotritil qatronidan foydalandik. Fmoc guruhlarini himoya qilish DMFdagi piperidin eritmasi yordamida amalga oshirildi.
Sintez jarayonida birinchi amino kislotani qatronga joylashtirish juda muhimdir. Ikki gramm 2Cl-Trt qatroni 10 ml shpritsga quyiladi. DMF shpritsga tortildi va qatron 15 daqiqa davomida shishib ketishiga ruxsat berildi. Keyin DMF yuvildi. Keyin birinchi aminokislota (fmoc-Pro) va reaktsiya faollashtiruvchisi (DIPEA) eritmasi 1RESIN/1,2FMOC-PRO/4DIPEA nisbatida shpritsga tortildi. Birinchi aminokislotani qo'shish reaktsiyasi 3 soat davom etdi.Sintezning juda muhim sharti birinchi aminokislota qo'shilgandan keyin erkin bog'lovchilarning yo'qligi, shuning uchun qatron birinchi aminokislota bilan bog'langandan so'ng, aralashma bilan ishlov berilgan. metilen, DIPEA (diizoproiletilamin) va DMF 80DMF/15MEOH/5DIPEA nisbatida qolgan bo'sh uchlarini blokirovka qilish uchun. Shundan so'ng, DMF qatroni 5 daqiqa davomida 5 marta yuviladi. Keyin aminokislotalar DMFdagi pipedinning 30% li eritmasi bilan 8 marta 5 daqiqa davomida blokirovka qilingan. Shundan so'ng, qatronlar DMF bilan 5 marta 5 daqiqa davomida yuviladi. Ushbu tsikl peptid sintezi davomida takrorlandi. Aminokislotalarni qo'shish va blokirovka qilishning har bir bosqichidan so'ng, reaktsiyaning borishi Kayzer testi bilan kuzatildi, bu ningidrinning erkin aminokislota bilan reaktsiyasi bo'lib, xarakterli quyuq ko'k rang hosil qiladi. Ushbu test tufayli aminokislotalarni bog'lash va blokirovka qilish reaktsiyalarini bosqichma-bosqich kuzatish mumkin bo'ldi.
7-sonli sintezlangan peptidni tozalash va nazorat qilish Waters (AQSh) dan 2 komponentli preparativ HPLC tizimida amalga oshirildi. Namunani in'ektsiya qilish uchun 500 mkL halqa hajmiga ega Rheodyne injektori ishlatilgan. Aniqlash 190-360 nm oralig'ida amalga oshirildi. Teskari fazali HPLC uchun Symmetry Si-100 C18 ustunidan (4,6x250 mm) foydalandik. Oqim tezligi 50 ml / min. H2O/ACN/TFA (98/2/0,1)/(0,100,0,1) gradientli eluent tizimidan foydalanilgan. Tahlil vaqti 15 min. Rexromatografiya Knauer HPLC analitik tizimida amalga oshirildi. XbridgeC18 ustuni (2,6x150 mm) ishlatilgan. Aniqlash 214 nm da amalga oshirildi.
Olingan ma'lumotlarni tasdiqlash uchun sintez qilingan preparat CSU "Analitik spektrometriya" da ommaviy spektral tahlildan o'tkazildi.
Natijalar va muhokama. Xromatogrammadan olingan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, sintezlangan peptid No7 tozalangandan keyin tozaligi 99,6% dan ortiq (1-rasm).
– – –
Biz X-bridgeC18 ustunida 7-sonli mahalliy peptidning qiyosiy xromatografik tahlilini uning sintezlangan analogi bilan bir xil sharoitda o'tkazdik. Taqqoslash natijalari keltirilgan (2-rasm).
Cho'chqa atriumidan IZOLALANGAN kardioaktiv peptidning qattiq fazali sintezi
– – –
Guruch. 4. Sintezlangan (A) va nativ (B) dori vositalarining spektrogrammasi.
G.S. CHAILIAN Xromatogrammalarni taqqoslashdan ko'rinib turibdiki, sintez qilingan analog va 7-sonli mahalliy peptid massasi va ajralib chiqish vaqti bo'yicha bir xil bo'lib, bu ularning tuzilishi va aminokislotalar ketma-ketligini ko'rsatadi. Shunday qilib, qattiq fazali peptid sintezi usulidan foydalangan holda va o'rganilayotgan peptidning strukturaviy xususiyatlarini hisobga olgan holda, biz 9 ta aminokislotadan tashkil topgan bir hil va mahalliy peptidga o'xshashni olishga muvaffaq bo'ldik. Kelajakda preparatning etarli miqdoriga ega bo'lgan holda, biz nafaqat ushbu peptidning yurak faoliyatini tartibga solish usullarini, balki boshqa organlar va tizimlarga ta'sir qilish mexanizmlarini aniqlash uchun bir qator biotestlar o'tkazishni rejalashtirmoqdamiz.
ADABIYOT
Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Buqaning yuragida yangi 1 ni aniqlash va aniqlash.
kardioaktiv oqsillar. Savol asal. Kimyo, 37, 2, p. 56-58, 1991 yil.
Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Izolyatsiya va tavsif 2.
"C" neyrogormonining tashuvchisi oqsilining kardioaktiv triptik qismi. Neyrokimyo, 2, 3, p. 263-271, 1983 yil.
Srapionyan, R.M. Misryan, S.S. Past molekulyar og'irlikdagi koronar faol birikmalarni ajratish 3.
jel filtrlash va poliakrilamid jel elektroforez usullari kombinatsiyasidan foydalangan holda yurak mushaklari. Biolog. jurnali Armaniston, 27, 10, 102-104, 1974 yil.
4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Turli hayvonlarning qalbida kardioaktiv oqsil komplekslarining tarqalishi. Biolog. jurnali Armaniston, 40, 7, 588-590, 1987 yil.
5. Galoyan A. Gipotalamo-neyrohipofiz tizimining neyrosekretsiyasi va gormonlarini tartibga solish, SSSR, 1963 yil.
6. Galoyan A.A. Yangi kardioaktiv gormonlar va funktsional tizimning immunomodulyatorlari biokimyosi Neyrosekretor gipotalamus, endokrin yurak. Fan nashriyoti. p. 240, 1997 yil.
7. Galoyan A.A., Besedovskiy H. Neyrokimyo va molekulyar neyrobiologiya bo'yicha qo'llanma, 3-nashr, Springer Publishers, 500 p., 2008 yil.
8. Galoyan A.A., Miya neyrosekretorsitokinlari: Immunitet reaktsiyasi va neyronlarning omon qolish, VIII, 188 p., 2004 yil.
9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Gipotalamusdan ajratilgan koronarodilator oqsillarni tozalash. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966 yil.
10. Mart J., Smit M. Martning rivojlangan organik kimyosi. John Wiley & Sons, Inc. tomonidan nashr etilgan, Hoboken, Nyu-Jersi, p. 133, 2007 yil.
– – –
Shunga o'xshash ishlar:
"JAMOATLAR" nashriyoti "FAN" Moskva 1979 UDC 581.55:56.017 Plotnikov V.V. O'simliklar jamoalari tuzilishining evolyutsiyasi. M .: Fan, p. 1979, 276 Zamonaviy metall haqida...”
nomidagi muzey fondi yangiliklari. A.A.Brauner No2 I jild 2004 yil nomidagi muzey fondi yangiliklari. "
Ixtiro H-D--Nal--Thr-NH 2 formulali peptid sintezining qattiq fazali usuliga taalluqlidir, bunda ham Boc-himoyalangan, ham Fmoc-himoyalangan aminokislotalar va xlorometillangan polistirol qatroni ishlatiladi. 10 ish haqi pashsha.
Ixtiro tegishli bo'lgan texnologiya sohasi
Ushbu ixtiro uch yoki undan ortiq aminokislota qoldiqlarini o'z ichiga olgan, N-terminal aminokislotaga, N-terminal aminokislotaga qo'shni so'nggi aminokislotaga va C-terminal aminokislotalarga ega bo'lgan peptidni tayyorlash usuliga tegishli.
San'atdan oldingi
Qattiq fazali peptid sintezi 1963 yilda eritmadagi peptid sintezi bilan bog'liq oraliq tozalash bosqichlarining ko'plab muammolarini bartaraf etish uchun kiritilgan (Stewart va boshqalar. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2-nashr, 1984). Qattiq fazali sintezda aminokislotalar istalgan ketma-ketlikdagi peptidga yig'iladi (masalan, birlashtiriladi), zanjirning bir uchi (masalan, C-terminus) erimaydigan tayanchga biriktiriladi. Istalgan ketma-ketlik tayanchga (tayanchga) yig'ilgandan so'ng, peptid tayanchdan chiqariladi (ya'ni ajraladi). Birlashtiruvchi aminokislotalarning a-amino guruhlari uchun ikkita standart himoya guruhi kuchli kislota bilan chiqariladigan Boc va asos bilan olib tashlanadigan Fmoc hisoblanadi. Ushbu ixtiro arzon xlorometillangan polistirol qatronida bitta sintezda ushbu ikkala a-amino himoya vositalarining kombinatsiyasidan foydalangan holda peptidlarni ishlab chiqarishning qulay usuli bilan bog'liq.
Yuqorida aytib o'tilgan a-aminokislotalarni himoya qilish sxemalarining har qandayidan foydalangan holda qattiq fazali peptid sintezini ishlab chiqishda, zanjirni yig'ish paytida peptidning tarkibiy aminokislotalarining har qanday reaktiv "yon guruhlari" kiruvchi kimyoviy reaktsiyalardan himoyalangan bo'lishi muhimdir. Har xil yon guruhlarni himoya qilish uchun tanlangan kimyoviy guruhlar a-amino guruhlarni himoya qilish uchun ishlatiladigan reagentlar tomonidan olib tashlanmasligi ham ma'qul. Uchinchidan, o'sib borayotgan peptid zanjirining qatron zarrachalari bilan bog'lanishi, har qanday turdagi aminokislotalarni himoya qilish uchun zanjirni yig'ish jarayonida ishlatiladigan reagentlarga chidamli bo'lishi muhimdir. Fmoc yordamida a-amino guruhini himoya qilish sxemasi bo'lsa, yon guruh himoyasi Fmocni olib tashlash uchun ishlatiladigan gidroksidi reagentlarga chidamli bo'lishi kerak. Amalda, bu yon zanjirni himoya qiluvchi guruhlar odatda peptid zanjiri yig'ilishi tugagandan so'ng zaif kislotali reagentlar bilan chiqariladi. Agar Boc yordamida a-amino himoya qilish sxemasi ishlatilsa, yon guruh himoyasi har bir tsiklda Boc guruhini olib tashlash uchun ishlatiladigan zaif kislotali reagentga chidamli bo'lishi kerak. Amalda, Boc bilan a-amino himoya qilish sxemasidagi bu yon zanjirni himoya qiluvchi guruhlar odatda peptid zanjiri yig'ilishi tugagandan so'ng suvsiz HF bilan chiqariladi. Shunday qilib, amalda Fmoc bilan -amino guruhini himoya qilish sxemasida yon zanjirlarni himoya qilish uchun keng tarqalgan bo'lib foydalaniladigan guruhlar, Boc bilan -amino guruhlarini himoya qilish uchun ishlatiladigan sharoitlarda beqaror. Shuning uchun qattiq fazali peptid sintezida peptid zanjirini yig'ish jarayonida a-amino guruhlarini himoya qilish sxemalarining ikki turi birlashtirilmaydi. Bundan tashqari, peptid sintezida ishlatiladigan eng arzon polimer qatroni (xlorometillangan polistirol yoki "Merifild qatroni") Boc guruhlari bilan himoyalangan aminokislotalar bilan birgalikda keng qo'llanilsa-da, adabiyotlar a-amino himoyasi uchun qo'llanilmaydi degan xulosaga keladi. ishqoriy sharoitda uning beqarorligi tufayli Fmoc guruhlari tomonidan guruhlar (qarang. Styuart va boshq. Qattiq fazali peptid sintezi. Pirs Chemical Co., 2-nashr, 1984). Ushbu ixtiro ma'lum peptidlarning qattiq fazali sintezi jarayonida Merifild qatronida Boc-himoyalangan va Fmoc-himoyalangan aminokislotalarni birlashtirish usuliga qaratilgan.
Somatostatin analogi bo'lgan Lanreotide® o'sish gormoni chiqarilishini inhibe qilishi, shuningdek insulin, glyukagon va oshqozon osti bezi ekzokrin sekretsiyasini inhibe qilishi ma'lum.
AQSh patenti № 4,853,371 Lanreotide® ni ochib beradi va da'vo qiladi, uni tayyorlash jarayoni va o'sish gormoni, insulin, glyukagon va ekzokrin oshqozon osti bezi sekretsiyasini inhibe qilish usuli.
AQSh patenti № 5,147,856 restenozni davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
AQSh Patenti № 5,411,943 gepatomani davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
AQSh Patenti № 5,073,541 o'pka saratonini davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
1993-yil 9-iyulda berilgan AQSH Patent arizasi № 08/089410 melanomani davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
AQSh patenti № 5,504,069 qattiq o'smaning tez o'sishini inhibe qilish uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
1997-yil 13-mayda berilgan AQSh Patent arizasi № 08/854941, tana vaznini yo'qotish uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
1997-yil 13-mayda berilgan AQSH patentiga oid № 08/854943 arizasi Lanreotide® dan insulin qarshiligi va X sindromini davolashda foydalanishni ochib beradi.
AQSh Patenti № 5,688,418, oshqozon osti bezi hujayralarining hayotiyligini uzaytirish uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
PCT Ilova No. PCT/US 97/14154 fibrozni davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
1997-yil 13-mayda berilgan AQSH Patent arizasi № 08/855311 giperlipidemiyani davolash uchun Lanreotide® dan foydalanishni ochib beradi.
1995-yil 12-mayda berilgan 08/440061-sonli AQSh patenti talabnomasida giperamilinemiyani davolash uchun Lanreotid® dan foydalanish ko'rsatilgan.
1997-yil 7-mayda berilgan AQSH Patent arizasi № 08/852221, Lanreotide® dan giperprolaktinemiya va prolaktinomalarni davolashda foydalanishni ochib beradi.
Ixtironing mohiyati
Ushbu ixtiro uch yoki undan ortiq aminokislota qoldiqlarini o'z ichiga olgan, N-terminal aminokislotaga, N-terminal aminokislotaga qo'shni so'nggidan oldingi aminokislotaga va C-terminal aminokislotaga ega bo'lgan peptidni tayyorlash usulini taqdim etadi, bu usul quyidagilarni o'z ichiga oladi: quyidagi qadamlar:
(a) birinchi aminokislotani qattiq qo'llab-quvvatlovchi qatronga ester bog'i orqali biriktirib, birinchi qo'shilish mahsulotini hosil qiladi, bu (i) seziy tuzini hosil qilish uchun seziy karbonatning suvli eritmasi bilan birinchi aminokislotaning alkogolli eritmasi bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi. birinchi aminokislotadan, (ii) hal qiluvchisiz birinchi aminokislota seziy tuzini olish, (iii) qattiq qatron tayanchini quruq (suvsiz) qutbli aprotik erituvchida birinchi aminokislotaning seziy tuzi bilan reaksiyaga kiritish. birinchi qo'shimcha mahsulot hosil qilish,
bu erda birinchi aminokislota peptidning C-terminal aminokislotasiga to'g'ri keladi, birinchi aminokislotaning yon bo'lmagan zanjiri (asosiy) zanjirining aminokislotalari Boc tomonidan bloklanadi va birinchi aminokislota funktsional xususiyatga ega emas. himoya zarur bo'lgan yon zanjirdagi guruh va qattiq tashuvchi qatronlar xlorometillangan polistirolli qatronlardir;
(b) himoyalanmagan birinchi qo'shilish mahsulotini hosil qilish uchun kislota bilan birinchi qo'shilgan mahsulotdan Bocni himoya qilish (blokirovka qilish);
(c) ixtiyoriy ravishda, birinchi qo'shilgan mahsulotga qo'shimcha aminokislota qo'shish, bu keyingi aminokislotani peptid kengaytiruvchi reagentni o'z ichiga olgan organik erituvchida chiqarilgan birinchi qo'shilgan mahsulot bilan bloklangan (himoyalangan) keyingi qo'shilish mahsulotini ishlab chiqarish uchun reaksiyaga kiritishni o'z ichiga oladi; bunda keyingi aminokislota asosiy zanjirda Boc tomonidan bloklangan aminokislotaga ega va agar quyidagi aminokislota bir yoki bir nechta yon zanjir funktsional guruhlariga ega bo'lsa, u holda yon zanjirning funktsional guruhlari himoyaga muhtoj emas yoki yon zanjir funktsional guruhlari mos ravishda Boc va Fmoc himoyasini olib tashlash uchun ishlatiladigan kislota yoki gidroksidi reagentlarga chidamli himoya guruhlariga ega bo'lishi;
(d) bloklangan keyingi qo'shilish mahsulotidan Bocni himoya qilish, bu bloklangan keyingi qo'shilish mahsulotini blokirovka qilingan keyingi qo'shilish mahsulotini olish uchun kislota bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi;
(e) ixtiyoriy ravishda (c) va (d) bosqichlarni takrorlash va har bir tsiklda (X+1)-chi keyingi qo'shimchaning bo'shatilgan mahsuloti hosil bo'ladi, bu erda X - tsiklning zarur takrorlanishi soni;
(e) keyingi aminokislotani (b) bosqichning birinchi qo'shilgan mahsulotiga yoki ixtiyoriy ravishda (e) bosqichdan chiqarilgan (X+1) keyingi qo'shilgan mahsulotga qo'shimcha aminokislota qo'shish, bu keyingi aminokislota bilan yuqorida ko'rsatilgan aminokislota bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi. birinchi qo'shilgan mahsulot yoki bloklangan (himoyalangan) keyingi qo'shilish mahsulotini ishlab chiqarish uchun peptidni uzaytirish uchun reagentni o'z ichiga olgan organik erituvchida yuqorida ko'rsatilgan bloklanmagan (X+1)- keyingi qo'shilish mahsuloti, bunda keyingi aminokislota Fmoc-bloklangan magistralga ega. aminokislota, agar keyingi aminokislota yon zanjirda bir yoki bir nechta funktsional guruhlarga ega bo'lsa, u holda yon zanjirdagi funktsional guruhlar himoyaga muhtoj bo'lmasa yoki yon zanjirdagi funktsional guruhlarga chidamli himoya guruhlari mavjud bo'lsa. Fmocni himoya qilish uchun ishlatiladigan gidroksidi reagentlar;
(g) blokirovka qilingan keyingi qo'shilish mahsulotidan Fmocni himoya qilish, bu bloklangan keyingi qo'shilish mahsulotini blokirovka qilingan keyingi qo'shilish mahsulotini olish uchun asosiy yoki ikkilamchi amin bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi;
(h) ixtiyoriy ravishda, (e) va (g) bosqichlarini takrorlash va har bir tsiklda (X+1)-chi keyingi qo'shimchaning bloklangan mahsuloti hosil bo'ladi, bu erda X - tsiklning kerakli takrorlanish soni, oxirgidan oldingi peptid va blokirovka qilingan aminokislota tarkibiga kiradi;
(i) keyingi (X+1)-chi qo‘shilishning bloklangan mahsulotiga N-terminal aminokislota qo‘shish, bu N-terminal aminokislota bilan keyingi qo‘shilishning bloklangan mahsuloti (X+1) bilan reaksiyaga kirishishni o‘z ichiga oladi. peptid kengaytirish reagentini o'z ichiga olgan organik erituvchida, N-terminal aminokislota Boc yoki Fmoc tomonidan bloklangan magistral aminokislotaga ega bo'lgan bloklangan yakuniy mahsulotni ishlab chiqaradi;
(j) qatronda tugallangan peptid mahsulotini hosil qilish uchun qopqoqli adduktorni Boc holatida kislota yoki Fmoc holatida asos bilan himoya qilish;
(j) agar tugallangan peptid qatroni mahsuloti yon zanjirli funktsional guruhlarni o'z ichiga olgan bo'lsa, ixtiyoriy ravishda, tugallangan peptid qatroni mahsulotining yon zanjiri funktsional guruhlarini himoyadan chiqarish, shu jumladan tugallangan peptid qatroni mahsulotini to'liq peptid qatronini olish uchun mos himoyasiz reagentlar bilan reaksiyaga kirishish. himoyalangan qatronlar ustidagi peptid mahsuloti; Va
(k) qatronli peptid mahsuloti yoki himoyalanmagan qatron bilan tugallangan peptid mahsulotini ammiak, birlamchi amin yoki himoyalangan peptid mahsuloti bilan reaksiyaga kiritishni o‘z ichiga olgan peptid ishlab chiqarish uchun peptidni tayyor qatronli peptid mahsuloti yoki himoyalanmagan qatronli to‘ldirilgan peptid mahsuloti ichidagi qattiq qatron tayanchidan ajratish. peptidning qatrondan ajralishi sezilarli darajada tugaguniga qadar ikkilamchi amin;
peptid sintezidagi (e) va (g) bosqichlari kamida bir marta bajarilishi sharti bilan.
Ushbu ixtiroga muvofiq usul afzal ko'riladi, bunda (l) bosqichdagi ammiak, birlamchi amin yoki ikkilamchi amin tarkibida spirt va ixtiyoriy ravishda aprotik qutbli erituvchi bo'lgan erituvchida bo'ladi.
Ushbu ixtiroga muvofiq usul afzalroqdir, bunda (k) bosqich keyingi bosqichlarni o'z ichiga oladi:
erituvchidan ajratilgan peptidning cho'kishi;
qattiq qatron tayanchini va cho'kma peptidni filtrlash yo'li bilan ajratish; va
peptidni kislotali eritma bilan ajratib olish, peptidni ajratish.
Birinchi aminokislota Boc-L-Thr bo'lgan ushbu ixtiroga muvofiq usul afzalroqdir.
Mavjud topilmaning usuli afzal ko'riladi, unda birinchi aminokislota Boc-L-Thr ning seziy tuzi bo'lib, birinchi qo'shilgan mahsulot sifatida Boc-L-Thr qatronini beradi va himoyalanmagan birinchi qo'shilgan mahsulot H-L-Thr qatroni hisoblanadi. .
Mavjud ixtiroga muvofiq usul afzal ko'riladi, unda (i) bosqichda Boc himoya guruhini olib tashlash uchun ishlatiladigan kislota trifluoroasetik kislota (TFA).
Oldingi usul bilan bog'liq bo'lgan afzal usul organik erituvchi metilenxlorid, xloroform yoki dimetilformamid va peptid kengaytiruvchi reagent diizopropil karbodiimid, disikloheksil karbodiimid yoki N-etil-N"-(3-dimetil-) bo'lgan usuldir. ) karbodiimid.
Oldingi usul bilan bog'liq afzal qilingan usul bu H-L-Thr-qatron formulasining himoyalangan birinchi qo'shilish mahsuloti hosil bo'lgandan keyin (e) va (g) bosqichlarini olti marta bajarishni o'z ichiga olgan usul, bu erda keyingi aminokislotalar tartibda qo'shildi: Fmoc-L-Cys (Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys (Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr (O-t-Bu) va Fmoc-L- Cys(Acm) H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-qatron hosil qilish uchun.
Darhol oldingi usul bilan bog'liq afzal usul H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys( ga Boc-D--Nal qo'shilishi bilan bog'liq usuldir. Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Act)-Thr qatronini olish uchun (c) bosqichga muvofiq Acm) -Tnr qatroni.
Oldingi usul bilan bog'liq afzal qilingan usul bir vaqtning o'zida D--Nalni himoya qiluvchi Boc guruhini, Tyrni himoya qiluvchi O-t-Bu guruhini va Boc-D-Nal-Cys(Acm) da Lysni himoya qiluvchi Boc guruhini bir vaqtning o'zida olib tashlashni o'z ichiga oladi. )-Tyr( O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr qatroni (i) bosqichga muvofiq, H-D- -Nal formulali qatron bo'yicha to'liq peptid mahsulotini olish uchun. -Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-qatron.
Oldingi usul bilan bog'liq afzal qilingan usul H-D-ni bajarish orqali qattiq qatrondan H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptidini olib tashlashni o'z ichiga oladi. Nal-Cys reaksiyasi (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-qatronlar ammiak bilan alkogol va ixtiyoriy ravishda aprotik qutbli erituvchi bo'lgan erituvchida, H-D- ni olish uchun deyarli to'liq bartaraf etilgunga qadar. -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-NH 2.
Oldingi usul bilan bog'liq bo'lgan afzal qilingan usul bu usul bo'lib, unda spirt metanol va qutbli aprotik erituvchi dimetilformamiddir.
Oldingi usulning afzal qilingan usuli bir vaqtning o'zida cys-himoya qiluvchi Acm guruhlarini olib tashlash va natijada himoyalangan Cys qoldiqlarini H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- formulasining peptid mahsulotiga aylanishini o'z ichiga oladi. Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 ni H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 ni yod eritmasi bilan reaksiyaga kiritish orqali. H-D--Nal--Thr-NH 2 ni olish uchun deyarli to'liq himoyalanish va siklizatsiyaga qadar spirt.
Oldingi usul bilan bog'liq bo'lgan afzal qilingan usul peptid H-D--Nal--Thr-NH2 bo'lgan usuldir.
Oldingi usul bilan bog'liq afzal qilingan usul peptid somatostatin analogi bo'lgan usuldir.
Ushbu ixtiro tavsifida ishlatiladigan atamalar quyidagicha ta'riflangan:
"birinchi aminokislota": asosiy zanjirdagi (yon zanjirda bo'lmagan) aminokislotalar Boc tomonidan himoyalangan har qanday aminokislotalarni o'z ichiga oladi, u bozorda mavjud yoki oddiy tajribaga ega bo'lgan biriga ma'lum bo'lgan usullarga muvofiq sintezlanishi mumkin. san'at, masalan, Boc-L-Thr;
"birinchi qo'shilgan mahsulot": qattiq qatron tayanchiga birinchi aminokislota qo'shilishi natijasida hosil bo'lgan qattiq qatron tayanchiga biriktirilgan mahsulotni tavsiflaydi, masalan, Boc-L-Thr-qatron;
"himoyadan chiqarilgan birinchi qo'shilgan mahsulot": birinchi qo'shilgan mahsulotdan Boc guruhini olib tashlash yoki olib tashlash natijasida hosil bo'lgan mahsulotni tavsiflaydi - masalan, H-L-Thr qatroni, bu erda "H" himoyani bekor qilish bosqichidan kelib chiqadigan mavjud aminokislota vodorodini ifodalaydi. ;
"keyingi aminokislota": asosiy zanjirdagi aminokislota Boc yoki Fmoc bilan himoyalangan har qanday aminokislotalarni tavsiflaydi, ular tijoratda mavjud yoki ushbu sohada oddiy tajribaga ega bo'lgan biriga ma'lum bo'lgan usullarga muvofiq sintezlanishi mumkin. (c) bosqich va (e) bosqich bir necha marta bajariladigan takroriy siklning bir qismi bo'lishi mumkinligi sababli, har safar (c) bosqich yoki (e) bosqich bajarilganda, "keyingi aminokislota" mustaqil ravishda tanlanishi mumkin. asosiy zanjirdagi aminokislotalar Boc yoki Fmoc bilan himoyalangan ma'lum yoki mumkin bo'lgan sintez qilingan aminokislotalar guruhidan;
"(X+1)-keyingi qo'shilish bloklangan mahsulot": keyingi aminokislota bilan "bloklanmagan keyingi qo'shilgan mahsulot" birikmasidan kelib chiqadigan qattiq qo'llab-quvvatlovchi qatronga biriktirilgan mahsulotni tavsiflaydi. (c) va (d) bosqichlari va (e) va (g) bosqichlar qo'shimcha aminokislotalar qo'shilishi mumkin bo'lgan takroriy tsiklning bir qismi bo'lishi mumkinligi sababli, "keyingi qo'shilishning (X+1) bloklangan mahsuloti" atamasi oldingi qo'shilish davrlarining har biri natijasida olingan mahsulotga;
“Keyingi (X+1)-chi qo‘shimchaning bloklanmagan mahsuloti”: “Keyingi (X+1)-chi qo‘shimchaning bloklangan mahsuloti”dan Fmoc guruhini olib tashlash natijasida hosil bo‘lgan mahsulotni tavsiflaydi;
"qatrondagi tugallangan peptid mahsuloti": N-terminal aminokislota peptid zanjiriga biriktirilgandan so'ng va N-terminal aminokislotalarning magistral aminokislotalari himoyalangan yoki himoyalanganidan keyin qattiq qatron tayanchiga biriktirilgan peptid mahsulotini tavsiflaydi. , lekin N-terminal aminokislotalarning asosiy zanjiridan himoya guruhini olib tashlaydigan reaktsiya bilan olib tashlanmagan yon zanjirlarning funktsional guruhlarida hali ham himoya guruhlari mavjud; Va
"Himoyasiz qatronda tugallangan peptid mahsuloti": barcha aminokislotalar yon zanjiri funktsional guruhlari olib tashlangan yoki himoyalanmagan qattiq qatron tayanchiga biriktirilgan peptid mahsulotini tavsiflaydi.
Bocni himoya qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan kislotalarga misollar trifluoroasetik kislota (TFA), metansülfonik kislota va HCl ni o'z ichiga olgan organik eritmalardir.
4-(aminometil)piperidin, piperidin, dietilamin, DBU va tris(2-aminoetil)amin Fmocni himoya qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan birlamchi va ikkilamchi aminlarga misol bo'ladi.
Erkin bo'lgan aminokislotalarning TFA tuzlarini (RNH 3 + CF 3 COO -) neytrallash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan nukleofil bo'lmagan asoslarga misollar, bu tuzlar keyingi aminokislotalar qo'shilishidan oldin yoki qo'shilishi paytida "erkin" aminlarga (NH 2) aylantirilishi kerak. kislota, aks holda qo'shilish sodir bo'lmaydi) diizopropiletilamin (DIEA) va trietilamin (TEA).
Aminokislota qo'shilishi reaktsiyalarida ishlatilishi mumkin bo'lgan organik erituvchilarga misollar: metilenxlorid, xloroform, dikloroetan, dimetilformamid, dietilasetamid, tetrahidrofuran, etil asetat, 1-metil-2-pirolidon, asetonitril yoki ularning kombinatsiyasi.
Peptid kengaytirish agentlariga misollar orasida almashtirilgan karbodiimidlar kiradi: diizopropil-karbodiimid, disikloheksil-karbodiimid yoki N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid.
Peptid amid bog'ining hosil bo'lishida ishtirok etadigan karboksil guruhlari va aminokislotalar mos ravishda karboksil guruhi yoki "yon bo'lmagan zanjir" amino guruhi deb ataladi. Boshqa tomondan, peptid amid bog'ini hosil qilishda ishtirok etmaydigan har qanday aminokislota funktsional guruhlari "yon zanjir" funktsional guruhlari deb ataladi.
"Asosiy barqaror guruh" atamasi (1) asosga barqaror bo'lgan, masalan, 4-(aminoetil)piperidin, piperidin yoki tris(2) kabi asoslar bilan olib tashlanishi mumkin bo'lmagan aminokislotalarning funktsional guruhlarini himoya qilish uchun ishlatiladigan himoya guruhlariga ishora qiladi. Fmoc himoya guruhini olib tashlash uchun keng tarqalgan asoslar bo'lgan -aminoetil) amin va (2) trifloroasetik kislota kabi kislota yoki katalitik gidrogenatsiya kabi boshqa usul bilan olib tashlanishi mumkin.
"Fmoc" va "Boc" belgilari bu erda va qo'shilgan formulada mos ravishda 9-fluorenil-metoksikarbonil va tert-butiloksikarbonilni belgilash uchun ishlatiladi.
Yuqorida tavsiflangan usul peptidlarni, afzalroq somatostatin analoglarini, masalan, Lanreotide® oktapeptidni tayyorlashda qo'llanilishi mumkin, bu quyidagi formulaga ega: H-D--Nal--Thr-NH 2. Agar H-D--Nal--Thr-NH 2 sintez qilinadigan bo'lsa, Cys, Lys va Tyr yon zanjiri funktsional guruhlarini himoya qilish uchun ishlatiladigan tayanch-barqaror himoya guruhlari mos ravishda asetamidometil (Acm), Boc va tert-butil bo'lishi mumkin. Cys uchun Acm afzalroqdir.
Somatostatin analogi deganda somatostatinga o'xshash (ya'ni agonist) yoki unga qarama-qarshi (ya'ni antagonist) biologik faollikni namoyon qiluvchi peptid tushuniladi.
H-D- -Nal--Thr-NH 2 formulasida umumiy uch harfli aminokislota belgilarining har biri (masalan, Lys) aminokislotalarning strukturaviy qoldig'iga ishora qiladi. Masalan, yuqoridagi formuladagi Lys belgisi -NH-CH((CH 2) 4 NH 2) -CO-ni bildiradi. D- -Nal- belgisi D-2-naftilalanilil aminokislota qoldig'ini ifodalaydi. Qavslar peptiddagi ikkita Cys qoldig'ining erkin tiollarini bog'laydigan disulfid bog'lanishini ko'rsatadi, bu esa qavslar ichidagi peptidning aminokislotalari tsiklni tashkil qilishini ko'rsatadi.
Bu erda berilgan tavsifga asoslanib, ushbu sohada tajribali kishi ushbu ixtirodan to'liq foydalanishi mumkin.
Agar boshqacha belgilanmagan bo'lsa, bu erda qo'llaniladigan barcha texnik va ilmiy atamalar ushbu ixtiro tegishli bo'lgan san'at bo'yicha oddiy tajribaga ega bo'lganlar tomonidan tushunilgan bir xil ma'noga ega. Bundan tashqari, bu erda keltirilgan barcha nashrlar, patent talabnomalari, patentlar va boshqa ma'lumotnomalar ma'lumotnoma sifatida kiritilgan.
Peptidni ushbu ixtironing usuliga muvofiq quyidagi tartib bo'yicha tayyorlash mumkin.
Seziy karbonatning 0,5 molyar ekvivalentining suvdagi eritmasi asta-sekin 1 molyar ekvivalent Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) eritmasiga qo'shiladi, bu erda AA 1 spirtda erigan C-terminal aminokislotaga to'g'ri keladi, afzal metanol. Olingan aralash xona haroratida taxminan 1 soat davomida aralashtiriladi, so'ngra barcha spirt va barcha suv seziy tuzi Boc-AA 1 quruq kukunini olish uchun pasaytirilgan bosim ostida chiqariladi. Merifild qatroni, 1,0 ekvivalenti (xlormetillangan polistirol, 200-400 mesh, xlor ioni qo'shilishi 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentukki yoki Polimer Laboratories, Church Stretton, Angliya) afzalroq xlorli solvent, DCMmetchlo bilan yuviladi. alkogol, yaxshisi metanol va qutbli aprotik erituvchi, yaxshisi dimetilformamid (DMF). Seziy tuzi Boc-AA 1 kukuni suvsiz (quruq) qutbli aprotik erituvchida, yaxshisi DMFda eritiladi va eritma oldindan yuvilgan qatron bilan birlashtiriladi. Bulyon azot kabi inert atmosferada taxminan 45°-65°C da, yaxshisi 50°-60°C da, taxminan 48 dan 106 soatgacha, yaxshisi 85 dan 90 soatgacha aralashtiriladi. Qatronlar filtrlash orqali ajratiladi va qutbli aprotik erituvchi, yaxshisi DMF, suv va nihoyat MeOH kabi spirt bilan yaxshilab yuviladi. Boc-AA 1 qatroni past bosim ostida quritiladi.
Vos-AA 1 smolasi katta gözenekli eritilgan shishadan yasalgan filtrli tubiga ega shisha reaktorga kiritiladi. Qatronlar DCM kabi xlorli erituvchi bilan yuviladi, organik kislota bilan bloklanadi, tercihen DCMda 25% TFA, DCM kabi xlorli eritma va MeOH kabi spirt bilan qisqa vaqt yuviladi, organik asos bilan neytrallanadi, yaxshisi trietilamin bilan. DCM va DCM va DMF kabi qutbli aprotik erituvchi bilan yana yuvilib, himoyalanmagan AA 1 qatronini hosil qildi.
Kerakli miqdordagi aminokislotalar ixtiyoriy ravishda himoyalangan AA 1 qatroniga qo'shiladi. Agar keyingi aminokislota Fmoc himoyasi bilan -amino guruhiga ega bo'lsa (Fmoc-AA x), u holda yon zanjir guruhi himoyani talab qilmaydi (masalan, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe yoki Fmoc-Thr) yoki yon zanjir taglikka chidamli guruh bilan himoya qiladi. Fmoc-AA x ning molyar ortiqligi (bu erda x peptiddagi aminokislotalarning joylashuvi soni, C-terminusdan o'lchanadi) diizopropilkarbodiimid (DIC) kabi peptid kengaytiruvchi reagent yordamida himoyalangan AA 1 qatroniga taxminan 60 daqiqa davomida ulanadi. ), DCM/DMF aralashmasida. Fmoc-AA x -AA 1 qatronini olish uchun qo'shilgan qatron DMF, spirt va DCM bilan yuviladi. Qo'shimchani Kayzer ningidrin usuli yordamida tekshirish mumkin. Keyin Fmoc-AA x -AA 1 qatroni bir marta DMF bilan yuviladi va keyin AA x -AA 1 qatronini olish uchun DMFdagi piperidin kabi organik erituvchidagi asos eritmasi bilan bloklanadi. Keyin AA x -AA 1 qatroni DMF bilan yuviladi, keyin MeOH va DCM kabi spirtli ichimliklar bilan bir necha marta yuviladi. Keyin AA x -AA 1 qatroni DMF bilan bir marta taxminan 3 daqiqa davomida, uch marta izopropanol bilan, yaxshisi har safar taxminan 2 daqiqa davomida va uch marta DCM bilan, yaxshisi har safar taxminan 2 daqiqa davomida yuviladi. Keyin qatron yuqorida tavsiflanganidek Fmoc bilan himoyalangan aminokislota yoki quyida tavsiflanganidek Boc bilan himoyalangan aminokislotalarni keyingi biriktirishga tayyor bo'ladi.
Xuddi shunday, agar himoyalanmagan AA 1-qatroniga biriktiriladigan har qanday keyingi aminokislota himoyalangan Boc-amino guruhiga (Boc-AA x) ega bo'lishi uchun tanlangan bo'lsa, u holda yon zanjir guruhi himoyaga muhtoj emas (bu Boc- bo'lishi mumkin). Gly, Boc-Ala, Boc-Phe yoki Boc-Thr) yoki yon zanjir kislota va asos tomonidan olib tashlanishiga chidamli bo'lgan guruh tomonidan himoyalangan bo'lishi kerak - bu Boc-Cys (Acm) bo'lishi mumkin. Agar Boc-AA x tanlansa, u Fmoc-aminokislotalar uchun yuqorida ko'rsatilgan holatda bo'lgani kabi bir xil reaktivlar va erituvchilar yordamida qo'shiladi va qo'shilishning to'liqligi (tugalligi) Kayzer ningidrin usuli bilan tekshirilishi mumkin. Keyin Boc-AA x -AA 1 qatroni CF 3 CO - H + -AA x -AA 1 qatronini ishlab chiqarish uchun DCMdagi TFA kabi organik erituvchidagi kislota eritmasi bilan himoyadan chiqariladi. Keyin bu qatron DCM kabi xlorli erituvchilar, MeOH kabi spirt bilan bir necha marta yuviladi va DCMdagi trietilamin kabi nukleofil bo'lmagan asos bilan neytrallanadi, so'ngra DCM kabi xlorli erituvchi bilan yana bir necha marta yuviladi, natijada AA x hosil bo'ladi. -AA 1 - qatron Keyin qatron yuqorida aytib o'tilganidek, Boc yoki Fmoc bilan himoyalangan aminokislotalarni qo'shimcha biriktirishga tayyor.
Kerakli peptidlar ketma-ketligiga va ishlatiladigan a-aminokislotalarning turiga (Fmoc himoyalangan yoki Boc himoyalangan) qarab, qaysi aminokislota egallashiga qarab, yuqorida tavsiflangan ulanish protseduralarining mos kombinatsiyasi qo'llaniladi. peptidlar ketma-ketligidagi yon zanjirning pozitsiyasi , himoya guruhiga ega bo'lib, uni asos bilan olib tashlash mumkin, Fmocni -amino guruhidan olib tashlash uchun zarur bo'lgan yoki Bocni -amino guruhidan olib tashlash uchun zarur bo'lgan kislota bilan. Bunday himoyalangan aminokislota N- -Boc-N"- -Fmoc-lizin yoki N- -Fmoc-N"- -Boc-lizin bo'lishi mumkin. Agar shunday bo'lsa, keyingi aminokislotalarning a-aminokislotalari uchun tanlangan barcha himoya guruhlari, N-terminal aminokislotagacha, ushbu pozitsiya uchun tanlangan himoya guruhiga mos kelishi kerak. Bu shuni anglatadiki, yon zanjirni himoya qiluvchi guruhlar keyingi aminokislotalarning a-amino guruhlarini himoya qilish uchun ishlatiladigan himoya qiluvchi vositaga chidamli bo'lishi kerak. N-terminal aminokislota uchun Boc yoki Fmoc-aminokislotalarni himoya qilish sifatida ishlatilishi mumkin, chunki N-terminal aminokislotalarni himoya qilish bir vaqtning o'zida peptid sintezi strategiyasiga kiruvchi ta'sir ko'rsatmasdan himoyalangan ba'zi yon zanjirlarni himoya qilishi mumkin. qolgan aminokislotalar qo'shiladi.
Hali ham qatronga biriktirilgan tugallangan peptid zanjiri himoyasini olib tashlash va bo'shatish kerak. Barcha asosga barqaror himoya guruhlari va N-terminal aminokislotalarni blokirovka qiluvchi guruhni olib tashlash uchun, agar mavjud bo'lsa, qatrondagi peptid DCMdagi TFA kabi organik erituvchidagi kislota bilan ishlanadi. Barcha kislota-barqaror himoya guruhlari va N-terminal aminokislotalarni blokirovka qiluvchi guruhni olib tashlash uchun, agar mavjud bo'lsa, qatrondagi peptid DMFdagi piperidin kabi organik asos bilan ishlov beriladi. Shu bilan bir qatorda, kislota-barqaror guruhlar peptidning ammiak yoki amin asosi bilan keyingi parchalanishi bilan olib tashlanmaguncha saqlanishi mumkin. So'ngra qatrondagi himoyalanmagan peptid DCM kabi xlorli erituvchi, MeOH kabi spirt bilan yuviladi va past bosim ostida doimiy og'irlikda quritiladi.
Peptid qatrondan ajraladi va peptidni qatronda 3:1 MeOH/DMF aralashmasida to'xtatib, C-terminal amidga aylanadi. Suspenziya azotli atmosferada taxminan 10 ° C dan past haroratgacha sovutiladi va suvsiz ammiak gazi eritma bilan to'yingangacha erituvchi yuzasiga kiritiladi, bunda harorat taxminan 10 ° C dan past bo'ladi. Harorat taxminan 20 ° C gacha ko'tarilishi uchun atala taxminan 24 soat davomida muloyimlik bilan aralashtiriladi. Reaksiyaning tugallanish darajasi HPLCda metil efir oraliq mahsulotining peptid turiga qarab mos sharoitlarda yo'qolishi bilan tekshiriladi. Reaksiya aralashmasi sovutiladi va suvsiz ammiakning kerakli miqdori metil efirga to'g'ri keladigan HPLC tepalik maydoni kerakli mahsulotning eng yuqori maydonining 10% dan kam bo'lgunga qadar qo'shiladi. Bulyon taxminan 10°C dan past haroratgacha sovutiladi va peptidni cho'ktirish uchun kechasi davomida aralashtirish davom ettiriladi. Cho'kma va smola filtrlash yo'li bilan ajratiladi va sovuq MeOH bilan yuviladi. Cho'kma va smola pasaytirilgan bosim ostida quritiladi va mahsulot sirka kislotasining suvli eritmasi bilan qatrondan olinadi.
Agar peptid o'z ketma-ketligida himoyalangan Cys qoldiqlarini o'z ichiga olsa, tiol guruhlari himoyasini olib tashlash va qoldiqlarni quyidagi protsedura bo'yicha tsiklga aylantirish mumkin. Acm bilan himoyalangan Cys guruhlarini o'z ichiga olgan peptid azotli atmosferada sirka kislotasining suvli eritmasida eritiladi. Eritma tezda aralashtiriladi va bir qismga yodning spirtdagi eritmasi qo'shiladi. Aralash aralashtiriladi va HPLC yordamida himoyalanishning to'liqligi tekshiriladi. Keyin reaksiya 2% li natriy tiosulfat eritmasi bilan eritma rangi yo‘qolguncha titrlab to‘xtatiladi. Xom aralashma 0,1 ammoniy asetat buferidagi atsetonitril gradienti bo'lgan C8 kartrijda preparativ xromatografiya bilan tozalanadi, C8 kartrijda 0,25 N sirka kislotasida atsetonitril gradienti bilan tuzsizlanadi va maqsadli peptidni olish uchun liofilizatsiya qilinadi.
Ixtironi amalga oshirishga misol
Quyidagi misol ushbu ixtironing usulini ko'rsatish uchun berilgan va uning doirasini cheklovchi sifatida talqin qilinmasligi kerak.
1-misol. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2
A) Boc-L-Thr-qatron
2,5 ml suvdagi 2,58 g seziy karbonat eritmasi 7 ml metanolda eritilgan 3,48 g Boc-L-treonin (Bachem California, Torrance, Calif.) eritmasiga asta-sekin qo'shildi. Olingan aralash xona haroratida taxminan 1 soat davomida aralashtiriladi, keyin barcha metanol va barcha suv quruq Boc-L-treonin sezyum tuzi kukunini olish uchun past bosim ostida olib tashlandi. 10 g Merifild qatroni (xlorometillangan polistirol, 200-400 mesh, xlor qo'shilishi 1,3 mEq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentukki) diklorometan (DCM), metanol (MeOH) va dimetilformamid (DM2 marta) bilan yuvilgan. ml). Seziy tuzi Boc-L-treonin kukuni 60 ml quruq DMFda eritildi va eritma yuqoridagi kabi yuvilgan qatron bilan birlashtirildi. Bulyon azotli atmosferada taxminan 85-90 soat davomida taxminan 50-60 ° C haroratda muloyimlik bilan aralashtiriladi. Qatronlar filtrlash orqali ajratildi va DMF, deionizatsiyalangan suv va nihoyat MeOH bilan yaxshilab yuvildi. Boc-treonin qatroni past bosim ostida taxminan 40 ° C da quritilgan. Treonin qo'shilishi 0,85 ± 0,15 meq / g quruq qatron edi.
B) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-qatron
(A) bosqichdan 2,0 g Boc-treonin qatroni katta gözenekli eritilgan shisha filtrli pastki (yuk 1,74 mmol) bo'lgan 50 ml shisha reaktorga qo'shildi. Qatronlar DCM (20 ml) bilan 2 marta yuvildi, har safar taxminan 5 daqiqa davomida, DCM (30 ml) da 25% TFA bilan blokirovka qilindi - birinchi marta taxminan 2 daqiqa va ikkinchi marta taxminan 25 daqiqa davomida yuvildi. DCM (20 ml), izopropanol (20 ml) va DCM (20 ml) bilan taxminan 2 daqiqa davomida, DCM (20 ml) dagi 10% trietilamin bilan ikki marta taxminan 5 daqiqa davomida neytrallanadi, DCM bilan taxminan 2 daqiqa davomida 3 marta yuviladi. va bir marta DMF (20 ml) taxminan 5 daqiqa davomida yuviladi.
Bloklangan qatronga 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-sistein (Acm) (Bachem, CA) va 683 mkl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) diizopropil-karbodiimid (DIC) 14 ga qo'shildi. ml 2:1 nisbatda DCM/DMF aralashmasidan taxminan 1 soat davomida. Ulanishdan keyin qatron 1 marta taxminan 3 daqiqa davomida DMF (20 ml), 3 marta taxminan 2 daqiqa davomida izopropanol va 3 marta taxminan yuvilgan. 2 daqiqa DXM (20 ml). Bog'lanish Kayzer nigidrin usuli bilan sinovdan o'tkazildi.
Qo'shilgandan so'ng, qatron bir marta DMF bilan yuvilgan va keyin DMFdagi piperidin eritmasi bilan blokirovka qilingan. Keyin qo'shilgan blokirovka qilingan qatron DMF va bir vaqtning o'zida MeOH va DCM bilan bir necha marta yuvildi. Qo'shilgan qatron 1 marta taxminan 3 daqiqa davomida DMF (20 ml), 3 marta taxminan 2 daqiqa davomida izopropanol (20 ml) va 3 marta DCM (20 ml) bilan har safar taxminan 2 daqiqa davomida yuvilgan. Bog'lanish Kayzer ningidrin usuli bilan sinovdan o'tkazildi.
Quyidagi himoyalangan aminokislotalarning har biri DMF/DCM da DIC yordamida yuvilgan qatronga birlashtirildi va yuqorida tavsiflanganidek quyidagi ketma-ketlikda himoyadan chiqarildi: Fmoc-L-valin, Fmoc-L-lizin (Boc), Fmoc-D-triptofan, Fmoc-L-tirozin (O-t-Bu) va Fmoc-L-sistein (Acm) (barchasi Bachem Kaliforniyadan), Boc-D-2-naftilalanin (Synthech, Albany, OR).
Tugallangan peptid zanjiri blokirovka qilingan va ikki marta 75:20:5 DCM/TFA/anizol (30 ml) bilan taxminan 2 daqiqa va taxminan 25 daqiqa davomida himoyalanmagan, har safar taxminan 2 daqiqa davomida DCM (20 ml), izopropanol bilan 3 marta yuvilgan. (10 ml) va DCM (20 ml), DCM (20 ml) da 10% trietilamin bilan taxminan 5 daqiqa davomida 2 marta neytrallanadi va DCM (20 ml) va MeOH (20 ml) bilan taxminan 2 daqiqa davomida 3 marta yuviladi. Qatronlar past bosim ostida quritilgan. Quruq og'irligi 3,91 g (nazariy hosilning 103%).
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2
(B) bosqichdan (1,3 mmol-ekv) 2,93 g peptid yuklangan qatron 50 ml 3:1 MeOH/DMF aralashmasida to'xtatildi. Suspenziya azotli atmosferada taxminan 10 ° C dan past haroratgacha sovutilgan va eritma u bilan to'yingangacha quruq ammiak gazidan tozalangan, harorat esa taxminan 10 ° C dan past bo'lgan. Bulamaz taxminan 24 soat davomida sekin aralashtiriladi va harorat taxminan 20 ° C ga ko'tariladi. Reaksiyaning tugallanganlik darajasi HPLC (VYDAC® sorbent, don hajmi 5 mkm, g'ovak o'lchami 100 A, C18, izokratik sharoitda 26% CH 3 CN 0,1% TFAda elutsiya) yordamida metil efir oraliq mahsulotining yo'qolishi bilan tekshirildi. tezlik 1 ml / min, 220 mm da qayd; bu sharoitda Rt kechikish vaqti metil efir uchun ~ 14 min va amid mahsuloti uchun ~ 9,3 min). Reaksiya aralashmasi sovutildi va ortiqcha suvsiz ammiak metil esteriga to'g'ri keladigan HPLC tepalik maydoni kerakli mahsulotning eng yuqori maydonining 10% dan kam bo'lguncha qo'shildi. Atlama taxminan 10 ° C dan past haroratgacha sovutildi va peptidni cho'ktirish uchun bir kechada aralashtirish davom ettirildi. Cho'kma va qatron filtrlash yo'li bilan ajratildi va 15 ml sovuq MeOH bilan yuvildi. Cho'kma va qatronlar past bosim ostida quritilgan va mahsulot sirka kislotasining 50% suvli eritmasi (30 ml dan 3 porsiya) bilan qatrondan olingan. HPLC tahlili aralashmada 870 mg (0,70 mmol) nom mahsulot mavjudligini ko'rsatdi (izokratik HPLC tizimida 96% tozalik).
D) H-D- -Nal--Thr-NH 2
(B) bosqichdagi 500 mg (0,40 mmol) peptid 300 ml 4% sirka kislotasida eritildi va azotli atmosfera ostida taxminan 55 ° C gacha qizdirildi. Eritma tezda aralashtiriladi va bir qismga 7,7 ml MeOH (0,60 mmol) dagi 2% og'irlikdagi yod eritmasi qo'shiladi. Aralash taxminan 15 daqiqa davomida aralashtiriladi, so'ngra rang yo'qolguncha (~ 2 ml) 2% natriy tiosulfat eritmasi bilan titrlash orqali reaktsiya to'xtatiladi. Aralash xona haroratiga qadar sovutiladi va filtrlanadi. Aralash 0,1 M ammoniy asetatdagi asetonitril gradienti bilan C8 ustunida (YMC, Inc., Wilmington, NC) preparativ xromatografiya bilan tozalandi, C8 YMC ustunida 0,25 N sirka kislotasida asetonitril gradienti bilan tuzsizlandi va 99% tozalik bilan 350 mg maqsadli peptidni berish uchun liyofillangan.
Yuqoridagi tavsifga asoslanib, ushbu sohada malakali kishi ushbu ixtironing muhim xususiyatlarini osongina aniqlashi va uning ruhi va ko'lamidan chetga chiqmasdan, uni turli xil ilovalar va sharoitlarga moslashtirish uchun ixtiroga turli xil o'zgartirishlar va modifikatsiyalarni kiritishi mumkin. Shunday qilib, ixtironing boshqa tartibga solishlari ham talablar bilan qamrab olingan.
TALAB
1. H-D- -Nal--Thr-NH 2 formulali peptidni tayyorlash usuli, bunda ko'rsatilgan usul quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:
(a) "birinchi qo'shilgan mahsulot" hosil qilish uchun ester bog'i orqali birinchi aminokislotani qattiq qo'llab-quvvatlovchi qatronga biriktirish, bu (i) seziy karbonatning suvdagi eritmasi bilan birinchi aminokislotalarning spirtli eritmasi bilan reaksiyaga kirishish Birinchi aminokislotaning seziy tuzi, (ii) erituvchisiz birinchi aminokislota seziy tuzini olish, (iii) qattiq qatron tayanchini suvsiz qutbli aprotik erituvchida birinchi amino kislotaning seziy tuzi bilan reaksiyaga kirishishi. "birinchi qo'shimcha mahsulot",
bunda birinchi aminokislota Boc-L-Thr bo'lib, u peptidning C-terminal aminokislotasiga mos keladi va qattiq qo'llab-quvvatlovchi qatron xlorometillangan polistirol qatroni;
(b) birinchi qo'shilgan mahsulotdan Boc ni kislota bilan himoya qilishdan "himoyasiz birinchi qo'shilgan mahsulot" hosil qilish;
(c) ixtiyoriy ravishda, "bo'shatilgan birinchi qo'shilgan mahsulot"ga "keyingi aminokislota" qo'shiladi, bu "keyingi aminokislota" bilan "bo'shatilgan birinchi qo'shilgan mahsulot" bilan organik erituvchida peptid kengaytiruvchi reagent ishlab chiqarishni o'z ichiga oladi. "keyingi qo'shimchaning bloklangan mahsuloti", bunda "keyingi aminokislota" asosiy zanjirda Boc bilan qoplangan aminokislotaga ega va agar bu "keyingi aminokislota" yon zanjirda bir yoki bir nechta funktsional guruhlarga ega bo'lsa, u holda funktsional yon zanjirdagi guruhlar himoya qilishni talab qilmaydi yoki yon zanjirdagi ushbu funktsional guruhlar himoyadan chiqarish uchun ishlatiladigan kislotali yoki ishqoriy reagentlarga barqaror bo'lgan himoya guruhlariga ega, mos ravishda Boc va Fmoc;
(d) "bloklangan keyingi qo'shilish mahsuloti"ning Boc himoyasini olib tashlash, bu "bloklangan keyingi qo'shilish mahsuloti"ni kislota bilan reaksiyaga kirishib, "blokirovka qilingan keyingi qo'shilish mahsulotini" ishlab chiqarishni o'z ichiga oladi;
(e) ixtiyoriy ravishda (c) va (d) bosqichlarini takrorlash, har bir tsikl "keyingi qo'shimchaning (X+1) bloklanmagan mahsulotini" hosil qiladi, bu erda X tsikllarning kerakli takrorlanish sonini bildiradi;
(f) (b)-bosqichdagi “birinchi qo‘shilgan blokirovka qilingan mahsulot”ga “keyingi aminokislota”ni yoki ixtiyoriy ravishda (e) bosqichdagi “(X+1)-chi keyingi qo‘shilgan blokirovka qilingan mahsulot”ga qo‘shish. "Keyingi aminokislota" reaktsiyasini yuqorida aytilgan "birinchi qo'shilgan bloklanmagan mahsulot" bilan yoki "(X+1) keyingi qo'shilgan bloklanmagan mahsulot" bilan "keyingi qo'shilgan bloklangan mahsulot" hosil qilish uchun peptid kengaytiruvchi reagentni o'z ichiga olgan organik erituvchida, bunda "keyingi aminokislota" Fmoc bilan qoplangan asosiy zanjirli aminokislotalarga ega bo'ladi, agar bu "keyingi aminokislota" bir yoki bir nechta yon zanjir funktsional guruhlariga ega bo'lsa, u holda yon zanjirning funktsional guruhlari himoya qilishni yoki yon zanjirning funktsional guruhlarini talab qilmaydi. guruhlarda Fmocni himoya qilish uchun ishlatiladigan gidroksidi reagentlarga chidamli himoya guruhlari mavjud;
(g) "bloklangan keyingi qo'shimcha" Fmoc himoyasini bekor qilish, bu "bloklangan keyingi qo'shimchani" asosiy yoki ikkilamchi amin bilan reaksiyaga kirishib, "blokirovka qilingan keyingi qo'shimcha" hosil qilish;
(h) ixtiyoriy ravishda (e) va (g) bosqichlarni takrorlash, har bir tsikl “keyingi qo‘shilishning (X+1) bloklanmagan mahsulotini” hosil qiladi, bunda X tsiklga kiritilgunga qadar tsiklning kerakli takrorlanish sonidir. peptid va oxirgidan oldingi aminokislota chiqariladi;
(i) N-terminal aminokislotani "(X+1)-chi bog'lanishning ajratilgan mahsulotiga" qo'shish, bu N-terminal aminokislota bilan "(X+1)-chi bog'lanishning chiqarilgan mahsuloti bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi. "Bloklangan qo'shilish mahsulotini" ishlab chiqarish uchun peptid kengaytiruvchi reagentni o'z ichiga olgan organik erituvchiga ulanish" bunda "N-terminal aminokislota" Boc yoki Fmoc tomonidan bloklangan magistral aminokislotaga ega;
(j) Qopqoqli biriktiruvchi mahsulot Boc yoki Fmocni himoyadan chiqarish, yopilgan ulash mahsulotini Boc holatida kislota yoki Fmoc holatida asos bilan reaksiyaga kirishib, qatronda qopqoqli peptid mahsulotini hosil qilish;
(k) agar "tugallangan peptid qatroni mahsuloti" yon zanjir funktsional guruhlarini o'z ichiga olgan bo'lsa, ixtiyoriy ravishda, "tugallangan peptid qatroni mahsuloti" ning yon zanjiri funktsional guruhlarini himoyadan chiqarish, bu "tugallangan peptid qatroni mahsuloti" ni tegishli himoya reagentlari bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi. "himoyasiz qatronda to'liq peptid mahsulotini" ishlab chiqarish; Va
(k) peptidni ishlab chiqarish uchun "tugallangan peptid qatroni mahsuloti" yoki "tugallangan peptid mahsuloti qatroni" dagi qattiq qatron tayanchidan peptidni ajratish, bu "qatrondagi tugallangan peptid mahsuloti" yoki "tugallangan peptid mahsuloti" bilan reaksiyaga kirishishni o'z ichiga oladi. qatronda.” peptid qatrondan sezilarli darajada tozalanmaguncha ammiak, birlamchi amin yoki ikkilamchi amin bilan himoyalangan qatron;
peptid sintezidagi (e) va (g) bosqichlari H-L-Thr-qatron formulasining "bloklangan birinchi qo'shilish mahsuloti" hosil bo'lgandan keyin olti marta amalga oshirilsa, bu erda keyingi aminokislotalar qo'shiladi. tartib: Fmoc-L-Cys (Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys (Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr (O-t-Bu) va Fmoc-L-Cys (Acm) ) H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-qatron hosil qilish.
2. 1-bandga muvofiq usul bo'lib, unda (k) bosqichdagi ammiak, birlamchi amin yoki ikkilamchi amin spirt va ixtiyoriy ravishda aprotik qutbli erituvchini o'z ichiga olgan erituvchida bo'ladi.
3. 1-bandga muvofiq usul, bunda (k) bosqich keyingi bosqichlarni o'z ichiga oladi:
(i) erituvchidan ajratilgan peptidning cho'kishi;
(ii) qattiq qatron tayanchini va cho'kma peptidni filtrlash yo'li bilan ajratish; va
(iii) peptidni ajratib olish uchun kislotali eritma bilan peptidni ekstraktsiya qilish.
4. 1-3-bandlarning birortasiga muvofiq usul bo'lib, unda birinchi aminokislota Boc-L-Thr seziy tuzi bo'lib, birinchi qo'shilgan mahsulot sifatida Boc-L-Thr qatronini beradi va "blokirovka qilingan birinchi qo'shimcha" mahsulot” H-L-Thr -qatron hisoblanadi.
5. 4-bandga muvofiq usul bo'lib, unda Boc himoya guruhini bosqich(lar)da olib tashlash uchun ishlatiladigan kislota trifloroatsetik kislotadir (TFA).
6. 5-bandga muvofiq usul, bunda organik erituvchi metilenxlorid, xloroform yoki dimetilformamid va peptidni oshirish uchun reagent diizopropil-karbodiimid, disikloheksil-karbodiimid yoki N-etil-N"-(3-dimetil-aminrop) bo'ladi. ) karbodiimid.
7. 6-bandga muvofiq usul, jumladan H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-ga Boc-D- -Nal qo'shilishi. Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr qatronini olish uchun (i) bosqichga muvofiq Thr-qatron.
8. 7-bandga muvofiq usul, shu jumladan D--Nal blokirovka qiluvchi Boc guruhini, Tyrni himoya qiluvchi O-t-Bu guruhini va Boc-D--Nal-Cys(Acm)-dagi Lysni himoya qiluvchi Boc guruhini bir vaqtda olib tashlash. Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-qatron, H-D- -Nal-Cys formulali qatron bo'yicha to'liq peptid mahsulotini olish uchun bosqich(lar)ga muvofiq. (Acm) -Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-qatron.
9. 8-bandga muvofiq usul, jumladan H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptidini reaksiyani amalga oshirish orqali qattiq qatrondan ajratish. H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-qatronlar tarkibida alkogol va ixtiyoriy ravishda aprotik qutbli erituvchi bo'lgan erituvchida ammiak bilan, sezilarli darajada to'liq yo'q qilinmaguncha. H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-NH 2.
10. 9-bandga muvofiq usul, bunda spirt metanol va qutbli aprotik erituvchi dimetilformamiddir.
11. 10-bandga muvofiq usul, shu jumladan Cys ni himoya qiluvchi Acm guruhlarini bir vaqtning o'zida olib tashlash va natijada himoyalanmagan Cys qoldiqlarini H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr formulali "to'liq peptid qatroni mahsuloti"da siklizatsiya qilish. -D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 bilan reaksiyaga kirishib. yodning spirtdagi eritmasi H-D--Nal--Thr-NH 2 ni berish uchun sezilarli darajada to'liq himoyalanish va siklizatsiyaga qadar.
Peptidlarning qattiq fazali sintezi Rokfeller universitetidan R. B. Merrifild tomonidan taklif qilingan (1984 yil Nobel mukofoti). Bu usul himoyalangan a-amino va yon guruhlarga ega bo'lgan aminokislotalar qoldiqlarini ketma-ket qo'shish orqali peptidni erimaydigan polimer tayanchiga yig'ishga asoslangan. Rejaga ko'ra, peptid zanjirini bosqichma-bosqich yig'ish, zanjir bir uchida sintez paytida mustahkam tayanchga biriktirilgan. Natijada, oraliq mahsulotlarni va maqsadli peptid hosilalarini izolyatsiya qilish va tozalash oddiygina eritmada qolgan barcha ortiqcha reagentlar va yon mahsulotlarni olib tashlash uchun qattiq polimerni filtrlash va yaxshilab yuvish edi.
Qattiq faza atamasi ko'proq tashuvchidagi moddaning fizik xususiyatlarini anglatadi, chunki polimer tashuvchisidagi kimyoviy reaktsiya bir fazada - eritmada sodir bo'ladi. Tegishli erituvchida polimer shishadi, past viskoziteli, lekin yuqori strukturali jelga aylanadi (o'zaro bog'langan polimerlar) yoki eriydi (o'zaro bog'liq bo'lmagan polimerlar holatida) va sintez jarayoni ultramikrogeterogen darajada sodir bo'ladi. , deyarli bir hil tizimda.
Qattiq fazali organik sintez polimer asosini - qatronni talab qiladi. S, unga bog‘lovchi biriktirilgan L. Birinchi bosqichda bog'lovchiga substrat molekulasi biriktirilgan A.Molekula A immobilizatsiya qiladi (ya'ni harakatchan bo'lishni to'xtatadi), lekin boshqa reagent bilan reaksiyaga kirishish qobiliyatini saqlab qoladi. IN(2-bosqich).
Mahsulot AB qatronda qoladi, bu esa uni ortiqcha reagentdan ajratish imkonini beradi IN(va yon mahsulotlar) oddiy yuvish orqali. (Siz asl substratni ketma-ket murakkablashtirib, ko'proq va ko'proq yangi reagentlarni qo'shishingiz mumkin A, asosiysi, bog'lovchi bu reaktsiyalarda o'zgarishsiz qoladi). Ikki funktsiyali bog'lovchi L uning qatronlar bilan aloqasi shunday tanlanadi S substratga qaraganda ancha bardoshli edi A. Keyin oxirgi bosqichda maqsadli birikma AB uning bog‘lovchi bilan bog‘lanishini uzib, qatrondan ajratish mumkin. Aloqa borligi aniq L-AB yumshoq sharoitda ulanishning o'ziga zarar bermasdan bo'linishi kerak (bog'lanish A-IN), na bog'lovchining qatron bilan aloqasi (bog' L-S).
Shunday qilib, ideal holda, har bir qadamdan keyin qatronni yuvish va tashuvchi bilan bog'lanishni ajratish orqali sof modda olinadi. Ko'p hollarda reagentlarning ko'p miqdorda ishlatilishi va keyinchalik qatrondan ajralishi ko'p hollarda kimyoviy muvozanatni maqsadli mahsulot hosil bo'lishiga qarab siljish va sintez vaqtini qisqartirish imkonini beradi, deb ishonish tabiiydir. Qattiq fazali organik sintezning kamchiliklari orasida juda katta ortiqcha (2-30 ekvivalent) reagentlardan foydalanish zarurati, oraliq sintez mahsulotlarini aniqlashdagi qiyinchiliklar, shuningdek modifikatsiyalangan polimer tayanchlarining nisbatan yuqori narxi kiradi. bog'lovchining narxi.
Merrifild tomonidan organik sintez amaliyotiga kiritilgan xlorometillangan polistirol (oz miqdorda divinilbenzol bilan o'zaro bog'langan), Merrifild qatroni deb ataladigan polimer tashuvchilarning eng qulayidir.
Qattiq fazali peptid sintezining metodologiyasi va asosiy bosqichlari
Belgilangan vazifa almashtirish uchun faollashtirilgan geterotsikl bilan reaksiyaga payvandlangan aminokislota bilan polimer tashuvchini kiritishni talab qiladi. Keling, polimer tayanchlarda immobilizatsiyalangan aminokislotalarni olishning metodologik jihatini batafsil ko'rib chiqaylik.
Bosqich1. N-himoyalangan aminokislotalarni polimer tashuvchida immobilizatsiya qilish.
Bizning sxemamizning birinchi bosqichi aminokislotalarni polimer tashuvchiga immobilizatsiya qilishdir. Oligopeptidlarning shakllanishi kabi yon jarayonlardan qochish uchun aminokislota oldindan himoyalangan. Odatda, N-himoyalangan aminokislotalar ishlatiladi va natijada aminokislota va tashuvchi o'rtasidagi bog'lanish amid yoki ester turiga kiradi.
Qattiq fazali organik sintezda eng ko'p ishlatiladigan aminokislotalar himoyasi karbamat tipidagi himoya guruhlari, tert-butoksikarbonil (Boc) va 9H-fluorenilmetoksikarbonil himoyasi (Fmoc), X himoyalangan guruhdir:
Shuni ta'kidlash kerakki, himoya guruhini tanlash ishlatiladigan polimer qo'llab-quvvatlash turiga qarab belgilanadi. Har xil turdagi polimer tashuvchilar uchun himoyalangan aminokislotalarni immobilizatsiya qilish shartlari har xil. Boc-aminokislotalarni xlormetillangan polistirol bo'lgan Merrifild qatroniga immobilizatsiya qilish amalga oshiriladi. joyida seziy tuzlari shaklida dimetil ftalat (DMF) va kaliy yodidning katalitik miqdoridagi seziy karbonat suspenziyasini qo'shib. Reagentlarning tashuvchining miqdoriga nisbatan ortiqcha miqdori har bir holatda alohida tanlanadi va 1,5-4 ekvivalentni tashkil qiladi.
Fmoc aminokislotalarini Vang polimer tayanchiga (X=O) immobilizatsiya qilish, benzil tipidagi ester bog'lovchisini hosil qilish uchun 4-(dimetilamino)piridin (DMAP) ishtirokida diizopropilkarbodiimid (DIC) yordamida karbodiimid usuli bilan amalga oshiriladi. katalizator. Sterik to'siqsiz aminokislotalar bilan immobilizatsiya reaktsiyasi xona haroratida sodir bo'ladi. Sterilizatsiyalangan aminokislotalarni immobilizatsiya qilish uchun 40-60 °C haroratda 2 kun davomida reaksiya va takroriy immobilizatsiya kerak (1-sxema).Fmoc ning immobilizatsiyasi. - aminokislotalarning Rink polimer tashuvchisiga (X=NH) o‘tishi bilan benzigidril tipidagi amid bog‘lovchi hosil bo‘lishi Kastro reaktivi (1H-1,2,3-benzotriazol-1-iloksi) ishtirokida amalga oshiriladi. tris-(dimetilamino)fosfoniy geksaftorofosfat (BOP), diizopropiletilamin asosi (DIEA) va 1-gidroksibenzotriazol (HOBt), katalizator sifatida. Reaktsiya xona haroratida sterik to'sqinliksiz aminokislotalar uchun 2 soat, sterik to'sqinliksiz aminokislotalar uchun 4-6 soat davom etadi.
2-bosqich.Polimer tashuvchida himoyalangan aminokislotalarni himoya qilish
Ikkinchi bosqichda biz rejalashtirmoqdamiz (himoyalangan aminokislota immobilizatsiyasidan so'ng), aminokislotalarni faollashtirish uchun himoya guruhini olib tashlash kerak. Boc va Fmoc himoyasini olib tashlash usullari boshqacha. Merrifild qatronida aminokislotalarning Boc himoyasini olib tashlash yarim soat davomida diklorometandagi 50% trifluoroasetik kislota bilan amalga oshiriladi, bu sharoitda Merrifild bog'lovchisi buzilmagan holda qoladi.
Himoyadan olib tashlangandan so'ng, qatron trifluoroasetik kislotani olib tashlash uchun trietilamin eritmasi bilan yuviladi. Vang (X=O) va Rink (X=NH) tashuvchilarda aminokislotalarning Fmoc himoyasini olib tashlash DMFdagi piperidinning 20% li eritmasi bilan 40-50 daqiqa davomida amalga oshiriladi.
Fmoc himoyasi olib tashlanganidan keyin qatronlar massasining sezilarli darajada pasayishi qattiq fazali sintezning birinchi bosqichida himoyalangan aminokislotalarning immobilizatsiya darajasini gravimetrik aniqlash uchun asos bo'lib xizmat qilishi mumkin. Qatronlar dimetilftalatdagi piperidin eritmasi bilan ketma-ket ishlov berish tavsiya etiladi - avval 5-10 daqiqa, keyin 30 daqiqa davomida yangi eritmada. Himoyani olib tashlaganingizdan so'ng, Fmoc himoyasini yo'q qilish mahsulotlarini olib tashlash uchun qatron kamida 4 marta dimetil ftalat bilan yuviladi. Qo'llab-quvvatlashda asillanish reaktsiyasining borishini kuzatish yoki aminokislotadan himoya funktsiyasini olib tashlash Kaiser testi yordamida mumkin.
3-bosqich.Tashuvchida immobilizatsiyalangan aminokislota ishtirokidagi geterosikllarda nukleofil almashtirish
Amaliy amalga oshirish uchun biz rejalashtirgan keyingi qadam aromatik nukleofil almashtirish reaktsiyasini amalga oshirishdir; Payvandlangan aminokislota nukleofil bo'lib xizmat qiladi va faollashtirilgan geterotsikl eritmada bo'ladi. Tayanchlardagi nukleofil almashinish reaksiyalarining aksariyati suyuq fazadagi reaksiyalardan bajarilishida farq qilmaydi. Shu bilan birga, jarayonning harorati 120 ° C dan oshmasligi kerakligini yodda tutish kerak, undan yuqorida tashuvchining polistirol bazasi yomonlasha boshlaydi. Tayanchda amalga oshirilgan reaktsiya sharoitida bog'lovchi ham saqlanishi kerak.
Tegishli faollashtirilgan geterotsiklik substratlarni tanlashda, geterotsiklda qoldiradigan guruhning tabiatini hisobga olish kerak.
4-bosqich.Polimer tashuvchilardan maqsadli birikmani olib tashlash
Qattiq fazali organik sintezdagi ko'pchilik bog'lovchilar kislotali muhitda parchalanadi. Merrifild qatronidan Vang va Rink qatroniga o'tishda bog'lovchilarning kislotaga chidamliligi keskin kamayadi. Rink bog'lovchisi Vang bog'lovchisiga (50% CF3COOH) nisbatan yumshoqroq sharoitlarda (10-20% CF3COOH) parchalanadi.Merrifild qatroni bunday sharoitda passiv bo'lib, uning parchalanishi uchun NaOMe/MeOH eritmasida transesterifikatsiya qo'llaniladi, bu esa: kislota esterining hosil bo'lishi.
Yana bir bor eslatib o'tamizki, bog'lovchining tabiati substratdan chiqarilgan hosil bo'lgan molekulada terminal funktsiyasining turini belgilaydi. Vang smolasi kislotalarni, Rink smolasi esa amidlarni hosil qiladi.
Qattiq fazali peptid sintezining ushbu sxemasining afzalliklari:
1. Turli ota-ona birikmalari alohida granulalar bilan bog'lanishi mumkin. Keyin bu boncuklar aralashtiriladi, shunda barcha boshlang'ich birikmalar bitta tajribada reagent bilan reaksiyaga kirishishi mumkin. Natijada, individual granulalarda reaktsiya mahsulotlari hosil bo'ladi. Ko'pgina hollarda, an'anaviy suyuq kimyoda boshlang'ich materiallarni aralashtirish odatda muvaffaqiyatsizlikka olib keladi - mahsulotlarning polimerizatsiyasi yoki rezinizatsiyasi. Qattiq substratlardagi tajribalar bu ta'sirlarni istisno qiladi.
2. Boshlang'ich materiallar va mahsulotlar qattiq tayanchga bog'langanligi sababli, ortiqcha reaktivlar va qo'llab-quvvatlanmaydigan mahsulotlar polimer qattiq tayanchdan osongina yuvilishi mumkin.
3. Reaksiyani yakunlash uchun (99% dan ortiq) katta miqdorda reagentlardan foydalanish mumkin, chunki bu ortiqcha moddalar osongina ajratiladi.
4. Kam yuklash hajmlari (bir gramm substrat uchun 0,8 mmol dan kam) yordamida kiruvchi nojo'ya reaktsiyalarni bartaraf etish mumkin.
5. Reaksiya aralashmasidagi oraliq mahsulotlar granulalar bilan bog'lanadi va ularni tozalash kerak emas.
6. Tajriba oxirida alohida polimer granulalarini ajratish mumkin va shu bilan alohida mahsulotlar olinadi.
7. Polimer taglik sindirish sharoitlari tanlangan va tegishli ankraj guruhlari - bog'lovchilar tanlangan hollarda qayta tiklanishi mumkin.
8. Qattiq fazali sintezni avtomatlashtirish mumkin.
Qattiq fazali sintezni amalga oshirish uchun zarur shartlar, reaktsiya sharoitida inert bo'lgan erimaydigan polimer tayanchining mavjudligiga qo'shimcha ravishda:
Ankraj yoki bog'lovchining mavjudligi substratning qo'llaniladigan birikma bilan bog'lanishini ta'minlaydigan kimyoviy funktsiyadir. U qatron bilan kovalent bog'langan bo'lishi kerak. Substratlarning u bilan o'zaro ta'sir qilishi uchun ankraj ham reaktiv funktsional guruh bo'lishi kerak.
Substrat va bog'lovchi o'rtasida hosil bo'lgan bog'lanish reaksiya sharoitida barqaror bo'lishi kerak.
Mahsulot yoki oraliq mahsulotning bog'lovchi bilan bog'lanishini buzish usullari bo'lishi kerak.
