Oqsillarni past molekulyar aralashmalardan ajratish
Membranli elak usuli (dializ)
Polimer bo'lgan va ma'lum hajmdagi teshiklarga ega bo'lgan dializ membranasi ishlatiladi. Kichik molekulalar (past molekulyar aralashmalar) membranadagi teshiklardan o'tadi, katta molekulalar (oqsillar) esa saqlanib qoladi. Shunday qilib, oqsillar kirlardan yuviladi.
Oqsillarni molekulyar og'irlik bo'yicha ajratish
Jel xromatografiyasi
Xromatografik ustun ma'lum o'lchamdagi teshiklarga ega bo'lgan gel granulalari (Sephadex) bilan to'ldirilgan. Ustunga oqsillar aralashmasi qo'shiladi. Kattaligi Sephadex g'ovaklarining o'lchamidan kichikroq bo'lgan oqsillar ustunda saqlanadi, chunki ular teshiklarda "yopishib qoladi", qolganlari esa ustunni erkin tark etadi. Proteinning kattaligi uning molekulyar og'irligiga bog'liq.
Ultratsentrifugalash
Bu usul turli zichlik gradientlari (saxaroza buferi yoki seziy xlorid) bo'lgan eritmalarda oqsil molekulalarining cho'kishi (cho'kishi)ning turli tezligiga asoslangan.
elektroforez
Bu usul zaryadga qarab elektr maydonida oqsillar va peptidlarning turli ko'chish tezligiga asoslangan.
Jellar, tsellyuloza asetat, agar elektroforez uchun tashuvchi sifatida xizmat qilishi mumkin. Ajraladigan molekulalar hajmiga qarab jelda harakatlanadi: katta bo'lganlar jelning teshiklaridan o'tayotganda ushlab turiladi. Kichikroq molekulalar kamroq qarshilikka duch keladi va shuning uchun tezroq harakat qiladi. Natijada, elektroforezdan keyin katta molekulalar kichikroqlarga qaraganda boshlang'ichga yaqinroq bo'ladi.
Proteinlarni elektroforez yordamida molekulyar og'irligi bo'yicha ajratish mumkin. Buning uchun natriy dodesil sulfat (DDS-Na) ishtirokida PAAGda elektroforez qo'llaniladi.
SDS-Na amfifil modda bo'lib, zaryadlangan va hidrofobik guruhni o'z ichiga oladi. Proteinlar o'zlarining hidrofobik radikallari bilan SDS-Na bilan bog'lanadi va jarayonda denatüratsiyalanadi. Shunday qilib, oqsillar shakli va zaryadiga mos keladi. Shundan so'ng, elektroforez paytida oqsilning harakatchanligi faqat uning molekulyar og'irligiga bog'liq.
tuzlash: gidroksidi, gidroksidi tuproqli metallar (natriy xlorid, magniy sulfat), ammoniy sulfat tuzlari bilan cho'kish; shu bilan birga, oqsilning birlamchi tuzilishi buzilmaydi;
yog'ingarchilik: suvsizlantiruvchi vositalardan foydalanish: past haroratlarda (taxminan -20 ° C) alkogol yoki aseton.
Ushbu usullardan foydalanganda oqsillar hidratsiya qobig'ini yo'qotadi va eritmada cho'kadi.
Denaturatsiya- oqsillarning fazoviy tuzilishining buzilishi (molekulaning birlamchi tuzilishi saqlanib qoladi). U qayta tiklanadigan (oqsil strukturasi denaturatsiya qiluvchi moddani olib tashlangandan keyin tiklanadi) yoki qaytarilmas (molekulaning fazoviy tuzilishi tiklanmaydi, masalan, oqsillar konsentrlangan mineral kislotalar, og'ir metallarning tuzlari bilan cho'ktirilsa).
Proteinlarni ajratish usullari Oqsillarni past molekulyar aralashmalardan ajratish
Dializ
Muayyan o'lchamdagi teshiklarga ega bo'lgan maxsus polimer membranasi ishlatiladi. Kichik molekulalar (past molekulyar aralashmalar) membranadagi teshiklardan o'tadi, katta molekulalar (oqsillar) esa saqlanib qoladi. Shunday qilib, oqsillar kirlardan yuviladi.
Oqsillarni molekulyar og'irlik bo'yicha ajratish
Jel xromatografiyasi
Xromatografik ustun ma'lum o'lchamdagi teshiklarga ega bo'lgan gel granulalari (Sephadex) bilan to'ldirilgan. Ustunga oqsillar aralashmasi qo'shiladi. Hajmi Sephadex g'ovaklarining o'lchamidan kichikroq bo'lgan oqsillar ustunda saqlanadi, chunki ular teshiklarda "yopishib qoladi", qolganlari esa ustunni erkin tark etadi (2.1-rasm). Proteinning kattaligi uning molekulyar og'irligiga bog'liq.
Guruch. 2.1. Oqsillarni jel filtrlash orqali ajratish
Ultratsentrifugalash
Bu usul zichligi turlicha gradientli eritmalarda (saxaroza buferi yoki seziy xlorid) oqsil molekulalarining turlicha cho‘ktirish (cho‘ktirish) tezligiga asoslangan (2.2-rasm).
Guruch. 2.2. Ultratsentrifugalash orqali oqsillarni ajratish
elektroforez
Bu usul zaryadga qarab elektr maydonida oqsillar va peptidlarning turli ko'chish tezligiga asoslangan.
Jellar, tsellyuloza asetat, agar elektroforez uchun tashuvchi sifatida xizmat qilishi mumkin. Ajraladigan molekulalar hajmiga qarab jelda harakatlanadi: kattaroq bo'lganlar jelning teshiklaridan o'tayotganda ushlab turiladi. Kichikroq molekulalar kamroq qarshilikka duch keladi va shuning uchun tezroq harakat qiladi. Natijada, elektroforezdan so'ng, kattaroq molekulalar kichikroqlarga qaraganda boshlang'ichga yaqinroq bo'ladi (2.3-rasm).
Guruch. 2.3. Oqsillarni gel elektroforez bilan ajratish
Proteinlarni molekulyar og'irligi bo'yicha elektroforez bilan ham ajratish mumkin. Ushbu foydalanish uchun natriy dodesil sulfat (SDS-Na) ishtirokida PAAGda elektroforez.
Individual oqsillarni izolyatsiya qilish
Yaqinlik xromatografiyasi
Usul oqsillarning turli molekulalar bilan kovalent bo'lmagan bog'lanishlar bilan kuchli bog'lanish qobiliyatiga asoslangan. Fermentlarni, immunoglobulinlarni, retseptor oqsillarini ajratish va tozalash uchun ishlatiladi.
Ba'zi oqsillar maxsus bog'langan moddalar molekulalari (ligandlar) inert moddaning zarralari bilan kovalent tarzda birlashadi. Proteinlar aralashmasi ustunga qo'shiladi va kerakli protein ligandga mahkam bog'lanadi. Qolgan oqsillar ustundan erkin chiqib ketadi. Keyin ushlab turilgan oqsilni ustundan erkin ligandni o'z ichiga olgan bufer bilan yuvish mumkin. Bu juda sezgir usul yuzlab boshqa oqsillarni o'z ichiga olgan hujayra ekstraktidan juda oz miqdorda sof oqsilni ajratib olish imkonini beradi.
Izoelektrik fokuslash
Usul oqsillarning turli xil IEP qiymatlariga asoslangan. Proteinlar amfolinli plastinkada elektroforez bilan ajratiladi (bu 3 dan 10 gacha bo'lgan oraliqda oldindan hosil bo'lgan pH gradientiga ega bo'lgan moddadir). Elektroforez jarayonida oqsillar IEP qiymatiga ko'ra ajratiladi (IEPda oqsilning zaryadi nolga teng bo'ladi va u elektr maydonida harakat qilmaydi).
2D elektroforez
Bu SDS-Na bilan izoelektrik fokuslash va elektroforezning kombinatsiyasi. Birinchidan, elektroforez amfolinli plastinkada gorizontal yo'nalishda amalga oshiriladi. Proteinlar zaryadga (CEP) qarab ajratiladi. Keyin plastinka SDS-Na eritmasi bilan ishlanadi va vertikal yo'nalishda elektroforez amalga oshiriladi. Proteinlar molekulyar og'irligiga qarab tasniflanadi.
Immunoelektroforez (Western blot)
Namunadagi maxsus oqsillarni aniqlash uchun ishlatiladigan analitik usul (2.4-rasm).
Biologik materialdan oqsillarni ajratib olish.
SDS-Na bilan PAAGda elektroforez orqali oqsillarni molekulyar og'irlik bo'yicha ajratish.
Keyingi ishni osonlashtirish uchun oqsillarni jeldan polimer plastinkasiga o'tkazish.
Qolgan teshiklarni to'ldirish uchun plastinkani o'ziga xos bo'lmagan oqsil eritmasi bilan davolash.
Shunday qilib, ushbu bosqichdan so'ng, teshiklari ajratilgan oqsillarni o'z ichiga olgan plastinka olindi va ular orasidagi bo'shliq nonspesifik oqsil bilan to'ldiriladi. Endi biz izlayotgan oqsillar orasida qandaydir kasallik uchun javobgar ekanligini aniqlashimiz kerak. Aniqlash uchun antikorlarni davolash qo'llaniladi. Birlamchi antikorlar ostida kerakli proteinga antikorlar tushuniladi. Ikkilamchi antikorlar deganda birlamchi antikorlarga antikorlar tushuniladi. Ikkilamchi antikorlar tarkibiga qo'shimcha maxsus yorliq (molekulyar prob deb ataladi) qo'shiladi, natijada natijalarni keyinroq ko'rish mumkin. Yorliq sifatida radioaktiv fosfat yoki ikkilamchi antikor bilan mahkam bog'langan ferment ishlatiladi. Avval birlamchi, keyin esa ikkilamchi antikorlarga bog'lash ikkita maqsadga ega: usulni standartlashtirish va natijalarni yaxshilash.
Birlamchi antikorlar eritmasi bilan ishlov berish bog'lanish antijen (kerakli oqsil) mavjud bo'lgan plastinka o'rnida sodir bo'ladi.
Bog'lanmagan antikorlarni olib tashlash (yuvish).
Keyingi rivojlanish uchun etiketli ikkilamchi antikorlarning eritmasi bilan davolash.
Bog'lanmagan ikkilamchi antikorlarni olib tashlash (yuvish).
Guruch. 2.4. Immunoelektroforez (Western blot)
Biologik materialda kerakli oqsil mavjud bo'lsa, plastinkada bu oqsilning tegishli antikorlar bilan bog'lanishini ko'rsatadigan tarmoqli paydo bo'ladi.
Fizik-kimyoviy xossalari, kimyoviy tarkibi va tuzilishini o'rganish faqat tozalangan oqsil preparatini o'rganishda mumkin. Alohida oqsillarni ajratish va fraksiyalash uchun tuzlash, organik erituvchilar bilan cho'ktirish, gel filtrlash, elektroforez, ion almashinish xromatografiyasi va yaqinlik xromatografiyasi qo'llaniladi.
Proteinlarni tuzlash oqsil eruvchanligining muhit xususiyatlariga bog'liqligiga asoslanadi. Distillangan suvda oqsillar kuchsiz tuz eritmalariga qaraganda yomonroq eriydi, chunki ionlarning past konsentratsiyasi ularning hidratsion qobiqlarini saqlaydi. Ammo yuqori tuz konsentratsiyasida oqsil molekulalari hidratsion qobiqlarini, agregatlarini yo'qotadi va cho'kma hosil bo'ladi. Tuzni olib tashlangandan so'ng, oqsillar o'zlarining tabiiy xususiyatlarini va konformatsiyasini saqlab, yana eritmaga o'tadi.
Turli xil tuz konsentrasiyalarida va o'rta pH darajasida eruvchanlikning o'zgarishi alohida oqsillarni ajratish uchun ishlatiladi. Ko'pincha oqsillarni tuzlash uchun turli konsentratsiyali ammoniy sulfat eritmalari ishlatiladi.
Proteinlarni denaturatsiyasiz eritmadan cho'ktirish dehidrogenlashtiruvchi moddalar - organik erituvchilar (etanol, aseton) yordamida amalga oshiriladi.
Jel filtrlash U oqsillarni molekula hajmi va shakliga ko'ra bo'linishga asoslangan. Ajratish ma'lum bir pH qiymatiga ega bufer eritmasida g'ovakli gel granulalari (Sephadex, agaroz) bilan to'ldirilgan xromatografik ustunlarda amalga oshiriladi. Jel granulalari ma'lum o'rtacha diametrga ega bo'lgan ichki kanallar (poralar) tufayli oqsillarni o'tkazuvchan bo'lib, ularning o'lchamlari jel turiga bog'liq (Sephadex G-25, G-200 va boshqalar). Proteinlar aralashmasi ustunga kiritiladi va keyin ma'lum bir pH qiymatiga ega bo'lgan bufer eritmasi bilan yuviladi (elyutlanadi). Katta oqsil molekulalari gelning teshiklariga kirmaydi va erituvchi bilan birga yuqori tezlikda harakatlanadi. Past molekulyar og'irlikdagi nopoklik (tuz) yoki boshqa oqsilning kichik molekulalari jel granulalari tomonidan saqlanadi va kolonnadan sekinroq yuviladi (1.29-rasm). Ustunning chiqishida eritma (eluat) alohida fraktsiyalar sifatida yig'iladi.
Guruch. 1.29. Oqsillarni jel filtrlash orqali ajratish
elektroforez zaryadlangan oqsil molekulalarining elektr maydonida umumiy zaryadiga mutanosib tezlikda harakat qilish xususiyatiga asoslanadi. Berilgan pHda umumiy manfiy zaryadga ega bo'lgan oqsillar anodga, musbat zaryad esa katodga qarab harakatlanadi. Elektroforez turli muhitlarda amalga oshiriladi: qog'oz, kraxmal jeli, poliakrilamid jeli va boshqalar Harakat tezligi oqsil molekulalarining zaryadiga, massasiga va shakliga bog'liq. Elektroforez tugagandan so'ng, tashuvchidagi oqsil zonalari maxsus bo'yoqlar bilan bo'yalgan (1.30-rasm, A).
Jeldagi elektroforezning ruxsati qog'ozga qaraganda yuqori, shuning uchun qon zardobidagi oqsillarni elektroforeza qilishda qog'ozda 5 ta fraksiya (albuminlar, a 1 -, a 2 -, b-, g-globulinlar) ajratiladi va 18 tagacha. poliakrilamid jelidagi fraktsiyalar (1.30-rasm, B).
Guruch. 1.30. Sog'lom odamning qon zardobidagi oqsillarining elektroferogrammasi
A- qog'ozda qon zardobidagi oqsillarni elektroferogrammasi;
B- turli fraktsiyalarning plazma oqsillari miqdori.
I - g-globulinlar; II - b-globulinlar; III - a 2 - globulinlar;
IV - a 1 - globulinlar; V - albuminlar
Ion almashinish xromatografiyasi umumiy zaryadda farq qiluvchi oqsillarni ajratishga asoslangan. Ma'lum bir pH qiymatiga ega bo'lgan oqsil eritmasi qattiq g'ovakli sorbent bilan to'ldirilgan xromatografik kolonka orqali o'tkaziladi, oqsillarning bir qismi elektrostatik o'zaro ta'sir natijasida saqlanib qoladi. Sorbent sifatida ion almashtirgichlar qo'llaniladi: kislotali oqsillarni ajratish uchun anion almashinuvchilar (katyonik guruhlarni o'z ichiga olgan); asosiy oqsillarni ajratish uchun kation almashinuvchilari (anionik guruhlarni o'z ichiga olgan).
Protein kolonna orqali o'tkazilganda, uning ion almashinuvchi bilan bog'lanish kuchi sorbent zaryadiga qarama-qarshi bo'lgan zaryadning kattaligiga bog'liq. Ion almashinadigan sorbentga adsorbsiyalangan oqsillar turli xil tuz konsentrasiyalari va pH ga ega bufer eritmalar bilan elutsiya qilinadi, turli oqsil fraksiyalari olinadi.
Yaqinlik xromatografiyasi qattiq tayanchga biriktirilgan ligand bilan oqsil bog'lanishining o'ziga xosligiga asoslanadi. Ligandlar sifatida ferment substratlari, holoproteinlarning prostetik guruhlari, antigenlar va boshqalar ishlatiladi. Kolonka orqali oqsillar aralashmasi o'tkazilganda ligandga faqat to'ldiruvchi oqsil biriktiriladi (1.31-rasm, A), qolganlarning hammasi eritma bilan chiqadi. Adsorbsiyalangan oqsil boshqa pH qiymatiga ega bo'lgan eritma bilan tozalanadi (1.31-rasm, B). Bu usul juda o'ziga xosdir va yuqori darajada tozalangan protein preparatlarini olish imkonini beradi.
Proteinni ajratish va tozalash odatda turli usullar yordamida bir necha bosqichda amalga oshiriladi. Bosqichlar ketma-ketligi empirik tarzda tanlanadi va turli oqsillar uchun farq qilishi mumkin. Proteinni yuqori darajada tozalash ularni dori sifatida (insulin gormoni va boshqalar) qo'llashda ham, to'qimalar, qon, tupurik va boshqalarning oqsil tarkibini o'zgartirish orqali turli kasalliklarni tashxislashda juda muhimdir.
Voyaga etgan odamning turli organlari hujayralaridagi oqsillar to'plami individualdir va hayot davomida nisbatan doimiy bo'lib qoladi. Ixtisoslashgan to'qimalarda qizil qon tanachalarida gemoglobin, mushaklarda aktin va miozin, retinada rodopsin va suyak va biriktiruvchi to'qimalarda turli xil kollagen kabi maxsus oqsillar bo'lishi mumkin. Ba'zi oqsillar ko'p to'qimalarda mavjud, ammo har xil miqdorda. Tanlangan kompozitsiya o'zgaradi
Guruch. 1.31. Oqsillarni yaqinlik xromatografiyasi bilan ajratish
A- ajratilgan oqsilning neytral tashuvchiga biriktirilgan o'ziga xos ligand bilan bog'lanishi; B- individual oqsil eritmasini olish
to'qimalar va qon oqsillari mumkin va birinchi navbatda insonning dietasi, oziq-ovqat tarkibi va jismoniy faoliyati bilan bog'liq.
Kasalliklarda qon va to'qima hujayralarining oqsil tarkibi sezilarli darajada o'zgarishi mumkin, ko'pincha oqsil etishmovchiligi yoki uning faolligining pasayishi rivojlanadi - proteinopatiya. Shuning uchun qon va to'qimalarning oqsil tarkibidagi aniq o'zgarishlarni aniqlash klinik sinovlarda turli kasalliklarga tashxis qo'yish uchun ishlatiladi.
Protein aralashmasi biologik materialdan olingandan so'ng, u alohida oqsil fraktsiyalariga bo'linadi. Oqsillarning turli fizik-kimyoviy xossalari asosida oqsillarni fraksiyalashning bir qancha usullari ishlab chiqilgan.
– izoelektrik nuqtada oqsillarning cho'kishi – usul oqsil molekulasi zaryadini neytrallash hisobiga izoelektrik nuqtada cho‘kma oqsillarning xossasiga asoslangan. Har bir oqsil uchun izoelektrik nuqtaning qiymati qat'iy individualdir, shuning uchun bu usul alohida oqsillarni ajratishi mumkin (usul haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun Biokimyo kursidagi 3-sonli laboratoriya ishiga qarang).
– oqsillarni tuzlash orqali fraksiyalash - molekulyar og'irligiga qarab neytral tuzlarning konsentrlangan eritmalarida oqsillarning turli xil eruvchanligiga asoslanadi (usul bo'yicha batafsil ma'lumot uchun "Biokimyo" kursining 3-sonli laboratoriya ishiga qarang).
– elektroforetik ajratish usuli oqsillarni fraksiyalarga - oqsillarning fizik-kimyoviy xossalari bo'limida tasvirlangan.
Proteinlarni fraksiyalarga ajratishning yuqoridagi usullaridan tashqari, ular keng qo'llaniladi. xromatografik usullar . Ustunli xromatografiya eng ko'p qo'llaniladi.
Ushbu usulning o'ziga xos xususiyati shundaki, turli xil oqsillar va peptidlarning molekulalari aralashmasi qattiq g'ovakli material (matritsa) bo'lgan ustun orqali o'tkaziladi. Matritsa bilan o'zaro ta'sir qilish natijasida turli xil oqsillar ustundan turli xil tezlikda o'tadi. Proteinlar ma'lum ketma-ketlikda ustunning pastki qismiga etib kelganidan so'ng, ular alohida fraktsiyalarda probirkalarda yig'iladi.
Ajratish uchta asosiy tur ustun xromatografiyasi:
– ion almashinuvi - oqsil xromatografiyasi uchun tsellyuloza yoki boshqa hidrofilik polimerlarga asoslangan ion almashtirgichlar, masalan, katyonik guruhlar (salbiy zaryad) yoki tarkibida amin guruhlari (musbat zaryad) bo'lgan karboksimetilselüloza (CM-tsellyuloza) bo'lgan dietilaminoetilselüloza (DEAE-tsellyuloza) ishlatiladi:
Oqsilning DEAE-tsellyuloza bilan bog'lanish kuchi qanchalik yuqori bo'lsa, oqsil molekulasidagi karboksil guruhlari shunchalik ko'p bo'ladi. DEAE-tsellyulozaga adsorbsiyalangan oqsillarni kolonkadan natriy xlorid konsentratsiyasi ortib borayotgan eritmalar bilan yuvish (elyutsiya qilish) mumkin. Birinchidan, zaif bog'langan oqsillar, tuz konsentratsiyasi ortishi bilan, DEAE-tsellyulozaga yaqinligini oshirish uchun boshqa oqsillar elutsiya qilinadi.
KM-tsellyuloza ham xuddi shunday ishlatiladi, ammo oqsillarning unga yaqinligi oqsil molekulasidagi aminokislotalar soniga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir.
Bog'langan oqsilni olib tashlash uchun eluentning pH qiymati ham o'zgartiriladi.
– gel xromatografiyasi - "molekulyar elak usuli" ikkinchi nomiga ega. Elak sifatida Sephadex (epixlorgidrin bilan ishlangan dekstran polisaxarid) ishlatiladi. Sefadeks donalari suvda shishadi va jel hosil qiladi. Shishgan granulalarda ma'lum diametrli teshiklar mavjud.
Ajratish Sephadex donalari (granulalar g'ovaklari) katta molekulyar og'irlikka ega bo'lgan moddalarni o'tkazmaydigan yoki cheklangan darajada o'tkazuvchanligi va kichik molekulalarning donalarning g'ovaklariga erkin diffuziyalanishi (kirishi) bilan asoslanadi.
Shishgan Sefadeksning jelga o'xshash massasi shisha ustunga (naychaga) joylashtiriladi, jel yuzasiga oqsil eritmasi qatlami qo'llaniladi (12-rasm, a) so'ngra bufer eritmasi (elyutuvchi suyuqlik) o'tkaziladi. ustun. Proteinlar granulalar orasidagi ustun bo'ylab sekinroq o'tadi, ularning molekulyar og'irligi shunchalik past bo'ladi, chunki molekulyar og'irligi pastroq bo'lgan oqsil molekulalari granulalarga (g'ovaklarga) osonroq tarqaladi (12-rasm).
Guruch. 12. Jel filtrlash orqali oqsillarni fraksiyalash
Proteinlar kolonnadan molekulyar og'irlikning kamayish tartibida yuviladi (elyusiya qilinadi). Binobarin, birinchi navbatda yirik oqsil molekulalari elutsiya qilinadi (12b-rasm), ular donalarga tarqalmaydi, so'ngra kichik molekulalar va nihoyat, past molekulyar og'irlikdagi aralashmalar.
Bu usul nafaqat oqsillarni molekulyar og'irligi bo'yicha fraktsiyalash, balki ularni past molekulyar og'irlikdagi aralashmalardan tozalash uchun ham qo'llaniladi.
– yaqinlik xromatografiyasi yoki yaqinlik xromatografiyasi. Usulning printsipi shundaki, oqsillarning o'ziga xos moddalar - tashuvchilarga mahkamlangan ligandlar bilan selektiv o'zaro ta'siri mavjud (13-rasm).
Sianogen bromid bilan faollashtirilgan sefaroza tashuvchi sifatida ishlatiladi. Sefarozaga turli xil kelib chiqadigan ligandlar biriktirilgan - substrat yoki antigen yoki retseptor, ular aralashmadan faqat bitta oqsilni bog'laydi:
– substrat → ferment;
– antigen → antikor;
– gormon → bu gormonning retseptorlari.
Ligand bilan bog'lanmagan boshqa oqsillar ustunni yuvish orqali chiqariladi.
Guruch. 13. Yaqinlik xromatografiyasi mexanizmi
Ustunga yaqinlik bilan mustahkamlangan oqsilni olib tashlash bufer eritmasi (eluent) yordamida amalga oshiriladi. Buferga oqsil va ligand o'rtasidagi bog'lanishlarni zaiflashtiradigan detarjan kiritiladi yoki kolonnadan yuqori konsentratsiyali erkin ligandli eritma o'tkaziladi. Bunda oqsil erkin ligand bilan osonroq bog'lanadi va kolonnadan yuviladi (elyusiya qilinadi).
№8 laboratoriya
OQILLARNING ELEKTROFORETIK AYRISHI
Usul oqsil molekulalarining elektr zaryadiga ega ekanligiga asoslanadi, uning kattaligi va belgisi oqsilning aminokislotalar tarkibi, pH va muhitning ion kuchi bilan belgilanadi. Tashqi elektr maydon ta'sirida zaryadlangan molekulalar eritmada qarama-qarshi zaryadlangan qutbga o'tadi. Protein zarrachalarining harakat tezligi ularning zaryadining kattaligiga proportsional va zarrachalarning kattaligiga va ularning hidratsiya darajasiga teskari proportsionaldir.
Hozirgi vaqtda "zonal elektroforez" deb ataladigan narsa keng qo'llaniladi - kerakli pH qiymatiga ega bufer eritmasi bilan singdirilgan qattiq tashuvchida (qog'oz chiziqlar, agar, kraxmal, akrilamidda) elektroforez. Proteinlarning qog'oz yoki jeldagi holati ularni mahkamlash va keyin u yoki bu bo'yoq bilan bo'yash orqali aniqlanadi (odatda bromofenol ko'k, amid qora yoki Coomassie ko'k). Har bir fraksiyadagi oqsil miqdori taxminan bog'langan bo'yoqning rang intensivligi bilan aniqlanishi mumkin. Bunday ta'rif oqsil fraktsiyalarining qat'iy miqdoriy nisbatini bermaydi, chunki turli xil oqsillar bilan bog'langan bo'yoq miqdori bir xil emas.
ELEKTROFOREZ HA Qog'oz
Tahlil qilingan aralashmani ajratish elektroforez qurilmalarida bufer eritmasi bilan singdirilgan ma'lum turdagi xromatografik qog'ozlarda sodir bo'ladi. Proteinlar 500 V gacha kuchlanishda ajratiladi.
Elektroforez kamerasi plexiglass vannadan va unga o'rnatilgan qopqoqdan iborat. (1). Vannada 2 ta elektrod bo'linmasi (2) mavjud bo'lib, ularning har biri uzunlamasına bo'linma bilan ajratilgan. (3) bir-biri bilan aloqa qiladigan ikkita bo'limga. Bo'limlarning ichki bo'linmalari elektrodlarni tushiradi va qog'oz chiziqlarining uchlari tashqi qismga tushadi. (4), uning asosiy qismi kameraning markaziy qismida joylashgan tikanlar (5) bilan gorizontal plastinkaga joylashtiriladi. Gorizontal plastinka va elektrod bo'linmalarining tashqi bo'limi o'rtasida tayoqchalar mavjud. (6),
2-rasm. Past kuchlanishli elektroforez uchun qurilma sxemasi
ular orqali qog'oz chiziqlar tashlanadi va ularni qo'llab-quvvatlash uchun xizmat qiladi. Kameraning ustki qopqog'i ostida katta dumaloq teshiklari (7) bo'lgan pleksiglasdan yasalgan plastinka bo'lib, uning ustiga distillangan suvga 4-5 marta namlangan filtr qog'oz varaqlari qo'yiladi. Ushbu choyshablar kameraning zichligini oshirishga va natijada elektroforez paytida suyuqlikning elektroforegrammalardan bug'lanishini kamaytirishga yordam beradi.
Qog'ozda elektroforez yordamida talabalar qon zardobidagi oqsillarni ajratishni amalga oshirishga taklif qilinadi. Ushbu usul bilan qon zardobini 5 - 9 fraksiyaga bo'lish va ularning har biridagi nisbiy oqsil miqdorini aniqlash mumkin. Ajratish xona haroratida 3 - 5 V/sm (40 - 45 sm uzunlikdagi chiziqlar uchun 120 - 350 V) potentsial gradientda bufer eritmasida (pH 8,6 - 8,9) amalga oshiriladi. Oqim kuchi qog'oz tasmasi kesimining santimetriga 0,1 - 0,3 mA dan oshmasligi kerak. Joriy quvvatning 2 baravardan ko'proq oshishi qabul qilinishi mumkin emas, chunki bu haddan tashqari qizib ketishga, bug'lanishning sezilarli darajada oshishiga olib keladi va V yakuniy natija - qog'ozni yoqish
Reaktivlar:
1. Bufer eritmasi. Foydalanish mumkin:
a) veronal-medinal bufer (pH 8,6): 300 ml distillangan suvda 10,32 gmedinal (veronal natriy tuzi) eritiladi, 1,84 gveronal qo'shiladi, suv hammomida eriguncha aralashtirib isitiladi va suv bilan 1 l gacha suyultiriladi;
b) veronal asetat buferi (pH 8,6): 4,3 gveronal, 0,95 natriy gidroksid va 3,24 natriy gidroksid 300 ml distillangan suvda eritiladi. Probirkaga 30 ml 0,1 M HCl eritmasidan soling va 1 litr suv bilan suyultiriladi;
v) Tris buferi (pH 8,9): 60,5 g tris, 6 g etilendiamintetraasetik kislota va 4,6 g borik kislota 1 l distillangan suvda eritiladi.
2. Elektroforegrammalarni bo'yash uchun eritmalar:
a) kislotali ko'k-qora bo'yoq (amid qora 10 B ga o'xshash) -0,2 g aralashmada: sirka kislotasi (muzlik) - 100 ml + metil spirti - 900 ml;
b) bromofenol ko'k - 0,5 g, sublimat - 10 g, sirka kislotasi (muzlik) - 20 ml, distillangan suv - 980 ml;
v) bromofenol ko'k - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O -50 g, sirka kislotasi (muzlik) 50 ml, distillangan suv - 900 ml.
3. Oqsil bilan bog‘lanmagan bo‘yoqdan elektroforegrammalarni yuvish va bo‘yoqni oqsilga mahkamlash uchun eritmalar:
a) sirka kislotasi - 2% eritma;
b) natriy asetat - 10% sirka kislota eritmasi bilan tayyorlangan 2% eritma.
4. Elektroferogrammalardan rangli mahsulotlarni elutsiya qilish uchun eritmalar:
a) ko'k bromofenolni olish uchun - 0,01 M NaOH eritmasi;
b) kislotali ko'k-qora bo'yoq - 0,1 M NaOH eritmasini olish uchun.
Uskunalar: sinov naychalari; kyuvetalar, spektrofotometr, elektroforez moslamasi, xromatografik qog'oz: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM va boshqalar.
Qon zardobini olish. Quruq sentrifuga probirkasiga 2 - 3 ml qon quyiladi va 1/2 - 1 soatga qoldiriladi.. Naycha devorlariga yupqa shisha tayoqchani ehtiyotkorlik bilan aylantirib, ulardan trombni ajratish uchun sentrifuga qilinadi va zardob quyiladi. toza quvur.
Kamera tayyorlash. Elektrod bo'linmalari bir xil darajadagi bufer eritmasi bilan to'ldiriladi (bufer to'lib ketishining oldini olish uchun), har bir bo'limga taxminan 800 ml. Bo elektrod bo'linmalarining ichki qismlari elektrodlarni botiradi. Xromatografik qog'oz varag'ida (18x45 sm) (nozik navli qog'ozdan foydalanganda namunalarni 4-5 sm kenglikdagi alohida chiziqlarga qo'llash yaxshidir) oddiy yumshoq qalam bilan tor tomondan biridan 15 sm masofada. (grafit suyuqlik tarqalishini oldini oladi) namunalarni qo'llash joylarini belgilang. Ular to'rtburchaklar (2 x 0,3 sm), ularning katta tomonlari qog'oz tasmasining uzunligiga perpendikulyar. Elektroferogrammaning boshlang'ich zonalari va qirralari orasidagi masofa -2 sm. Elektroferogramma elektroforez sodir bo'ladigan bufer bilan singdirilgan. Buning uchun u bufer eritmasi bo'lgan kyuveta orqali tortiladi. Qog'oz chiziqlarining uchlari (6-8 sm) namlanmaydi. Ortiqcha bufer ikki yoki uch varaq filtr qog'ozi orasidagi chiziqlarni tozalash orqali chiqariladi. Xo'l elektroferogramma kameraga markaziy gorizontal plastinka (5) qo'yiladi va uchlari elektrod bo'linmalarining tashqi bo'limlariga tushiriladi.Asbob qopqoq bilan mahkam yopiladi, uning ostida suv bilan namlangan filtr qog'oz varaqlari joylashgan. .
Elektroforezni o'tkazish. Qog'oz chiziqlari bufer eritmasi bilan to'liq to'yingandan so'ng, namunalar belgilangan joylarga 0,1 ml pipetka yordamida qo'llaniladi: 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg protein) sarum. Xona qopqoq bilan yopiladi va oqim yoqiladi. Elektroforezning davomiyligi 200 - 300 V kuchlanishda 22 - 24 soat.
Elektroforegrammalarni mahkamlash va bo'yash. Elektroforez oxirida oqimni o'chiring va darhol elektroferogrammalarni qurilmadan olib tashlang. Ular maxsus stendga joylashtiriladi va havoda shashka ostida quritiladi, so'ngra oqsillarni qog'ozga mahkamlash uchun 20 daqiqa davomida 105 ºC pechda quritiladi, shundan so'ng ular sirlangan kyuvetaga joylashtiriladi, bo'yoq bilan to'ldiriladi va 2-3 soatga qoldiriladi. yoki undan ko'p. Bo'yoq drenajlanadi va elektroforegrammalar uning ortiqcha qismidan sirka kislotasining 2% li eritmasi bilan har safar 5-10 daqiqa davomida 3-4 marta suv bosish orqali yuviladi. Tarkibida protein bo'lmagan qog'oz joylari butunlay bo'yoqlardan tozalangan bo'lishi kerak. Elektroforegrammaning rangli mahsulotlarini mahkamlash uchun ular natriy asetatning 2% eritmasi bilan 2 daqiqa davomida quyiladi va qoralama ostida havoda quritiladi.
Alohida oqsil fraksiyalarining nisbatini aniqlash. PH 8,6 da sarum oqsillari manfiy zaryadlanadi va elektr maydonida anod tomon harakatlanadi. Anodga eng tez harakatlanuvchi fraksiya albumin, undan keyin a 1 -, a 2 -, b- va g-globulinlar (3-rasmga qarang). . Proteinli dog'lar paydo bo'ladigan qog'oz lentalarining bo'limlari oddiy qalam bilan ko'ndalang chiziqlar bilan 3-5 mm kenglikdagi chiziqlarga bo'linadi va shu chiziqlar bo'ylab kesiladi. Har bir tasma maydalanadi va alohida raqamlangan probirkaga solinadi, 3 ml 0,01 M NaOH eritmasiga quyiladi, qog‘ozdan bo‘yoq olish uchun bir soatga qoldiriladi, so‘ngra fotokolorimetrda (spektrofotometrda) har bir eritma uchun optik zichlik qiymati topiladi. ) 612 nm da.
Guruch. 3. Inson qon zardobining elektroferogrammasi va oqsil fraksiyalarining taqsimlanish egri chizig'i
Shu bilan birga, nazorat namunasi qayta ishlanadi. Buning uchun elektroferogrammaning bo'yalmagan qismlaridan chiziq kesiladi.
Olingan ma'lumotlar asosida elektroforegrammada rangli mahsulotlarning taqsimot egri chizig'i quriladi.Abtsissa o'qlari probirkalar sonini belgilaydi, ordinat o'qlari mos keladigan optik zichlik qiymatini ko'rsatadi (3-rasmga qarang). . Qon zardobidagi oqsil fraksiyalarining foizini hisoblang. Buning uchun chizilgan egri chiziq alohida kasrlarga mos keladigan bir qancha bo'limlarga minimal bo'linadi. Har bir qismning maydonining o'lchami ushbu fraktsiyaning oqsili bilan birlashtirilgan bo'yoq miqdori bilan mutanosibdir. Ushbu maydonlar orasidagi nisbat og'irlik bo'yicha hisoblanadi (qog'oz bo'limlarining og'irligi ularning maydoniga mutanosib), butun maydon 100% sifatida qabul qilinadi. Densitometr mavjud bo'lganda, qon zardobidagi oqsil fraktsiyalarining nisbati densitogramma orqali aniqlanishi mumkin.
Zardobdagi protein tarkibini oldindan belgilab, uning miqdorini har bir fraksiya uchun hisoblang.
