Genellikle seramik olarak adlandırılan katı faz sentezi veya katı faz teknolojisi, çeşitli bilim ve endüstri dalları için inorganik malzemelerin üretiminde en yaygın olanıdır. Bunlar arasında nükleer yakıt, uzay teknolojisi malzemeleri, radyo elektroniği, enstrümantasyon, katalizörler, refrakterler, yüksek sıcaklık süper iletkenleri, yarı iletkenler, ferro- ve piezoelektrikler, mıknatıslar, çeşitli kompozitler ve diğerleri yer alır.

Katı faz sentezi, reaktanlardan en az birinin katı formda olduğu kimyasal reaksiyonlara dayanır. Bu tür reaksiyonlara heterojen veya katı faz denir. Katı faz etkileşimi, sıvı veya gazlı ortamdaki reaksiyonların aksine, iki temel süreçten oluşur: kimyasal reaksiyonun kendisinden ve maddenin reaksiyon bölgesine transferinden.

Kristal bileşenleri içeren katı hal reaksiyonları, atomlarının veya iyonlarının sınırlı hareketliliği ve birçok faktöre karmaşık bir bağımlılık ile karakterize edilir. Bunlar, reaksiyona giren katıların kimyasal yapısı ve ilgili reaktivitesi, kusurların doğası ve konsantrasyonu, yüzeyin durumu ve reaksiyon bölgesinin morfolojisi, reaksiyona giren reaktiflerin temas alanı, ön mekanokimyasal aktivasyon ve bir dizi içerir. diğerleri. Yukarıdakilerin tümü, heterojen reaksiyon mekanizmalarının karmaşıklığını belirler. Heterojen reaksiyonların incelenmesi, katı hal kimyasına, kimyasal fiziğe ve katıların yüzeyinin fiziksel kimyasına, termodinamik ve kinetik yasalarına dayanır.

Çoğu zaman, katı hal reaksiyonlarının mekanizması, yalnızca zamanın bir fonksiyonu olarak etkileşim derecesine ilişkin deneysel verilerin herhangi bir özel kinetik model ve karşılık gelen kinetik denklem tarafından en iyi şekilde tanımlandığı temelinde değerlendirilir. Bu yaklaşım yanlış sonuçlara yol açabilir.

Katı hal malzemelerdeki işlemler, sıvı veya gazlardaki işlemlerden bir takım önemli farklılıklara sahiptir. Bu farklılıklar, her şeyden önce, katılarda önemli ölçüde (birkaç büyüklük sırasına göre) daha düşük difüzyon hızı ile ilişkilidir, bu da sistemdeki bileşenlerin konsantrasyonunun ortalamasını önler ve böylece meydana gelen süreçlerin uzamsal lokalizasyonuna yol açar. Uzamsal lokalizasyon, hem sürecin özgül hızının (ya da difüzyon katsayısının) hem de reaksiyon bölgesinin geometrisinin, süreçlerin gözlenen kinetiğine katkıda bulunmasına yol açar. Geometrik faktörler tarafından belirlenen katı faz işlemlerinin bu tür özelliklerine topokimyasal denir. Ek olarak, tartışılan dönüşümler uzamsal olarak yerelleştirildiğinden, hızları hem faz sınırındaki süreçlerin kendisi (reaksiyon kontrolü) hem de bileşenlerden herhangi birinin bu arayüze tedarik oranı veya ürünün çıkarılması ile belirlenebilir ( s) (difüzyon kontrolü). Model varsayımlarının karşılandığı basit sistemler için bu durumlar, dönüşüm derecesinin zamana bağlılığı şeklinde deneysel olarak tanımlanabilir. Katılardaki faz dönüşümlerinin bir başka özelliği, katı bir matriste yeni bir faz çekirdeğinin oluşumunun, ikincisinde elastik gerilmelerin ortaya çıkmasına neden olması gerçeğiyle ilgilidir; bu, bazı durumlarda enerjisi termodinamik dikkate alınırken dikkate alınmalıdır. bu dönüşümlerin

Katı faz proseslerinin kinetiğini ve bu şekilde elde edilen malzemelerin mikro yapısını etkileyen çok sayıda faktör de bu proseslerin sınıflandırılma türlerinin çokluğunu belirlemektedir. Bu nedenle, çeşitli türlerdeki dalgalanmalara göre bir sistemin kararlılığı göz önüne alındığında, heterojen (işgal edilen hacimdeki küçük dalgalanmalara karşı kararlı olan sistemler durumunda ve büyük dalgalanmalara karşı kararsız olan sistemler söz konusu olduğunda) ve homojen (stabil olmayan sistemler durumunda) küçük dalgalanmalara kadar) süreçler ayırt edilir. Heterojen süreçler için, çekirdeğin oluşum ve büyüme mekanizmasına göre ilerleyen dönüşümler, homojen süreçler için bazı düzen-düzensizlik geçişleri ve katı çözeltilerin spinodal ayrışması örnek olarak verilebilir.

Heterojen süreçler söz konusu olduğunda, heterojen ve homojen çekirdeklenmeyi heterojen ve homojen süreçlerden ayırmak gerekir. Heterojen çekirdeklenme, yapısal kusurlar (nokta kusurları, dislokasyonlar ve faz sınırları dahil) üzerinde çekirdek oluşumunu ifade eder; homojen çekirdeklenme - katı fazın hatasız bir hacminde çekirdek oluşumu.

Bir katı faz dönüşümünün ürünü analiz edildiğinde, tek fazlı ve çok fazlı çekirdekler arasında ayrım yapılır. Çok fazlı çekirdekler söz konusu olduğunda, işlemin ürünü, oluşan fazların sınırının yüzey enerjisi tarafından belirlenen karakteristik bir mikro yapıya sahip çok fazlı bir kolonidir; bu tür süreçlere, tek fazlı çekirdeklerin oluşumu ve büyümesi durumunda sürekli süreçlerin aksine süreksiz denir.

Katı faz dönüşümlerini sınıflandırmanın başka bir yolu, başlangıç ​​fazının bileşimi ile reaksiyon ürününün bileşiminin karşılaştırılmasına dayanır. Eğer çakışırlarsa, difüzyonsuz süreçlerden söz ederler ve bileşim değişirse, difüzyondan söz ederler. Ayrıca, ilk fazın büyük bir hacminde atomların eş zamanlı olarak hafif yer değiştirmesi yoluyla meydana gelen kooperatif süreçleri (örneğin martensitik dönüşüm) difüzyon olmayan süreçlerden ayırmakta fayda vardır.

Difüzyonsuz faz dönüşümleri, işlem sırasında değişen termodinamik özelliklerinin türüne göre farklılık gösterebilir.

Birinci türden dönüşümler, sıcaklık veya basınca göre kimyasal potansiyelin türevlerinde bir değişikliğin olduğu işlemlerdir. Bu, entropi, hacim, entalpi ve iç enerji gibi termodinamik parametrelerin faz geçişi sırasında ani bir değişiklik anlamına gelir. İkinci tür dönüşümler sırasında, yoğun parametrelere göre kimyasal potansiyelin birinci türevleri değişmez, ancak daha yüksek dereceli türevler değişir (ikinciden başlayarak). Bu işlemlerde, sistemin sürekli entropisi ve hacmi ile Gibbs enerjisinin ikinci türevleri cinsinden ifade edilen miktarlarda ani bir değişiklik olur: ısı kapasitesi, termal genleşme katsayısı, sıkıştırılabilirlik, vb.

İki faz arasındaki katı faz reaksiyonları (üç veya daha fazla faz arasındaki temas olası değildir ve karşılık gelen işlemler birkaç iki fazlı reaksiyonun kombinasyonları olarak temsil edilebilir) difüzyon işlemleridir ve hem heterojen hem de homojen çekirdeklenme ile heterojen veya homojen olabilir. . Homojen işlemler ve bu tür reaksiyonlarda homojen çekirdeklenme içeren işlemler, örneğin, sonraki ayrışmasıyla birlikte yarı kararlı bir katı çözeltinin oluşması durumunda (dahili reaksiyonlar olarak adlandırılır) mümkündür. Bu tür işlemlerin bir örneği dahili oksidasyon olabilir.

Diğer herhangi bir kimyasal dönüşümde olduğu gibi, katı hal dönüşümünde termodinamik dengenin koşulu, başlangıç ​​malzemeleri ve reaksiyon ürünlerindeki bileşenlerin kimyasal potansiyellerinin eşitliğidir. İki katı faz etkileşime girdiğinde, bu kimyasal potansiyel eşitliği farklı şekillerde gerçekleştirilebilir: 1) katı çözeltilerin oluşumu ile bileşenlerin başlangıç ​​fazlarında yeniden dağıtılması; 2) farklı bir kristal yapıya sahip (aslında genellikle katı faz reaksiyonu olarak adlandırılır) yeni fazların oluşumu ve çok fazlı bir sistemin çeşitli fazlarındaki bileşenin kimyasal potansiyeli miktarına bağlı olmadığından Her fazda, denge ancak başlangıç ​​fazlarının tamamen dönüştürülmesiyle elde edilebilir. Katı faz reaksiyonlarının mekanizması hakkında en güvenilir bilgi, faz bileşimi, termal etkiler, kütle değişiklikleri ve daha fazlası dahil olmak üzere reaksiyona giren sistemin çeşitli parametrelerini aynı anda gözlemlemeyi mümkün kılan karmaşık kullanımla elde edilir.

Katı hal reaksiyonlarının termodinamik teorisi Wagner tarafından önerilmiş ve ayrıca Schmalzried tarafından ilave reaksiyonları örneği kullanılarak geliştirilmiştir.

Bugüne kadar, çok çeşitli heterojen reaksiyonların birleşik bir sınıflandırması yoktur. Bunun nedeni, böyle bir evrensel sınıflandırma için temel olarak bir kriter seçmenin zorluğudur. Kimyasal kriterlere göre reaksiyonlar, oksidasyon, indirgeme, ayrışma, kombinasyon, değişim vb.

Tüm heterojen reaksiyonların karakteristik bir özelliği, reaksiyon bölgesinin faz sınırında varlığı ve lokalizasyonudur. Kural olarak, küçük kalınlıktaki reaksiyon bölgesi, farklı bileşime ve farklı özelliklere sahip maddeler tarafından işgal edilen iki alan bölgesini ayırır. Reaksiyon bölgesinin oluşum nedenleri genellikle iki gruba ayrılır: difüzyon işlemlerinin göreceli yavaşlığı ve kimyasal nedenler. Son grup, katı bir reaktifin yüzeyinde veya mevcut iki faz arasındaki arayüzde bulunan atomların veya moleküllerin yüksek reaktivitesinden kaynaklanır. Katı veya sıvı bir maddenin yüzeyinin, kompakt bir numunenin yığın özelliklerinden farklı özelliklere sahip olduğu bilinmektedir. Bu, arayüz özelliklerini belirli kılar. Burada kristal paketlenmesinde önemli bir yeniden düzenleme gerçekleşir, iki kristal kafes arasındaki gerilimler azalır ve kimyasal bileşim değişir.

Kütle transferi difüzyonla gerçekleştirildiğinden ve katı parçacıkların difüzyon hareketliliği yapının kusurlu olmasına bağlı olduğundan, kusurların katı faz reaksiyonlarının mekanizması ve kinetiği üzerinde önemli bir etkisi beklenebilir. Bu aşama, arayüzey arayüzünde reaktanların dönüşümünün kimyasal aşamasından önce gelir. Böylece, heterojen reaksiyonların kinetiği, hem kimyasal reaksiyonun seyrinin doğası hem de maddenin reaksiyon bölgesine iletilme yöntemi ile belirlenir. Yukarıdakilere uygun olarak reaksiyonların hızı, kimyasal aşama (kimyasal kinetik) veya difüzyon (difüzyon kinetiği) ile sınırlanacaktır. Böyle bir fenomen gerçekte gözlenir.

Wagner'e göre, katılarda difüzyon ve dolayısıyla reaksiyon, esas olarak kafesin dengesiz durumu nedeniyle iyonların ve elektronların hareketliliği nedeniyle gerçekleştirilir. Kafesin farklı iyonları, içinde farklı hızlarda hareket eder. Özellikle, vakaların büyük çoğunluğunda anyonların hareketliliği, katyonların hareketliliğine kıyasla ihmal edilebilir düzeydedir. Bu nedenle difüzyon ve buna bağlı olarak katılardaki reaksiyon katyonların hareketi nedeniyle gerçekleştirilir. Bu durumda farklı katyonların difüzyonu aynı yönde veya birbirine doğru gidebilir. Farklı yüklü katyonlar söz konusu olduğunda, elektronların hareketi nedeniyle sistemin elektronötralitesi korunur. Farklı yüklü katyonların hareket hızlarındaki farklılıktan dolayı sistemde bir elektrik potansiyeli ortaya çıkar. Sonuç olarak, daha hareketli iyonların hareket hızı azalır ve tersine, daha az hareketli? artışlar. Böylece ortaya çıkan elektrik potansiyeli iyon difüzyon hızlarını düzenler. İkincisi ve tüm katı hal dönüşüm sürecinin kendisi tarafından belirlenen oranı, elektronik iletkenlik ve transfer sayıları temelinde hesaplanabilir. Açıkçası, iyonların yönlendirilmiş difüzyonu, yalnızca bir elektrik alanında veya sistemdeki bir konsantrasyon gradyanının varlığında mümkündür.

Katı haldeki maddelerin sentezinde, elde edilen ürünün yalnızca kimyasal (elemental ve faz) bileşimini değil, aynı zamanda mikroyapısal organizasyonunu da kontrol etmek genellikle gereklidir. Bunun nedeni, hem kimyasal (örneğin, katı faz reaksiyonlarındaki aktivite) hem de birçok fiziksel (manyetik, elektriksel, optik vb.) özelliğin, çeşitli hiyerarşik seviyelerde bir katının yapısal organizasyonunun özelliklerine güçlü bir şekilde bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. Bu seviyelerin ilki, bir katının temel bileşimini ve elementlerin atomlarının uzayda karşılıklı düzenlenmesi yöntemini - kristal yapıyı (veya amorf katılardaki atomların en yakın koordinasyon ortamının özelliklerini) ve ayrıca bileşimi ve nokta kusurlarının konsantrasyonu. Katı bir cismin yapısının bir sonraki seviyesi olarak, atomların düzeninde öteleme simetrisinin gözlemlendiği (nokta kusurlarının varlığı için düzeltilmiş) bölgelerin boyutlarını belirleyen bir kristaldeki genişletilmiş kusurların dağılımını düşünebiliriz. . Bu tür bölgeler, mükemmel mikro kristaller olarak kabul edilebilir ve tutarlı saçılma bölgeleri olarak adlandırılır. Tutarlı saçılma bölgelerinden bahsetmişken, genel durumda, önemli sayıda genişletilmiş kusurlar ve sonuç olarak tutarlı bölgeler içerebilen katı fazlı bir malzeme oluşturan kompakt parçacıklara eşdeğer olmadıkları unutulmamalıdır. saçılma. Tutarlı saçılma bölgelerinin parçacıklarla çakışması (bu durumda tek alan olarak adlandırılır) genellikle yalnızca yeterince küçük (100 nm'den az) ikinci boyutlar için gözlenir. Sonraki yapısal seviyeler, toz veya seramik malzemeyi oluşturan parçacıkların şekil ve boyut dağılımı, bunların kümelenmesi, birincil agregaların kümelenmesi vb. ile ilişkilendirilebilir.

Katı faz malzemelerinin farklı uygulamalarının, yukarıda listelenen yapısal özellikler için farklı, genellikle birbiriyle çelişen gereksinimleri vardır ve bu nedenle farklı sentetik yöntemler gerektirir. Bu nedenle, katı fazlı maddelerin değil, katı fazlı malzemelerin sentez yöntemlerinden bahsetmek ve her durumda, elde edilen ürünün müteakip uygulama alanını dikkate alarak bir sentez yöntemi seçmek daha doğrudur.

Genel durumda, katı fazlı malzemelerin sentezi için yöntemler, kullanılan kimyasal işlemlerin akışı için termodinamik olarak denge koşullarından uzaklıklarına göre sınıflandırılabilir. Genel yasalara göre, dengeden olabildiğince uzak bir duruma karşılık gelen koşullar altında, çekirdeklenme hızının, oluşan çekirdeklerin büyüme hızının üzerinde önemli bir fazlalığı gözlenir, bu da açıkça en dağınık ürünün elde edilmesine yol açar. İşlemin termodinamik dengeye yakın bir şekilde yürütülmesi durumunda, halihazırda oluşturulmuş çekirdeklerin büyümesi, yenilerinin oluşumundan daha hızlı gerçekleşir ve bu da kaba taneli (sınırlı durumda, tek kristalli) malzemeler elde etmeyi mümkün kılar. Kristallerin büyüme hızı da büyük ölçüde içlerindeki uzun süreli (dengesiz) kusurların konsantrasyonu tarafından belirlenir.

Kombinatoryal sentez sadece çözeltide (sıvı faz sentezi) değil, aynı zamanda kimyasal olarak inert bir katı fazın yüzeyinde de gerçekleştirilebilir. Bu durumda, birinci başlangıç ​​malzemesi, polimer taşıyıcının yüzeyindeki işlevsel gruplara kimyasal olarak "dikilir" (çoğunlukla bir ester veya amid bağı kullanılır) ve ikinci başlangıç ​​malzemesinin bir çözeltisiyle işlenir; reaksiyonun tamamlanması için önemli bir fazlalık. Ürünleri izole etme tekniği kolaylaştırıldığı için bu reaksiyon biçiminde belirli bir kolaylık vardır: polimer (genellikle granül formunda) basitçe süzülür, ikinci reaktifin kalıntılarından iyice yıkanır ve hedef bileşik ondan kimyasal olarak ayrılır.

Organik kimyada, pratikte her durumda hedef ürünlerin kantitatif verimlerini sağlayan tek bir reaksiyon yoktur. Görünüşe göre tek istisna, organik maddelerin yüksek sıcaklıkta oksijen içinde C02 ve H20'ye tamamen yanmasıdır. Bu nedenle, hedef ürünün saflaştırılması her zaman vazgeçilmez ve çoğu zaman en zor ve zaman alıcı görevdir. Özellikle zor bir görev, peptit sentezi ürünlerinin izolasyonu, örneğin karmaşık bir polipeptit karışımının ayrılmasıdır. Bu nedenle, 1960'ların başında R. B. Merifield tarafından geliştirilen katı bir polimer substrat üzerinde sentez yöntemi peptit sentezinde en yaygın şekilde kullanılmaya başlandı.

Merrifield yöntemindeki polimer taşıyıcı, desteği polipeptidin ilk amino asit kalıntısına bağlayan bağlayıcılar olan benzen halkalarında klorometil grupları içeren granüler çapraz bağlı bir polistirendir. Bu gruplar, polimeri fonksiyonel bir benzil klorür analoğuna dönüştürür ve karboksilat anyonları ile reaksiyona girerek kolayca ester bağları oluşturma yeteneği verir. Böyle bir reçinenin N korumalı amino asitlerle yoğunlaştırılması, karşılık gelen benzil esterlerin oluşumuna yol açar. N-korumasının çıkarılması, polimere kovalent olarak bağlı birinci amino asidin C-korumalı bir türevini verir. Serbest kalan amino grubunun ikinci amino asidin N-korumalı bir türevi ile aminoasilasyonu, ardından N-korumasının çıkarılması, yine polimere bağlı benzer bir dipeptid türevi ile sonuçlanır:

Bu tür iki aşamalı bir döngü (koruma kaldırma - aminoasilasyon), prensip olarak, belirli bir uzunlukta bir polipeptit zinciri oluşturmak için gerektiği kadar tekrar edilebilir.

Merifield'ın fikirlerinin daha da geliştirilmesi, her şeyden önce, substratlar için yeni polimerik malzemelerin araştırılması ve yaratılması, ürünlerin ayrılması için yöntemlerin geliştirilmesi ve tüm polipeptit sentezi döngüsü için otomatik kurulumların oluşturulmasına yönelikti.

Merifield yönteminin etkinliği, başta insülin olmak üzere bir dizi doğal polipeptitin başarılı senteziyle kanıtlanmıştır. Avantajları özellikle ribonükleaz enziminin sentezi örneğinde açıkça gösterilmiştir. Bu nedenle, örneğin, önemli çabalar pahasına, birkaç yıl boyunca Hirschman ve 22 çalışanı, geleneksel sıvı faz yöntemlerini kullanarak ribonükleaz enziminin (124 amino asit kalıntısı) sentezini gerçekleştirdi. Neredeyse aynı anda, otomatik katı faz sentezi ile aynı protein elde edildi. İkinci durumda, 369 kimyasal reaksiyon dahil olmak üzere toplam 11.931 farklı işlemi içeren sentez, iki katılımcı (Gatte ve Merrifield) tarafından sadece birkaç ayda gerçekleştirildi.

Merrifield'ın fikirleri, çeşitli yapılardaki polipeptit kitaplıklarının kombinatoryal sentezi için çeşitli yöntemlerin oluşturulmasına temel teşkil etti.

Böylece 1982'de peptitlerin katı faz üzerinde çok aşamalı paralel sentezi için "bölünmüş yöntem" olarak bilinen orijinal bir strateji önerildi ( bölmek- bölme, ayırma) veya "karıştır ve ayır" yöntemi (Şek. 3). Özü aşağıdaki gibidir. Diyelim ki üç amino asitten (A, B ve C) tüm olası tripeptit kombinasyonlarını elde etmeniz gerekiyor. Bunu yapmak için, bir katı polimer taşıyıcının (P) granülleri üç eşit parçaya bölünür ve amino asitlerden birinin çözeltisi ile işlenir. Bu durumda, tüm amino asitler fonksiyonel gruplarından biri tarafından polimerin yüzeyine kimyasal olarak bağlanır. Elde edilen üç dereceli polimerler iyice karıştırılır ve karışım tekrar üç kısma bölünür. Daha sonra, üç amino asidin tümünü eşit miktarlarda içeren her parça, yine aynı üç amino asitten biri ile işlenir ve dokuz dipeptit elde edilir (her biri üç üründen oluşan üç karışım). Başka bir karıştırma, üç eşit parçaya bölme ve amino asitlerle işleme, istenen 27 tripeptit'i (dokuz ürünün üç karışımı) sadece dokuz aşamada verir, ayrı ayrı elde etmek ise 27 × 3 = 81 aşamalı bir sentez gerektirir.

"Biyolog. dergi Ermenistan, 1 (65), 2013 PIG ATRIUM G.S.'DEN İZOLE EDİLEN KALP AKTİF PEPTİTİNİN KATI FAZLI SENTEZİ CHAILYAN Biyokimya Enstitüsü. Bünyatyan NAS RA..."

Deneysel ve teorik makaleler

Deneysel ve teorik makaleler

Biyolog. dergi Ermenistan, 1 (65), 2013

KALP PEPTİTİNİN KATI FAZLI SENTEZİ,

DOMUZ ATRİUMUNDAN İZOLE EDİLMİŞTİR

G.S. CHAILYAN

Biyokimya Enstitüsü. Bünyatyan NAS RA

[e-posta korumalı]

Araştırmaya devam etmek için acad. Galoyan ile domuz kalbinin atriyum ve auriküler kısımlarından yeni izole edilmiş peptid bileşiklerinin biyolojik yönelimini izole etmek, saflaştırmak ve belirlemek için bir dizi deney gerçekleştirdik. Biyotestleri yürütmek için, incelenen numunelerin hazırlayıcı miktarlarını elde etmek gerekliydi. Bunu yapmak için, peptitlerin katı faz sentezi yöntemini daha fazla modifikasyonu ile kullandık. Sentezlenen preparasyonların saflığı ve kimliği, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektral analizi ile kontrol edildi.

Katı faz sentezi - fmoc-amino asitler - HPLC - fenilizotiyosiyanat - kütle spektral analizi:

fmoc- – – Galoyan tarafından kurulan ileri çalışmalar için, domuz kulakçıklarından izole edilen peptitlerin izolasyonu, saflaştırılması ve biyolojik yönünün belirlenmesi üzerine bir dizi deney yapılmıştır. Biyotestleri yerine getirmek için hazırlayıcı miktarda numune gerekliydi. Modifiye edilmiş bir katı faz peptit sentezi yöntemi kullanıldı. Sentezlenen peptit saflığı ve kimliği, HPLC ve kütle spektral analizi ile tanımlandı.

Katı faz sentezi – yüksek performanslı sıvı kromatografisi – kütle spektrometrisi – fmoc-amino asitler – kardiyopeptitler – kulakçıklar Galoyan ve diğerleri, hipotalamik nörohormonların vücuttaki çeşitli süreçler üzerindeki düzenleme yollarını ve etki mekanizmalarını inceledi.

Hipotalamus - hipofiz bezi - adrenal bezler gibi bir sistemin birbirine bağlı, birbirine bağlı, bütünleyici işleyişi fikrinin doğrulanması endokrinolojide bir dönüm noktasıydı. Hipotalamus - hipofiz bezinin etkileşimi ile ilgili olarak Galoyan tarafından öne sürülen tual üçlüsünün DOMUZ ATRİYUMUNDAN İZOLE EDİLMİŞ BİR KALP AKTİF PEPTİTİNİN KATI FAZLI SENTEZİ

– kalp, büyük bir bilimsel başarıdır. Daha sonra yeni bir doku-hedef-kalp keşfedildi, bu organın spesifik peptitlerin işleyişini kontrol etme yeteneği ve ayrıca bu peptitler aracılığıyla hipotalamus ile kalp arasında bir geri bildirim mekanizmasının varlığı gösterildi.

Kardiyoaktif bileşiklerin keşfi - nörohormon K, C, G ve çeşitli hayvanların hipotalamusundaki diğer birkaç kişi, yalnızca bu nörohormonların moleküler etki mekanizmalarının incelenmesi için değil, aynı zamanda araştırma için de çalışmanın başlangıcı oldu. kalpteki benzer bileşikler için. Kardiyoaktif ilkelerin biyokimyasal ve fizikokimyasal özelliklerine ilişkin kapsamlı bir çalışmanın temeli, kalp kasında 2 kardiyoaktif bileşiğin varlığına ilişkin verilerdi. "C" nörohormonunun glikolitik süreçlerin düzenlenmesine ve siklik nükleotitlerin seviyesine katılımı, PDE cAMP, cAMP'ye bağlı protein kinaz, vb.'nin inhibisyonu yoluyla kurulmuştur. Bu bileşiğin düşük molekül ağırlıklı olduğu ve glikopeptidlere ait olduğu gösterilmiştir.

Analitik Kromatografi ve Peptid Sentezi Laboratuvarında domuz kalbinin atriyum ve auriküler bölgelerinden peptit bileşiklerinin izolasyonu ve saflaştırılması üzerine çalışmalar yürüttük. Hazırlayıcı HPLC ile peptit fraksiyonlarının ayrılması sırasında, peptit doğasına sahip 20 bileşik izole ettik ve homojen bir duruma saflaştırdık. Biyolojik odağı belirlemek için tüm preparatlar sıçanlarda EKG bileşenlerindeki değişiklikler açısından test edildi. Deneylerin sonuçları, 7 bileşiğin EKG'nin belirli bileşenleri üzerinde çok yönlü etki faktörlerine sahip olduğunu gösterdi.

Peptit No.7, R bileşeninin genliğini, QRS kompleksinin süresini, S genliğini ve diğer parametreleri değiştirmede en büyük aktiviteyi gösterdi.

Bu ilacın biyolojik etki mekanizmalarını incelemek için, büyük miktarda test örneğine sahip olmak gerekli hale geldi. Biyolojik ürünlerin izolasyon ve saflaştırma işlemlerinin son derece verimsiz, zahmetli, zaman alıcı olması ve iyi tekrarlanabilirlik sağlayamaması nedeniyle bu ilacın kimyasal sentezinin gerçekleştirilmesi son derece önemli hale gelmiştir. Peptidlerin kimyasal sentezi alanındaki dünya literatürünü inceleyerek, bizim için en uygun olanın fmoc korumalı amino asitler kullanan katı faz sentez yöntemi olduğu sonucuna vardık. 1984 yılında keşfedilen Katı faz peptit sentezi, geleneksel senteze göre verimlilik, uygun işleme ve saflaştırma açısından birçok avantaja sahiptir.

Birkaç farklı yöntem kullanarak: bu ilacın hidrolizi, amino asitlerin fenilizotiyosiyanat ile modifikasyonu, peptid No.7'nin amino asit bileşimini elde ettik. Kütle spektral ve NMR analizleri, Edmon degradasyonu verilerini kullanarak, sadece amino asit bileşimini değil, aynı zamanda peptid No.7'nin amino asit dizisini de elde edebildik.

Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Etkili bir katı faz sentez prosesi, büyük ölçüde, reçine, solvent ve sentez kinetiği seçimi gibi, uygulanması için çeşitli koşulların doğru seçimine bağlıdır. Bu değişkenler, reçinenin şişme derecesini ve amino asitlerle ilişkisini, sonuçta bir bütün olarak peptidin sentezini etkileyen bağlanma bölgelerinin sayısını etkiler. Amino asit dizilerinin özelliklerini dikkate alarak, incelediğimiz peptitlerle ilgili olarak katı faz sentezi sürecini uyarladık.

G.S. CHAILYAN Malzeme ve yöntemler. Kullanılan tüm reaktifler, solventler, reçineler Advanced Chem Techcompany'dendir. Sentez sırasında amino asitlerin N-ucunu korumak için fmoc grupları ve tüm sentez sırasında çözücü olarak dimetilformamid (DMF) kullandık. Substrat olarak aside duyarlı 2-klorotritil reçine kullandık. Koruyucu fmoc gruplarının çıkarılması, DMF içinde bir piperidin çözeltisi kullanılarak gerçekleştirildi.

Sentez sürecinde çok önemli olan ilk amino asidin reçine üzerine inmesidir. İki gram 2Cl-Trt reçinesi 10 ml'lik bir şırıngaya döküldü. Şırıngaya DMF çekildi, reçinenin 15 dakika şişmesi sağlandı. Bundan sonra, DMF yıkandı. Daha sonra birinci amino asit (fmoc-Pro) ve bir reaksiyon aktivatörü (DIPEA) çözeltisi 1 RESIN/1.2 FMOC-PRO/4DIPEA oranında şırıngaya çekildi. İlk amino asidin ekilmesi reaksiyonu 3 saat sürmüştür Sentez için çok önemli bir koşul, ilk amino asidin ekilmesinden sonra serbest bağlayıcıların olmamasıdır, bu nedenle, birinci amino aside bağlandıktan sonra, reçine bir karışımla işlendi. kalan serbest uçları bloke etmek için 80DMF/15MEOH/5DIPEA oranında metilen, DIPEA (diizopropiletilamin) ve DMF. Daha sonra reçine DMF ile 5 kez 5 dakika yıkandı. Daha sonra amino asitler DMF içinde %30'luk piperidin solüsyonu ile 5 dakika boyunca 8 kez debloke edildi. Daha sonra reçine DMF ile 5 kez 5 dakika yıkandı. Bu döngü, peptidin sentezi boyunca tekrarlandı. Her amino asit ilavesi ve blok çözme adımından sonra, reaksiyonun ilerleyişi, karakteristik bir koyu mavi renk oluşturmak için ninhidrinin serbest bir amino grubu ile reaksiyonu olan Kaiser testi ile izlendi. Bu test sayesinde, amino asitlerin yüklenmesi ve blokajının çözülmesi reaksiyonlarının adım adım kontrolü mümkün hale geldi.

Sentezlenen peptid no.7'nin saflaştırılması ve kontrolü, Waters'tan (ABD) temin edilen 2 bileşenli bir hazırlayıcı HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirildi. Örneği enjekte etmek için 500 ul döngü hacmine sahip bir Rheodyne enjektörü kullanıldı. Tespit 190–360 nm aralığında gerçekleştirildi. Ters fazlı HPLC için “Symmetry Si-100 C18” (4.6x250 mm) kolonu kullandık. Akış hızı 50 ml/dk idi. Bir gradyan yıkama sistemi H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1) kullanıldı. Analiz süresi 15 dk. Yeniden kromatografi, bir Knauer HPLC analitik sistemi üzerinde gerçekleştirildi. Bir XbridgeC18 kolonu (2,6x150 mm) kullanıldı. Saptama 214 nm'de gerçekleştirilmiştir.

Elde edilen verileri doğrulamak için sentezlenen müstahzar, CSU "Analitekal spektrometri" üzerinde kütle spektral analizine tabi tutuldu.

Sonuçlar ve tartışma. Kromatogramda elde edilen veriler, saflaştırmadan sonra sentezlenen peptit No.7'nin saflığının %99.6'dan fazla olduğunu göstermektedir (Şekil 1).

–  –  –

7 numaralı doğal peptidin, sentezlenmiş analoğuyla aynı koşullar altında bir X-bridgeC18 kolonu üzerinde karşılaştırmalı bir kromatografik analizini gerçekleştirdik. Karşılaştırma sonuçları sunulmuştur (Şekil 2).

Domuz Atriyumundan İzole Edilen Kardiyoaktif Peptitin Katı Fazlı Sentezi

–  –  –

Pirinç. Şekil 4. Sentezlenmiş (A) ve doğal (B) müstahzarların spektrogramları.

G.S. CHAILYAN Kromatogramların karşılaştırmasından da görülebileceği gibi, sentezlenen analog ve doğal peptit No. 7, yapılarının ve amino asit dizilimlerinin özdeşliğini gösteren kütle ve salım süresi bakımından aynıdır. Böylece, katı faz peptid sentezi yöntemini kullanarak ve incelenen peptidin yapısal özelliklerini dikkate alarak, 9 amino asitten oluşan doğal peptid ile homojen ve özdeş bir peptit elde etmeyi başardık. Gelecekte, yeterli miktarda ilaca sahip olarak, sadece bu peptit tarafından kardiyak aktiviteyi düzenleme yollarını değil, aynı zamanda diğer organlar ve sistemler üzerindeki etki mekanizmalarını da belirlemek için bir dizi biyotest yapmayı planlıyoruz.

EDEBİYAT

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Yeni bir boğanın kalbinde tespit ve teşhis 1.

kardiyoaktif proteinler. Soru. bal. Kimya, 37, 2, s. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. İzolasyon ve karakterizasyon 2.

nörohormon C taşıyıcı proteinin kardiyoaktif triptik parçası. Nörokimya, 2, 3, s. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Mısıryan, S.S. Düşük moleküler ağırlıklı korona aktif bileşiklerinin ayrılması 3.

jel filtrasyonu ve poliakrilamid jel elektroforezi kombinasyonu ile kalp kası. Biyolog. dergi Ermenistan, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Kardiyoaktif protein komplekslerinin çeşitli hayvanların kalbinde dağılımı. Biyolog. dergi Ermenistan, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. Nörosekresyon ve Hipotalamo-Nörohipofiz Sisteminin Hormonlarının Düzenlenmesi, SSCB, 1963.

6. Galoyan A.A. Yeni Kardiyoaktif Hormonların Biyokimyası ve Fonksiyonel Sistem Nörosekretuar Hipotalamus, Endokrin Kalbin İmmünomodülatörleri. Bilim Yayını p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and moleküler Neurobiology, 3. baskı, Springer Publishers, 500 s., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 s., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Hipotalamustan izole edilen koronarodilatör proteinlerin saflaştırılması. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, s. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March'ın ileri organik kimyası. John Wiley & Sons, Inc. tarafından yayınlandı, Hoboken, New Jersey, s. 133, 2007.

–  –  –

Benzer işler:

« TOPLULUKLAR YAYIN EVİ "NAUKA" Moskova 1979 UDC 581.55:56.017 Konu nik v VV Bitki topluluklarının yapısının evrimi. M.: Nauka, s. 1979, 276 Modern metal üzerine...»

“Müze Fonu'nun İzvestia'sı. A.A. Brauner №2 Cilt I 2004 Müze Fonu Tutanakları. A. A. Brauner Cilt I No. 2 2004 Bilimsel dergi Aralık 2003'te kuruldu Yılda 4 kez yayınlandı 13.12.2003 tarihli OD No. 913 devlet tescil belgesi Kurucu ve yayıncı ... "

Buluş, hem Boc-korumalı hem de Fmoc-korumalı amino asitleri ve bir klorometillenmiş polistiren reçinesi kullanan, H-D-Nal--Thr-NH2 formülünün bir peptidinin sentezi için bir katı faz yöntemi ile ilgilidir. 10 saat uçmak.

Buluşun ait olduğu teknoloji alanı

Mevcut buluş, bir N-terminal amino asit, N-terminal amino aside bitişik bir sondan bir önceki amino asit ve bir C-terminal amino asit içeren, üç veya daha fazla amino asit kalıntısı içeren bir peptit hazırlama yöntemi ile ilgilidir.

Önceki Sanat

Katı faz peptit sentezi, peptitlerin çözelti senteziyle ilişkili ara saflaştırma adımlarının problemlerinin çoğunun üstesinden gelmek için 1963'te tanıtıldı (Stewart ve diğ. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. baskı, 1984). Katı faz sentezinde, zincirin bir ucu (örneğin, C-terminali) çözünmeyen bir taşıyıcıya bağlanırken, amino asitler istenen herhangi bir dizide bir peptit halinde birleştirilir (örneğin birleştirilir). Taşıyıcı (destek) üzerinde istenen sekans bir kez birleştirildiğinde, peptit taşıyıcıdan salınır (yani yarılır). Bağlanacak amino asitlerin a-amino grupları için iki standart koruma grubu, güçlü bir asitle ayrılan Boc ve bir bazla çıkarılan Fmoc'dur. Mevcut buluş, klorometillenmiş polistirenden pahalı olmayan bir reçine üzerinde tek bir sentezde a-amino grupları için bu korumaların her ikisinin bir kombinasyonunu kullanan peptitlerin üretimi için uygun bir yöntemle ilgilidir.

Yukarıdaki a-amino koruma şemalarından herhangi biri kullanılarak katı faz peptid sentezi tasarlanırken, peptidi oluşturan amino asitlerin herhangi bir reaktif "yan grubunun" zincir montajı sırasında istenmeyen kimyasal reaksiyonlardan korunması önemlidir. Çeşitli yan grupları korumak için seçilen kimyasal grupların, fi-amino gruplarının korumasını kaldırmak için kullanılan reaktifler tarafından uzaklaştırılmaması da arzu edilir. Üçüncüsü, büyüyen peptit zincirinin reçine parçacığına bağının, her türlü a-amino korumasını ortadan kaldırmak için zincir birleştirme işleminde kullanılan reaktiflere dirençli olması önemlidir. Fmoc kullanan bir a-amino koruma şeması durumunda, yan grup koruması, Fmoc'u uzaklaştırmak için kullanılan alkali reaktiflere dirençli olmalıdır. Uygulamada, bu yan zincir koruma grupları, peptit zincirinin montajı tamamlandıktan sonra genellikle hafif asidik reaktiflerle çıkarılır. Boc kullanan bir β-amino grubu koruma şeması kullanılıyorsa, yan grup koruması her döngüde Boc grubunu çıkarmak için kullanılan zayıf asidik reaktife dirençli olmalıdır. Uygulamada, Boc ile β-amino koruma şemasındaki bu yan zincir koruma grupları, peptit zinciri montajı tamamlandıktan sonra genellikle susuz HF ile çıkarılır. Bu nedenle pratikte, Fmoc ile a-amino koruma şemasında yaygın olarak kullanılan yan zincir koruma grupları, Boc ile a-amino gruplarının korumasını kaldırmak için kullanılan koşullar altında stabil değildir. Bu nedenle, katı faz peptit sentezinde peptit zincirinin montajı sırasında a-amino grupları için iki tip koruma şeması birleştirilmez. Ayrıca peptit sentezinde kullanılan en ucuz polimer reçine (klorometile polistiren veya “Maryfield reçinesi”), Boc grupları tarafından korunan amino asitlerle birlikte yaygın olarak kullanılmasına rağmen koruma durumunda uygulanamayacağı literatürde sonucuna varılmıştır. Alkali koşullar altındaki istikrarsızlığı nedeniyle Fmoc grupları ile a-amino gruplarının (bkz. Stewart ve diğ. Katı Fazlı Peptid Sentezi. Pierce Chemical Co., 2. baskı, 1984). Mevcut buluş, bir Merifield reçinesi üzerinde hem Boc-korumalı hem de Fmoc-korumalı amino asitlerin katı faz sentezinde belirli peptitlerin birlikte kullanılması için bir yönteme yöneliktir.

Bir somatostatin analoğu olan Lanreotide®'nin büyüme hormonu salınımını inhibe ettiği ve ayrıca insülin, glukagon ve ekzokrin pankreas salgısını inhibe ettiği bilinmektedir.

ABD Patenti No. 4,853,371, Lanreotide®'i, bunun hazırlanması için bir işlemi ve büyüme hormonu, insülin, glukagon ve ekzokrin pankreas salgısının önlenmesi için bir yöntemi açıklar ve talep eder.

5147856 sayılı ABD Patenti, restenoz tedavisi için Lanreotide® kullanımını açıklamaktadır.

ABD Patenti No. 5411943, hepatomun tedavisi için Lanreotide® kullanımını açıklamaktadır.

ABD Patenti No. 5073541, Lanreotide®'nin akciğer kanseri tedavisi için kullanımını açıklamaktadır.

9 Temmuz 1993'te dosyalanan ABD Patent Başvurusu No. 08/089410, melanom tedavisi için Lanreotide® kullanımını açıklar.

5,504,069 sayılı ABD Patenti, hızlandırılmış katı tümör büyümesini engellemek için Lanreotide® kullanımını açıklamaktadır.

13 Mayıs 1997'de tevdi edilen ABD Patent Başvurusu No. 08/854941, kilo kaybı için Lanreotide® kullanımını açıklamaktadır.

13 Mayıs 1997'de dosyalanan ABD Patent Başvurusu No. 08/854,943, Lanreotide®'nin insülin direnci ve X Sendromu tedavisi için kullanımını açıklamaktadır.

ABD Patenti No. 5688418, Lanreotide®'nin pankreas hücrelerinin canlılığını uzatmak için kullanımını açıklamaktadır.

PCT Başvurusu No. PCT/US 97/14154, Lanreotide®'nin fibroz tedavisi için kullanımını açıklamaktadır.

13 Mayıs 1997'de dosyalanan ABD Patent Başvurusu No. 08/855311, hiperlipideminin tedavisi için Lanreotide® kullanımını açıklar.

12 Mayıs 1995'te dosyalanan ABD Patent Başvurusu No. 08/440061, Lanreotide®'nin hiperamilineminin tedavisi için kullanımını açıklamaktadır.

7 Mayıs 1997'de dosyalanan ABD Patent Başvurusu No. 08/852221, Lanreotide®'nin hiperprolaktinemi ve prolaktinomaların tedavisi için kullanımını açıklamaktadır.

Buluşun özü

Mevcut buluş, bir N-terminal amino asit, N-terminal amino aside bitişik sondan bir önceki amino asit ve bir C-terminal amino asit içeren, üç veya daha fazla amino asit kalıntısı içeren bir peptit hazırlamak için bir yöntem sağlar; adı geçen yöntem şunları içerir: aşağıdaki adımlar:

(a) birinci amino asidin katı destek reçinesine bir eter bağıyla bağlanması ve birinci birleştirme ürününün oluşturulması, (i) sezyum tuzu oluşturmak üzere birinci amino asidin alkollü bir çözeltisiyle sezyum karbonatın sulu bir çözeltisinin reaksiyona sokulmasını içerir. (ii) birinci amino asidin çözücüsüz bir sezyum tuzunun elde edilmesi, (iii) katı destek reçinesinin birinci amino asidin sezyum tuzu ile kuru (susuz) polar aprotik bir çözücü içinde reaksiyona sokularak oluşturulması ilk eklenen ürün,

burada birinci amino asit peptitin C-terminal amino asidine karşılık gelir, birinci amino asidin yan olmayan (ana) zincirinin amino grubu Boc tarafından bloke edilir ve birinci amino asidin bir fonksiyonel grubu yoktur koruma gerektiren yan zincirde ve katı destek - reçine - bir klorometillenmiş polistiren reçinesidir;

(b) Boc'un birinci girişin ürününden bir asitle korumasının kaldırılması (blokajın kaldırılması) ve birinci girişin blokajı kaldırılmış bir ürünü oluşturmak;

(c) isteğe bağlı olarak, bloke edilmiş (korumalı) bir sonraki bağlanma ürünü elde etmek için bir peptit büyüme reaktifi içeren bir organik solvent içinde bir sonraki amino asidin blokajı kaldırılmış birinci bağlanma ürünü ile reaksiyona sokulmasını içeren bir sonraki amino asidin blokajı kaldırılmış birinci bağlanma ürününe bağlanması, burada bir sonraki amino asit ana zincirde Boc tarafından bloke edilen bir amino grubuna sahiptir ve bir sonraki amino asit yan zincirde bir veya daha fazla fonksiyonel gruba sahipse, yan zincirdeki fonksiyonel gruplar koruma gerektirmez veya fonksiyonel gruplar yan zincirde, korumayı kaldırmak için kullanılan asit veya alkali reaktiflere dirençli koruyucu gruplara, sırasıyla Boc ve Fmoc'a sahiptir;

(d) koruması kaldırılmış bir sonraki eklentiyi elde etmek için bloke edilmiş bir sonraki eklentiyi bir asitle reaksiyona sokmayı içeren, Boc'un bloke edilmiş bir sonraki eklentiden korumasının kaldırılması;

(e) isteğe bağlı olarak, (c) ve (d) adımlarının tekrarlanması, her döngünün (X+1)'inci bir sonraki ekin salınan bir ürününü oluşturması, burada X, döngünün gerekli tekrarının sayısıdır;

(f) bir sonraki amino asidin adım (b)'den salınan birinci bağlanma ürününe veya isteğe bağlı olarak adım (e)'den salınan (X+l)inci sonraki bağlanma ürününe eklenmesi, bu, bir sonraki amino asidin söz konusu amino asitle reaksiyona sokulmasını içerir. bloke edilmiş (korumalı) bir sonraki bağlanma ürünü elde etmek için peptidi büyütmek için bir reaktif içeren bir organik çözücü içinde ilk bağlanma ürünü veya (X+1)inci sonraki bağlanmanın belirtilen blokajı kaldırılmış ürünü ile ve bir sonraki amino asidin bir ana zinciri vardır Bir sonraki amino asidin yan zincirde bir veya daha fazla fonksiyonel gruba sahip olması durumunda, yan zincirdeki fonksiyonel grupların koruma gerektirmemesi veya yan zincirdeki fonksiyonel grupların koruyucu gruplara sahip olması şartıyla, Fmoc tarafından bloke edilen amino grubu Fmoc'un korumasını kaldırmak için kullanılan alkali reaktiflere dirençli;

(g) Fmoc'un bloke edilmiş bir sonraki eklentiden korumasının kaldırılması, bu, koruması kaldırılmış bir sonraki eklentinin elde edilmesi için bloke edilmiş bir sonraki eklentinin bir birincil veya ikincil amin ile reaksiyona sokulmasını içerir;

(h) isteğe bağlı olarak, (e) ve (g) adımlarının tekrarlanması, her döngünün sonraki (X+1)'inci eklemenin bloke edilmiş bir ürününü oluşturması, burada X, sondan bir önceki olana kadar döngünün gerekli tekrarının sayısıdır. peptit ve deblocked amino asitte yer alır;

(i) N-terminal amino asidin koruması kaldırılmış (X+1)inci sonraki katılım ürününe bağlanması, bu, N-terminali amino asidin koruması kaldırılmış (X+1)inci sonraki katılım ürünü ile bir organik solvent içinde reaksiyona sokulmasını içerir: bloke edilmiş bir son ürün elde etmek için peptit büyüme reaktifi, burada N-terminal amino asit, Boc veya Fmoc tarafından bloke edilmiş bir omurga amino grubuna sahiptir;

(j) reçine üzerinde tamamlanmış peptit ürününü oluşturmak için bloke edilmiş tamamlanmış ilave ürünün Boc durumunda bir asit veya Fmoc durumunda bir baz ile reaksiyona sokulmasını içeren, bloke edilmiş tamamlanmış ilave üründen Boc veya Fmoc'un korumasının kaldırılması;

(j) reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün yan zincir fonksiyonel grupları varsa, o zaman isteğe bağlı olarak reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün yan zincir fonksiyonel gruplarının korumasının kaldırılması, buna reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün uygun koruma kaldırma reaktifleri ile reaksiyona sokulması dahildir. reçine üzerinde tamamlanmış koruması kaldırılmış peptit ürünü; ve

(k) reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün veya koruması kaldırılmış reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün katı reçine taşıyıcısından peptitin ayrılması, reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün veya koruması kaldırılmış reçine üzerindeki tamamlanmış peptit ürününün amonyakla reaksiyona sokulmasını içeren bir peptit elde edilmesi peptitin reçineden ayrılmasının pratik olarak tamamlanmasına kadar birincil amin veya ikincil amin;

peptit sentezindeki (e) ve (g) aşamalarının en az bir kez gerçekleştirilmesi şartıyla.

Tercih edilen, mevcut buluşa göre işlem olup, burada (k) adımındaki amonyak, birincil amin veya ikincil amin, bir alkol ve isteğe bağlı olarak bir aprotik polar çözücü içeren bir çözücü içindedir,

Tercih edilen mevcut buluşa göre olan yöntemdir, burada adım (l) ayrıca aşağıdaki adımları içerir:

bölünmüş peptidin çözücüden çökeltilmesi;

katı reçine desteğini ve çökeltilmiş peptidi süzerek ayırma ve

peptidi izole etmek için peptidin asidik bir çözelti ile ekstraksiyonu.

Tercih edilen, birinci amino asidin Boc-L-Thr olduğu mevcut buluşa göre olan yöntemdir.

Birinci amino asidin Boc-L-Thr'nin sezyum tuzu olduğu, birinci birleştirme ürünü olarak Boc-L-Thr reçinesini verdiği ve blokajı kaldırılmış birinci birleştirme ürününün H-L-Thr reçinesi olduğu mevcut buluşa göre yöntem tercih edilir. .

Tercih edilen, adım(lar)da Boc koruma grubunu çıkarmak için kullanılan asidin trifluoroasetik asit (TFA) olduğu mevcut buluşun işlemidir.

Hemen önceki işlemle ilgili olarak tercih edilen yöntem, organik çözücünün metilen klorür, kloroform veya dimetilformamid olduğu ve peptit büyüme reaktifinin diizopropilkarbodiimid, disikloheksilkarbodiimid veya N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid olduğu yöntemdir. .

Hemen önceki usule ilişkin olarak tercih edilen usul, H-L-Thr-reçine formülüne sahip blokajı çözülmüş bir birinci bağlama ürününün oluşumundan sonra altı kez (e) ve (g) adımlarının gerçekleştirilmesini içeren bir usuldür; burada müteakip amino asitler sırayla eklendi: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ve Fmoc-L- Cys(Acm) H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçine ürününü oluşturmak için.

Hemen önceki yöntemle ilgili olarak tercih edilen yöntem, Boc-D-Nal'in H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-'e eklenmesini içeren bir yöntemdir. Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) elde etmek için adım (c)'ye göre Cys(Acm) -Tnr-reçinesi -Thr reçinesi.

Hemen önceki yöntemle ilgili tercih edilen yöntem, Boc-D--Nal-Cys(Acm) içinde D-Nal'ı koruyan Boc grubunun, Tyr'ı koruyan O-t-Bu grubunun ve Lys'i koruyan Boc grubunun aynı anda çıkarılmasını içerir. )-Tyr( O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesi, H-D- formülünün reçinesi üzerinde tamamlanmış bir peptit ürünü elde etmek için adım (i)'ye göre Nal-Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-reçine.

Hemen önceki usule ilişkin tercih edilen usul, katı reçineden H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptidinin gerçekleştirilerek bölünmesini içerir. H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesinin, bir alkol ve isteğe bağlı olarak bir aprotik polar çözücü içeren bir çözücü içinde amonyak ile reaksiyonu, büyük ölçüde eliminasyonun H-D'ye dönüşmesi için --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 .

Hemen önceki işlemle ilgili olarak tercih edilen işlem, alkolün metanol olduğu ve polar aprotik çözücünün dimetilformamid olduğu durumdur.

Hemen önceki yöntemle ilgili tercih edilen yöntem, Acm koruyucu Cys gruplarının eşzamanlı olarak çıkarılmasını ve H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D formülünün tamamlanmış peptit ürününde ortaya çıkan koruması kaldırılmış Cys kalıntılarının siklizasyonunu içerir. -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH reaksiyonunu gerçekleştirerek 2 H-D--Nal--Thr-NH2'yi vermek üzere hemen hemen tam koruma kaldırma ve siklizasyona kadar alkol içinde bir iyot çözeltisi ile.

Hemen önceki yöntemle ilgili olarak tercih edilen yöntem, peptitin H-D-Nal-Thr-NH2 olduğu yöntemdir.

Hemen önceki yöntemle ilgili tercih edilen bir yöntem, peptidin bir somatostatin analoğu olduğu yöntemdir.

Mevcut buluşun açıklamasında kullanılan terimler aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır:

"birinci amino asit": ana zincirdeki (yan zincirdeki değil) amino grubunun ticari bir ürün olan Boc tarafından korunduğu veya sıradan deneyime sahip bir kişinin bildiği yöntemlere göre sentezlenebildiği herhangi bir amino asidi kapsar. teknikte, örneğin Boc-L-Thr;

"birinci bağlantı ürünü": katı bir taşıyıcı reçineye, örneğin Boc-L-Thr reçinesine bir birinci amino asidin eklenmesinden kaynaklanan bir katı taşıyıcı reçineye eklenen bir ürünü tarif eder;

"blokesi çözülmüş birinci birleştirme ürünü": birinci birleştirme ürününden Boc grubunun çıkarılmasından veya çıkarılmasından elde edilen ürünü tarif eder - örneğin, H-L-Thr-reçine, burada "H", ana amino grubunun mevcut hidrojenidir. koruma kaldırma aşamasından kaynaklanan zincir;

"sonraki amino asit": ana zincirdeki amino grubunun ticari olarak temin edilebilen veya teknikte uzman kişilerce bilinen yöntemlere göre sentezlenebilen Boc veya Fmoc tarafından korunduğu herhangi bir amino asidi tarif eder. Adım (c) ve adım (e), adımın birden fazla kez gerçekleştirildiği bir tekrar döngüsüne dahil edilebileceğinden, adım (c) veya adım (e) her gerçekleştirildiğinde, "sonraki amino asit" bağımsız olarak şunlardan seçilebilir: ana zincirdeki amino grubunun Boc veya Fmoc tarafından korunduğu bilinen veya sentezlenmesi muhtemel amino asitler grubu;

"(X+l)-th sonraki girişin bloke edilmiş ürünü": bir sonraki amino asidin "bir sonraki katılımın bloke edilmiş ürünü" ile bağlantısının sonucu olan katı destek reçinesine bağlı ürünü tarif eder. (c) ve (d) adımları ve (e) ve (g) adımları, aşağıdaki amino asitlerin eklenebileceği tekrar eden bir döngüye dahil edilebildiğinden, "(X+1)inci sonraki bağlanmanın bloke edilmiş ürünü" terimi önceki katılım döngülerinin her birinin bir sonucu olarak elde edilen ürünü ifade eder;

"(X+1)inci sonraki erişimin bloke edilmemiş ürünü": Fmoc grubunun "(X+1)nci sonraki katılımın bloke edilmiş ürününden" çıkarılmasından kaynaklanan ürünü tanımlar;

"reçine üzerinde tamamlanmış peptit ürünü": peptit zincirine bir N-terminal amino asit eklendikten ve N-terminal amino asit omurgasının amino grubunun koruması kaldırıldıktan veya blokajı kaldırıldıktan sonra katı bir destek reçinesine bağlanan bir peptit ürününü tarif eder. , ancak yan zincirlerin fonksiyonel grupları üzerinde hala herhangi bir koruyucu gruba sahip olan, reaksiyonla çıkarılmayan, koruyucu grubun N-terminal amino asidinin ana zincirinden çıkarılmasını gerçekleştiren; ve

"koruması kaldırılmış bir reçine üzerinde tamamlanmış peptit ürünü": tüm koruma gruplarının amino asit yan zincirlerinin fonksiyonel gruplarından çıkarıldığı veya korumasının kaldırıldığı bir katı reçine desteğine bağlı bir peptit ürününü tarif eder.

Boc'un korumasını kaldırmak için kullanılabilecek asit örnekleri, trifloroasetik asit (TFA), metansülfonik asit ve HCI içeren organik çözeltilerdir.

Fmoc'un korumasını kaldırmak için kullanılabilen birincil ve ikincil aminlerin örnekleri, 4-(aminometil)piperidin, piperidin, dietilamin, DBU ve tris(2-aminoetil)amindir.

Serbest amino gruplarının (RNH3 + CF3COO) TFA tuzlarını nötralize etmek için kullanılabilecek nükleofilik olmayan bazlara örnekler (RNH3 + CF3COO - bu tuzlar, bir sonraki amino asidin eklenmesinden önce veya sırasında "serbest" aminlere (NH2) dönüştürülmelidir) , aksi takdirde ekleme gerçekleşmeyecektir) diizopropiletilamin (DIEA) ve trietilamindir (TEA).

Amino asit ekleme reaksiyonlarında kullanılabilen organik solvent örnekleri, metilen klorür, kloroform, dikloroetan, dimetilformamid, dietilasetamid, tetrahidrofuran, etil asetat, 1-metil-2-pirolidon, asetonitril veya bu solventlerin bir kombinasyonudur.

Peptid genişletici örnekleri arasında, diizopropilkarbodiimid, disikloheksilkarbodiimid veya N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid gibi ikame edilmiş karbodiimidler yer alır.

Bir peptit amid bağının oluşumuna katılan karboksil grupları ve amino grupları, sırasıyla bir "yan zincir" karboksil grubu veya amino grubu olarak adlandırılır. Öte yandan, bir peptit amid bağının oluşumuna katılmayan herhangi bir amino asit fonksiyonel grubuna "yan zincir" fonksiyonel grupları denir.

"Baz-dirençli grup" terimi, (1) baz-dirençli olan, örneğin 4-(aminoetil)piperidin, piperidin veya tris(2) gibi bazlar tarafından çıkarılamayan amino asit fonksiyonel gruplarını korumak için kullanılan koruyucu grupları belirtir. Fmoc koruma grubunu çıkarmak için yaygın olarak kullanılan bazlar olan -aminoetil)amin ve (2) trifloroasetik asit gibi bir asitle veya katalitik hidrojenasyon gibi başka bir yöntemle çıkarılabilir.

"Fmoc" ve "Boc" sembolleri burada ve ekteki formülde sırasıyla 9-fluorenilmetoksikarbonil ve t-bütiloksikarbonili belirtmek için kullanılmaktadır.

Yukarıda açıklanan yöntem, aşağıdaki formüle sahip peptitleri, tercihen Lanreotide® oktapeptit gibi somatostatin analoglarını hazırlamak için kullanılabilir: H-D--Nal--Thr-NH2. H-D--Nal--Thr-NH2 sentezlenecekse Cys, Lys ve Tyr yan zincir fonksiyonel gruplarını korumak için kullanılan baz dirençli koruma grupları sırasıyla asetamidometil (Acm), Boc ve tert-bütil olabilir. Asm, Cys'e tercih edilir.

Somatostatin analoğu ile, somatostatininkine benzer (yani agonist) veya zıt (yani antagonist) bir biyolojik aktivite sergileyen bir peptit kastedilmektedir.

H-D--Nal--Thr-NH2 formülünde, olağan üç harfli amino asit sembollerinin (örn. Lys) her biri, yapısal bir amino asit kalıntısına karşılık gelir. Örneğin, yukarıdaki formüldeki Lys sembolü -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-'yu temsil eder. D--Nal- sembolü amino asit kalıntısı D-2-naftilanilili temsil eder. Köşeli parantezler, peptiddeki iki Cys kalıntısının serbest tiollerini birbirine bağlayan bir disülfit bağını belirtir, bu da peptidin parantez içindeki amino asitlerinin bir döngü oluşturduğunu gösterir.

Burada verilen açıklamaya dayalı olarak, teknikte uzman bir kişi mevcut buluşu en iyi şekilde kullanabilecektir.

Aksi belirtilmedikçe, burada kullanılan tüm teknik ve bilimsel terimler, mevcut buluşun ilgili olduğu teknikte sıradan deneyime sahip kişiler tarafından yaygın olarak anlaşılan anlamlara sahiptir. Ek olarak, burada belirtilen tüm yayınlar, patent başvuruları, patentler ve diğer referanslar, bunlara atıfta bulunularak buraya dahil edilmiştir.

Peptit, aşağıdaki prosedüre göre mevcut buluşun yöntemine göre hazırlanabilir.

Su içinde 0.5 molar eşdeğerde sezyum karbonat çözeltisi, yavaş yavaş 1 molar eşdeğerde Boc-AA1 (Bachem California, Torrance, CA) içeren bir çözeltiye ilave edilir; burada AA1, tercihen alkolde çözünmüş C-terminal amino aside karşılık gelir. metanol. Nihai karışım, oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat karıştırıldı, ardından tüm alkol ve tüm su, kuru bir Boc-AA1 sezyum tuzu tozu verecek şekilde indirgenmiş basınç altında çıkarıldı. Merifield reçinesi, 1,0 eşdeğeri (klor-metillenmiş polistiren, 200-400 ağ, klorür iyonu katılımı 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky veya Polymer Laboratories, Church Stretton, İngiltere), tercihen diklorometan (DCM) olmak üzere klorlu bir çözücü ile yıkanır ), bir alkol, tercihen metanol ve bir polar aprotik çözücü, tercihen dimetilformamid (DMF). Sezyum tuzu Boc-AA1 tozu, susuz (kuru) polar aprotik bir çözücü, tercihen DMF içinde eritilir ve çözelti, önceden yıkanmış reçine ile birleştirilir. Bulamaç, nitrojen gibi inert bir atmosfer altında yaklaşık 45°-65°C'de, tercihen 50°-60°C'de yaklaşık 48 ila 106 saat, tercihen 85 ila 90 saat boyunca hafifçe karıştırılır. Reçine süzülerek ayrılır ve polar bir aprotik solvent, tercihen DMF, su ve son olarak MeOH gibi bir alkol ile iyice yıkanır. Boc-AA 1 reçinesi, indirgenmiş basınç altında kurutulur.

Boc-AA1-reçinesi, kaba erimiş camdan yapılmış bir filtre tabanı olan bir cam reaktöre konur. Reçine, DCM gibi klorlu bir çözücü ile yıkanır, organik bir asitle, tercihen DCM'de %25 TFA ile blokajı giderilir, DCM gibi klorlu bir çözelti ve MeOH gibi bir alkolle kısaca yıkanır, tercihen trietilamin gibi bir organik bazla nötralize edilir. DCM ve koruması kaldırılmış bir AA 1 reçinesi vermek üzere tekrar DCM ve DMF gibi bir polar aprotik çözücü ile yıkandı.

Arzu edilen herhangi bir sayıda amino asit daha sonra isteğe bağlı olarak koruması kaldırılmış AA 1 reçinesine bağlanır. Bir sonraki amino asit, Fmoc korumalı (Fmoc-AA x) bir a-amino grubuna sahipse, yan zincir grubu koruma gerektirmez (örneğin, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe veya Fmoc- Thr) veya yan zincir baz dirençli bir grup ile koruma sağlar. Fmoc-AAx'in molar fazlalığı (burada x, peptitteki amino asidin C-terminalinden sayılan konum sayısıdır), diizopropilkarbodiimid gibi bir peptit büyüme reaktifi ile koruması kaldırılmış AA1 reçinesine yaklaşık 60 dakika süreyle eklenir (DIC), bir DCM/DMF karışımı içinde. İlave reçine, bir Fmoc-AAx-AA1 reçinesi verecek şekilde DMF, alkol ve DCM ile yıkandı. Ataşman Kaiser ninhidrin yöntemi ile kontrol edilebilir. Daha sonra, Fmoc-AAx-AA1 reçinesi bir kez DMF ile yıkanır ve ardından bir AAx-AA1 reçinesi elde etmek için DMF içindeki piperidin gibi organik bir çözücü içindeki bir baz çözeltisiyle blokajı giderilir. AAx-AA1 reçinesi daha sonra DMF ile yıkanır, ardından birkaç kez hem MeOH hem de DCM gibi bir alkolle yıkanır. AAx-AA1 reçinesi daha sonra bir kez DMF ile yaklaşık 3 dakika, üç kez izopropanol ile, tercihen her seferinde yaklaşık 2 dakika ve üç kez DCM ile, tercihen her seferinde yaklaşık 2 dakika yıkanır. Reçine daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi Fmoc korumalı bir amino asidin veya aşağıda tarif edildiği gibi Boc korumalı bir amino asidin daha fazla eklenmesi için hazırdır.

Benzer şekilde, koruması kaldırılmış AA 1 reçinesine eklenecek sonraki herhangi bir amino asit, korumalı bir Boc-amino grubu (Boc-AAx) ile seçilirse, o zaman ya yan zincir grubu için koruma gerekli değildir (bu, Boc-Gly olabilir) , Boc-Ala, Boc-Phe veya Boc-Thr) veya yan zincir, Boc-Cys(Acm) olabilecek hem asit hem de baz tarafından uzaklaştırılmaya dirençli bir grupla korunmalıdır. Boc-AAx seçilirse, yukarıda Fmoc-amino asitler için açıklananla aynı reaktifler ve çözücüler kullanılarak bağlanır ve bağlanmanın eksiksizliği (tamamlanması) Kaiser ninhidrin yöntemiyle kontrol edilebilir. Daha sonra Boc-AAx-AAı reçinesinin koruması, bir CF3CO-H + -AAx-AA1 reçinesi verecek şekilde DCM'deki TFA gibi bir organik çözücü içindeki bir asit solüsyonuyla kaldırılır. Bu reçine daha sonra birkaç kez DCM gibi klorlu bir solventle, MeOH gibi bir alkolle yıkanır ve DCM'de trietilamin gibi nükleofilik olmayan bir bazla nötralize edilir ve daha sonra DCM gibi klorlu bir solventle birkaç kez daha yıkanarak elde edilir. AA x -AA 1 - reçine. Reçine daha sonra, yukarıda tarif edildiği gibi korumalı Boc veya Fmoc amino asidinin daha fazla eklenmesi için hazırdır.

Peptidin istenen sekansına ve kullanılan a-amino korumalı amino asit tipine (Fmoc korumalı veya Boc korumalı) bağlı olarak, hangi amino asidin içinde yer alacağına bağlı olarak yukarıdaki bağlanma prosedürlerinin uygun bir kombinasyonu kullanılır. peptit dizisi - yan zincir, ya Fmoc'u a-amino grubundan çıkarmak için gerekli bazla ya da Boc'u a-amino grubundan çıkarmak için gerekli asitle çıkarılabilen bir koruyucu gruba sahiptir. Böyle bir korumalı amino asit, N-p-Boc-N"-p-Fmoc-lizin veya N-p-Fmoc-N"-p-Boc-lizin olabilir. Durum buysa, sonraki amino asitlerin a-amino grupları için N-terminal amino aside kadar tüm seçilebilir koruma grupları, o pozisyon için seçilen yan grup koruması ile uyumlu olmalıdır. Bu, yan zincir koruma gruplarının, sonraki amino asitlerin a-amino gruplarının korumasını kaldırmak için kullanılan blokaj giderici maddeye dirençli olması gerektiği anlamına gelir. N-terminal amino asidi için, a-amino koruması olarak Boc veya Fmoc kullanılabilir, çünkü N-terminal amino asidin korumasının kaldırılması, peptit sentezi stratejisini istenmeyen bir şekilde etkilemeden, korunan bazı yan zincirlerin korumasını aynı anda kaldırabilir, çünkü hiçbir amino asitler artık kullanılabilir.eklenir.

Hala reçineye bağlı olan tamamlanmış peptit zincirinin koruması kaldırılmalı ve serbest bırakılmalıdır. N-terminal amino asidin tüm baza dirençli koruma gruplarını ve a-amino bloke edici grubunu çıkarmak için, eğer uygulanabiliyorsa, reçine üzerindeki peptit, DCM'de TFA gibi bir organik çözücü içinde bir asitle işlenir. Varsa, aside dirençli koruma gruplarını ve N-terminal amino asidin a-amino bloke edici grubunu çıkarmak için, reçine üzerindeki peptit, DMF'de piperidin gibi bir organik baz ile işlenir. Alternatif olarak, aside dirençli gruplar, peptitin amonyak veya bir amin bazı ile müteakip klevajı üzerine ayrılana kadar tutulabilir. Koruması kaldırılmış reçine üzerindeki peptit daha sonra DCM gibi klorlu bir solvent ve MeOH gibi bir alkol ile yıkanır ve düşük basınç altında sabit ağırlığa kadar kurutulur.

Peptit reçineden ayrılır ve C-terminali, peptitin reçine üzerinde 3:1 MeOH/DMF içinde süspanse edilmesiyle amide dönüştürülür. Bulamaç, bir nitrojen atmosferi altında yaklaşık 10°C'nin altındaki bir sıcaklığa soğutulur ve sıcaklık yaklaşık 10°C'nin altında tutulurken, çözelti onunla doyana kadar çözücünün yüzeyinin altına susuz amonyak gazı verilir. Bulamaç, sıcaklığın yaklaşık 20°C'ye yükselmesine izin verilirken yaklaşık 24 saat hafifçe karıştırılır. Reaksiyonun tamamlanma derecesi, peptit tipine bağlı olarak uygun koşullar altında HPLC'de metil ester ara ürününün kaybolmasıyla kontrol edilir. Reaksiyon karışımı soğutulur ve HPLC'de metil estere karşılık gelen pik alanı, istenen ürünün pik alanının %10'undan az olana kadar gerekli miktarda susuz amonyak ilave edilir. Bulamaç yaklaşık 10°C'nin altına soğutulur ve peptidi çökeltmek için gece boyunca karıştırmaya devam edilir. Çökelti ve reçine süzülerek ayrılır ve soğuk MeOH ile yıkanır. Çökelti ve reçine, indirgenmiş basınç altında kurutulur, ürün, sulu bir asetik asit çözeltisi ile reçineden çıkarılır.

Peptit, sekansında korumalı Cys tortuları içeriyorsa, tiyol gruplarının koruması kaldırılabilir ve tortular, aşağıdaki prosedüre göre siklize edilebilir. Cys'in korumalı Asm gruplarını içeren peptit, nitrojen atmosferi altında sulu bir asetik asit çözeltisi içinde çözülür. Çözelti hızla karıştırılır ve alkol içinde bir iyot çözeltisi bir kısım halinde ilave edilir. Karışım karıştırılır ve tam koruma kaldırma için HPLC ile kontrol edilir. Daha sonra %2 sodyum tiyosülfat çözeltisi ile çözeltinin rengi kaybolana kadar titrasyon yapılarak reaksiyon durdurulur. Ham karışım, 0.1 amonyum asetat tamponu içindeki bir asetonitril gradyanı ile bir C8 kartuşu üzerinde hazırlayıcı kromatografi ile saflaştırıldı, 0.25 N asetik asit içindeki bir asetonitril gradyanı ile bir C8 kartuşu üzerinde tuzu giderildi ve hedef peptidi vermek üzere liyofilize edildi.

Buluşun örnek bir düzenlemesi

Aşağıdaki örnek, mevcut buluşun yöntemini açıklamak için sağlanmıştır ve kapsamını sınırladığı şeklinde yorumlanmamalıdır.

Örnek 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2

A) Boc-L-Thr-reçine

2.5 ml su içinde 2.58 gr sezyum karbonat solüsyonu, 7 ml metanol içerisinde çözülmüş 3.48 gr Boc-L-treonin (Bachem California, Torrance, CA) solüsyonuna yavaşça ilave edildi. Nihai karışım, oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat karıştırıldı, ardından tüm metanol ve tüm su, kuru bir Boc-L-treonin sezyum tuzu tozu verecek şekilde indirgenmiş basınç altında çıkarıldı. 10 g Maryfield reçinesi (klorometillenmiş polistiren, 200-400 ağ, klor katılması 1.3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky), diklorometan (DCM), metanol (MeOH) ve dimetilformamid (DMF) (her biri 2 kez 70°C) ile yıkandı. ml). Boc-L-treonin sezyum tuzu tozu, 60 ml kuru DMF içinde eritildi ve çözelti, yukarıdaki gibi yıkanmış reçine ile birleştirildi. Bulamaç, bir nitrojen atmosferi altında yaklaşık 85 ila 90 saat boyunca yaklaşık 50°-60°C'lik bir sıcaklıkta hafifçe karıştırıldı. Reçine, süzülerek ayrıldı ve DMF, deiyonize su ve son olarak MeOH ile iyice yıkandı. Boc-treonin reçinesi, yaklaşık 40°C'de indirgenmiş basınç altında kurutuldu. Treoninin dahil edilmesi 0.85±0.15 meq/g kuru reçine idi.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-reçine

Adım (A)'daki Boc-treonin reçinesinin 2,0 g'ı, kaba erimiş cam filtre tabanına (yük 1,74 mmol) sahip 50 ml'lik bir cam reaktöre kondu. Reçine 2 kez DCM (20 mi) ile her seferinde yaklaşık 5 dakika yıkandı, DCM (30 mi) içinde %25 TFA ile bloke edildi - ilk kez yaklaşık 2 dakika ve ikinci kez yaklaşık 25 dakika, yıkandı 3 DCM (20 mi), izopropanol (20 mi) ve DCM (20 mi), DCM (20 mi) içinde %10 trietilamin ile yaklaşık 5 dakika boyunca iki kez nötralize edildi, 3 kez yaklaşık 2 dakika yıkandı DCM ile ve bir kez yaklaşık 5 dakika DMF (20 mi) ile yıkandı.

Blokajı kaldırılan reçineye 14 litrede 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 eşd.) Fmoc-L-sistein(Acm) (Bachem, CA) ve 683 ul (4,35 mmol, 2,5 eşd.) diizopropil-karbodiimid (DIC) ilave edildi. ml 2:1 DCM/DMF yaklaşık 1 saat ilave edildikten sonra, reçine bir kez yaklaşık 3 dakika DMF (20 mi) ile, 3 kez yaklaşık 2 dakika 2 dakika DXM (20 mi) ile yıkandı. Bağlanma, Kaiser nihidrin yöntemiyle kontrol edildi.

Bağlandıktan sonra, reçine 1 kez DMF ile yıkandı ve ardından DMF içinde bir piperidin çözeltisi ile bloke edildi. Blokajı kaldırılan reçine daha sonra DMF ile yıkandı ve birkaç kez aynı anda MeOH ve DCM ile yıkandı. Bağlama reçinesi 1 kez yaklaşık 3 dakika DMF (20 mi), 3 kez yaklaşık 2 dakika izopropanol (20 mi) ve 3 kez DCM (20 mi) ile her seferinde yaklaşık 2 dakika yıkandı. Bağlanma, Kaiser ninhidrin yöntemiyle test edildi.

Aşağıdaki korumalı amino asitlerin her biri, DMF/DCM içinde DIC kullanılarak yıkanmış reçineye bağlandı ve yukarıda açıklandığı gibi aşağıdaki sırayla serbest bırakıldı: Fmoc-L-valin, Fmoc-L-lizin(Boc), Fmoc-D-triptofan, Fmoc-L-tirozin (O-t-Bu) ve Fmoc-L-sistein (Acm) (tümü Bachem California'dan), Boc-D-2-naftilalanin (Synthethech, Albany, OR).

Tamamlanan peptit zinciri bloke edildi ve iki kez 75:20:5 DCM/TFA/anisol (30 mi) ile yaklaşık 2 dakika ve yaklaşık 25 dakika süreyle korundu, her seferinde DCM (20 mi), izopropanol ile 3 kez yaklaşık 2 dakika süreyle yıkandı (10 mi) ve DCM (20 mi), DCM (20 mi) içinde %10 trietilamin ile 2 kez yaklaşık 5 dakika nötralize edildi ve DCM (20 mi) ve MeOH (20 mi) ile 3 kez yaklaşık 2 dakika yıkandı. Reçine, indirgenmiş basınç altında kurutuldu. Kuru ağırlık 3.91 gr (teorik verimin %103'ü) olmuştur.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

Adım (B)'deki peptit yüklü reçinenin 2.93 g'ı (1.3 mmol-eşd.), 50 ml 3:1 MeOH/DMF karışımı içinde süspanse edildi. Bulamaç, bir nitrojen atmosferi altında yaklaşık 10°C'nin altındaki bir sıcaklığa soğutuldu ve kuru amonyak gazı, sıcaklık yaklaşık 10°C'nin altında tutulurken çözelti onunla doyana kadar temizlendi. Bulamaç yaklaşık 24 saat hafifçe karıştırılarak sıcaklığın yaklaşık 20°C'ye yükselmesi sağlandı. Reaksiyonun tamamlanma derecesi, HPLC (VYDAC® sorbent, tane boyutu 5 um, gözenek boyutu 100 Å, C18, izokratik koşullar altında elüsyon) %0.1 TFA içinde %26 CH3CN, kullanılarak metil ester ara ürününün kaybolmasıyla kontrol edildi. hız 1 ml/dk, 220 mm'de kayıt; bu koşullar altında geciktirme süresi Rt metil ester için ~ 14 dk ve amid ürünü için ~ 9.3 dk). Reaksiyon karışımı soğutuldu ve HPLC'de metil estere karşılık gelen pik alanı, istenen ürünün pik alanının %10'undan az olana kadar fazla miktarda susuz amonyak ilave edildi. Bulamaç, yaklaşık 10°C'nin altındaki bir sıcaklığa soğutuldu, peptidi çökeltmek için gece boyunca karıştırmaya devam edildi. Çökelti ve reçine, süzülerek ayrıldı ve 15 ml soğuk MeOH ile yıkandı. Çökelti ve reçine, indirgenmiş basınç altında kurutuldu, ürün, %50 sulu asetik asit çözeltisi (3 x 30 mi) ile reçineden çıkarıldı. HPLC analizi, karışımda (izokratik HPLC sisteminde %96 saf) 870 mg (0.70 mmol) başlık ürünü gösterdi.

D) H-D- -Nal--Thr-NH 2

Adım (B)'den 500 mg (0.40 mmol) peptit, 300 ml %4 asetik asit içinde eritildi ve nitrojen altında yaklaşık 55°C'ye ısıtıldı. Solüsyon hızla karıştırıldı ve 7.7 ml MeOH (0.60 mmol) içindeki %2 w/v iyodin solüsyonu tek kısım halinde ilave edildi. Karışım yaklaşık 15 dakika karıştırıldı, ardından reaksiyon, renk kaybolana kadar (~2 mi) %2 sodyum tiyosülfat çözeltisi ile titrasyonla durduruldu. Karışım, oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve süzüldü. Karışım, 0.1 M amonyum asetat içinde bir asetonitril gradyanı ile bir C8 kolonu (YMC, Inc., Wilmington, NC) üzerinde hazırlayıcı kromatografiyle arıtıldı, bir C8 YMC kolonu üzerinde 0.25 N asetik asit içinde bir asetonitril gradyanı ile tuzu giderildi ve ve %99 saflıkta 350 mg hedef peptit verecek şekilde liyofilize edildi.

Yukarıdaki açıklamaya dayanarak, teknikte uzman bir kişi, mevcut buluşun temel özelliklerini kolayca tanıyabilir ve ruhundan ve kapsamından ayrılmadan, buluşu çeşitli uygulama ve koşullara uyarlamak için çeşitli değişiklikler ve modifikasyonlar yapabilir. Dolayısıyla buluşun diğer düzenlemeleri de istemler kapsamındadır.

İDDİA

1. H-D--Nal--Thr-NH2 formülüne sahip bir peptit hazırlamak için bir yöntem olup, adı geçen yöntem aşağıdaki adımları içerir:

(a) bir "birinci bağlama ürünü" oluşturmak üzere bir birinci amino asidin bir katı destek reçinesine bir eter bağıyla bağlanması, (i) sulu bir sezyum karbonat çözeltisinin birinci amino asidin alkollü bir çözeltisiyle reaksiyona sokularak birinci amino asidin sezyum tuzu, (ii) birinci amino asidin çözücüsüz bir sezyum tuzunun elde edilmesi, (iii) katı destek reçinesinin birinci amino asidin sezyum tuzu ile susuz bir polar aprotik çözücü içinde reaksiyona sokularak bir "ilk eklenen ürün",

burada birinci amino asit, bu peptidin C-terminal amino asidine karşılık gelen Boc-L-Thr'dir ve katı ortam reçinesi, bir klorometillenmiş polistiren reçinesidir;

(b) bir "koruması kaldırılmış birinci ilave ürün" oluşturmak için Boc'un birinci ilave üründen bir asitle korumasının kaldırılması;

(c) İsteğe bağlı olarak, "bir sonraki amino asidin", peptit büyüme reaktifini içeren bir organik çözücü içinde "bir sonraki amino asidin" "blokajı kaldırılmış ilk bağlanma ürünü" ile reaksiyona sokulmasını içeren "bir sonraki amino asidin" eklenmesi. “bloke sonraki amino asit ürünü”. ilave" ve "sonraki amino asit", ana zincirde Boc tarafından bloke edilen bir amino grubuna sahiptir ve eğer bu "sonraki amino asit", yan zincirde bir veya daha fazla fonksiyonel gruba sahipse, o zaman yan zincirdeki fonksiyonel gruplar koruma gerektirmez veya yan zincirdeki bu fonksiyonel gruplar, sırasıyla Boc ve Fmoc gibi asidik veya alkalin koruma kaldırma maddelerine karşı kararlı koruyucu gruplara sahiptir;

(d) "bloke edilmiş sonraki ürün"ün bir "bloke edilmiş sonraki ürün" elde etmek için bir asitle reaksiyona sokulmasını içeren "bloke edilmiş sonraki ürün"den Boc'un korumasının kaldırılması;

(e) isteğe bağlı olarak, (c) ve (d) adımlarının tekrarlanması, her döngünün "(X+1)inci sonraki bağlantının blokajı kaldırılmış bir ürününü" üretmesi, burada X, istenen döngü tekrarlarının sayısıdır;

(e) "sonraki amino asidin" (b) adımındaki "blokajı kaldırılmış ilk bağlantı ürününe" veya isteğe bağlı olarak, adım (e)'deki "(X+l)inci sonraki bağlantının blokajı kaldırılmış ürününe" eklenmesi; peptidi büyütmek için bir reaktif içeren bir organik çözücü içinde "bir sonraki amino asit" reaksiyonunun belirtilen "ilk bağlantının bloke edilmiş ürünü" veya belirtilen "(X + 1)inci bağlantının bloke edilmiş ürünü" ile gerçekleştirilmesini içerir "bloke edilmiş bir sonraki bağlanma ürünü" elde etmek için ve bu "sonraki amino asit", bir Fmoc bloke edilmiş ana zincir amino grubuna sahiptir, şu şartla ki, "sonraki amino asit" yan zincirde bir veya daha fazla fonksiyonel gruba sahipse, o zaman fonksiyonel gruplar yan zincirde koruma gerekmez veya yan zincirdeki fonksiyonel gruplar, Fmoc'un korumasını kaldırmak için kullanılan alkali reaktiflere dirençli koruma gruplarına sahiptir;

(g) "bloke edilmiş sonraki ürün" Fmoc'un korumasının kaldırılması, buna "bloke edilmiş sonraki ürün"ün bir "blokesi kaldırılmış sonraki ürün" elde etmek için bir birincil veya ikincil amin ile reaksiyona sokulması dahildir;

(h) isteğe bağlı olarak, (e) ve (g) adımlarının tekrarlanması, her bir döngünün "(X+1)inci sonraki ataşmanın bloke edilmiş ürününü" üretmesi, burada X, döngü tekrarlarının istenen sayısıdır. peptit ve sondan bir önceki amino asit salınır;

(i) N-terminal amino asidin "sonraki (X+1)inci katılımın blokajı kaldırılmış ürünü" ile reaksiyona sokulmasını içeren "(X+1)'inci katılımın bloke edilmiş ürünü"ne bir N-terminal amino asit eklenmesi bir "bloke edilmiş tam bağlanma ürünü" oluşturmak üzere bir peptitin uzatılması için bir reaktif içeren bir organik solvent içinde erişim", burada "N-terminal amino asit", Boc veya Fmoc tarafından bloke edilmiş bir omurga amino grubuna sahiptir;

(j) reçine üzerinde tamamlanmış peptit ürününü oluşturmak için "bloke edilmiş tamamlanmış ürün"ün Boc durumunda bir asit veya Fmoc durumunda bir baz ile reaksiyona sokulmasını içeren "bloke edilmiş tamamlanmış ürün"den Boc veya Fmoc'un korumasının kaldırılması;

(j) "reçine sonlu peptit ürününün" yan zincir fonksiyonel gruplarına sahip olması durumunda, isteğe bağlı olarak "reçine sonlu peptit ürünü" yan zincir fonksiyonel gruplarının korumasının kaldırılması, buna "reçine sonlu peptit ürünü"nün uygun koruma kaldırma reaktifleri ile reaksiyona sokulması dahildir "koruması kaldırılmış bir reçine üzerinde tam bir peptit ürünü" üretmek; ve

(k) peptitin "reçine üzerinde bitmiş peptit ürünü"nün veya "korumasız reçine üzerinde nihai hale getirilmiş peptit ürünü"nün katı reçine taşıyıcısından ayrılması, "reçine üzerinde bitmiş peptit ürünü" veya "bitmiş peptit ürününün" reçine üzerinde reaksiyona sokulmasını içeren bir peptit elde edilmesi reçine"; koruması kaldırılmış reçine", peptitin reçineden ayrılması neredeyse tamamlanana kadar amonyak, bir birincil amin veya ikincil bir amin ile;

peptit sentezindeki (e) ve (g) adımlarının, sonraki amino asitlerin eklendiği H-L-Thr-resin formülünün "ilk bağlanmanın bloke edilmiş ürünü"nün oluşumundan sonra altı kez gerçekleştirilmesi koşuluyla sıralama: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ve Fmoc-L-Cys( Acm) H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçine oluşturmak için.

2. İstem l'e göre yöntem olup, burada (k) adımındaki amonyak, birincil amin veya ikincil amin, bir alkol ve isteğe bağlı olarak bir aprotik polar çözücü içeren bir çözücü içindedir.

3. İstem 1'e göre yöntem olup, burada adım (l) ayrıca aşağıdaki adımları içerir:

(i) çözücüden ayrılan peptidin çökeltilmesi;

(ii) katı reçine desteğinin ve çökeltilmiş peptitin filtrelenmesi ve

(iii) peptidi izole etmek için peptidin asidik bir solüsyonla ekstrakte edilmesi.

4. İstem 1 ila 3'ten herhangi birine göre yöntem olup, burada birinci amino asit, Boc-L-Thr'nin sezyum tuzudur ve birinci bağlama ürünü olarak Boc-L-Thr reçinesini ve "debloke edilmiş birinci bağlama ürününü" verir. ", H-L-Thr-reçinesidir.

5. İstem 4'e göre yöntem olup, burada adım (i)'de Boc koruma grubunu çıkarmak için kullanılan asit trifloroasetik asittir (TFA).

6. Organik çözücünün metilen klorür, kloroform veya dimetilformamid olduğu ve peptit büyütme reaktifinin diizopropilkarbodiimid, disikloheksilkarbodiimid veya N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid olduğu, istem 5'e göre yöntem.

7. İstem 6'ya göre yöntem, Boc-D-Nal'in H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesine eklenmesini içerir. Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesini elde etmek için adım (i)'ye göre.

8. Boc-D--Nal-Cys(Acm)-'de D--Nal'ı bloke eden Boc grubunun, Tyr'ı koruyan O-t-Bu grubunun ve Lys'i koruyan Boc grubunun aynı anda çıkarılmasını içeren, istem 7'ye göre yöntem. Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesi, H-D--Nal-Cys formülünün reçinesi üzerinde tamamlanmış bir peptit ürünü elde etmek için adım (d)'ye göre (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-reçine.

9. İstem 8'e göre yöntem olup, özelliği, H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptidinin katı reçineden H-D- reaksiyonunu gerçekleştirerek ayrılmasını içermesidir. -Nal-Cys( Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-reçinesi, bir alkol ve isteğe bağlı olarak bir aprotik polar çözücü içeren bir çözücü içinde amonyak ile, H-D--Nal verecek şekilde büyük ölçüde tamamen elimine edilene kadar -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 .

10. İstem 9'a göre işlem olup, bu işlemde, alkol metanol ve polar aprotik çözücü dimetilformamiddir.

11. İstem 10'a göre yöntem olup, aynı anda Cys'i koruyan Acm gruplarının çıkarılmasını ve H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D formülünün "reçine üzerindeki tam peptit ürünü"nde ortaya çıkan koruması kaldırılmış Cys kalıntılarının siklize edilmesini içerir. -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH reaksiyonunu gerçekleştirerek 2 H-D--Nal--Thr-NH2 verecek şekilde korumanın kaldırılmasını ve siklizasyonu büyük ölçüde tamamlamak için alkol içinde bir iyot çözeltisi ile.

Katı faz peptit sentezi, Rockefeller Üniversitesi'nden R. B. Merrifield tarafından önerildi (Nobel Ödülü 1984). Bu yöntem, korunan a-amino ve yan gruplar ile amino asit kalıntılarının ardışık olarak eklenmesiyle bir peptitin çözünmez bir polimerik destek üzerinde birleştirilmesine dayanır. Plan, peptit zincirini, zincirin bir ucu sentez sırasında katı bir desteğe bağlı olacak şekilde aşamalı olarak birleştirmekti. Sonuç olarak, ara ve hedef peptid türevlerinin izolasyonu ve saflaştırılması, çözelti içinde kalan tüm fazla reaktifleri ve yan ürünleri çıkarmak için katı polimerin basit bir filtrasyonuna ve iyice yıkanmasına indirgenmiştir.

Katı faz terimi daha çok taşıyıcı üzerindeki maddenin fiziksel özelliklerini ifade eder, çünkü polimer taşıyıcı üzerindeki kimyasal reaksiyon bir fazda - çözelti içinde ilerler. Uygun bir çözücü içinde, polimer şişer, düşük viskoziteli ancak yüksek düzeyde yapılandırılmış bir jele (çapraz bağlı polimerler) dönüşür veya çözünür (çapraz bağlı olmayan polimerler söz konusu olduğunda) ve sentez işlemi ultramikroheterojen bir seviyede, pratik olarak gerçekleşir. homojen sistem

Katı fazlı organik sentez, bir polimer baz - reçine gerektirir S bağlayıcının bağlı olduğu L. ilk aşamada bağlayıcıya bir substrat molekülü bağlanır ANCAK.Molekül ANCAK immobilize (yani mobil olmayı bırakır), ancak başka bir reaktifle reaksiyona girme yeteneğini korur AT(2. aşama).

Ürün AB reçine üzerinde kalarak fazla reaktiften ayrılmasını sağlar AT(ve yan ürünler) basit yıkama ile. (Orijinal substratı art arda karmaşıklaştıran tüm yeni reaktifleri ekleyebilirsiniz. ANCAK, asıl mesele, bağlayıcının bu reaksiyonlarda değişmeden kalmasıdır). iki işlevli bağlayıcı L reçine ile bağlantısı olacak şekilde seçilir. S alt tabakadan daha dayanıklıydı ANCAK. Daha sonra son aşamada hedef bileşik AB reçineden ayrılarak bağlayıcı ile bağlantısını bozabilir. Açıktır ki, bağlantı L-ABılımlı koşullar altında bileşiğe zarar vermeden ayrılmalıdır (bağ ANCAK-AT), ne de bağlayıcının reçine ile teması (bağ L-S).

Böylece ideal olarak her aşamadan sonra reçinenin yıkanması ve taşıyıcı ile bağın kırılması ile saf bir madde elde edilir. Birçok durumda büyük miktarda reaktif kullanımının ve ardından reçineden ayrılmanın, kimyasal dengeyi hedef ürünün oluşumuna doğru kaydırmayı ve sentez süresini kısaltmayı mümkün kıldığını varsaymak doğaldır. Katı fazlı organik sentezin dezavantajları, yeterince fazla miktarda (2-30 eşdeğer) reaktif kullanma ihtiyacı, ara sentez ürünlerinin tanımlanmasındaki zorluklar ve maliyet tarafından belirlenen modifiye polimer desteklerin nispeten yüksek maliyetidir. bağlayıcı.

Merrifield tarafından organik sentez pratiğine dahil edilen, Merrifield reçinesi olarak adlandırılan klorometil polistiren (az miktarda divinilbenzen ile çapraz bağlanmış), polimer taşıyıcıların en erişilebiliridir.

Katı faz peptit sentezinin metodolojisi ve ana aşamaları

Eldeki görev, aşılanmış bir amino asit ile bir polimer taşıyıcının ikame için aktive edilmiş bir heterosikl ile reaksiyona sokulmasını gerektirir. Polimerik taşıyıcılar üzerinde hareketsizleştirilmiş amino asitler elde etmenin metodolojik yönünü daha ayrıntılı olarak ele alalım.

Sahne1. N korumalı bir amino asidin bir polimer taşıyıcı üzerinde immobilizasyonu.

Şemamızın ilk aşaması, amino asidin bir polimer taşıyıcı üzerinde immobilizasyonudur. Oligopeptitlerin oluşumu gibi yan süreçlerden kaçınmak için amino asit önceden korunur. Tipik olarak, N-korumalı amino asitler kullanılır ve amino asit ile taşıyıcı arasında ortaya çıkan bağ, amid veya ester tipindedir.

Katı faz organik sentezde en sık kullanılan amino grubu korumaları, karbamat tipi koruma grupları tert-bütoksikarbonil (Boc) ve 9H-florenilmetoksikarbonil korumadır (Fmoc), X, korunan gruptur:

Koruma grubu seçiminin, kullanılan polimer taşıyıcı tipine göre belirlendiğine dikkat edilmelidir. Korunan amino asitlerin immobilizasyon koşulları, farklı polimerik taşıyıcı tipleri için farklıdır. Boc-amino asitlerin klorometillenmiş bir polistiren olan Merrifield reçinesi üzerinde immobilizasyonu gerçekleştirilir. yerinde dimetil ftalat (DMF) içinde bir sezyum karbonat süspansiyonu ve katalitik miktarlarda potasyum iyodür ilavesiyle sezyum tuzları olarak. Taşıyıcı miktarına göre reaktif fazlalığı her durumda ayrı ayrı seçilir ve 1.5-4 eşdeğerdir.

Bir benzil tipi ester bağlayıcı oluşturmak için bir Wang (X=O) polimer taşıyıcı üzerinde Fmoc-amino asitlerin immobilizasyonu, 4-(dimetilamino)piridin (DMAP) varlığında diizopropilkarbodiimid (DIC) kullanılarak karbodiimid yöntemiyle gerçekleştirilir. bir katalizör olarak. Sterik olarak engellenmemiş amino asitlerle immobilizasyon reaksiyonu, oda sıcaklığında ilerler. Sterik olarak engellenmiş amino asitlerin immobilizasyonu, reaksiyonun 40–60°C'de 2 gün boyunca yürütülmesini ve immobilizasyonun tekrarlanmasını gerektirir (Şema 1). - Benzhidril tipi bir amid bağlayıcı oluşumu ile bir Rink polimer taşıyıcı (X=NH) üzerindeki amino asitler, bir Castro reaktifi (1H-1,2,3-benzotriazol-1-iloksi) varlığında gerçekleştirilir. tris Katalizör olarak -(dimetilamino)fosfonyum hekzaflorofosfat (BOP), diizopropiletilamin baz (DIEA) ve 1-hidroksibenzotriazol (HOBt). Reaksiyon oda sıcaklığında sterik olarak engellenmemiş amino asitler için 2 saat ve sterik olarak engellenmiş amino asitler için 4-6 saat sürer.

2. aşamaBir Polimer Taşıyıcı Üzerinde Korumalı Bir Amino Asidin Korumasının Kaldırılması

Tarafımızdan planlanan ikinci aşamada (korumalı amino asidin immobilizasyonundan sonra) amino grubunu aktif hale getirmek için koruyucu grubun çıkarılması gerekmektedir. Boc ve Fmoc korumasını kaldırma yöntemleri farklıdır. Merrifield reçinesi üzerindeki amino asitlerin Boc korumasının çıkarılması, diklorometan içinde %50 trifloroasetik asit ile yarım saat süreyle gerçekleştirilir, bu koşullar altında Merrifield bağlayıcı bozulmadan kalır.

Korumanın kaldırılmasından sonra reçine, trifloroasetik asidi çıkarmak için bir trietilamin solüsyonu ile yıkanır. Wang (X=O) ve Rink (X=NH) taşıyıcıları üzerindeki amino asitlerin Fmoc korumasının çıkarılması, 40-50 dakika boyunca DMF içinde %20'lik bir piperidin çözeltisi ile gerçekleştirilir.

Fmoc koruması kaldırıldıktan sonra reçine ağırlığında önemli bir azalma, katı faz sentezinin ilk aşamasında korumalı amino asitlerin immobilizasyon derecesinin gravimetrik olarak belirlenmesi için bir temel olarak hizmet edebilir. Reçinenin dimetil ftalat içinde bir piperidin çözeltisi ile önce 5-10 dakika, ardından taze bir çözelti içinde 30 dakika sırayla işlenmesi önerilir. Korumanın kaldırılmasından sonra reçine, Fmoc korumasının tahrip edici ürünlerini çıkarmak için en az 4 kez dimetil ftalat ile yıkanır. Taşıyıcı üzerindeki asilasyon reaksiyonunun ilerleyişini izlemek veya amino grubundan koruyucu işlevi kaldırmak Kaiser testi ile mümkündür.

Sahne 3Bir destek üzerinde immobilize edilmiş bir amino asidi içeren heterosikllerde nükleofilik sübstitüsyon

Pratik uygulama için tarafımızca planlanan bir sonraki aşama, aromatik nükleofilik ikame reaksiyonudur; aşılanmış amino asit, nükleofil görevi görür ve aktifleştirilmiş heterosikl, çözelti halindedir. Desteklerdeki nükleofilik yer değiştirme reaksiyonlarının çoğu, performans açısından sıvı fazdaki reaksiyonlardan farklı değildir. Bununla birlikte, işlem sıcaklığının, üzerinde taşıyıcının polistiren bazının parçalanmaya başladığı 120 С'yi geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır. Taşıyıcı üzerinde gerçekleştirilen reaksiyon koşulları altında bağlayıcı da korunmalıdır.

Uygun aktive edilmiş heterosiklik substratları seçerken, heterosikldeki ayrılan grubun doğası dikkate alınmalıdır.

Aşama 4Hedef bileşiğin polimerik taşıyıcılardan uzaklaştırılması

Katı faz organik sentezdeki çoğu bağlayıcı, asidik bir ortamda parçalanır. Bağlayıcıların aside direnci, Merrifield reçinesinden Wang ve Rink reçinesine geçerken keskin bir şekilde düşer. Rink bağlayıcı, Wang bağlayıcıdan (%50 CF3COOH) daha yumuşak koşullar altında (%10-20 CF3COOH) ayrılır.Merrifield reçinesi bu koşullar altında pasiftir ve onu parçalamak için NaOMe/MeOH çözeltisinde transesterifikasyon kullanılır ve bu da oluşumuna yol açar. bir asit esteri.

Bağlayıcının doğasının, substrattan ayrılan oluşturulmuş moleküldeki terminal fonksiyonunun tipini belirlediğini bir kez daha hatırlayalım. Wang'ın reçinesi asitleri ve Rink'in reçinesi - amidleri elde etmenizi sağlar.

Bu katı faz peptit sentezi şemasının avantajları:

1. Çeşitli ana bileşikler, bireysel boncuklarla ilişkilendirilebilir. Bu granüller daha sonra karıştırılır ve böylece tüm başlangıç ​​bileşikleri, bir deneyde reaktif ile etkileşime girebilir. Sonuç olarak, ayrı granüller üzerinde reaksiyon ürünleri oluşur. Çoğu durumda, geleneksel sıvı kimyada ham maddelerin karıştırılması genellikle başarısızlıklara yol açar - ürünlerin polimerizasyonu veya yapışkanlaşması. Katı bir substrat üzerinde yapılan deneyler, bu etkileri ortadan kaldırır.

2. Hammaddeler ve ürünler katı desteğe bağlı olduğundan, fazla reaktanlar ve destek olmayan ürünler polimerik katı destekten kolayca yıkanabilir.

3. Reaksiyonun tamamlanması için (%99'dan fazla) büyük reaktif fazlalıkları kullanılabilir, çünkü bu fazlalıklar kolayca ayrılır.

4. Düşük yığın hacimleri kullanılarak (destek gramı başına 0,8 mmol'den az), istenmeyen yan reaksiyonlardan kaçınılabilir.

5. Reaksiyon karışımındaki ara maddeler granüllere bağlıdır ve saflaştırılmaları gerekmez.

6. Deney sonunda tek tek polimer tanecikleri ayrılabilir ve böylece tek tek ürünler elde edilir.

7. Polimer substrat, kırılma koşulları seçildiğinde ve uygun ankraj grupları - bağlayıcılar seçildiğinde yeniden üretilebilir.

8. Katı faz sentezinin otomasyonu mümkündür.

Reaksiyon koşulları altında inert olan çözünmez bir polimer substratın varlığına ek olarak katı faz sentezi için gerekli koşullar şunlardır:

Bir çapa veya bağlayıcının varlığı, substratın uygulanan bileşik ile bağlantısını sağlayan kimyasal bir fonksiyondur. Reçineye kovalent olarak bağlı olmalıdır. Alt tabakaların onunla etkileşime girmesi için çapanın ayrıca reaktif bir fonksiyonel grup olması gerekir.

Substrat ile bağlayıcı arasında oluşan bağ, reaksiyon koşulları altında kararlı olmalıdır.

Ürün veya ara ürünün linker ile bağlantısını kesmenin yolları olmalıdır.