Proteinlerin düşük molekül ağırlıklı safsızlıklardan ayrılması
Membran eleme yöntemi (diyaliz)
Polimer olan ve belirli büyüklükte gözeneklere sahip diyaliz membranı kullanılır. Küçük moleküller (düşük molekül ağırlıklı safsızlıklar) zardaki gözeneklerden geçer ve büyük moleküller (proteinler) tutulur. Bu sayede proteinler yabancı maddelerden arındırılır.
Proteinlerin moleküler ağırlığa göre ayrılması
Jel kromatografisi
Kromatografik kolon, belirli büyüklükte gözeneklere sahip jel granülleri (Sephadex) ile doldurulur. Sütuna bir protein karışımı eklenir. Boyutu Sephadex gözeneklerinin boyutundan daha küçük olan proteinler, gözeneklere "sıkışıp" kaldıkları için sütunda tutulur, geri kalanı ise sütundan serbestçe çıkar. Bir proteinin boyutu molekül ağırlığına bağlıdır.
Ultrasantrifüjleme
Bu yöntem, farklı yoğunluk gradyanlarına (sakkaroz tamponu veya sezyum klorür) sahip çözeltilerdeki protein moleküllerinin farklı çökelme (çökelme) hızlarına dayanmaktadır.
Elektroforez
Bu yöntem, yüke bağlı olarak bir elektrik alanında proteinlerin ve peptidlerin farklı göç hızlarına dayanmaktadır.
Jeller, selüloz asetat ve agar, elektroforez için taşıyıcı görevi görebilir. Ayrılan moleküller boyutlarına bağlı olarak jel içerisinde hareket ederler; büyük olanlar jelin gözeneklerinden geçerken gecikecektir. Daha küçük moleküller daha az dirençle karşılaşacak ve dolayısıyla daha hızlı hareket edecektir. Sonuç olarak elektroforez sonrasında büyük moleküller başlangıca küçük moleküllere göre daha yakın olacaktır.
Elektroforez, proteinleri moleküler ağırlığa göre ayırmak için kullanılabilir. Bunu yapmak için, sodyum dodesil sülfat (SDS-Na) varlığında PAGE elektroforezi kullanılır.
DDS-Na difilik bir maddedir ve yüklü bir grup ve hidrofobik bir grup içerir. Proteinler hidrofobik radikalleri ile SDS-Na'ya bağlanır ve bu süreçte denatüre olurlar. Bu şekilde proteinler şekil ve yük bakımından hizalanır. Bundan sonra proteinin elektroforez sırasındaki hareketliliği yalnızca molekül ağırlığına bağlıdır.
tuzlamak: alkali tuzları, alkali toprak metalleri (sodyum klorür, magnezyum sülfat), amonyum sülfat ile çökeltme; proteinin birincil yapısı bozulmaz;
biriktirme: su giderici maddelerin kullanımı: düşük sıcaklıklarda (yaklaşık –20 С) alkol veya aseton.
Bu yöntemleri kullanırken proteinler hidrasyon kabuklarını kaybeder ve çözelti içinde çöker.
Denatürasyon- proteinlerin uzaysal yapısının ihlali (molekülün birincil yapısı korunur). Tersine çevrilebilir (denatüre edici madde çıkarıldıktan sonra protein yapısı restore edilir) veya geri döndürülemez (molekülün uzaysal yapısı, örneğin proteinler konsantre mineral asitler, ağır metal tuzları ile çökeltildiğinde restore edilmez).
Protein ayırma yöntemleri Proteinlerin düşük molekül ağırlıklı safsızlıklardan ayrılması
Diyaliz
Belli büyüklükte gözeneklere sahip özel bir polimer membran kullanılır. Küçük moleküller (düşük molekül ağırlıklı safsızlıklar) zardaki gözeneklerden geçer ve büyük moleküller (proteinler) tutulur. Böylece proteinler yabancı maddelerden yıkanarak uzaklaştırılır.
Proteinlerin moleküler ağırlığa göre ayrılması
Jel kromatografisi
Kromatografik kolon, belirli büyüklükte gözeneklere sahip jel granülleri (Sephadex) ile doldurulur. Sütuna bir protein karışımı eklenir. Boyutu Sephadex gözeneklerinin boyutundan daha küçük olan proteinler, gözeneklere "sıkışıp" kaldıkları için sütunda tutulur, geri kalanı ise sütundan serbestçe çıkar (Şekil 2.1). Bir proteinin boyutu molekül ağırlığına bağlıdır.
Pirinç. 2.1. Jel filtrasyonu ile protein ayrımı
Ultrasantrifüjleme
Bu yöntem, farklı yoğunluk gradyanlarına (sakkaroz tamponu veya sezyum klorür) sahip çözeltilerde protein moleküllerinin farklı sedimantasyon (çökelme) hızlarına dayanmaktadır (Şekil 2.2).
Pirinç. 2.2. Proteinlerin ultrasantrifüjleme ile ayrılması
Elektroforez
Bu yöntem, yüke bağlı olarak bir elektrik alanında proteinlerin ve peptidlerin farklı göç hızlarına dayanmaktadır.
Jeller, selüloz asetat ve agar, elektroforez için taşıyıcı görevi görebilir. Ayrılmış moleküller boyutlarına bağlı olarak jel içinde hareket eder: daha büyük olanlar jelin gözeneklerinden geçerken gecikecektir. Daha küçük moleküller daha az dirençle karşılaşacak ve dolayısıyla daha hızlı hareket edecektir. Sonuç olarak, elektroforez sonrasında büyük moleküller başlangıca küçük moleküllere göre daha yakın olacaktır (Şekil 2.3).
Pirinç. 2.3. Jel elektroforezi ile protein ayrımı
Elektroforez ayrıca proteinleri moleküler ağırlığa göre ayırmak için de kullanılabilir. Bunun için kullanıyorlar Sodyum dodesil sülfat (SDS-Na) varlığında PAGE elektroforezi.
Bireysel proteinlerin izolasyonu
Afinite kromatografisi
Yöntem, proteinlerin çeşitli moleküllere kovalent olmayan bağlar yoluyla güçlü bir şekilde bağlanabilme yeteneğine dayanmaktadır. Enzimlerin, immünoglobulinlerin ve reseptör proteinlerinin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılır.
Belirli proteinlerin spesifik olarak bağlandığı madde molekülleri (ligandlar), inert bir maddenin parçacıkları ile kovalent olarak birleştirilir. Protein karışımı kolona eklenir ve istenilen protein liganda sıkı bir şekilde bağlanır. Geri kalan proteinler kolondan serbestçe ayrılır. Tutulan protein daha sonra serbest ligand içeren bir tampon çözeltisi kullanılarak kolondan yıkanarak çıkarılabilir. Bu son derece hassas yöntem, yüzlerce başka protein içeren bir hücre ekstraktından çok küçük miktarlarda proteinin saf formda izole edilmesine olanak tanır.
Izoelektrik odaklama
Yöntem proteinlerin farklı IET değerlerine dayanmaktadır. Proteinler, amfolinli bir plaka üzerinde elektroforez ile ayrılır (bu, 3 ila 10 aralığında bir pH gradyanının önceden oluşturulduğu bir maddedir). Elektroforez sırasında proteinler IET değerlerine göre ayrılır (IET'te proteinin yükü sıfır olacak ve elektrik alanında hareket etmeyecektir).
2D elektroforez
İzoelektrik odaklama ve elektroforezin SDS-Na ile birleşimidir. Elektroforez önce amfolinli bir plaka üzerinde yatay yönde gerçekleştirilir. Proteinler yüklerine (IET) göre ayrılır. Daha sonra plaka bir SDS-Na çözeltisi ile muamele edilir ve elektroforez dikey yönde gerçekleştirilir. Proteinler molekül ağırlıklarına göre ayrılır.
İmmünoelektroforez (Western blot)
Bir numunedeki belirli proteinleri tanımlamak için kullanılan analitik bir yöntem (Şekil 2.4).
Proteinlerin biyolojik materyalden izolasyonu.
SDS-Na ile PAGE'de elektroforez yoluyla proteinlerin moleküler ağırlığa göre ayrılması.
Daha fazla çalışmayı kolaylaştırmak için proteinlerin jelden bir polimer plakaya aktarılması.
Kalan gözenekleri doldurmak için plakanın spesifik olmayan bir protein çözeltisiyle işlenmesi.
Böylece bu aşamadan sonra gözenekleri ayrılmış proteinler içeren bir plaka elde edilir ve aralarındaki boşluk spesifik olmayan bir proteinle doldurulur. Şimdi proteinler arasında bazı hastalıklardan sorumlu olanın olup olmadığını belirlememiz gerekiyor. Tespit için antikor tedavisi kullanılır. Birincil antikorlar ilgilenilen proteine karşı antikorlardır. İkincil antikorlar, birincil antikorlara karşı antikorlar anlamına gelir. Sonuçların görselleştirilebilmesi için ikincil antikorlara ek bir özel etiket (moleküler prob adı verilen) eklenir. Etiket olarak ikincil bir antikora sıkı bir şekilde bağlanan radyoaktif bir fosfat veya enzim kullanılır. Önce birincil, sonra ikincil antikorlara bağlanmanın iki amacı vardır: yöntemin standardizasyonu ve sonuçların iyileştirilmesi.
Primer antikorların bağlanmasının bir çözeltisi ile tedavi, antijenin (istenen protein) bulunduğu plakanın yerinde meydana gelir.
Bağlanmamış antikorların uzaklaştırılması (yıkama).
Daha sonraki gelişim için etiketli ikincil antikorlardan oluşan bir çözelti ile tedavi.
Bağlanmamış ikincil antikorların uzaklaştırılması (yıkama).
Pirinç. 2.4. İmmünoelektroforez (Western blot)
Biyolojik materyalde istenen protein mevcutsa, plaka üzerinde bu proteinin karşılık gelen antikorlara bağlandığını gösteren bir bant belirir.
Fizikokimyasal özelliklerin, kimyasal bileşimin ve yapının incelenmesi yalnızca saflaştırılmış bir protein preparatının incelenmesiyle mümkündür. Bireysel proteinleri izole etmek ve fraksiyonlara ayırmak için aşağıdaki yöntemler kullanılır: tuzlama, organik çözücülerle çökeltme, jel filtrasyonu, elektroforez, iyon değişim kromatografisi, afinite kromatografisi.
Proteinlerin tuzlanması Protein çözünürlüğünün ortamın özelliklerine bağımlılığına dayanır. Düşük iyon konsantrasyonları hidrasyon kabuklarını koruduğu için proteinler damıtılmış suda zayıf tuz çözeltilerine göre daha az çözünür. Ancak yüksek tuz konsantrasyonlarında protein molekülleri hidrasyon kabuklarını kaybeder, kümelenir ve çökelti oluşur. Tuz uzaklaştırıldıktan sonra proteinler doğal özelliklerini ve konformasyonlarını koruyarak çözeltiye geri döner.
Farklı tuz konsantrasyonlarında ve pH'ta çözünürlükteki değişiklikler, tek tek proteinleri izole etmek için kullanılır. Çoğu zaman, proteinleri tuzlamak için farklı konsantrasyonlardaki amonyum sülfat çözeltileri kullanılır.
Proteinlerin denatürasyon olmadan çözeltiden çökeltilmesi, hidrojen giderme maddeleri - organik çözücüler (etanol, aseton) kullanılarak gerçekleştirilir.
Jel filtrasyonu proteinlerin molekülün boyutuna ve şekline göre ayrılmasına dayanır. Ayırma, belirli bir pH değerine sahip bir tampon çözelti içerisinde gözenekli jel granülleri (Sephadex, agaroz) ile doldurulmuş kromatografik kolonlarda gerçekleştirilir. Jel granülleri, boyutu jelin türüne (Sephadex G-25, G-200, vb.) bağlı olan belirli bir ortalama çapa sahip iç kanallar (gözenekler) sayesinde proteinlere karşı geçirgendir. Protein karışımı kolona eklenir ve daha sonra belirli bir pH değerine sahip bir tampon çözeltisiyle yıkanır (seçilir). Büyük protein molekülleri jelin gözeneklerine nüfuz etmez ve solvent ile birlikte yüksek hızda hareket eder. Düşük molekül ağırlıklı bir safsızlığın (tuz) veya başka bir proteinin küçük molekülleri, jel granülleri tarafından tutulur ve kolondan daha yavaş yıkanır (Şekil 1.29). Kolon çıkışında çözelti (elüat) ayrı fraksiyonlar halinde toplanır.
Pirinç. 1.29. Jel filtrasyonu ile protein ayrımı
Elektroforez yüklü protein moleküllerinin bir elektrik alanında toplam yükleriyle orantılı bir hızla hareket etme özelliğine dayanır. Belirli bir pH değerinde toplam negatif yüke sahip proteinler anoda doğru, pozitif yük ise katoda doğru hareket eder. Elektroforez farklı ortamlarda gerçekleştirilir: kağıt, nişasta jeli, poliakrilamid jel vb. Hareket hızı, protein moleküllerinin yüküne, kütlesine ve şekline bağlıdır. Elektroforez tamamlandıktan sonra taşıyıcı üzerindeki protein bölgeleri özel boyalarla boyanır (Şekil 1.30, A).
Bir jeldeki elektroforezin çözünürlüğü kağıt üzerindekinden daha yüksektir, bu nedenle kan serumu proteinleri kağıt üzerinde elektroforezlendiğinde 5 fraksiyon izole edilir (albümin, a1 -, a2 -, β-, γ-globülinler) ve bir poliakrilamid jelde - 18 kesire kadar ( Şekil 1.30, B).
Pirinç. 1.30. Sağlıklı bir kişinin kan serumu proteinlerinin elektroferogramı
A- kağıt üzerinde kan serumu proteinlerinin elektroferogramı;
B- farklı fraksiyonlardaki plazma proteinlerinin miktarı.
I - γ-globulinler; II - β-globulinler; III - a 2 -globulinler;
IV - a 1 -globulinler; V - albüminler
İyon değiştirme kromatografisi toplam yükleri farklı olan proteinlerin ayrılmasına dayanır. Belirli bir pH değerine sahip bir protein çözeltisi, katı gözenekli bir sorbent ile doldurulmuş bir kromatografik kolondan geçirilirken, elektrostatik etkileşim sonucunda proteinlerin bir kısmı tutulur. İyon değiştirici maddeler emici olarak kullanılır: asidik proteinleri izole etmek için anyon değiştiriciler (katyonik gruplar içeren); Temel proteinleri izole etmek için katyon değiştiriciler (anyonik gruplar içeren).
Bir protein bir kolondan geçerken iyon değiştiriciye bağlanma kuvveti, sorbentin yükünün karşısındaki yükün büyüklüğüne bağlıdır. Bir iyon değişim sorbenti üzerine adsorbe edilen proteinler, farklı tuz konsantrasyonları ve pH değerlerine sahip tampon çözeltileri ile ayrıştırılarak farklı protein fraksiyonları elde edilir.
Afinite kromatografisi proteinin katı desteğe bağlı liganda bağlanma spesifikliğine dayanmaktadır. Ligand olarak enzim substratları, holoproteinlerin protez grupları, antijenler vb. kullanılır. Bir protein karışımını kolondan geçirirken, liganda yalnızca tamamlayıcı protein bağlanır (Şekil 1.31, A), diğerleri çözeltiyle birlikte dışarı çıkar. Adsorbe edilen protein, farklı pH değerine sahip bir çözelti ile elüt edilir (Şekil 1.31, B). Bu yöntem son derece spesifiktir ve yüksek düzeyde saflaştırılmış protein preparatları elde edilmesini sağlar.
Protein izolasyonu ve saflaştırılması genellikle farklı yöntemler kullanılarak birkaç adımda gerçekleşir. Adımların sırası ampirik olarak seçilir ve farklı proteinler için farklılık gösterebilir. Hem ilaç olarak kullanıldığında (insülin hormonu vb.) hem de dokuların, kanın, tükürüğün vb. protein bileşimini değiştirerek çeşitli hastalıkların teşhisinde yüksek derecede protein saflaştırılması çok önemlidir.
Bir yetişkinin çeşitli organlarının hücrelerindeki protein seti bireyseldir ve yaşam boyunca nispeten sabit kalır. Özelleşmiş dokular, kırmızı kan hücrelerinde hemoglobin, kaslarda aktin ve miyozin, retinada rodopsin ve kemik ve bağ dokularında farklı kollajen türleri gibi spesifik proteinler içerebilir. Bazı proteinler birçok dokuda fakat farklı miktarlarda bulunur. Seçilen kompozisyon değişiklikleri
Pirinç. 1.31. Afinite kromatografisi ile proteinlerin ayrılması
A- izole edilmiş proteinin nötr bir taşıyıcıya bağlı spesifik bir liganda bağlanması; B- bireysel proteinden oluşan bir çözeltinin elde edilmesi
doku ve kan proteinleri mümkündür ve öncelikle diyet, besin bileşimi ve kişinin fiziksel aktivitesi ile ilişkilidir.
Hastalıklarda, kan ve doku hücrelerinin protein bileşimi önemli ölçüde değişebilir, sıklıkla herhangi bir proteinin eksikliği veya aktivitesinde azalma gelişir - proteinopati. Bu nedenle, klinik çalışmalarda çeşitli hastalıkların teşhisinde kan ve dokuların protein bileşimindeki belirgin değişikliklerin belirlenmesi kullanılmaktadır.
Biyolojik materyalden bir protein karışımı çıkarıldıktan sonra, bireysel protein fraksiyonlarına ayrılır. Proteinlerin farklı fizikokimyasal özelliklerine dayalı olarak çeşitli protein fraksiyonlama yöntemleri geliştirilmiştir.
– proteinlerin izoelektrik noktada çökelmesi – yöntem, protein molekülünün yükünün nötrleştirilmesi nedeniyle proteinlerin izoelektrik noktada çökelme özelliğine dayanmaktadır. Her protein için izoelektrik noktanın değeri kesinlikle bireyseldir, bu nedenle bu yöntem bireysel proteinlerin izole edilmesini mümkün kılar (yöntem hakkında daha fazla bilgi için "Biyokimya" dersindeki 3 numaralı laboratuvar çalışmasına bakın).
– tuzlama yöntemiyle protein fraksiyonlaması – molekül ağırlığına bağlı olarak proteinlerin konsantre nötr tuz çözeltilerindeki farklı çözünürlüğüne dayanmaktadır (yöntem hakkında daha fazla bilgi için “Biyokimya” dersindeki 3 numaralı laboratuvar çalışmasına bakınız).
– elektroforetik ayırma yöntemi proteinleri fraksiyonlara ayırma - proteinlerin fizikokimyasal özellikleri bölümünde açıklanmıştır.
Yukarıda sunulan yöntemlere ek olarak, proteinleri fraksiyonlara ayırmak için yaygın olarak kullanılırlar. kromatografik yöntemler . Sütun kromatografisi en sık kullanılır.
Bu yöntemin özelliği, çeşitli protein ve peptidlerden oluşan moleküllerin bir karışımının, katı gözenekli bir malzeme (matris) içeren bir sütundan geçirilmesidir. Matriks ile etkileşim sonucunda farklı proteinler kolondan farklı hızlarda geçer. Proteinler belirli bir sıra ile kolonun dibine ulaştıktan sonra ayrı fraksiyonlar halinde test tüplerinde toplanır.
Vurgulamak üç ana tip kolon kromatografısi:
– iyon değişimi – protein kromatografisi için, selüloz veya diğer hidrofilik polimerlere dayanan iyon değiştiriciler kullanılır; örneğin, katyonik gruplar içeren (negatif yük) veya amin grupları içeren (pozitif yük) karboksimetilselüloz (CM-selüloz) içeren dietilaminoetilselüloz (DEAE-selüloz) :
Proteinlerin DEAE-selüloza bağlanması ne kadar güçlü olursa, protein molekülündeki karboksil gruplarının sayısı da o kadar yüksek olur. DEAE selülozuna adsorbe edilen proteinler, artan konsantrasyonlarda sodyum klorür solüsyonları ile kolondan yıkanabilir (selüsyon yapılabilir). Gevşek bağlı proteinler ilk olarak elüe edilir ve tuz konsantrasyonu arttıkça DEAE-selüloz için afinitenin arttırılması amacıyla diğer proteinler elüe edilir.
CM selüloz benzer şekilde kullanılır, ancak proteinlerin buna olan afinitesi, protein molekülündeki amino gruplarının sayısıyla doğru orantılıdır.
Bağlı proteini uzaklaştırmak için elüentin pH'ı da değiştirilir.
– jel filtrasyon kromatografisi – ikinci adı “moleküler elek yöntemi”dir. Elek olarak Sephadex (epiklorür hidrin ile işlenmiş polisakarit dekstran) kullanılır. Sephadex taneleri suda şişer ve bir jel oluşturur. Şişmiş granüllerin belirli bir çapta gözenekleri vardır.
Ayırma, Sephadex tanelerinin (granüllerin gözenekleri) büyük moleküler ağırlığa sahip maddelere karşı geçirimsiz veya sınırlı derecede geçirgen olması ve küçük moleküllerin tanelerin gözeneklerine serbestçe yayılması (nüfuz etmesi) gerçeğine dayanmaktadır.
Jel benzeri şişmiş Sephadex kütlesi bir cam kolona (tüp) yerleştirilir, jelin yüzeyine bir protein çözeltisi tabakası uygulanır (Şekil 12, a) ve ardından bir tampon çözeltisi (elüsyon sıvısı) içinden geçirilir sütun. Proteinler granüller arasındaki sütun boyunca daha yavaş geçer, moleküler ağırlıkları o kadar düşük olur, çünkü daha düşük moleküler ağırlığa sahip protein molekülleri granüllere (gözeneklere) daha kolay yayılır (Şekil 12).
Pirinç. 12. Jel filtrasyonu ile protein fraksiyonlaması
Proteinler, molekül ağırlığına göre azalan sırada kolondan yıkanır (seçilir). Sonuç olarak, önce tanelere yayılmayan büyük protein molekülleri (Şekil 12, b), ardından küçük moleküller ve son olarak düşük moleküler safsızlıklar ayrıştırılır.
Bu yöntem sadece proteinleri moleküler ağırlığa göre parçalamak için değil, aynı zamanda onları düşük moleküler ağırlıklı safsızlıklardan arındırmak için de kullanılır.
– Afinite kromatografisi – veya afinite kromatografisi. Yöntemin ilkesi, proteinlerin seçici etkileşiminin belirli maddelerle (taşıyıcılara bağlı ligandlar) meydana gelmesidir (Şekil 13).
Taşıyıcı olarak siyanojen bromürle aktifleştirilen Sefaroz kullanılır. Çeşitli kökenlerden ligandlar, karışımdan yalnızca bir proteine afiniteyle bağlanacak olan bir substrat, bir antijen veya bir reseptör olan Sepharose'a bağlanır:
– substrat → enzim;
– antijen → antikor;
– belirli bir hormon için hormon → reseptör.
Liganda bağlı olmayan diğer proteinler kolonun yıkanmasıyla uzaklaştırılır.
Pirinç. 13. Afinite kromatografisinin mekanizması
Afiniteye bağlı proteinin kolondan çıkarılması, bir tampon çözeltisi (eluent) kullanılarak gerçekleştirilir. Tamponun içine, protein ile ligand arasındaki bağları zayıflatan bir deterjan eklenir veya yüksek konsantrasyonda serbest ligand içeren bir çözelti kolondan geçirilir. Bu durumda protein, serbest liganda daha kolay bağlanır ve kolondan yıkanır (seçilir).
8 numaralı laboratuvar çalışması
PROTEİNLERİN ELEKTROFORETİK AYIRILMASI
Yöntem, protein moleküllerinin, büyüklüğü ve işareti, proteinin amino asit bileşimi, pH ve ortamın iyonik kuvveti ile belirlenen bir elektrik yüküne sahip olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Harici bir elektrik alanının etkisi altında, yüklü moleküller çözelti içinde zıt yüklü kutba doğru hareket eder. Protein parçacıklarının hareket hızı, yüklerinin büyüklüğüyle orantılı, parçacıkların boyutu ve hidrasyon dereceleriyle ters orantılıdır.
"Bölgesel elektroforez" adı verilen yöntem şu anda yaygındır - istenen pH değerine sahip bir tampon çözeltisi ile emprenye edilmiş katı bir taşıyıcı (kağıt şeritler, agar, nişasta, akrilamid üzerinde) üzerinde elektroforez. Proteinlerin kağıt veya jel üzerindeki konumu, sabitlenip ardından bir veya başka bir boyayla (genellikle bromofenol mavisi, amid siyahı veya Coomassie mavisi) boyanarak belirlenir. Her fraksiyondaki protein miktarı, ilgili boyanın renk yoğunluğuna göre yaklaşık olarak belirlenebilir. Bu tanım, farklı proteinler tarafından bağlanan boya miktarı aynı olmadığından, protein fraksiyonlarının kesin olarak niceliksel bir oranını vermez.
ELEKTROFOREZ HA KAĞIT
Analiz edilen karışımın ayrılması, elektroforez cihazlarında bir tampon çözeltisi ile emprenye edilmiş belirli tipteki kromatografik kağıt üzerinde gerçekleşir. Proteinler 500 V'a kadar voltajlarda ayrılır.
Elektroforez odası bir pleksiglas banyo ve ona takılan bir kapaktan oluşur. (1). Banyoda her biri uzunlamasına bir bölmeyle bölünmüş 2 elektrot bölmesi (2) bulunur (3) birbirleriyle iletişim kuran iki bölmeye ayrılır. Bölmelerin iç bölmeleri elektrotları indirir ve kağıt şeritlerin uçları dış bölmelere girer (4), ana kısmı, odanın orta kısmında bulunan sivri uçlu (5) yatay bir plaka üzerine yerleştirilmiştir. Yatay plaka ile elektrot bölmelerinin dış bölmesi arasında çubuklar bulunmaktadır. (6),
İncir. 2. Alçak gerilim elektroforezi için cihaz şeması
içinden kağıt şeritlerin atıldığı ve bunları desteklemeye yarayan. Odanın üst kapağının altında, üzerine damıtılmış suya batırılmış ve 4-5 kez katlanmış filtre kağıdı tabakalarının yerleştirildiği, büyük yuvarlak delikli (7) pleksiglastan yapılmış bir plaka bulunmaktadır. Bu tabakalar odanın sıkılığını arttırmaya yardımcı olur ve sonuç olarak elektroforez sırasında elektroferogramlardan sıvının buharlaşmasını azaltır.
Kağıt elektroforezi kullanılarak öğrencilerden kan serumu proteinlerini ayırmaları istenir. Bu yöntem kullanılarak kan serumu 5 - 9 parçaya bölünebilir ve her birindeki göreceli protein içeriği belirlenebilir. Ayırma, oda sıcaklığında 3 - 5 V/cm (40 - 45 cm uzunluğundaki şeritler için 120 - 350 V) potansiyel gradyanı olan bir tampon çözeltisinde (pH 8,6 - 8,9) gerçekleştirilir. Akım, kağıt şeridin kesitinin her santimetresi için 0,1 - 0,3 mA'yı geçmemelidir. Akım gücünün 2 kattan fazla arttırılması kabul edilemez, çünkü bu aşırı ısınmaya, buharlaşmada önemli bir artışa ve V sonuçta - kağıdın yanması
Reaktifler:
1. Tampon çözeltisi. Kullanılabilir:
a) veronal-medinal tampon (pH 8.6): 10.32 gmedinali (veronalin sodyum tuzu) 300 ml damıtılmış suda çözün, 1.84 gveronal ekleyin, bir su banyosunda çözünene kadar karıştırarak ısıtın ve 1 litreye kadar su ekleyin;
b) veronal-asetat tamponu (pH 8,6): 4,3 veronal, 0,95 sodyum hidroksit ve 3,24 sodyum asetat, 300 ml damıtılmış su içerisinde çözülür. Çözeltiye 30 ml 0,1 M HCl çözeltisi ekleyin ve 1 litreye kadar su ekleyin;
c) Tris tamponu (pH 8,9): 60,5 g Tris, 6 etilendiamintetraasetik ve 4,6 gborik asit, 1 distile su içerisinde çözülür.
2. Elektroferogramların renklendirilmesine yönelik çözümler:
a) asidik mavi-siyah boya (amid siyahı 10 B'ye benzer) -0,2 g karışım: asetik asit (buzlu) - 100 ml + metil alkol - 900 ml;
b) bromofenol mavisi -0,5 g, cıva klorür -10 g, asetik asit (buzlu) - 20 ml, damıtılmış su - 980 ml;
c) bromofenol mavisi - 0,1 g, ZnS047H20 -50 g, asetik asit (buzlu) 50 ml, damıtılmış su - 900 ml.
3. Proteine bağlı olmayan boyadan elektroferogramların yıkanması ve boyanın protein üzerine sabitlenmesi için çözümler:
a) asetik asit - %2'lik çözelti;
b) sodyum asetat - %10'luk asetik asit çözeltisi ile hazırlanan %2'lik çözelti.
4. Renkli ürünlerin elektroferogramlardan elüsyonuna yönelik çözümler:
a) bromofenol mavisi -0,01 M NaOH çözeltisinin ekstrakte edilmesi;
b) asidik mavi-siyah boyanın -0,1 M NaOH çözeltisini çıkarmak için.
Teçhizat: test tüpleri; küvetler, spektrofotometre, elektroforez cihazı, kromatografik kağıt: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM, vb.
Kan serumu elde etmek. Kuru bir santrifüj tüpüne 2 - 3 ml kan alınır ve 1/2 - 1 saat bekletilir.İnce bir cam çubuk kullanarak tüpün duvarlarını dikkatlice daire içine alarak pıhtıyı onlardan ayırın, santrifüj edin ve serumu bir kaseye dökün. temiz tüp.
Kamerayı hazırlamak. Elektrot bölmeleri, her bölmede yaklaşık 800 ml olacak şekilde (tampon taşmasını önlemek için) aynı seviyeye kadar tampon çözeltisiyle doldurulur. Elektrot bölmelerinin iç kısımları elektrotları batırır. Bir kromatografik kağıt (18x45 cm) üzerine (ince kağıt türleri kullanıldığında, örnekleri 4-5 cm genişliğinde ayrı şeritler üzerine uygulamak daha iyidir) dar kenarlarından birinden 15 cm mesafede basit bir yumuşak kullanın. numunelerin uygulanacağı yerlerin ana hatlarını çizmek için kalem (grafit sıvının yayılmasını önler). Bunlar, büyük kenarları kağıt şeridin uzunluğuna dik olan dikdörtgenlerdir (2 x 0,3 cm). Başlangıç bölgeleri ile elektroferogramın kenarları arasındaki mesafe 2 cm'dir Elektroferogram, elektroforezin gerçekleşeceği tamponla emprenye edilir. Bunu yapmak için tampon çözeltili bir küvetten çekilir. Kağıt şeritlerin uçları (6-8 cm) ıslanmaz. Fazla tampon, şeritlerin iki veya üç yaprak filtre kağıdı arasında kurutulmasıyla giderilir. Islak elektroferogram, merkezi yatay plaka (5) üzerindeki odaya yerleştirilir ve uçları elektrot bölmelerinin dış bölmelerine indirilir.Cihaz, altında nemlendirilmiş filtre kağıdı tabakalarının bulunduğu bir kapakla sıkıca kapatılır. su.
Elektroforez yapılması. Kağıt şeritler tampon çözeltisine tamamen doyurulduktan sonra 0,1 ml'lik pipet kullanılarak işaretli alanlara 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg protein) serum örnekleri uygulanır. Oda bir kapakla kapatılır ve akım açılır. Elektroforez süresi 200 - 300 V voltajda 22 - 24 saattir
Elektroferogramların sabitlenmesi ve boyanması. Elektroforezin sonunda akımı kapatın ve elektroferogramları derhal cihazdan çıkarın. Özel bir standa yerleştirilip hava akımı altında kurutulur, ardından 105 °C sıcaklıktaki fırında 20 dakika boyunca proteinlerin kağıt üzerinde sabitlenmesi için kurutulur, ardından emaye küvete yerleştirilip boya ile doldurularak 2 - 3 dakika bekletilir. saat veya daha fazla. Boya boşaltılır ve elektroferogramlar, her seferinde 5-10 dakika boyunca% 2'lik asetik asit çözeltisi ile 3-4 kez dökülerek fazlalığından yıkanır. Kağıdın protein içermeyen alanları tamamen boyadan arındırılmış olmalıdır. Renkli ürünleri sabitlemek için elektroferogramlar 2 dakika boyunca %2'lik sodyum asetat çözeltisi ile doldurulur ve emme altında havada kurutulur.
Bireysel protein fraksiyonlarının oranının belirlenmesi. pH 8,6'da serum proteinleri negatif yüklüdür ve elektrik alanında anoda doğru hareket eder. Anoda en hızlı hareket eden kısım albümindir ve onu α1-, α2-, β- ve γ-globülinler takip eder (bkz. Şekil 3) . Üzerinde protein lekelerinin göründüğü kağıt bantların bölümleri, basit bir kalemle enine çizgilerle 3-5 mm genişliğinde şeritlere bölünür ve bu çizgiler boyunca kesilir. Her şerit ezilir ve ayrı bir numaralı test tüpüne yerleştirilir, 3 ml 0,01 M NaOH çözeltisi ile doldurulur, boyanın kağıttan çıkarılması için bir saat bekletilir ve ardından fotokolorimetrede her çözelti için optik yoğunluk değeri bulunur ( spektrofotometre) 612 nm'de.
Pirinç. 3. İnsan kan serumunun elektroferogramı ve protein fraksiyonlarının dağılım eğrisi
Bir kontrol örneği paralel olarak işlenir. Bunun için elektroferogramın lekesiz alanlarından bir şerit kesilir.
Elde edilen verilere dayanarak, elektroferogram üzerinde renkli ürünlerin bir dağılım eğrisi çizilir.Tüplerin sayıları apsis ekseninde işaretlenir ve karşılık gelen optik yoğunluk değeri ordinat ekseninde işaretlenir (bkz. Şekil 3). . Kan serumundaki protein fraksiyonlarının yüzdesi hesaplanır. Bunu yapmak için, çizilen eğri minimumlara göre bireysel kesirlere karşılık gelen bir dizi bölüme bölünür. Her bölümün alanının boyutu, belirli bir fraksiyonun proteini ile birleşen boya miktarıyla orantılıdır. Bu alanlar arasındaki oran ağırlıkça hesaplanır (kağıt bölümlerinin ağırlığı alanlarıyla orantılıdır), tüm alan %100 olarak alınır. Bir dansitometreniz varsa, kan serumundaki protein fraksiyonlarının oranı bir dansitogramdan belirlenebilir.
Peynir altı suyundaki protein içeriği önceden belirlendikten sonra her fraksiyon için miktarı hesaplanır.
