ცილების და ამინომჟავების გამოყოფის მეთოდები. ცილების გამოყოფა (ფრაქციული) ცილების გამოყოფის მეთოდები

ცილების გამოყოფა დაბალი მოლეკულური წონის მინარევებისაგან

მემბრანული საცრის მეთოდი (დიალიზი)

გამოიყენება დიალიზის მემბრანა, რომელიც არის პოლიმერული და აქვს გარკვეული ზომის ფორები. მცირე მოლეკულები (დაბალმოლეკულური წონის მინარევები) გადის მემბრანის ფორებში, ხოლო დიდი მოლეკულები (ცილები) შენარჩუნებულია. ამრიგად, ცილები ირეცხება მინარევებისაგან.

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით

გელის ქრომატოგრაფია

ქრომატოგრაფიული სვეტი ივსება გელის გრანულებით (სეფადექსი), რომელსაც აქვს გარკვეული ზომის ფორები. სვეტს ემატება ცილების ნარევი. ცილები, რომელთა ზომა Sephadex-ის ფორების ზომაზე მცირეა, რჩება სვეტში, რადგან ფორებში „იჭედება“, დანარჩენი კი თავისუფლად ტოვებს სვეტს. ცილის ზომა დამოკიდებულია მის მოლეკულურ წონაზე.

ულტრაცენტრფუგაცია

ეს მეთოდი ეფუძნება ცილის მოლეკულების დალექვის (ნალექის) სხვადასხვა სიჩქარეს სხვადასხვა სიმკვრივის გრადიენტის მქონე ხსნარებში (საქაროზას ბუფერი ან ცეზიუმის ქლორიდი).

ელექტროფორეზი

ეს მეთოდი ეფუძნება ცილების და პეპტიდების მიგრაციის სხვადასხვა სიჩქარეს ელექტრულ ველში, მუხტის მიხედვით.

გელები, ცელულოზის აცეტატი, აგარი შეიძლება იყოს ელექტროფორეზის მატარებლები. გამოსაყოფი მოლეკულები მოძრაობენ გელში მათი ზომის მიხედვით: ისინი, რომლებიც დიდია, შეჩერდება გელის ფორებში გავლისას. პატარა მოლეკულები ნაკლებ წინააღმდეგობას შეხვდებიან და შესაბამისად უფრო სწრაფად მოძრაობენ. შედეგად, ელექტროფორეზის შემდეგ, დიდი მოლეკულები უფრო ახლოს იქნება საწყისთან, ვიდრე პატარა.

ცილების გამოყოფა შესაძლებელია მოლეკულური წონის მიხედვით ელექტროფორეზის გამოყენებით. ამისათვის გამოიყენება ელექტროფორეზი PAAG-ში ნატრიუმის დოდეცილ სულფატის (DDS-Na) თანდასწრებით.

SDS-Na არის ამფიფილური ნივთიერება და შეიცავს დამუხტულ ჯგუფს და ჰიდროფობიურ ჯგუფს. პროტეინები აკავშირებს SDS-Na-ს თავისი ჰიდროფობიური რადიკალებით და ამ პროცესში დენატურდება. ამგვარად, ცილები ფორმაში და მუხტში ემთხვევა. ამის შემდეგ ცილის მობილურობა ელექტროფორეზის დროს დამოკიდებულია მხოლოდ მის მოლეკულურ წონაზე.

მარილიანი გარეთ: ნალექი ტუტეების მარილებით, მიწის ტუტე ლითონებით (ნატრიუმის ქლორიდი, მაგნიუმის სულფატი), ამონიუმის სულფატი; ამავდროულად, ცილის პირველადი სტრუქტურა არ ირღვევა;

ნალექები: წყლის გამწმენდი საშუალებების გამოყენება: ალკოჰოლი ან აცეტონი დაბალ ტემპერატურაზე (დაახლოებით -20°C).

ამ მეთოდების გამოყენებისას ცილები კარგავენ დამატენიანებელ გარსს და იშლება ხსნარში.

დენატურაცია- ცილების სივრცითი სტრუქტურის დარღვევა (მოლეკულის პირველადი სტრუქტურა შენარჩუნებულია). ის შეიძლება იყოს შექცევადი (ცილის სტრუქტურა აღდგება დენატური აგენტის ამოღების შემდეგ) ან შეუქცევადი (მოლეკულის სივრცითი სტრუქტურა არ აღდგება, მაგალითად, როდესაც ცილები გროვდება კონცენტრირებული მინერალური მჟავებით, მძიმე ლითონების მარილებით).

ცილების გამოყოფის მეთოდები ცილების გამოყოფა დაბალი მოლეკულური მინარევებისაგან

დიალიზი

გამოიყენება სპეციალური პოლიმერული მემბრანა, რომელსაც აქვს გარკვეული ზომის ფორები. მცირე მოლეკულები (დაბალმოლეკულური წონის მინარევები) გადის მემბრანის ფორებში, ხოლო დიდი მოლეკულები (ცილები) შენარჩუნებულია. ამრიგად, ცილები ირეცხება მინარევებისაგან.

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით

გელის ქრომატოგრაფია

ქრომატოგრაფიული სვეტი ივსება გელის გრანულებით (სეფადექსი), რომელსაც აქვს გარკვეული ზომის ფორები. სვეტს ემატება ცილების ნარევი. ცილები, რომელთა ზომა უფრო მცირეა, ვიდრე სეფადექსის ფორების ზომა, ინახება სვეტში, რადგან ისინი „იჭედება“ ფორებში, ხოლო დანარჩენი თავისუფლად ტოვებს სვეტს (ნახ. 2.1). ცილის ზომა დამოკიდებულია მის მოლეკულურ წონაზე.

ბრინჯი. 2.1.ცილების გამოყოფა გელის ფილტრაციით

ულტრაცენტრფუგაცია

ეს მეთოდი ეფუძნება ცილის მოლეკულების დალექვის (ნალექის) სხვადასხვა სიჩქარეს სხვადასხვა სიმკვრივის გრადიენტის მქონე ხსნარებში (საქაროზას ბუფერი ან ცეზიუმის ქლორიდი) (ნახ. 2.2).

ბრინჯი. 2.2.ცილების გამოყოფა ულტრაცენტრიფუგაციით

ელექტროფორეზი

ეს მეთოდი ეფუძნება ცილების და პეპტიდების მიგრაციის სხვადასხვა სიჩქარეს ელექტრულ ველში, მუხტის მიხედვით.

გელები, ცელულოზის აცეტატი, აგარი შეიძლება იყოს ელექტროფორეზის მატარებლები. გამოსაყოფი მოლეკულები გელში მოძრაობენ მათი ზომის მიხედვით: ისინი, რომლებიც უფრო დიდია, შეჩერდება გელის ფორებში გავლისას. პატარა მოლეკულები ნაკლებ წინააღმდეგობას შეხვდებიან და შესაბამისად უფრო სწრაფად მოძრაობენ. შედეგად, ელექტროფორეზის შემდეგ, უფრო დიდი მოლეკულები უფრო ახლოს იქნებიან საწყისთან, ვიდრე პატარაები (ნახ. 2.3).

ბრინჯი. 2.3. ცილების გამოყოფა გელის ელექტროფორეზით

ცილები ასევე შეიძლება გამოიყოს ელექტროფორეზით მოლეკულური წონის მიხედვით.ამ გამოყენებისთვის ელექტროფორეზი PAAG-ში ნატრიუმის დოდეცილ სულფატის თანდასწრებით (SDS-Na).

ცალკეული ცილების იზოლაცია

აფინური ქრომატოგრაფია

მეთოდი ეფუძნება ცილების უნარს, ძლიერად დაუკავშირდნენ სხვადასხვა მოლეკულებს არაკოვალენტური ბმებით. გამოიყენება ფერმენტების, იმუნოგლობულინების, რეცეპტორული ცილების იზოლირებისთვის და გასაწმენდად.

ნივთიერებების მოლეკულები (ლიგანდები), რომლებთანაც სპეციალურად აკავშირებს გარკვეული ცილები, კოვალენტურად არის შერწყმული ინერტული ნივთიერების ნაწილაკებთან. ცილების ნარევი ემატება სვეტს და სასურველი ცილა მყარად არის მიმაგრებული ლიგანდთან. დარჩენილი ცილები თავისუფლად გამოდიან სვეტიდან. შემდეგ შეკავებული ცილა შეიძლება ჩამოიბანოთ სვეტიდან ბუფერით, რომელიც შეიცავს თავისუფალ ლიგანდს. ეს უაღრესად მგრძნობიარე მეთოდი საშუალებას იძლევა ძალიან მცირე რაოდენობით სუფთა ცილის იზოლირება უჯრედის ექსტრაქტიდან, რომელიც შეიცავს ასობით სხვა ცილას.

იზოელექტრული ფოკუსირება

მეთოდი ეფუძნება ცილების სხვადასხვა IEP მნიშვნელობებს. ცილები გამოიყოფა ელექტროფორეზით ფირფიტაზე ამფოლინით (ეს არის ნივთიერება, რომელსაც აქვს წინასწარ ჩამოყალიბებული pH გრადიენტი 3-დან 10-მდე). ელექტროფორეზის დროს ცილები გამოიყოფა მათი IEP-ის მნიშვნელობის მიხედვით (IEP-ში ცილის მუხტი იქნება ნული და ის არ იმოძრავებს ელექტრულ ველში).

2D ელექტროფორეზი

ეს არის იზოელექტროფოკუსირებისა და ელექტროფორეზის კომბინაცია SDS-Na-სთან. პირველ რიგში, ელექტროფორეზი ტარდება ჰორიზონტალური მიმართულებით ფირფიტაზე ამფოლინით. ცილები გამოყოფილია მუხტის მიხედვით (CEP). შემდეგ ფირფიტა მუშავდება SDS-Na-ს ხსნარით და ტარდება ელექტროფორეზი ვერტიკალური მიმართულებით. ცილები კლასიფიცირდება მოლეკულური წონის მიხედვით.

იმუნოელექტროფორეზი (ვესტერნ ბლოტი)

ანალიტიკური მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ნიმუშის სპეციფიკური ცილების დასადგენად (სურათი 2.4).

ცილების იზოლაცია ბიოლოგიური მასალისგან.

ცილების გამოყოფა მოლეკულური წონის მიხედვით ელექტროფორეზით PAAG-ში SDS-Na-ით.

პროტეინების გადატანა გელიდან პოლიმერულ ფირფიტაზე შემდგომი მუშაობის გასაადვილებლად.

ფირფიტის დამუშავება არასპეციფიკური ცილის ხსნარით დარჩენილი ფორების შესავსებად.

ამრიგად, ამ ეტაპის შემდეგ მიიღეს ფირფიტა, რომლის ფორები შეიცავს განცალკევებულ ცილებს და მათ შორის სივრცე ივსება არასპეციფიკური ცილით. ახლა ჩვენ უნდა დავადგინოთ, არის თუ არა პასუხისმგებელი ცილებს შორის, რომლებსაც ჩვენ ვეძებთ, რაიმე სახის დაავადებაზე. გამოვლენისთვის გამოიყენება ანტისხეულების მკურნალობა. პირველადი ანტისხეულების ქვეშ ესმით ანტისხეულები სასურველი ცილის მიმართ. მეორადი ანტისხეულების ქვეშ იგულისხმება ანტისხეულები პირველადი ანტისხეულების მიმართ. მეორადი ანტისხეულების შემადგენლობას ემატება დამატებითი სპეციალური ეტიკეტი (ე.წ. მოლეკულური ზონდი), რათა მოგვიანებით შედეგების ვიზუალიზაცია მოხდეს. ეტიკეტად გამოიყენება რადიოაქტიური ფოსფატი ან მეორად ანტისხეულთან მჭიდროდ შეკრული ფერმენტი. პირველად პირველად და შემდეგ მეორად ანტისხეულებთან დაკავშირებას ორი მიზანი აქვს: მეთოდის სტანდარტიზაცია და შედეგების გაუმჯობესება.

პირველადი ანტისხეულების ხსნარით დამუშავება  შეკავშირება ხდება ფირფიტის იმ ადგილას, სადაც არის ანტიგენი (სასურველი ცილა).

შეუზღუდავი ანტისხეულების მოცილება (გამორეცხვა).

მკურნალობა მონიშნული მეორადი ანტისხეულების ხსნარით შემდგომი განვითარებისთვის.

შეუზღუდავი მეორადი ანტისხეულების მოცილება (გამორეცხვა).

ბრინჯი. 2.4. იმუნოელექტროფორეზი (ვესტერნ ბლოტი)

ბიოლოგიურ მასალაში სასურველი ცილის არსებობის შემთხვევაში ფირფიტაზე ჩნდება ზოლი, რომელიც მიუთითებს ამ ცილის შესაბამის ანტისხეულებთან შეკავშირებაზე.

ფიზიკოქიმიური თვისებების, ქიმიური შემადგენლობისა და სტრუქტურის შესწავლა შესაძლებელია მხოლოდ გასუფთავებული ცილოვანი პრეპარატის შესწავლისას. ცალკეული ცილების იზოლაციისა და ფრაქციაციისთვის გამოიყენება მარილის გამოყოფა, ორგანული გამხსნელებით დალექვა, გელის ფილტრაცია, ელექტროფორეზი, იონგაცვლის ქრომატოგრაფია და აფინური ქრომატოგრაფია.

ცილების მარილის გამოყოფაეფუძნება ცილის ხსნადობის დამოკიდებულებას გარემოს თვისებებზე. გამოხდილ წყალში ცილები იხსნება უფრო ცუდად, ვიდრე სუსტი მარილის ხსნარებში, რადგან იონების დაბალი კონცენტრაცია ინარჩუნებს მათ დამატენიანებელ გარსს. მაგრამ მარილის მაღალი კონცენტრაციის დროს ცილის მოლეკულები კარგავენ დამატენიანებელ გარსებს, გროვდება და წარმოიქმნება ნალექი. მარილის მოცილების შემდეგ, ცილები კვლავ გადადიან ხსნარში, ინარჩუნებენ თავიანთ თვისებებს და კონფორმაციას.

ხსნადობის ცვლილებები მარილის სხვადასხვა კონცენტრაციაში და საშუალო pH-ში გამოიყენება ცალკეული ცილების იზოლირებისთვის. ყველაზე ხშირად, სხვადასხვა კონცენტრაციის ამონიუმის სულფატის ხსნარები გამოიყენება ცილების დასამარილად.

ცილების დალექვა ხსნარიდან მათი დენატურაციის გარეშე ხდება დეჰიდროგენაციის საშუალებების - ორგანული გამხსნელების (ეთანოლი, აცეტონი) გამოყენებით.

გელის ფილტრაციაიგი ეფუძნება ცილების დაყოფას მოლეკულის ზომისა და ფორმის მიხედვით. გამოყოფა ხორციელდება ქრომატოგრაფიულ სვეტებში, რომლებიც სავსეა ფოროვანი გელის გრანულებით (სეფადექსი, აგაროზა) ბუფერულ ხსნარში გარკვეული pH მნიშვნელობით. გელის გრანულები ცილებისთვის გამტარია გარკვეული საშუალო დიამეტრის შიდა არხების (ფორების) გამო, რომელთა ზომა დამოკიდებულია გელის ტიპზე (Sephadex G-25, G-200 და სხვ.). ცილების ნარევი შეჰყავთ სვეტში და შემდეგ გამოირეცხება (გამოირეცხება) ბუფერული ხსნარით გარკვეული pH მნიშვნელობით. ცილის დიდი მოლეკულები არ შეაღწევენ გელის ფორებში და მოძრაობენ გამხსნელთან ერთად დიდი სიჩქარით. დაბალმოლეკულური წონის მინარევის (მარილის) ან სხვა ცილის მცირე მოლეკულები ინარჩუნებს გელის გრანულებს და უფრო ნელა გამოირეცხება სვეტიდან (ნახ. 1.29). სვეტის გამოსასვლელში ხსნარი (ელუატი) გროვდება ცალკე ფრაქციებად.

ბრინჯი. 1.29. ცილების გამოყოფა გელის ფილტრაციით

ელექტროფორეზიდაფუძნებულია დამუხტული ცილის მოლეკულების თვისებაზე, გადაადგილდნენ ელექტრულ ველში მათი მთლიანი მუხტის პროპორციული სიჩქარით. ცილები, რომლებსაც აქვთ მთლიანი უარყოფითი მუხტი მოცემულ pH-ზე, მოძრაობენ ანოდისკენ, ხოლო დადებითი - კათოდისკენ. ელექტროფორეზი ტარდება სხვადასხვა მედიაზე: ქაღალდი, სახამებლის გელი, პოლიაკრილამიდური გელი და ა.შ. მოძრაობის სიჩქარე დამოკიდებულია ცილის მოლეკულების მუხტზე, მასაზე და ფორმაზე. ელექტროფორეზის დასრულების შემდეგ მატარებელზე ცილოვანი ზონები იღებება სპეციალური საღებავებით (სურ. 1.30, ა).

გელში ელექტროფორეზის გარჩევადობა უფრო მაღალია, ვიდრე ქაღალდზე, ამიტომ სისხლის შრატის ცილების ელექტროფორეზის დროს 5 ფრაქცია (ალბუმინები, α 1 -, α 2 -, β-, γ-გლობულინები) იზოლირებულია ქაღალდზე, ხოლო 18-მდე. ფრაქციები პოლიაკრილამიდის გელში (სურ. 1.30, B).

ბრინჯი. 1.30. ჯანმრთელი ადამიანის სისხლის შრატის ცილების ელექტროფეროგრამა

ა- სისხლის შრატის ცილების ელექტროფეროგრამა ქაღალდზე;

ბ- სხვადასხვა ფრაქციების პლაზმის ცილების რაოდენობა.

I - γ-გლობულინები; II - β-გლობულინები; III - a 2 -გლობულინები;

IV - a 1 -გლობულინები; V - ალბუმინები

იონგაცვლის ქრომატოგრაფიაეფუძნება ცილების გამოყოფას, რომლებიც განსხვავდება მთლიანი მუხტით. პროტეინის ხსნარი გარკვეული pH მნიშვნელობით გადადის ქრომატოგრაფიულ სვეტში, რომელიც სავსეა მყარი ფოროვანი სორბენტით, ხოლო ზოგიერთი ცილა შენარჩუნებულია ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების შედეგად. როგორც სორბენტი იონგამცვლელები გამოიყენება: ანიონგამცვლელები (კათიონური ჯგუფების შემცველი) მჟავე ცილების იზოლირებისთვის; კათიონ გადამცვლელები (ანიონური ჯგუფების შემცველი) ძირითადი ცილების იზოლირებისთვის.

როდესაც ცილა გადის სვეტში, მისი შებოჭვის სიძლიერე დამოკიდებულია სორბენტის მუხტის სიდიდეზე. იონგაცვლის სორბენტზე ადსორბირებული ცილები გამოირეცხება ბუფერული ხსნარებით სხვადასხვა მარილის კონცენტრაციით და pH-ით, მიიღება სხვადასხვა ცილის ფრაქციები.

აფინური ქრომატოგრაფიადაფუძნებულია ცილებთან დაკავშირების სპეციფიკაზე მყარ საყრდენზე მიმაგრებულ ლიგანდთან. ლიგანდებად გამოიყენება ფერმენტული სუბსტრატები, ჰოლოპროტეინების პროთეზირების ჯგუფები, ანტიგენები და სხვ. როდესაც ცილების ნაზავი გადის სვეტში, ლიგანდს მიმაგრებულია მხოლოდ დამატებითი ცილა (სურ. 1.31, A), დანარჩენი ხსნარით გამოდის. ადსორბირებული ცილა გამოირეცხება სხვადასხვა pH მნიშვნელობის მქონე ხსნარით (ნახ. 1.31, B). ეს მეთოდი უაღრესად სპეციფიკურია და შესაძლებელს ხდის მაღალგანწმენდილი ცილოვანი პრეპარატების მიღებას.

ცილის იზოლაცია და გაწმენდა ჩვეულებრივ ხდება რამდენიმე ეტაპად სხვადასხვა მეთოდის გამოყენებით. ნაბიჯების თანმიმდევრობა არჩეულია ემპირიულად და შეიძლება განსხვავდებოდეს სხვადასხვა პროტეინისთვის. ცილების გაწმენდის მაღალი ხარისხი ძალზე მნიშვნელოვანია როგორც მათი სამკურნალოდ გამოყენებისას (ჰორმონი ინსულინი და ა.შ.), ასევე სხვადასხვა დაავადების დიაგნოსტირებისას ქსოვილების, სისხლის, ნერწყვის და ა.შ. ცილის შემადგენლობის შეცვლით.

ზრდასრული ადამიანის სხვადასხვა ორგანოების უჯრედებში ცილების ნაკრები ინდივიდუალურია და შედარებით მუდმივია მთელი ცხოვრების მანძილზე. სპეციალიზებული ქსოვილები შეიძლება შეიცავდეს სპეციფიკურ ცილებს, როგორიცაა ჰემოგლობინი სისხლის წითელ უჯრედებში, აქტინი და მიოზინი კუნთებში, როდოპსინი ბადურაში და სხვადასხვა სახის კოლაგენი ძვლებში და შემაერთებელ ქსოვილებში. ზოგიერთი ცილა გვხვდება ბევრ ქსოვილში, მაგრამ სხვადასხვა რაოდენობით. შერჩეული შემადგენლობა იცვლება

ბრინჯი. 1.31. ცილების გამოყოფა აფინური ქრომატოგრაფიით

ა- გამოყოფილი ცილის შეკავშირება ნეიტრალურ მატარებელთან დამაგრებულ სპეციფიკურ ლიგანდთან; ბ- ინდივიდუალური ცილის ხსნარის მიღება

ქსოვილებისა და სისხლის ცილები შესაძლებელია და დაკავშირებულია პირველ რიგში ადამიანის დიეტასთან, საკვების შემადგენლობასთან და ფიზიკურ აქტივობასთან.

დაავადებებში სისხლისა და ქსოვილის უჯრედების ცილოვანი შემადგენლობა შეიძლება მნიშვნელოვნად შეიცვალოს, ხშირად ვითარდება ცილის დეფიციტი ან მისი აქტივობის დაქვეითება - პროტეინოპათია.ამიტომ, სისხლისა და ქსოვილების ცილის შემადგენლობის გამოხატული ცვლილებების განსაზღვრა გამოიყენება კლინიკურ კვლევებში სხვადასხვა დაავადების დიაგნოსტიკისთვის.

მას შემდეგ, რაც ცილის ნარევი გამოიყოფა ბიოლოგიური მასალისგან, იგი იყოფა ცალკეულ ცილოვან ფრაქციებად. შემუშავებულია ცილების ფრაქციების რამდენიმე მეთოდი, რომელიც ეფუძნება ცილების სხვადასხვა ფიზიკურ-ქიმიურ თვისებებს.

– ცილების დალექვა იზოელექტრულ წერტილში - მეთოდი დაფუძნებულია ცილების თვისებაზე, იზოელექტრიკულ წერტილში დალექონ ცილის მოლეკულის მუხტის განეიტრალების გამო. თითოეული ცილისთვის იზოელექტრული წერტილის მნიშვნელობა მკაცრად ინდივიდუალურია, ამიტომ ამ მეთოდით შესაძლებელია ცალკეული ცილების იზოლირება (მეტი ინფორმაციისთვის მეთოდის შესახებ იხილეთ ლაბორატორიული ნაშრომი No3 ბიოქიმიის კურსში).

– ცილის დანაწილება მარილის გამოყოფით - ნეიტრალური მარილების კონცენტრირებულ ხსნარებში ცილების განსხვავებული ხსნადობის საფუძველზე, მოლეკულური წონის მიხედვით (მეტი დეტალისთვის მეთოდის შესახებ იხილეთ ლაბორატორიული ნაშრომი No3 კურსში „ბიოქიმია“).

– ელექტროფორეზული გამოყოფის მეთოდი ცილები ფრაქციებად - აღწერილია განყოფილებაში ცილების ფიზიკოქიმიური თვისებების შესახებ.

ცილების ფრაქციებად გამოყოფის ზემოაღნიშნული მეთოდების გარდა, ისინი ფართოდ გამოიყენება. ქრომატოგრაფიული მეთოდები . ყველაზე ხშირად გამოიყენება სვეტის ქრომატოგრაფია.

ამ მეთოდის თავისებურება ის არის, რომ სხვადასხვა ცილების და პეპტიდების მოლეკულების ნარევი გადის სვეტში, რომელიც შეიცავს მყარი ფოროვანი მასალის (მატრიცას). მატრიქსთან ურთიერთქმედების შედეგად, სხვადასხვა ცილა გადის სვეტში სხვადასხვა სიჩქარით. მას შემდეგ, რაც ცილები მიაღწევენ სვეტის ფსკერს გარკვეული თანმიმდევრობით, ისინი აგროვებენ ცალკეულ ფრაქციებს სინჯარებში.

გამოყოფა სამი ძირითადი ტიპისვეტის ქრომატოგრაფია:

– იონური გაცვლა - ცილის ქრომატოგრაფიისთვის გამოიყენება ცელულოზაზე ან სხვა ჰიდროფილურ პოლიმერებზე დაფუძნებული იონური გადამცვლელები, მაგალითად, დიეთილამინეთილცელულოზა (DEAE-ცელულოზა), რომელიც შეიცავს კატიონურ ჯგუფებს (უარყოფითი მუხტი) ან შეიცავს კარბოქსიმეთილცელულოზას (CM-ცელულოზა), რომელიც შეიცავს ამინ ჯგუფებს (დადებითი მუხტი):

DEAE-ცელულოზასთან ცილებთან შეკავშირების ძალა რაც უფრო მაღალია, მით მეტია კარბოქსილის ჯგუფი ცილის მოლეკულაში. DEAE-ცელულოზაზე ადსორბირებული ცილები შეიძლება გაირეცხოს (გამოირეცხოს) სვეტიდან ნატრიუმის ქლორიდის მზარდი კონცენტრაციის მქონე ხსნარებით. პირველ რიგში, სუსტად შეკრული პროტეინები გამოირეცხება და მარილის კონცენტრაციის მატებასთან ერთად, სხვა ცილები გამოიყოფა, რათა გაიზარდოს მათი აფინურობა DEAE-ცელულოზასთან.

KM-ცელულოზა გამოიყენება ანალოგიურად, მაგრამ მის მიმართ ცილების მიდრეკილება პირდაპირპროპორციულია ცილის მოლეკულაში ამინოჯგუფების რაოდენობაზე.

შეკრული ცილის მოსაშორებლად, ელუენტის pH ასევე იცვლება.

– გელის ქრომატოგრაფია - აქვს მეორე სახელი "მოლეკულური საცრის მეთოდი". სეფადექსი (დექსტრანის პოლისაქარიდი დამუშავებული ეპიქლორჰიდრინი) გამოიყენება საცერად. სეფადექსის მარცვლები იშლება წყალში და ქმნის გელს. ადიდებულ გრანულებს აქვს გარკვეული დიამეტრის ფორები.

განცალკევება ემყარება იმ ფაქტს, რომ სეფადექსის მარცვლები (გრანულების ფორები) გაუმტარი ან შეზღუდულია დიდი მოლეკულური წონის ნივთიერებების მიმართ, ხოლო მცირე მოლეკულები თავისუფლად იშლება (შეაღწევს) მარცვლების ფორებში.

ადიდებულმა სეფადექსის გელისმაგვარი მასა მოთავსებულია მინის სვეტში (მილაკში), ცილოვანი ხსნარის ფენა გამოიყენება გელის ზედაპირზე (სურ. 12, ა) და შემდეგ გადადის ბუფერული ხსნარი (გამომრეცხავი სითხე). სვეტის მეშვეობით. ცილები გადის გრანულებს შორის სვეტის გასწვრივ უფრო ნელა, რაც უფრო დაბალია მათი მოლეკულური წონა, ვინაიდან ცილის მოლეკულები კიდევ უფრო დაბალი მოლეკულური მასით უფრო ადვილად იშლება გრანულებში (ფორებში) (ნახ. 12).

ბრინჯი. 12. ცილის ფრაქციაცია გელის ფილტრაციით

ცილები იშლება (გამოირეცხება) სვეტიდან მოლეკულური წონის კლებადობით. შესაბამისად, ჯერ იხსნება ცილის დიდი მოლეკულები (ნახ. 12ბ), რომლებიც არ იშლება მარცვლებში, შემდეგ მცირე მოლეკულებში და ბოლოს, დაბალი მოლეკულური წონის მინარევებისაგან.

ეს მეთოდი გამოიყენება არა მხოლოდ ცილების მოლეკულური წონის მიხედვით დანაწილებისთვის, არამედ მათი დაბალმოლეკულური მინარევებისაგან გასაწმენდად.

– აფინური ქრომატოგრაფია ან აფინური ქრომატოგრაფია. მეთოდის პრინციპი მდგომარეობს იმაში, რომ ხდება ცილების შერჩევითი ურთიერთქმედება სპეციფიკურ ნივთიერებებთან - ლიგანდებთან, რომლებიც ფიქსირდება მატარებლებზე (სურ. 13).

ციანოგენ ბრომიდით გააქტიურებული სეფაროზა გამოიყენება როგორც გადამზიდავი. სეფაროზას მიმაგრებულია სხვადასხვა წარმოშობის ლიგანდები - სუბსტრატი, ან ანტიგენი, ან რეცეპტორი, რომელიც ნაზავიდან მხოლოდ ერთ ცილას აკავშირებს:

– სუბსტრატი → ფერმენტი;

– ანტიგენი → ანტისხეული;

– ამ ჰორმონის ჰორმონი → რეცეპტორი.

სხვა ცილები, რომლებიც არ არის დაკავშირებული ლიგანდთან, ამოღებულია სვეტის გარეცხვით.

ბრინჯი. 13. აფინური ქრომატოგრაფიის მექანიზმი

სვეტიდან აფინურობით ფიქსირებული ცილის ამოღება ხორციელდება ბუფერული ხსნარის (ელუენტის) გამოყენებით. ბუფერში შეჰყავთ სარეცხი საშუალება, რომელიც ასუსტებს კავშირს ცილასა და ლიგანდს შორის, ან სვეტში გადადის თავისუფალი ლიგანდის მაღალი კონცენტრაციის მქონე ხსნარი. ამ შემთხვევაში ცილა უფრო ადვილად უერთდება თავისუფალ ლიგანდს და ირეცხება (გამოირეცხება) სვეტიდან.

ლაბორატორია #8

ცილების ელექტროფორეზული გამოყოფა

მეთოდი ეფუძნება იმ ფაქტს, რომ ცილის მოლეკულებს აქვთ ელექტრული მუხტი, რომლის სიდიდე და ნიშანი განისაზღვრება ცილის ამინომჟავის შემადგენლობით, pH-ით და გარემოს იონური სიძლიერით. გარე ელექტრული ველის გავლენის ქვეშ დამუხტული მოლეკულები ხსნარში გადადიან საპირისპიროდ დამუხტულ ბოძზე. ცილის ნაწილაკების მოძრაობის სიჩქარე პროპორციულია მათი მუხტის სიდიდისა და უკუპროპორციულია ნაწილაკების ზომისა და მათი ჰიდრატაციის ხარისხზე.

ახლა ფართოდ გამოიყენება ეგრეთ წოდებული „ზონალური ელექტროფორეზი“ - ელექტროფორეზი მყარ მატარებელზე (ქაღალდის ზოლებზე, აგარს, სახამებელზე, აკრილამიდზე), რომელიც გაჟღენთილია ბუფერული ხსნარით სასურველი pH მნიშვნელობით. ცილების პოზიცია ქაღალდზე ან გელზე განისაზღვრება მათი დაფიქსირებით და შემდეგ შეღებვით ამა თუ იმ საღებავით (ჩვეულებრივ ბრომფენოლის ლურჯი, ამიდური შავი ან Coomassie ლურჯი). ცილის რაოდენობა თითოეულ ფრაქციაში შეიძლება უხეშად განისაზღვროს ასოცირებული საღებავის ფერის ინტენსივობით. ასეთი განმარტება არ იძლევა ცილის ფრაქციების მკაცრად რაოდენობრივ თანაფარდობას, ვინაიდან სხვადასხვა ცილებით შეკრული საღებავის რაოდენობა არ არის იგივე.

ელექტროფორეზი HA ქაღალდი

გაანალიზებული ნარევის გამოყოფა ხდება ელექტროფორეზის მოწყობილობებში ბუფერული ხსნარით გაჟღენთილ ქრომატოგრაფიულ ქაღალდზე. ცილები გამოყოფილია 500 ვ-მდე ძაბვით.

ელექტროფორეზის კამერა შედგება პლექსიგლასის აბაზანისა და მასზე მორგებული სახურავისგან. (1). აბაზანას აქვს 2 ელექტროდის განყოფილება (2), რომელთაგან თითოეული გამოყოფილია გრძივი დანაყოფით. (3) ორ განყოფილებად, რომლებიც ურთიერთობენ ერთმანეთთან. Bo კუპეების შიდა კუპეები აქვეითებენ ელექტროდებს, ხოლო ქაღალდის ბოლოები გარედან იჭრება. (4), რომლის ძირითადი ნაწილი მოთავსებულია ჰორიზონტალურ ფირფიტაზე წვეტით (5), რომელიც მდებარეობს კამერის ცენტრალურ ნაწილში. ჰორიზონტალურ ფირფიტასა და ელექტროდის ნაწილების გარე განყოფილებას შორის არის ჩხირები (6),

ნახ.2. მოწყობილობის სქემა დაბალი ძაბვის ელექტროფორეზისთვის

რომლის მეშვეობითაც იყრება ქაღალდის ზოლები და რომლებიც ემსახურება მათ საყრდენს. კამერის ზედა საფარის ქვეშ მოთავსებულია პლექსიგლასისგან დამზადებული ფირფიტა დიდი მრგვალი ნახვრეტებით (7), რომელზედაც ზემოდან დევს გამოხდილ წყალში 4-5-ჯერ დაკეცილი ფილტრის ქაღალდის ფურცლები. ეს ფურცლები ხელს უწყობს კამერის შებოჭილობის გაზრდას და, შედეგად, ელექტროფორეზის დროს ელექტროფორეგრამებიდან სითხის აორთქლების შემცირებას.

ქაღალდზე ელექტროფორეზით, სტუდენტებს ეწვევათ სისხლის შრატის ცილების გამოყოფა. ამ მეთოდით სისხლის შრატი შეიძლება დაიყოს 5-9 ფრაქციად და თითოეულ მათგანში განისაზღვროს პროტეინის ფარდობითი შემცველობა. გამოყოფა ხორციელდება ბუფერულ ხსნარში (pH 8.6 - 8.9) ოთახის ტემპერატურაზე 3 - 5 ვ/სმ პოტენციურ გრადიენტზე (120 - 350 ვ 40 - 45 სმ სიგრძის ზოლებისთვის). დენის სიძლიერე არ უნდა აღემატებოდეს 0,1 - 0,3 mA-ს ქაღალდის ზოლის კვეთის სანტიმეტრზე. დენის სიძლიერის 2-ჯერ მეტი ზრდა მიუღებელია, რადგან ეს იწვევს გადაჭარბებულ გათბობას, აორთქლების მნიშვნელოვან ზრდას და ვსაბოლოო შედეგი - ქაღალდის წვა

რეაგენტები:

1. ბუფერული ხსნარი. შეიძლება გამოყენებულ იქნას:

ა) ვერონალ-მედინალური ბუფერი (pH 8,6): 10,32 გმედინალი (ვერონალური ნატრიუმის მარილი) გავხსნათ 300 მლ გამოხდილ წყალში, დავამატოთ 1,84 გვერონალი, ვადუღოთ წყლის აბაზანაში გახსნამდე და გავაზავოთ წყლით 1 ლ-მდე;

ბ) ვერონალის აცეტატის ბუფერი (pH 8,6): 4,3 გვერონალი, 0,95 ნატრიუმის ჰიდროქსიდი და 3,24 ნატრიუმის ჰიდროქსიდი იხსნება 300 მლ გამოხდილ წყალში. ხსნარს დაუმატეთ 30 მლ 0,1 მ HCl ხსნარი და განზავეთ 1 ლიტრამდე წყლით;

გ) ტრის ბუფერი (pH 8,9): 60,5 გ ტრისი, 6 გ ეთილენდიამინტეტრაძმარმჟავა და 4,6 გ ბორის მჟავა იხსნება 1 ლ გამოხდილ წყალში.

2. ელექტროფორეგრამების შეღებვის ხსნარები:

ა) მჟავა ლურჯი შავი საღებავი (მსგავსი ამიდური შავი 10 B) -0,2 გ ნარევში: ძმარმჟავა (მყინვარული) - 100 მლ + მეთილის სპირტი - 900 მლ;

ბ) ბრომფენოლის ლურჯი - 0,5 გ, სუბლიმატი - 10 გ, ძმარმჟავა (მყინვარული) - 20 მლ, გამოხდილი წყალი - 980 მლ;

გ) ბრომფენოლის ლურჯი - 0,1 გ, ZnSO 4 7H 2 O -50 გ, ძმარმჟავა (მყინვარული) 50 მლ, გამოხდილი წყალი - 900 მლ.

3. ხსნარები ელექტროფორეგრამების სარეცხი საღებავისგან, რომელიც არ არის შეკრული ცილაზე და საღებავის ცილაზე დასამაგრებლად:

ა) ძმარმჟავა - 2% ხსნარი;

ბ) ნატრიუმის აცეტატი – 2%-იანი ხსნარი მომზადებული 10%-იანი ძმარმჟავას ხსნარით.

4. ელექტროფეროგრამებიდან ფერადი პროდუქტების გამორეცხვის ხსნარები:

ა) ბრომფენოლ ლურჯის ექსტრაქციისთვის - 0,01 M NaOH ხსნარი;

ბ) მჟავე ცისფერ-შავი საღებავის ამოსაღებად - 0,1 მ NaOH ხსნარი.

აღჭურვილობა: საცდელი მილები; კუვეტები, სპექტროფოტომეტრი, ელექტროფორეზის მოწყობილობა, ქრომატოგრაფიული ქაღალდი: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM და ა.შ.

სისხლის შრატის მიღება. 2 - 3 მლ სისხლი იღებენ მშრალ ცენტრიფუგის მილში და ტოვებენ 1/2 - 1 სთ. თხელი მინის ღერო გულდასმით შემოავლებენ მილის კედლებს, რათა გამოეყოს თრომბო მათგან, ცენტრიფუგირდება და შრატი ასხამენ სუფთა მილი.

კამერის მომზადება.ელექტროდის განყოფილებები ივსება ბუფერული ხსნარით იმავე დონეზე (ბუფერის გადინების თავიდან ასაცილებლად), დაახლოებით 800 მლ თითოეულ განყოფილებაში. Bo ელექტროდის ნაწილების შიდა ნაწილები ჩაძირავს ელექტროდებს. ქრომატოგრაფიული ქაღალდის ფურცელზე (18x45 სმ) (თხელი კლასების ქაღალდის გამოყენებისას უმჯობესია ნიმუშები ცალკე 4-5 სმ სიგანის ზოლებზე წაისვათ) მისი ერთ-ერთი ვიწრო მხრიდან 15 სმ დაშორებით მარტივი რბილი ფანქრით. (გრაფიტი ხელს უშლის სითხის გავრცელებას) დახაზეთ ნიმუშების გამოყენების ადგილები. ისინი მართკუთხედებია (2 x 0,3 სმ), რომელთა დიდი გვერდები პერპენდიკულარულია ქაღალდის ზოლის სიგრძეზე. სასტარტო ზონებსა და ელექტროფეროგრამის კიდეებს შორის მანძილი არის -2 სმ ელექტროფეროგრამა გაჟღენთილია ბუფერით, რომელშიც ჩატარდება ელექტროფორეზი. ამისათვის იგი გაიყვანება კუვეტის მეშვეობით ბუფერული ხსნარით. ქაღალდის ზოლების ბოლოები (6-8 სმ) არ არის დასველებული. ჭარბი ბუფერი იხსნება ფილტრის ქაღალდის ორ ან სამ ფურცელს შორის ზოლების გასუფთავებით. სველი ელექტროფეროგრამა მოთავსებულია კამერაში ცენტრალურ ჰორიზონტალურ ფირფიტაზე (5), ბოლოები ჩაშვებულია ელექტროდის განყოფილებების გარე განყოფილებებში, მოწყობილობა მჭიდროდ იკეტება სახურავით, რომლის ქვეშ არის წყლით დასველებული ფილტრის ფურცლები. .

ელექტროფორეზის ჩატარება.მას შემდეგ, რაც ქაღალდის ზოლები მთლიანად გაჯერებულია ბუფერული ხსნარით, ნიმუშები გამოიყენება მონიშნულ ადგილებში 0,1 მლ პიპეტის გამოყენებით: 0,01 - 0,02 მლ (1 - 2 მგ ცილა) შრატი. კამერა დახურულია სახურავით და დენი ჩართულია. ელექტროფორეზის ხანგრძლივობაა 22 - 24 საათი 200 - 300 ვ ძაბვის დროს.

ელექტროფორეგრამების ფიქსაცია და შეღებვა.ელექტროფორეზის ბოლოს გამორთეთ დენი და დაუყოვნებლივ ამოიღეთ ელექტროფეროგრამები მოწყობილობიდან. ათავსებენ სპეციალურ სადგამზე და აშრობენ ჰაერში ნაკადის ქვეშ, შემდეგ ღუმელში 105ºC ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში ქაღალდზე ცილების დასამაგრებლად, რის შემდეგაც ათავსებენ ემალირებულ კუვეტაში, ავსებენ საღებავით და ტოვებენ 2-3 საათის განმავლობაში. ან მეტი. საღებავს აცლიან და ელექტროფორეგრამებს რეცხავენ მისი ჭარბიდან 3-4-ჯერ დატბორვით ძმარმჟავას 2%-იანი ხსნარით, ყოველ ჯერზე 5-10 წუთის განმავლობაში. ქაღალდის ის ადგილები, რომლებიც არ შეიცავს პროტეინს, სრულიად თავისუფალი უნდა იყოს საღებავისგან. ელექტროფორეგრამის ფერადი პროდუქტების დასაფიქსირებლად მათ 2 წუთის განმავლობაში ასხამენ ნატრიუმის აცეტატის 2%-იან ხსნარს და აშრობენ ჰაერში ნაკადის ქვეშ.

ცალკეული ცილოვანი ფრაქციების თანაფარდობის განსაზღვრა. pH 8.6-ზე შრატის ცილები უარყოფითად არის დამუხტული და ელექტრულ ველში მოძრაობენ ანოდისკენ. ანოდამდე ყველაზე სწრაფად მოძრავი ფრაქცია არის ალბუმინი, რასაც მოჰყვება α 1 -, α 2 -, β- და γ-გლობულინები (იხ. სურ. 3). . ქაღალდის ლენტების სექციები, რომლებზეც ჩნდება ცილოვანი ლაქები, განივი ხაზებით იყოფა მარტივი ფანქრით 3-5 მმ სიგანის ზოლებად და იჭრება ამ ხაზების გასწვრივ. თითოეულ ზოლს აჭედებენ და ათავსებენ ცალკე დანომრილ სინჯარაში, ასხამენ 3 მლ 0,01 M NaOH ხსნარში, ტოვებენ 1 საათის განმავლობაში საღებავის ქაღალდიდან ამოღების მიზნით და შემდეგ ფოტოკოლორიმეტრზე (სპექტროფოტომეტრი) თითოეული ხსნარის ოპტიკური სიმკვრივის მნიშვნელობას ვხვდებით. ) 612 ნმ.

ბრინჯი. 3. ადამიანის სისხლის შრატის ელექტროფეროგრამა და ცილის ფრაქციების განაწილების მრუდი

ამავდროულად მუშავდება საკონტროლო ნიმუში. ამისათვის ელექტროფეროგრამის გაუფერულ მონაკვეთებს აჭრიან ზოლს.

მიღებული მონაცემების საფუძველზე ელექტროფორეგრამაზე აგებულია ფერადი პროდუქტების განაწილების მრუდი, აბსცისის ღერძები აღნიშნავს საცდელი მილების რაოდენობას, ორდინატთა ღერძები მიუთითებს შესაბამის ოპტიკური სიმკვრივის მნიშვნელობაზე (იხ. სურ. 3). . გამოთვალეთ ცილის ფრაქციების პროცენტი სისხლის შრატში. ამისათვის შედგენილი მრუდი დაყოფილია მინიმუმებით რამდენიმე მონაკვეთად, რომლებიც შეესაბამება ცალკეულ წილადებს. თითოეული მონაკვეთის ფართობის ზომა პროპორციულია საღებავის რაოდენობისა, რომელიც შერწყმულია ამ ფრაქციის ცილასთან. ამ უბნებს შორის თანაფარდობა გამოითვლება წონით (ქაღალდის მონაკვეთების წონა მათი ფართობის პროპორციულია), მთელი ფართობი აღებულია როგორც 100%. დენსიტომეტრის არსებობისას სისხლის შრატში ცილოვანი ფრაქციების თანაფარდობა შეიძლება განისაზღვროს დენსიტოგრამიდან.

შრატში ცილის შემცველობის წინასწარ განსაზღვრისას, გამოთვალეთ მისი რაოდენობა თითოეული ფრაქციისთვის.