Imuni sistem. Inducibilni faktori odbrane organizma (imuni sistem). Glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC prve i druge klase). MHC I i MHC II geni.
Imuni sistem- skup organa, tkiva i ćelija koji osiguravaju strukturnu i genetsku postojanost ćelija tijela; formira drugu liniju odbrane organizma. Funkcije prve barijere na putu stranih agenasa obavljaju koža i sluzokože, masne kiseline (koje su dio lučenja lojnih žlijezda kože) i visoka kiselost želučanog soka, normalna mikroflora tijelo, kao i stanice koje obavljaju funkcije nespecifične zaštite od infektivnih agenasa.
Imuni sistem sposoban je prepoznati milione različitih supstanci, otkrivajući suptilne razlike čak i između molekula slične strukture. Optimalno funkcionisanje sistema obezbeđuju suptilni mehanizmi interakcije između limfoidnih ćelija i makrofaga, koji se odvijaju direktnim kontaktima i uz učešće rastvorljivih medijatora (medijatora imunog sistema). Sistem ima imunološke memorije, pohranjivanje informacija o prethodnim izloženostima antigenima. Principi održavanja strukturne postojanosti tijela („antigenska čistoća“) zasnivaju se na prepoznavanju „prijatelja ili neprijatelja“.
Za to postoje glikoproteinski receptori (Ag) na površini ćelija tijela, koji čine glavni kompleks histokompatibilnosti - WPC[sa engleskog. glavni kompleks histokompatibilnosti]. Ako je struktura ovih antigena narušena, odnosno promjena „sopstvenih“, imunološki sistem ih smatra „vanzemaljcima“.
Spektar MHC molekula je jedinstven za svaki organizam i određuje njegovu biološku individualnost; ovo vam omogućava da razlikujete "svoje" ( histokompatibilan) od "stranog" (nekompatibilno). Alocirajte gene i Ag dvije glavne klase WPC.
Glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC prve i druge klase). MHC I i MHC II geni.
Molekuli I i II klase kontrolišu imuni odgovor. One su prepoznate površinskom diferencijacijom CD-Ar ciljnih ćelija i uključene su u ćelijske reakcije citotoksičnosti posredovane citotoksičnim T-limfocitima (CTL).
MHC geni klase I odrediti tkivni Ag; Ag klasa MHC I prisutna na površini svih ćelija sa jezgrom.
MHC geni klase II kontrolni odgovor na timus zavisan Ag; Antigeni klase II se pretežno eksprimiraju na membranama imunokompetentnih ćelija, uključujući makrofage, monocite, B-limfocite i aktivirane T-ćelije.
Na citoplazmatskim membranama gotovo svih ćelija makroorganizma, antigeni histokompatibilnosti. Većina njih pripada sistemumain comhistokompatibilni pleks, ili WPC(skraćeno od engleskog. Main Histokompatibilnost Kompleks).
Antigeni histokompatibilnosti igraju ključnu ulogu u implementaciji specifičnih prepoznavanje "prijatelja ili neprijatelja" I indukcija stečenog imunološkog odgovora. Oni određuju kompatibilnost organa i tkiva tokom transplantacije unutar iste vrste, genetsko ograničenje (ograničenje) imunološkog odgovora i druge efekte.
Velike zasluge u proučavanju MNS-a, kao fenomena biološkog sveta, pripadaju J. Dosseu, P. Dohertyju, P. Goreru, G. Snellu, R. Zinkernagelu, R. V. Petrovu, koji su postali osnivači imunogenetika.
MHC je prvi put otkriven 1960-ih. u eksperimentima na genetski čistim (inbred) linijama miševa u pokušaju interline transplantacije tumorskih tkiva (P. Gorer, G. Snell). Kod miševa je ovaj kompleks nazvan H-2 i mapiran je na 17. hromozom.
Kod ljudi, MHC je opisan nešto kasnije u radovima J. Dossea. Bio je označen kao HLA (skraćeno od engleskog.čovjek Leukocit Antigen ), budući da je povezan sa leukocitima.
BiosintezaHLAodređeno genima, lokaliziran odjednom u nekoliko lokusa kratkog kraka 6. kromosoma.
MHC ima složenu strukturu i visok polimorfizam. Hemijski, antigeni histokompatibilnosti su glikoproteini, čvrsto vezana za citoplazmumatična membrana ćelija. Njihovi pojedinačni fragmenti su strukturna homologija sa molekulima imunoglobulina i stoga pripadaju istoj superfamilija.
Razlikovati dvije glavne klase MHC molekula.
Konvencionalno je prihvaćeno da MHC klase I izaziva pretežno ćelijski imuni odgovor.
MHC klasa II - humoralna.
Glavne klase ujedinjuju mnoge antigene slične po strukturi, koje kodiraju mnogi alelni geni. Istovremeno, na ćelijama pojedinca mogu se eksprimirati najviše dvije varijante proizvoda svakog MHC gena, što je važno za održavanje heterogenosti populacije i opstanak kako pojedinca tako i cijele populacije u cjelini.
WPCIklasa sastoji se od dva nekovalentno povezana polipeptidna lanca različite molekulske težine: teškog alfa lanca i laganog beta lanca. Alfa lanac ima ekstracelularni region sa strukturom domena (al-, a2- i a3-domeni), transmembranski i citoplazmatski. Beta lanac je beta-2 mikroglobulin koji se "lijepi" za a3 domenu nakon ekspresije alfa lanca na citoplazmatskoj membrani ćelije.
Alfa lanac ima visok kapacitet sorpcije za peptide. Ovo svojstvo određuju al- i a2-domeni, koji formiraju takozvani "Bjorkmanov jaz" - hipervarijabilnu regiju odgovornu za sorpciju i prezentaciju molekula antigena. "Bjorkmanov jaz" MHC klase I sadrži nanopeptid, koji se u ovom obliku lako otkriva pomoću specifičnih antitijela.
Proces formiranja kompleksa antigena MHC klase I se nastavlja intracelularno kontinuirano.
Njegov sastav uključuje bilo kojiendogeno sintetizirani peptidi, uključujući viruse. Kompleks se u početku sklapa u endoplazmatskom retikulumu, gdje se uz pomoć posebnog proteina proteazom, transport peptida iz citoplazme. Peptid uključen u kompleks daje strukturnu stabilnost MHC klase I. U njegovom nedostatku, funkciju stabilizatora obavlja chaperone(kalneksin).
MHC klase I karakteriše visoka stopa biosinteze - proces se završava za 6 sati.
Ovaj kompleks izraženo skoro na površini sve ćelije, osim eritrocita nenuklearne ćelije su odsutnetvuet biosinteza) i ćelije viloznog trofoblasta (“prevencija” odbacivanja fetusa). Gustoća MHC klase I dostiže 7000 molekula po ćeliji, a pokrivaju oko 1% njene površine. Ekspresija molekula je značajno pojačana pod uticajem citokina, kao što je γ-interferon.
Trenutno se kod ljudi razlikuje više od 200 različitih varijanti HLAI klase. Oni su kodirani genima mapiranim u tri glavna sublokusa 6. hromozoma i nasleđuju se i eksprimiraju nezavisno: HLA-A, HLA-B i HLA-C. Lokus A objedinjuje više od 60 varijanti, B - 130, a C - oko 40.
Tipizacija jedinke za HLA klasu I vrši se na limfocitima serološkim metodama - u reakciji mikrolimfocitolize sa specifičnim serumima. Za dijagnozu se koriste poliklonska specifična antitijela koja se nalaze u krvnom serumu višeporodnih žena, pacijenata koji su primili masivnu transfuzijsku terapiju, kao i monoklonska.
S obzirom na nezavisno nasljeđivanje sublokusnih gena, u populaciji se formira beskonačan broj neponavljajućih kombinacija klase HLAI. Stoga je svaka osoba striktno jedinstvena u smislu skupa antigena histokompatibilnosti, sa izuzetkom identičnih blizanaca, koji su apsolutno slični u smislu skupa gena.
Osnovni bioloziakademska uloga HLAIklasa je to oni definišu biološka jedinkaness ("biološki pasoš") i su markeri "sopstvenih" za imunokompetentne ćelije. Infekcija ćelije virusom ili mutacijom mijenja strukturuHLAIklasa. Sadržistrani ili modifikovani peptidi MHC molekulaIklasa ima netipičnustrukture ovog organizma i signal je za aktivaciju T-ubica (CO8 + -lim-fociti). Ćelije koje se razlikuju poIklasauništena kao strano.
MHC 1 -kako bi se olakšalo prepoznavanje intracelularne infekcije.
U strukturi i funkciji WHC-aII klasa ima niz fundamentalnih razlika.
Prvo, imaju složeniju strukturu. Kompleks je formiran od dva nekovalentno povezana polipeptidna lanca (alfa lanac i beta lanac) koji imaju sličnu strukturu domena. Alfa lanac ima jednu globularnu regiju, a beta lanac ima dva. Oba lanca kao transmembranski peptidi sastoje se od tri sekcije - ekstracelularnog, transmembranskog i citoplazmatskog.
Drugo, „Bjorkmanov jaz“ u MHC klasi II formiraju istovremeno oba lanca. Sadrži veći oligopeptid (12-25 aminokiselinskih ostataka), a ovaj je u potpunosti "skriven" unutar ovog jaza i u tom stanju ga ne detektuju specifična antitijela.
Treće, MHC klasa II uključuje peptid uhvaćen iz ekstracelularnog okruženjaendocitozom, ne sintetizira sama ćelija.
četvrto, WPCIIekspresna klasana površini ograničenog brojaćelije: dendriti, B-limfociti, T-pomagači, aktivirani makrofagi, mast, epitelne i endotelne ćelije. Detekcija MHC klase II na atipičnim ćelijama trenutno se smatra imunopatologijom.
Biosinteza MHC klase II odvija se u endoplazmatskom retikulumu, a nastali dimerni kompleks se zatim ugrađuje u citoplazmatsku membranu. Prije nego što se peptid uključi u njega, kompleks se stabilizira pomoću šaperona (kalneksina). MHC klase II se eksprimira na ćelijskoj membrani u roku od sat vremena nakon endocitoze antigena. Ekspresija kompleksa može biti pojačana γ-interferonom i smanjena prostaglandinom E g
Prema dostupnim podacima, ljudsko tijelo karakteriše izuzetno visok HLA polimorfizam II klase, koji je u velikoj mjeri određen strukturnim karakteristikama beta lanca. Kompleks uključuje proizvode tri glavna lokusa: HLA DR, DQ i DP. Istovremeno, DR lokus kombinuje oko 300 alelnih oblika, DQ - oko 400, a DP - oko 500.
Prisustvo i tip antigena histokompatibilnosti klase II određuju se serološkim (mikrolimfocitotoksični test) i reakcijama ćelijskog imuniteta (mešovita kultura limfocita ili MCL). Serološka tipizacija MHC klase II vrši se na B-limfocitima pomoću specifičnih antitijela koja se nalaze u krvnom serumu višeporodnih žena, pacijenata koji su primili masivnu transfuzijsku terapiju, a također su sintetizirana genetskim inženjeringom. Testiranje u SCL otkriva manje komponente MHC klase II koje se serološki ne mogu otkriti. U posljednje vrijeme PCR se sve više koristi.
Biološka uloga MHC-aII klasa je izuzetno velika. U stvari, ovaj kompleks je uključen u indukcija koju je stekaomutan odgovor. Fragmenti molekule antigena eksprimiraju se na citoplazmatskoj membrani posebne grupe ćelija, tzv. ćelije koje predstavljaju antigen (APC). Ovo je još uži krug među ćelijama sposobnim za sintetizaciju MHC klase II. Najaktivnijim APC se smatra dendritična ćelija, zatim B-limfocit i makrofag.
Antigeni histokompatibilnosti su glikoproteini koji se nalaze na površini svih stanica. Prvobitno identificirani kao glavni ciljni antigeni u reakcijama presađivanja. Transplantacija tkiva odraslog donora iste vrste (alotransplantacija) ili druge vrste (ksenotransplantacija) obično rezultira njegovim odbacivanjem. Eksperimenti presađivanja kože između različitih linija miševa pokazali su da je odbacivanje transplantata posljedica imunološkog odgovora na strane antigene smještene na površini njegovih stanica. Kasnije se pokazalo da su T ćelije uključene u ove reakcije. Reakcije su usmjerene protiv genetski "stranih" varijanti glikoproteina ćelijske površine, koje se nazivaju molekuli histokompatibilnosti (tj. kompatibilnost tkiva).
Glavni molekuli histokompatibilnosti su porodica glikoproteina kodiranih genima koji čine glavni kompleks histokompatibilnosti (WPC - glavni kompleks histokompatibilnosti). Unutar MHC-a lokalizirani su geni koji kontroliraju glavne transplantacijske antigene i geni koji određuju intenzitet imunološkog odgovora na određeni antigen, tzv. Ir geni (imuni odgovor). MHC molekuli su prisutni na površini ćelije svih viših kralježnjaka. Prvo su pronađeni kod miševa i nazvani H2 antigeni ( histokompatibilnost-2). Kod ljudi se zovu HLA(leukociti, povezane sa ljudskim leukocitima), budući da su prvobitno pronađeni na leukocitima.
Postoje dvije glavne klase MHC molekula, od kojih je svaka skup glikoproteina na površini ćelije. molekule MHC klasa I izražena na skoro svim ćelijama, molekulima razred II- na ćelije uključene u imunološki odgovor (limfociti, makrofagi). Molekule klase I prepoznaju citotoksične T-ćelije (ubice), koje moraju stupiti u interakciju sa bilo kojom ćelijom tijela koja je zaražena virusom, dok molekule klase II prepoznaju T-pomagači (Tx), koji stupaju u interakciju uglavnom s drugim stanicama. uključeni u imunološke odgovore, kao što su B-limfociti i makrofagi (ćelije koje predstavljaju antigen).
Prema teorija klonske selekcije imuniteta, u tijelu postoje brojne grupe (klonovi) limfocita genetski programiranih da odgovore na jedan ili više antigena. Stoga svaki specifični antigen ima selektivno djelovanje, stimulirajući samo one limfocite koji imaju afinitet za njegove površinske determinante.
Pri prvom susretu sa antigenom (tzv. primarni odgovor) limfociti su stimulirani i podvrgnuti transformaciji u blastne oblike koji su sposobni za proliferaciju i diferencijaciju u imunocite. Kao rezultat proliferacije, povećava se broj limfocita odgovarajućeg klona koji je "prepoznao" antigen. Diferencijacija rezultira dvije vrste ćelija - efektor i ćelije memorija. Efektorske ćelije su direktno uključene u eliminaciju ili neutralizaciju stranog materijala. Efektorske ćelije uključuju aktivirane limfocite i plazma ćelije. Memorijske ćelije su limfociti koji se vraćaju u neaktivno stanje, ali nose informaciju (sjećanje) o susretu sa specifičnim antigenom. Ponovljenim uvođenjem ovog antigena u stanju su da pruže brzi imunološki odgovor većeg intenziteta (tzv. sekundarni odgovor) zbog povećane proliferacije limfocita i stvaranja imunocita.
U zavisnosti od mehanizma uništavanja antigena, razlikuje se ćelijski imunitet i humoralni imunitet.
At ćelijskog imuniteta efektorske ćelije su citotoksični T-limfociti, ili limfociti ubice (ubice). Oni su direktno uključeni u uništavanje stranih ćelija drugih organa ili patoloških vlastitih (na primjer tumorskih) stanica, te luče litičke tvari. Takva reakcija je u osnovi odbacivanja stranih tkiva u uslovima transplantacije ili pod dejstvom hemijskih (senzibilizirajućih) supstanci na koži koje izazivaju preosjetljivost (tzv. preosjetljivost odgođenog tipa) i druge reakcije.
At humoralni imunitet efektorske ćelije su plazma ćelije koje sintetiziraju i luče antitijela u krv.
Neki pojmovi iz praktične medicine:
· agamaglobulinemija(agamaglobulinemija; a- + gama globulini + gr. haima krv; sinonim: hipogamaglobulinemija, sindrom nedostatka antitijela) - opći naziv grupe bolesti koje karakterizira izostanak ili nagli pad razine imunoglobulina u krvnom serumu;
· autoantigeni(auto- + antigeni) - sopstveni normalni antigeni organizma, kao i antigeni koji nastaju pod uticajem različitih bioloških i fizičko-hemijskih faktora, u odnosu na koje se formiraju autoantitela;
· autoimuna reakcija- imuni odgovor organizma na autoantigene;
· alergija (alergije; grčki allos drugo, drugačije + Ergon djelovanje) - stanje izmijenjene reaktivnosti tijela u obliku povećanja njegove osjetljivosti na ponovljeno izlaganje bilo kojim supstancama ili komponentama vlastitih tkiva; Alergija se zasniva na imunološkom odgovoru koji se javlja oštećenjem tkiva;
· aktivni imunitet imunitet koji je rezultat imunološkog odgovora tijela na uvođenje antigena;
Glavne ćelije koje provode imunološke reakcije su T- i B-limfociti (i derivati potonjih - plazma ćelije), makrofagi, kao i niz stanica koje s njima stupaju u interakciju (mastociti, eozinofili, itd.).
· Limfociti
Populacija limfocita je funkcionalno heterogena. Postoje tri glavne vrste limfocita: T-limfociti, B-limfociti i tzv nula limfociti (0-ćelije). Limfociti se razvijaju iz nediferenciranih progenitora limfoidne koštane srži i nakon diferencijacije dobijaju funkcionalne i morfološke karakteristike (prisustvo markera, površinskih receptora) otkrivene imunološkim metodama. 0-limfociti (null) su lišeni površinskih markera i smatraju se rezervnom populacijom nediferenciranih limfocita.
· T-limfociti- najbrojnija populacija limfocita, koja čini 70-90% krvnih limfocita. Razlikuju se u timusnoj žlijezdi - timusu (otuda i njihov naziv), ulaze u krv i limfu i naseljavaju T-zone u perifernim organima imunog sistema - limfne čvorove (duboki dio kortikalne supstance), slezinu (periarterijski omotači limfnih žlezda). nodule), u pojedinačnim i višestrukim folikulima različitih organa, u kojima se pod uticajem antigena formiraju T-imunociti (efektor) i T-memorije. T-limfocite karakterizira prisustvo na plazmalemi posebnih receptora koji mogu specifično prepoznati i vezati antigene. Ovi receptori su proizvodi gena imunog odgovora. T-limfociti obezbeđuju ćelijski imunitet, učestvuju u regulaciji humoralnog imuniteta, vrše proizvodnju citokina pod dejstvom antigena.
U populaciji T-limfocita razlikuje se nekoliko funkcionalnih grupa ćelija: citotoksični limfociti (TC) ili T-ubice(TK), T-pomagači(Tx), T-supresori(Ts). TK su uključeni u reakcije ćelijskog imuniteta, osiguravajući uništavanje (lizu) stranih stanica i vlastitih izmijenjenih stanica (na primjer, tumorske ćelije). Receptori im omogućavaju da prepoznaju proteine virusa i tumorskih ćelija na njihovoj površini. Istovremeno, aktivacija Tc (ubica) se javlja pod uticajem antigeni histokompatibilnosti na površini stranih ćelija.
Osim toga, T-limfociti su uključeni u regulaciju humoralnog imuniteta uz pomoć Tx i Tc. Tx stimulišu diferencijaciju B-limfocita, stvaranje plazma ćelija iz njih i proizvodnju imunoglobulina (Ig). Tx imaju površinske receptore koji se vezuju za proteine na plazmolemi B ćelija i makrofaga, stimulišući Tx i makrofage da proliferiraju, proizvode interleukine (peptidne hormone) i B ćelije da proizvode antitijela.
Dakle, glavna funkcija Tx-a je prepoznavanje stranih antigena (predstavljenih od strane makrofaga), lučenje interleukina koji stimulišu B-limfocite i druge ćelije da učestvuju u imunološkim odgovorima.
· Smanjenje broja Tx u krvi dovodi do slabljenja odbrambenih reakcija organizma (ove osobe su podložnije infekcijama). Zabilježen je nagli pad broja Tx-a kod osoba zaraženih virusom AIDS-a.
· Tc su u stanju da inhibiraju aktivnost Tx, B-limfocita i plazma ćelija. Uključeni su u alergijske reakcije, reakcije preosjetljivosti. Tc potiskuju diferencijaciju B-limfocita.
Jedna od glavnih funkcija T-limfocita je proizvodnja citokini, koji imaju stimulativni ili inhibitorni efekat na ćelije uključene u imunološki odgovor (hemotaktički faktori, faktor inhibitora makrofaga - MIF, nespecifične citotoksične supstance, itd.).
· prirodne ubice. Među limfocitima u krvi, pored gore opisanih Tc, koji obavljaju funkciju ubica, postoje i tzv. prirodni ubice (Hk, NK), koji su također uključeni u ćelijski imunitet. Oni čine prvu liniju odbrane od stranih ćelija, deluju odmah, brzo uništavajući ćelije. NK u vlastitom tijelu uništavaju tumorske stanice i ćelije inficirane virusom. Tc čine drugu liniju odbrane, jer im je potrebno vrijeme da se razviju iz neaktivnih T-limfocita, pa stupaju u akciju kasnije od Hc. NK su veliki limfociti prečnika 12-15 mikrona, imaju režnjevito jezgro i azurofilne granule (lizozome) u citoplazmi.
Razvoj T- i B-limfocita
· Predak svih ćelija imunog sistema je hematopoetska matična ćelija (HSC). HSC su lokalizovani u embrionalnom periodu u žumančanoj vrećici, jetri i slezeni. U kasnijem periodu embriogeneze, pojavljuju se u koštanoj srži i nastavljaju da se razmnožavaju u postnatalnom životu. HSC u koštanoj srži proizvode limfopoetsku progenitornu ćeliju (limfoidnu multipotentnu progenitornu ćeliju) koja stvara dvije vrste ćelija: pre-T ćelije (progenitori T ćelija) i pre-B ćelije (progenitori B ćelija).
Diferencijacija T-limfocita
Pre-T ćelije migriraju iz koštane srži kroz krv do centralnog organa imunog sistema, timusne žlezde. Čak iu periodu embrionalnog razvoja stvara se mikrookruženje u timusnoj žlijezdi, što je važno za diferencijaciju T-limfocita. U formiranju mikrookruženja posebna se uloga pripisuje retikuloepitelnim stanicama ove žlijezde, koje su sposobne proizvoditi niz biološki aktivnih tvari. Pre-T ćelije koje migriraju u timus stiču sposobnost da reaguju na stimulanse iz mikrookruženja. Pre-T ćelije u timusu proliferiraju, transformišu se u T-limfocite koji nose karakteristične membranske antigene (CD4+, CD8+). T-limfociti stvaraju i “isporučuju” u krvotok i timus zavisne zone perifernih limfoidnih organa 3 vrste limfocita: Tc, Tx i Tc. "Djevičanski" T-limfociti koji migriraju iz timusa (virgilni T-limfociti) su kratkog vijeka. Specifična interakcija s antigenom u perifernim limfoidnim organima pokreće procese njihove proliferacije i diferencijacije u zrele i dugovječne stanice (T-efektor i T-memorijske ćelije), koje čine većinu recirkulacijskih T-limfocita.
Ne migriraju sve ćelije iz timusne žlezde. Dio T-limfocita umire. Postoji mišljenje da je uzrok njihove smrti vezanje antigena za antigen-specifičan receptor. U timusu nema stranih antigena, pa ovaj mehanizam može poslužiti za uklanjanje T-limfocita koji mogu reagirati sa vlastitim strukturama tijela, tj. obavljaju funkciju zaštite od autoimunih reakcija. Smrt nekih limfocita je genetski programirana (apoptoza).
· Antigeni diferencijacije T ćelija. U procesu diferencijacije limfocita na njihovoj površini se pojavljuju specifične membranske molekule glikoproteina. Takvi molekuli (antigeni) se mogu detektovati upotrebom specifičnih monoklonskih antitijela. Dobijena su monoklonska antitela koja reaguju samo sa jednim antigenom ćelijske membrane. Koristeći skup monoklonskih antitijela, mogu se identificirati subpopulacije limfocita. Postoje setovi antitijela na antigene diferencijacije ljudskih limfocita. Antitijela formiraju relativno malo grupa (ili "klastera"), od kojih svaka prepoznaje jedan protein na površini ćelije. Izrađena je nomenklatura antigena diferencijacije ljudskih leukocita, detektiranih monoklonskim antitijelima. Ova nomenklatura CD-a ( CD - klaster diferencijacije- diferencijacijski klaster) se zasniva na grupama monoklonskih antitela koja reaguju sa istim antigenima diferencijacije.
· Dobijena su poliklonska antitela na brojne diferencirajuće antigene humanih T-limfocita. Prilikom određivanja ukupne populacije T ćelija mogu se koristiti monoklonska antitela CD specifičnosti (CD2, CD3, CDS, CD6, CD7).
· Poznati su diferencirajući antigeni T-ćelija, koji su karakteristični ili za određene faze ontogeneze, ili za subpopulacije koje se razlikuju po funkcionalnoj aktivnosti. Dakle, CD1 je marker rane faze sazrevanja T-ćelija u timusu. Tokom diferencijacije timocita, CD4 i CD8 markeri se istovremeno eksprimiraju na njihovoj površini. Međutim, nakon toga, CD4 marker nestaje iz dijela ćelija i ostaje samo na subpopulaciji koja je prestala da eksprimira CD8 antigen. Zrele CD4+ ćelije su Th. CD8 antigen se eksprimira na oko ⅓ perifernih T ćelija koje sazrevaju iz CD4+/CD8+ T limfocita. Subpopulacija CD8+ T ćelija uključuje citotoksične i supresorske T limfocite. Antitela na CD4 i CD8 glikoproteine se široko koriste za razlikovanje i razdvajanje T ćelija u Tx i Tc, respektivno.
Pored antigena diferencijacije poznati su i specifični markeri T-limfocita.
· T-ćelijski receptori za antigene su heterodimeri slični antitijelima koji se sastoje od polipeptidnih α- i β-lanaca. Svaki od lanaca je dugačak 280 aminokiselina, a veliki ekstracelularni dio svakog lanca presavijen je u dva domena slična Ig: jednu varijabilnu (V) i jednu konstantnu (C). Heterodimer sličan antitelu kodiran je genima koji se sastavljaju iz nekoliko segmenata gena tokom razvoja T ćelija u timusu.
Razlikovati antigen nezavisnu i antigen zavisnu diferencijaciju i specijalizaciju B- i T-limfocita.
· Nezavisan od antigena proliferacija i diferencijacija su genetski programirani za formiranje ćelija sposobnih da daju specifičan tip imunološkog odgovora kada naiđu na specifični antigen zbog pojave posebnih „receptora“ na plazmolemi limfocita. Odvija se u centralnim organima imuniteta (timus, koštana srž ili Fabriciusova burza kod ptica) pod uticajem specifičnih faktora koje proizvode ćelije koje formiraju mikrookruženje (retikularna stroma ili retikuloepitelne ćelije u timusu).
· zavisna od antigena do proliferacije i diferencijacije T- i B-limfocita dolazi kada naiđu na antigene u perifernim limfoidnim organima, pri čemu se formiraju efektorske ćelije i memorijske ćelije (zadržavaju informacije o delujućem antigenu).
Nastali T-limfociti formiraju bazen dugovečni, recirkulirajući limfociti i B-limfociti - kratko trajaoćelije.
66. Karakteristike B-limfocita.
B-limfociti su glavne ćelije uključene u humoralni imunitet. Kod ljudi se formiraju iz SCM crvene koštane srži, zatim ulaze u krvotok i potom naseljavaju B-zone perifernih limfoidnih organa – slezinu, limfne čvorove, limfne folikule mnogih unutrašnjih organa. Njihova krv sadrži 10-30% ukupne populacije limfocita.
B-limfocite karakterizira prisustvo površinskih imunoglobulinskih receptora (SIg ili MIg) za antigene na plazmalemi. Svaka B ćelija sadrži 50.000-150.000 SIg molekula specifičnih za antigen. U populaciji B-limfocita postoje ćelije sa različitim SIg: većina (⅔) sadrži IgM, manji broj (⅓) sadrži IgG, a oko 1-5% IgA, IgD, IgE. U plazma membrani B-limfocita nalaze se i receptori za komplement (C3) i Fc receptori.
Pod djelovanjem antigena, B-limfociti u perifernim limfoidnim organima se aktiviraju, proliferiraju, diferenciraju se u plazma ćelije, aktivno sintetiziraju antitijela različitih klasa koja ulaze u krv, limfu i tkivnu tekućinu.
Diferencijacija B-limfocita
Prekursori B ćelija (pre-B ćelije) se dalje razvijaju kod ptica u Fabriciusovoj burzi (bursa), odakle potiče naziv B-limfociti, kod ljudi i sisara - u koštanoj srži.
Fabriciusova vrećica (bursa Fabricii) - centralni organ imunopoeze kod ptica, gdje dolazi do razvoja B-limfocita, nalazi se u kloaki. Njegovu mikroskopsku strukturu karakteriše prisustvo brojnih nabora prekrivenih epitelom, u kojima se nalaze limfoidni čvorovi, omeđeni membranom. Čvorići sadrže epiteliocite i limfocite u različitim fazama diferencijacije. Tokom embriogeneze u centru folikula se formira zona mozga, a na periferiji (izvan membrane) kortikalna zona u koju vjerovatno migriraju limfociti iz moždane zone. Zbog činjenice da se u Fabricijevoj burzi kod ptica formiraju samo B-limfociti, to je pogodan objekt za proučavanje strukture i imunoloških karakteristika ove vrste limfocita. Ultramikroskopsku strukturu B-limfocita karakteriše prisustvo grupa ribozoma u obliku rozeta u citoplazmi. Ove ćelije imaju veće jezgre i manje gust hromatin od T-limfocita zbog povećanog sadržaja euhromatina.
B-limfociti se razlikuju od ostalih tipova ćelija po svojoj sposobnosti da sintetiziraju imunoglobuline. Zreli B-limfociti eksprimiraju Ig na ćelijskoj membrani. Takvi membranski imunoglobulini (MIg) funkcionišu kao antigen-specifični receptori.
Pre-B ćelije sintetiziraju intracelularni citoplazmatski IgM, ali nemaju površinske imunoglobulinske receptore. Virgil B limfociti koštane srži imaju IgM receptore na svojoj površini. Zreli B-limfociti nose na svojoj površini imunoglobulinske receptore različitih klasa - IgM, IgG itd.
Diferencirani B-limfociti ulaze u periferne limfoidne organe, gdje pod djelovanjem antigena dolazi do proliferacije i dalje specijalizacije B-limfocita sa formiranjem plazma ćelija i memorijskih B-ćelija (VP).
Tokom svog razvoja, mnoge B ćelije prelaze sa proizvodnje antitela jedne klase na proizvodnju antitela drugih klasa. Ovaj proces se naziva prebacivanje klasa. Sve B ćelije započinju svoju aktivnost sinteze antitela tako što proizvode IgM molekule, koji se ugrađuju u plazma membranu i služe kao receptori za antigen. Tada, čak i prije interakcije s antigenom, većina B ćelija nastavlja sa istovremenu sintezu IgM i IgD molekula. Kada virgil B-ćelija prelazi sa proizvodnje samo IgM vezanog na membranu na istovremenu proizvodnju IgM i IgD vezanog za membranu, promjena je vjerovatno zbog promjene u procesuiranju RNK.
Kada se stimulišu antigenom, neke od ovih ćelija se aktiviraju i počinju da luče IgM antitela, koja dominiraju u primarnom humoralnom odgovoru.
Druge ćelije stimulisane antigenom prelaze na proizvodnju IgG, IgE ili IgA antitela; Memorijske B ćelije nose ova antitijela na svojoj površini, a aktivne B stanice ih luče. IgG, IgE i IgA molekuli se zajednički nazivaju antitijelima sekundarne klase jer se čini da se formiraju tek nakon izazivanja antigena i dominiraju u sekundarnim humoralnim odgovorima.
Uz pomoć monoklonskih antitijela bilo je moguće identificirati određene antigene diferencijacije, koji, čak i prije pojave citoplazmatskih µ-lanaca, omogućavaju da se limfocit koji ih nosi pripiše B-ćelijskoj liniji. Dakle, CD19 antigen je najraniji marker koji omogućava da se limfocit pripiše seriji B-ćelija. Prisutan je na pre-B ćelijama u koštanoj srži, na svim perifernim B ćelijama.
Antigen detektovan monoklonskim antitelima CD20 grupe je specifičan za B-limfocite i karakteriše kasnije faze diferencijacije.
Na histološkim presecima antigen CD20 se detektuje na B-ćelijama germinativnih centara limfoidnih čvorova, u kortikalnoj supstanciji limfnih čvorova. B-limfociti takođe nose niz drugih (npr. CD24, CD37) markera.
67. Makrofagi igraju važnu ulogu kako u prirodnom tako i u stečenom imunitetu organizma. Učešće makrofaga u prirodnom imunitetu očituje se u njihovoj sposobnosti fagocitoze i u sintezi niza aktivnih supstanci – probavnih enzima, komponenti sistema komplementa, fagocitina, lizozima, interferona, endogenog pirogena i dr. faktori prirodnog imuniteta. Njihova uloga u stečenom imunitetu sastoji se u pasivnom transferu antigena do imunokompetentnih ćelija (T- i B-limfociti), u indukciji specifičnog odgovora na antigene. Makrofagi su također uključeni u osiguravanje imunološke homeostaze tako što kontroliraju reprodukciju stanica koje karakteriziraju brojne abnormalnosti (tumorske ćelije).
Za optimalan razvoj imunoloških odgovora pod dejstvom većine antigena neophodno je učešće makrofaga kako u prvoj induktivnoj fazi imuniteta, kada stimulišu limfocite, tako i u njenoj završnoj fazi (produktivnoj), kada učestvuju u proizvodnji antitijela i uništavanje antigena. Antigeni koje fagocitiraju makrofagi izazivaju jači imunološki odgovor od onih koji nisu fagocitirani. Blokada makrofaga unošenjem suspenzije inertnih čestica (na primjer, leševa) u tijelo životinja značajno slabi imunološki odgovor. Makrofagi su sposobni fagocitizirati i topljive (na primjer, proteine) i čestice antigena. Korpuskularni antigeni izazivaju jači imuni odgovor.
Neke vrste antigena, kao što su pneumokoki, koji na površini sadrže komponentu ugljikohidrata, mogu se fagocitirati tek nakon preliminarne opsonizacija. Fagocitoza je znatno olakšana ako se opsoniziraju antigenske determinante stranih stanica, tj. vezano za antitijelo ili kompleks antitijelo-komplement. Proces opsonizacije je obezbeđen prisustvom receptora na membrani makrofaga koji vezuju deo molekula antitela (Fc fragment) ili deo komplementa (C3). Samo antitela IgG klase mogu se direktno vezati za membranu makrofaga kod ljudi kada su u kombinaciji sa odgovarajućim antigenom. IgM se može vezati za membranu makrofaga u prisustvu komplementa. Makrofagi su u stanju da "prepoznaju" rastvorljive antigene, kao što je hemoglobin.
U mehanizmu prepoznavanja antigena dvije faze su usko povezane jedna s drugom. Prvi korak je fagocitoza i probava antigena. U drugoj fazi, fagolizozomi makrofaga akumuliraju polipeptide, rastvorljive antigene (serumski albumini) i korpuskularne bakterijske antigene. Nekoliko uvedenih antigena može se naći u istim fagolizosomima. Proučavanje imunogenosti različitih subcelularnih frakcija otkrilo je da je najaktivnije stvaranje antitijela uzrokovano unošenjem lizosoma u tijelo. Antigen se takođe nalazi u ćelijskim membranama. Većina obrađenog antigenskog materijala koji luče makrofagi ima stimulativni učinak na proliferaciju i diferencijaciju klonova T- i B-limfocita. Mala količina antigenskog materijala može se dugo čuvati u makrofagima u obliku hemijskih jedinjenja koja se sastoje od najmanje 5 peptida (moguće u vezi sa RNK).
U B-zonama limfnih čvorova i slezene nalaze se specijalizirani makrofagi (dendritske ćelije), na čijoj površini se pohranjuju mnogi antigeni koji ulaze u tijelo i prenose se na odgovarajuće klonove B-limfocita. U T-zonama limfnih folikula nalaze se interdigitalne ćelije koje utiču na diferencijaciju klonova T-limfocita.
Dakle, makrofagi su direktno uključeni u kooperativnu interakciju ćelija (T- i B-limfocita) u imunološkim odgovorima tijela.
Charles B . Carpenter (Charles IN . stolar)
Antigeni koji obezbeđuju intraspecifične razlike kod pojedinaca označavaju se kao aloantigeni, a kada se uključe u proces odbacivanja alogenih tkivnih transplantata, postaju poznati kao antigeni tkivne kompatibilnosti (histokompatibilnosti). Evolucija je fiksirala jednu regiju blisko povezanih gena histokompatibilnosti, čiji proizvodi na površini ćelije pružaju snažnu barijeru za alotransplantaciju. Izrazi "glavni antigeni histokompatibilnosti" (glavni antigeni histokompatibilnosti) i "glavni genski kompleks histokompatibilnosti" (MHC) (kompleks glavnih histokompatibilnih gena) odnose se na proizvode gena i gene ove hromozomske regije. Naprotiv, brojni manji antigeni histokompatibilnosti kodirani su višestrukim regijama genoma. Oni odgovaraju slabijim aloantigenim razlikama između molekula koje obavljaju različite funkcije. Strukture koje nose MHC determinante igraju značajnu ulogu u imunitetu i samoprepoznavanju tokom diferencijacije ćelija i tkiva. Informacije o MHC-kontroli imunološkog odgovora dobijene su u eksperimentima na životinjama, kada su geni imunološkog odgovora mapirani unutar MHC-kod miševa (H-2), pacova (RT1), zamoraca (GPLA). Kod ljudi, MHC se zove HLA. Pojedinačna slova skraćenice HLA imaju različita značenja, a prema međunarodnom dogovoru, HLA služi za označavanje ljudskog MHC kompleksa.
O MHC-u se može napraviti nekoliko generalizacija. Prvo, u maloj regiji (manje od 2 centimorgana) MHC kodira tri klase genskih proizvoda. Molekuli klase I, eksprimirani u skoro svim ćelijama, sadrže jedan teški i jedan laki polipeptidni lanac i produkti su tri reduplicirana lokusa - HLA-A, HLA-B i HLA-C. Molekuli klase II, čija je ekspresija ograničena na B-limfocite, monocite i aktivirane T-limfocite, sadrže dva polipeptidna lanca (a i b) nejednake veličine i produkti su nekoliko blisko povezanih gena, zajednički nazvanih HLA-D zona . Molekuli klase III su komponente komplementa C4, C2 i Bf. Drugo, molekuli klase I i II formiraju kompleks sa pseudoantigenom, ili se antigen histokompatibilnosti i pseudoantigen zajedno prepoznaju od strane T-limfocita koji imaju odgovarajući receptor za antigen. Prepoznavanje sebe i ne-sebe na početku i u efektornoj fazi imunog odgovora direktno usmjeravaju molekuli klase I i II. Treće, nema jasnih ograničenja za međućelijske interakcije koje uključuju supresorske T-limfocite kod ljudi, ali je uloga HLA gena prilično važna za neke manifestacije aktivnosti supresorskih T-ćelija. Četvrto, MHC regija sadrži gene za enzimske sisteme koji nisu direktno povezani sa imunitetom, ali su važni za rast i razvoj skeleta. Poznati HLA lokusi na kratkom kraku hromozoma 6 prikazani su na 63-1.
Lokusi HLA sistema. Antigeni klase I. Antigeni HLA klase I se određuju serološki korišćenjem humanih seruma, uglavnom od višeporođajnih žena, au manjoj meri korišćenjem monoklonskih antitela. Antigeni klase I putuju u različitim gustinama u mnogim tjelesnim tkivima, uključujući B ćelije, T ćelije i trombocite, ali ne i na zrele eritrocite. Broj serološki detektabilnih specifičnosti je velik, a HLA sistem je najpolimorfniji od poznatih ljudskih genetskih sistema. Unutar HLA kompleksa, tri lokusa su jasno definisana za serološki detektivne antigene HLA klase I. Svaki antigen klase 1 sadrži b2-mikroglobulinsku podjedinicu (mol. wt. 11500) i teški lanac (mol. wt. 44000) koji nosi antigensku specifičnost (63-2). Postoji 70 dobro definisanih specifičnosti A i B i osam specifičnosti lokusa C. Oznaka HLA se obično koristi u imenovanju antigena glavnog kompleksa histokompatibilnosti, ali se može izostaviti kada kontekst to dozvoljava. Antigeni klasifikovani od strane SZO neubedljivo su označeni sa w iza imena lokusa. Broj iza oznake lokusa služi kao ime antigena. HLA antigeni populacija Afrike, Azije i Okeanije trenutno nisu dobro definisani, iako uključuju neke od uobičajenih antigena zajedničkih ljudima zapadnoevropskog porijekla. Raspodjela HLA antigena je različita u različitim rasnim grupama i mogu se koristiti kao antropološki markeri u proučavanju bolesti i migracijskih procesa.
63-1. Šematski prikaz hromozoma 6.
Prikazana je lokalizacija HLA zone u regiji 21 kratke ruke. HLA-A, HLA-B i HLA-C lokusi kodiraju teške lance klase I (44.000), dok b2-mikroglobulinski laki lanac (11.500) molekula klase I kodira gen na hromozomu 15. HLA- D zona (klasa II) nalazi se centromera u odnosu na lokuse A, B i C sa usko povezanim genima za komponente komplementa C4A, C4B, Bf i C2 u B-D regiji. Redoslijed gena komplementa nije utvrđen. Svaki molekul klase II D-regije formiran je od a- i b-lanaca. Oni putuju po površini ćelije u različitim područjima (DP, DQ i DR). Broj koji prethodi znakovima a i b znači da postoje različiti geni za ovu vrstu lanca, na primjer, za DR postoje tri gena b-lanca, tako da izraženi molekuli mogu biti 1ba, 2ba ili 3ba. Antigeni DRw52(MT2) i DRw53(MT3) su na lancu 2b, dok je DR na lancu lb. DR je nepolimorfan, dok su molekuli antigena DQ polimorfni u a- i b-lancima (2a2b). Ostali DQ tipovi (1a1b) imaju ograničen polimorfizam. DP polimorfizam je povezan sa b-lancima. Ukupna dužina HLA regije je oko 3 cm.
Pošto su hromozomi upareni, svaki pojedinac ima do šest serološki detektabilnih HLA-A, HLA-B i HLA-C antigena, po tri od svakog roditelja. Svaki od ovih skupova je označen kao haplotip, a prema jednostavnom Mendelovom nasljeđu, četvrtina potomaka ima identične haplotipove, polovina je dio zajedničkih haplotipova, a preostala četvrtina je potpuno nekompatibilna (63-3). Značaj uloge ovog genskog kompleksa u transplantacijskom odgovoru potvrđuje činjenica da odabir haplotipa parova donor-primalac među potomcima jedne generacije daje najbolje rezultate u transplantaciji bubrega - oko 85-90% dugotrajnog preživljavanja. (poglavlje 221).
antigeni klase II. HLA-D zona je u blizini lokusa klase I na kratkom kraku 6. hromozoma (63-1). Ova regija kodira niz molekula klase II, od kojih svaki sadrži a-lanac (molekulska težina 29.000) i b-lanac (molekulska težina 34.000) (63-2). Inkompatibilnost u ovoj regiji, posebno kod DR antigena, određuje proliferativni odgovor limfocita in vitro. Mješovita limfocitna reakcija (MLR) se procjenjuje prema nivou proliferacije u miješanoj kulturi limfocita (MLC) i može biti pozitivna čak i kada je identična za HLA-A, HLA-B i HLA-C antigene (63-3). HLA-D antigeni se detektuju pomoću standardnih stimulirajućih limfocita homozigotnih za HLA-D i inaktiviranih rendgenskim zracima ili mitomicinom C da bi se postigao jednosmjerni odgovor. Postoji 19 takvih antigena (HLA-Dwl-19) otkrivenih pomoću ćelija homozigotnog tipa.
Pokušaji određivanja HLA-D serološkim metodama prvi put su omogućili otkrivanje serije D-vezanih (DR) antigena eksprimiranih na molekulima klase II B limfocita, monocita i aktiviranih T limfocita. Zatim su opisani i drugi blisko povezani antigenski sistemi, koji su dobili različita imena (MB, MT, DC, SB). Sada je utvrđen identitet pojedinih grupa molekula klase II, a geni odgovarajućih a - i b-lanci su izolovani i sekvencirani. Mapa gena klase II prikazana u 63-1 odražava minimalni broj gena i molekularnih regija. Iako molekul mase II može sadržavati DRa iz haplotipa jednog od roditelja, i DRb iz drugog (transkomplementacija), kombinatorika izvan svake od DP, DQ, DR regija je rijetka, ako ne i nemoguća. DR molekuli, i donekle DQ, mogu poslužiti kao stimulans za primarni MLR. Sekundarni MLR se definiše kao limfociti-primed test (PLT) i rezultira u 24-36 sati umjesto 6-7 dana za primarni odgovor. DP aloantigeni su otkriveni zbog njihove sposobnosti da indukuju PLT stimulaciju, iako ne daju primarni MLR. Iako B-limfociti i aktivirani T-limfociti eksprimiraju sva tri seta molekula klase II, DQ antigeni nisu eksprimirani na 60-90% DP- i DR-pozitivnih monocita.
63-2. Šematski prikaz molekula površine ćelije I i II klase.
Molekuli klase I sastoje se od dva polipeptidna lanca. Teški lanac sa molom. težak 44.000 prolazi kroz plazma membranu; njegov vanjski dio se sastoji od tri domene (a 1, a 2 i a 3) formirane disulfidnim vezama. Laki lanac sa mol. sa masom od 11500 (b 2 -mikroglobulin, b2mu) je kodiran hromozomom 15 i nekovalentno je vezan za teški lanac. Homologija aminokiselina između molekula klase I je 80-85%, opadajući na 50% u a 1 i a 2 regijama, što vjerovatno odgovara regijama aloantigenskog polimorfizma. Molekule klase II formiraju dva nekovalentno povezana polipstidna lanca, a-lanac sa stubom. sa masom od 34 000 i b-lanac sa molskom masom od 29 000. Svaki lanac sadrži dva domena formirana disulfidnim vezama (od S. B. Carpenter, E. L. Milford, Renal Transplantation: Immunobiology in the Kidnev/Eds. B. Brenner, F. Rector, New York: Samiders, 1985).
63-3. HLA regija hromozoma 6: nasljeđivanje HLA haplotipova. Svaki hromozomski segment povezanih gena označen je kao haplotip, a svaki pojedinac nasljeđuje po jedan haplotip od svakog roditelja. Dijagram prikazuje antigene A, B i C haplotipova a i b za ovu hipotetičku individuu; u nastavku su prikazane oznake haplotipova u skladu sa tekstom. Ako muškarac sa ab haplotipom oženi ženu sa cd haplotipom, potomci mogu biti samo četiri tipa (u smislu HLA). Ako tokom mejoze jedan od roditelja doživi rekombinaciju (označeno isprekidanim linijama), onda to dovodi do stvaranja izmijenjenog haplotipa. Učestalost izmijenjenih haplotipova kod djece služi kao mjera udaljenosti na genetskoj veštici (1% frekvencije rekombinacije == 1 cM; 63-1) (od H. W. Carpenter. Kidney International, D)78. 14.283).
Molekularna genetika. Svaki polipeptidni lanac molekula klase I i II sadrži nekoliko polimorfnih regiona pored "privatne" antigene determinante, određene upotrebom antiseruma. Test limfolize posredovane ćelijama (CML) meri specifičnost T ćelija ubica (TK) koje se razmnožavaju u MLR testiranjem na ciljnim ćelijama od donatora koji nisu obezbedili MLR stimulativne ćelije. Antigenski sistemi utvrđeni ovom metodom pokazuju blisku, ali nepotpunu korelaciju sa "posebnim" antigenima klase 1. Citotoksično kloniranje ćelija otkrilo je skup polimorfnih ciljnih determinanti na HLA molekulima, od kojih se neke ne mogu detektovati korišćenjem aloantisera i monoklonskih antitela dobijenih imunizacijom ljudskih ćelija miševa. Neki od ovih reagensa se mogu koristiti za identifikaciju "posebnih" determinanti HLA, dok drugi ciljaju na "općenitije" (ponekad se nazivaju supertipizacija) determinante. Jedan takav sistem "uobičajenih" HLA-B antigena ima dva alela, Bw4 i Bw6. Većina "privatnih" HLA-B je povezana sa Bw4 ili Bw6. Drugi sistemi su povezani sa podgrupama HLA antigena. Na primjer, HLA-B pozitivni teški lanci sadrže dodatne regije zajedničke za B7, B27, Bw22 i B40 ili B5, B15, B18 i Bw35. Postoje i druge vrste preklapajućih antigenskih determinanti, o čemu svjedoči reakcija monoklonskih antitijela sa mjestom zajedničkim teškim lancima HLA-A i HLA-B. Proučavanje sekvence aminokiselina i mapa pstida nekih HLA molekula pokazalo je da su hipervarijabilni regioni antigena klase I koncentrisani u spoljašnjem a 1-domenu (63-2) i susednom regionu a 2-domena. Varijabilne sekvence molekula klase II su različite za različite lokuse. Zanimljivo je da 3-domen klase I, 2-domen klase II i b2-domen, kao i dio membranskog molekula T8 (Leu 2) uključen u međućelijske interakcije (poglavlje 62), pokazuju značajna homologija sekvence aminokiselina sa konstantnim područjima imunoglobulina. Ovo potvrđuje hipotezu o evolucijskom formiranju porodice genskih proizvoda koji nose funkcije imunološkog prepoznavanja. U proučavanju HLA genomske DNK za molekule klase I i II, pronađene su tipične sekvence egzon-introna, a egzoni su identifikovani za signalne peptide (5) svakog od domena, transmembranski hidrofobni segment i citoplazmatski segment (3) . cDNA sonde su dostupne za većinu HLA lanaca, a upotreba enzimskih digestija za procjenu statusa polimorfizma dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP) dala je podatke koji koreliraju sa serološkim testovima klase 11 u MLR. Međutim, obilje (20-30) gena klase 1 otežava procjenu polimorfizma pomoću RFLP-a. Mnogi od ovih gena nisu eksprimirani (pseudogeni), iako neki mogu odgovarati dodatnim lokusima klase I koji su eksprimirani samo na aktiviranim T ćelijama; njihove funkcije su nepoznate. Razvoj specifičnih testova za HLA-A i HLA-B lokuse pomoći će u razumijevanju ovog prilično složenog problema.
Komplement (klasa III). Strukturni geni tri komponente komplementa C4, C2 i Bf putuju u HLA-B-D zonu (63-1). Ovo su dva C4 lokusa koji kodiraju C4A i C4B, originalno opisani kao eritrocitni antigeni Rodgers i Chido, respektivno. Ovi antigeni su u stvari apsorbovani iz plazme od strane C4 molekula. Ostale komponente komplementa nemaju čvrstu vezu sa HLA. Nije opisano ukrštanje između gena C2, Bf i C4. Svi oni su kodirani odsjekom između HLA-B i HLA-DR dužine oko 100 kb. Postoje dva C2 alela, četiri Bf, sedam C4A i tri C4B alela, osim toga, na svakom lokusu postoje tihi QO aleli. Izuzetan polimorfizam histotipova (komplotipova) komplementa čini ovaj sistem pogodnim za genetička istraživanja.
Tabela 63-1. Najčešći HLA haplotini
U tabeli. Slika 63-1 prikazuje četiri najčešća haplotipa pronađena kod osoba zapadnoevropskog porijekla. MLR rezultati kod nepovezanih pojedinaca odabranih za kompatibilnost za ove haplotipove su negativni, dok se reakcija obično javlja ako se nepovezane osobe podudaraju samo za HLA-DR i DQ kompatibilnost. Takvi identični zajednički haplotipovi mogu poticati nepromijenjeni od jednog pretka.
Ostali geni 6. hromozoma. Nedostatak steroidne 21-hidroksilaze, autosomno recesivne osobine, uzrokuje sindrom kongenitalne adrenalne hiperplazije (pogl. 325 i 333). Gen za ovaj enzim nalazi se u HLA-B-D regiji. Kod osoba koje pate od navedenog sindroma briše se i gen 21-hidroksilaze koji se nalazi pored C4A gena, zajedno sa C4A (C4AQO), a HLA-B gen se može transformirati konverzijom B 13 u rijedak Bw47, koji se nalazi samo u izmijenjenim haplotipovi. Za razliku od kasnog početka HLA-vezanog nedostatka 21-hidroksilaze, kongenitalna adrenalna hiperplazija s nedostatkom 21b-hidroksilaze nije HLA-vezana. Nekoliko porodičnih studija je pokazalo da je idiopatska hemohromatoza, autosomno recesivna bolest, povezana sa HLA (poglavlje 310). Iako je patogeneza poremećaja apsorpcije željeza u gastrointestinalnom traktu nepoznata, utvrđeno je da se geni koji moduliraju ovaj proces nalaze u blizini HLA-A regije.
| Tabela 63-2. Povezivanje genetskih defekata | ||
| Lokalizacija | otkriti |
|
| haplotipovi |
||
| C2 nedostatak | Aw25, B18, BfS, DR2 |
|
| Nedostatak 21-OH | A3, Bw47, BfF, DR7 |
|
| Nedostatak 21-OH (kasna manifestacija) | ||
| Idiopatska hemokromatoza | ||
| Pagetova bolest | ||
| Spino-cerebelarna ataksija | ||
| Hodgkinova bolest | ||
63-4. Šema relativne uloge HLA-A, HLA-B, HLA-C i HLA-D antigena u pokretanju aloimunog odgovora i formiranju efektorskih ćelija i antitela.
Dvije glavne klase T limfocita prepoznaju antigene: Tk - prekursori citotoksičnih ćelija "ubice" i Tx pomoćne ćelije koje doprinose razvoju citotoksičnog odgovora. Tx također pruža pomoć B-limfocitima u razvoju "zrelog" IgG odgovora. Važno je napomenuti da TK obično prepoznaju antigene klase I, dok signal za Th generiše pretežno HLA-D, koji je usko povezan sa antigenima klase II (iz C. B. Carpenter. - Kidney International, 1978, 14, 283).
gene imunog odgovora. In vitro studija odgovora na sintetičke polipeptidne antigene, hemocijanin, kolagen i tetanus toksoid otkrila je da je HLA-D zona slična H-2 regiji. Ja u mišu. Prezentacija antigenskih fragmenata na površini makrofaga ili drugih ćelija koje nose molekule klase II zahteva povezano prepoznavanje molekula klase II + kompleksa antigena od strane T-limfocita koji nose odgovarajući(e) receptor(e) (poglavlje 62). Srž ove hipoteze „samo-)-X“ ili „promijenjenog selfa“ je da se T-ovisni imunološki odgovor, djelovanje T-pomoćnika/indukatora (Tx) provodi samo ako se sintetiziraju odgovarajuće determinante II klase. Geni potonjeg su Ir-geni. Pošto su alogene determinante klase I prepoznate kao već izmenjene, alogena MLP je model imunog sistema u kojem je prolaz pseudoantigena opcioni (63-4). Efektorske faze imuniteta zahtijevaju prepoznavanje pseudoantigena u kombinaciji s njegovim vlastitim strukturama. Potonji kod ljudi, kao i kod miševa, su molekuli antigena histokompatibilnosti klase I. Ljudske ćelijske linije inficirane gripom liziraju se imunološkim citotoksičnim T-limfocitima (TC) samo ako su odgovorne i ciljne ćelije identične na HLA-A i HLA-B lokusima. Alogeni MLR takođe služi kao model za formiranje klase I-restriktiranih citotoksičnih T-limfocita (63-4). Detalji o ograničenju za različite molekule i epitope klase I i II mogu se izolirati korištenjem primarnih ćelija koje su proširene i klonirane. Na primjer, na nivou ćelija koje predstavljaju antigen, dati Th klon prepoznaje antigenski fragment kompleksiran sa specifičnim regionom molekula klase II preko Ti receptora. Restriktivni elementi za neke mikrobne antigene su DR i Dw aleli.
Supresija imunog odgovora (ili nizak nivo odgovora) na polen kedra, streptokokne antigene i antigene šistozoma je dominantna i vezana za HLA, što ukazuje na postojanje gena za supresiju imuniteta (Is). Pokazano je i prisustvo specifičnih alelnih asocijacija HLA sa nivoom imunog odgovora, na primer, za antigen ricinusovog zrna Ra5 - sa DR2 i za kolagen - sa DR4.
Asocijacije na bolesti. Ako glavni kompleks histokompatibilnosti ima važnu biološku funkciju, koja je to funkcija? Jedna hipoteza je da igra ulogu u imunološkom nadzoru neoplastičnih ćelija koje se pojavljuju tokom života pojedinca. Značaj ovog sistema tokom trudnoće je veliki, jer uvek postoji tkivna nekompatibilnost između majke i fetusa. Visok stepen polimorfizma također može doprinijeti opstanku vrsta suočenih s ogromnim brojem mikrobnih agenasa koji lutaju u okolišu. Tolerancija na “sebe” (samotolerancija) može preći na mikrobne antigene, što rezultira visokom osjetljivošću koja dovodi do fatalnih infekcija, dok polimorfizam u HLA sistemu doprinosi tome da dio populacije prepoznaje opasne agense kao strane i uključuje adekvatnu odgovor . Ove hipoteze povezuju ulogu HLA sa prednostima sistema koji opstaje pod pritiskom selekcije.Svaka od ovih hipoteza ima neku podršku.
Važan dokaz uloge HLA kompleksa u imunobiologiji bilo je otkriće pozitivne povezanosti nekih patoloških procesa sa HLA antigenima. Proučavanje ovih asocijacija potaknuto je otkrićem gena imunog odgovora povezanih s H-2 kompleksom kod miševa. U tabeli. 63-3 sumira najznačajnije asocijacije HLA i bolesti.
Utvrđeno je da je učestalost pojave HLA-B27 povećana kod nekih reumatskih bolesti, posebno kod ankilozirajućeg spondilitisa, bolesti izrazito porodične prirode. Antigen B27 prisutan je kod samo 7% ljudi zapadnoevropskog porijekla, ali se nalazi u 80-90% pacijenata sa ankilozirajućim spondilitisom. U odnosu na to znači da je ovaj antigen odgovoran za sklonost nastanku ankilozirajućeg spondilitisa, koja je 87 puta veća kod njegovih nosilaca nego u opštoj populaciji. Slično, visok stupanj povezanosti s B27 antigenom kod akutnog prednjeg uveitisa, Reiterovog sindroma i reaktivnog artritisa kod najmanje tri bakterijske infekcije (jersinioze, salmoneloze i gonoreje) je prikazan. Iako je uobičajeni oblik juvenilnog reumatoidnog artritisa također povezan s B27, tip bolesti s blagim zglobnim sindromom i iritisom povezan je s B27. Kod psorijatičnog artritisa centralnog tipa, B27 je češći, dok je Bw38 povezan i sa centralnim i perifernim tipom. Psorijaza je povezana sa Cw6. Pacijenti s degenerativnim artritisom ili gihtom ne pokazuju nikakvu promjenu u učestalosti antigena.
Većina drugih asocijacija na bolesti karakteristična je za HLA-D antigene.Na primjer, enteropatija osjetljiva na gluten kod djece i odraslih povezana je s DR3 antigenom (u odnosu na 21) Stvarni postotak pacijenata s ovim antigenom varira od 63 do 96% u poređenju na 22-27% u kontrolama. Isti antigen se češće nalazi kod pacijenata sa aktivnim hroničnim hepatitisom i dermatitisom herpetiformisom, koji takođe pate od enteropatije osetljive na gluten. Juvenilni insulin-zavisni dijabetes melitus (tip I) povezan je sa DR3 i DR4 i negativno povezan sa DR2.Kod 17-25% pacijenata sa dijabetesom tipa I pronađen je redak alel Bf (M). Dijabetes s početkom u odrasloj dobi (tip II) nema nikakve veze s HLA. Hipertireoza u SAD-u je povezana sa B8 i Dw3, dok je u japanskoj populaciji povezana sa Bw35. Šire istraživanje zdravih i bolesnih predstavnika različitih rasa pomoći će da se razjasni pitanje univerzalnih HLA markera. Na primjer, antigen B27, koji je rijedak kod zdravih Japanaca, čest je kod pacijenata s ankilozirajućim spondilitisom. Slično, DR4 je marker za dijabetes tipa I lisnih uši kod svih rasa. Ponekad je HLA marker jasno povezan samo sa dijelom simptoma unutar sindroma. Na primjer, mijastenija gravis je značajno snažnije povezana s B8 i DR3 antigenima kod pacijenata bez timoma, a multipla skleroza je povezana s DR2 antigenom kod osoba s brzo progresivnim tokom bolesti. Goodpastureov sindrom povezan s autoimunim oštećenjem bazalnih membrana glomerula, idiopatski membranski glomerulonefritis, koji odražava autoimune procese sa stvaranjem antitijela na glomerularne antigene, kao i zlatom inducirani membranski nefritis, uvelike su povezani s HLA-DR.
Tabela 63-3. Bolesti povezane s HLA antigenima
| Bolesti | U odnosu na | |||
| Reumatoidni | ||||
| Ankilozantni spondilitis | ||||
| Reiterov sindrom | ||||
| Akutni prednji uveitis | ||||
| Reaktivni artritis (Yersinia, Salmonella, Gonococcus) | ||||
| Psorijatični artritis (centralni) | ||||
| Psorijatični artritis (periferni) | ||||
| Juvenilni reumatoidni artritis | ||||
| Juvenilni artritis sa blagim zglobnim sindromom | ||||
| Reumatoidni artritis | ||||
| Sjogrenov sindrom | ||||
| Sistemski eritematozni lupus | ||||
| Sistemski eritematozni lupus (kao rezultat | ||||
| uzimanje apresina) | ||||
| Gastrointestinalni | ||||
| Enteropatija osetljiva na gluten | ||||
| Hronični aktivni hepatitis | ||||
| Ulcerozni kolitis | ||||
| Hematološki | ||||
| Idiopatska hemokromatoza | ||||
| perniciozna anemija | ||||
| Dermatitis herpetiformis | ||||
| Psoriasis vulgaris | ||||
| Psoriasis vulgaris (u japanskoj populaciji) | ||||
| Pemphigus vulgaris (u evropskoj populaciji) | ||||
| Behcetova bolest | ||||
| Endokrine | ||||
| Dijabetes tipa I | ||||
| Hipertireoza | ||||
| Ginertireoza (u japanskoj populaciji) | ||||
| Bolesti | Najbliskiji antigeni | U odnosu na |
||
| Adrenalna insuficijencija | ||||
| Subakutni tiroiditis (de Quervain) | ||||
| Hashimotov tiroiditis | ||||
| H eurološki | ||||
| miastenija gravis | ||||
| Multipla skleroza | ||||
| Manično depresivni poremećaj | ||||
| Shizofrenija | ||||
| Renal | ||||
| Idiopatski membranski glomerulo- | ||||
| Goodpastureova bolest (anti-GMB) | ||||
| Bolest minimalnih promjena (steroid | ||||
| Policistična bolest bubrega | ||||
| IgA nefropatija | ||||
| Nefropatija uzrokovana zlatom | ||||
| zarazna | ||||
| Tuberkuloidna guba (u azijskoj guzici | ||||
| potpuna paraliza | ||||
| Slab odgovor na vakcinu protiv virusa | ||||
| imunodeficijencija | ||||
| Nedostatak IgA (davaoci krvi) | ||||
Neuravnotežen zahvat. Iako distribucija HLA alela varira u rasnim i etničkim populacijama, najkarakterističnija karakteristika populacione genetike HLA antigena je prisustvo neravnoteže veza za neke A i B, B i C, B, D antigene i lokuse komplementa. Neravnoteža veza znači da se antigeni iz blisko povezanih lokusa nalaze zajedno češće nego što bi se očekivalo iz pretpostavke o nasumičnoj povezanosti. Klasičan primjer neravnoteže veze je povezanost antigena lokusa AHLA-A1 sa antigenom lokusa HLA-B8 B kod osoba zapadnoevropskog porijekla. Istovremeno prisustvo A1 i B8, izračunato na osnovu frekvencija njihovih gena, treba posmatrati sa frekvencijom od 0,17. 0,11, odnosno približno 0,02. Dok je uočena učestalost njihovog suživota 0,08, odnosno 4 puta veća od očekivane, a razlika između ovih vrijednosti je 0,06. Posljednja vrijednost je označena delta (D) i služi kao mjera neravnoteže. Nađena je i neravnoteža veza drugih haplotipova A- i B-lokusa: A3 i B7, A2 i B12, A29 i B12, A11 i Bw35. AT 8); kao i za antigene B i C lokusa. Serološki detektabilni HLA antigeni služe kao markeri za čitave haplotipske gene unutar porodice i kao markeri za specifične gene u populaciji, ali samo u prisustvu neravnoteže veza.
Neravnoteža veza je značajna jer takve asocijacije gena mogu generirati određene funkcije. Pritisak selekcije tokom evolucije može biti glavni faktor u održavanju određenih kombinacija gena u genotipovima. Na primjer, postoji teorija da A1 i B8, kao i neke determinante D i drugih regija, daju selektivnu prednost u suočavanju s epidemijama bolesti kao što su kuga ili male boginje. Međutim, moguće je i da potomci ljudi koji su preživjeli ovakve epidemije ostanu osjetljivi na druge bolesti, jer njihov jedinstveni genski kompleks ne daje adekvatan odgovor na druge faktore okoline. Glavna poteškoća ove hipoteze leži u pretpostavci da selekcija djeluje na nekoliko gena istovremeno i time osigurava pojavu uočenih vrijednosti P, međutim, potreba za složenim interakcijama između proizvoda različitih lokusa MHC kompleksa je samo početna veza za posmatrane pojave, a selekcija može poboljšati neravnotežu višestrukih veza. Zadržavanje nekih uobičajenih haplotipova navedenih gore podržava ovaj stav.
S druge strane, hipoteza selekcije ne mora objašnjavati neravnotežu veze. Kada se populacija kojoj nedostaju neki antigeni ukrsti s drugom koja ima visoku učestalost ovih antigena u ravnoteži, D se može pojaviti nakon nekoliko generacija. Na primjer, povećanje D za A1 i B8 pronađeno u populacijama u smjeru istok-zapad od Indije do Zapadne Europe može se objasniti na osnovu migracije i asimilacije stanovništva. U malim grupama, neravnoteža može biti posljedica kompatibilnosti, efekata osnivača i genetskog odstupanja. Konačno, neki slučajevi neravnoteže veza su rezultat nenasumičnog ukrštanja tokom mejoze, jer segmenti hromozoma mogu biti manje ili više krhki. Bilo da se radi o pritisku selekcije ili ukrštenim ograničenjima, neravnoteža veze može nestati u roku od nekoliko generacija. U kompleksu HLA gena postoji veliki broj neslučajnih asocijacija, a utvrđivanje njihovih uzroka može pružiti uvid u mehanizme koji su u osnovi podložnosti bolesti.
Kvačilo i asocijacije. U tabeli. 63-2 navodi bolesti koje služe kao primjer HLA veze, kada su nasljedne osobine unutar porodice označene odgovarajućim haplotipovima. Na primjer, nedostatak C2, 21-hidroksilaze, idiopatska hemohromatoza se nasljeđuju na recesivan način sa parcijalnim nedostatkom kod heterozigota. Ovi genetski poremećaji su također povezani s HLA i uzrokovani su viškom određenih HLA alela kod nepovezanih oboljelih osoba. Nedostatak C2 obično je povezan sa haplotipovima HLA-Aw 25, B 18, B55, D/DR2, a kod idiopatske hemohromatoze se manifestuje i veza i snažna povezanost između HLA-A3 i B 14. Visok stepen neravnoteže veze u ovaj slučaj je uzrokovan mutacijama u osobi koja je služila kao njegov izvor; osim toga, vremenski period potreban za povratak genskog fonda u stanje ravnoteže bio je nedovoljan. Sa ove tačke gledišta, HLA geni su jednostavni markeri povezanih gena. S druge strane, interakcija sa specifičnim HLA alelima može biti potrebna da bi se manifestirao određeni poremećaj. Poslednja hipoteza zahtevala bi prepoznavanje veće stope mutacija sa ekspresijom defektnih gena, što se javlja samo pod uslovom veze sa nekim HLA genima.
Pagetova bolest i spinalna ataksija su HLA-vezani, autosomno dominantni nasljedni poremećaji; nalaze se kod nekoliko članova porodice odjednom. Hodgkinova bolest je manifestacija HLA-povezanog recesivnog nasljednog defekta. Nisu pronađene HLA asocijacije u ovim bolestima, što ukazuje na početno mnoštvo začetnika ovih bolesti s mutacijama povezanim s različitim HLA alelima.
Veza sa HLA se lako utvrđuje kada je dominaciju i recesivnost osobina lako razlikovati, odnosno kada je ekspresivnost visoka i proces je određen defektom u pojedinačnim genima. U većini asocijacija, HLA markeri odražavaju faktore uključene u implementaciju i modulaciju imunog odgovora pod uticajem više gena. Primjer poligene imunološke bolesti je atonska alergija, u kojoj povezanost s HLA može biti očigledna samo kod osoba s niskim genetski kontroliranim (ne zbog HLA) nivoima proizvodnje IgE. Još jedan primjer ove vrste je nedostatak IgA (Tabela 63-3) povezan sa HLA-DR3.
Klinički značaj HLA sistema. Klinički značaj HLA tipizacije za dijagnozu ograničen je na određivanje B27 u dijagnozi ankilozirajućeg spondilitisa; međutim, u ovom slučaju postoji 10% lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata. Proučavanje HLA je takođe od značaja u praksi genetskog savetovanja za rano otkrivanje bolesti u porodicama sa idiopatskom hemohromatozom, kongenitalnom adrenalnom hiperplazijom udruženom sa nedostatkom steroidne hidroksilaze, posebno ako se HLA tipizacija vrši na ćelijama dobijenim amniocentezom. Visok stepen polimorfizma u HLA sistemu čini ga vrednim alatom za ispitivanje različitih ćelijskih preparata, posebno u sudskoj medicini. Neke bolesti, kao što je dijabetes melitus tipa I i druge, za koje su indikovane HLA asocijacije, zahtevaju dalje proučavanje uloge komponenti HLA sistema u patogenezi ovih bolesti.
Tokom prve transplantacije ljudskog srca koju je 1967. izvršio C. Barnard, i stotina kasnijih transplantacija, hirurzi su se suočili s problemom odbacivanja transplantata. Pokazalo se da glavna poteškoća nije u tehnici operacije, koja je sada dobro razvijena, već u nekompatibilnosti tkiva zbog imunoloških mehanizama. Tako kod ljudi preživljavanje transplantata uzetih od slučajnog donora iznosi 10,5 dana, dok su transplantacije razmijenjene između identičnih blizanaca (izografti), ukorijeniti se. To je zbog prisustva antigena na površini ćelija tzv transplantacijski antigeni ili antigeni histokompatibilnosti. Većina transplantacijskih antigena nalazi se na leukocitima, ali se nalaze i na svim drugim ćelijama s jezgrom (ćelije kože, pluća, jetre, bubrega, crijeva, srca itd.). Geni koji kodiraju ove antigene nazivaju se geni za kompatibilnost tkiva. Sistem gena koji kontroliše transplantacijske antigene leukocita naziva se glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC). Kodominantni su geni histokompatibilnosti.
Efikasnost transplantacije zavisi ne samo od antigena leukocita i eritrocita, već i od manji sistem histokompatibilnosti. Transplantacije između monozigotnih blizanaca se ukorijene. Međutim, kod braće i sestara, ako se MHC haplotipovi poklapaju, ali se manji sistemi histokompatibilnosti ne poklapaju, presađivanje kože se odbija.
Nakon imunoglobulina i T-ćelijskih receptora, proteini glavnog kompleksa histokompatibilnosti su najraznovrsniji od svih proteina. Postoje dvije klase MHC proteina. Proteini klase I nalaze se na površini gotovo svih ćelija. Molekul proteina se sastoji od dva polipeptidna lanca: velikog i malog. Vjeverice
MHC klase II su prisutni na površini nekih ćelija (B-" limfociti, makrofagi, specijalizovane epitelne ćelije), a njihov molekul se sastoji od približno jednakih polipeptidnih-* lanaca. MHC proteini imaju neke sličnosti sa imunoglobulinima. Glavna uloga MHC proteina nije u odbacivanju stranog tkiva, već u pravcu reakcije T ćelija na antigen Citotoksične T ćelije mogu prepoznati antigen ako se nalazi zajedno sa MHC proteinima klase I na površini jedne ćelije T ćelije pomoćnice prepoznaju antigen u kombinaciji sa proteinima MHC klase II. Takva dvostruka stimulacija se naziva MHC-o restrikcija. Po prvi put, glavni sistem tkivne kompatibilnosti mišjeg H-2 otkrio je P. Gorer 1936. godine. Pored H -2, pronađeno je mnogo lokusa kompatibilnosti tkiva koji se nalaze u svim hromozomima.
Godine 1980. D. Snell, J. Dosset i B. Benatzeraff su dobili Nobelovu nagradu za "različite aspekte istraživanja koji vode do modernog razumijevanja ljudskog sistema gena histokompatibilnosti". D. Snell je formulisao osnovne genetske zakone kompatibilnosti tkiva i dobio podatke o finoj strukturi H-2 lokusa kod miševa.
H-2 sistem je prilično dobro shvaćen i stoga služi kao dobar model za proučavanje MHC kod drugih životinjskih vrsta. H-2 kompleks uključuje nekoliko usko povezanih lokusa dužine 0,35 cm koji se nalaze na 17. hromozomu. Kompleks H-2 je podeljen na pet regiona: K, I, S, G, D (Sl. 56).
