Popravak DNK

Opće informacije

Sredstva koja oštećuju DNK

Radijacija

1. jonizujuće zračenje (gama zraci, rendgenski zraci)

2. Ultraljubičasto zračenje (posebno ~260 nm, upravo u ovoj regiji dolazi do maksimalne apsorpcije DNK)

Reaktivni radikali kiseonika nastaju tokom normalnog ćelijskog disanja na različitim biohemijskim putevima.
Hemikalije za životnu sredinu.

Mnogo ugljovodonika.

Hemikalije koje se koriste u antitumorskoj kemoterapiji.

Vrste oštećenja DNK

1. Sve četiri baze u DNK (A, T, C, G) mogu se kovalentno modificirati na različitim pozicijama.
Najčešći je gubitak amino grupe (deaminacija) - u ovom slučaju C prelazi u U.
Pogrešna inkorporacija baza nastaje zbog grešaka u radu DNK polimeraza tokom replikacije.
Najčešća inkluzija je uracil umjesto timina.
Povrede strukture.
Mogu nastati lomovi u DNK. Prekidi mogu biti jednolančani, ili oba lanca DNK mogu biti prekinuta.

Jonizujuće zračenje može biti čest uzrok takvih ruptura.
Kovalentna veza se može formirati između susednih baza, a veza se može formirati između susednih baza na istom lancu ili između dva lanca DNK.
vrste oštećenja DNK
promena jedne baze
apurinizacija
zamena C sa Y
zamena A sa hipoksantinom
bazna alkilacija
umetanje ili brisanje nukleotida
ugradnja slične baze
promena dve baze
formiranje timinskih dimera
umrežavanje sa bifunkcionalnim alkilirajućim agensom
prekid lanca
jonizujuće zračenje
radioaktivno uništavanje osnovnih elemenata
unakrsne veze
između osnova jednog navoja ili dva paralelna navoja
između DNK i proteinskih molekula, kao što su histoni

Popravka oštećenih baza

Oštećeni temelji se mogu popraviti na različite načine:
Direktna hemijska popravka oštećenja.

Eksciziona popravka (ER), pri kojoj se oštećena baza uklanja i zamjenjuje novom. Postoje tri modela ekscizijske popravke, od kojih svaki koristi vlastiti set enzima.
Popravak ekscizije baze (BER).
Popravak ekscizijom nukleotida (NER).
Popravak neusklađenosti (MMR).

Direktna popravka oštećenja.

Najčešći uzrok tačkastih mutacija kod ljudi je spontano dodavanje metil grupe, vrsta alkilacije. Takve modifikacije ispravljaju enzimi zvani glikozilaze, koji ispravljaju grešku bez uništavanja lanca DNK.

Neki lijekovi koji se koriste u kemoterapiji također oštećuju DNK alkilacijom.
Problem s popravkom je u tome što s ograničenim skupom enzima i mehanizama, ćelija mora da se nosi sa mnogim oštećenjima uzrokovanim širokim spektrom hemijskih i fizičkih agenasa.

Popravak ekscizije baze (BER)

Glavni ključni događaji:

1. Uklanjanje oštećene baze (javlja se ~20.000 puta dnevno u svakoj ćeliji ljudskog tijela) DNK glikozilamina. Ljudi imaju najmanje 8 gena koji kodiraju različite DNK glikozilaze, od kojih svaki prepoznaje drugačiji skup baznih lezija.
2. Uklanjanje deoksiribofosfata dovodi do stvaranja praznine u DNK.
3. Zamjena ispravnim nukleotidom. Ovu funkciju kod ljudi obavlja DNK polimeraza beta.
4. Ligacija prekida lanca. Postoje dva enzima, oba zahtijevaju ATP.

Popravak ekscizijom nukleotida (NER)

NER se razlikuje od BER-a na nekoliko načina.
Korištenje različitih enzimskih sistema.
Čak i ako je greška u jednom nukleotidu, odjednom se uklanja mnogo nukleotida u području oštećenja.

Glavni ključni događaji NER-a:
1. Oštećenje se prepoznaje po jednom ili više faktora povezanih s mjestom oštećenja.
2. DNK se odmotava na mestu oštećenja. Ovaj proces uključuje
različiti faktori transkripcije IIH, TFIIH, (koji također rade tokom normalne transkripcije).
3. DNK se preseca na krajevima od 3" i 5" oštećenja, usled čega se uklanja fragment DNK koji sadrži oštećeni nukleotid.
4. Novi DNK lanac je završen korišćenjem šablona neoštećenog DNK lanca delta ili epsilon polimerazama.
5. Ligaze unakrsno povezuju novosintetizovani kraj lanca.

Xeroderma pigmentosum (XP)
XP je rijetka nasljedna ljudska bolest koja se manifestira oštećenjem kože pri izlaganju svjetlosti, što u konačnici dovodi do razvoja raka kože i smrti pacijenta.
Bolest nastaje zbog mutacija gena uključenih u popravku NER-a. Na primjer:
XPA kodira protein koji se veže za mjesto ozljede i pomaže u sastavljanju kompleksa za popravak.
XPB i XPD, koji su dijelovi transkripcionog faktora TFIIH. Neke mutacije u XPB i XPD također mogu uzrokovati prerano starenje.
XPF preseca lanac DNK sa 5" kraja oštećenja.

XPG seče lanac sa kraja od 3"

Reparacija neusklađenosti (MMR)

Popravak neusklađenosti ispravlja neusklađene netaknute baze koje ne formiraju normalan Watson-Crick par (AT, C G). Takve greške se javljaju tokom rada DNK polimeraze tokom replikacije.
Popravak neusklađenosti uključuje enzime uključene u popravku BER i NER, kao i specijalizirane enzime.
Sinteza DNK tokom popravke neusklađenosti vrši se DNK polimerazama delta ili epsilon.
Sistem popravke neusklađenosti je uključen u povećanje tačnosti rekombinacije tokom mejoze.

Popravak prekida DNK

Jonizujuće zračenje i neke hemikalije mogu razbiti jedan ili dva lanca DNK.
Jednostruki prekidi (SSB)
Prekidi u jednom od lanaca DNK često se popravljaju enzimima uključenim u popravku BER.
Dvostruki prekidi (DSB)
Postoje dva mehanizma koji mogu eliminisati dvolančane prekide DNK:
Direktno spajanje slomljenih krajeva. Ovaj proces zahtijeva posebne
enzimi koji prepoznaju i vezuju slomljene krajeve, a zatim ih spajaju. Ako slomljena DNK ima tupe krajeve i spajanje dva fragmenta DNK se dešava nasumično, tada se ova popravka naziva NHEJ. Ku protein je neophodan za NHEJ. Ku je heterodimerna podjedinica koja se sastoji od dva proteina Ku70 i Ku80.
Greške koje se javljaju tokom direktnog vezivanja mogu uzrokovati translokacije.
Polinukleotidna ligaza- restauriran jedno kolo DNK puca

Homologna rekombinacija

Homologna rekombinacija je sposobna da popravi slomljene krajeve hromozoma koristeći DNK neoštećene sestrinske hromatide dostupne nakon duplikacije hromozoma.
Geni potrebni za homolognu rekombinaciju su BRCA-1 i BRCA-2.

Konverzija gena
Novi donor gena može biti:
homologni hromozom (tokom mejoze)
sestrinska hromatida (također tokom mejoze)
duplicirani gen na istom hromozomu (tokom mitoze)

Ispravka grešaka zbog 3'-5' egzonukleazne aktivnosti polimeraze tokom replikacije (samo kod prokariota) (mutacija E. coli mutD-mutator-promjena - podjedinica DNK-pol.III)
Dimeri timina, enzim fotoliaze gen-phr (kod nižih eukariota)
Uklanjanje vezanih alkil i metil grupa - O-6-metilguanin transferaza (ada gen) - uklanja O-6-metilguanin
eksciziona r. baze [E.coli] [ljudski | prepoznavanje štete XPA protein u kombinaciji sa RPA | f-r transcr je uključen. TFIIH (P52, P34, P44, P62, XPB-XPD-aktivnost helikaze) | ERCC1-XPF, XPG – nukleaze, presecaju DNK sa obe strane oštećenja. | DNK polimeraza i pomoćna. RFC i PCNA proteini popunjavaju prazninu]
R. dušična bazična glikozilaza uklanja bazičnu.
AP lokacija (apurinska, apirimidinska) | AP endonukleaza prepoznaje jaz, rez. 5' DNK
post-replikacijski r. (PRR)
SOS-r. proteini konn. sa DNK polimerazom, doc. DNK je izgrađen nasuprot oštećenja. DNK

Skraćenice.
BER - Popravak ekscizije baze

NER - Nucleotide Excision Repair
MMR - Popravak neslaganja
NHEJ - Nehomologno spajanje kraja

Reparacija neusklađenosti

Tokom procesa replikacije, kao rezultat grešaka polimeraze, mogu se ubaciti nekomplementarni nukleotidi, što može dovesti do mutacija u lancu DNK kćeri. Nesparene baze prepoznaju enzimi za popravku neusklađenosti i zamjenjuju neusklađene nukleotide.

Enzimi ovog sistema osiguravaju homolognu rekombinaciju, kao i zaustavljanje ćelijskog ciklusa kao odgovor na oštećenje DNK.
Sistem za popravku neusklađenosti E. coli, koristeći MutHLS proteine, prepoznaje i popravlja sve nekomplementarne parove baza osim C–C. Osim toga, ovaj sistem popravlja male umetke u jedan od lanaca DNK koji su rezultat grešaka u replikaciji, čija dužina ne prelazi četiri nukleotida.
Tipično, E. coli ima metiliranu DNK Dam methylase po sajtu GATC. Međutim, nakon što je replikacija završena, lanac DNK kćeri ostaje nemetiliran neko vrijeme.
Ovaj sistem se može rekonstituisati in vitro upotrebom
DNK sa jednim metiliranim lancem kao supstratom, kojem se dodaju pročišćeni proteini MutH, MutL, MutS, UvrD (helikaza II), holoenzim DNK polimeraze III, DNK ligaza, SSB protein i jedna od egzonukleaza: ExoI, ExoVII ili RecJ. Proces popravke se pokreće uvođenjem jednolančanog prekida u nemetilirani lanac u blizini djelomično metiliranog GATC mjesta, nakon čega slijedi hidroliza DNK lanca i popunjavanje rezultirajućeg jednolančanog jaza. U ovom slučaju, MutS protein se vezuje za pogrešno uparene nukleotide. MutL protein nema enzimsku aktivnost, iako je u interakciji sa MutS-om i neophodan je za aktivaciju MutH, endonukleaze koja vrši lomljenje jednolančane DNK. Dakle, kompleks MutS–MutL, sastavljen na mjestu DNK sa pogrešno sparenim nukleotidom, stimulira endonukleazu (nikaza) aktivnost MutH. Sistem bez ćelija ne zahteva prisustvo MutH u prisustvu jednolančanog prekida u DNK supstratu. MutHLS sistem popravke može
koristiti djelomično metilirane GATC sekvence koje se nalaze uzvodno i nizvodno od oštećene regije DNK. Istovremeno, u
Osim helikaze II, ekscizija pogrešno uključenog nukleotida uključuje jednu od egzonukleaza: ExoI (3'-exo), ExoVII (3'- i 5'-exo) ili RecJ (5'-exo), ovisno o lokacija GATC mjesta u odnosu na korigirani nukleotid. Nakon ekscizije nukleotida, rezultujuća jednolančana praznina je popunjena holoenzimom DNK polimeraze III u prisustvu SSB proteina i DNK ligaze. Treba naglasiti da je upotreba MutH proteina i Dam metilaze za prepoznavanje kćerke lanca replicirane DNK jedinstveno svojstvo gram-negativnih bakterija. Gram-pozitivne bakterije ne metiliraju DNK niti u svrhu obilježavanja. Ako su GATC mesta potpuno metilirana, sistem popravke E. coli MutHLS modifikuje neusklađene nukleotide na oba lanca DNK sa jednakom efikasnošću.
E. coli ima još najmanje dva specifična
putevi za popravku neusklađenih nukleotida. VSP (veoma kratak put popravke zakrpa) sistem popravlja nekomplementarne G–T parove, zamjenjujući ih G–C. Vjeruje se da se takvi parovi formiraju kao rezultat deaminacije 5-metilcitozina na mjestima gdje su C ostaci metilirani pomoću Dcm metilaze. Sa manjom efikasnošću, isti sistem zamjenjuje G–U parove sa G–C. Drugi sistem za popravku ovisan o MutY posebno eliminiše posljedice oksidativnog oštećenja gvanina. Ako se dGTP oksidira u 8-okso-dGTP, MutT protein cijepa potonji, sprječavajući njegovu inkorporaciju u DNK. Ako je ipak uključen nasuprot C ostatka, tada Fpg glikozilaza (MutM) uklanja ovu modificiranu bazu. U slučaju kada 8-okso-G ostane u DNK, u sljedećem krugu replikacije on se uparuje sa A i kao rezultat može doći do transverzije G–C>T–A. U ovom slučaju, MutY protein djeluje kao DNK glikozilaza, uklanjajući ostatak A iz pogrešnog para, i kao AP liaza, uvodeći jednolančani
jaz u blizini AP lokacije. Nakon toga slijede procesi o kojima je već bilo riječi u vezi sa funkcionisanjem BER sistema popravke. Slijed reakcija koje uključuje MutY također popravlja nekomplementarne A–G i A–C parove kako bi se formirali C–G i G–C parovi, respektivno. Popravak neusklađenih baza kod eukariota nastaje kada
učešće kompleksa proteina sličnog bakterijskom MutHLS sistemu. Ljudski GTBP protein je homolog bakterijskog MutS proteina, au kvascu protein Msh6 igra odgovarajuću ulogu. Prepoznavanje neusklađenih nukleotida kod ljudi se vrši pomoću MSH2–GTBP heterodimera. MutL homolozi u ćelijama S. cerevisiae su proteini MLH1 i PMS2, koji takođe postoje kao heterodimerni kompleksi. Mutacije u genima koji kodiraju ove proteine ​​kod ljudi su praćene formiranjem fenotipa mutatora i razvojem nasljednog nepolipoznog raka debelog crijeva (HNPCC sindrom).

Direktna reparacija

Postoje dva glavna puta za popravak alkiliranih baza: popravak ekscizijom baze (BER) i direktna popravka ekscizijom baze. U BER-u, DNK glikozilaze cijepaju citotoksične alkilirane baze u DNK u prvom koraku sa formiranjem AP mjesta i njegovom naknadnom obradom.U slučaju direktnog popravka sprovode se dvije metode: popravak alkiltransferazama ili oksidacija alkil grupe, u oba slučaja dolazi do regeneracije intaktnih baza. Ako se popravak dogodi alkiltransferazama (kod sisara se ovim putem popravlja samo O6-alkilgvanin), tada O6-alkilgvanin transferaza (AGT) prenosi metil ili etil grupu sa O6-alkilgvanina na jedan od vlastitih cisteinskih ostataka . Protein alkiliran kao rezultat vlastite aktivnosti je inaktiviran, ali može poslužiti kao regulator aktivnosti njegovog gena i nekoliko drugih. Za razliku od samoubilačkih O6-metilguanin transferaza, koje specifično demetiliraju visoko mutagene i toksične
Oštećenje O6-metilgvaninom, AlkB iz E. coli i njegovih ljudskih kolega hABH2 i hABH3 oksidiraju metilne grupe 1-metiladenina (1-meA) i 3-metilcitozina (3-meC) u DNK kako bi regenerirali nemodificirane baze adenina i citozina.

O 6 -alkilgvanin transferaza

Aktivnost O 6 -alkilgvanin transferaze nalazi se u većini organizama i ometa mutageni efekat O 6 -alkilgvanina. AGT pretvara O6-alkilgvanin u gvanin prenošenjem alkil grupe sa DNK na reaktivni cisteinski ostatak u proteinu u ireverzibilnoj reakciji.

Ovaj kovalentni dodatak alkil grupe na cisteinski ostatak inaktivira enzim. Stoga je AGT samoubilački enzim koji se nakon jedne proteolitičke degradacije
reakcije transalkilacije. Strukturne studije otkrivaju da se aktivni centar AGT-a nalazi unutar najvećeg dijela enzima na određenoj udaljenosti od mjesta vezanja DNK. Smatra se da enzim "radi" mehanizmom "okretanja nukleotida" kako bi doveo bazu supstrata i nukleofilno aktivno mjesto AGT-a u neposrednu blizinu.

Značaj AGT-a u zaštiti sisara od toksičnih i mutagenih efekata alkilirajućih agenasa je dokazan kod miševa. Transgeni miševi s prekomjernom ekspresijom AGT-a pokazali su značajno niže stope inicijacije tumora kao odgovor na metilirajući agens N-metil-N-nitrozoureu, dok su miševi s manjkom AGT-a bili mnogo podložniji inicijaciji tumora i toksičnim efektima ovog agensa. . AGT je važan enzim u terapiji protiv karcinoma jer antagonizira citotoksične efekte kloroetilnitrozouree (CENU) klase lijekova protiv raka, npr.
BCNU (N,N-bis(2-kloroetil)N-nitrozourea) ili temozolomid. Pokazalo se da količina u kojoj je AGT prisutan u tumorima u velikoj mjeri određuje koliko će biti povoljan ishod antitumorske terapije primjenom CENU-a. CENU u početku reaguje sa O6-karbonil grupom gvanina i formira jedinjenje 4 , koji se naknadno pretvara u N 1 , O 6 -etanogvanin 5 . Compound 5 pregrupiše se u roku od nekoliko sati u fiziološki aktivan ICL 6 . AGT ometa formiranje 6 prilikom interakcije sa 4 ili 5 , obnavljanje guanina ili formiranje adukta DNK-proteina 8 . Dobivena je eksperimentalna potvrda formiranja adukta 8 , ali je izoliran u premaloj količini za detaljan opis. Tokom biohemijskog proučavanja ovog problema uveden je N1,O6-etanoksantin
9 kao stabilan analog 5 u DNK. Ethanoxanthin 9 reaguje sa AGT i formira stabilan adukt DNK-proteina 7 . Ovaj pristup je omogućio formiranje kovalentno vezanog adukta AGT-DNK 10 u velikim količinama, koje se mogu koristiti za određivanje strukture AGT vezanog za DNK. Interakcija AGT i alkilirajuće terapije dovela je do potrage za AGT inhibitorima koji se mogu koristiti u terapiji karcinoma u kombinaciji sa alkilirajućim agensima. Do danas su stvoreni inhibitori, uglavnom derivati ​​gvanina sa supstituentima na O 6 poziciji. O 6 -benzilgvanin 2 Utvrđeno je da je tipičan AGT inhibitor sa kojim se upoređuju novi molekuli. Efikasnost O 6 -BzG u povećanju citotoksičnosti CENU-a je dokazana na životinjskim modelima. Ograničavajući faktor ovog terapijskog pristupa je toksičnost za zdrave organe, dijelom i za koštanu srž. Neki
Grupa naučnika ima za cilj da zaobiđe ovaj problem stvaranjem varijante ATG koja je otporna na inhibiciju O 6 -BzG, koja se može koristiti za zaštitu koštane srži pomoću transfera gena.

AlkB, hABH2 i hABH3 oksidoreduktaze

Drugi način direktnog popravljanja alkiliranih baza je oksidacija alkil grupe uz regeneraciju netaknute dušične baze. AlkB enzim u Escherichia coli i dva ljudska analoga hABH2 i hABH3 specifično demetiliraju 1-metiladenin i 3-metilcitozin u DNK. Ali za razliku od AGT-a, ovi enzimi imaju specifičnost supstrata usmjerenu prema površini baznih parova G:C i A:T. Oštećenje 1-alkiladenina
i 3-metilcitozin nastaju kada su adenin i citozin u jednolančanoj strukturi (tokom replikacije ili transkripcije) i su supstrati za AlkB, hABH2 i hABH3. Oni oksidiraju metil grupe 1-metiladenina (1-meA) i 3-metilcitozina (3-meC) u DNK kako bi regenerirali azotne baze adenin i citozin. AlkB se također pokazalo da štiti od toksičnih oštećenja – adukta s etil grupom i pretvara 1-etiladenin u adenin u DNK, stvarajući acetaldehid kao rezultat reakcije. Na taj način se sanira oštećenje poznatog mutagena i kancerogenog etilen oksida, koji se endogeno formira tokom metabolizma etilena i koji se široko koristi i kao fumigant za sterilizaciju. Hidroksietil adukti generisani etilen oksidom nalaze se u ćelijskoj DNK. Drugi mali alkilirajući epoksidi se također koriste u velikim količinama u hemijskoj proizvodnji. Pokazalo se da AlkB smanjuje toksične efekte agenasa koji oštećuju DNK koji stvaraju hidroksietilen.
propil i hidroksipropil adukti. AlkB popravlja alkilirane trifosfate sa 1-me-dATP aktivno, ali neefikasno. Pretpostavlja se da ova sposobnost može smanjiti nivo inkorporacije alkiliranih trifosfata tokom sinteze DNK; osim toga, Klenow fragment DNK polimeraze I u E. coli može koristiti 1-me-dATP kao prekursor za sintezu DNK in vitro. Ljudski enzimi hABH2 i hABH3 su također demetilirali ostatke 1-metiladenina u poli(dA), ali su bili nedjelotvorni na kratkim supstratima. Dakle, hABH3 je imao vrlo nisku aktivnost na d(Tp1-meApT) trimer, dok aktivnost nije otkrivena za hABH2.

AlkB i njegove ljudske kolege dio su β-ketoglutarat/Fe(II) zavisne superfamilije diooksigenaza, a proces popravke uključuje kombinaciju dekarboksilacije β-ketoglutarata i oksidativne demetilacije oštećene baze. 1-meA i 3-meC lezije nastaju uglavnom u jednolančanoj DNK i vjerovatno
javljaju se na replikacijskoj vilici i u aktivno transkribovanim genima gdje mogu blokirati DNK i RNK polimeraze. U stvari, AlkB, hABH2 i hABH3 popravljaju ove lezije u jednolančanoj DNK, ali se popravak događa i na oligonukleotidima žarenim u komplementarnom lancu nakon alkilacije. Efikasnost reparacije 1-metiladenina pomoću AlkB ne zavisi od strukture polinukleotida, ali je potrebno prisustvo nukleotidne 5"-fosfatne grupe. Takođe, ljudski enzimi hABH2 i hABH3 demetilirali su ostatke 1-metiladenina u poli(dA); bile su neefikasne na kratkim podlogama Osim toga, lezije koje sadrže pozitivan naboj (ribonukleozidi 1-meA i 3-meC imaju pKa = 9,3 i 9,6, respektivno) bile su bolje sanirane od nenabijenih baza (1-meG i 3-meT). Međutim, pošto je 1-meG (iu manjoj meri 3-meT) popravljen od strane AlkB, onda formalni pozitivni naboj baze nije neophodan uslov za funkcionisanje AlkB. Sa ove tačke gledišta
Nejasno je da li je ovaj rezultat rezultat toga što se pozitivno nabijene baze bolje prepoznaju kroz elektrostatičke interakcije sa AlkB ili pozitivno nabijene baze jednostavno čine DNK boljom odlazećom grupom nakon hidroksilacije metil grupe.

Skraćenice:

• AGT - alkilgvanin transferaza
• BER - popravak ekscizije baze
• DNK - deoksiribonukleinska kiselina
• RNK - ribonukleinska kiselina
• BCNU - N,N-bis(2-kloroetil)N-nitrozourea
• CENU - kloroetilnitrozourea
• O 6 -BzG - O 6 -benzilgvanin
• 1-meA - 1-metiladenin
• 1-meG - 1-metilgvanin
• 3-meC - 3-metilcitozin
• 3-meT - 3-metiltimin

književnost:

» Orlando D. Scharer (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42, 2946-2974
» James C. Delaney i John M. Essigmann Mutageneza, genotoksičnost i popravak 1-metiladenina, 3-alkilcitozina, 1-metilguanina i 3-metiltimina u alkB Escherichia coli
» Pertti Koivisto, Tod Duncan, Tomas Lindahl i Barbara Sedgwick Minimalni metilirani supstrat i prošireni raspon supstrata Escherichia coli AlkB proteina, 1-metiladenin-DNA dioksigenaze*
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T. & Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Akad. Sci. USA 99, 16660-16665. 5. Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., et. al. (2003) Nature 421, 859-863.
" Hollis, T., Lau, A., i Ellenberger, T. (2000) Mutat. Res. 460, 201-210
" Daniels, D. S., i Tainer, J. A. (2000) Mutat. Res. 460, 151-163
" Trewick, S. C., Henshaw, T. F., Hausenger, R. P., Lindahl, T., i Sedgwick, B. (2002) Nature 419, 174-178
» Falnes, P. O., Johansen, R. F., i Seeberg, E. (2002) Nature 419, 178-181
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T., i Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A. 99, 16660-16665
» Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., i Krokan , H. E. (2003) Nature 421, 859-863
» Aravind, L., i Koonin, E. V. (2001) Genome Biology 2, 0007.1-0007.8
" Bodell, W. J., i Singer, B. (1979) Biochemistry 18, 2860-2863
» Boiteux, S., i Laval, J. (1982) Biochimie (Paris) 64, 637-641
» Larson, K., Sahm, J., Shenkar, R., i Strauss, B. (1985) Mutat. Res. 150, 77-84
» Dinglay, S., Trewick, S. C., Lindahl, T., i Sedgwick, B. (2000) Genes Dev. 14, 2097-2105

Popravak prekida DNK

Fotoreaktivacija

Apsorpcija energije UV zračenja od strane molekula DNK dovodi do stvaranja raznih vrsta oštećenja. Iako može doći do jedno- i dvolančanih lomova i umrežavanja DNK-proteina, većina oštećenja izazvanih UV zračenjem nastaje zbog modifikacije dušičnih baza, uz stvaranje ciklobutan pirimidin dimera (CPD) i pirimidin-pirimidonskih fotoproizvoda (6 -4PP) su najčešći tipovi fotooštećenja.

Pirimidinski dimeri su inhibitori i replikacije i transkripcije, što usporava rast i dovodi do mutageneze tokom replikacije DNK ako takvo oštećenje ostane nepopravljeno.

Da bi uklonili oštećenje DNK izazvano svjetlom, mnogi organizmi koriste enzime koji se specifično vezuju za CPD (CPD fotoliaza) ili 6-4PP (6-4PP fotoliaza) i ispravljaju ta oštećenja. CPD fotoliaze se nalaze u bakterijama, gljivama, biljkama, beskičmenjacima i mnogim kralježnjacima; 6-4PP fotoliaze su do sada pronađene samo u Drosophila, svilene bube, Xenopus laevis i zvečarke, ali ne i u Escherichia coli ili kvascu. Fotoliaze nisu otkrivene kod ljudi. Fotoliaze sadrže FAD kao katalitički kofaktor i dodatni hromofor kao antenu za prikupljanje svjetlosti.

Dodatni hromofori su ili 5,10-meteniltetrahidrofolat (MTHF) ili 8-hidroksi-5-deazoriboflavin (8-HDF), sa maksimumom apsorpcije na talasnim dužinama od 380 i 440 nm, respektivno. Kristalne strukture CPD fotoliaza iz E. coli i Anacystis nidulans sugeriraju da enzimi, da bi vezali DNK, rotiraju pirimidin dimer iz dupleksa u bunar koji sadrži katalitički kofaktor. Ciklobutanski prsten se zatim cijepa prijenosom elektrona izazvanim svjetlom. CPD fotoliaze selektivno prepoznaju CPD, slično proteinima koji se vezuju za DNK. Bijelo svjetlo ili UV-B zračenje indukuje ekspresiju CPD fotoliaze. Za razliku od CPD fotoliaza, 6-4PP fotoliaze su stabilno eksprimirane i nisu regulirane ni bijelim svjetlom ni UV-B zračenjem.

Šematski prikaz fotoreaktivacije u hromatinu. Gitone oktameri su plavi, DNK je crn. Fotoliaza se vezuje za dimere ciklobutan pirimidina (CPD), rotira pirimidinski dimer i regeneriše prirodne pirimidine u reakciji koja zavisi od svetlosti. Fotoliaza preferencijalno popravlja CPD u vezivnoj DNK. Popravka u nukleosomima je spora i vjerovatno je olakšana dinamičkim svojstvima nukleozoma koji pomiču oštećenje DNK na regiju DNK linkera.

Klasa CDP-specifičnih fotoliaza iz mikroorganizama, definisana kao fotoliaze klase I, bila je prvi okarakterisani član porodice fotoliaza. Nedavno je otkrivena blisko povezana klasa fotoliaza od 6-4 foto-proizvoda; članovi ove porodice pronađeni su u Drosophila melanogaster, Xenopus laevis i Arabidopsis thaliana. Kriptokromi, koji su fotoreceptori za ljubičasti dio svjetlosnog spektra koji se nalazi u biljkama i drugim organizmima, također su blisko povezani sa fotoliazama klase I.

Udaljenija porodica fotoliaza CPD, nazvana fotoliaze klase II, identificirana je u brojnim vrstama, uključujući životinje, Archaebacterium, Eubacterium i više biljke. Pokazalo se da sve okarakterizirane fotoliaze sadrže smanjeni FAD, a većina sadrži sekundarne hromofore, ovisno o vrsti, bilo MTHF ili 8-HDF. Sličan mehanizam reakcije je predložen za obje klase CPD fotoliaza. MTHF ili 8-HDF hromofor je poput antene koja upija ljubičastu svjetlost i koristi apsorbiranu energiju za regeneraciju FADH-a.

Sastav kofaktora fotoliaze biljke nije u potpunosti shvaćen, iako je nedavno pokazano da CPD fotoliaze iz Arabidopsis koje sadrže samo FADH imaju enzimsku aktivnost.

književnost:

» Fritz Thoma, Svjetlo i tamno u popravci hromatina: popravak lezija DNK izazvanih UV zračenjem fotoliazom i popravkom ekscizije nukleotida, Institut fur Zellbiologie, ETH-Zurich, Honggerberg, CH-8093 Cirih, Švicarska
» Karakterizacija enzima fotoliaze Arabidopsis i analiza njihove uloge u zaštiti od ultraljubičastog-B zračenja, Wanda M. Waterworth 1, Qing Jiang, Christopher E. West, M. Nikaido i Clifford M. Bray

Istorija otkrića

Oštećenje jednolančane i dvolančane DNK

Studija reparacije započela je radom A. Kelnera (SAD), koji je otkrio fenomen fotoreaktivacije (PR) - smanjenje oštećenja bioloških objekata uzrokovanih ultraljubičastim (UV) zracima uz naknadno izlaganje jakoj vidljivoj svjetlosti ( laka reparacija).

Popravak ekscizije

Postreplikativna popravka otkrivena je u ćelijama E.Coli, nesposoban da cijepa dimere timina. Ovo je jedini tip popravka koji nema fazu prepoznavanja oštećenja.

Bilješke

Wikimedia fondacija. 2010.

Pogledajte šta je "popravak DNK" u drugim rječnicima:

Popravljanje defekata u DNK koji su rezultat mutacije ili rekombinacije. Izvodi ga sistem reparativnih enzima, od kojih jedni uspostavljaju mesto oštećenja, drugi ga „izrezuju“, treći sintetizuju oštećena mesta, a treći… Mikrobiološki rječnik

Popravak DNK- - ispravljanje "grešaka" u primarnoj strukturi DNK kao rezultat djelovanja posebnih enzima za popravak... Kratak rječnik biohemijskih pojmova

Popravak DNK- - Biotehnološke teme EN popravka DNK... Vodič za tehnički prevodilac

Popravak DNK- DNR reparacija statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis DNR struktūros atsikūrimas po pažeidimo. atitikmenys: engl. DNK popravka rus. popravka DNK... Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

DNK REPAIR- Obnavljanje originalne strukture u molekuli DNK, tj. ispravan nukleotidni niz... Termini i definicije koji se koriste u uzgoju, genetici i reprodukciji domaćih životinja

Popravak DNK- * popravka DNK * popravka DNK enzimska korekcija grešaka u nukleotidnoj sekvenci molekula DNK. Mehanizmi DNK str. štite genetske informacije tijela od oštećenja uzrokovanih mutagenima iz okoliša (npr. ultraljubičasto, ... ...

DNK-ovisna DNK polimeraza DNK polimeraza- DNK zavisna DNK polimeraza, DNK polimeraza * DNK zavisna DNK polimeraza, DNK polimeraza * DNK zavisna DNK polimeraza ili DNK polimeraza enzim koji katalizuje polimerizaciju (vidi) deoksiribonukleozid trifosfata u polimer... Genetika. enciklopedijski rječnik

- (od kasnolat. reparatio restauracija), svojstveno svim ćelijama živih organizama, obnavljanje izvorne (nativne) strukture DNK u slučaju njenog kršenja. Oštećenje strukture DNK može dovesti do blokiranja replikacije DNK (smrtonosno ... ... Hemijska enciklopedija

Popravka: popravka DNK je sposobnost ćelija da poprave hemijska oštećenja i lomove u molekulima DNK. Reparacije su oblik finansijske odgovornosti subjekta međunarodnog prava za štetu nastalu kao rezultat međunarodnog... ... Wikipedia

Sistem za detekciju i popravku umetanja, izostavljanja i pogrešnih sparivanja nukleotida do kojih dolazi tokom procesa replikacije i rekombinacije DNK, kao i kao posledica određenih vrsta oštećenja DNK Sama činjenica pogrešnog sparivanja ne dozvoljava... ... Wikipedia

Knjige

• Metilacija DNK u biljkama. Mehanizmi i biološka uloga, B. F. Vanyušin. Ovo štivo jednog od pionira i renomiranih svjetskih lidera u proučavanju DNK metilacije u različitim organizmima detaljno prikazuje trenutno stanje općeg biološkog problema...

Oštećena tokom normalne biosinteze DNK u ćeliji ili kao rezultat izlaganja fizičkim ili hemijskim reagensima. Obavljaju ga posebni enzimski sistemi ćelije. Brojne nasljedne bolesti (npr. pigmentna kseroderma) su povezane s poremećajima sistema popravke.

Istorija otkrića

Studija reparacije započela je radom Alberta Kellnera (SAD), koji je 1948. otkrio fenomen fotoreaktivacije - smanjenje oštećenja bioloških objekata uzrokovanih ultraljubičastim (UV) zracima nakon naknadnog izlaganja jakoj vidljivoj svjetlosti ( laka reparacija).

R. Setlow, K. Rupert (SAD) i drugi ubrzo su ustanovili da je fotoreaktivacija fotohemijski proces koji se odvija uz učešće posebnog enzima i dovodi do cijepanja timinskih dimera nastalih u DNK pri apsorpciji UV kvanta.

Kasnije, proučavanjem genetske kontrole osjetljivosti bakterija na UV svjetlo i jonizujuće zračenje, otkriveno je tamna popravka- sposobnost ćelija da eliminišu oštećenje DNK bez učešća vidljive svetlosti. Mehanizam tamne popravke bakterijskih ćelija ozračenih UV svjetlom predvidio je A. P. Howard-Flanders, a eksperimentalno potvrdili 1964. F. Hanawalt i D. Petitjohn (SAD). Pokazalo se da se kod bakterija nakon ozračivanja izrezuju oštećeni dijelovi DNK sa izmijenjenim nukleotidima i u nastalim prazninama se ponovo sintetiše DNK.

Sistemi popravke postoje ne samo u mikroorganizmima, već iu životinjskim i ljudskim ćelijama, u kojima se proučavaju u kulturama tkiva. Poznata je nasljedna ljudska bolest - pigmentna kseroderma, kod koje je regeneracija poremećena.

Izvori oštećenja DNK

Glavne vrste oštećenja DNK

Struktura reparacionog sistema

Svaki sistem popravke uključuje sljedeće komponente:

• DNK helikaza je enzim koji „prepoznaje“ hemijski izmenjena mesta u lancu i razbija lanac blizu oštećenja;
• DNaza (deoksiribonukleaza) je enzim koji „presiječe“ 1 DNK lanac (nukleotidnu sekvencu) na fosfodiestarskoj vezi i uklanja oštećeni dio: egzonukleaza djeluje na terminalne nukleotide 3` ili 5`, endonukleaza - na nukleotide koji nisu terminalni;
• DNK polimeraza je enzim koji sintetizira odgovarajući dio lanca DNK kako bi zamijenio uklonjeni;
• DNK ligaza je enzim koji zatvara posljednju vezu u polimernom lancu i time obnavlja njegov kontinuitet.

Vrste reparacija

Direktna reparacija

Direktna popravka je najjednostavniji način eliminacije oštećenja u DNK, što obično uključuje specifične enzime koji mogu brzo (obično u jednom koraku) eliminirati odgovarajuća oštećenja, vraćajući originalnu strukturu nukleotida. To je slučaj, na primjer, sa O6-metilguanin-DNA metiltransferazom, koja uklanja metilnu grupu sa dušične baze na jedan od vlastitih ostataka cisteina.

Popravak ekscizije

Excision repair (eng. excision - cutting) uključuje uklanjanje oštećenih azotnih baza iz DNK i naknadnu restauraciju normalne strukture molekula duž komplementarnog lanca. Enzimski sistem uklanja kratku jednolančanu sekvencu dvolančane DNK koja sadrži neusklađene ili oštećene baze i zamjenjuje ih sintetizirajući sekvencu komplementarnu preostalom lancu.

Reparacija ekscizijom je najčešća metoda za popravku modificiranih baza DNK. Zasnovan je na prepoznavanju modificirane baze raznim glikozilazama, koje cijepaju N-glikozidnu vezu ove baze sa šećerno-fosfatnom kičmom molekule DNK. Istovremeno, postoje glikozilaze koje specifično prepoznaju prisustvo određenih modifikovanih baza u DNK (hidroksimetiluracil, hipoksantin, 5-metiluracil, 3-metiladenin, 7-metilguanin itd.). Za mnoge glikozilaze je sada opisan polimorfizam povezan sa zamjenom jednog od nukleotida u kodirajućoj sekvenci gena. Brojne izoforme ovih enzima su povezane sa povećanim rizikom od raka [Chen, 2003].

Visoku stabilnost DNK osigurava ne samo očuvanje njene strukture i visoka tačnost replikacije, već i prisustvo posebnih sistema u ćelijama svih živih organizama. reparacije, eliminišući oštećenja DNK koja se u njoj javljaju.

Djelovanje različitih kemikalija, jonizujućeg zračenja i ultraljubičastog zračenja može uzrokovati sljedeća oštećenja strukture DNK:

· oštećenje pojedinačnih baza (deaminacija koja dovodi do konverzije citozina u uracil, adenina u hipoksantin; alkilacija baza; uključivanje analoga baze, umetanje i delecija nukleotida);

· oštećenje baznih parova (formiranje timinskih dimera);

· prekidi strujnih kola (jednostruki i dvostruki);

· formiranje unakrsnih veza izmedju baza, kao i DNK-protein poprecnih veza.

Neki od ovih poremećaja mogu nastati i spontano, tj. bez učešća bilo kakvih štetnih faktora.

Bilo koja vrsta oštećenja dovodi do poremećaja sekundarne strukture DNK, što uzrokuje djelomično ili potpuno blokiranje replikacije. Takvi konformacioni poremećaji služe kao mete za sisteme popravke. Proces obnavljanja strukture DNK zasniva se na činjenici da su genetske informacije predstavljene u DNK u dvije kopije – po jedna u svakoj od niti dvostruke spirale. Zahvaljujući tome, oštećenje u jednom od lanaca može biti uklonjeno enzimom za popravku, a ovaj dio lanca se ponovo sintetizira u svom normalnom obliku zahvaljujući informacijama sadržanim u neoštećenom lancu.

Trenutno su identificirana tri glavna mehanizma popravke DNK: fotoreaktivacija, ekscizija i post-replikativna popravka. Posljednje dvije vrste se također nazivaju tamnim popravkom.

Fotoreaktivacija sastoji se od probave pomoću enzima fotolyase, aktivirane vidljivom svjetlošću, dimeri timina koji se pojavljuju u DNK pod utjecajem ultraljubičastog zračenja.

Ekscizija reparacija se sastoji od prepoznavanja oštećenja DNK, ekscizije oštećenog područja, resinteze DNK pomoću šablona netaknutog lanca, vraćanja kontinuiteta lanca DNK. Ova metoda se također naziva popravkom po vrsti ekscizije-zamjene, ili slikovitije, mehanizmu "cut-patch". Popravak ekscizije je proces u više koraka i sastoji se od:

1) „prepoznavanje” štete;

2) presecanje jednog lanca DNK u blizini oštećenja (rez);

3) uklanjanje oštećenog područja (ekscizija);

4) resinteza DNK na mestu deletiranog mesta;

5) obnavljanje kontinuiteta popravljenog lanca zbog stvaranja fosfodiestarskih veza između nukleotida
(Slika 6.2)

Rice. 6.2 Šema ekscizijske popravke

Reparacija počinje aneksijom DNK-N-glikozilaze do oštećene baze. Postoje mnoge DNK N-glikozilaze specifične za različite modificirane baze. Enzimi hidrolitički cijepaju N-glikozidnu vezu između modificirane baze i deoksiriboze, što dovodi do formiranja AP (apurinsko-apirimidinskog) mjesta u DNK lancu (prvi korak). Popravak AP lokacije može se desiti samo uz učešće DNK insertaze, koji dodaje bazu deoksiribozi prema pravilu komplementarnosti. U ovom slučaju, nema potrebe za presecanjem DNK lanca, izrezivanjem netačnog nukleotida i popravkom prekida. Za složenije oštećenje strukture DNK neophodno je učešće čitavog kompleksa enzima uključenih u popravku (slika 6.2.): AP endonukleaza prepoznaje AP mjesto i presijeca lanac DNK blizu njega (faza II). Čim dođe do prekida u strujnom kolu, AP egzonukleaza, koji uklanja fragment DNK koji sadrži grešku (faza III). DNK polimeraza b popunjava prazninu koja je nastala po principu komplementarnosti (faza IV). DNK ligaza povezuje 3¢-kraj novosintetizovanog fragmenta sa glavnim lancem i završava popravku oštećenja (faza V).

Post-replikacija popravak se aktivira u slučajevima kada ekscizijski popravak ne može izaći na kraj s eliminacijom svih oštećenja DNK prije njegove replikacije. U ovom slučaju, reprodukcija oštećenih molekula dovodi do pojave DNK sa jednolančanim prazninama, a nativna struktura se obnavlja tokom rekombinacije.

Kongenitalni defekti sistema popravke uzrok su nasljednih bolesti kao što su pigmentna kseroderma, ataksija-telangiektazija, trihotiodistrofija, progerija.

DNK REPAIR

Sistemi reparacije

2 Popravak ekscizije. Primjeri i vrste

3 Popravka grešaka u replikaciji DNK

4 Rekombinantna (post-replikacijska) popravka u bakterijama

5 SOS reparacija

Sistemi za popravku DNK su prilično konzervativni u evoluciji od bakterija do ljudi i najviše su proučavani kod E. coli.

Poznate su dvije vrste reparacija:direktni i ekscizioni

Direktna reparacija

Direktna popravka je najjednostavniji način da se eliminira oštećenje u DNK, što obično uključuje specifične enzime koji mogu brzo (obično u jednoj fazi) eliminirati odgovarajuća oštećenja, vraćajući originalnu strukturu nukleotida.

1. Ovo funkcionira npr.O6-metilguanin DNK metiltransferaza

(samoubilački enzim), koji uklanja metilnu grupu iz azotne baze na jedan od vlastitih ostataka cisteina

U E. coli, do 100 molekula ovog proteina može se sintetizirati za 1 minut. Protein sličan u funkciji višim eukariotima očito igra važnu ulogu u zaštiti od raka uzrokovanog unutarnjim i vanjskim alkilirajućim faktorima.

DNK insertaza

2. DNK insertaze

fotolyase

3. Dimeri timina su “nepovezani” pomoću direktnu reparaciju glumifotolyase, vršeći odgovarajuću fotohemijsku transformaciju. DNK fotoliaze su grupa svetlosno aktiviranih enzima talasne dužine od 300 - 600 nm (vidljivo područje), za koje u svojoj strukturi imaju poseban centar osetljiv na svetlost.

U prirodi su rasprostranjeni i nalaze se u bakterijama, kvascima, insektima, gmizavcima, vodozemcima i ljudima. Ovi enzimi zahtijevaju razne kofaktore (FADH, tetrahidrofolna kiselina, itd.) uključene u fotokemijsku aktivaciju enzima. E. coli fotoliaza je protein molekulske težine 35 kDa, čvrsto povezan sa oligoribonukleotid dužine 10-15 nukleotida neophodna za aktivnost enzima.

Primjeri direktne reparacije

1. Metilirana baza O 6-mG dimetiliran enzimom metiltransferazomO6-metilguanin DNK metiltransferaza (samoubilački enzim), koji prenosi metilnu grupu na jedan od svojih ostataka

cistein

2. AP mjesta se mogu popraviti direktnim umetanjem purina uz učešće enzima tzvDNK insertaze(od engleskog insert - insert).

DIJAGRAM PRIMJERA DIREKTNE POPRAVKE OŠTEĆENJA U DNK – metilirana baza O6- mGdemetiliran enzimom metiltransferazom, koji prenosi metilnu grupu na jedan od njegovih cisteinskih aminokiselinskih ostataka.

3. Fotoliaza se veže na dimer timina i nakon ozračivanja ovog kompleksa vidljivom svjetlošću (300-600 nm), dimer se raspliće.

DIJAGRAM PRIMJERA DIREKTNE POPRAVKE OŠTEĆENJA U DNK – Photolyase

veže se za dimer timina i nakon ozračivanja vidljivim spektrom svjetlosti, ovaj dimer se raspliće

Popravak ekscizije

(od engleskog excision - rezanje).

DEFINICIJA

Ekscizijska popravka uključuje brisanje oštećene azotne baze iz DNK i naknadni oporavak normalna molekularna struktura.

MEHANIZAM

Popravak ekscizije obično uključuje nekoliko enzima, a uključuje i sam proces

ne samo oštećena ,

ali i nukleotidi koji se nalaze uz njega .

USLOVI

Popravak ekscizije zahtijeva drugi (komplementarni) lanac DNK. Opšti pojednostavljeni dijagram popravka ekscizijom prikazan je na Sl. 171.

KORACI

Prvi korak u popravci ekscizije je uklanjanje abnormalnih azotnih baza. Katalizuje ga grupaDNK-N-glikozilaze- enzimi koji cijepaju glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze.

VAŽNA NAPOMENA:

UosobaDNK-N-glikozilazeimaju visoku supstratnu specifičnost: različiti enzimi ove porodice prepoznaju i režu razne anomalne osnove(8-oksoguanin, uracil, metilpurini, itd.).

UbakterijeDNK-N-glikozilazenema takvu specifičnost supstrata

OBIČNI ENZIMI ZA POPRAVKU ISKLJUČIVANJA

NAME	FUNCTION	MEHANIZAM
DNK-N-glikozilaze	ekscizija abnormalnih azotnih baza	cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i azotne baze
AP endonukleaza	stvara uslove za rad sledećeg enzima - egzonukleaze	lomi šećerno-fosfatnu kičmu molekula DNK na mjestu AP
egzonukleaza	oslobađa nekoliko nukleotida	sekvencijalno odcjepljuje nekoliko nukleotida sa oštećenog dijela jednog DNK lanca

SPECIFIČNI POSLEDIČNI KORACI OVOG MEHANIZMA:

Kao rezultat akcije DNK- N-glikozilazeformira se AP mjesto koje enzim napada AP endonukleaza. Razbija šećerno-fosfatnu kičmu molekule DNK na mjestu AP i time stvara uslove za rad sljedećeg enzima - egzonukleaze, koji sekvencijalno odcjepljuje nekoliko nukleotida sa oštećenog dijela jednog DNK lanca.

U bakterijskim ćelijama oslobođeni prostor se popunjava odgovarajućim nukleotidima uz učešće DNK polimeraza I, orijentisan prema drugom (komplementarnom) lancu DNK.

Budući da je DNK polimeraza I sposobna proširiti 3" kraj jednog od lanaca na mjestu prekida dvolančane DNK i ukloniti nukleotide sa 5" kraja istog prekida,

one. shvatiti “nick emitiranje” , ovaj enzim igra ključnu ulogu u popravci DNK. Izvodi se završno šivanje popravljenih područja DNK ligaza.

U ćelijama eukariota (sisara).

Popravak ekscizije DNK u stanicama sisara je praćen naglim porastom aktivnosti drugog enzima -poli ADR-riboza polimeraza . Ovo se dešava ADP-ribozilacija proteina hromatina(histoni i nehistonski proteini), što dovodi do slabljenja njihove veze sa DNK i otvara pristup enzimima za popravku.

Donator ADP-ribozadjeluje u ovim reakcijamaNAD+, čije se rezerve uvelike iscrpljuju prilikom ekscizijske sanacije oštećenja uzrokovanih rendgenskim zračenjem:

Negativno nabijeni ostaci ADP-riboza iz unutrašnjeg sastava molekula NAD+ dodati preko radikalaglutamin kiselina ili fosfoserinna proteine ​​hromatina, što dovodi do neutralizacije pozitivnih naboja ovih proteina i slabljenja njihovog kontakta sa DNK.

ŠTA JE GRUPA ENZIMA

DNK glikozilaze

cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze

što rezultira ekscizijom abnormalnih azotnih baza

DNK glikozilaze uključeni u eliminaciju oksidativnih oštećenja DNK u stanicama prokariota i eukariota, veoma su raznoliki i razlikuju se po specifičnosti supstrata, prostornoj strukturi i metodama interakcije sa DNK.

Najviše proučavane DNK glikozilaze uključuju:

endonukleaza III(EndoIII),

formira amidopirimidin DNK glikozilazu (Fpg),

Mut T I

Mut Ycoli.

Endonukleaza IIIE. coli "prepoznaje" i specifično se odvaja od DNK oksidirano pirimidinske baze.

Ovaj enzim je monomerni globularni protein koji se sastoji od 211 aminokiselina ostaci (mol. masa 23,4 kDa). Gen koji kodira Endo III je sekvencioniran i određena je njegova nukleotidna sekvenca. Endo III je gvožđe sumpor protein [(4 Fe-4S )2+ protein] koji ima element suprasekundarna struktura Tip "grčki ključ" (spirala - ukosnica - spirala), služe za vezivanje za DNK. Enzimi sa sličnom specifičnošću supstrata i sličnim sekvencama aminokiselina su također izolovani iz goveđe i ljudske ćelije.

Formirajte amidopiridin DNK glikozilazu E. coli "prepoznaje" i cijepa oksidirana heterociklična jedinjenja iz DNK purinske baze .

ŠEMA FAZA POPRAVKE EKCIZIJE 1

DNKN

ŠEMA POPRAVKE ISKLJUČIVANJA

1 DNKNglikozidaza uklanja oštećenu bazu

AP endonukleaza razbija DNK

2 Egzonukleaza uklanja određeni broj nukleotida

3 DNK polimeraza ispunjava oslobođeno područje komplementarnim

Mononukleotidi

DNK ligaza spaja popravljeni lanac DNK

Mut T- mali protein molekulske težine 15 kDa sa aktivnošću nukleozid trifosfataze, koja je pretežno hidrolizira dGTP u dGMP i pirofosfat.

Biološka uloga Mut T je spriječiti formiranje nekanonskih parova tokom replikacijeA:G I A: 8-okso-G.

Takvi parovi se mogu pojaviti kada oksidirani oblik

dGTP (8-okso-dGTP) postaje supstrat DNK polimeraze.

Mut T hidrolizuje 8-okso-dGTP10 puta brži od dGTP-a.

Ima 8-okso-dGTPnajpoželjniji supstratMutTi objašnjava njegovu funkcionalnu ulogu.

Mut Yje specifična adenin DNK glikozilaza koja cijepa N-glikozidnu vezu između adenina i deoksiriboze adenozin, formirajući nekanonski par sa gvaninom.

Funkcionalna uloga ovog enzima je da spriječi mutaciju

T:A - G:A od cijepanje netaknutog ostatka adeniniz baznog para A: 8-okso-G.

Popravak ekscizijom nukleotida

(ATP ovisan mehanizam za uklanjanje oštećenja DNK)

U posljednje vrijeme, u ekscizijskoj popravci, posebna pažnja je posvećena ATP-ovisnom mehanizmu za uklanjanje oštećenja iz DNK. Ova vrsta ekscizijske popravke naziva se nukleotidna eksciziona popravka (NER).

Uključuje DVIJE FAZE :

1. uklanjanje iz DNKoligonukleotidnih fragmenata koji sadrže štetu, i

Eksinukleaza

2. naknadna rekonstrukcija lanca DNK uz učešće kompleksa enzima (nukleaze, DNK polimeraze, DNK ligaze itd.).

Dolazi do uklanjanja fragmenta DNK sa obe strane oštećenog nukleotida. Dužina uklonjenih fragmenata oligonukleotida razlikuje se između prokariota i eukariota.

Uklanjanje fragmenta DNK iz prokariota

Dakle, kod E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, dužina fragmenta 12-13 nukleotidi,

Uklanjanje fragmenta DNK kod eukariota

a kod kvasca, vodozemaca i ljudi - fragment koji se sastoji od 24-32 nukleotidi.

Eksinukleaza– enzim koji uklanja fragmente DNK

Cepanje fragmenta DNK vrši enzimeksinukleaza(eksinukleaza). U E. coli, ovaj enzim se sastoji od 3 različita protomera -

uvrA

uvr B

uvr C

od kojih svaki obavlja specifičnu funkciju tokom ekscizijskog cijepanja fragmenta DNK. Nazivi ovih proteina dati su prvim slovima riječi"ultraljubičasta popravka".

Protomer uvr Aima aktivnost ATPaze, vezuje se za DNK u obliku dimera, izvodeći

početno prepoznavanje štete i

vezivanjeuvr B

Protomer uvr B ima:

1 . Latentno Aktivnost ATPaze i latentne helikaze, neophodne za promjenu konformacija i odmotavanje dvostruke spirale DNK;

2. Endonukleaza aktivnost, cijepanje internukleotidne (fosfodiestarske) veze odZ"-krajusitnjeni fragment.

Protomer uvr Cdeluje kao endonukleaza, uvodeći prekid u lancu DNK koji se popravlja5" krajeviizrezani fragment.

Dakle, protomeriuvr A, uvr B, uvr Cstupaju u interakciju s DNK u određenom nizu, izvodeći ATP-ovisnu reakcijucijepanje oligonukleotidnog fragmenta od lanca DNK koji se popravlja.

Nastali jaz u molekuli DNK obnavlja se uz učešće DNK polimeraze I i DNK ligaze. Model ekscizijske popravke koji uključuje gore navedene enzime prikazan je na Sl. 172.

Ekscizijski popravci kod ljudi

Popravke ekscizije kod ljudi su također zavisne od ATP-a i uključujutri glavne faze :

prepoznavanje štete,

presecanje dvostrukog DNK lanca

reduktivna sinteza i

podvezivanje popravljene niti.

Međutim, popravak ekscizije ljudske DNK uključuje

25 različitih polipeptida ,

16 od kojih učestvuju u cijepanju oligonukleotidnog fragmenta, budući da su protomerieksinukleaze,

i ostalo 9 izvršiti sintezu popravljenog dijela molekula.

U sistemu popravke DNK kod ljudi, transkripcijski proteini igraju veoma značajnu ulogu -

RNA polimeraza II I

TF Mon- jedan od šest glavnih faktora transkripcije eukarioti.

Treba napomenuti da popravak ekscizije kod prokariota, kao i kod eukariota, zavisi od funkcionalnog stanja DNK:

Transkribovana DNK se brže popravlja

nego transkripcijski neaktivan.

Ovaj fenomen se objašnjava sljedećim faktorima:

struktura hromatina,

homologija lanaca transkribovanih delova DNK,

efekat oštećenja niti i njegov uticaj na RNA polimerazu.

VAŽNA NAPOMENA:

DNK LANAC KODIRANJA (lanac za pohranu informacija)

DNK MATRIX LANAC (informacije su kopirane iz njega)

Poznato je da tako velika šteta kao formiranje timinskih dimera, blokiraju transkripciju i kod bakterija i kod ljudi ako se pojave na matrični lanac DNK (oštećenje kodiranje lancima ne utiču u kompleks transkripcije). RNA polimeraza se zaustavlja na mjestu oštećenja DNK i blokira funkcioniranje transkripcionog kompleksa.

Faktor povezivanja transkripcije i popravke (TRCF) .

Kod E. coli, povećana popravka transkripcije je posredovana jednim posebnim proteinom -faktor povezivanja transkripcije i popravke (TRCF) .

Ovaj protein podstiče :

1. odvajanje RNK polimeraze od DNK

2. istovremeno stimuliše stvaranje proteinskog kompleksa,

Izvođenje sanacije oštećenog područja.

Kada se popravka završi, RNA polimeraza se vraća u prvobitni položaj i transkripcija se nastavlja (vidi sliku).

Dakle, opća shema popravka ekscizije

1. DNK-N -glikozilaza uklanja oštećenu bazu

2. AP endonukleaza prekida lanac DNK

3. Egzonukleaza uklanja određeni broj nukleotida

4. DNK polimeraza ispunjava oslobođeno područje

Komplementarni nukleotidi

5. DNK ligaza spaja popravljeni lanac DNK

Popravak greške u replikaciji DNK

metilacijom

Greške u sparivanju azotnih baza tokom replikacije DNK javljaju se prilično često (u bakterijama, jednom na 10 hiljada nukleotida), zbog čegaćerki lanac DNK Uključeni su nukleotidi koji nisu komplementarni nukleotidima matičnog lanca -neusklađenosti(eng. mismatch n e odgovaraju).

IakoDNK polimeraza Iprokarioti imaju sposobnost samoispravljanja, njegove napore da eliminišu pogrešno vezane nukleotide ponekad nisu dovoljni, a zatim neki netačni (nekomplementarni) parovi ostaju u DNK.

U ovom slučaju, popravak se dešava korišćenjem specifičnog sistema povezanog saDNK metilacija . Djelovanje ovog sistema popravke zasniva se na činjenici da nakon replikacije, nakon određenog vremena (nekoliko minuta), DNK prolazi kroz metilaciju.

U E. coli metilirani uglavnom adenin sa obrazovanjem

N6-metil-adenin (N6-mA).

Do ove tačke, novosintetizovano(podružnica)lanac ostaje nemetiliran.

Ako takav lanac sadrži nesparene nukleotide, onda se podvrgava popravci: Daklemetilacije DNK i

uključuje sistem za ispravljanje grešaka replikacija.

U ovom sistemu popravki prepoznaju se posebne strukture:

podsekvencaG-N6-mA-T-CI sljedeći iza toga postoji deformacija

u dvostrukoj spirali gde nema komplementarnosti (slika ispod).

U eliminaciji nesparenih nukleotida u polu-metilirani DNK molekul uključuje prilično složen kompleks enzima za popravak, koji skenira površinu molekule DNK,seče dio dječjeg lanca pribegava se mismatcham, a zatim stvara uslove za razvoj

njegovi neophodni (komplementarni) nukleotidi.

Različite komponente ovog kompleksa imaju različite aktivnostinukleaza,

helikaza,

ATPaza,

neophodan za uvođenje prekida u DNK i cijepanje nukleotida, odmotavanje dvostruke spirale DNK i obezbjeđivanje energije za kretanje kompleksa duž popravljenog dijela molekule.

Kompleks popravljajućih enzima slične strukture i funkcije identificiran je kod ljudi.

Rekombinantna (post-replikativna) popravka

U slučajevima kada su, iz ovog ili onog razloga, gore pomenuti sistemi popravke poremećeni, mogu se formirati praznine (nedovoljno popravljene sekcije) u lancima DNK, koji imaju ponekad prilično značajne veličine, što je ispunjeno poremećajem sistema replikacije i može dovesti do smrti ćelije.

U ovom slučaju, ćelija je u stanju da iskoristi drugi molekul DNK dobijen nakon replikacije za popravku jednog molekula DNK, tj. da privuče mehanizam za tu svrhurekombinacija.

U bakterijama

U bakterijama učestvuje u rekombinantnoj popravci.protein Rec A. Veže se za jednolančani region DNK i uključuje ga u rekombinaciju sahomologne regije netaknutih lanaca drugog molekula DNK .

Kao rezultat toga, i slomljeni (koji sadrže praznine) i netaknuti lanci molekula DNK koji se popravljaju su upareno sa netaknutim komplementarnim DNK regionima, što otvara mogućnost popravke kroz gore opisane sisteme.

U ovom slučaju može postojati rezanje određeni fragment i

punjenjeuz njegovu pomoć, praznine u neispravnom krugu.

Praznine i prekidi koji nastaju u lancima DNK popunjavaju se učešćemDNK polimeraza I i DNK ligaza .

SOS reparacija

Postojanje ovog sistema prvi je pretpostavio M. Radman 1974. godine. On je i dao ime ovom mehanizmu uključivši u njega međunarodni signal za pomoć “SOS” (spasi naše duše).

Zaista, ovaj sistem se uključuje kada Oštećenje DNK postaje toliko veliko da ugrožava život ćelije. U ovom slučaju dolazi do indukcije aktivnosti različite grupe gena uključenih u različite ćelijske procese povezane s popravkom DNK.

Uključivanje određenih gena, određeno količinom oštećenja u DNK, dovodi do ćelijskih odgovora različitog značaja (počevši od standardnih reparacija oštećenih nukleotidi i završetak potiskivanjećelijska dioba).

Najviše proučavanoSOS reparacijau E. coli, čiji su glavni učesnici kodirani proteini geni Rec AILex A.

Prvi od njih je multifunkcionalniRec A protein, učestvujući

V DNK rekombinacija, i

V regulacija transkripcije gena fag lambda, koji utiče na E. coli,

i drugo (Lex A protein)je represor transkripciju velike grupe gena namijenjenih za Popravak DNK bakterije. Kada je inhibirana ili riješena popravka je aktivirana.

Uvezivanje Rec A sa Lexom Avodi do cijepanja potonjeg i shodno tome aktivacija gena za popravku.

Zauzvrat, indukcija bakterijskog SOS sistema služi zafag lambda signal opasnosti i uzrokuje prelazak profaga pasivni na aktivni (litički) put postojanje, na taj način uzrokujući smrt ćelije domaćina.

SOS sistem popravke je identificiran ne samo kod bakterija, već i kod životinja i ljudi.

Geni uključeni u popravku oštećenja SOS DNK

Geni	Posljedice aktivacije gena
uvr A, B, C, D	Popravka oštećenja sekundarne strukture DNK
Rec A	Postreplikativna popravka, indukcija SOS sistema
lex A	Isključivanje SOS sistema
rec N,ruv	Popravka dvolančanih prekida
	Osiguravanje rekombinacijske popravke
umu C, D	Mutageneza uzrokovana promjenama svojstava DNK polimeraze
sul A	Potiskivanje diobe ćelija

Zaključak

Popravljanje oštećenja DNK usko je povezano s drugim fundamentalnim molekularno-genetskim procesima: replikacija, transkripcija i rekombinacija. Svi ovi procesi se ispostavljaju isprepleteni u opšti sistem interakcija, opslužuje veliki broj različitih proteina, od kojih su mnogi multifunkcionalni molekuli uključeni u kontrolu nad implementacijom genetskih informacija u pro- i eukariotskim ćelijama. Istovremeno, očigledno je da priroda "ne štedi" na kontrolnim elementima, stvarajući veoma složene sisteme za ispravljanje onih oštećenja u DNK koja su opasni za tijelo, a posebno za njegovo potomstvo. S druge strane, u slučajevima kada sposobnosti popravke nisu dovoljne za očuvanje genetskog statusa organizma, javlja se potreba za programiranom smrću ćelije -apoptoza..

ŠEMA POPRAVKE EKCIZIJE NUKLEOTIDA E. COLIUZ UČEŠĆE EXINUCLEASE-a

1. MEHANIZAM NEZAVISAN TRANSKRIPCIJE

2. MEHANIZAM OVISAN O TRANSKRIPCIJI

3. OPĆA FAZA POPRAVKE

LEGENDA

A - proteinuvr A

B - proteinuvr IN

C - proteinuvr WITH

mali crni trokut - znak označava mjesto oštećenja

ŠEMA POPRAVKE POVEZANA SA METILANJEM DNK