], međutim, definicija antioksidansa kao hemijskih spojeva ne daje potpunu sliku o zaštitnim svojstvima predmeta koji se proučava: ona su određena ne samo količinom određenog antioksidansa, već i aktivnošću svakog od njih. Antioksidativna aktivnost, ili antioksidativna aktivnost, AOA, je konstanta brzine reakcije antioksidansa sa slobodnim radikalom (kInH). Metoda hemiluminiscencije (CL) vam omogućava da odredite ukupnu količinu radikala koji vežu antioksidanse u uzorku (ukupni antioksidativni kapacitet, TAU), a kada koristite metodu matematičkog modeliranja kinetike CL, i brzinu formiranja i reakcije radikala sa antioksidansima, odnosno AOA [, ,].

Najčešća modifikacija hemiluminiscentne metode za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta zasniva se na upotrebi luminola kao aktivatora hemiluminiscencije [, , ,]. Uzorak se stavlja u hemiluminometarsku kivetu uz dodatak luminola, vodikovog peroksida i jedinjenja sposobnog da formira radikale kao rezultat spontane razgradnje (termolize), na primjer 2,2'-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorid (ABAP). ): ABAP → 2R. U prisustvu molekularnog kiseonika, alkil radikal R formira peroksilni radikal ROO: R + O 2 → ROO. Zatim, peroksilni radikal oksidira hemiluminiscentnu sondu luminol (LH 2), a luminol radikal (LH) se formira: ROO + LH 2 → ROOH + LH. Iz LH, formiranjem međusupstanci (luminol hidroperoksid i luminol endoperoksid), u elektronski pobuđenom stanju nastaje molekul konačnog proizvoda oksidacije luminola, aminoftalne kiseline, koja emituje foton, a kao rezultat toga se opaža hemiluminiscencija. . Intenzitet CL je proporcionalan brzini proizvodnje fotona, a zauzvrat je proporcionalan stacionarnoj koncentraciji LH u sistemu. Interakcijom s radikalima antioksidansi prekidaju opisani lanac transformacija i sprječavaju nastanak fotona.

Spojevi podložni termolizi nisu jedini mogući izvor radikala kada se analizira antioksidativni kapacitet uzorka metodom hemiluminiscencije. Alternative su sistemi ren peroksidaza–vodikov peroksid [, ], hemin–vodikov peroksid, citokrom With–kardiolipin–vodonik peroksid, itd. Reakciona shema oksidacije luminola peroksidazama razmatrana je u radu Cormier et al. .

Kinetičke krive CL za ove sisteme odražavaju dvije faze reakcije: fazu povećanja intenziteta CL i fazu platoa ili postepenog opadanja luminiscencije, kada je intenzitet CL ili konstantan ili polako opada. Rad opisuje dva pristupa mjerenju ukupnog antioksidativnog kapaciteta koji uzimaju u obzir ovu osobinu krivulja. TRAP (ukupni reaktivni antioksidativni potencijal) metoda se zasniva na mjerenju latentnog perioda CL τ i mogu se koristiti za određivanje antioksidansa kao što su Trolox ili askorbinska kiselina: karakterizira ih visoka konstanta brzine reakcije s radikalima i iz tog razloga se mogu nazvati jakim antioksidansima. Tokom latentnog perioda dolazi do njihove potpune oksidacije. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) mjeri stepen gašenja hemiluminiscencije q na platou ili maksimumu krivulje hemiluminiscencije: formula, gdje je I intenzitet hemiluminiscencije bez antioksidansa, a I 1 je intenzitet CL u prisustvu antioksidansa. Ova metoda se koristi ako sistem sadrži pretežno slabe antioksidante sa niskim konstantama brzine interakcije sa radikalima - mnogo nižim u poređenju sa konstantom luminola.

Učinak antioksidansa karakteriziraju ne samo indikatori τ I q. Kao što se vidi iz radova [,], efekat antioksidanata kao što su mokraćna kiselina u sistemu hemin–H 2 O 2 –luminol ili tokoferol, rutin i kvercetin u sistemu citokroma With–kardiolipin–H 2 O 2 –luminol, karakteriziran promjenom maksimalne stope povećanja CL ( vmax). Kao što pokazuju rezultati matematičkog modeliranja kinetike, vrijednosti konstanti brzine interakcije ovih antioksidansa s radikalima su blizu vrijednosti luminol konstante, pa se takvi antioksidansi mogu nazvati antioksidansima srednje jačine.

Ako je materijal koji se proučava, a posebno biljne sirovine, sadržavao samo jednu vrstu antioksidansa, onda bi se njihov sadržaj mogao okarakterizirati jednim od tri gore navedena pokazatelja ( τ , q ili vmax). Ali biljni materijali sadrže mješavinu antioksidansa različite jačine. Da bi riješili ovaj problem, neki autori [ , , , ] koristili su promjenu svjetlosne sume hemiluminiscencije tokom određenog vremena ∆S, izračunatu po formuli , gdje je ∆ S 0 i ∆ S S- CL svjetlosne sume za dato vrijeme t u kontrolnim i ispitnim uzorcima. Vrijeme mora biti dovoljno za oksidaciju svih antioksidanata u sistemu, odnosno da CL kriva ispitnog uzorka dostigne nivo CL krive kontrolnog uzorka. Ovo poslednje pretpostavlja da istraživači moraju ne samo da snime svetlosnu sumu sjaja, već i da snime CL kinetičku krivu dovoljno dugo, što se ne radi uvek.

Budući da svi izmjereni pokazatelji zavise od uređaja i uvjeta mjerenja, antioksidativni učinak supstance u ispitivanom sistemu obično se uspoređuje sa učinkom antioksidansa koji se uzima kao standard, na primjer Trolox [,].

Sistem peroksidaza ren-vodonik peroksid koristili su mnogi autori za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnog materijala. U radovima [ , ] za procjenu količine antioksidansa u uzorcima korišćen je latentni period CL (TRAP metoda), a u radovima [ , , ] - površina ispod krivulje razvoja CL. Međutim, navedeni radovi ne daju jasno opravdanje za izbor jednog ili drugog parametra za ocjenu OAU.

Svrha istraživanja bila je utvrditi kako odnos različitih tipova antioksidanata utiče na TOA, te modificirati metodu hemiluminiscencije na način da se može preciznije odrediti TOA u biljnom materijalu. Da bismo to učinili, postavili smo si nekoliko zadataka. Prvo, uporedite kinetiku CL proučavanih objekata sa kinetikom standardnih antioksidanata tri tipa (jaki, srednji i slabi) kako biste shvatili koji tip antioksidansa daje glavni doprinos OAU ispitivanih objekata. Drugo, izračunajte OAE objekata koji se proučavaju mjerenjem smanjenja svjetlosne sume CL pod uticajem ovih objekata u poređenju sa efektom antioksidansa koji daje najveći doprinos OAE.

MATERIJALI I METODE

Predmet istraživanja bili su industrijski uzorci gloga, vrane i šipka proizvođača JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), kao i plodovi maline koje su autori sakupili u Moskovskoj oblasti u prirodnim uslovima rasta i sušeni na temperaturi od 60-80° C dok ne prestanu puštati sok i deformirati se kada se pritisnu.

Reagensi za analizu antioksidativnog kapaciteta hemiluminiscentnom metodom su: KH 2 PO 4, 20 mM puferski rastvor (pH 7,4); peroksidaza iz korijena rena (aktivnost 112 jedinica/mg, M = 44.173,9), 1 mM vodeni rastvor; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, M = 177,11), 1 mM vodeni rastvor; vodonik peroksid (H 2 O 2, M = 34,01), 1 mM vodeni rastvor; rastvori antioksidansa (askorbinska kiselina, kvercetin, tokoferol). Sve reagense proizvodi Sigma Aldrich (SAD).

Uvarci od plodova gloga, rowan i šipka i infuzija plodova maline pripremljeni su prema metodama Državne farmakopeje SSSR-a, navedenim u općem farmakopejskom članku „Infuzije i dekocije“.

Određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta izvršeno je snimanjem hemiluminiscencije na hemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) korišćenjem softvera PowerGraph 3.3. Za određivanje OAE u biljnom materijalu potrebno je 40 μl luminola u koncentraciji od 1 mM, 40 μl peroksidaze hrena u koncentraciji 0,1 μM, od 10 do 50 μl dekokcije ili infuzije (ovisno o koncentraciji) i fosfatni pufer u potrebne količine stavljene su u kivetu uređaja kako bi se ukupna zapremina uzorka dovela do 1 ml. Kiveta je ugrađena u uređaj i CL je snimljen, posmatrajući pozadinski signal. Nakon 48 s snimanja pozadinskog signala, u kivetu je dodano 100 μl H2O2 u koncentraciji od 1 mM i CL snimanje je nastavljeno 10 min. Pripremljena su četiri uzorka s različitim koncentracijama svakog biljnog objekta. CL je također zabilježen za otopine askorbinske kiseline, kvercetina i tokoferola u pet različitih koncentracija za svaki antioksidans. Nakon toga, OAU uzoraka dekocija i infuzija preračunat je na kvercetin.

Koncentracije luminola, peroksidaze hrena i vodonik peroksida odabrane su tako da se u prihvatljivom vremenu (ne duže od 10 min) odredi antioksidativni kapacitet vodenih ekstrakata iz ljekovitog biljnog materijala. Za to vrijeme, krivulje hemiluminiscencije za antioksidanse askorbat i flavonoid kvercetin (glavni antioksidansi biljnog materijala) dostigle su plato, što ukazuje na potpuno uništenje antioksidansa u sistemu. Razblaženja ispitivanih uzoraka i koncentracije rastvora standardnih antioksidanata (navedene u legendama uz slike) odabrane su na način da su sve CL kinetičke krive merene pri istoj osetljivosti uređaja.

Antioksidativni kapacitet izračunat je iz promjene površine (∆ S) ispod kinetičke krivulje hemiluminiscencije (svjetlosne sume) pri dodavanju tvari koja sadrži antioksidans. U tu svrhu smo izračunali S 0 za sistem bez antioksidansa i oduzeo površinu od njega S S, koji karakteriše sistem u koji je dodat antioksidans. Vrijednost ∆ S zavisi od osetljivosti hemiluminometra i uslova merenja. Odnos ∆ S/C V(Gdje C- koncentracija ispitivanog biološkog materijala u kiveti, g/l, i V- zapremina kivete, l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g materijala koji se proučava, odnosno biljnih sirovina.

Antioksidativni kapacitet ∆ izračunat je na sličan način S A otopina standardnog antioksidansa, na primjer kvercetina, stavljena u isti volumen reakcione smjese. Odnos ∆ S A /C A V(Gdje C A- težinska koncentracija antioksidansa u kiveti, g/l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g antioksidansa.

Za svaki od standardnih antioksidansa zabilježen je signal iz otopina nekoliko koncentracija kako bi se osiguralo da su proračuni u linearnom odnosu i da su dobijeni rezultati ponovljivi. Zaista, dobijena je linearna zavisnost (∆ S A = k A C A) signal iz koncentracije iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent k A. Prema Fišerovom kriteriju, dobivene vrijednosti za standardne antioksidante k A statistički značajno sa vjerovatnoćom od 0,975. Zatim je zabilježen signal iz četiri koncentracije za svaki od četiri uzorka biljaka, a za sve uzorke je dobivena linearna ovisnost signala od koncentracije (∆ S = k·C), iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent k. Sa vjerovatnoćom od 0,975 (Fisherov test), k vrijednosti dobijene za uzorke biljaka su statistički značajne. Ukupni antioksidativni kapacitet biljnog materijala u odnosu na masu standardnog antioksidansa (mg%) utvrđen je pomoću formule.

Vrijednosti su predstavljene kao aritmetička sredina ± standardna devijacija (M ± δ) na p

REZULTATI ISTRAŽIVANJA

Proučavanje kinetike hemiluminiscencije u prisustvu natrijum-askorbata (slika 1. Uticaj natrijum-askorbata na kinetiku hemiluminiscencije" data-note="Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 µM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM natrijum askorbat.">Slika 1) pokazuje taj antioksidant. karakteriše latentni period kada je CL skoro potpuno potisnut.Njegovo trajanje je proporcionalno količini antioksidansa u sistemu.Pri tome se ne menja ni nagib CL krive ni intenzitet CL na platou.To se objašnjava činjenicom da je askorbinska kiselina jak antioksidans koji presreće sve radikale nastale u sistemu, uključujući i luminol radikale, a CL se ne razvija dok se sav askorbat ne oksidira.

Drugi istraživači su također pokazali da se rezultati kemijske analize i TAU vrijednost određena hemiluminiscentnom metodom često ne poklapaju. U radu je ukupan antioksidativni kapacitet određen u sistemu peroksidaza–luminol–vodonik peroksid korelirao sa sadržajem jedinjenja triterpena. Međutim, u radu istih autora, u kojem je predmet proučavanja bila druga biljka, nisu uočili korelaciju OAE sa sadržajem bilo koje grupe supstanci, uključujući flavonoide.

Ovakva odstupanja su povezana sa najmanje tri faktora. Najprije je važna aktivnost antioksidansa, odnosno brzina njihove interakcije s radikalima, koja je različita za različite antioksidanse uključene u biljni uzorak. Prema Izmailovu, konstante brzine odgovarajućih reakcija za meksidol, tokoferol i kvercetin koreliraju kao 0,04:2:60. Drugo, svaki molekul antioksidansa, ulazeći u hemijsku reakciju, može presresti različit broj radikala. Prema radu, kvercetin, mokraćna i askorbinska kiselina su presrele 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 i 0,5 ± 0,2 radikala po reagovanom molekulu antioksidansa, respektivno (korišćen je sistem hemin–H 2 O 2 -luminol). Treće, na rezultate istraživanja moglo bi uticati prisustvo aktivnosti peroksidaze u samim biljnim uzorcima, kao iu radu, kao i prisustvo kalcijuma u uzorcima, koji, kako je prikazano u radu, može povećati aktivnost peroksidaze hrena pod određenim uslovima. To obično uzrokuje veći intenzitet CL na platou nego na kontrolnim krivuljama, što mi, međutim, nismo uočili.

Prvi faktor oštro ograničava upotrebu parametra kao što je promjena svjetlosne sume, budući da vrijeme za mjerenje hemiluminiscencije mora biti duže od vremena za potrošnju svih antioksidansa u ispitivanom uzorku. O nastanku ovog trenutka može se suditi samo mjerenjem kinetike hemiluminiscencije. Osim toga, doprinos slabih antioksidanata TAU je oštro potcijenjen, jer je vrijeme njihove potpune oksidacije višestruko duže od prihvatljivog trajanja mjerenja (10-20 min).

Stehiometrijski koeficijent antioksidansa je još važniji. Broj radikala n presretnuti je jednako , gdje ρ je stehiometrijski koeficijent, i ∆ m- promjena koncentracije antioksidansa tokom mjerenja, u našem slučaju - početne koncentracije ispitivane supstance u uzorku za ispitivanje.

Razlika u sumi svjetlosti luminescencije u odsustvu antioksidansa i u njegovom prisustvu je proporcionalna n. Ukupan broj presretnutih radikala je , gdje ρ i je stehiometrijski koeficijent specifičnog antioksidansa, i m i- njegovu koncentraciju tokom mjerenja. Ukupan broj presretnutih radikala očito nije jednak ukupnoj količini antioksidanata, budući da su koeficijenti ρ i ne samo da nisu jednake jedinici, već se i značajno razlikuju za različite antioksidanse.

Magnituda n je proporcionalna razlici u svjetlosnim sumama izmjerenim tokom određenog vremena između uzorka koji sadrži antioksidans i kontrolnog uzorka koji ne sadrži antioksidanse: S = k n, Gdje k- koeficijent, konstantan pod istim uslovima mjerenja.

Metoda o kojoj se govori u članku omogućava nam da odredimo ukupni antioksidativni kapacitet, dok nam hemijska analiza omogućava određivanje ukupnog sadržaja antioksidansa u proizvodu. Stoga se čini da je metoda hemiluminiscencije informativnija od kemijskih analiza.

Uslove koje smo odabrali za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih sirovina snimanjem kinetike hemiluminiscencije u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola (koncentracije komponenti - 4 nM, 100 µM i 40 µM, respektivno; 20 mM phosphate pufera, pH 7,4), osigurala je oksidaciju jakih antioksidanata (askorbinska kiselina) i antioksidanata srednje jačine (kvercetin) za 10 minuta. Ovo trajanje mjerenja je zgodno i osigurava potreban kvalitet mjerenja.

Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da su u proučavanim objektima (dekocije plodova arabine, šipka, gloga i infuzije plodova maline) glavni antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabe jačine (tokoferol i dr.). Na osnovu smanjenja hemiluminiscencije svjetlosne sume izračunat je ukupni antioksidativni kapacitet za proučavane objekte. Poređenje dobijenih TAU vrednosti sa rezultatima hemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa u različitim omjerima mogu razlikovati po svojoj sposobnosti da efikasno zaštite organizam od štetnog dejstva slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih antioksidansa. Istovremeno ga karakterizira jednostavnost i niska cijena istraživanja. Kombinacija mjerenja kinetike hemiluminiscencije sa matematičkim modeliranjem reakcija neće samo automatizirati proces određivanja TAU-a, već će odrediti i doprinos pojedinih grupa antioksidanata indikatoru.

Ključne riječi

slobodni radikal/antioksidans/ antioksidativno djelovanje / ukupni antioksidativni kapacitet / hemiluminiscencija/ luminol / slobodni radikal / antioksidans / antioksidativna aktivnost / ukupni antioksidativni kapacitet / hemiluminiscencija / luminol

anotacija naučni članak o hemijskim naukama, autor naučnog rada - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Ljekoviti biljni materijali su jedan od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim objektima rasprostranjena je metoda hemiluminiscentne analize. U ovom radu je korišten za procjenu ukupni antioksidativni kapacitet(OAE) dekocije plodova aromana, šipka i gloga i infuzija plodova maline. Kinetika je zabilježena u eksperimentu hemiluminiscencija u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema u uzorku odabrane su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i umereni antioksidansi (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 min). Predložena je i opravdana metoda za izračunavanje OAE na osnovu promjena svjetlosne sume hemiluminiscencija u prisustvu biljnih uzoraka. Kinetička analiza hemiluminiscencija pokazalo je da u proučavanim objektima dominiraju antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol i dr.). Poređenje izračunatih vrijednosti OAE za proučavane objekte i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima po vrsti mogu razlikovati po svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Povezane teme naučni radovi iz hemijskih nauka, autor naučnog rada - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

• 2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.

• Određivanje antioksidansa aktiviranom hemiluminiscencijom pomoću 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana)

  2012 / Aleksejev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Antioksidativni učinak dihidrokvercetina i rutina u reakcijama peroksidaze kataliziranim citokromom c

  2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Procjena oksidativnog i antioksidativnog kapaciteta bioloških supstrata hemiluminiscencijom izazvanom Fentonovom reakcijom

  2016 / Piskarev Igor Mihajlovič, I.P. Ivanova

• Određivanje sadržaja lipohidroperoksida u serumskim lipoproteinima pomoću sistema mikroperoksidaza-luminol

  2011 / Teselkin Jurij Olegovič, Babenkova Irina Vladimirovna

• Metode istraživanja antioksidansa

  2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.

• Antioksidativno djelovanje biljaka koje se koriste u etnomedicini Tuve

  2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.

• Proučavanje antioksidativnih svojstava Fosprenila u različitim biološkim test sistemima

  2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova

• Utjecaj različitih doza polikloriranih bifenila na stanje spontane i imunoglobulinom izazvane hemiluminiscencije pune krvi zavisne od luminola

  2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samokhodova O.V.

• Evaluacija sistema antioksidativne zaštite lipidne peroksidacije kod djece sa esencijalnom arterijskom hipertenzijom spektrofotometrijskim i hemiluminiscentnim metodama

  2014 / Natjaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Hemiluminiscentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

Ljekoviti biljni materijal jedan je od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Hemiluminiscencijska analiza je jedna od uobičajenih metoda za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim materijalima. U našem radu hemiluminiscentnom analizom je određivan ukupni antioksidativni kapacitet (TAC) voćnih dekocija planinskog pepela, ruže i gloga, kao i infuzije plodova maline. Eksperimentima je utvrđena kinetika hemiluminiscencije sistema koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema su odabrane tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i antioksidansi prosečne snage (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 minuta). Predložena je i utemeljena metoda za proračun TAC-a zasnovana na promjenama hemiluminiscencije svjetlosne sume u prisustvu biljnih uzoraka. Analiza kinetike hemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima dominiraju antioksidansi prosječne snage, uključujući flavonoide i slabe antioksidante (tokoferol i drugi). Poređenje izračunatih TAC vrijednosti za objekte koji se proučavaju i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima antioksidanata po vrstama mogu varirati u svojoj sposobnosti da zaštite tijelo od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih vrsta antioksidansa.

Tekst naučnog rada na temu “Kemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu”

hemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1Odsek za medicinsku biofiziku, Fakultet fundamentalne medicine, Moskovski državni univerzitet M.V. Lomonosov, Moskva

2 Katedra za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet,

Prvi Moskovski državni medicinski univerzitet po imenu I.M. Sechenov, Moskva

Ljekoviti biljni materijali su jedan od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim objektima rasprostranjena je metoda hemiluminiscentne analize. U ovom radu korišćen je za procenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TAC) dekocija plodova vrane, šipka i gloga i infuzije plodova maline. U eksperimentu je zabilježena kinetika hemiluminiscencije u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema u uzorku odabrane su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i umereni antioksidansi (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 min). Predložena je i opravdana metoda za izračunavanje OAE na osnovu promjena svjetlosne sume hemiluminiscencije u prisustvu biljnih uzoraka. Analiza kinetike hemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima prevladavaju antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol i dr.). Poređenje izračunatih vrijednosti OAE za proučavane objekte i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima po vrsti mogu razlikovati po svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Ključne riječi: slobodni radikal, antioksidans, antioksidativna aktivnost, ukupni antioksidativni kapacitet, hemiluminiscencija, luminol

Finansiranje: rad je podržan od strane Ruske naučne fondacije, grant br. 14-15-00375.

Ex3 Za prepisku: Georgij Konstantinovič Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovski pr-t, 31, zgrada 5; [email protected]

Članak primljen: 10.03.2016. Članak prihvaćen za objavljivanje: 18.03.2016.

hemiluminiscentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

1 Katedra za medicinsku biofiziku, Fakultet fundamentalne medicine, Moskovski državni univerzitet Lomonosov, Moskva, Rusija

2 Katedra za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet,

Prvi Moskovski državni medicinski univerzitet Sečenov, Moskva, Rusija

Ljekoviti biljni materijal jedan je od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Hemiluminiscencijska analiza je jedna od uobičajenih metoda za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim materijalima. U našem radu hemiluminiscentnom analizom je određivan ukupni antioksidativni kapacitet (TAC) voćnih dekocija planinskog pepela, ruže i gloga, kao i infuzije plodova maline. Eksperimentima je utvrđena kinetika hemiluminiscencije sistema koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema su odabrane tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i antioksidansi prosečne snage (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 minuta). Predložena je i utemeljena metoda za proračun TAC-a zasnovana na promjenama hemiluminiscencije svjetlosne sume u prisustvu biljnih uzoraka. Analiza kinetike hemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima dominiraju antioksidansi prosječne snage, uključujući flavonoide i slabe antioksidante (tokoferol i drugi). Poređenje izračunatih TAC vrijednosti za objekte koji se proučavaju i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima antioksidanata po vrstama mogu varirati u svojoj sposobnosti da zaštite tijelo od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih vrsta antioksidansa.

Ključne riječi: slobodni radikal, antioksidans, antioksidativna aktivnost, ukupni antioksidativni kapacitet, hemiluminiscencija, luminol

Finansiranje: ovaj rad je podržan od strane Ruske naučne fondacije, grant br. 14-15-00375.

Priznanja: autori zahvaljuju Andreju Aleksejevu sa Moskovskog državnog univerziteta Lomonosov za njegovu pomoć u sprovođenju eksperimenta. Prepisku treba adresirati: Georgiy Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, k. 5, Moskva, Rusija, 119192; ur [email protected] Primljeno: 03.10.2016. Prihvaćeno: 18.03.2016.

Slobodni radikali koji nastaju u tijelu remete strukturu ćelijskih membrana, što zauzvrat dovodi do razvoja različitih patoloških stanja. Destruktivni oksidativni efekti radikala spriječeni su antioksidativnim odbrambenim sistemom tijela, u kojem važnu ulogu imaju jedinjenja niske molekularne težine – presretači radikala (zamke). Jedan od izvora antioksidansa su ljekoviti biljni materijali, kao i lijekovi na njihovoj osnovi, čije proučavanje antioksidativnog potencijala pomaže u povećanju njihovog preventivnog i terapijskog djelovanja.

U radovima se razmatraju glavne metode za određivanje antioksidanata, međutim, definicija antioksidanata kao hemijskih jedinjenja ne daje potpunu sliku o zaštitnim svojstvima predmeta koji se proučava: ona se određuju ne samo količinom određenog antioksidansa, ali i aktivnošću svakog od njih. Antioksidativna aktivnost, ili antioksidativna aktivnost, AOA, je konstanta brzine reakcije antioksidansa sa slobodnim radikalom (kInH). Metoda hemiluminiscencije (CL) omogućava određivanje ukupne količine radikala koji vežu antioksidanse u uzorku (ukupni antioksidativni kapacitet, TCA), a kada se koristi metodom matematičkog modeliranja kinetike CL, i brzinu formiranja i reakcije radikali sa antioksidansima, odnosno AOA.

Najčešća modifikacija metode hemiluminiscencije za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta zasniva se na upotrebi luminola kao aktivatora hemiluminiscencije. Uzorak s dodatkom luminola, vodikovog peroksida i spoja sposobnog da formira radikale kao rezultat spontane razgradnje (termolize), na primjer 2,2"-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorid (ABAP):

U prisustvu molekularnog kiseonika, alkil radikal R^ formira peroksilni radikal ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Od LH, stvaranjem međusupstanci (luminol hidroperoksid i luminol endoperoksid), nastaje molekul konačnog proizvoda oksidacije luminola, aminoftalne kiseline, u elektronski pobuđenom stanju, koji emituje foton , a kao rezultat se uočava hemiluminiscencija . Intenzitet CL je proporcionalan brzini proizvodnje fotona, a zauzvrat je proporcionalan stacionarnoj koncentraciji LH u sistemu. Interakcijom s radikalima antioksidansi prekidaju opisani lanac transformacija i sprječavaju nastanak fotona.

Spojevi podložni termolizi nisu jedini mogući izvor radikala kada se analizira antioksidativni kapacitet uzorka metodom hemiluminiscencije. Alternative su peroksidaza hrena-vodonik peroksid, hemin-vodonik peroksid, citokrom c-kardiolipin-vodonik peroksid, itd. Reakciona shema za oksidaciju luminola peroksidazama je razmatrana u radu Cormier et al. .

CL kinetičke krive za ove sisteme odražavaju dvije faze reakcije: fazu povećanja intenziteta CL i fazu platoa ili postepenog opadanja luminiscencije, kada

Intenzitet CL je ili konstantan ili se polako smanjuje. Rad opisuje dva pristupa mjerenju ukupnog antioksidativnog kapaciteta koji uzimaju u obzir ovu osobinu krivulja. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) bazirana je na mjerenju latentnog perioda CL t i može se koristiti za određivanje antioksidansa kao što su Trolox ili askorbinska kiselina: oni se odlikuju velikom konstantom brzine reakcije s radikalima i iz tog razloga se mogu koristiti nazivaju jakim antioksidansima. Tokom latentnog perioda dolazi do njihove potpune oksidacije. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) se koristi za mjerenje stepena gašenja hemiluminiscencije q na platou ili maksimumu hemiluminiscentne krivulje:

gdje je I intenzitet hemiluminiscencije bez antioksidansa, a 11 je intenzitet CL u prisustvu antioksidansa. Ova metoda se koristi ako sistem sadrži pretežno slabe antioksidante sa niskim konstantama brzine interakcije sa radikalima - mnogo nižim u poređenju sa konstantom luminola.

Učinak antioksidansa karakteriziraju ne samo indikatori t i c. Kao što se vidi iz radova, dejstvo antioksidanata poput mokraćne kiseline u sistemu hemin-H2O2-luminol ili tokoferola, rutina i kvercetina u sistemu citokroma c-kardiolipin-H2O2-luminol karakteriše promena maksimalne brzine. povećanja CL (utx). Kao što pokazuju rezultati matematičkog modeliranja kinetike, vrijednosti konstanti brzine interakcije ovih antioksidansa s radikalima su blizu vrijednosti luminol konstante, pa se takvi antioksidansi mogu nazvati antioksidansima srednje jačine.

Ako je materijal koji se proučava, a posebno biljne sirovine, sadržavao samo jednu vrstu antioksidansa, onda bi se njihov sadržaj mogao okarakterizirati jednim od tri gore navedena pokazatelja (t, c ili V). Ali biljni materijali sadrže mješavinu antioksidansa različite jačine. Da bi riješili ovaj problem, neki autori su koristili promjenu svjetlosne sume kemiluminiscencije tokom određenog vremena DE, izračunatu po formuli

DE = DE0 - DE,

gdje su DE0 i DE5 sumi svjetlosti CL za dato vrijeme? u kontrolnim i ispitnim uzorcima. Vrijeme mora biti dovoljno za oksidaciju svih antioksidanata u sistemu, odnosno da CL kriva ispitnog uzorka dostigne nivo CL krive kontrolnog uzorka. Ovo poslednje pretpostavlja da istraživači moraju ne samo da snime svetlosnu sumu sjaja, već i da snime CL kinetičku krivu dovoljno dugo, što se ne radi uvek.

Budući da svi mjereni parametri zavise od uređaja i uslova mjerenja, antioksidativni učinak supstance u ispitivanom sistemu obično se upoređuje sa učinkom standardnog antioksidansa, na primjer Troloxa.

Sistem peroksidaza ren-vodonik peroksid koristili su mnogi autori za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnog materijala. Za procjenu količine antioksidansa u uzorcima korišten je latentni period CL (TRAP metoda), a u radu je korištena površina ispod krivulje razvoja CL. Međutim, navedeni radovi ne daju jasno opravdanje

izbor jednog ili drugog parametra za procjenu OAU.

Svrha istraživanja bila je utvrditi kako odnos različitih tipova antioksidanata utiče na TOA, te modificirati metodu hemiluminiscencije na način da se može preciznije odrediti TOA u biljnom materijalu. Da bismo to učinili, postavili smo si nekoliko zadataka. Prvo, uporedite kinetiku CL proučavanih objekata sa kinetikom standardnih antioksidanata tri tipa (jaki, srednji i slabi) kako biste shvatili koji tip antioksidansa daje glavni doprinos OAU ispitivanih objekata. Drugo, izračunajte OAE objekata koji se proučavaju mjerenjem smanjenja svjetlosne sume CL pod uticajem ovih objekata u poređenju sa efektom antioksidansa koji daje najveći doprinos OAE.

MATERIJALI I METODE

Predmet istraživanja bili su industrijski uzorci gloga, borovnice i šipka proizvođača JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), kao i plodovi maline koje su autori sakupili u Moskovskoj oblasti u prirodnim uslovima rasta i sušeni na temperaturi od 60-80°. C dok ne prestanu puštati sok i deformirati se kada se pritisnu.

Reagensi za analizu antioksidativnog kapaciteta hemiluminiscentnom metodom su: KH2PO4, 20 mM puferski rastvor (pH 7,4); peroksidaza iz korijena rena (aktivnost 112 jedinica/mg, M = 44.173,9), 1 mM vodeni rastvor; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, M = 177,11), 1 mM vodeni rastvor; vodonik peroksid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vodeni rastvor; rastvori antioksidansa (askorbinska kiselina, kvercetin, tokoferol). Sve reagense proizvodi Sigma Aldrich (SAD).

Uvarci od plodova gloga, rowan i šipka i infuzija plodova maline pripremljeni su prema metodama Državne farmakopeje SSSR-a, navedenim u općem farmakopejskom članku „Infuzije i dekocije“.

Određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta izvršeno je snimanjem hemiluminiscencije na hemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) korišćenjem softvera PowerGraph 3.3. Za određivanje OAE u biljnom materijalu potrebno je 40 μl luminola u koncentraciji od 1 mM, 40 μl peroksidaze hrena u koncentraciji 0,1 μM, od 10 do 50 μl dekokcije ili infuzije (ovisno o koncentraciji) i fosfatni pufer u potrebne količine stavljene su u kivetu uređaja kako bi se ukupna zapremina uzorka dovela do 1 ml. Kiveta je ugrađena u uređaj i CL je snimljen, posmatrajući pozadinski signal. Nakon 48 s snimanja pozadinskog signala, u kivetu je dodano 100 μl H2O2 u koncentraciji od 1 mM i CL snimanje je nastavljeno 10 min. Pripremljena su četiri uzorka s različitim koncentracijama svakog biljnog objekta. CL je također zabilježen za otopine askorbinske kiseline, kvercetina i tokoferola u pet različitih koncentracija za svaki od antioksidansa. Nakon toga, OAU uzoraka dekocija i infuzija preračunat je na kvercetin.

Koncentracije luminola, peroksidaze hrena i vodonik peroksida odabrane su tako da se u prihvatljivom vremenu (ne duže od 10 min) odredi antioksidativni kapacitet vodenih ekstrakata iz ljekovitog biljnog materijala. Za to vrijeme, krivulje hemiluminiscencije za antioksidanse askorbat i flavonoid kvercetin (glavni antioksidansi biljnog materijala)

dostigla plato, što ukazuje na potpuno uništenje antioksidanata u sistemu. Razblaženja proučavanih uzoraka i koncentracije rastvora standardnih antioksidanata (navedene u natpisima slika) odabrani su na način da su sve CL kinetičke krive merene pri istoj osetljivosti uređaja.

Antioksidativni kapacitet izračunat je iz promjene površine (AS) ispod kinetičke krivulje hemiluminiscencije (svjetlosne sume) nakon dodavanja tvari koja sadrži antioksidans. Da bismo to učinili, izračunali smo S0 za sistem bez antioksidansa i od njega oduzeli površinu SS, koja karakterizira sistem kojem je dodat antioksidans. Vrednost AS zavisi od osetljivosti hemiluminometra i uslova merenja. Odnos AS/C ■ V (gde je C koncentracija biološkog materijala koji se proučava u kiveti, g/l, a V zapremina kivete, l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g ispitivanog materijala, odnosno biljne sirovine.

Na sličan način izračunali smo antioksidativni kapacitet ASa otopine standardnog antioksidansa, na primjer, kvercetina, stavljenog u isti volumen reakcione smjese. Odnos AS/CÄ ■ V (gdje je CA težinska koncentracija antioksidansa u kiveti, g/l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g antioksidansa.

Za svaki od standardnih antioksidansa zabilježen je signal iz otopina nekoliko koncentracija kako bi se osiguralo da su proračuni u linearnom odnosu i da su dobijeni rezultati ponovljivi. Zaista, dobijena je linearna zavisnost (ASa = kA ■ CA) signala o koncentraciji, iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent kA. Prema Fišerovom kriterijumu, dobijene vrednosti kA za standardne antioksidante su statistički značajne sa verovatnoćom od 0,975. Zatim je zabilježen signal iz četiri koncentracije za svaki od četiri uzorka biljaka, a za sve uzorke je dobivena linearna ovisnost signala o koncentraciji (AS = k ■ C), iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent k. Sa vjerovatnoćom od 0,975 (Fisherov test), k vrijednosti dobijene za uzorke biljaka su statistički značajne. Ukupni antioksidativni kapacitet biljnog materijala u odnosu na masu standardnog antioksidansa (mg%) utvrđen je pomoću formule

OAE = k ■ 105. k

Vrijednosti su predstavljene kao aritmetička sredina ± standardna devijacija (M ± 5) na p<0,05.

REZULTATI ISTRAŽIVANJA

Istraživanje kinetike hemiluminiscencije u prisustvu natrijum askorbata (slika 1) pokazalo je da ovaj antioksidans karakteriše latentni period kada je CL skoro potpuno potisnut. Njegovo trajanje je proporcionalno količini antioksidansa u sistemu. U ovom slučaju se ne mijenja ni nagib krivulje CL niti intenzitet CL na platou. To se objašnjava činjenicom da je askorbinska kiselina jak antioksidans koji presreće sve radikale nastale u sistemu, uključujući i luminol radikale, a CL se ne razvija dok se sav askorbat ne oksidira.

Efekat tokoferola (slika 2) manifestovao se smanjenjem intenziteta CL na platou, što je tipično za slabe antioksidante, iako se tokoferol smatra jednim od

moćni antioksidansi. Možda je ovo neslaganje posljedica činjenice da su u našem eksperimentu slobodni radikali bili u vodenoj otopini, dok se djelovanje tokoferola obično proučava u nepolarnim medijima. U studiji u kojoj je izvor radikala bio kompleks citokroma c sa kardiolipinom, a reakcija sa luminolom se odvijala unutar ovog kompleksa, tokoferol je imao svojstva antioksidansa srednje jakosti.

Proučavajući uticaj različitih koncentracija kvercetina na naš sistem (slika 3) i upoređujući kinetičke krivulje za njega i natrijum askorbat i tokoferol, može se primetiti da se glavni efekat kvercetina manifestuje u promeni nagiba kvercetina. krivulje, odnosno brzinu razvoja CL, što je tipično za antioksidante srednje jačine.

CL krive za sve proučavane dekokcije (slika 4) liče na krivulje za kvercetin uz blagi pad intenziteta CL na kraju, tj.

Vrijeme, min

Rice. 1. Utjecaj natrijum askorbata na kinetiku hemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 µM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 µM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM natrijum askorbat.

plato. Kao što je prikazano u radu, ovakvo ponašanje je tipično za antioksidante srednje jačine, koji u našem slučaju uključuju polifenole – flavonoide i tanine. Za infuziju plodova maline (Sl. 4, D) primetno je smanjenje hemiluminiscencije na nivou platoa, što je tipično za slabe antioksidante, kao što je u ovom slučaju tokoferol. Što se tiče kvercetina i tokoferola, infuzija maline sadrži 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetina i 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferola.

Upoređivanjem krivulja hemiluminiscencije dobijenih za različite koncentracije četiri proučavana vodena ekstrakta iz biljnog materijala, pokazalo se da se doprinos srednjih i slabih antioksidanata ukupnom antioksidativnom kapacitetu uzoraka smanjuje u sljedećim serijama: infuzija ploda maline (slika 4.). , D), odvar od šipka (sl. 4, B), odvar od plodova aromana (sl. 4, A), odvar od plodova gloga (sl. 4, B). Vrijednosti AS na osnovu koncentracije C ispitivane tvari u kiveti i vrijednosti ukupnog antioksidativnog kapaciteta u smislu kvercetina date su u tabeli.

DISKUSIJA O REZULTATIMA

Podaci dobiveni tijekom eksperimenata i na osnovu njih izračunate vrijednosti OAE proučavanih objekata upoređene su sa sadržajem glavnih antioksidansa u njima, utvrđenim hemijskim metodama analize. Unatoč činjenici da je pozitivna korelacija između ukupne količine antioksidansa i TAU-a u različitim objektima neosporna, ipak postoje primjetne razlike između ovih pokazatelja. Na primjer, ako uzmemo zbir sadržaja flavonoida, tanina i askorbinske kiseline, onda se ispostavi da je veći od izračunatog TAU-a za sve proučavane objekte, osim za izvarak plodova gloga (tablica).

Drugi istraživači su također pokazali da se rezultati kemijske analize i TAU vrijednost određena hemiluminiscentnom metodom često ne poklapaju. U radu se utvrđuje ukupni antioksidativni kapacitet

46 Vrijeme, min

Ja" "h chi----.

Rice. 2. Utjecaj tokoferola na kinetiku hemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 µM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 µM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,01 µM; 3 - 0,025 µM; 4 - 0,06 µM; 5 - 0,1 µM; 6 - 0,2 µM tokoferol.

46 Vrijeme, min

Rice. 3. Uticaj kvercetina na kinetiku hemiluminiscencije Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 µM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 µM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,02 µM; 3 - 0,03 µM; 4 - 0,04 µM; 5 - 0,05 µM; 6 - 0,06 µM kvercetin.

Vrijeme, min

46 Vrijeme, min

46 Vrijeme, min

120 I 100 80\60 40 20

46 Vrijeme, min

Rice. 4. Utjecaj dekocija plodova vrane (A), gloga (B), šipka (C) i infuzije plodova maline (D) na kinetiku hemiluminiscencije Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 µM, peroksidaza rena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. (A) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l odvar od plodova orena. (B) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l odvar od plodova gloga. (B) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l odvar od šipka. (D) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infuzije plodova maline.

u sistemu peroksidaza-luminol-vodonik peroksid u korelaciji sa sadržajem jedinjenja triterpena. Međutim, u radu istih autora, u kojem je predmet proučavanja bila druga biljka, nisu uočili korelaciju OAE sa sadržajem bilo koje grupe supstanci, uključujući flavonoide.

Ovakva odstupanja su povezana sa najmanje tri faktora. Najprije je važna aktivnost antioksidansa, odnosno brzina njihove interakcije s radikalima, koja je različita za različite antioksidanse uključene u biljni uzorak. Prema Izmailovu, konstante brzine odgovarajućih reakcija za meksidol, tokoferol i kvercetin koreliraju kao 0,04:2:60. Drugo, svaki molekul antioksidansa, ulazeći u hemijsku reakciju, može presresti različit broj radikala. Prema radu, kvercetin, mokraćna i askorbinska kiselina su presrele 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 i 0,5 ± 0,2 radikala po reagovanom molekulu antioksidansa, respektivno (korišćen je sistem hemin-H2O2-luminol). Treće, na rezultate istraživanja moglo bi uticati prisustvo aktivnosti peroksidaze u samim biljnim uzorcima, kao iu radu, kao i prisustvo kalcijuma u uzorcima, koji, kako je prikazano u radu, može povećati aktivnost peroksidaze hrena pod određenim uslovima. To obično vodi do više

veći intenzitet CL na platou nego na kontrolnim krivuljama, što mi, međutim, nismo uočili.

Prvi faktor oštro ograničava upotrebu parametra kao što je promjena svjetlosne sume, budući da vrijeme za mjerenje hemiluminiscencije mora biti duže od vremena za potrošnju svih antioksidansa u ispitivanom uzorku. O nastanku ovog trenutka može se suditi samo mjerenjem kinetike hemiluminiscencije. Osim toga, doprinos slabih antioksidanata OAU je oštro potcijenjen, jer je vrijeme njihove potpune oksidacije višestruko duže od prihvatljivog trajanja mjerenja (10-20 min).

Stehiometrijski koeficijent antioksidansa je još važniji. Broj radikala n koje je presjekao jednak je

gdje je p stehiometrijski koeficijent, a Am promjena koncentracije antioksidansa tokom vremena mjerenja, u našem slučaju početna koncentracija ispitivane tvari u uzorku za ispitivanje.

Razlika u sumi svjetlosti luminescencije u odsustvu antioksidansa iu njegovom prisustvu je proporcionalna n. Ukupan broj presretnutih radikala jednak je n = Y.p. m,

gdje je stehiometrijski koeficijent određenog antioksidansa, a m njegova koncentracija tokom mjerenja

Predmet istraživanja Flavonoidi, mg%* Tanini, mg%* Askorbinska kiselina, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. jedinice TAU, mg% kvercetina

Uvarak od plodova orena 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Uvarak od šipka 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Uvarak plodova gloga 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infuzija suhih plodova maline 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Napomena: * - podaci iz literature, . AS - promjena svjetlosne sume za uzorak, rel. jedinica, C - koncentracija uzorka u kiveti, g/l. Izračunate vrijednosti su pouzdane na str<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhenia. Ukupan broj presretnutih radikala svakako nije jednak ukupnoj količini antioksidansa, jer pt koeficijenti ne samo da nisu jednaki jedinici, već se i značajno razlikuju za različite antioksidanse.

Vrijednost n proporcionalna je razlici svjetlosnih suma izmjerenih tokom određenog vremena između uzorka koji sadrži antioksidans i kontrolnog uzorka koji ne sadrži antioksidanse:

gdje je k koeficijent koji je konstantan pod istim uslovima mjerenja.

Metoda o kojoj se govori u članku omogućava nam da odredimo ukupni antioksidativni kapacitet, dok nam hemijska analiza omogućava određivanje ukupnog sadržaja antioksidansa u proizvodu. Stoga se čini da je metoda hemiluminiscencije informativnija od kemijskih analiza.

Odabrali smo uslove za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih sirovina snimanjem kinetike hemiluminiscencije u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola (koncentracije komponenti - 4 nM, 100 µM i 40 µM, respektivno; 20 mM phosphate pufer, pH 7,4),

osigurala je oksidaciju jakih antioksidansa (askorbinska kiselina) i antioksidansa srednje jačine (kvercetin) za 10 minuta. Ovo trajanje mjerenja je zgodno i osigurava potreban kvalitet mjerenja.

Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da su u proučavanim objektima (dekocije plodova arabine, šipka, gloga i infuzije plodova maline) glavni antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabe jačine (tokoferol i dr.). Na osnovu smanjenja hemiluminiscencije svjetlosne sume izračunat je ukupni antioksidativni kapacitet za proučavane objekte. Poređenje dobijenih TAU vrednosti sa rezultatima hemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa u različitim omjerima mogu razlikovati po svojoj sposobnosti da efikasno zaštite organizam od štetnog dejstva slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih antioksidansa. Istovremeno ga karakterizira jednostavnost i niska cijena istraživanja. Kombinacija mjerenja kinetike hemiluminiscencije sa matematičkim modeliranjem reakcija neće samo automatizirati proces određivanja TAU-a, već će odrediti i doprinos pojedinih grupa antioksidanata indikatoru.

Književnost

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Slobodni radikali kao učesnici u regulatornim i patološkim procesima. U: Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., urednici. Osnovne nauke - medicina. Biophys. med. technol. M.: MAX Press; 2015. tom 1. str. 38-71.

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Metode za proučavanje antioksidansa. Chem. rast. sirovine. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimov A. V. Antioksidativna aktivnost halkona. Hemiluminiscentno određivanje reaktivnosti i kvantno-hemijski proračun energije i strukture reagenasa i intermedijara. Kinetika i kataliza. 2010; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasilev RF, Veprintsev TL. Peroksi-

radikalno posredovana hemiluminiscencija: mehanička raznolikost i osnove za antioksidativni test. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalnog kapaciteta hemiluminiscencijom luminola izazvanom H2O2-heminom. J Agric Food Chem. 2003. 3. decembar; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Slobodni radikali i ćelijska hemiluminiscencija. Uspekhi biol. chem. 2009; 49: 341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinetička hemiluminiscencija kao metoda za proučavanje reakcija slobodnih radikala. Biofizika. 2011; 56 (6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Određivanje antioksidativne aktivnosti mjerenjem kinetike hemiluminiscencije. Fotobiologija i fotomedicina. 2011; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescencija izazvana 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolizom. Besplatno

Radić Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O upotrebi gašenja luminolne luminiscencije za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. 1994 Jun; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Procjena ukupnog antioksidativnog potencijala (TRAP) i ukupne antioksidativne reaktivnosti iz mjerenja hemiluminiscencije pojačane luminolom. Free Radic Biol Med. 1995 Feb; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraživanje mehanizma luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog toka. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

21. Aleksejev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Određivanje antioksidanata aktiviranom hemiluminiscencijom upotrebom 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012;53(3): 187-93.

24. Ministarstvo zdravlja SSSR Državna farmakopeja SSSR XI izd. Vol. 2 “Opšte metode analize. Ljekovite biljne sirovine." M.: Medicina; 1987. str. 147-8.

25. Sergunova E.V., Sorokina A.A., Kornyushina M.A. Studija preparata za ekstrakciju šipka. Pharmacy. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Proučavanje plodova gloga korištenjem različitih metoda konzerviranja i vodene ekstrakcije. Pharmacy. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Biološki aktivne supstance plodova i vodenih ekstrakata obične maline. Pharmacy. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Proučavanje biološki aktivnih supstanci plodova gloga - sirovine za pripremu homeopatskih matričnih tinktura. On Sat. naučnim tr. na osnovu materijala iz XXIV Moskve. međunarodni homeopata. konf. “Razvoj homeopatske metode u savremenoj medicini”; 24-25 januara 2014; Moskva. M.; 2014. str. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Proučavanje sastava biološki aktivnih supstanci u ljekovitim biljnim sirovinama različitih metoda konzerviranja. On Sat. teze zasnovane na materijalima iz XX Ross. nacionalni kongr. "Čovjek i medicina"; 15-19. aprila 2013.; Moskva. M.: EKOOnis; 2013. str. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Proučavanje aktivnosti peroksidaze u ekstraktima rizoma i korijena rena i njegove stabilnosti na različite utjecaje. Vestn. Moskovski državni univerzitet. Ser. 2. Chem. 2006; 47 (5): 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. U: Grigor"ev AI, Vladimirov YuA, urednici. Fundamental"nye nauki - medicina. Biofizicheskie meditsinskie tehnologii. Moskva: MAKS Press; 2015.v. 1. str. 38-71. ruski.

2. Chanda S, Dave R. In vitro modeli za procjenu antioksidativne aktivnosti i neke ljekovite biljke koje posjeduju antioksidativna svojstva: pregled. Afr J Microbiol Res. 2009 Dec; 3 (13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal'tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel'nogo Syr'ja. 2004; (3): 63-75. Russian.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reakcione sposobnosti i kvantovsko-himičeskij raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinetika i kataliza. 2010; 51 (4): 533-41. ruski.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioksidativni potencijal spojeva povezanih s kurkuminom proučavan kinetikom hemiluminiscencije, efikasnošću prekida lanca, aktivnošću čišćenja (ORAC) i DFT proračunima. Beilstein J Org Chem. 2015 Aug 11; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasilev RF, Veprintsev TL. Peroksi-radikalno posredovana hemiluminiscencija: mehanička raznolikost i osnove za antioksidativni test. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasilev RF. Lagani hemiluminiscencijski test za antioksidativna svojstva biljnih lipida: osnove i ilustrativni primjeri. Analyst. Oct 2009; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalnog kapaciteta pomoću luminola izazvanog H2O2-heminom

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49: 341-88. ruski.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestentsiya kak metod izučeniâ reakcii svobodnykh radikalov. Biofizika. 2011; 56 (6): 1081-90. ruski.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologiya i fotomeditsina. 2011; 7 (2): 70-6. ruski.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescencija izazvana 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolizom. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O upotrebi gašenja luminolne luminiscencije za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. 1994 Jun; 16 (6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Vidljiva hemiluminiscencija povezana s reakcijom između methemoglobina ili oksihemoglobina sa vodonik peroksidom. Photochem Photobiol. 1994 Nov; 60 (5): 405-11.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Procjena ukupnog antioksidativnog potencijala (TRAP) i ukupne antioksidativne reaktivnosti iz mjerenja hemiluminiscencije pojačane luminolom. Free Radic Biol Med. 1995 Feb; 18 (2): 153-8.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro procjena antioksidativne aktivnosti lipozomalnih flavonola pomoću HRP-H2O2-luminol sistema. J Microencapsul. 2011; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraga mehanizma

luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog protoka. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fitokemijske karakteristike, aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala i neuroprotekcija pet ekstrakata ljekovitih biljaka. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. avgust.

19. Chang CL, Lin CS. Fitokemijski sastav, antioksidativna aktivnost i neuroprotektivni učinak ekstrakta Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5. jul.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Procjena antioksidativne aktivnosti različitih flavonoida metodom hemiluminiscencije. AAPS PharmSci. 2003; 5 (2): 111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktiviranoj hemilyuminestsentsii s ispol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Hemijski bilten Moskovskog univerziteta. 2012; 53 (3): 187-93. ruski.

22. Pogačnik L, Ulrih NP. Primena optimizovanog testa hemiluminiscencije za određivanje antioksidativnog kapaciteta biljnih ekstrakata. Luminescencija. 2012. novembar-dec; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Ukupni antioksidansi niske molekularne težine kao zbirni parametar, kvantificirani u biološkim uzorcima testom inhibicije hemiluminiscencije. Nat Protoc. 2010 Sep; 5 (10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11th ed. br. 2. "Obshchie metody analysis."

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Moskva: Medltsina; 1987. str. 147-8. Russian.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Pharmacy. 2012; (2): 14-6. ruski.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsiya. 2010; (5): 16-8. ruski.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsiya. 2014; (1): 8-10. ruski.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Zbornik radova 14. Moskovske međunarodne homeopatske konferencije "Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi meditine1.2.2.2014.14.2014"; 146- 7. ruski.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izučenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konzervatsii. Zbornik radova 20. ruskog nacionalnog kongresa "Čelovek i lekarstvo"; 2013. april 1519; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. str. 184-90. ruski.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izučenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktah iz kornevišcha i kornei khrena i ee stabilnosti k različitim vozdejstvima. Chemistry Bulletin Moskovskog univerziteta. 2006; 47 (5): 350-2. Russian.

1 Bolshakova L.S. 1Milentyev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Federalna državna budžetska ustanova „Centar za hemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju „Orlovsky”

3 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državni univerzitet - obrazovno-istraživački i proizvodni kompleks"

Istražena je mogućnost primjene hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti nutrijenata. Predložena metoda se zasniva na hemiluminiscenciji luminola u alkalnoj sredini, čiji intenzitet zavisi od količine peroksida u hemiluminiscentnom uzorku. Hemiluminiscencija je snimljena pomoću razvijene instalacije koja sadrži dozirnu pumpu, svjetlo-nepropusnu komoru, stakleni vakuum fotomultiplikator i kompjuterski sistem. Da bi se pojačala hemiluminiscencija, u luminol je dodan rastvor kalijum-gvozdenog sulfida. Promjene u intenzitetu hemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po visokoj antioksidativnoj aktivnosti. Utvrđeno je da se metoda hemiluminiscencije može koristiti za određivanje antioksidativnih svojstava različitih jedinjenja hrane.

Istražena je mogućnost primjene hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti nutrijenata. Predložena metoda se zasniva na hemiluminiscenciji luminola u alkalnoj sredini, čiji intenzitet zavisi od količine peroksida u hemiluminiscentnom uzorku. Hemiluminiscencija je snimljena pomoću razvijene instalacije koja sadrži dozirnu pumpu, svjetlo-nepropusnu komoru, stakleni vakuum fotomultiplikator i kompjuterski sistem. Da bi se pojačala hemiluminiscencija, u luminol je dodan rastvor kalijum-gvozdenog sulfida. Promjene u intenzitetu hemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po visokoj antioksidativnoj aktivnosti. Utvrđeno je da se metoda hemiluminiscencije može koristiti za određivanje antioksidativnih svojstava različitih jedinjenja hrane.

Bibliografska veza

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentyev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UPOTREBA KEMILUMINESCENCIJE ZA PROCJENU ANTIOKSIDANTNIH SVOJSTVA HRANE SUPSTANCI // Racionalna prehrana, aditivi u hrani i biostimulansi. – 2014. – br. 6. – str. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (datum pristupa: 17.12.2019.). Predstavljamo Vam časopise koje izdaje izdavačka kuća "Akademija prirodnih nauka"

diplomski rad

1.4 Metode istraživanja antioksidansa

antioksidativna aktivnost se klasificira: prema metodama snimanja ispoljene AOA (volumetrijska, fotometrijska, hemiluminiscentna, fluorescentna, elektrohemijska); prema vrsti izvora oksidacije; prema vrsti spoja koji se oksidira; metodom mjerenja oksidiranog spoja.

Međutim, najpoznatije metode za određivanje antioksidativne aktivnosti su:

1 TEAC (trolox ekvivalentni antioksidativni kapacitet): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Metmioglobin + H 2 O 2 > Ferrylglobin + ABTS > ABTS * + AO.

Metoda Trolox ekvivalenata (TEAC) zasniva se na sposobnosti antioksidansa da redukuju katione 2,2-azinobis radikala (ABTS) i na taj način inhibiraju apsorpciju u dugovalnom području spektra (600 nm). Značajan nedostatak metode je reakcija u dva koraka za proizvodnju radikala. Ovo produžava vrijeme analize i može povećati rasipanje rezultata, uprkos činjenici da se za analizu koristi standardizirani set reagensa.

2 FRAP (antioksidativna moć redukcije željeza): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Fe(III)-Tripiriditriazin+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazin.

Kapacitet smanjenja gvožđa/antioksidativni kapacitet (FRAP). Reakcija koja se ovdje koristi je redukcija Fe(III)-tripiridiltriazina u Fe(II)-tripiridiltriazin. Međutim, ova metoda ne može odrediti određivanje nekih antioksidansa, kao što je glutation. Ova metoda omogućava direktno određivanje antioksidansa niske molekularne težine. Pri niskom pH, redukcija Fe(III)-tripiridiltriazin kompleksa u Fe(II) kompleks je praćena pojavom intenzivne plave boje. Mjerenja se zasnivaju na sposobnosti antioksidansa da potisnu oksidativni učinak reakcionih vrsta nastalih u reakcijskoj smjesi. Ova metoda je jednostavna, brza i jeftina za implementaciju.

3 ORAC (kapacitet apsorpcije radikala kisika): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Određivanje kapaciteta apsorpcije radikala kisika (ORAC). U ovoj metodi se bilježi fluorescencija supstrata (fikoeritrin ili fluorescein), koja nastaje kao rezultat njegove interakcije sa ROS. Ako test uzorak sadrži antioksidanse, tada se opaža smanjenje fluorescencije u odnosu na kontrolni uzorak. Ovu metodu je prvobitno razvio dr. Guohua Kao iz Nacionalnog instituta za starenje 1992. Godine 1996. dr Kao se udružio sa dr. Ronaldom Pryerom u zajedničkoj grupi u USDA Istraživačkom centru za starenje, gdje je poluautomatska metoda bila kreiran.

4 TRAP (ukupni parametar antioksidansa za hvatanje radikala): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Ova metoda koristi prednost sposobnosti antioksidansa da interaguju sa peroksil radikalom 2,2-azobis(2-amidinopropan) dihidrokloridom (AAPH). TRAP modifikacije se sastoje od metoda za snimanje analitičkog signala. Najčešće, u završnoj fazi analize, peroksi radikal AAPH stupa u interakciju sa luminiscentnim (luminol), fluorescentnim (dihlorofluorescein diacetat, DCFH-DA) ili drugim optički aktivnim supstratom.

Derivat vitamina E rastvorljiv u vodi Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksi kiselina) koristi se kao standard za TEAC, ORAC i TRAP metode.

Nedavno se povećao interes za korištenje elektrohemijskih metoda za procjenu antioksidativne aktivnosti. Ove metode imaju visoku osjetljivost i brzu analizu.

Procjena antioksidativne aktivnosti nekih prehrambenih proizvoda vrši se potenciometrijskom metodom, koja se temelji na korištenju svojstva antioksidativnih supstanci da učestvuju u redoks reakcijama zbog enol (-OH) i sulfhidril (-SH) grupa.

Određivanje antioksidativnih svojstava rastvora zasniva se na hemijskoj interakciji antioksidansa sa posredničkim sistemom, što dovodi do promene njegovog redoks potencijala. Elektrohemijska ćelija je kontejner koji sadrži rastvor K-Na-fosfatnog pufera, sistem medijatora Fe(III)/Fe(II) i složenu elektrodu pre merenja redoks potencijala. Antioksidativna aktivnost se procjenjuje u g-eq/l.

Amperometrijska metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti zasniva se na mjerenju električne struje koja nastaje prilikom oksidacije ispitivane supstance na površini radne elektrode koja je pod određenim potencijalom. Osjetljivost amperometrijske metode određena je i prirodom radne elektrode i potencijalom koji se na nju primjenjuje. Granica detekcije amperometrijskog detektora polifenola i flavonoida je na nivou nano-pikograma, pri tako niskim koncentracijama manja je vjerovatnoća međusobnog utjecaja različitih antioksidanata kada su prisutni zajedno, a posebno manifestacija fenomena sinergije. . Nedostaci metode uključuju njenu specifičnost: u ovim uvjetima antioksidansi koji su sami oksidirani ili reducirani u području potencijala elektroredukcije kisika ne mogu se analizirati. Prednosti metode uključuju njenu brzinu, prostatu i osjetljivost.

Metoda galvanostatske kulometrije korištenjem električno generiranih oksidanata - metoda je primjenjiva za analizu antioksidanata topljivih u mastima.

Razvijene su različite metode za određivanje askorbinske kiseline:

amperometrijska metoda pomoću aluminijske elektrode modificirane filmom nikal (II) heksacijanoferata jednostavnim uranjanjem u otopinu;

metodu za spektrofotometrijsko i vizuelno određivanje askorbinske kiseline u čvrstoj fazi pomoću kserogela silicijumske kiseline modifikovanog Wawele reagensom i bakrom (II) kao indikatorskim prahom;

hemiluminiscentno određivanje askorbinske kiseline može se provesti metodom protočne injekcije koristeći hemiluminiscentnu reakciju rodamina B sa cerijumom (IV) u mediju sumporne kiseline.

određivanje askorbinske kiseline u rasponu od 10 -8 -10 -3 g/cm 3 anodnom voltametrijom u vodenim i vodeno-organskim medijima.

Najčešća je FRAP metoda, jer je brza i vrlo osjetljiva. U proteklih nekoliko decenija razvijen je veliki broj varijeteta metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti FRAP metodom (tabela 1).

Tabela 1 Razvoj FRAP metode i njena primjena za određivanje antioksidativne aktivnosti različitih objekata

				Objekti analize	Bilješke
				Krvna plazma	t=4min. Proučavana je stehiometrija reakcije i aditivnost.
				Čaj, vino	Određivanje AOA zbog polifenola
					Uspoređene su vrijednosti AOA različitih sorti čaja
Pulido, Bravo, Saura-Calixto				Modelska rješenja	t=30min. Otkriven je uticaj nevodenog rastvarača
				Biljke
				Krv, tkivo	PIA metoda. Ispitan je uticaj stranih materija.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.				Modelska rješenja	Proučavana je osjetljivost određivanja različitih AO u funkciji njihove strukture i redoks potencijala.
Katalinić, Miloš,				Razna vina
Temerdašev, Tsyupko i drugi.				Model mješavine
Loginova, Konovalova				Lijekovi Lijekovi	Metoda ispitivanja
Temerdašev, Tsyupko i drugi.				Suva crvena vina	Korelacija AOA sa ostalim pokazateljima kvaliteta vina
Nastavak tabele 1
				Model mješavine	Proučavana je osjetljivost određivanja različitih AO
Veršinjin, Vlasova, Tsyupko				Model mješavine	Utvrđeno je da signal nije aditivan kada je nedostajalo oksidacijsko sredstvo
Anisimovich, Deineka i drugi.				Modelska rješenja	Predloženi su kinetički parametri za procjenu AOA.

Napomene: Konvencionalno označeno: FIA-protočna injekcijska analiza, TPTZ-tripiridiltriazin, DIP-2,2,-dipiridil, PHEN-o-fenantrolin, DPA-piridindikarboksilna kiselina, FZ-ferozin, AA-askorbinska kiselina, CT-katehol, t - vrijeme ekspozicije, min.

Interakcija između proteina i polielektrolita u vodenim otopinama

Za karakterizaciju proteinsko-polielektrolitnih kompleksa koriste se različite analitičke metode. Instrumentalne metode daju informacije o strukturnim i optičkim svojstvima, a takođe određuju dinamiku i prirodu PEC vezivanja...

Utjecaj spojeva d-metala na brzinu disocijacije molekula vode u bipolarnoj membrani

U procesu sinteze novih BPM-a veliku pažnju treba posvetiti proučavanju svojstava dobijenih uzoraka za naknadni odabir uslova sinteze koji obezbeđuju poboljšanje elektrohemijskih karakteristika sintetizovanih membrana...

Dizajnerske droge i sintetički kanabinoidi

Detekcija sintetičkih kanabinoida u biljnim mješavinama može se provesti različitim fizičko-hemijskim metodama, kao što su hromatografija-masena spektrometrija, plinska hromatografija, tankoslojna hromatografija i tečna hromatografija visokih performansi...

Razvoj metode za određivanje flavonoida u ljekovitom biljnom materijalu

Sinteza i farmakološka svojstva kinolinona-2

Predmet istraživanja: Kinolinon-2. Metoda istraživanja: Pomoću kompjuterskog programa “Marvin JS” kreirana je struktura supstance. Zatim je poslata na sajt “http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php” radi daljeg istraživanja...

Termička spektralna metoda za proučavanje proizvoda isparavanja epoksi polimera

Tehnologija za proizvodnju visoko prečišćenog hitozana iz ljuske rakova

Određivanje molekulske mase hitozana Molekularna težina hitozana određena je viskozometrijski koristeći standardnu ​​metodu. Rastvori koncentracije 0,05 i 0,5 g/dL pripremljeni su otapanjem uzorka polimernog praha u acetatnom puferu (0...

Fiziografske karakteristike teritorije parka prirode

1 Milentyev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Federalna državna budžetska ustanova „Centar za hemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju „Orlovsky”

3 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državni univerzitet - obrazovno-istraživački i proizvodni kompleks"

Istražena je mogućnost primjene hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti nutrijenata. Predložena metoda se zasniva na hemiluminiscenciji luminola u alkalnoj sredini, čiji intenzitet zavisi od količine peroksida u hemiluminiscentnom uzorku. Hemiluminiscencija je snimljena pomoću razvijene instalacije koja sadrži dozirnu pumpu, svjetlo-nepropusnu komoru, stakleni vakuum fotomultiplikator i kompjuterski sistem. Da bi se pojačala hemiluminiscencija, u luminol je dodan rastvor kalijum-gvozdenog sulfida. Promjene u intenzitetu hemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po visokoj antioksidativnoj aktivnosti. Utvrđeno je da se metoda hemiluminiscencije može koristiti za određivanje antioksidativnih svojstava različitih jedinjenja hrane.

hemiluminiscencija

antioksidativno djelovanje

peroksidi

hranljive materije

1. Vasiliev R.F. Kemijski sjaj // Kemija i kemičari, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (datum pristupa: 22.08.13.).

2. Vladimirov Yu.A. Slobodni radikali i antioksidansi // Vestn. RAMS. – 1998. – br. 7. – Str. 43–51.

3. Kondrashova E.A. Hemiluminiscencija kao najosjetljivija metoda enzimskog imunoeseja i njena primjena // Klinička laboratorijska dijagnostika. – 1999. – br. 9. – str. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Kemiluminiscentna analiza // Imunologija. – 1991. – br. 1. – Str. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktivna hemiluminiscencija u sistemu fagocitoze // Mikrobiologija. – 1987. – br. 1. – Str. 109–115.

6. Sherstnev M.P. Putevi ovisni o kalciju i neovisni o kalciju za stvaranje ćelijske kemiluminescencije // Pitanja kemiluminescencije. – 1991. – br. 2. – Str. 1–4.

Danas hemiluminiscencija predstavlja veliko područje nauke koje se nalazi na razmeđi između hemije, fizike i biologije. Kod hemiluminiscencije dolazi do direktne konverzije hemijske energije u energiju elektromagnetnih vibracija, tj. u svijet Pomoću hemiluminiscencije možete saznati kako se reakcija odvija, koji je njen mehanizam, šta je potrebno za efektivno i efikasno sprovođenje tehnoloških procesa. Ako je tehnološki proces proizvodnje hemijskog proizvoda praćen hemiluminiscencijom, tada njen intenzitet može poslužiti kao mjera brzine procesa: što je reakcija brža, to je sjaj sjajniji. Tokom reakcije hemiluminiscencije dobijaju se energetski bogati produkti koji zatim oslobađaju energiju emitovanjem svetlosti, odnosno hemijska energija se pretvara u energiju elektromagnetnog zračenja.

Svrha studije je istražiti mogućnost korištenja hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti nutrijenata.

Rezultati istraživanja i diskusija

Problem procjene antioksidativne aktivnosti nutrijenata je vrlo relevantan. Upotreba termina "antioksidativna aktivnost" da bi se pokazala korisnost određenog proizvoda često se koristi bez ikakve hemijske ili biohemijske argumentacije. U pravilu, antioksidativna aktivnost bilo koje tvari znači djelotvornost smanjenja peroksidne vrijednosti. Sam koncept peroksidne vrijednosti također ne otkriva u potpunosti njegovu kemijsku suštinu, jer ne odgovara u potpunosti kinetici i termodinamici faza metabolizma određenog prehrambenog proizvoda. Osim toga, ova vrijednost se koristi za karakterizaciju lipida u obliku masti. Međutim, procesi oksidacije i stvaranja peroksida u organizmu se javljaju ne samo pri konzumiranju masti, već i drugih namirnica. Drugim riječima, može se reći da je sadržaj peroksida u određenom proizvodu „izmjeren“ na nekoj vrsti vage, gdje je „referentna težina“ jedinica koncentracije u kiseloj sredini jodidnog jona oksidiranog peroksidima, kao rezultat čega nastaje molekularni jod:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Kada se molekularni jod titrira otopinom koja sadrži natrijev tiosulfat, utvrđuje se njegova koncentracija i stoga se određuje količina oksidirajućih jodidnih jona, tj. peroksidnih spojeva, koji se zapravo nazivaju peroksidni broj. Određivanje peroksidnog broja korištenjem ove vrste "vaganja" temelji se na reakciji prikazanoj na Sl. 1.

Rice. 1. Određivanje peroksidne vrijednosti pomoću natrijum tiosulfata

Dakle, koncentracija peroksida se određuje iz jednačine

S(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

gdje je ϒ koeficijent korelacije između koncentracije molekularnog joda i koncentracije peroksida.

Naš predloženi metod za određivanje peroksida u proizvodima zasniva se na kemiluminiscenciji luminola (C[lm]) u alkalnom mediju, čiji intenzitet (Ichl) zavisi od koncentracije peroksida (C[-O-O-]) u hemiluminiscentnom mediju uzorak:

IHL = Ϧhl ω, (4)

gdje je Ϧhl kvantni prinos hemiluminiscencije; ω - brzina reakcije koja uključuje perokside:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

gdje je khl konstanta brzine reakcije ili na:

C[lm] khl Ϧkhl = K, (6)

IHL = K C[ -O-O-]. (7).

Količina peroksida (-O-O-) određena je svjetlosnom sumom (S):

Vrijednost S ovisi o stupnju potpunog utroška peroksida u hemiluminiscentnoj reakciji.

Da bi se odredila konstanta K, konstruiše se kalibraciona kriva za zavisnost svetlosne sume S o koncentraciji peroksida, koja se utvrđuje titracijom:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Vodikov peroksid H2O2 se koristi kao peroksid.

Podaci dobijeni iz jednačine (3) i (9) se zatim upoređuju. Na osnovu poređenja ϒ i K dolazi se do zaključka o podudarnosti reakcionih mehanizama koji su u osnovi određivanja peroksida ovim metodama. Otkriveno je da se u ovom rasponu koncentracija peroksida ϒ i K zapravo međusobno slažu i stoga se mogu koristiti za određivanje peroksidnog broja.

Hemiluminiscencija je uočena u alkalnoj sredini koja sadrži luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, 3-aminoftalična kiselina hidrazid, H2L). Snimljen je pomoću hemiluminiscentne postavke uključujući stakleni vakuum fotomultiplikator. Fotomultiplikator napaja visokonaponski ispravljač (7) spojen na blok (9) koji pojačava signal fotomultiplikatora, koji se snima na displeju monitora računara (5).

Rice. 2. Registracija hemiluminiscencije analiziranog proizvoda: 1 - dozirna pumpa; 2 - svjetlootporna komora; 3 - ogledalo; 4 - kiveta; 5 - kompjuterski sistem; 6 - fotomultiplikator; 7 - visokonaponski ispravljač; 8 - uređaj koji vam omogućava da odredite područje spektra hemiluminiscentnog zračenja; 9 - blok koji pojačava signal fotomultiplikatora

Dozirna pumpa (1) je neophodna za uvođenje analiziranog uzorka u kivetu (4) koja sadrži hemiluminiscentni rastvor luminola. Ovaj dozator služi kao mikser za ubrizgani uzorak sa hemiluminiscentnim rastvorom. Da bi se povećala brzina reakcije i intenzitet hemiluminiscencije, u luminol je dodan rastvor kalijum-gvozdenog sulfida. Miješanje se vrši pomoću zračnih mjehurića dobivenih pumpanjem zraka kroz tekućinu u otopini. Ogledalo (3), koje se nalazi u svetlo-nepropusnoj komori (2), služi za bolje sakupljanje svetlosti hemiluminiscentnog zračenja koje upada na fotokatodu fotomultiplikatora (6), postavljenu u svetlo-nepropusnu komoru. Dozator vam omogućava da unesete potrebne tečne komponente u kivetu bez otvaranja svetlo-nepropusne komore (2) tokom eksperimenata. U tom slučaju te tekućine ulaze u kivetu (4) kroz staklene ili plastične cijevi. Računarski sistem omogućava snimanje zavisnosti intenziteta sjaja I od vremena t, odnosno kinetike hemiluminiscencije:

Kompjuterski sistem odražava konstante rasta i pada u funkciji I = f(t), koje su povezane sa konstantama brzine reakcija koje izazivaju hemiluminiscenciju, odnosno sa njihovom kinetikom. U hemiluminiscentnu komoru je uključen uređaj (8) koji omogućava određivanje spektralnog područja hemiluminiscentnog zračenja, odnosno zavisnosti:

I = f1(λ). (jedanaest)

Ovaj blok je kaseta u obliku diska u koju su montirani granični filteri. Promena filtera se vrši rotacijom disk kasete u odnosu na horizontalnu os koja povezuje središta ravni filtera i ravni fotokatode fotomultiplikatora.

Proces mjerenja se izvodi na sljedeći način:

1. Utvrđena je reakcija fotomultiplikatora na promjene napona napajanja i na promjene intenziteta referentnog izvora svjetlosti koji pada na njegovu katodu.

2. Kiveta se napuni rastvorom luminola u alkalnom mediju.

3. Dozator se puni analiziranim uzorkom.

4. Snima se zavisnost intenziteta hemiluminiscencije od vremena t. Posmatranja hemiluminiscencije se vrše do vremena t1, u kojem je promjena I1 od vremena t minimalna: I1 = f1(t).

5. Dio analiziranog rastvora se isporučuje pomoću dozatora.

6. Uočena je hemiluminiscencija analiziranog uzorka čija je kinetika I = f(t).

Na sl. Na slici 3 prikazan je graf zavisnosti funkcija (I1 = f1(t)), pridruženih grafu (I = f(t)), nakon uvođenja analiziranog rješenja.

Kao što se može videti sa sl. 3, intenzitet hemiluminiscencije luminola se mijenja: nagli porast prati nagli pad luminiscencije nakon dodavanja analiziranog uzorka.

Budući da je povećanje hemiluminiscencije tokom oksidacije luminola povezano sa stvaranjem peroksida, smanjenje intenziteta hemiluminiscencije nakon unošenja analiziranog uzorka ukazuje na smanjenje njihove količine. Shodno tome, može se govoriti o prisutnosti antioksidativne aktivnosti u jedinjenjima uključenim u analizirani uzorak.

Treba napomenuti da je analizirani uzorak bio ekstrakt maslačka dobijen suhom niskotemperaturnom destilacijom, koji sadrži fenolne spojeve poznate po visokom antioksidativnom djelovanju.

Rice. 3. Grafikon zavisnosti funkcije (I1 = f1(t)), spojen sa grafom (I = f(t)), nakon uvođenja analiziranog rješenja

Osim toga, eksperimentom je utvrđeno da je pomoću hemiluminiscencije moguće odrediti količinu peroksida u ultra-razrijeđenim sistemima, što je važno za procjenu početka oksidacije proizvoda, na primjer, tokom skladištenja.

Dakle, istraživanja su pokazala da metoda za određivanje peroksida u proizvodima, zasnovana na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, omogućava procjenu antioksidativne aktivnosti prehrambenih supstanci i može se koristiti za utvrđivanje antioksidativnih svojstava različitih jedinjenja hrane. .

Recenzenti:

Litvinova E.V., doktor tehničkih nauka, profesor Katedre za tehnologiju, organizaciju i higijenu hrane, Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "OrelGIET", Orel;

Kovaleva O.A., doktor bioloških nauka, direktor Instituta, Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Orelski državni agrarni univerzitet", Orel.

Rad je primljen od strane urednika 8. novembra 2013. godine.

Bibliografska veza

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentyev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UPOTREBA KEMILUMINESCENCIJE ZA PROCJENU ANTIOKSIDANTNIH SVOJSTAVA SUPSTANCI U HRANI // Fundamentalna istraživanja. – 2013. – br. 10-11. – P. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (datum pristupa: 17.12.2019.). Predstavljamo Vam časopise koje izdaje izdavačka kuća "Akademija prirodnih nauka"