Odvajanje proteina od nečistoća male molekularne težine
Metoda membranskog sita (dijaliza)
Koristi se membrana za dijalizu, koja je polimer i ima pore određene veličine. Mali molekuli (nečistoće male molekularne težine) prolaze kroz pore u membrani, a veliki molekuli (proteini) se zadržavaju. Na taj način se proteini ispiru od nečistoća.
Razdvajanje proteina prema molekularnoj težini
Gel hromatografija
Kromatografska kolona je ispunjena granulama gela (Sephadex), koje imaju pore određene veličine. U kolonu se dodaje mješavina proteina. Proteini čija je veličina manja od veličine pora Sephadexa zadržavaju se u koloni, jer su „zaglavljeni“ u porama, dok ostali slobodno izlaze iz kolone. Veličina proteina ovisi o njegovoj molekularnoj težini.
Ultracentrifugiranje
Ova metoda se zasniva na različitim brzinama sedimentacije (precipitacije) proteinskih molekula u rastvorima sa različitim gradijentima gustine (saharozni pufer ili cezijum hlorid).
Elektroforeza
Ova metoda se zasniva na različitim brzinama migracije proteina i peptida u električnom polju ovisno o naboju.
Gelovi, celulozni acetat i agar mogu poslužiti kao nosači za elektroforezu. Molekuli koji se odvajaju kreću se u gelu ovisno o njihovoj veličini: oni koji su veliki bit će odloženi dok prolaze kroz pore gela. Manji molekuli će naići na manji otpor i stoga će se kretati brže. Kao rezultat toga, nakon elektroforeze, velike molekule će biti bliže startu od manjih.
Elektroforeza se može koristiti za razdvajanje proteina prema molekularnoj težini. Za to se koristi PAGE elektroforeza u prisustvu natrijum dodecil sulfata (SDS-Na).
DDS-Na je difilna supstanca i sadrži nabijenu grupu i hidrofobnu. Proteini se vezuju za SDS-Na sa svojim hidrofobnim radikalima i u tom procesu postaju denaturirani. Tako su proteini usklađeni u obliku i naboju. Nakon toga, pokretljivost proteina tokom elektroforeze zavisi samo od njegove molekularne težine.
soljenje: taloženje solima alkalnih, zemnoalkalnih metala (natrijum hlorid, magnezijum sulfat), amonijum sulfat; u isto vrijeme, primarna struktura proteina nije poremećena;
taloženje: upotreba tvari koje uklanjaju vodu: alkohola ili acetona na niskim temperaturama (oko –20 S).
Kada se koriste ove metode, proteini gube svoju hidratantnu ljusku i talože se u otopini.
Denaturacija- kršenje prostorne strukture proteina (primarna struktura molekula je očuvana). Može biti reverzibilna (struktura proteina se obnavlja nakon uklanjanja denaturirajućeg agensa) ili ireverzibilna (prostorna struktura molekula se ne obnavlja, na primjer, kada se proteini precipitiraju koncentriranim mineralnim kiselinama, solima teških metala).
Metode odvajanja proteina Odvajanje proteina od nečistoća male molekularne težine
Dijaliza
Koristi se posebna polimerna membrana koja ima pore određene veličine. Mali molekuli (nečistoće male molekularne težine) prolaze kroz pore u membrani, a veliki molekuli (proteini) se zadržavaju. Tako se proteini ispiru od nečistoća.
Razdvajanje proteina prema molekularnoj težini
Gel hromatografija
Kromatografska kolona je ispunjena granulama gela (Sephadex), koje imaju pore određene veličine. U kolonu se dodaje mješavina proteina. Proteini čija je veličina manja od veličine pora Sephadexa zadržavaju se u koloni, jer su „zaglavljeni“ u porama, dok ostali slobodno izlaze iz kolone (slika 2.1). Veličina proteina ovisi o njegovoj molekularnoj težini.
Rice. 2.1. Odvajanje proteina gel filtracijom
Ultracentrifugiranje
Ova metoda se zasniva na različitim brzinama sedimentacije (precipitacije) proteinskih molekula u rastvorima sa različitim gradijentima gustine (saharozni pufer ili cezijum hlorid) (slika 2.2).
Rice. 2.2. Odvajanje proteina ultracentrifugiranjem
Elektroforeza
Ova metoda se zasniva na različitim brzinama migracije proteina i peptida u električnom polju ovisno o naboju.
Gelovi, celulozni acetat i agar mogu poslužiti kao nosači za elektroforezu. Odvojeni molekuli se kreću u gelu ovisno o njihovoj veličini: oni koji su veći bit će odloženi dok prolaze kroz pore gela. Manji molekuli će naići na manji otpor i stoga će se kretati brže. Kao rezultat, nakon elektroforeze, veći molekuli će biti bliže početku od manjih (slika 2.3).
Rice. 2.3. Odvajanje proteina gel elektroforezom
Elektroforeza se također može koristiti za razdvajanje proteina prema molekularnoj težini. Za to koriste PAGE elektroforeza u prisustvu natrijum dodecil sulfata (SDS-Na).
Izolacija pojedinačnih proteina
Afinitetna hromatografija
Metoda se zasniva na sposobnosti proteina da se snažno vežu za različite molekule putem nekovalentnih veza. Koristi se za izolaciju i pročišćavanje enzima, imunoglobulina i receptorskih proteina.
Molekuli supstanci (ligandi), za koje se određeni proteini specifično vezuju, kovalentno se spajaju sa česticama inertne supstance. Smjesa proteina se dodaje u kolonu, a željeni protein je čvrsto vezan za ligand. Preostali proteini slobodno napuštaju kolonu. Zadržani protein se zatim može isprati iz kolone puferom koji sadrži slobodni ligand. Ova vrlo osjetljiva metoda omogućava da se vrlo male količine čistog proteina izoluju iz ćelijskog ekstrakta koji sadrži stotine drugih proteina.
Izoelektrično fokusiranje
Metoda se zasniva na različitim IET vrijednostima proteina. Proteini se odvajaju elektroforezom na ploči s amfolinom (to je tvar koja ima prethodno formirani pH gradijent u rasponu od 3 do 10). Tokom elektroforeze, proteini se odvajaju prema vrijednosti njihovog IEP-a (u IEP-u će naboj proteina biti nula i neće se kretati u električnom polju).
2D elektroforeza
To je kombinacija izoelektrofokusiranja i elektroforeze sa SDS-Na. Prvo, elektroforeza se provodi u horizontalnom smjeru na ploči s amfolinom. Proteini se odvajaju prema naboju (IET). Zatim se ploča tretira otopinom SDS-Na i izvodi se elektroforeza u vertikalnom smjeru. Proteini se odvajaju na osnovu molekularne težine.
Imunoelektroforeza (Western blot)
Analitička metoda koja se koristi za određivanje specifičnih proteina u uzorku (slika 2.4).
Izolacija proteina iz biološkog materijala.
Odvajanje proteina prema molekularnoj težini elektroforezom u PAGE sa SDS-Na.
Prenos proteina sa gela na polimernu ploču kako bi se olakšao dalji rad.
Tretman ploče nespecifičnim proteinskim rastvorom za popunjavanje preostalih pora.
Tako se nakon ove faze dobija ploča čije pore sadrže odvojene proteine, a prostor između njih je ispunjen nespecifičnim proteinom. Sada moramo utvrditi da li je među proteinima koje tražimo odgovorni za neku vrstu bolesti. Za detekciju se koristi tretman antitijelima. Primarna antitijela su antitijela na protein od interesa. Sekundarna antitijela znače antitijela na primarna antitijela. Dodatna posebna oznaka (tzv. molekularna sonda) dodaje se u sastav sekundarnih antitijela, kako bi se kasnije mogli vizualizirati rezultati. Radioaktivni fosfat ili enzim čvrsto vezan za sekundarno antitijelo se koristi kao oznaka. Vezivanje prvo za primarna, a zatim za sekundarna antitijela ima dva cilja: standardizirati metodu i poboljšati rezultate.
Obrada rastvorom primarnih antitela vezivanje se dešava na mestu ploče gde se nalazi antigen (željeni protein).
Uklanjanje nevezanih antitijela (ispiranje).
Tretman otopinom označenih sekundarnih antitijela za kasniji razvoj.
Uklanjanje nevezanih sekundarnih antitijela (ispiranje).
Rice. 2.4. Imunoelektroforeza (Western blot)
Ako je željeni protein prisutan u biološkom materijalu, na ploči se pojavljuje traka koja ukazuje na vezivanje ovog proteina za odgovarajuća antitijela.
Proučavanje fizičko-hemijskih svojstava, hemijskog sastava i strukture moguće je samo proučavanjem prečišćenog proteinskog preparata. Za izolovanje i frakcionisanje pojedinačnih proteina koriste se: isoljavanje, taloženje organskim rastvaračima, gel filtracija, elektroforeza, hromatografija jonske izmene, afinitetna hromatografija.
Soljenje proteina na osnovu zavisnosti rastvorljivosti proteina o svojstvima medijuma. Proteini su manje rastvorljivi u destilovanoj vodi nego u slabim rastvorima soli, jer niske koncentracije jona održavaju njihovu hidratantnu ljusku. Ali pri visokim koncentracijama soli, proteinski molekuli gube svoju hidratantnu ljusku, agregiraju se i formira se talog. Nakon što se sol ukloni, proteini se vraćaju u otopinu, zadržavajući svoja nativna svojstva i konformaciju.
Promjene u topljivosti pri različitim koncentracijama soli i pH se koriste za izolaciju pojedinačnih proteina. Najčešće se za soljenje proteina koriste otopine amonijevog sulfata različitih koncentracija.
Precipitacija proteina iz rastvora bez njihove denaturacije vrši se pomoću sredstava za dehidrogenaciju - organskih rastvarača (etanol, aceton).
Gel filtracija baziran na razdvajanju proteina prema veličini i obliku molekula. Odvajanje se vrši u hromatografskim kolonama punjenim poroznim granulama gela (Sephadex, agaroza) u puferskom rastvoru određene pH vrednosti. Gel granule su propustljive za proteine zahvaljujući unutrašnjim kanalima (porama) određenog prosečnog prečnika, čija veličina zavisi od vrste gela (Sephadex G-25, G-200, itd.). Smjesa proteina se dodaje u kolonu, a zatim ispere (eluira) puferskim rastvorom određene pH vrijednosti. Veliki proteinski molekuli ne prodiru u pore gela i kreću se velikom brzinom zajedno sa rastvaračem. Mali molekuli nečistoće male molekulske mase (soli) ili drugog proteina zadržavaju se granulama gela i sporije se ispiru iz kolone (slika 1.29). Na izlazu iz kolone, rastvor (eluat) se sakuplja u obliku odvojenih frakcija.
Rice. 1.29. Odvajanje proteina gel filtracijom
Elektroforeza temelji se na svojstvu nabijenih proteinskih molekula da se kreću u električnom polju brzinom proporcionalnom njihovom ukupnom naboju. Proteini koji imaju ukupni negativni naboj pri datoj pH vrijednosti kreću se do anode, a pozitivni naboj se pomiče na katodu. Elektroforeza se izvodi na različitim medijima: papiru, škrobnom gelu, poliakrilamidnom gelu itd. Brzina kretanja zavisi od naboja, mase i oblika proteinskih molekula. Nakon završetka elektroforeze, proteinske zone na nosaču su obojene posebnim bojama (slika 1.30, A).
Rezolucija elektroforeze u gelu je veća nego na papiru, pa se pri elektroforezi proteina krvnog seruma na papiru izdvaja 5 frakcija (albumin, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globulini), a u poliakrilamidnom gelu - do 18 frakcija (Sl. 1.30, B).
Rice. 1.30. Elektroferogram proteina krvnog seruma zdrave osobe
A- elektroferogram proteina krvnog seruma na papiru;
B- količina proteina plazme različitih frakcija.
I - γ-globulini; II - β-globulini; III - a 2 -globulini;
IV - a 1 -globulini; V - albumini
Ionska izmjenjivačka hromatografija zasnovano na razdvajanju proteina koji se razlikuju po ukupnom naboju. Proteinski rastvor određene pH vrednosti prolazi kroz hromatografsku kolonu napunjenu čvrstim poroznim sorbentom, dok se deo proteina zadržava kao rezultat elektrostatičke interakcije. Supstance za ionsku izmjenu koriste se kao sorbenti: anjonski izmjenjivači (koji sadrže kationske grupe) za izolaciju kiselih proteina; kationski izmjenjivači (koji sadrže anjonske grupe) za izolaciju bazičnih proteina.
Prilikom prolaska proteina kroz kolonu, snaga njegovog vezivanja za ionski izmjenjivač ovisi o veličini naboja suprotnog naboju sorbenta. Proteini adsorbirani na sorbentu za ionsku izmjenu eluiraju se puferskim otopinama s različitim koncentracijama soli i pH, čime se dobivaju različite proteinske frakcije.
Afinitetna hromatografija zasniva se na specifičnosti vezivanja proteina za ligand vezan za čvrsti nosač. Kao ligandi se koriste enzimski supstrati, prostetske grupe holoproteina, antigeni itd. Prilikom prolaska mješavine proteina kroz kolonu, samo se komplementarni protein veže za ligand (slika 1.31, A), svi ostali izlaze zajedno s otopinom. Adsorbovani protein se eluira rastvorom različite pH vrednosti (slika 1.31, B). Ova metoda je vrlo specifična i omogućava dobijanje visoko prečišćenih proteinskih preparata.
Izolacija i pročišćavanje proteina se obično odvija u nekoliko koraka korištenjem različitih metoda. Redoslijed koraka je odabran empirijski i može varirati za različite proteine. Visok stepen prečišćavanja proteina je veoma važan kako kada se koriste kao lekovi (hormon insulin i dr.), tako i kada se dijagnostikuje različita oboljenja promenom proteinskog sastava tkiva, krvi, pljuvačke itd.
Skup proteina u stanicama različitih organa odrasle osobe je individualan i održava se relativno konstantnim tijekom cijelog života. Specijalizirana tkiva mogu sadržavati specifične proteine, kao što su hemoglobin u crvenim krvnim zrncima, aktin i miozin u mišićima, rodopsin u retini i različite vrste kolagena u kostima i vezivnom tkivu. Neki proteini se nalaze u mnogim tkivima, ali u različitim količinama. Odabrani sastav se mijenja
Rice. 1.31. Odvajanje proteina afinitetnom hromatografijom
A- vezivanje izolovanog proteina za specifični ligand vezan za neutralni nosač; B- dobijanje rastvora individualnog proteina
proteini tkiva i krvi su mogući i povezani su prvenstveno sa ishranom, sastavom hrane i fizičkom aktivnošću osobe.
Kod bolesti se proteinski sastav krvi i ćelija tkiva može značajno promijeniti; često se razvija nedostatak bilo kojeg proteina ili smanjenje njegove aktivnosti - proteinopatija. Stoga se određivanje izraženih promjena u proteinskom sastavu krvi i tkiva koristi za dijagnosticiranje različitih bolesti u kliničkim studijama.
Nakon ekstrakcije mješavine proteina iz biološkog materijala, ona se razdvaja na pojedinačne proteinske frakcije. Razvijeno je nekoliko metoda frakcionisanja proteina, zasnovanih na različitim fizičko-hemijskim svojstvima proteina.
– taloženje proteina na izoelektričnoj tački – metoda se zasniva na svojstvu proteina da se talože na izoelektričnoj tački zbog neutralizacije naboja proteinskog molekula. Za svaki protein, vrijednost izoelektrične tačke je strogo individualna, tako da ova metoda omogućava izolaciju pojedinačnih proteina (za više informacija o metodi pogledajte laboratorijski rad br. 3 na predmetu „Biohemija“).
– frakcionisanje proteina metodom isoljavanja – na osnovu različite rastvorljivosti proteina u koncentrovanim rastvorima neutralnih soli, u zavisnosti od molekulske mase (za više informacija o metodi pogledajte laboratorijski rad br. 3 na predmetu „Biohemija“).
– metoda elektroforetskog odvajanja proteini u frakcije - opisano u odjeljku fizičko-hemijska svojstva proteina.
Pored gore navedenih metoda, oni se široko koriste za razdvajanje proteina u frakcije. hromatografske metode . Najčešće se koristi kolonska hromatografija.
Posebnost ove metode je da se mješavina molekula različitih proteina i peptida propušta kroz kolonu koja sadrži čvrsti porozni materijal (matriks). Kao rezultat interakcije sa matriksom, različiti proteini prolaze kroz kolonu različitim brzinama. Nakon što proteini stignu do dna kolone u određenom nizu, skupljaju se u odvojene frakcije u epruvete.
Istaknite tri glavne vrste kolonska hromatografija:
– jonska izmjena – za proteinsku hromatografiju koriste se jonski izmjenjivači na bazi celuloze ili drugih hidrofilnih polimera, na primjer dietilaminoetilceluloza (DEAE-celuloza), koja sadrži kationske grupe (negativno naelektrisanje) ili koja sadrži karboksimetilcelulozu (CM-celuloza), koja sadrži aminske grupe (pozitivno naelektrisanje) :
Što je jače vezivanje proteina za DEAE-celulozu, to je veći broj karboksilnih grupa u proteinskom molekulu. Proteini adsorbovani na DEAE celulozu mogu se isprati (eluirati) iz kolone rastvorima rastuće koncentracije natrijum hlorida. Prvo se eluiraju slabo vezani proteini, a kako se koncentracija soli povećava, eluiraju se i drugi proteini, kako bi se povećao afinitet za DEAE-celulozu.
CM celuloza se koristi na sličan način, ali je afinitet proteina za nju direktno proporcionalan broju amino grupa u proteinskom molekulu.
Da bi se uklonio vezani protein, pH eluensa se također mijenja.
– gel filtracijska hromatografija – ima drugi naziv “metoda molekularnog sita”. Sephadex (polisaharidni dekstran tretiran epihlorid hidrinom) se koristi kao sita. Zrna sefadeksa bubre u vodi i formiraju gel. Natečene granule imaju pore određenog prečnika.
Razdvajanje se zasniva na činjenici da su zrna Sephadexa (pore granula) nepropusna ili ograničeno propusna za tvari velike molekularne težine, a male molekule slobodno difundiraju (prodiraju) u pore zrna.
Gelasta masa nabubrelog sefadeksa stavlja se u staklenu kolonu (epruvetu), sloj proteinskog rastvora se nanosi na površinu gela (slika 12, a) i zatim se propušta puferski rastvor (tečnost za eluiranje). kolona. Proteini prolaze duž kolone između granula to sporije, što je njihova molekulska težina manja, jer proteinski molekuli sa još nižom molekulskom težinom lakše difundiraju u granule (u pore) (slika 12).
Rice. 12. Frakcioniranje proteina gel filtracijom
Proteini se ispiru (eluiraju) iz kolone u opadajućem redoslijedu molekularne težine. Posljedično, prvo se eluiraju veliki proteinski molekuli (slika 12, b), koji ne difundiraju u zrna, zatim mali molekuli i, na kraju, niskomolekularne nečistoće.
Ova metoda se koristi ne samo za frakcioniranje proteina prema molekularnoj težini, već i za njihovo pročišćavanje od nečistoća niske molekularne težine.
– afinitetna hromatografija – ili afinitetnu hromatografiju. Princip metode je da se javlja selektivna interakcija proteina sa specifičnim supstancama - ligandima vezanim za nosače (slika 13).
Sefaroza aktivirana cijanogen bromidom koristi se kao nosač. Za sefarozu su vezani ligandi različitog porijekla - supstrat, ili antigen, ili receptor, koji će afinitetno vezati samo jedan protein iz smjese:
– supstrat → enzim;
– antigen → antitelo;
– hormon → receptor za dati hormon.
Drugi proteini koji nisu vezani za ligand uklanjaju se ispiranjem kolone.
Rice. 13. Mehanizam afinitetne hromatografije
Uklanjanje afinitetno vezanog proteina iz kolone se vrši upotrebom puferskog rastvora (eluent). U pufer se unosi deterdžent koji slabi veze između proteina i liganda, ili se kroz kolonu propušta otopina s visokom koncentracijom slobodnog liganda. U ovom slučaju, protein se lakše vezuje za slobodni ligand i ispire se (eluira) iz kolone.
Laboratorijski rad br.8
ELEKTROFORETSKO ODJELJAVANJE PROTEINA
Metoda se zasniva na činjenici da proteinski molekuli imaju električni naboj, čija veličina i znak su determinisani sastavom aminokiselina proteina, pH i jonskom snagom okoline. Pod uticajem spoljašnjeg električnog polja, naelektrisani molekuli se kreću u rastvoru do suprotno naelektrisanog pola. Brzina kretanja proteinskih čestica proporcionalna je veličini njihovog naboja i obrnuto proporcionalna veličini čestica i stepenu hidratacije.
Danas se široko koristi takozvana "zonska elektroforeza" - elektroforeza na čvrstom nosaču (na papirnim trakama, agaru, škrobu, akrilamidu) impregniranom puferskom otopinom željene pH vrijednosti. Položaj proteina na papiru ili gelu određuje se fiksiranjem i zatim bojenjem jednom ili drugom bojom (obično bromofenol plava, amid crna ili Coomassie plava). Količina proteina u svakoj frakciji može se grubo odrediti intenzitetom boje povezane boje. Takva definicija ne daje striktno kvantitativni omjer proteinskih frakcija, jer količina boje koju vezuju različiti proteini nije ista.
ELEKTROFOREZA HA PAPER
Odvajanje analizirane smjese se odvija na određenim vrstama hromatografskog papira impregniranog puferskim rastvorom u uređajima za elektroforezu. Proteini se odvajaju na naponima do 500 V.
Komora za elektroforezu sastoji se od kade od pleksiglasa i poklopca koji je na nju pričvršćen. (1). Kupatilo ima 2 odjeljka za elektrode (2), od kojih je svaki odvojen uzdužnom pregradom (3) u dva odeljka koji međusobno komuniciraju. Bo unutrašnji odjeljci odjeljaka spuštaju elektrode, a krajevi papirnih traka u vanjske (4), čiji je glavni dio postavljen na horizontalnu ploču sa šiljcima (5) koja se nalazi u središnjem dijelu komore. Između horizontalne ploče i vanjskog odjeljka odjeljka za elektrode nalaze se štapići (6),
Fig.2. Šema uređaja za niskonaponsku elektroforezu
kroz koje se provlače papirne trake i koje služe da ih podupiru. Ispod gornjeg poklopca komore nalazi se ploča od pleksiglasa sa velikim okruglim rupama (7), na koju se stavljaju listovi filter papira presavijeni 4-5 puta natopljeni destilovanom vodom. Ovi listovi doprinose povećanju nepropusnosti komore i, kao rezultat, smanjenju isparavanja tekućine iz elektroforegrama tijekom elektroforeze.
Elektroforezom na papiru studenti se pozivaju da izvrše odvajanje proteina krvnog seruma. Ovom metodom krvni serum se može podijeliti na 5 - 9 frakcija i odrediti relativni sadržaj proteina u svakoj od njih. Odvajanje se vrši u puferskom rastvoru (pH 8,6 - 8,9) pri gradijentu potencijala od 3 - 5 V/cm (120 - 350 V za trake dužine 40 - 45 cm) na sobnoj temperaturi. Jačina struje ne smije prelaziti 0,1 - 0,3 mA po centimetru poprečnog presjeka papirne trake. Povećanje jačine struje za više od 2 puta je neprihvatljivo, jer to uzrokuje prekomjerno zagrijavanje, značajno povećanje isparavanja i V na kraju - spaljivanje papira
reagensi:
1. Puferski rastvor. Može biti korišteno:
a) veronal-medinalni pufer (pH 8,6): rastvoriti 10,32 gmedinala (veronske natrijumove soli) u 300 ml destilovane vode, dodati 1,84 gveronala, zagrejati uz mešanje u vodenom kupatilu dok se ne rastvori i razblažiti vodom do 1 l;
b) veronalni acetatni pufer (pH 8,6): 4,3 gveronala, 0,95 natrijum hidroksida i 3,24 natrijum hidroksida se rastvori u 300 ml destilovane vode. Dodati 30 ml 0,1 M rastvora HCl u rastvor i dodati vodu u 1 litar;
c) Tris pufer (pH 8,9): 60,5 g trisa, 6 g etilendiamintetrasirćetne kiseline i 4,6 g borne kiseline rastvoreno je u 1 l destilovane vode.
2. Rješenja za bojenje elektroferograma:
a) kisela plavo-crna boja (slična amidnoj crnoj 10 B) -0,2 g u smeši: sirćetna kiselina (glacijalna) - 100 ml + metil alkohol - 900 ml;
b) bromofenol plavo - 0,5 g, sublimat - 10 g, sirćetna kiselina (glacijalna) - 20 ml, destilovana voda - 980 ml;
c) bromofenol plavo - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O -50 g, sirćetna kiselina (glacijalna) 50 ml, destilovana voda - 900 ml.
3. Rješenja za ispiranje elektroforegrama sa boje koja nije vezana za protein i fiksiranje boje na protein:
a) sirćetna kiselina - 2% rastvor;
b) natrijum acetat - 2% rastvor pripremljen sa 10% rastvorom sirćetne kiseline.
4. Rješenja za eluiranje obojenih proizvoda sa elektroferograma:
a) za ekstrakciju bromofenol plavog -0,01 M rastvora NaOH;
b) za ekstrakciju kisele plavo-crne boje -0,1 M rastvora NaOH.
Oprema: epruvete; kivete, spektrofotometar, uređaj za elektroforezu, hromatografski papir: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM, itd.
Dobivanje krvnog seruma. U suvu epruvetu za centrifugiranje izvuče se 2 - 3 ml krvi i ostavi 1/2 - 1 sat. Tankom staklenom šipkom pažljivo kruži zidove epruvete da se od njih odvoji ugrušak, centrifugira i serum sipati u čista cijev.
Priprema kamere. Odjeljci za elektrode su napunjeni puferskom otopinom do istog nivoa (da bi se izbjeglo prelijevanje pufera), otprilike 800 ml u svakom odeljku. Bo unutrašnji dijelovi odjeljaka za elektrode potapaju elektrode. Na list kromatografskog papira (18x45 cm) (kada koristite tanke vrste papira, bolje je nanijeti uzorke na zasebne trake širine 4-5 cm) na udaljenosti od 15 cm od jedne od njegovih uskih strana, koristite jednostavan mekani olovkom (grafit sprečava širenje tečnosti) za ocrtavanje mesta za nanošenje uzoraka. To su pravokutnici (2 x 0,3 cm), čije su velike stranice okomite na dužinu papirne trake. Udaljenost između početnih zona i rubova elektroferograma je 2 cm Elektroferogram je impregniran puferom u kojem će se odvijati elektroforeza. Da biste to učinili, provlači se kroz kivetu s puferskom otopinom. Krajevi papirnih traka (6-8 cm) nisu navlaženi. Višak pufera se uklanja upijanjem traka između dva ili tri lista filter papira. Vlažni elektroferogram se postavlja u komoru na središnju horizontalnu ploču (5), a krajevi se spuštaju u vanjske pregrade odjeljka za elektrode.Aparat se čvrsto zatvara poklopcem, ispod kojeg se nalaze listovi filter papira navlaženi vode.
Izvođenje elektroforeze. Nakon što su papirne trake potpuno zasićene puferskom otopinom, uzorci od 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg proteina) seruma se nanose na označena područja pomoću pipete od 0,1 ml. Komora se zatvara poklopcem i uključuje struju. Trajanje elektroforeze je 22 - 24 sata na naponu od 200 - 300 V
Fiksiranje i bojenje elektroferograma. Na kraju elektroforeze isključite struju i odmah uklonite elektroferograme iz uređaja. Stavljaju se na poseban stalak i suše na zraku na promaji, zatim u pećnici na 105 ºC 20 minuta da se proteini učvrste na papiru, nakon čega se stavljaju u emajl kivetu, pune bojom i ostavljaju 2-3 sati ili više. Boja se ocijedi, a elektroferogrami se ispiru od njenog viška sipanjem 3-4 puta sa 2% rastvorom sirćetne kiseline, svaki put u trajanju od 5-10 minuta. Područja papira koja ne sadrže proteine moraju biti potpuno bez boje. Za fiksiranje obojenih proizvoda, elektroferogrami se pune 2% otopinom natrijevog acetata 2 minute i suše na zraku uz usisavanje.
Određivanje omjera pojedinačnih proteinskih frakcija. Na pH 8,6, serumski proteini su negativno nabijeni i kreću se u električnom polju prema anodi. Frakcija koja se najbrže kreće do anode je albumin, a zatim slijede α1-, α2-, β- i γ-globulini (vidi sliku 3) . Dijelovi papirnatih traka na kojima su se pojavile mrlje od proteina podijeljene su poprečnim linijama jednostavnom olovkom na trake širine 3-5 mm i izrezane duž ovih linija. Svaka traka se zgnječi i stavi u posebnu numerisanu epruvetu, napuni se sa 3 ml 0,01 M rastvora NaOH, ostavi sat vremena da se ukloni boja sa papira, a zatim se za svaki rastvor na fotokolorimetru pronađe vrednost optičke gustine ( spektrofotometar) na 612 nm.
Rice. 3. Elektroferogram seruma ljudske krvi i kriva distribucije proteinskih frakcija
Paralelno se obrađuje kontrolni uzorak. Za to se izrezuje traka iz neobojenih područja elektroferograma.
Na osnovu dobijenih podataka, na elektroferogramu se iscrtava krivulja distribucije obojenih proizvoda.Na osi apscise označeni su brojevi epruveta, a na osi ordinata odgovarajuća vrijednost optičke gustine (vidi sliku 3). . Izračunava se procenat proteinskih frakcija u krvnom serumu. Da bi se to postiglo, nacrtana kriva je podijeljena prema minimumu na više dijelova koji odgovaraju pojedinačnim razlomcima. Veličina površine svakog dijela je proporcionalna količini boje u kombinaciji s proteinom date frakcije. Omjer između ovih površina izračunava se po težini (težina dijelova papira je proporcionalna njihovoj površini), cijela površina se uzima kao 100%. Ako imate denzitometar, omjer proteinskih frakcija u krvnom serumu može se odrediti iz denzitograma.
Nakon što se prethodno odredi sadržaj proteina u sirutki, izračunava se njegova količina za svaku frakciju.
