Твердофазний синтез або твердофазна технологія, яку часто називають керамічною, є найпоширенішими при отриманні неорганічних матеріалів для різних галузей науки та промисловості. До них відносяться ядерне паливо, матеріали для космічної техніки, радіоелектроніки, приладобудування, каталізатори, вогнетриви, високотемпературні надпровідники, напівпровідники, сегнето-і п'єзоелектрики, магнетики, різні композити та багато інших.

В основі твердофазного синтезу лежать хімічні реакції, в яких принаймні хоча б один із реагентів знаходиться у вигляді твердої речовини. Такі реакції називаються гетерогенними чи твердофазними. Твердофазна взаємодія, на відміну від реакцій у рідкому чи газовому середовищі, складається з двох фундаментальних процесів: із самої хімічної реакції та перенесення речовини до реакційної зони.

Твердофазні реакції за участю кристалічних компонентів характеризуються обмеженою рухливістю атомів або іонів і складною залежністю від багатьох факторів. До них відносяться такі, як хімічна структура і пов'язана з нею реакційна здатність твердих речовин, що реагують, природа і концентрація дефектів, стан поверхні і морфологія реакційної зони, площа контакту взаємодіючих реагентів, попередня механохімічна активація та ряд інших. Усі зазначене зумовлює складність механізмів гетерогенних реакцій. Вивчення гетерогенних реакцій ґрунтується на хімії твердого тіла, хімічній фізиці та фізичній хімії поверхні твердих тіл, на законах термодинаміки та кінетики.

Нерідко про механізм твердофазних реакцій судять лише на підставі того, що експериментальні дані про ступінь взаємодії як функції часу описуються найкраще якоюсь конкретною кінетичною моделлю і відповідним рівнянням кінетики. Такий підхід може призвести до неправильних висновків.

Процеси у твердофазних матеріалах мають низку важливих відмінностей від процесів у рідинах чи газах. Ці відмінності пов'язані, насамперед, із суттєво (на кілька порядків) нижчою швидкістю дифузії в твердих тілах, що перешкоджає усередненню концентрації компонентів у системі і, таким чином, призводить до просторової локалізації процесів, що протікають. Просторова локалізація у свою чергу призводить до того, що в кінетику процесів, що спостерігається, робить внесок як питома швидкість процесу (або коефіцієнт дифузії), так і геометрія реакційної зони. Такі зумовлені геометричними факторами особливості твердофазних процесів називають топохімічними. Крім того, оскільки обговорювані перетворення просторово локалізовані, їх швидкість може визначатися як власне процесами на межі розділу фаз (реакційний контроль), так і швидкістю підведення до цієї межі якогось компонента або відведення продукту (ів) (дифузійний контроль). Ці випадки для простих систем, для яких виконуються модельні припущення, можуть бути ідентифіковані в експерименті за тимчасовою залежністю ступеня перетворення. Ще одна особливість фазових перетворень у твердих тілах пов'язана з тим, що утворення зародка нової фази у твердій матриці викликає появу в останній пружних напруг, енергія яких у ряді випадків повинна враховуватися при розгляді термодинаміки цих перетворень.

Велика кількість факторів, що впливають на кінетику твердофазних процесів і мікроструктуру матеріалів, що отримуються при цьому, визначає і множинність типів класифікації цих процесів. Так, розглядаючи стійкість системи стосовно флуктуацій різного типу, виділяють гетерогенні (у разі систем, стійких до малих за займаним обсягом флуктуацій і нестійких до великих) і гомогенні (у разі систем, нестійких до малих флуктуацій) процеси. Для гетерогенних процесів як приклад можна навести перетворення, що йдуть за механізмом утворення і зростання зародків, для гомогенних - деякі переходи порядок - безлад і спинодальний розпад твердих розчинів.

Від гетерогенних та гомогенних процесів необхідно відрізняти гетерогенне та гомогенне зародки у разі гетерогенних процесів. Гетерогенним зародкомутворенням називають утворення зародків на дефектах структури (включаючи точкові дефекти дислокації та межі розділу фаз); гомогенним зародкомутворенням - утворення зародків у бездефектному обсязі твердої фази.

Аналізуючи продукт твердофазного перетворення, розрізняють однофазні та багатофазні зародки. У разі багатофазних зародків продуктом процесу виявляється багатофазна колонія з характерною мікроструктурою, що визначається поверхневою енергією межі фаз, що утворюються; процеси цього типу називають переривчастими на відміну безперервних у разі утворення та зростання однофазних зародків.

Ще один спосіб класифікації твердофазних перетворень заснований на зіставленні складу вихідної фази та складу продукту реакції. У разі їх збігу говорять про бездифузійні процеси, а при зміні складу - про дифузійні. Причому бездифузійних корисно виділити кооперативні процеси (наприклад, мартенситне перетворення), що відбуваються шляхом одночасного незначного переміщення атомів у великому обсязі вихідної фази.

Бездифузійні фазові перетворення можуть різнитися на кшталт змінюваних у процесі їх термодинамічних характеристик.

Перетвореннями першого роду називають процеси, у яких відбувається зміна похідних хімічного потенціалу за температурою чи тиску. Звідси випливає стрибкоподібна зміна при фазовому переході таких термодинамічних параметрів, як ентропія, об'єм, ентальпія, внутрішня енергія. При перетворення другого роду перші похідні хімічного потенціалу за інтенсивними параметрами не змінюються, але змінюються похідні більш високих порядків (починаючи з другого). У цих процесах при безперервних ентропії та обсязі системи відбувається стрибкоподібна зміна величин, що виражаються через другі похідні енергії Гіббса: теплоємності, коефіцієнта теплового розширення, стисливості тощо.

Твердофазні реакції між двома фазами (контакти між трьома або більше фазами малоймовірні, а відповідні процеси можуть бути представлені як комбінації декількох двофазних реакцій) відносяться до дифузійних процесів і можуть бути як гетерогенними, так і гомогенними, як з гетерогенним, так і з гомогенним зародком. Гомогенні процеси та процеси з гомогенним зародком утворенням при таких реакціях можливі, наприклад, у разі утворення метастабільного твердого розчину з подальшим його розпадом (так звані внутрішні реакції). Прикладом таких процесів може бути внутрішнє окиснення.

Умовою термодинамічної рівноваги при твердофазному перетворенні, як і за будь-якого іншого хімічного перетворення, є рівність хімічних потенціалів компонентів у вихідних речовинах і продуктах реакції. При взаємодії двох твердих фаз зазначена рівність хімічних потенціалів може реалізовуватись різними способами: 1) перерозподіл компонентів у вихідних фазах з утворенням твердих розчинів; 2) утворення нових фаз з іншою кристалічною структурою (що, власне, зазвичай і називають твердофазною реакцією), причому оскільки хімічний потенціал компонента в різних фазах багатофазної системи не залежить від кількості кожної фази, рівновага може бути досягнута тільки при повному перетворенні вихідних фаз. Найбільш достовірні відомості про механізм твердофазних реакцій отримують при комплексному використанні, що дозволяє одночасно спостерігати кілька параметрів системи, що реагує, включаючи фазовий склад, теплові ефекти, зміна маси та інше.

Термодинамічна теорія твердофазних реакцій була запропонована Вагнером, а надалі розвинена Шмальцрид на прикладі реакцій приєднання.

На сьогодні немає єдиної класифікації великої різноманітності гетерогенних реакцій. Пов'язано це з труднощами вибору критерію як основу такої універсальної класифікації. За хімічними критеріями реакції поділяються на реакції окислення, відновлення, розкладання, з'єднання, обміну і т. д. Поряд із зазначеним критерієм широко використовується як основний критерій фізичного стану реагентів:

Характерною рисою всіх гетерогенних реакцій є існування та локалізація на межі поділу фаз реакційної зони. Реакційна зона, як правило, малої товщини поділяє дві області простору, зайняті речовинами різного складу та з різними властивостями. Причини утворення реакційної зони зазвичай поділяються на дві групи: відносна повільність процесів дифузії та хімічні причини. Остання група обумовлена ​​великою реакційною здатністю на поверхні твердого реагенту або на поверхні розділу двох наявних фаз атомів або молекул. Відомо, що поверхня твердої або рідкої речовини має властивості, відмінні від об'ємних властивостей компактного зразка. Це робить властивості поверхні поділу фаз специфічними. Саме тут відбувається суттєва перебудова кристалічної упаковки, знижується напруга між двома кристалічними ґратами, відбувається зміна хімічного складу.

Оскільки масоперенос здійснюється шляхом дифузії, а дифузійна рухливість частинок твердого тіла залежить від дефектності його структури, очікується істотного впливу дефектів на механізм і кінетику твердофазних реакцій. Ця стадія передує стадії хімічної перетворення реагуючих речовин на міжфазній поверхні розділу. Таким чином, кінетика гетерогенних реакцій визначається як характером протікання самої хімічної реакції, і способом доставки речовини в реакційну зону. Відповідно до зазначеного швидкість реакцій буде лімітуватися хімічною стадією (хімічна кінетика) або дифузією (дифузійна кінетика). Таке явище і спостерігається насправді.

По Вагнер дифузія і, отже, реакція в твердих тілах здійснюється головним чином за рахунок рухливості іонів і електронів, обумовленої нерівноважним станом решітки. Різні іони решітки переміщаються у ній із різною швидкістю. Зокрема, рухливість аніонів у переважній більшості випадків мізерно мала порівняно з рухливістю катіонів. Тому дифузія і реакція в твердих тілах здійснюється за рахунок переміщення катіонів. При цьому дифузія різноїменних катіонів може йти в одному напрямку або назустріч один одному. При разнозарядных катіонах електронейтральність системи зберігається з допомогою руху електронів. За рахунок відмінності у швидкостях переміщення різнозарядних катіонів у системі виникає електричний потенціал. В результаті швидкість переміщення рухоміших іонів зменшується і, навпаки, для менш рухливих? збільшується. Таким чином, електричний потенціал, що виникає, регулює швидкості дифузії іонів. Остання та обумовлена ​​нею швидкість всього процесу твердофазного перетворення може бути розрахована на основі електронної провідності та чисел переносу. Очевидно, що спрямована дифузія іонів можлива лише в електричному полі або за наявності концентрації градієнта в системі.

При синтезі речовин у твердому стані часто виявляється необхідним контролювати як хімічний (елементний і фазовий) склад одержуваного продукту, а й його микроструктурную організацію. Це з сильною залежністю як хімічних (наприклад, активності у твердофазних реакціях), і багатьох фізичних (магнітних, електричних, оптичних тощо.) властивостей від характеристик структурної організації твердого тіла різних ієрархічних рівнях. До першого з таких рівнів можна віднести елементний склад твердого тіла та спосіб взаємного розташування атомів елементів у просторі – кристалічну структуру (або особливості найближчого координаційного оточення атомів в аморфних твердих тілах), а також склад та концентрацію точкових дефектів. Як наступний рівень структури твердого тіла може бути розглянуто розподіл у кристалі протяжних дефектів, що визначає розміри областей, в яких (з поправкою на існування точкових дефектів) спостерігається трансляційна симетрія розташування атомів. Такі області можуть вважатися досконалими мікрокристалами та називаються областями когерентного розсіювання. Говорячи про області когерентного розсіювання, необхідно пам'ятати, що в загальному випадку вони не еквівалентні компактним частинкам, що утворюють твердофазний матеріал, які можуть містити значну кількість протяжних дефектів, а отже, і областей когерентного розсіювання. Збіг областей когерентного розсіювання з частинками (які у разі називають однодоменними) зазвичай спостерігається лише досить малих (менш 100 нм) розмірів останніх. Наступні структурні рівні можуть бути пов'язані з формою і розподілом за розмірами частинок, що утворюють порошкоподібний або керамічний матеріал, їх агрегацією, агрегацією первинних агрегатів і т.д.

Різні сфери застосування твердофазних матеріалів пред'являють різні, часто протилежні вимоги до перерахованих вище структурних характеристик і, отже, вимагають застосування різних синтетичних методів. Тому правильніше говорити про методи синтезу не твердофазних речовин, а твердофазних матеріалів і в кожному випадку вибирати метод синтезу з урахуванням області подальшого застосування продукту.

У загальному випадку методи синтезу твердофазних матеріалів можуть бути класифіковані за віддаленням від термодинамічно рівноважних умов перебігу використовуваних хімічних процесів. Відповідно до загальних закономірностей, за умов, що відповідають стану, максимально віддаленому від рівноважного, спостерігається значне перевищення швидкості зародка освіти над швидкістю зростання зародків, що утворилися, що, очевидно, призводить до отримання максимально дисперсного продукту. У разі проведення процесу поблизу термодинамічної рівноваги зростання зародків, що вже утворилися, відбувається швидше утворення нових, що в свою чергу дозволяє отримувати великокристалічні (у граничному випадку - монокристалічні) матеріали. Швидкістю зростання кристалів значною мірою визначається концентрація в них протяжних (нерівноважних) дефектів.

Комбінаторний синтез можна проводити у розчині (рідкофазний синтез), а й у поверхні твердої хімічно інертної фази. У цьому випадку перша вихідна речовина хімічно „пришивають“ до функціональних груп на поверхні полімерного носія (найчастіше використовують складноефірний або амідний зв'язок) і обробляють розчином другої вихідної речовини, яка береться у значному надлишку, щоб реакція пройшла до кінця. У такій формі реакції є певна зручність, оскільки полегшується техніка виділення продуктів: полімер (зазвичай у вигляді гранул) просто відфільтровують, ретельно промивають від залишків другого реагенту та хімічно відщеплюють від нього цільову сполуку.

В органічній хімії немає жодної реакції, що забезпечує практично кількісні виходи цільових продуктів у разі. Єдине виняток становить, мабуть, повне спалювання органічних речовин у кисні при високій температурі до СО 2 і Н 2 О. Тому очищення цільового продукту завжди є неодмінним, а часто найскладнішим і трудомістким завданням. Особливо складним завданням є виділення продуктів пептидного синтезу, наприклад, поділ складної суміші поліпептидів. Тому саме в пептидному синтезі найбільшого поширення набув метод синтезу на твердій полімерній підкладці, розроблений на початку 60-х років ХХ століття Р.Б. Меріфілдом.

Полімерний носій у методі Мерріфілда – це гранульований зшитий полістирол, що містить хлорметильні групи в бензольних ядрах, які є лінкерами, що зв'язують підкладку з першим залишком амінокислотним поліпептиду. Ці групи перетворюють полімер на функціональний аналог бензилхлориду і повідомляють йому здатність легко утворювати складноефірні зв'язки при реакції з карбоксилат-аніонами. Конденсація такої смоли з N-захищеними амінокислотами призводить до утворення відповідних бензилових ефірів. Видалення N-захисту дає С-захищене похідне першої амінокислоти, ковалентно пов'язане з полімером. Аміноацилювання звільненої аміногрупи N-захищеним похідним другої амінокислоти з подальшим видаленням N-захисту призводить до аналогічного похідного дипептиду також прив'язаного до полімеру:

Такий двостадійний цикл (видалення захисту - аміноацилювання) може бути, в принципі, повторений стільки разів, скільки потрібно для нарощування поліпептидного ланцюга заданої довжини.

Подальший розвиток ідей Мерифільда ​​було спрямовано насамперед на пошук і створення нових полімерних матеріалів для підкладок, розробку методів поділу продуктів та створення автоматизованих установок для всього циклу поліпептидного синтезу

Ефективність методу Мерифілда була продемонстрована успішним синтезом цілого ряду природних поліпептидів, зокрема інсуліну. Особливо його переваги були продемонстровані на прикладі синтезу ферменту рибонуклеази. Так, наприклад, ціною значних зусиль протягом кількох років Хіршмен з 22 співробітниками виконали синтез ферменту рибонуклеази (124 амінокислотні залишки) за допомогою традиційних рідкофазних методів. Майже водночас той самий білок було отримано шляхом автоматизованого твердофазного синтезу. У другому випадку синтез, що включає всього 11 931 різних операцій, у тому числі і 369 хімічних реакцій, був виконаний двома учасниками (Гатте та Мерріфілдом) всього за кілька місяців.

Ідеї ​​Меррифільда ​​послужили основою створення різних методів комбінаторного синтезу бібліотек поліпептидів різного будови.

Так у 1982 році було запропоновано оригінальну стратегію багатостадійного паралельного синтезу пептидів на твердій фазі відома як „спліт-метод“ ( split- Розщеплення, поділ) або метод "змішай і розділи" (рис. 3). Суть її полягає у наступному. Припустимо, що з трьох амінокислот (А, В та С) потрібно отримати всі можливі комбінації трипептидів. Для цього гранули твердого полімерного носія (Р) поділяють на три рівні порції та обробляють їх розчином однієї з амінокислот. При цьому всі амінокислоти хімічно зв'язуються з поверхнею полімеру однієї зі своїх функціональних груп. Отримані полімери трьох сортів ретельно змішують і суміш знову поділяють на три частини. Потім кожну частину, що містить всі три амінокислоти в однакових кількостях, знову обробляють однією з трьох амінокислот і отримують дев'ять дипептидів (три суміші по три продукти). Ще одне змішання, поділ на три рівні частини та обробка амінокислотами дають шукані 27 трипептидів (три суміші по дев'ять продуктів) всього через дев'ять стадій, тоді як отримання їх окремо вимагало синтезу з 27×3 = 81 стадій.

«Біолог. журн. Вірменії, 1 (65), 2013 ТВЕРДОФАЗНИЙ СИНТЕЗ КАРДІОАКТИВНОГО ПЕПТИДУ, ВИДІЛЕНОГО З ПЕРЕДСЕРДІЙ СВИНІ Г.С. ЧАІЛЯН Інститут біохімії ім. Бунятяна НАН РА...»

Експериментальні та теоретичні статті

Experimental and theoretical articles

Біолог. журн. Вірменії, 1 (65), 2013

ТВЕРДОФАЗНИЙ СИНТЕЗ КАРДІОАКТИВНОГО ПЕПТИДУ,

ВИДІЛЕНОГО З ПЕРЕДСЕРДІВ Свині

Г.С. ЧАІЛЯН

Інститут біохімії ім. Бунятяна НАН РА

[email protected]

З метою продовження досліджень акад. Галояна, нами було проведено низку експериментів щодо виділення, очищення та визначення біологічної спрямованості нововиділених сполук пептидної природи з передсердь та вушкових частин серця свині. Для проведення біотестів потрібно отримати препаративні кількості досліджуваних зразків. Для цього ми скористалися методикою твердофазного синтезу пептидів із її подальшою модифікацією. Чистота та ідентичність синтезованих препаратів перевірялися методами високоефективної рідинної хроматографії та мас-спектрального аналізу.

Твердофазний синтез – fmoc-амінокислоти – ВЕРХ – фенілізотіоціанат – мас-спектральний аналіз:

fmoc- – – Для чотирьох досліджень визначений Галояном, серія experiments on isolation, purification and determination of biological direction of peptides isolated from pigs atria were carried out. Для повногознімання biotests preparative amount of samples was required. A modified method of solid phase peptide synthesis was used. Синтезісований peptide purity and identity були визначені HPLC і мас-spectral analysis.

Протягом багатьох років в Інституті біохімії НАН РА у відділі біохімії нейрогормонів акад. Галояном із співробітниками вивчалися шляхи регуляції та механізми дії гіпоталамічних нейрогормонів на різні процеси в організмі.

Підтвердження ідеї про взаємопов'язане, взаємозумовлене, цілісне функціонування такої системи, як гіпоталамус – гіпофіз – надниркові залози, стало переломним моментом в ендокринології. Поповнення ж цієї концепТВЕРДОФАЗНИЙ СИНТЕЗ КАРДІОАКТИВНОГО ПЕПТИДУ, ВИДІЛЕНОГО З ПЕРЕДСЕРДІЙ СВИННИ туальної тріади, висунутої Галояном щодо взаємодії гіпоталамус - гіпофіз

- Серце, є величезним науковим досягненням. Згодом було виявлено нову тканину-мішень-серце, показано здатність цього органу керувати функціонуванням специфічних пептидів, а також існування механізму зворотного зв'язку між гіпоталамусом та серцем за допомогою цих пептидів.

Виявлення кардіоактивних сполук – нейрогормону К, С, G та інших у гіпоталамусі різних тварин послужило початком робіт як з вивчення молекулярних механізмів дії цих нейрогормонів, а й у пошуку подібних сполук у серці. Підставою для всебічного дослідження біохімічних та фізико-хімічних властивостей кардіоактивних начал послужили дані про наявність 2-х кардіоактивних сполук у серцевому м'язі. Було встановлено участь нейрогормону “С” у регуляції гліколітичних процесів та рівня циклічних нуклеотидів за допомогою інгібування ФДЕ цАМР, цАМФ-залежної протеїнкінази тощо. Було показано, що ця сполука є низькомолекулярною і відноситься до глікопептидів.

Нами в лабораторії аналітичної хроматографії та пептидного синтезу було проведено роботу з виділення та очищення сполук пептидної природи з передсердь та вушкових зон серця свині. При поділі пептидних фракцій препаративної ВЕРХ, нами були виділені та очищені до гомогенного стану 20 сполук пептидної природи. Для визначення біологічної спрямованості всі препарати були тестовані на зміни компонентів ЕКГ у щурів. Результати експериментів показали, що 7 сполук мають різнобічні чинники впливу певні компоненти ЕКГ.

Пептид №7 показав найбільшу активність зміну амплітуди компонента R, тривалості комплексу QRS, амплітуди S та інших параметрів.

Для вивчення біологічних механізмів дії даного препарату стала потрібна наявність великої кількості досліджуваного зразка. Зважаючи на те, що процес виділення та очищення біопрепаратів є вкрай неефективним, трудомістким, часом витратним і не може забезпечувати хорошої відтворюваності, стало вкрай актуальним проведення хімічного синтезу даного препарату. Аналізуючи світову літературу в галузі хімічного синтезу пептидів, ми дійшли висновку, що найбільш оптимальною для нас є методика твердофазного синтезу з використанням fmoc-захищених амінокислот. Відкритий у 1984 році твердофазний синтез пептидів (Solid phase peptide synthesis) має багато переваг у порівнянні зі звичайним синтезом з точки зору ефективності, а також зручної обробки та очищення.

З використанням кілька різних методик: гідролізу даного препарату, модифікування амінокислот фенілізотіоціанатом, нами було отримано амінокислотний склад пептиду №7. Використовуючи дані мас-спектрального та ЯМР-аналізів, едмонівської деградації, нам вдалося отримати не лише амінокислотний склад, але також амінокислотну послідовність пептиду №7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Ефективний процес твердофазного синтезу багато в чому залежить від правильного вибору різних умов його проведення, таких як вибір смоли, розчинника та кінетики проведення синтезу. Ці змінні впливають на ступінь набухання смоли та її зв'язку з амінокислотами, кількості зв'язувальних сайтів, що в кінцевому підсумку впливає на синтез пептиду в цілому. Ми пристосували процес твердофазного синтезу по відношенню до наших досліджуваних пептидів з урахуванням особливостей їх амінокислотної послідовності.

Г.С. ЧАІЛЯН Матеріал та методика. Усі використані реактиви, розчинники, смоли фірми Advanced Chem Techcompany. Ми використовували fmoc-групи для захисту N-кінців амінокислот у процесі синтезу та диметилформаміду (DMF) як розчинник у процесі всього синтезу. Як підкладку ми використовували кислотолабільну 2-хлортритильну смолу. Зняття захисних fmoc-груп проводилося за допомогою розчину піперидину DMF.

Дуже важливим у процесі синтезу є посадка першої амінокислоти на смолу. Два грами 2Cl-Trt-ї смоли насипали в шприц об'ємом 10 мл. Набирали DMF у шприц, давали набухнути смолі протягом 15 хв. Після цього DMF вимивався. Потім шприц набирався розчин першої амінокислоти (fmoc-Pro) і активатор реакції (DIPEA) у співвідношенні 1СМОЛА/1,2FMOC-PRO/4DIPEA. Реакція посадки першої амінокислоти йшла 3 год. Дуже важливою умовою проведення синтезу є відсутність вільних лінкерів після посадки першої амінокислоти, тому смолу після зв'язування з першою амінокислотою обробляли сумішшю метилену, DIPEA (диизопроилэтиламин) і DMF у співвідношенні 80DMF/1 вільних кінців. Після цього промивали DMF смолу 5 разів по 5 хв. Потім проводили деблокування амінокислот 30%-ним розчином піпередину DMF 8 разів по 5 хв. Після цього смолу промивали DMF 5 разів по 5 хв. Цей цикл повторювався протягом усього синтезу пептиду. Після кожного кроку приєднання та деблокування амінокислот контроль ходу реакції перевірявся Кайзер тестом, що є реакцією нінгідрину з вільною аміногрупою з утворенням характерного темно-синього кольору. Завдяки цьому тесту став можливим покроковий контроль реакцій посадки та деблокування амінокислот.

Очищення та контроль синтезованого пептиду № 7 були проведені на 2-х компонентній препаративній системі ВЕРХ фірми Waters (USA). Для введення зразка використовувався інжектор Rheodyne об'ємом петлі 500 мкл. Детектування проводилося у діапазоні 190-360 нм. Ми використовували колонку "Symmetry Si-100 C18" (4,6х250 mm) для обернено-фазової ВЕРХ. Швидкість потоку була 50 мл/хв. Використовувалася градієнтна система елюентів H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1). Час аналізу 15 хв. Рехроматографію проводили на аналітичній системі HPLC Knauer. Використовувалася стовпчик XbridgeC18 (2.6x150 mm). Детектування проводили за 214 нм.

Для підтвердження отриманих даних синтезований препарат був підданий мас-спектрального аналізу на CSU "Analitycal spectrometry".

Результати та обговорення. Дані, одержані на хроматограмі, дозволяють стверджувати, що чистота синтезованого пептиду №7 після очищення становить понад 99,6% (рис.1).

–  –  –

Нами було проведено порівняльний хроматографічний аналіз нативного пептиду №7 на колонці X-bridgeC18 у тих самих умовах, що його синтезований аналог. Результати порівняння представлені (рис. 2).

Твердофазний синтез кардіоактивного пептиду, виділеного з передсердь свині

–  –  –

Мал. 4. Спектрограми синтезованого (А) та нативного (В) препаратів.

Г.С. ЧАІЛЯН Як видно з порівняння хроматограм, синтезований аналог і нативний пептид № 7 однакові за масою та часом виходу, що говорить про ідентичність їх структур та амінокислотну послідовність. Таким чином, використовуючи метод твердофазного синтезу пептидів та враховуючи особливості будови досліджуваного пептиду, нам вдалося отримати гомогенний та ідентичний нативний пептид, що складається з 9 амінокислот. Надалі, маючи достатню кількість препарату, ми плануємо провести низку біотестів щодо виявлення не тільки шляхів регуляції серцевої діяльності цим пептидом, а й механізмів дії на інші органи та системи.

ЛІТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапіонян Р.М., Галоян А.А. Виявлення та ідентифікація у серці бика нових 1.

кардіоактивних білків. Зап. мед. хімії, 37, 2, с. 56-58, 1991.

Срапіонян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Виділення та характеристика 2.

кардіоактивного триптичного фрагмента білка-носія нейрогормону "С" Нейрохімія, 2, 3, с. 263-271, 1983.

Срапіонян, Р.М. Місірян, С.С. Поділ низькомолекулярних коронароактивних сполук 3.

серцевого м'яза поєднанням методів гелевої фільтрації та електрофорезу в поліакриламідному гелі Біолог. журн. Вірменії, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапіонян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Розподіл кардіоактивних білкових комплексів у серці різних тварин. Біолог. журн. Вірменії, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Галояна А. Регулювання невросекреції та Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Біохімічні Novel Cardioactive Hormones and Immunomodulators of Functional System Neurosecretory Hypothalamus, Endocrine Heart. Nauka Publ. p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Пуралізація коронародилаторних proteínів ізолюється від hypothalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March's advanced organic chemistry. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, pp. 133, 2007.

–  –  –

Схожі роботи:

« СПІЛЬНИЦТВ ВИДАВНИЦТВО «НАУКА» Москва 1979 УДК 581.55:56.017 Пліт н і к о · В. В. Еволюція структури рослинних угруповань. М: Наука, с. 1979, 276 На сучасній мет ... »

«Известия Музейного Фонду ім. А.А.Браунера №2 Том I 2004 Вісті Музейного Фонду ім. А. А. Браунера Том I № 2 2004 Науковий журнал Заснований у грудні 2003 р. Виходить 4 рази на рік Свідоцтво про державну реєстрацію ОД № 913 від 13.12.2003 р. Засновник та вида...»

Винахід відноситься до твердофазного способу синтезу пептиду формули H-D-Nal-Thr-NH 2 , в якому використовуються і Вос-захищені, і Fmoc-захищені амінокислоти і смола з хлорметилированного полістиролу. 10 з.п. ф-ли.

Область техніки, до якої належить винахід

Даний винахід відноситься до способу приготування пептиду, що містить три або більше амінокислотних залишків, що має N-кінцеву амінокислоту, передостанню амінокислоту, прилеглу до N-кінцевої амінокислоти, і С-кінцеву амінокислоту.

Попередній рівень техніки

Твердофазний синтез пептидів був введений у 1963 р. з метою подолати багато проблем проміжних стадій очищення, пов'язаних із синтезом пептидів у розчині (Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). При твердофазному синтезі амінокислоти збираються (наприклад, з'єднуються) в пептид будь-якої необхідної послідовності, тоді як один кінець ланцюга (наприклад, С-кінець) закріплений на нерозчинному носії. Як тільки носії (підкладці) зібрана потрібна послідовність, пептид після цього деблокують (тобто відщеплюють) з носія. Двома стандартними захисними групами для -аміногруп амінокислот, що з'єднуються, є Вос, яку видаляють сильною кислотою, і Fmoc, яку видаляють основою. Даний винахід відноситься до зручного способу виробництва пептидів з використанням комбінації обох цих захистів -аміногруп в одному синтезі на недорогій смолі з хлорметилированного полістиролу.

При розробці синтезу пептидів твердофазним способом з використанням будь-якої із зазначених вище схем захисту -аміногруп важливо, щоб будь-які реакційно-здатні «бічні групи» складових пептид амінокислот були в ході складання ланцюга захищені від небажаних хімічних реакцій. Бажано також, щоб вибрані для захисту різних бічних груп хімічні групи не видалялися реагентами, що використовуються для зняття захисту з аміногруп. По-третє, важливо, щоб зв'язок зростаючого пептидного ланцюга з часткою смоли була стійка до дії реагентів, що використовуються в процесі складання ланцюга для видалення будь-яких типів захисту -аміногруп. У випадку схеми захисту -аміногруп з використанням Fmoc, захист бічних груп повинен бути стійким до дії лужних реагентів, що використовуються для видалення Fmoc. Насправді ці захисні групи для бічних ланцюгів зазвичай видаляють слабо кислотними реагентами після завершення складання пептидної ланцюга. Якщо використовується схема захисту -аміногруп з використанням ВОС, захист бічних груп має бути стійким до дії слабо кислотного реагенту, що використовується для зняття групи ВОС у кожному циклі. На практиці ці захисні групи для бічних ланцюгів у схемі захисту -аміногруп за допомогою Вос зазвичай видаляють безводним HF після завершення складання пептидного ланцюга. Таким чином, на практиці повсюдно використовуються для захисту бічних ланцюгів групи у схемі із захистом -аміногруп за допомогою Fmoc нестабільні в умовах, що використовуються для зняття з -аміногруп захисних груп Вос. Тому два типи схем захисту -аміногруп при складанні пептидного ланцюга у твердофазному синтезі пептидів не поєднують. Крім того, хоча застосовувану в пептидному синтезі найбільш дешеву полімерну смолу (хлорметильований полістирол або «смола Мерифілда») широко використовують разом з амінокислотами, захищеними групами Вос, у літературі зроблено висновок, що вона не застосовна у разі захисту -аміногруп групами Fmoc через її нестабільності в лужних умовах (див. Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). Даний винахід націлений на спосіб спільного використання в ході твердофазного синтезу деяких пептидів і Вос-захищених, і Fmoc-захищених амінокислот на смолі Мерифілда.

Відомо, що Lanreotide®, який є аналогом соматостатину, пригнічує вивільнення гормону росту, а також пригнічує секрецію інсуліну, глюкагону та екзокринну панкреатичну секрецію.

Патент США № 4853371 розкриває та заявляє Lanreotide®, спосіб його отримання та спосіб інгібування секреції гормону росту, інсуліну, глюкагону та екзокринної панкреатичної секреції.

Патент США №5147856 розкриває застосування Lanreotide® для лікування рестенозу.

Патент США №5411943 розкриває застосування Lanreotide® для лікування гепатоми.

Патент США №5073541 розкриває застосування Lanreotide® для лікування раку легень.

Заявка на патент США № 08/089410, зареєстрована 9 липня 1993 р., розкриває застосування Lanreotide® для лікування меланоми.

Патент США № 5504069 розкриває застосування Lanreotide® для пригнічення прискореного росту твердої пухлини.

Заявка на патент США № 08/854941, зареєстрована 13 травня 1997 р., розкриває застосування Lanreotide® для зниження ваги тіла.

Заявка на патент США № 08/854943, зареєстрована 13 травня 1997 р., розкриває застосування Lanreotide® для лікування стійкості до інсуліну та синдрому X.

Патент США №5688418 розкриває застосування Lanreotide® для продовження життєздатності панкреатичних клітин.

Заявка РСТ PCT/US 97/14154 розкриває застосування Lanreotide® для лікування фіброзу.

Заявка на патент США № 08/855311, зареєстрована 13 травня 1997 р., розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперліпідемії.

Заявка на патент США № 08/440061, зареєстрована 12 травня 1995 р., розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперамілінемії.

Заявка на патент США № 08/852221, зареєстрована 7 травня 1997 р., розкриває застосування Lanreotide® для лікування гіперпролактинемії та пролактином.

Сутність винаходу

Даний винахід надає спосіб приготування пептиду, що містить три або більше амінокислотних залишків, що має N-кінцеву амінокислоту, передостанню амінокислоту, прилеглу до N-кінцевої амінокислоти, і С-кінцеву амінокислоту, причому зазначений спосіб включає наступні етапи:

(а) прикріплення першої амінокислоти до твердого носія - смолі - ефірного зв'язку з утворенням продукту першого приєднання, що включає (i) проведення реакції водного розчину карбонату цезію зі спиртовим розчином першої амінокислоти з утворенням цезієвої солі першої амінокислоти, (ii) одержання вільної від розчинника цезієвої солі першої амінокислоти, (iii) проведення реакції твердого носія смоли з цезієвою сіллю першої амінокислоти в сухому (безводному) полярному апротонному розчиннику з утворенням продукту першого приєднання,

де перша амінокислота відповідає С-кінцевій амінокислоті пептиду, аміногрупа небокового (основного) ланцюга першої амінокислоти блокована Воc, і перша амінокислота не має в бічному ланцюгу функціональної групи, для якої потрібен захист, і твердий носій - смола - являє собою смолу з хлор;

(б) зняття захисту (деблокування) З продукту першого приєднання кислотою з утворенням деблокованого продукту першого приєднання;

(в) на розсуд, приєднання до деблокованого продукту першого приєднання наступної амінокислоти, що включає проведення реакції наступної амінокислоти з деблокованим продуктом першого приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду, з отриманням блокованого (захищеного) продукту наступного приєднання, причому в основному ланцюзі аміногрупу, блоковану Воc, і якщо наступна амінокислота має одну або кілька функціональних груп в бічній ланцюгу, тоді функціональні групи в бічній ланцюгу не вимагають захисту або функціональні групи в бічній ланцюгу мають захисні групи, які стійкі до кислотних або лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту відповідно Воc та Fmoc;

(г) зняття захисту з блокованого продукту наступного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту наступного приєднання з кислотою з отриманням деблокованого продукту наступного приєднання;

(д) на розсуд, повторення етапів (в) і (г), причому в кожному циклі утворюється деблокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання, де Х - номер необхідного повторення циклу;

(е) приєднання наступної амінокислоти до деблокованого продукту першого приєднання з етапу (б) або, на розсуд, до деблокованого продукту (Х+1)-го наступного приєднання з етапу (д), що включає проведення реакції наступної амінокислоти із зазначеним продуктом першого приєднання або з зазначеним деблокованим продуктом (Х+1)-го наступного приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду з отриманням блокованого (захищеного) продукту наступного приєднання, причому наступна амінокислота має блоковану Fmoc аміногрупу основного ланцюга, за умови, що якщо має одну або кілька функціональних груп в бічній ланцюгу, тоді функціональні групи в бічній ланцюгу не вимагають захисту або функціональні групи в бічній ланцюга мають захисні групи, які стійкі до лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту Fmoc;

(ж) зняття захисту Fmoc з блокованого продукту наступного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту наступного приєднання з первинним або вторинним аміном, щоб отримати деблокований продукт наступного приєднання;

(з) на розсуд, повторення етапів (е) і (ж), причому в кожному циклі утворюється деблокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання, де Х - номер необхідного повторення циклу, доки не буде включена в пептид і деблокована передостання амінокислота;

(і) приєднання N-кінцевої амінокислоти до деблокованого продукту (Х+1)-го наступного приєднання, що включає проведення реакції N-кінцевої амінокислоти з деблокованим продуктом (Х+1)-го наступного приєднання в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду , з отриманням блокованого продукту завершеного приєднання, де N-кінцева амінокислота має аміногрупу основного ланцюга, блоковану Вос або Fmoc;

(й) зняття захисних груп Воc або Fmoc з блокованого продукту завершеного приєднання, що включає проведення реакції блокованого продукту завершеного приєднання з кислотою у разі Вос або з основою у випадку Fmoc з утворенням завершеного пептидного продукту на смолі;

(к) якщо на завершеному пептидному продукті на смолі є функціональні групи бічних ланцюгів, тоді, на розсуд, зняття захисту функціональних груп бічних ланцюгів завершеного пептидного продукту на смолі, що включає проведення реакції завершеного пептидного продукту на смолі з відповідними реагентами, що знімають захист з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі зі знятим захистом; і

(l) відщеплення пептиду від твердого носія смоли у складі завершеного пептидного продукту на смолі або завершеного пептидного продукту на смолі зі знятим захистом з отриманням пептиду, що включає проведення реакції завершеного пептидного продукту на смолі або завершеного пептидного продукту на смолі зі знятим захистом первинним аміном або вторинним аміном до практичного завершення відщеплення пептиду від смоли;

за умови, що етапи (е) та (ж) у синтезі пептиду повинні бути здійснені щонайменше один раз.

Переважним є спосіб згідно з цим винаходу, де аміак, первинний амін або вторинний амін в етапі (л) знаходяться в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник,

Переважним є спосіб згідно з цим винаходу, де етап (л) додатково включає наступні етапи:

осадження відщепленого пептиду з розчинника;

відділення фільтруванням твердого носія смоли та осадженого пептиду та

екстрагування пептиду кислотним розчином виділення пептиду.

Переважним є спосіб згідно з цим винаходу, де перша амінокислота являє собою Boc-L-Thr.

Переважним є спосіб згідно з цим винаходу, де перша амінокислота являє собою цезієву сіль Boc-L-Thr, що дає як продукт першого приєднання Boc-L-Thr-смолу, а деблокованим продуктом першого приєднання є H-L-Thr-смола.

Переважним є спосіб згідно з цим винаходу, де кислотою, яка використовується для видалення захисної групи Воc в етапі (й), є трифтороцтова кислота (ТФУ).

Переважним способом, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де органічним розчинником є ​​метилен-хлорид, хлороформ або диметилформамід, а реагентом для нарощування пептиду є діізопропіл-карбодіїмід, дициклогексил-карбодіімід або N-етил-N"-(3-диметил- амінопропіл)карбодіімід.

Переважним способом, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, що включає проведення етапів (е) і (ж) шість разів після утворення деблокованого продукту першого приєднання формули H-L-Thr-смола, де наступні амінокислоти приєднуються в порядку: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) та Fmoc-L-Cys(Acm) з утворенням продукту Н-Cys( Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Переважним способом, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, що включає приєднання Boc-D-Nal до H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm) -Tnr-смоле згідно з етапом (в) з отриманням Boc-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Сys(Аст)-Thr-смоли.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає одночасне зняття групи Воc, що захищає D-Nal, групи O-t-Bu, що захищає Тyr, і групи Воc, що захищає Lys в Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr( O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолі згідно з етапом (і), з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі формули H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає відщеплення пептиду H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr від твердої смоли шляхом проведення реакції H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смоли з аміаком у розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник, до практично повного відщеплення з отриманням H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

Переважним способом, що стосується безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де спиртом є метанол, а полярний апротонний розчинник - це диметилформамід.

Переважний спосіб, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, включає одночасне видалення груп Асm, що захищають Сys, і циклізацію залишків Cys, що виходять, зі знятим захистом в завершеному пептидному продукті формули H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val -Сys(Асm)-Thr-NH 2 шляхом проведення реакції H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 з розчином йоду в спирті до практично повних зняття захисту та циклізації з отриманням H-D--Nal--Thr-NH 2 .

Переважним способом, що відноситься до безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де пептид являє собою H-D-Nal-Thr-NH 2 .

Переважним способом, що стосується безпосередньо попереднього способу, є спосіб, де пептид є аналогом соматостатину.

Терміни, використані в описі цього винаходу, визначаються таким чином:

«перша амінокислота»: охоплює будь-яку амінокислоту, у якої в основному ланцюзі (не в бічній) аміногрупа захищена Воc, яка є комерційним продуктом або може бути синтезована згідно з методами, відомими фахівцю із звичайним досвідом у даній галузі, наприклад Boc-L-Thr;

«продукт першого приєднання»: описує продукт, який прикріплений до твердого носія - смолі, що є результатом приєднання першої амінокислоти до твердого носія - смоли, наприклад Boc-L-Thr-смола;

«деблокований продукт першого приєднання»: описує продукт, що є результатом видалення або зняття групи Воc з продукту першого приєднання - наприклад, H-L-Тhr-смола, де Н є доступний водень аміногрупи основного ланцюга, що з'являється в результаті етапу деблокування;

"наступна амінокислота": описує будь-яку амінокислоту, у якої в основному ланцюгу аміногрупа захищена Воc або Fmoc, яка є комерційним продуктом або може бути синтезована згідно з методами, відомими фахівцю зі звичайним досвідом у даній галузі. Оскільки етап (в) і етап (е) можуть входити в цикл, що повторюється, де етап здійснюється більше одного разу, кожен раз при здійсненні етапу (в) або етапу (е) «наступна амінокислота» може бути незалежно обрана з групи відомих або можуть бути синтезованими амінокислотами, у яких в основному ланцюгу аміногрупа захищена Воc або Fmoc;

"блокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання": описує продукт, приєднаний до твердого носія смолі, який є результатом з'єднання наступної амінокислоти з "деблокованим продуктом наступного приєднання". Оскільки етапи (в) і (г) і етапи (е) і (ж) можуть входити в цикл, що повторюється, де можуть бути приєднані наступні амінокислоти, термін «блокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання» відноситься до продукту, одержуваного внаслідок кожного з попередніх циклів приєднання;

"деблокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання": описує продукт, що є результатом зняття групи Fmoc з "блокованого продукту (Х+1)-го наступного приєднання";

«завершений пептидний продукт на смолі»: описує пептидний продукт, прикріплений до твердого носія смоли після того, як до пептидного ланцюга була приєднана N-кінцева амінокислота, і після того, як знято або деблоковано захист з аміногрупи основного ланцюга N-кінцевої амінокислоти, але який ще має будь-які захисні групи на функціональних групах бічних ланцюгів, не видалені реакцією, що здійснює зняття захисної групи з основного ланцюга N-кінцевої амінокислоти; і

«завершений пептидний продукт на смолі зі знятим захистом»: описує пептидний продукт, прикріплений до твердого носія - смолі, де було видалено або знято всі захисні групи з функціональних груп бічних ланцюгів амінокислот.

Прикладами кислот, які можна використовувати для зняття захисту, є трифтороцтова кислота (ТФУ), метансульфонова кислота і органічні розчини, що містять НСl.

Прикладами первинних та вторинних амінів, які можуть бути використані для зняття захисту Fmoc, є 4-(амінометил)піперидин, піперидин, діетиламін, DBU та трис(2-аміноетил)амін.

Прикладами ненуклеофільних основ, які можна використовувати для нейтралізації солей ТФУ звільнених аміногруп (RNH 3 + CF 3 COO - , ці солі повинні бути перетворені на «вільні» аміни (NH 2) до або в ході приєднання наступної амінокислоти, інакше є приєднання діізопропілетиламін (ДІЕА) та триетиламін (ТЕА).

Прикладами органічних розчинників, які можуть бути використані в реакціях приєднання амінокислот, є метилен-хлорид, хлороформ, дихлоретан, диметилформамід, діетилацетамід, тетрагідрофуран, етилацетат, 1-метил-2-піролідон, ацетонітрил або комбінація цих розчинників.

Приклади агентів для нарощування пептидів включають заміщені карбодііміди, такі як: діізопропіл-карбодіїмід, дициклогексил-карбодіїмід або N-етил-N"-(3-диметил-амінопропіл)карбодіімід.

Карбоксильні групи та аміногрупи, які беруть участь в утворенні пептидного амідного зв'язку, називають відповідно карбоксильною групою або аміногрупою «небокового (основного) ланцюга». З іншого боку, будь-які функціональні групи амінокислоти, які не беруть участь в утворенні пептидного амідного зв'язку, називають функціональними групами «бічного ланцюга».

Термін «стійка до дії основ група» відноситься до захисних груп, що використовуються для захисту функціональних груп амінокислот, які (1) стійкі до дії основ, наприклад, не можуть бути видалені основами, такими як 4-(аміноетил)піперидин, піперидин або трис(2 -аміноетил)амін, які є основами, які зазвичай використовуються для видалення захисної групи Fmoc, і (2) можуть бути видалені кислотою, такою як трифтороцтова кислота, або іншим способом, таким як каталітична гідрогенізація.

Символи «Fmoc» і «Воc» використані тут і в формулі, що додається, для позначення відповідно 9-флуореніл-метоксикарбонілу і трет-бутил-оксикарбонілу.

Описаний вище спосіб може бути застосований для приготування пептидів, переважно аналогів соматостатину, таких як октапептид Lanreotide®, який має таку формулу: H-D-Nal-Thr-NH 2 . Якщо потрібно синтезувати H-D-Nal-Thr-NH 2 , стійкими до дії основ захисними групами, що використовуються для захисту функціональних груп бічних ланцюгів Cys, Lys і Тyr, можуть бути відповідно ацетамідометил (Асm), Воc і трет-бутил. Асm кращий для Cys.

Під аналогом соматостатину мається на увазі пептид, який виявляє біологічну активність, подібну (тобто агоніст) чи протилежну (тобто антагоніст) активності соматостатину.

У формулі H-D-Nal-Thr-NH 2 кожен із звичайних трилітерних символів амінокислот (наприклад, Lys) відноситься до структурного залишку амінокислоти. Наприклад, символ Lys у наведеній вище формулі являє -NН-СН((СН 2) 4 NН 2)-ЗІ-. Символ D-Nal являє амінокислотний залишок D-2-нафтилаланіліл. Дужки позначають дисульфідний зв'язок, що з'єднує вільні тіоли двох залишків Cys в пептиді, це вказує на те, що амінокислоти пептиду всередині дужок утворюють цикл.

На підставі наведеного тут опису фахівець у даній галузі зможе найбільш повною мірою використовувати даний винахід.

Якщо не визначено інше, всі використані тут технічні та наукові терміни мають те саме значення, яке зазвичай розуміють фахівці зі звичайним рівнем підготовки в галузі, до якої відноситься даний винахід. Крім того, всі публікації, патентні заявки, патенти та інші наведені тут висипки включені сюди посиланням на них.

Пептид може бути приготовлений відповідно до способу цього винаходу згідно з наступною процедурою.

Розчин 0,5 молярних еквівалентів карбонату цезію у воді повільно додають до розчину 1 молярного еквівалента Вос-АА 1 (Bachem California, Torrance, СА), де АА 1 відповідає С-кінцевій амінокислоті, розчиненої в спирті, переважно метанолі. Отриману суміш перемішують протягом близько 1 години при кімнатній температурі, потім весь спирт і всю воду видаляють при зниженому тиску, отримуючи сухий порошок цезієвої солі Вос-АА 1 . Смолу Мерифілда, 1,0 еквівалент (хлорметилований полістирол, 200-400 меш, включення іонів хлору 1,3 мекв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky або Polymer Laboratories, Church Stretton, England) промивають хлорованим розчином ДХМ), спиртом, переважно метанолом, та полярним апротонним розчинником, переважно диметилформамідом (ДМФ). Порошок цезієвої солі Вос-АА 1 розчиняють у безводному (сухому) полярному апротонному розчиннику, переважно ДМФ, і об'єднують розчин з попередньо промитою смолою. Кашку акуратно перемішують при приблизно 45°-65°С, переважно при 50°-60°С, приблизно від 48 до 106 год, переважно від 85 до 90 год, в інертній атмосфері - такий як азот. Смолу відокремлюють фільтруванням і ретельно промивають полярним апротонним розчинником, переважно ДМФ, водою та остаточно спиртом - таким як МеОН. Вос-АА 1 -смолу сушать при зниженому тиску.

Вос-АА 1 -смолу вносять у скляний реактор з фільтруючим дном із великопористого сплавленого скла. Смолу промивають хлорованим розчинником - таким як ДХМ, деблокують органічною кислотою, переважно 25% ТФУ в ДХМ, короткочасно промивають хлорованим розчином - таким як ДХМ, і спиртом - таким як МеОН, нейтралізують органічною основою, переважно триетиламіном в ДХМ, і знову полярним апротонним розчинником - таким як ДМФ, отримуючи AA 1 -смолу зі знятим захистом.

Потім до АА 1 -смолі зі знятим захистом на розсуд приєднують будь-яку необхідну кількість амінокислот. Якщо наступна амінокислота має -аміногрупу із захистом Fmoc (Fmoc-AA x), тоді групі бічного ланцюга або не потрібний захист (це, наприклад, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe або Fmoc-Thr), або бічне ланцюг необхідно захистити групою, стійкою до дії основи. Молярний надлишок Fmoc-AA x (де х - номер положення амінокислоти в пептиді, що відраховується від С-кінця) приєднують протягом приблизно 60 хв до АА 1 -смоле зі знятим захистом за допомогою реагенту для нарощування пептиду - такого як діізопропілкарбодімід (ДІК) у суміші ДХМ/ДМФ. Смолу з приєднанням промивають ДМФ, спиртом та ДХМ, отримуючи Fmoc-АА x -АА 1 -смолу. Прикріплення можна перевірити нінгідриновим методом Кайзера. Потім Fmoc-AA x -АА 1 -смолу промивають один раз ДМФ і після цього деблокують розчином основи в органічному розчиннику, такому як піперидин в ДМФ, отримуючи АА x -АА 1 -смолу. Потім AA x -АА 1 -смолу промивають ДМФ, після чого кілька разів промивають спиртом, таким як МеОН, і ДХМ. Після цього AA x -АА 1 -смолу промивають один раз ДМФ протягом приблизно 3 хв, три рази ізопропанолом, переважно кожного разу протягом приблизно 2 хв, і три рази ДХМ, переважно кожного разу протягом приблизно 2 хв. Після цього смола готова для подальшого приєднання амінокислоти, захищеної Fmoc, як описано вище, або амінокислоти, захищеної Воc, як описано далі.

Подібним чином, якщо будь-яка підлягає приєднанню до АА 1 -смолі зі знятим захистом наступна амінокислота обрана із захищеною Воc -аміногрупою (Вос-АА x), тоді або для групи бічного ланцюга не потрібний захист (це можуть бути Boc-Gly, Boc- Ala, Boc-Phe або Boc-Thr), або бічний ланцюг повинен бути захищений групою, стійкою до видалення та кислотою, і основою - це може бути Boc-Cys(Acm). Якщо вибрано Вос-АА x , її приєднують за допомогою таких же реагентів і розчинників, як в описаному вище випадку для Fmoc-амінокислот, і повноту (завершення) приєднання можна перевірити нінгідриновим методом Кайзера. Після цього з Вос-АА x -АА 1 -смоли знімають захист розчином кислоти в органічному розчиннику - таким як ТФУ в ДХМ, отримуючи CF 3 CO - H + -AA x -АА 1 -смолу. Потім цю смолу кілька разів промивають хлорованими розчинниками, такими як ДХМ, спиртом, таким як МеОН, і нейтралізують ненуклеофільною основою, такою як триетиламін в ДХМ, після чого промивають ще кілька разів хлорованим розчинником, таким як ДХМ, одержуючи АА x -АА 1 - смолу. Після цього смола готова для подальшого приєднання захищеної Воc або Fmoc амінокислоти, як описано вище.

Залежно від необхідної послідовності пептиду і типу використаної амінокислоти із захищеною -аміногрупою (або із захистом Fmoc, або із захистом Воc) використовують відповідну комбінацію описаних вище процедур приєднання, залежно від того, яка амінокислота повинна зайняти місце в пептидній послідовності - з бічним ланцюгом , Що має захисну групу, яку можна видалити або основою, необхідною для зняття Fmoc з -аміногрупи, або кислотою, необхідною для зняття Воc з -аміногрупи. Такою захищеною амінокислотою може бути N-Boc-N"-Fmoc-лізин або N-Fmoc-N"-Вос-лізин. Якщо це має місце, всі вибираються захисні групи для -аміногруп наступних амінокислот, аж до N-кінцевої амінокислоти, повинні бути сумісними з обраним для цього положення захистом бічної групи. Це означає, що захисні групи бічних ланцюгів повинні бути стійкими до деблокуючого агента, що використовується для зняття захисту з -аміногруп наступних амінокислот. Для N-кінцевої амінокислоти як захист -аміногрупи можна використовувати або Воc, або Fmoc, так як зняття захисту з N-кінцевої амінокислоти може одночасно зняти захист з деяких із захищених бічних ланцюгів без небажаного впливу на стратегію синтезу пептиду, оскільки ніякі амінокислоти більше не додаються.

З завершеного пептидного ланцюга, який ще прикріплений до смоли, повинен бути знятий захист і він повинен бути деблокований. Щоб видалити всі стійкі до дії основ захисні групи та групу, що блокує -аміногрупу N-кінцевої амінокислоти, якщо вони застосовні, пептид на смолі обробляють кислотою в органічному розчиннику - такої як ТФУ в ДХМ. Щоб видалити всі стійкі до дії кислоти захисні групи та групу, що блокує -аміногрупу N-кінцевої амінокислоти, якщо вони застосовні, пептид на смолі обробляють органічною основою - таким як піперидин у ДМФ. Або ж стійкі до кислоти групи можна залишити до видалення при подальшому відщепленні пептиду аміаком або амінною основою. Потім пептид на смолі зі знятим захистом промивають хлорованим розчинником - таким як ДХМ, спиртом - таким як МеОН, і сушать до постійної ваги при зниженому тиску.

Пептид відщеплюють від смоли і С-кінець переводять в амід, суспендуючи пептид на смолі у суміші 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензію охолоджують до температури приблизно нижче 10°С в атмосфері азоту і під поверхню розчинника вводять безводний газоподібний аміак до насичення ним розчину, при цьому підтримують температуру нижче приблизно 10°С. Кашку акуратно перемішують протягом приблизно 24 год, дозволяючи при цьому температурі підвищитися до приблизно 20°С. Ступінь завершення реакції перевіряють за зникненням метил-ефірного проміжного з'єднання у ВЕРХ за відповідних умов, що залежать від типу пептиду. Реакційну суміш охолоджують і додають необхідну кількість безводного аміаку, поки при ВЕРХ площа піку, відповідного метилового ефіру, не стане менше 10% площі піку цільового продукту. Кашку охолоджують до температури нижче приблизно 10°С і продовжують перемішування протягом ночі для осадження пептиду. Осад і смолу відокремлюють фільтруванням та промивають холодним МеОН. Осад і смолу сушать при зниженому тиску, продукт екстрагують із смоли водним розчином оцтової кислоти.

Якщо пептид у своїй послідовності містить захищені залишки Сys, захист з тіольних груп можна зняти та циклізувати залишки згідно з наступною процедурою. Пептид, що містить захищені Асm групи Cys, розчиняють у водному розчині оцтової кислоти в атмосфері азоту. Розчин швидко перемішують та додають в одній порції розчин йоду у спирті. Суміш перемішують і перевіряють за допомогою ВЕРХ повноту зняття захисту. Потім реакцію зупиняють титруванням 2% розчином натрію тіосульфату до зникнення забарвлення розчину. Неочищену суміш піддають очищенню за допомогою препаративної хроматографії на патроні С8 з градієнтом ацетонітрилу в 0,1 буфері ацетату амонію, знесолюють на патроні С8 з градієнтом ацетонітрилу в 0,25 н оцтовій кислоті та ліофіліз.

Приклад здійснення винаходу

Наступний приклад наведено для того, щоб проілюструвати спосіб згідно з цим винаходу, і він не повинен розглядатися як обмеження його охоплення.

Приклад 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2

А) Boc-L-Thr-смола

Розчин 2,58 г карбонату цезію 2,5 мл води повільно додавали до розчину 3,48 г Boc-L-треоніну (Bachem California, Torrance, СА), розчиненого в 7 мл метанолу. Отриману суміш перемішували протягом приблизно 1 години при кімнатній температурі, потім видаляли весь метанол і всю воду при зниженому тиску, одержуючи сухий порошок цезієвої солі Boc-L-треоніну. 10 г смоли Мерифілда (хлорметильований полістирол, 200-400 меш, включення хлору 1,3 мекв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) промили дихлорметаном (ДХМ), метанолом (МеОН) та диметилформамідом (ДМФ) (кожним мл). Порошок цезієвої солі Boc-L-треоніну розчинили в 60 мл сухого ДМФ і об'єднали розчин з промитою, як зазначено вище, смолою. Кашку акуратно перемішували при температурі приблизно 50°-60°С протягом приблизно від 85 до 90 год в атмосфері азоту. Смолу відокремили фільтруванням і ретельно промили ДМФ, деіонізованою водою та насамкінець МеОН. Смолу з Вос-треоніном сушили при зниженому тиску приблизно 40°С. Включення треоніну склало 0,85±0,15 мекв/г сухої смоли.

Б) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола

2,0 г смоли з Вос-треоніном з етапу (А) внесли в скляний реактор об'ємом 50 мл з дном-фільтром з великопористого сплавленого скла (завантаження 1,74 ммоль). Смолу промили 2 рази ДХМ (20 мл), щоразу протягом приблизно 5 хв, деблокували 25% ТФУ в ДХМ (30 мл) - перший раз протягом приблизно 2 хв і вдруге протягом приблизно 25 хв, промили 3 рази протягом приблизно 2 хв ДХМ (20 мл), ізопропанолом (20 мл) та ДХМ (20 мл), нейтралізували двічі протягом близько 5 хв 10% розчином триетиламіну в ДХМ (20 мл), промили 3 рази протягом приблизно 2 хв ДХМ і промили один раз ДМФ (20 мл) протягом 5 хв.

До деблокованої смоли додали 1,8 г (4,35 ммоль, 2,5 екв.) Fmoc-L-цистеїну(Асm) (Bachem, СА) та 683 мкл (4,35 ммоль, 2,5 екв.) диізопропіл- карбодііміду (ДІК) в 14 мл суміші 2:1 ДХМ/ДМФ приблизно на 1 год. Після приєднання смолу промили 1 раз протягом близько 3 хв ДМФ (20 мл), 3 рази протягом близько 2 хв ізопропанолом і 3 рази протягом близько 2 хв ДХМ (20 мл). Зв'язування перевірили нігідриновим методом Кайзера.

Після приєднання смолу промили 1 раз ДМФ і потім деблокували розчином піперидину в ДМФ. Потім деблоковану смолу з приєднанням промили ДМФ і кілька разів МеОН і ДХМ одночасно. Смолу з приєднанням промили 1 раз протягом близько 3 хв ДМФ (20 мл), 3 рази протягом близько 2 хв ізопропанолом (20 мл) і 3 рази ДХМ (20 мл) протягом близько 2 хв щоразу. Зв'язування перевірили нінгідриновим методом Кайзера.

Кожну з наступних захищених амінокислот приєднували до промитої смоли, використовуючи ДІК у суміші ДМФ/ДХМ, і деблокували, як описано вище, в наступній послідовності: Fmoc-L-валін, Fmос-L-лізин(Вос), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин(О-t-Bu) та Fmос-L-цистеїн(Асm) (усі від фірми Bachem California), Boc-D-2-нафтилаланін (Synthethech, Albany, OR).

З завершеного пептидного ланцюга знімали блокування та захист двічі сумішшю 75:20:5 ДХМ/ТФУ/анізол (30 мл) протягом близько 2 хв і близько 25 хв, промили 3 рази протягом близько 2 хв щоразу ДХМ (20 мл), ізопропанолом (10 мл) та ДХМ (20 мл), нейтралізували 2 рази протягом близько 5 хв 10% розчином триетиламіну в ДХМ (20 мл) та промили 3 рази протягом близько 2 хв ДХМ (20 мл) та МеОН (20 мл) . Смолу сушили при зниженому тиску. Суха вага дорівнював 3,91 г (103% від теоретичного виходу).

B) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

2,93 г навантаженої пептидом смоли з етапу (Б) (1,3 ммоль-екв.) суспендували в 50 мл суміші 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензію охолодили до температури приблизно нижче 10°С в атмосфері азоту і продували сухий газоподібний аміак до насичення ним розчину, при цьому підтримували температуру нижче приблизно 10°С. Кашку акуратно перемішували протягом приблизно 24 год, дозволяючи температурі підвищитися до приблизно 20°С. Ступінь завершення реакції перевіряли за зникненням метил-ефірного проміжного з'єднання за допомогою ВЕРХ (сорбент VYDAC®, розмір зерен 5 мкм, розмір пор 100 Å, С18, елюювання в ізократичних умовах 26% CH 3 CN 0,1% ТФУ, швидкість 1 мл /хв, реєстрація при 220 мм; в цих умовах час ретардації Rt ~ 14 хв для метилового ефіру та ~ 9,3 хв для амідного продукту). Реакційну суміш охолоджували і додавали надлишок безводного аміаку, поки при ВЕРХ площа піку, відповідного метилового ефіру, не стала менше 10% площі піку цільового продукту. Кашку охолодили до температури приблизно нижче 10°С, перемішування продовжували протягом ночі для осадження пептиду. Осад і смолу відокремили фільтруванням та промили 15 мл холодного МеОН. Осад і смолу висушили при зниженому тиску, продукт екстрагували зі смоли 50% водним розчином оцтової кислоти (3 порції 30 мл). Аналіз методом ВЕРХ показав наявність у суміші 870 мг (0,70 ммоль) титульного продукту (96% чистота в ізократичній системі ВЕРХ).

Г) H-D--Nal--Thr-NH 2

500 мг (0,40 ммоль) пептиду з етапу (В) розчинили в 300 мл 4% оцтової кислоти і нагріли приблизно до 55°С в атмосфері азоту. Розчин швидко перемішали і додали однією порцією 2% розчин (вага до об'єму) йоду 7,7 мл МеОН (0,60 ммоль). Суміш перемішували протягом приблизно 15 хв, потім реакцію зупинили титруванням 2% розчином натрію тіосульфату до зникнення забарвлення (~ 2 мл). Суміш охолодили до кімнатної температури та профільтрували. Суміш піддали очищенню за допомогою препаративної хроматографії на колонці С8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) з градієнтом ацетонітрилу в 0,1 М ацетаті амонію, знесолювали на колонці С8 YMC з градієнтом ацетонітрилу в 0,25 н 350 мг цільового пептиду із чистотою 99%.

На підставі наведеного вище опису фахівець даної галузі може легко з'ясувати суттєві характеристики цього винаходу і без виходу за межі його ідеї та області охоплення зробити різні зміни та модифікації винаходу для пристосування його до різних застосувань та умов. Таким чином, інші варіанти здійснення винаходу охоплюються формулою винаходу.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб приготування пептиду формули H-D-Nal-Thr-NH 2 , причому зазначений спосіб включає наступні етапи:

(а) прикріплення першої амінокислоти до твердого носія смолі ефірним зв'язком з утворенням «продукту першого приєднання», що включає (i) проведення реакції водного розчину карбонату цезію зі спиртовим розчином першої амінокислоти з утворенням цезієвої солі першої амінокислоти, (ii) одержання вільної від розчинника цезієвої солі першої амінокислоти, (iii) проведення реакції твердого носія смоли з цезієвою сіллю першої амінокислоти у безводному полярному апротонному розчиннику з утворенням «продукту першого приєднання»,

де перша амінокислота являє собою Boc-L-Thr, що відповідає С-кінцевій амінокислоті цього пептиду, а твердий носій смола є смолою з хлорметилированного полістиролу;

(б) зняття захисту Вос з продукту першого приєднання кислотою з утворенням «деблокованого продукту першого приєднання»;

(в) на розсуд, приєднання до «деблокованого продукту першого приєднання» «наступної амінокислоти», що включає проведення реакції «наступної амінокислоти» з «деблокованим продуктом першого приєднання» в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду, з отриманням «блокованого продукту наступного приєднання», причому «наступна амінокислота» має в основному ланцюгу аміногрупу, блоковану Вос, і якщо ця «наступна амінокислота» має одну або кілька функціональних груп у бічному ланцюгу, тоді функціональні групи в бічному ланцюгу не вимагають захисту або ці функціональні групи в бічному ланцюгу мають захисні групи, які стабільні до кислотних або лужних реагентів, що використовуються для зняття захисту відповідно Вос та Fmoc;

(г) зняття захисту Вос з "блокованого продукту наступного приєднання", що включає проведення реакції цього "блокованого продукту наступного приєднання" з кислотою з отриманням "деблокованого продукту наступного приєднання";

(д) на розсуд, повторення етапів (в) і (г), причому у кожному циклі утворюється «деблокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання», де Х позначає кількість бажаних повторень циклів;

(е) приєднання «наступної амінокислоти» до «деблокованого продукту першого приєднання» з етапу (б) або, на розсуд, до «деблокованого продукту (Х+1) наступного приєднання» з етапу (д), що включає проведення реакції « наступної амінокислоти» із зазначеним «деблокованим продуктом першого приєднання» або із зазначеним «деблокованим продуктом (Х+1)-го наступного приєднання» в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду з отриманням «блокованого продукту наступного приєднання», причому ця «наступна амінокислота » має блоковану Fmoc аміногрупу основного ланцюга, за умови, що якщо ця «наступна амінокислота» має одну або кілька функціональних груп у бічній ланцюгу, тоді функціональні групи в бічній ланцюгу не вимагають захисту або функціональні групи в бічній ланцюгу мають захисні групи, які стійкі до лужним реагентам, які використовуються для зняття захисту Fmoc;

(ж) зняття захисту Fmoc з "блокованого продукту наступного приєднання", що включає проведення реакції "блокованого продукту наступного приєднання" з первинним або вторинним аміном, щоб отримати "деблокований продукт наступного приєднання";

(з) на розсуд, повторення етапів (е) і (ж), причому в кожному циклі утворюється «деблокований продукт (Х+1)-го наступного приєднання», де Х - бажана кількість повторень циклу, доки не будуть включені в пептид і деблоковано передостанню амінокислоту;

(і) приєднання N-кінцевої амінокислоти до «деблокованого продукту (Х+1)-го наступного приєднання», що включає проведення реакції N-кінцевої амінокислоти з «деблокованим продуктом (Х+1)-го наступного приєднання» в органічному розчиннику, що містить реагент для нарощування пептиду з отриманням «блокованого продукту завершеного приєднання», де «N-кінцева амінокислота» має аміногрупу основного ланцюга, блоковану Вос або Fmoc;

(й) зняття захисних груп Вос або Fmoc з "блокованого продукту завершеного приєднання", що включає проведення реакції "блокованого продукту завершеного приєднання" з кислотою у разі Вос або з основою у випадку Fmoc, з утворенням завершеного пептидного продукту на смолі;

(к) якщо на «завершеному пептидному продукті на смолі» є функціональні групи бічних ланцюгів, тоді, на розсуд, зняття захисту функціональних груп бічних ланцюгів «завершеного пептидного продукту на смолі», що включає проведення реакції «завершеного пептидного продукту на смолі» з відповідними реагентами, що знімають захист, з отриманням «завершеного пептидного продукту на смолі зі знятим захистом»; і

(l) відщеплення пептиду від твердого носія смоли у складі «завершеного пептидного продукту на смолі» або «завершеного пептидного продукту на смолі зі знятим захистом» з отриманням пептиду, що включає проведення реакції «завершеного пептидного продукту на смолі» або «завершеного пептидного продукту смолі зі знятим захистом» з аміаком, первинним аміном або вторинним аміном до практичного завершення відщеплення пептиду від смоли;

за умови, що етапи (е) та (ж) у синтезі пептиду здійснюють шість разів після утворення «деблокованого продукту першого приєднання» формули H-L-Thr-смолу, де наступні амінокислоти приєднуються в порядку: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) та Fmoc-L-Cys(Acm) з утворенням продукту H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

2. Спосіб згідно з п.1, де аміак, первинний амін або вторинний амін в етапі (л) знаходяться в розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник.

3. Спосіб згідно з п.1, де етап (л) додатково включає наступні стадії:

(i) осадження відщепленого пептиду з розчинника;

(ii) відділення фільтруванням твердого носія смоли та осадженого пептиду та

(iii) екстрагування пептиду кислотним розчином виділення пептиду.

4. Спосіб згідно з будь-яким з пп.1-3, де перша амінокислота являє собою цезієву сіль Boc-L-Thr, що дає як продукт першого приєднання Boc-L-Thr-смолу, а «деблокованим продуктом першого приєднання» є H-L-Thr -Смола.

5. Спосіб згідно з п.4, де кислотою, яка використовується для видалення захисної групи Вос в етапі (й), є трифтороцтова кислота (ТФУ).

6. Спосіб згідно з п.5, де органічним розчинником є ​​метилен-хлорид, хлороформ або диметилформамід, а реагентом для нарощування пептиду є діізопропіл-карбодіїмід, дициклогексил-карбодіімід або N-етил-N"-(3-диметил-амінопропіл)карбодіімід.

7. Спосіб згідно з п.6, що включає приєднання Boc-D-Nal до H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолі згідно з етапом (і) з отриманням Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоли.

8. Спосіб згідно з п.7, що включає одночасне зняття групи Вос, що блокує D-Nal, групи O-t-Bu, що захищає Тyr, і групи Воc, що захищає Lys в Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолі, згідно з етапом (й) з отриманням завершеного пептидного продукту на смолі формули H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

9. Спосіб згідно з п.8, що включає відщеплення пептиду H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr від твердої смоли шляхом проведення реакції H-D-Nal-Cys( Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смоли з аміаком у розчиннику, що містить спирт і, на розсуд, апротонний полярний розчинник, до переважно повного відщеплення з отриманням H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

10. Спосіб згідно з п.9, де спиртом є метанол, а апротонний полярний розчинник - це диметилформамід.

11. Спосіб згідно з п.10, що включає одночасне видалення груп Асm, що захищають Cys, і циклізацію залишків Cys, що виходять, зі знятим захистом в «завершеному пептидному продукті на смолі» формули H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 шляхом проведення реакції H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 з розчином йоду в спирті до в основному повних зняття захисту та циклізації з отриманням H-D-Nal-Thr-NH 2 .

Твердофазний синтез пептидів запропонований Р. Б. Мерріфілдом з університету Рокфеллера (Нобелівська премія 1984 р.). Цей метод заснований на складанні пептиду на нерозчинній полімерній підкладці послідовним приєднанням залишків амінокислот із захищеними -аміно- і бічними групами. План полягав у тому, щоб збирати пептидний ланцюг постадійно, причому під час синтезу ланцюг повинен бути одним кінцем прив'язаний до твердого носія. В результаті виділення та очищення проміжних та цільових похідних пептидів зводилися просто до фільтрування та ретельного промивання твердого полімеру для видалення всіх надлишкових реагентів та побічних продуктів, що залишаються в розчині.

Термін твердофазний (solid-phase) відноситься швидше до фізичних характеристик речовини на носії, тому що хімічна реакція на полімерному носії протікає в одній фазі - в розчині. У відповідному розчиннику полімер набухає, перетворюючись на мало в'язкий, але сильно структурований гель (зшиті полімери), або ж розчиняється (у разі не пошитих полімерів), і процес синтезу відбувається на ультрамікрогетерогенному рівні, практично гомогенної системі.

Для твердофазного органічного синтезу потрібна полімерна основа - смола. S, до якої прикріплений лінкер L. На першій стадії до лінкеру приєднують молекулу субстрату А.Молекула Аіммобілізується (тобто перестає бути мобільним), але зберігає здатність реагувати з іншим реагентом У(Стадія 2).

Продукт АВзалишається на смолі, що дозволяє відокремити його від надлишку реагенту У(і побічних продуктів) простим промиванням. (Можна додавати нові реагенти, послідовно ускладнюючи вихідний субстрат А, головне щоб лінкер у цих реакціях залишався незмінним). Біфункціональний лінкер Lпідбирається так, щоб його зв'язок зі смолою Sбула міцніша, ніж із субстратом А. Тоді на останній стадії цільове з'єднання ABможна відокремити від смоли, зруйнувавши його зв'язок із лінкером. Зрозуміло, що зв'язок L-ABповинна розщеплюватися в м'яких умовах, не пошкоджуючи жодного з'єднання (зв'язок А-У), ні контакт лінкера зі смолою (зв'язок L-S).

Таким чином, в ідеальному випадку, промиваючи смолу після кожної стадії та розщеплюючи зв'язок з носієм, одержують чисту речовину. Природно вважати, що застосування великого надлишку реагентів і подальше відокремлення від смоли в багатьох випадках дозволяють зрушувати хімічну рівновагу у бік утворення цільового продукту і скоротити час синтезу. До недоліків твердофазного органічного синтезу можна віднести необхідність використання досить великого надлишку (2-30 еквівалентів) реагентів, складності при ідентифікації проміжних продуктів синтезу, а також порівняно високу вартість модифікованих полімерних носіїв, що визначається вартістю лінкеру.

Введений Меррифільдом у практику органічного синтезу хлорметилований полістирол (зшитий невеликою кількістю дивінілбензолу), так звана смола Меррифільда, є найдоступнішим з полімерних носіїв.

Методологія та основні стадії твердофазного пептидного синтезу

Поставлене завдання вимагає введення полімерного носія з щепленою амінокислотою реакцію з активованим до заміщення гетероциклом. Розглянемо докладніше методологічний аспект отримання амінокислот іммобілізованих на полімерних носіях.

Стадія1. Іммобілізація N-захищеної амінокислоти полімерний носій.

Першою стадією нашої схеми є іммобілізація амінокислоти полімерний носій. Щоб уникнути таких побічних процесів, як утворення олігопептидів, амінокислоту попередньо захищають. Як правило, використовують N-захищені амінокислоти, і зв'язок, що утворюється між амінокислотою і носієм є зв'язком амідного або сложноэфирного типу.

Найбільш часто застосовуваними захистами аміногрупи в твердофазному органічному синтезі є захисні групи карбаматного типу трет-бутоксикарбонільний (Boc) і 9H-флуоренілметоксикарбонільний захист (Fmoc), X - група, що захищається:

Необхідно відзначити, що вибір захисної групи визначається типом полімерного носія, що використовується. Умови іммобілізації захищених амінокислот є різними для різних типів полімерних носіїв. Іммобілізація Boc-амінокислот на смолу Меррифільда, що є хлорметилованим полістиролом, проводиться. in situу вигляді цезієвих солей при додаванні суспензії карбонату цезію в диметилфталаті (DMF) та каталітичних кількостей йодиду калію. Надлишок реагентів по відношенню до кількості носія вибирається в кожному випадку індивідуально і становить 1,5-4 еквіваленти.

Іммобілізація Fmoc-амінокислот на полімерний носій Ванга (X=O) з утворенням складноефірного лінкеру бензильного типу здійснюється карбодіімідним методом за допомогою діізопропілкарбодіїміду (DIC) у присутності 4-(диметиламіно)піридину (DMAP) як каталізатор. Реакція іммобілізації зі стерично неутрудненими амінокислотами протікає за кімнатної температури. Іммобілізація стерично утруднених амінокислот вимагає проведення реакції при 40-60 ° С протягом 2-х днів та повторного проведення іммобілізації (схема 1). - амінокислот на полімерний носій Ринку (X=NH) з утворенням амідного лінкеру бензгідрильного типу здійснюється в присутності реагенту Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-ілокси) трис-(диметиламіно)фосфонія гексафторфосфату (BOP), основи діізопропілетиламіну (DIEA) та 1-гідроксибензотриазолу (HOBt), як каталізатор. Реакція протікає при кімнатній температурі протягом 2 годин для стерично неутруднених і 4-6 годин у разі стерично утруднених амінокислот.

Стадія 2Деблокування захищеної амінокислоти на полімерному носії

На другій запланованій нами стадії (після іммобілізації захищеної амінокислоти) потрібно зняти захисну групу для активації аміногрупи. Способи зняття Boc- та Fmoc-захисту різні. Видалення Boc-захисту амінокислот на смолі Мерріфілда проводиться 50%-ною трифтороцтової кислотою в дихлорметані протягом півгодини, в цих умовахлінкер Мерріфільда ​​залишається неушкодженим.

Після зняття захисту смолу промивають розчином триетиламіну для видалення трифтороцтової кислоти. Видалення Fmoc-захисту амінокислот на носіях Ванга (X=O) і Ринку (X=NH) проводиться 20% розчином піперидину в DMF протягом 40-50 хв.

Значне зменшення маси смоли після зняття Fmoc-захисту може бути основою гравіметричного визначення ступеня іммобілізації захищених амінокислот на першій стадії твердофазного синтезу. Рекомендується проводити послідовну обробку смоли розчином піперидину в диметилфталаті спочатку протягом 5-10 хв, потім 30 хв у свіжому розчині. Після зняття захисту смолу промивають не менше 4-х разів диметилфталатом для відмивання продуктів руйнування Fmoc-захисту. Контроль за перебігом реакції ацилювання на носії або видалення захисної функції з аміногрупи можливий за допомогою кайзерового тесту.

Стадія 3Нуклеофільне заміщення у гетероциклах за участю іммобілізованої на носії амінокислоти

Наступним етапом, запланованим нами для практичної реалізації, є проведення реакції ароматичного нуклеофільного заміщення; нуклеофілом служить щеплена амінокислота, а активований гетероцикл знаходиться у розчині. Більшість реакцій нуклеофільного заміщення на носіях за виконанням не відрізняються від реакцій у рідкій фазі. Проте слід мати на увазі, що температура процесу не повинна перевищувати 120 С, вище якої починає руйнуватися полістирольна основа носія. В умовах реакції, що проводиться на носії, лінкер також повинен зберігатися.

Вибираючи відповідні активовані гетероциклічні субстрати, слід враховувати природу групи, що йде в гетероциклі.

Стадія 4Зняття цільового з'єднання з полімерних носіїв

Більшість лінкерів при твердофазному органічному синтезі розщеплюються у кислому середовищі. Стійкість лінкерів до кислоти різко знижується під час переходу від смоли Меррифільда ​​до смоли Ванга і Ринку. Лінкер Ринку розщеплюється в більш м'яких умовах (10-20% CF3COOH), ніж лінкер Ванга (50% CF3COOH).

Ще раз нагадаємо, що природа лінкера визначає тип термінальної функції в молекулі, що утворюється, що видаляється з підкладки. Смола Ванга дозволяє одержувати кислоти, а смола Ринку – аміди.

Переваги зазначеної схеми пептидного твердофазного синтезу:

1. Різні вихідні сполуки можуть бути з окремими гранулами. Потім ці гранули змішуються і, таким чином, усі вихідні сполуки можуть взаємодіяти з реагентом в одному експерименті. Через війну продукти реакції утворюються окремих гранулах. У більшості випадків, змішування вихідних у традиційній рідкій хімії призводить зазвичай до невдач - полімеризації або осмолення продуктів. Експерименти на твердій основі виключають ці ефекти.

2. Оскільки вихідні матеріали та продукти пов'язані з твердою підкладною, надлишок реагентів і не пов'язаних з підкладкою продуктів можна легко відмити від полімерної твердої підкладки.

3. Можна використовувати великі надлишки реагентів, щоб провести реакцію до кінця (більше, ніж 99%), оскільки ці надлишки легко відокремлюються.

4. У разі використання низьких обсягів завантажень (менше 0,8 ммоль на грам підкладки) можна виключити небажані побічні реакції.

5. Інтермедіати в реакційній суміші пов'язані з гранулами і їх не потрібно очищати.

6. Індивідуальні гранули полімеру можуть бути розділені наприкінці експерименту і таким чином виходять індивідуальні продукти.

7. Полімерна підкладка може бути регенерована в тих випадках, коли підібрано умови розриву та вибрано відповідні якірні групи - лінкери.

8. Можлива автоматизація твердофазного синтезу.

Необхідними умовами проведення твердофазного синтезу, крім наявності нерозчинної полімерної підкладки, інертної в реакційних умовах, є:

Присутність якоря або лінкера - хімічної функції, що забезпечує зв'язок підкладки з сполукою, що наноситься. Він має бути ковалентно пов'язаний зі смолою. Якір також повинен бути реакційно-здатною функціональною групою для того, щоб субстрати могли взаємодіяти з ним.

Зв'язок, що утворюється між субстратом та лінкером має бути стабільним в умовах реакції.

Повинні існувати засоби розриву зв'язку продукту або інтермедіату з лінкером.