Ndarja e proteinave nga papastërtitë me peshë të ulët molekulare
Metoda e sitës membranore (dializë)
Përdoret një membranë dialize, e cila është një polimer dhe ka pore të një madhësie të caktuar. Molekulat e vogla (papastërtitë me peshë të ulët molekulare) kalojnë nëpër poret në membranë, ndërsa molekulat e mëdha (proteinat) mbahen. Kështu proteinat lahen nga papastërtitë.
Ndarja e proteinave sipas peshës molekulare
Kromatografia me xhel
Kolona kromatografike është e mbushur me granula xhel (Sephadex), e cila ka pore të një madhësie të caktuar. Një përzierje e proteinave shtohet në kolonë. Proteinat, madhësia e të cilave është më e vogël se madhësia e poreve të Sephadex, mbahen në kolonë, pasi ato "ngecin" në pore, dhe pjesa tjetër largohet lirshëm nga kolona. Madhësia e një proteine varet nga pesha e saj molekulare.
Ultracentrifugimi
Kjo metodë bazohet në shkallë të ndryshme të sedimentimit (precipitimit) të molekulave të proteinave në tretësira me gradient densiteti të ndryshëm (bufer saharozë ose klorur ceziumi).
elektroforezë
Kjo metodë bazohet në shkallë të ndryshme të migrimit të proteinave dhe peptideve në një fushë elektrike në varësi të ngarkesës.
Xhel, acetat celulozë, agar mund të shërbejnë si bartës për elektroforezë. Molekulat që do të ndahen lëvizin në xhel në varësi të madhësisë së tyre: ato që janë të mëdha do të mbahen prapa ndërsa kalojnë nëpër poret e xhelit. Molekulat më të vogla do të hasin më pak rezistencë dhe për këtë arsye lëvizin më shpejt. Si rezultat, pas elektroforezës, molekulat e mëdha do të jenë më afër fillimit sesa ato më të vogla.
Proteinat mund të ndahen sipas peshës molekulare duke përdorur elektroforezë. Për këtë përdoret elektroforeza në PAAG në prani të dodecilsulfatit të natriumit (DDS-Na).
SDS-Na është një substancë amfifilike dhe përmban një grup të ngarkuar dhe një hidrofobik. Proteinat lidhen me SDS-Na me radikalet e tyre hidrofobike dhe denatyrohen gjatë procesit. Kështu, proteinat janë në linjë në formë dhe ngarkesë. Pas kësaj, lëvizshmëria e proteinës gjatë elektroforezës varet vetëm nga pesha e saj molekulare.
kriposja: precipitimi me kripëra të alkalit, metaleve alkaline tokësore (klorur natriumi, sulfat magnezi), sulfat amonium; në të njëjtën kohë, struktura primare e proteinës nuk është e shqetësuar;
reshjet: Përdorimi i agjentëve dewaterues: alkool ose aceton në temperatura të ulëta (rreth -20°C).
Kur përdoren këto metoda, proteinat humbasin shtresën e tyre të hidratimit dhe precipitojnë në tretësirë.
Denatyrimi- shkelje e strukturës hapësinore të proteinave (struktura primare e molekulës ruhet). Mund të jetë e kthyeshme (struktura e proteinave restaurohet pas heqjes së agjentit denatyrues) ose e pakthyeshme (struktura hapësinore e molekulës nuk restaurohet, për shembull, kur proteinat precipitohen me acide minerale të përqendruara, kripëra të metaleve të rënda).
Metodat e ndarjes së proteinave Ndarja e proteinave nga papastërtitë me peshë të ulët molekulare
Dializa
Përdoret një membranë e veçantë polimer, e cila ka pore të një madhësie të caktuar. Molekulat e vogla (papastërtitë me peshë të ulët molekulare) kalojnë nëpër poret në membranë, ndërsa molekulat e mëdha (proteinat) mbahen. Kështu, proteinat lahen nga papastërtitë.
Ndarja e proteinave sipas peshës molekulare
Kromatografia me xhel
Kolona kromatografike është e mbushur me granula xhel (Sephadex), e cila ka pore të një madhësie të caktuar. Një përzierje e proteinave shtohet në kolonë. Proteinat, madhësia e të cilave është më e vogël se madhësia e poreve Sephadex, mbahen në kolonë, pasi ato "ngecin" në poret, dhe pjesa tjetër largohet lirshëm nga kolona (Fig. 2.1). Madhësia e një proteine varet nga pesha e saj molekulare.
Oriz. 2.1. Ndarja e proteinave me anë të filtrimit me xhel
Ultracentrifugimi
Kjo metodë bazohet në shpejtësi të ndryshme të sedimentimit (precipitimit) të molekulave të proteinave në tretësira me gradient të densitetit të ndryshëm (bufer saharozë ose klorur ceziumi) (Fig. 2.2).
Oriz. 2.2. Ndarja e proteinave me ultracentrifugim
elektroforezë
Kjo metodë bazohet në shkallë të ndryshme të migrimit të proteinave dhe peptideve në një fushë elektrike në varësi të ngarkesës.
Xhel, acetat celulozë, agar mund të shërbejnë si bartës për elektroforezë. Molekulat që do të ndahen lëvizin në xhel në varësi të madhësisë së tyre: ato që janë më të mëdha do të mbahen prapa ndërsa kalojnë nëpër poret e xhelit. Molekulat më të vogla do të hasin më pak rezistencë dhe për këtë arsye lëvizin më shpejt. Si rezultat, pas elektroforezës, molekulat më të mëdha do të jenë më afër fillimit sesa ato më të voglat (Fig. 2.3).
Oriz. 2.3. Ndarja e proteinave me elektroforezë me xhel
Proteinat gjithashtu mund të ndahen me elektroforezë sipas peshës molekulare. Për këtë përdorim elektroforezë në PAAG në prani të dodecil sulfat natriumi (SDS-Na).
Izolimi i proteinave individuale
Kromatografia e afinitetit
Metoda bazohet në aftësinë e proteinave për t'u lidhur fort me molekula të ndryshme nga lidhje jo kovalente. Përdoret për të izoluar dhe pastruar enzimat, imunoglobulinat, proteinat e receptorit.
Molekulat e substancave (ligandët), me të cilat lidhen në mënyrë specifike disa proteina, kombinohen në mënyrë kovalente me grimcat e një substance inerte. Një përzierje e proteinave shtohet në kolonë dhe proteina e dëshiruar është e lidhur fort me ligand. Proteinat e mbetura dalin lirisht nga kolona. Proteina e mbajtur më pas mund të lahet nga kolona me një tampon që përmban ligand të lirë. Kjo metodë shumë e ndjeshme lejon që sasi shumë të vogla të proteinave të pastër të izolohen nga një ekstrakt qelizor që përmban qindra proteina të tjera.
Fokusimi izoelektrik
Metoda bazohet në vlera të ndryshme IEP të proteinave. Proteinat ndahen me elektroforezë në një pjatë me amfolinë (kjo është një substancë që ka një gradient të pH të paraformuar në rangun nga 3 në 10). Gjatë elektroforezës, proteinat ndahen sipas vlerës së IEP-së së tyre (në IEP ngarkesa e proteinës do të jetë zero dhe nuk do të lëvizë në fushën elektrike).
Elektroforeza 2D
Është një kombinim i fokusimit izoelektrik dhe elektroforezës me SDS-Na. Së pari, elektroforeza kryhet në një drejtim horizontal në një pjatë me amfolinë. Proteinat ndahen në varësi të ngarkesës (CEP). Pastaj pllaka trajtohet me një tretësirë të SDS-Na dhe kryhet elektroforeza në drejtim vertikal. Proteinat klasifikohen në bazë të peshës molekulare.
Imunoelektroforeza (Western blot)
Një metodë analitike e përdorur për të përcaktuar proteinat specifike në një kampion (Figura 2.4).
Izolimi i proteinave nga materiali biologjik.
Ndarja e proteinave sipas peshës molekulare me elektroforezë në PAAG me SDS-Na.
Transferimi i proteinave nga xheli në pllakën e polimerit për të lehtësuar punën e mëtejshme.
Trajtimi i pllakës me një zgjidhje proteinike jo specifike për të mbushur poret e mbetura.
Kështu, pas kësaj faze u përftua një pjatë, poret e së cilës përmbajnë proteina të ndara dhe hapësira ndërmjet tyre mbushet me një proteinë jo specifike. Tani duhet të identifikojmë nëse ndër proteinat që kërkojmë, janë përgjegjëse për një lloj sëmundjeje. Trajtimi me antitrupa përdoret për zbulimin. Nën antitrupat primare kuptojnë antitrupat ndaj proteinës së dëshiruar. Me antitrupa dytësorë nënkuptohen antitrupat ndaj antitrupave parësorë. Një etiketë speciale shtesë (e ashtuquajtura sondë molekulare) i shtohet përbërjes së antitrupave dytësorë, në mënyrë që më vonë të mund të vizualizohen rezultatet. Fosfati radioaktiv ose një enzimë e lidhur fort me antitrupin dytësor përdoret si etiketë. Lidhja fillimisht me antitrupat primar dhe më pas me antitrupat dytësorë ka dy qëllime: të standardizojë metodën dhe të përmirësojë rezultatet.
Përpunimi me tretësirë të antitrupave parësorë lidhja ndodh në vendin e pllakës ku ka një antigjen (proteina e dëshiruar).
Heqja e antitrupave të palidhur (larje).
Trajtimi me një zgjidhje të antitrupave dytësorë të etiketuar për zhvillimin e mëvonshëm.
Heqja e antitrupave dytësorë të palidhur (larje).
Oriz. 2.4. Imunoelektroforeza (Western blot)
Në rastin e pranisë së proteinës së dëshiruar në materialin biologjik, në pjatë shfaqet një brez, që tregon lidhjen e kësaj proteine me antitrupat përkatës.
Studimi i vetive fiziko-kimike, përbërjes kimike dhe strukturës është i mundur vetëm në studimin e një preparati proteinik të pastruar. Për izolimin dhe fraksionimin e proteinave individuale, përdoren kriposja, precipitimi me tretës organikë, filtrimi me xhel, elektroforeza, kromatografia e shkëmbimit të joneve dhe kromatografia e afinitetit.
Kriposja e proteinave bazohet në varësinë e tretshmërisë së proteinave nga vetitë e mediumit. Në ujin e distiluar, proteinat treten më keq sesa në solucionet e dobëta të kripës, pasi përqendrimet e ulëta të joneve ruajnë guaskat e tyre të hidratimit. Por në përqendrime të larta të kripës, molekulat e proteinave humbasin lëvozhgat e tyre të hidratimit, grumbullohen dhe formohet një precipitat. Pas heqjes së kripës, proteinat përsëri kalojnë në tretësirë, duke ruajtur vetitë e tyre amtare dhe konformimin.
Ndryshimet në tretshmërinë në përqendrime të ndryshme të kripës dhe pH mesatar përdoren për të izoluar proteinat individuale. Më shpesh, zgjidhjet e sulfatit të amonit me përqendrime të ndryshme përdoren për të kripur proteinat.
Precipitimi i proteinave nga tretësira pa denatyrimin e tyre kryhet duke përdorur agjentë dehidrogjenues - tretës organikë (etanol, aceton).
Filtrimi me xhel Ai bazohet në ndarjen e proteinave sipas madhësisë dhe formës së molekulës. Ndarja kryhet në kolona kromatografike të mbushura me granula poroze xhel (Sephadex, agarose) në një tretësirë buferike me një vlerë të caktuar pH. Granulat e xhelit janë të përshkueshme nga proteinat për shkak të kanaleve të brendshme (poreve) me një diametër të caktuar mesatar, madhësia e të cilave varet nga lloji i xhelit (Sephadex G-25, G-200, etj.). Përzierja e proteinave futet në kolonë dhe më pas lahet (eluhet) me një tretësirë tampon me një vlerë të caktuar pH. Molekulat e mëdha të proteinave nuk depërtojnë në poret e xhelit dhe lëvizin me shpejtësi të lartë së bashku me tretësin. Molekulat e vogla të një papastërtie me peshë të vogël molekulare (kripë) ose proteina të tjera mbahen nga kokrrat e xhelit dhe lahen nga kolona më ngadalë (Fig. 1.29). Në dalje të kolonës, tretësira (eluati) mblidhet si fraksione të veçanta.
Oriz. 1.29. Ndarja e proteinave me anë të filtrimit me xhel
elektroforezë bazohet në vetinë e molekulave të proteinave të ngarkuara për të lëvizur në një fushë elektrike me një shpejtësi proporcionale me ngarkesën e tyre totale. Proteinat që kanë një ngarkesë totale negative në një pH të caktuar lëvizin drejt anodës dhe pozitive drejt katodës. Elektroforeza kryhet në media të ndryshme: letër, xhel niseshteje, xhel poliakrilamid etj. Shpejtësia e lëvizjes varet nga ngarkesa, masa dhe forma e molekulave të proteinave. Pas përfundimit të elektroforezës, zonat e proteinave në bartës lyhen me ngjyra të veçanta (Fig. 1.30, A).
Rezolucioni i elektroforezës në xhel është më i lartë se në letër, kështu që gjatë elektroforezës së proteinave të serumit të gjakut, 5 fraksione (albuminat, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globulina) izolohen në letër dhe deri në 18 fraksione në një xhel poliakrilamid (Fig. 1.30, B).
Oriz. 1.30. Elektroferogrami i proteinave të serumit të gjakut të një personi të shëndetshëm
A- elektroferogramë e proteinave të serumit të gjakut në letër;
B- sasia e proteinave plazmatike të fraksioneve të ndryshme.
I - γ-globulina; II - β-globulina; III - a 2 -globulina;
IV - a 1 -globulina; V - albuminat
Kromatografia e shkëmbimit të joneve bazuar në ndarjen e proteinave që ndryshojnë në ngarkesën totale. Një tretësirë proteine me një vlerë të caktuar pH kalon përmes një kolone kromatografike të mbushur me një sorbent të ngurtë poroz, ndërsa disa nga proteinat mbahen si rezultat i ndërveprimit elektrostatik. Si sorbent përdoren shkëmbyesit e joneve: shkëmbyesit anion (që përmbajnë grupe kationike) për izolimin e proteinave acidike; shkëmbyesit e kationeve (që përmbajnë grupe anionike) për të izoluar proteinat bazë.
Kur një proteinë kalon nëpër një kolonë, forca e lidhjes së saj me shkëmbyesin e joneve varet nga madhësia e ngarkesës së kundërt me atë të sorbentit. Proteinat e përthithura në sorbentin e shkëmbimit të joneve eluratohen me tretësira tampon me përqendrime të ndryshme kripe dhe pH, duke përftuar fraksione të ndryshme proteinash.
Kromatografia e afinitetit bazohet në specifikën e lidhjes së proteinave me një ligand të lidhur me një mbështetje të fortë. Si ligandë përdoren substrate enzimatike, grupe protetike holoproteinash, antigjene etj. Kur një përzierje e proteinave kalon nëpër kolonë, vetëm një proteinë plotësuese i ngjitet ligandit (Fig. 1.31, A), e gjithë pjesa tjetër del me tretësirën. Proteina e përthithur elurohet me një tretësirë me një vlerë pH të ndryshme (Fig. 1.31, B). Kjo metodë është shumë specifike dhe bën të mundur marrjen e preparateve proteinike shumë të purifikuara.
Izolimi dhe pastrimi i një proteine zakonisht ndodh në disa faza duke përdorur metoda të ndryshme. Sekuenca e hapave zgjidhet në mënyrë empirike dhe mund të ndryshojë për proteina të ndryshme. Një shkallë e lartë e pastrimit të proteinave është shumë e rëndësishme si gjatë përdorimit të tyre si ilaçe (hormoni insulinë etj.), ashtu edhe në diagnostikimin e sëmundjeve të ndryshme duke ndryshuar përbërjen e proteinave të indeve, gjakut, pështymës etj.
Grupi i proteinave në qelizat e organeve të ndryshme të një të rrituri është individual dhe mbahet relativisht konstant gjatë gjithë jetës. Indet e specializuara mund të përmbajnë proteina specifike, të tilla si hemoglobina në qelizat e kuqe të gjakut, aktina dhe miozina në muskuj, rodopsina në retinë dhe lloje të ndryshme kolagjeni në kockat dhe indet lidhëse. Disa proteina gjenden në shumë inde, por në sasi të ndryshme. Përbërja e zgjedhur ndryshon
Oriz. 1.31. Ndarja e proteinave me kromatografi afiniteti
A- lidhja e proteinës së sekretuar me një ligand specifik të lidhur me një bartës neutral; B- marrja e një tretësire të një proteine individuale
proteinat e indeve dhe gjakut janë të mundshme dhe lidhen kryesisht me dietën, përbërjen ushqimore dhe aktivitetin fizik të një personi.
Në sëmundjet, përbërja proteinike e qelizave të gjakut dhe indeve mund të ndryshojë ndjeshëm, shpesh zhvillohet një mungesë e një proteine ose një rënie në aktivitetin e saj - proteinopatia. Prandaj, përcaktimi i ndryshimeve të theksuara në përbërjen e proteinave të gjakut dhe indeve përdoret për të diagnostikuar sëmundje të ndryshme në provat klinike.
Pasi përzierja e proteinave nxirret nga materiali biologjik, ajo ndahet në fraksione të veçanta proteinike. Janë zhvilluar disa metoda për fraksionimin e proteinave bazuar në vetitë e ndryshme fiziko-kimike të proteinave.
– precipitimi i proteinave në pikën izoelektrike – metoda bazohet në vetinë e proteinave për të precipituar në pikën izoelektrike për shkak të neutralizimit të ngarkesës së molekulës së proteinës. Për secilën proteinë, vlera e pikës izoelektrike është rreptësisht individuale, prandaj, duke përdorur këtë metodë, është e mundur të izolohen proteinat individuale (për më shumë informacion rreth metodës, shih punën laboratorike nr. 3 në kursin Biokimi).
– fraksionimi i proteinave duke kripur jashtë - bazuar në tretshmërinë e ndryshme të proteinave në tretësirat e koncentruara të kripërave neutrale, në varësi të peshës molekulare (për më shumë detaje mbi metodën, shih punën laboratorike nr. 3 në lëndën "Biokimi").
– metoda e ndarjes elektroforetike proteinat në fraksione - të përshkruara në seksionin mbi vetitë fiziko-kimike të proteinave.
Përveç metodave të mësipërme për ndarjen e proteinave në fraksione, ato përdoren gjerësisht. metodat kromatografike . Më së shpeshti përdoret kromatografia në kolonë.
Një tipar i kësaj metode është se një përzierje e molekulave të proteinave dhe peptideve të ndryshme kalohet përmes një kolone që përmban një material poroz të ngurtë (matricë). Si rezultat i ndërveprimit me matricën, proteina të ndryshme kalojnë nëpër kolonë me shpejtësi të ndryshme. Pasi proteinat arrijnë në fund të kolonës në një sekuencë të caktuar, ato mblidhen në fraksione të veçanta në epruveta.
Ndani tre lloje kryesore kromatografia e kolonës:
– shkëmbimi i joneve - për kromatografinë e proteinave, përdoren shkëmbyes jonesh të bazuar në celulozë ose polimerë të tjerë hidrofilë, për shembull, dietilaminoetilcelulozë (DEAE-celulozë) që përmban grupe kationike (ngarkesë negative) ose që përmban karboksimetilcelulozë (CM-celulozë) që përmban grupe amine (ngarkesë pozitive):
Forca e lidhjes së proteinave me DEAE-celulozë është sa më e lartë, aq më shumë grupe karboksil në molekulën e proteinës. Proteinat e absorbuara në DEAE-celulozë mund të lahen (eluratohen) nga kolona me tretësira me përqendrim në rritje të klorurit të natriumit. Së pari, proteinat e lidhura dobët janë elutur dhe me rritjen e përqendrimit të kripës, proteinat e tjera janë elutur, në mënyrë që të rritet afiniteti i tyre për DEAE-celulozën.
KM-celuloza përdoret në mënyrë të ngjashme, por afiniteti i proteinave për të është drejtpërdrejt proporcional me numrin e grupeve amino në molekulën e proteinës.
Për të hequr proteinën e lidhur, ndryshohet edhe pH e eluentit.
– kromatografi xhel - ka emrin e dytë "metoda e sitës molekulare". Sephadex (polisakaridi i dekstranit i trajtuar me epiklorhidrinë) përdoret si sitë. Kokrrat e Sephadex fryhen në ujë dhe formojnë një xhel. Granulat e fryra kanë pore me një diametër të caktuar.
Ndarja bazohet në faktin se kokrrat e Sephadex (poret e kokrrizave) janë të papërshkueshme ose të kufizuara nga substancat me peshë të madhe molekulare, dhe molekulat e vogla shpërndahen (depërtojnë) lirshëm në poret e kokrrave.
Masa xhel-like e Sephadex-it të fryrë vendoset në një kolonë qelqi (tub), një shtresë me tretësirë proteinike aplikohet në sipërfaqen e xhelit (Fig. 12, a) dhe më pas kalohet përmes një solucion tampon (lëng shpërthyes). kolona. Proteinat kalojnë përgjatë kolonës ndërmjet kokrrizave aq më ngadalë, aq më e ulët pesha molekulare e tyre, pasi molekulat e proteinave me një peshë molekulare edhe më të ulët shpërndahen më lehtë në granula (në pore) (Fig. 12).
Oriz. 12. Fraksionimi i proteinave me anë të filtrimit me xhel
Proteinat shpëlahen (eluratohen) nga kolona në rend zbritës të peshës molekulare. Rrjedhimisht, së pari eliminohen molekulat e mëdha të proteinave (Fig. 12b), të cilat nuk shpërndahen në kokrra, pastaj molekula të vogla dhe së fundi, papastërti me peshë të ulët molekulare.
Kjo metodë përdoret jo vetëm për të fraksionuar proteinat sipas peshës molekulare, por edhe për t'i pastruar ato nga papastërtitë me peshë të ulët molekulare.
– kromatografia e afinitetit ose kromatografia e afinitetit. Parimi i metodës është se ekziston një ndërveprim selektiv i proteinave me substanca specifike - ligandë të fiksuar në bartës (Fig. 13).
Si bartës përdoret sefaroza e aktivizuar nga bromidi cianogjen. Ligandët me origjinë të ndryshme janë bashkangjitur në Sepharose - një substrat, një antigjen ose një receptor, i cili me afinitet do të lidhë vetëm një proteinë nga përzierja:
– substrat → enzimë;
– antigjen → antitrup;
– hormon → receptor i këtij hormoni.
Proteinat e tjera që nuk lidhen me ligand hiqen duke larë kolonën.
Oriz. 13. Mekanizmi i kromatografisë së afinitetit
Heqja nga kolona e proteinës së fiksuar me afinitet kryhet duke përdorur një tretësirë tampon (eluent). Një detergjent futet në tampon, i cili dobëson lidhjet midis proteinës dhe ligandit, ose një zgjidhje me një përqendrim të lartë të ligandit të lirë kalon nëpër kolonë. Në këtë rast, proteina lidhet më lehtë me ligandin e lirë dhe shpëlahet (eluhet) nga kolona.
Laboratori numër 8
NDARJA ELEKTROFORETIKE E PROTEINAVE
Metoda bazohet në faktin se molekulat e proteinave kanë një ngarkesë elektrike, madhësia dhe shenja e së cilës përcaktohen nga përbërja e aminoacideve të proteinës, pH dhe forca jonike e mjedisit. Nën ndikimin e një fushe elektrike të jashtme, molekulat e ngarkuara lëvizin në tretësirë në një pol të ngarkuar në mënyrë të kundërt. Shpejtësia e lëvizjes së grimcave të proteinave është proporcionale me madhësinë e ngarkesës së tyre dhe në përpjesëtim të zhdrejtë me madhësinë e grimcave dhe shkallën e hidratimit të tyre.
E ashtuquajtura "elektroforezë zonale" tani përdoret gjerësisht - elektroforezë në një bartës të ngurtë (në shirita letre, agar, niseshte, akrilamide) të ngopura me një zgjidhje tampon me vlerën e dëshiruar të pH. Pozicioni i proteinave në letër ose xhel përcaktohet duke i fiksuar dhe më pas duke i ngjyrosur me një ose një tjetër bojë (zakonisht blu bromofenol, i zi amid ose blu Coomassie). Sasia e proteinës në çdo fraksion mund të përcaktohet përafërsisht nga intensiteti i ngjyrës së bojës shoqëruese. Një përkufizim i tillë nuk jep një raport rreptësisht sasior të fraksioneve të proteinave, pasi sasia e bojës së lidhur nga proteina të ndryshme nuk është e njëjtë.
ELEKTROFOREZA HA LETËR
Ndarja e përzierjes së analizuar ndodh në disa lloje letre kromatografike të ngopura me një zgjidhje tampon në pajisjet elektroforezë. Proteinat ndahen në tensione deri në 500 V.
Dhoma e elektroforezës përbëhet nga një banjë pleksiglas dhe një kapak i vendosur në të. (1). Banja ka 2 ndarje elektroda (2), secila prej të cilave është e ndarë nga një ndarje gjatësore (3) në dy ndarje që komunikojnë me njëra-tjetrën. Bo ndarjet e brendshme të ndarjeve ulin elektrodat dhe skajet e letrës ngjiten në ato të jashtme (4), pjesa kryesore e së cilës vendoset në një pllakë horizontale me thumba (5) të vendosura në pjesën qendrore të dhomës. Midis pllakës horizontale dhe ndarjes së jashtme të ndarjeve të elektrodës ka shkopinj (6),
Fig.2. Skema e pajisjes për elektroforezë me tension të ulët
nëpër të cilat hidhen shiritat e letrës dhe që shërbejnë për mbështetjen e tyre. Nën mbulesën e sipërme të dhomës ka një pllakë prej pleksiglasi me vrima të mëdha të rrumbullakëta (7), mbi të cilën vendosen fletë letre filtri të palosur 4-5 herë të zhytura në ujë të distiluar. Këto fletë kontribuojnë në një rritje të ngushtësisë së dhomës dhe, si rezultat, në një ulje të avullimit të lëngut nga elektroforegramet gjatë elektroforezës.
Me elektroforezë në letër, studentët ftohen të kryejnë ndarjen e proteinave të serumit të gjakut. Me këtë metodë, serumi i gjakut mund të ndahet në 5 - 9 fraksione dhe mund të përcaktohet përmbajtja relative e proteinave në secilën prej tyre. Ndarja kryhet në një tretësirë tampon (pH 8,6 - 8,9) në një gradient potencial prej 3 - 5 V/cm (120 - 350 V për shiritat 40 - 45 cm të gjatë) në temperaturën e dhomës. Fuqia aktuale nuk duhet të kalojë 0,1 - 0,3 mA për centimetër të seksionit kryq të shiritit të letrës. Një rritje e forcës aktuale me më shumë se 2 herë është e papranueshme, pasi kjo shkakton ngrohje të tepërt, një rritje të konsiderueshme të avullimit dhe V rezultati përfundimtar - djegia e letrës
Reagentët:
1. Tretësirë buferike. Mund të përdoret:
a) tampon veronal-medinal (pH 8,6): shpërndani 10,32 gmedinal (kripë natriumi veronale) në 300 ml ujë të distiluar, shtoni 1,84 gveronal, ngrohni me përzierje në një banjë uji derisa të treten dhe holloni me ujë në 1 l;
b) tampon acetati veronal (pH 8,6): 4,3 gveronal, 0,95 hidroksid natriumi dhe 3,24 hidroksid natriumi treten në 300 ml ujë të distiluar. Shtoni 30 ml tretësirë HCl 0,1 M në tretësirë dhe holloni në 1 litër me ujë;
c) Tris buffer (pH 8,9): 60,5 g tris, 6 g acid etilendiaminetraacetik dhe 4,6 g acid borik treten në 1 l ujë të distiluar.
2. Zgjidhje për ngjyrosjen e elektroforegrameve:
a) bojë acid blu-zi (e ngjashme me të zezën amide 10 B) -0,2 g në përzierje: acid acetik (glacial) - 100 ml + alkool metil - 900 ml;
b) bromofenol blu - 0,5 g, sublimate - 10 g, acid acetik (glacial) - 20 ml, ujë i distiluar - 980 ml;
c) bromofenol blu - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O -50 g, acid acetik (glacial) 50 ml, ujë i distiluar - 900 ml.
3. Zgjidhje për larjen e elektroforegrameve nga boja që nuk lidhet me proteinën dhe fiksimin e bojës në proteinë:
a) acid acetik - zgjidhje 2%;
b) acetat natriumi - tretësirë 2% e përgatitur me tretësirë të acidit acetik 10%.
4. Tretësira për elucionin e produkteve me ngjyrë nga elektroferogramet:
a) për ekstraktimin e bromofenolit blu - tretësirë 0,01 M NaOH;
b) për të nxjerrë ngjyrën acidike blu-zezë - tretësirë 0,1 M NaOH.
Pajisjet: epruveta; kuveta, spektrofotometër, aparat elektroforezë, letër kromatografike: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM etj.
Marrja e serumit të gjakut. 2 - 3 ml gjak hidhet në një tub centrifuge të thatë dhe lihet për 1/2 - 1 orë. Një shufër qelqi e hollë rrethohet me kujdes rreth mureve të tubit për të ndarë mpiksjen prej tyre, centrifugohet dhe serumi derdhet në një tub i pastër.
Përgatitja e kamerës. Ndarjet e elektrodave mbushen me tretësirë tampon në të njëjtin nivel (për të shmangur tejmbushjen e buferit), afërsisht 800 ml në secilën ndarje. Bo pjesët e brendshme të ndarjeve të elektrodës zhytin elektrodat. Në një fletë letre kromatografike (18x45 cm) (kur përdorni nota të holla letre, është më mirë të aplikoni mostra në shirita të veçantë 4-5 cm të gjera) në një distancë prej 15 cm nga njëra nga anët e saj të ngushta me një laps të thjeshtë të butë. (grafiti parandalon përhapjen e lëngut) përshkruani vendet për aplikimin e mostrave. Janë drejtkëndësha (2 x 0,3 cm), anët e mëdha të të cilave janë pingul me gjatësinë e shiritit të letrës. Distanca ndërmjet zonave fillestare dhe skajeve të elektroferogramit është -2 cm Elektroferogrami është i ngopur me një tampon në të cilin do të bëhet elektroforeza. Për ta bërë këtë, ajo tërhiqet përmes një kuvete me një zgjidhje tampon. Skajet e shiritave të letrës (6-8 cm) nuk lagen. Buferi i tepërt hiqet duke fshirë shiritat midis dy ose tre fletëve të letrës filtri. Elektroferogrami i lagësht vendoset në dhomën në pllakën horizontale qendrore (5) dhe skajet ulen në ndarjet e jashtme të ndarjeve të elektrodave. Pajisja mbyllet fort me kapak, nën të cilin ka fletë letre filtri të lagura me ujë. .
Kryerja e elektroforezës. Pasi shiritat e letrës janë ngopur plotësisht me tretësirën tampon, mostrat aplikohen në zonat e shënuara duke përdorur një pipetë 0,1 ml: 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg proteinë) serum. Dhoma mbyllet me kapak dhe rryma ndizet. Kohëzgjatja e elektroforezës është 22 - 24 orë në një tension prej 200 - 300 V
Fiksimi dhe ngjyrosja e elektroforegrameve. Në fund të elektroforezës, fikni rrymën dhe hiqni menjëherë elektroferogramet nga pajisja. Vendosen në një stendë të posaçme dhe thahen në ajër nën shkarkim, pastaj në furrë në 105 ºC për 20 minuta për të fiksuar proteinat në letër, pas së cilës vendosen në një kuvetë të emaluar, të mbushur me bojë dhe lihen për 2-3 orë. ose më shumë. Bojëja kullohet dhe elektroforegramet lahen nga teprica e saj duke u përmbytur 3-4 herë me tretësirë 2% të acidit acetik, çdo herë për 5-10 minuta. Zonat e letrës që nuk përmbajnë proteina duhet të jenë plotësisht pa ngjyra. Për të rregulluar produktet me ngjyrë të elektroforegramit, ato derdhen për 2 minuta me një zgjidhje 2% të acetatit të natriumit dhe thahen në ajër nën një rrymë.
Përcaktimi i raportit të fraksioneve individuale të proteinave. Në pH 8.6, proteinat e serumit ngarkohen negativisht dhe lëvizin në fushën elektrike drejt anodës. Fraksioni që lëviz më shpejt në anodë është albumina, e ndjekur nga α1-, α2-, β- dhe γ-globulinat (shih Fig. 3) . Seksionet e shiritave të letrës në të cilat shfaqen njolla proteinike ndahen me vija tërthore me një laps të thjeshtë në shirita 3-5 mm të gjera dhe të prera përgjatë këtyre vijave. Çdo shirit grimcohet dhe vendoset në një epruvetë me numër të veçantë, derdhet në 3 ml tretësirë 0,01 M NaOH, lihet për një orë për të nxjerrë bojën nga letra dhe më pas vlera e densitetit optik gjendet për secilën tretësirë në një fotokolorimetër (spektrofotometër ) në 612 nm.
Oriz. 3. Elektroferogrami i serumit të gjakut të njeriut dhe kurba e shpërndarjes së fraksioneve proteinike
Në të njëjtën kohë, përpunohet një mostër kontrolli. Për të, një shirit është prerë nga seksionet e panjollosura të elektroferogramit.
Bazuar në të dhënat e marra, në elektroforegram ndërtohet një kurbë e shpërndarjes së produkteve me ngjyra. Boshtet e abshisave shënojnë numrat e epruvetave, boshtet e ordinatave tregojnë vlerën përkatëse të densitetit optik (shih Fig. 3). . Llogaritni përqindjen e fraksioneve të proteinave në serumin e gjakut. Për ta bërë këtë, kurba e tërhequr ndahet nga minimumi në një numër seksionesh që korrespondojnë me fraksionet individuale. Madhësia e sipërfaqes së çdo seksioni është proporcionale me sasinë e bojës që është kombinuar me proteinën e këtij fraksioni. Raporti midis këtyre zonave llogaritet me peshë (pesha e seksioneve të letrës është proporcionale me sipërfaqen e tyre), e gjithë sipërfaqja merret si 100%. Në prani të një densitometri, raporti i fraksioneve të proteinave në serumin e gjakut mund të përcaktohet nga një densitogram.
Duke përcaktuar paraprakisht përmbajtjen e proteinave në hirrë, llogaritni sasinë e saj për çdo fraksion.
