Η σύνθεση στερεάς φάσης ή τεχνολογία στερεάς φάσης, η οποία συχνά αποκαλείται κεραμική τεχνολογία, είναι η πιο κοινή στην παραγωγή ανόργανων υλικών για διάφορους κλάδους της επιστήμης και της βιομηχανίας. Αυτά περιλαμβάνουν πυρηνικά καύσιμα, υλικά για διαστημική τεχνολογία, ραδιοηλεκτρονικά, όργανα κατασκευής, καταλύτες, πυρίμαχα υλικά, υπεραγωγούς υψηλής θερμοκρασίας, ημιαγωγούς, σιδηροηλεκτρικά και πιεζοηλεκτρικά, μαγνήτες, διάφορα σύνθετα υλικά και πολλά άλλα.

Η σύνθεση στερεάς φάσης βασίζεται σε χημικές αντιδράσεις στις οποίες τουλάχιστον ένα από τα αντιδρώντα είναι παρόν με τη μορφή στερεού. Τέτοιες αντιδράσεις ονομάζονται ετερογενείς ή στερεάς φάσης. Η αλληλεπίδραση στερεάς φάσης, σε αντίθεση με τις αντιδράσεις σε υγρό ή αέριο μέσο, ​​αποτελείται από δύο θεμελιώδεις διεργασίες: την ίδια τη χημική αντίδραση και τη μεταφορά της ύλης στη ζώνη αντίδρασης.

Οι αντιδράσεις στερεάς φάσης που περιλαμβάνουν κρυσταλλικά συστατικά χαρακτηρίζονται από περιορισμένη κινητικότητα των ατόμων ή ιόντων τους και μια πολύπλοκη εξάρτηση από πολλούς παράγοντες. Αυτά περιλαμβάνουν όπως η χημική δομή και η σχετική αντιδραστικότητα των αντιδρώντων στερεών, η φύση και η συγκέντρωση των ελαττωμάτων, η κατάσταση της επιφάνειας και η μορφολογία της ζώνης αντίδρασης, η περιοχή επαφής των αντιδραστηρίων που αλληλεπιδρούν, η προκαταρκτική μηχανοχημική ενεργοποίηση και μια σειρά από οι υπολοιποι. Όλα τα παραπάνω καθορίζουν την πολυπλοκότητα των μηχανισμών των ετερογενών αντιδράσεων. Η μελέτη των ετερογενών αντιδράσεων βασίζεται στη χημεία στερεάς κατάστασης, στη χημική φυσική και στη φυσική χημεία της επιφάνειας των στερεών, στους νόμους της θερμοδυναμικής και της κινητικής.

Συχνά ο μηχανισμός των αντιδράσεων στερεάς φάσης κρίνεται μόνο με βάση ότι τα πειραματικά δεδομένα σχετικά με τον βαθμό αλληλεπίδρασης ως συνάρτηση του χρόνου περιγράφονται καλύτερα από ένα συγκεκριμένο κινητικό μοντέλο και την αντίστοιχη κινητική εξίσωση. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένα συμπεράσματα.

Οι διεργασίες σε υλικά στερεάς φάσης έχουν μια σειρά από σημαντικές διαφορές από τις διεργασίες σε υγρά ή αέρια. Αυτές οι διαφορές συνδέονται, πρώτα απ 'όλα, με σημαντικά (κατά πολλές τάξεις μεγέθους) χαμηλότερο ρυθμό διάχυσης στα στερεά, που εμποδίζει τον μέσο όρο της συγκέντρωσης των συστατικών στο σύστημα και, επομένως, οδηγεί σε χωρικό εντοπισμό των διεργασιών που συμβαίνουν. Ο χωρικός εντοπισμός, με τη σειρά του, οδηγεί στο γεγονός ότι τόσο ο ειδικός ρυθμός της διαδικασίας (ή ο συντελεστής διάχυσης) όσο και η γεωμετρία της ζώνης αντίδρασης συμβάλλουν στην παρατηρούμενη κινητική των διεργασιών. Τέτοια χαρακτηριστικά διεργασιών στερεάς φάσης που καθορίζονται από γεωμετρικούς παράγοντες ονομάζονται τοποχημικά. Επιπλέον, δεδομένου ότι οι υπό συζήτηση μετασχηματισμοί είναι χωρικά εντοπισμένοι, ο ρυθμός τους μπορεί να προσδιοριστεί τόσο από τις ίδιες τις διεργασίες στο όριο φάσης (έλεγχος αντίδρασης) όσο και από τον ρυθμό παροχής οποιουδήποτε από τα συστατικά σε αυτό το όριο ή την αφαίρεση του προϊόντος ( s) (έλεγχος διάχυσης). Αυτές οι περιπτώσεις για απλά συστήματα για τα οποία πληρούνται οι υποθέσεις του μοντέλου μπορούν να προσδιοριστούν στο πείραμα από τον τύπο της χρονικής εξάρτησης του βαθμού μετατροπής. Ένα άλλο χαρακτηριστικό των μετασχηματισμών φάσης στα στερεά σχετίζεται με το γεγονός ότι ο σχηματισμός ενός πυρήνα μιας νέας φάσης σε μια στερεά μήτρα προκαλεί την εμφάνιση ελαστικών τάσεων στην τελευταία, η ενέργεια των οποίων σε ορισμένες περιπτώσεις πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την εξέταση τη θερμοδυναμική αυτών των μετασχηματισμών.

Ένας μεγάλος αριθμός παραγόντων που επηρεάζουν την κινητική των διεργασιών στερεάς φάσης και τη μικροδομή των υλικών που προκύπτουν καθορίζουν επίσης την πολλαπλότητα των τύπων ταξινόμησης αυτών των διεργασιών. Έτσι, όταν εξετάζουμε τη σταθερότητα ενός συστήματος σε σχέση με διακυμάνσεις διαφόρων τύπων, ετερογενές (στην περίπτωση συστημάτων που είναι σταθερά σε μικρές διακυμάνσεις στον κατειλημμένο όγκο και ασταθή σε μεγάλες) και ομοιογενή (στην περίπτωση συστημάτων που είναι ασταθείς έως μικρές διακυμάνσεις) διακρίνονται διεργασίες. Για ετερογενείς διεργασίες, ως παράδειγμα, μπορούμε να αναφέρουμε μετασχηματισμούς που συμβαίνουν μέσω του μηχανισμού σχηματισμού και ανάπτυξης πυρήνων· για ομοιογενείς διεργασίες, ορισμένες μεταβάσεις τάξης-διαταραχής και σπονδυλική αποσύνθεση στερεών διαλυμάτων μπορούν να αναφερθούν.

Είναι απαραίτητο να διακρίνουμε την ετερογενή και την ομοιογενή πυρήνωση στην περίπτωση ετερογενών διεργασιών από ετερογενείς και ομοιογενείς διεργασίες. Η ετερογενής πυρήνωση αναφέρεται στον σχηματισμό πυρήνων σε δομικά ελαττώματα (συμπεριλαμβανομένων των ελαττωμάτων εξάρθρωσης σημείου και των ορίων φάσης). ομοιογενής πυρήνωση - ο σχηματισμός πυρήνων σε έναν όγκο χωρίς ελαττώματα της στερεάς φάσης.

Αναλύοντας το γινόμενο του μετασχηματισμού στερεάς φάσης, διακρίνονται μονοφασικοί και πολυφασικοί πυρήνες. Στην περίπτωση πολυφασικών πυρήνων, το προϊόν της διεργασίας είναι μια πολυφασική αποικία με χαρακτηριστική μικροδομή που καθορίζεται από την επιφανειακή ενέργεια του ορίου των φάσεων που προκύπτουν. διεργασίες αυτού του τύπου ονομάζονται διαλείπουσες, σε αντίθεση με τις συνεχείς διεργασίες στην περίπτωση του σχηματισμού και της ανάπτυξης μονοφασικών πυρήνων.

Μια άλλη μέθοδος ταξινόμησης μετασχηματισμών στερεάς φάσης βασίζεται σε σύγκριση της σύνθεσης της αρχικής φάσης και της σύνθεσης του προϊόντος αντίδρασης. Αν συμπίπτουν, μιλούν για διαδικασίες μη διάχυσης, και αν αλλάξει η σύνθεση, μιλούν για διαδικασίες διάχυσης. Επιπλέον, από τις διαδικασίες μη διάχυσης, είναι χρήσιμο να διακρίνουμε συνεργατικές διεργασίες (για παράδειγμα, μαρτενσιτικό μετασχηματισμό), οι οποίες συμβαίνουν μέσω της ταυτόχρονης ελαφριάς κίνησης ατόμων σε μεγάλο όγκο της αρχικής φάσης.

Οι μετασχηματισμοί φάσης χωρίς διάχυση μπορεί να διαφέρουν ως προς τον τύπο των θερμοδυναμικών χαρακτηριστικών που αλλάζουν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας.

Οι μετασχηματισμοί του πρώτου είδους είναι διεργασίες κατά τις οποίες τα παράγωγα του χημικού δυναμικού αλλάζουν σε σχέση με τη θερμοκρασία ή την πίεση. Αυτό συνεπάγεται μια απότομη αλλαγή κατά τη μετάβαση φάσης τέτοιων θερμοδυναμικών παραμέτρων όπως η εντροπία, ο όγκος, η ενθαλπία και η εσωτερική ενέργεια. Κατά τους μετασχηματισμούς του δεύτερου είδους, οι πρώτες παράγωγοι του χημικού δυναμικού σε σχέση με τις εντατικές παραμέτρους δεν αλλάζουν, αλλά οι παράγωγοι υψηλότερων τάξεων (ξεκινώντας από τη δεύτερη). Σε αυτές τις διεργασίες, με συνεχή εντροπία και όγκο του συστήματος, υπάρχει μια απότομη μεταβολή των ποσοτήτων που εκφράζονται μέσω των δεύτερων παραγώγων της ενέργειας Gibbs: θερμοχωρητικότητα, συντελεστής θερμικής διαστολής, συμπιεστότητα κ.λπ.

Οι αντιδράσεις στερεάς φάσης μεταξύ δύο φάσεων (οι επαφές μεταξύ τριών ή περισσότερων φάσεων είναι απίθανες και οι αντίστοιχες διεργασίες μπορούν να αναπαρασταθούν ως συνδυασμοί πολλών αντιδράσεων δύο φάσεων) είναι διαδικασίες διάχυσης και μπορεί να είναι είτε ετερογενείς είτε ομοιογενείς, με ετερογενή και ομοιογενή πυρήνωση . Ομοιογενείς διεργασίες και διεργασίες με ομοιογενή πυρήνωση σε τέτοιες αντιδράσεις είναι δυνατές, για παράδειγμα, στην περίπτωση σχηματισμού ενός μετασταθερού στερεού διαλύματος με την επακόλουθη αποσύνθεσή του (οι λεγόμενες εσωτερικές αντιδράσεις). Ένα παράδειγμα τέτοιων διαδικασιών είναι η εσωτερική οξείδωση.

Η προϋπόθεση για τη θερμοδυναμική ισορροπία κατά τη διάρκεια ενός μετασχηματισμού στερεάς φάσης, όπως και με κάθε άλλο χημικό μετασχηματισμό, είναι η ισότητα των χημικών δυναμικών των συστατικών στις αρχικές ουσίες και τα προϊόντα αντίδρασης. Όταν δύο στερεές φάσεις αλληλεπιδρούν, η υποδεικνυόμενη ισότητα των χημικών δυναμικών μπορεί να πραγματοποιηθεί με διαφορετικούς τρόπους: 1) ανακατανομή των συστατικών στις αρχικές φάσεις με το σχηματισμό στερεών διαλυμάτων. 2) ο σχηματισμός νέων φάσεων με διαφορετική κρυσταλλική δομή (η οποία, στην πραγματικότητα, συνήθως ονομάζεται αντίδραση στερεάς φάσης), και δεδομένου ότι το χημικό δυναμικό του συστατικού στις διάφορες φάσεις ενός πολυφασικού συστήματος δεν εξαρτάται από την ποσότητα σε κάθε φάση, η ισορροπία μπορεί να επιτευχθεί μόνο με πλήρη μεταμόρφωση των αρχικών φάσεων. Οι πιο αξιόπιστες πληροφορίες σχετικά με τον μηχανισμό των αντιδράσεων στερεάς φάσης λαμβάνονται μέσω πολύπλοκης χρήσης, η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη παρατήρηση πολλών παραμέτρων του αντιδρώντος συστήματος, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης φάσης, των θερμικών επιδράσεων, των αλλαγών μάζας και άλλων.

Η θερμοδυναμική θεωρία των αντιδράσεων στερεάς φάσης προτάθηκε από τον Wagner και αργότερα αναπτύχθηκε από τον Schmalzried χρησιμοποιώντας το παράδειγμα των αντιδράσεων προσθήκης.

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει ενιαία ταξινόμηση μιας μεγάλης ποικιλίας ετερογενών αντιδράσεων. Αυτό οφείλεται στη δυσκολία επιλογής ενός κριτηρίου ως βάσης για μια τέτοια καθολική ταξινόμηση. Σύμφωνα με χημικά κριτήρια, οι αντιδράσεις χωρίζονται σε αντιδράσεις οξείδωσης, αναγωγής, αποσύνθεσης, συνδυασμού, ανταλλαγής κ.λπ. Μαζί με το καθορισμένο κριτήριο, χρησιμοποιείται ευρέως ως το κύριο κριτήριο για τη φυσική κατάσταση των αντιδραστηρίων:

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα όλων των ετερογενών αντιδράσεων είναι η ύπαρξη και ο εντοπισμός στη διεπιφάνεια της ζώνης αντίδρασης. Η ζώνη αντίδρασης, συνήθως μικρού πάχους, χωρίζει δύο περιοχές χώρου που καταλαμβάνουν ουσίες διαφορετικής σύνθεσης και με διαφορετικές ιδιότητες. Οι λόγοι για το σχηματισμό μιας ζώνης αντίδρασης συνήθως χωρίζονται σε δύο ομάδες: τη σχετική βραδύτητα των διεργασιών διάχυσης και τους χημικούς λόγους. Η τελευταία ομάδα οφείλεται στην υψηλή αντιδραστικότητα ατόμων ή μορίων που βρίσκονται στην επιφάνεια ενός στερεού αντιδραστηρίου ή στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο υφιστάμενων φάσεων. Είναι γνωστό ότι η επιφάνεια μιας στερεής ή υγρής ουσίας έχει ιδιότητες διαφορετικές από τις ιδιότητες όγκου ενός συμπαγούς δείγματος. Αυτό καθιστά τις ιδιότητες της διεπαφής φάσης συγκεκριμένες. Εδώ συμβαίνει μια σημαντική αναδιάρθρωση της κρυσταλλικής συσκευασίας, η τάση μεταξύ δύο κρυσταλλικών δικτυωμάτων μειώνεται και εμφανίζεται μια αλλαγή στη χημική σύνθεση.

Δεδομένου ότι η μεταφορά μάζας λαμβάνει χώρα με διάχυση και η κινητικότητα διάχυσης των στερεών σωματιδίων εξαρτάται από την ελαττωματική δομή τους, μπορεί κανείς να αναμένει σημαντική επίδραση των ελαττωμάτων στον μηχανισμό και την κινητική των αντιδράσεων στερεάς φάσης. Αυτό το στάδιο προηγείται του χημικού σταδίου του μετασχηματισμού των αντιδρώντων ουσιών στη διεπιφανειακή διεπιφάνεια. Έτσι, η κινητική των ετερογενών αντιδράσεων καθορίζεται τόσο από τη φύση της ίδιας της χημικής αντίδρασης όσο και από τη μέθοδο παροχής της ουσίας στη ζώνη αντίδρασης. Σύμφωνα με τα σημειωθέντα, ο ρυθμός αντίδρασης θα περιοριστεί από το χημικό στάδιο (χημική κινητική) ή τη διάχυση (κινητική διάχυσης). Αυτό το φαινόμενο παρατηρείται στην πραγματικότητα.

Σύμφωνα με τον Wagner, η διάχυση και, κατά συνέπεια, η αντίδραση στα στερεά πραγματοποιείται κυρίως λόγω της κινητικότητας των ιόντων και των ηλεκτρονίων, που προκαλείται από την κατάσταση μη ισορροπίας του πλέγματος. Διαφορετικά ιόντα πλέγματος κινούνται μέσα από αυτό με διαφορετικές ταχύτητες. Συγκεκριμένα, η κινητικότητα των ανιόντων στη συντριπτική πλειονότητα των περιπτώσεων είναι αμελητέα σε σύγκριση με την κινητικότητα των κατιόντων. Επομένως, η διάχυση και, κατά συνέπεια, η αντίδραση στα στερεά πραγματοποιείται λόγω της κίνησης των κατιόντων. Σε αυτή την περίπτωση, η διάχυση διαφορετικών κατιόντων μπορεί να προχωρήσει προς την ίδια κατεύθυνση ή το ένα προς το άλλο. Με κατιόντα διαφορετικών φορτίων, η ηλεκτρική ουδετερότητα του συστήματος διατηρείται λόγω της κίνησης των ηλεκτρονίων. Λόγω της διαφοράς στους ρυθμούς κίνησης των διαφορετικά φορτισμένων κατιόντων στο σύστημα, προκύπτει ηλεκτρικό δυναμικό. Ως αποτέλεσμα, η ταχύτητα κίνησης των περισσότερων κινητών ιόντων μειώνεται και, αντίστροφα, για τα λιγότερο κινητά; αυξάνει. Έτσι, το ηλεκτρικό δυναμικό που προκύπτει ρυθμίζει τους ρυθμούς διάχυσης των ιόντων. Το τελευταίο και ο ρυθμός ολόκληρης της διαδικασίας μετασχηματισμού στερεάς φάσης που καθορίζεται από αυτό μπορούν να υπολογιστούν με βάση την ηλεκτρονική αγωγιμότητα και τους αριθμούς μεταφοράς. Είναι προφανές ότι η κατευθυνόμενη διάχυση ιόντων είναι δυνατή μόνο σε ηλεκτρικό πεδίο ή παρουσία βαθμίδωσης συγκέντρωσης στο σύστημα.

Κατά τη σύνθεση ουσιών σε στερεή κατάσταση, είναι συχνά απαραίτητο να ελέγχεται όχι μόνο η χημική (στοιχειακή και φάση) σύνθεση του προκύπτοντος προϊόντος, αλλά και η μικροδομική του οργάνωση. Αυτό οφείλεται στην ισχυρή εξάρτηση τόσο των χημικών (για παράδειγμα, δραστηριότητας σε αντιδράσεις στερεάς φάσης) όσο και πολλών φυσικών (μαγνητικών, ηλεκτρικών, οπτικών, κ.λπ.) ιδιοτήτων από τα χαρακτηριστικά της δομικής οργάνωσης ενός στερεού σε διάφορα ιεραρχικά επίπεδα. Το πρώτο από αυτά τα επίπεδα περιλαμβάνει τη στοιχειακή σύνθεση ενός στερεού και τη μέθοδο σχετικής διάταξης των ατόμων στοιχείων στο χώρο - την κρυσταλλική δομή (ή χαρακτηριστικά του άμεσου περιβάλλοντος συντονισμού των ατόμων σε άμορφα στερεά), καθώς και τη σύνθεση και τη συγκέντρωση των σημειακών ελαττωμάτων. Ως το επόμενο επίπεδο της δομής του στερεού σώματος, μπορούμε να θεωρήσουμε την κατανομή των εκτεταμένων ελαττωμάτων στον κρύσταλλο, η οποία καθορίζει τα μεγέθη των περιοχών στις οποίες (προσαρμοσμένες για την ύπαρξη σημειακών ελαττωμάτων) παρατηρείται μεταφορική συμμετρία στη διάταξη των ατόμων. Τέτοιες περιοχές μπορούν να θεωρηθούν τέλειοι μικροκρύσταλλοι και ονομάζονται περιοχές συνεκτικής σκέδασης. Μιλώντας για συνεκτικές περιοχές σκέδασης, είναι απαραίτητο να θυμόμαστε ότι στη γενική περίπτωση δεν είναι ισοδύναμες με τα συμπαγή σωματίδια που σχηματίζουν ένα υλικό στερεάς φάσης, το οποίο μπορεί να περιέχει σημαντικό αριθμό εκτεταμένων ελαττωμάτων και, κατά συνέπεια, συνεκτικές περιοχές σκέδασης. Η σύμπτωση συνεκτικών περιοχών σκέδασης με σωματίδια (τα οποία σε αυτήν την περίπτωση ονομάζονται μονοτομείς) παρατηρείται συνήθως μόνο για αρκετά μικρά (λιγότερα από 100 nm) μεγέθη των τελευταίων. Τα επόμενα δομικά επίπεδα μπορούν να συσχετιστούν με το σχήμα και την κατανομή μεγέθους των σωματιδίων που σχηματίζουν το κονιώδες ή κεραμικό υλικό, τη συσσωμάτωση τους, τη συσσωμάτωση των πρωτογενών αδρανών κ.λπ.

Διαφορετικές εφαρμογές υλικών στερεάς φάσης έχουν διαφορετικές, συχνά αντίθετες απαιτήσεις για τα δομικά χαρακτηριστικά που αναφέρονται παραπάνω και επομένως απαιτούν διαφορετικές συνθετικές μεθόδους. Ως εκ τούτου, είναι πιο σωστό να μιλάμε για μεθόδους σύνθεσης όχι ουσιών στερεάς φάσης, αλλά υλικών στερεάς φάσης, και σε κάθε περίπτωση, επιλέξτε μια μέθοδο σύνθεσης λαμβάνοντας υπόψη την περιοχή της επακόλουθης εφαρμογής του προϊόντος που προκύπτει.

Γενικά, οι μέθοδοι για τη σύνθεση υλικών στερεάς φάσης μπορούν να ταξινομηθούν ανάλογα με την απόστασή τους από τις συνθήκες θερμοδυναμικής ισορροπίας για την εμφάνιση των χημικών διεργασιών που χρησιμοποιούνται. Σύμφωνα με τους γενικούς νόμους, υπό συνθήκες που αντιστοιχούν σε μια κατάσταση που είναι σε μέγιστη απόσταση από την κατάσταση ισορροπίας, παρατηρείται σημαντική υπέρβαση του ρυθμού πυρήνωσης έναντι του ρυθμού ανάπτυξης των σχηματισμένων πυρήνων, γεγονός που προφανώς οδηγεί στην παραγωγή των πιο διασκορπισμένων προϊόν. Εάν η διαδικασία εκτελείται κοντά σε θερμοδυναμική ισορροπία, η ανάπτυξη των ήδη σχηματισμένων πυρήνων συμβαίνει ταχύτερα από το σχηματισμό νέων, γεγονός που με τη σειρά του καθιστά δυνατή τη λήψη χονδρόκρυσταλλων (στην περιοριστική περίπτωση, μονοκρυσταλλικών) υλικών. Ο ρυθμός ανάπτυξης των κρυστάλλων καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη συγκέντρωση εκτεταμένων (μη ισορροπίας) ελαττωμάτων σε αυτά.

Η συνδυαστική σύνθεση μπορεί να πραγματοποιηθεί όχι μόνο σε διάλυμα (σύνθεση υγρής φάσης), αλλά και στην επιφάνεια μιας στερεής, χημικά αδρανούς φάσης. Σε αυτή την περίπτωση, η πρώτη αρχική ουσία «συνδέεται» χημικά με λειτουργικές ομάδες στην επιφάνεια του πολυμερούς φορέα (τις περισσότερες φορές χρησιμοποιείται δεσμός εστέρα ή αμιδίου) και επεξεργάζεται με διάλυμα της δεύτερης αρχικής ουσίας, το οποίο λαμβάνεται σε σημαντικό βαθμό. υπερβάλλουμε έτσι ώστε η αντίδραση να προχωρήσει στην ολοκλήρωση. Υπάρχει κάποια ευκολία σε αυτή τη μορφή αντίδρασης, καθώς η τεχνική της απομόνωσης προϊόντων είναι απλοποιημένη: το πολυμερές (συνήθως με τη μορφή κόκκων) απλώς φιλτράρεται, πλένεται καλά για να αφαιρεθεί τυχόν υπολειπόμενο αντιδραστήριο και η ένωση στόχος διασπάται χημικά από το.

Στην οργανική χημεία δεν υπάρχει ούτε μία αντίδραση που στην πράξη να παρέχει ποσοτικές αποδόσεις των προϊόντων-στόχων σε κάθε περίπτωση. Η μόνη εξαίρεση είναι, προφανώς, η πλήρης καύση οργανικών ουσιών σε οξυγόνο σε υψηλές θερμοκρασίες σε CO 2 και H 2 O. Επομένως, ο καθαρισμός του προϊόντος στόχου είναι πάντα απαραίτητος και συχνά το πιο δύσκολο και χρονοβόρο έργο. Ένα ιδιαίτερα δύσκολο έργο είναι η απομόνωση προϊόντων πεπτιδικής σύνθεσης, για παράδειγμα, ο διαχωρισμός ενός πολύπλοκου μίγματος πολυπεπτιδίων. Ως εκ τούτου, είναι στη σύνθεση πεπτιδίων που η μέθοδος σύνθεσης σε ένα στερεό πολυμερές υπόστρωμα, που αναπτύχθηκε στις αρχές της δεκαετίας του '60 του 20ου αιώνα από τον R.B. Merifield, έχει γίνει πιο διαδεδομένη.

Ο φορέας πολυμερούς στη μέθοδο Merrifield είναι κοκκώδης διασταυρούμενη πολυστυρένιο που περιέχει ομάδες χλωρομεθυλίου σε πυρήνες βενζολίου, οι οποίοι είναι συνδετήρες που συνδέουν το υπόστρωμα με το πρώτο υπόλειμμα αμινοξέος του πολυπεπτιδίου. Αυτές οι ομάδες μετατρέπουν το πολυμερές σε ένα λειτουργικό ανάλογο του βενζυλοχλωριδίου και του δίνουν την ικανότητα να σχηματίζει εύκολα εστερικούς δεσμούς όταν αντιδρά με καρβοξυλικά ανιόντα. Η συμπύκνωση μιας τέτοιας ρητίνης με Ν-προστατευμένα αμινοξέα οδηγεί στον σχηματισμό των αντίστοιχων βενζυλεστέρων. Η αφαίρεση της Ν-προστασίας παράγει ένα C-προστατευμένο παράγωγο του πρώτου αμινοξέος που είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με το πολυμερές. Η αμινοακυλίωση της απελευθερωμένης αμινομάδας με ένα Ν-προστατευμένο παράγωγο του δεύτερου αμινοξέος που ακολουθείται από την αφαίρεση της Ν-προστασίας έχει ως αποτέλεσμα ένα παρόμοιο διπεπτιδικό παράγωγο επίσης συνδεδεμένο στο πολυμερές:

Ένας τέτοιος κύκλος δύο σταδίων (αποπροστασία - αμινοακυλίωση) μπορεί, κατ' αρχήν, να επαναληφθεί όσες φορές απαιτείται για τη δημιουργία μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας δεδομένου μήκους.

Η περαιτέρω ανάπτυξη των ιδεών του Merifield στόχευε, πρώτα απ' όλα, στην αναζήτηση και δημιουργία νέων πολυμερών υλικών για υποστρώματα, στην ανάπτυξη μεθόδων διαχωρισμού προϊόντων και στη δημιουργία αυτοματοποιημένων εγκαταστάσεων για ολόκληρο τον κύκλο της πολυπεπτιδικής σύνθεσης

Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου του Merifield αποδείχθηκε από την επιτυχή σύνθεση ενός αριθμού φυσικών πολυπεπτιδίων, ιδιαίτερα της ινσουλίνης. Τα πλεονεκτήματά του αποδείχθηκαν ιδιαίτερα καθαρά χρησιμοποιώντας το παράδειγμα της σύνθεσης του ενζύμου ριβονουκλεάση. Για παράδειγμα, με κόστος σημαντικής προσπάθειας για αρκετά χρόνια, ο Hirschman και 22 συνεργάτες συνέθεσαν το ένζυμο ριβονουκλεάση (124 υπολείμματα αμινοξέων) χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους υγρής φάσης. Σχεδόν ταυτόχρονα, η ίδια πρωτεΐνη ελήφθη με αυτοματοποιημένη σύνθεση στερεάς φάσης. Στη δεύτερη περίπτωση, μια σύνθεση που περιελάμβανε συνολικά 11.931 διαφορετικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων 369 χημικών αντιδράσεων, ολοκληρώθηκε από δύο συμμετέχοντες (Gatte και Merrifield) μέσα σε λίγους μόνο μήνες.

Οι ιδέες του Merrifield χρησίμευσαν ως βάση για τη δημιουργία διαφόρων μεθόδων για τη συνδυαστική σύνθεση βιβλιοθηκών πολυπεπτιδίων διαφόρων δομών.

Έτσι, το 1982, προτάθηκε μια πρωτότυπη στρατηγική για την παράλληλη σύνθεση πολλαπλών σταδίων των πεπτιδίων στη στερεά φάση, γνωστή ως «μέθοδος διαχωρισμού». διαίρεση- σχίσιμο, διαχωρισμός) ή η μέθοδος «αναμείξτε και διαιρέστε» (Εικ. 3). Η ουσία του είναι η εξής. Ας πούμε ότι από τρία αμινοξέα (Α, Β και Γ) πρέπει να λάβετε όλους τους πιθανούς συνδυασμούς τριπεπτιδίων. Για να γίνει αυτό, οι κόκκοι του στερεού πολυμερούς φορέα (Ρ) χωρίζονται σε τρία ίσα μέρη και υποβάλλονται σε επεξεργασία με ένα διάλυμα ενός από τα αμινοξέα. Στην περίπτωση αυτή, όλα τα αμινοξέα συνδέονται χημικά στην επιφάνεια του πολυμερούς με μία από τις λειτουργικές τους ομάδες. Οι τρεις ποιότητες πολυμερών που προκύπτουν αναμιγνύονται επιμελώς και το μείγμα χωρίζεται και πάλι σε τρία μέρη. Κάθε τμήμα που περιέχει και τα τρία αμινοξέα σε ίσες ποσότητες στη συνέχεια υποβάλλεται σε επεξεργασία ξανά με ένα από τα ίδια τρία αμινοξέα για να παραχθούν εννέα διπεπτίδια (τρία μείγματα τριών προϊόντων). Μια άλλη ανάμειξη, διαίρεση σε τρία ίσα μέρη και επεξεργασία με αμινοξέα δίνει τα επιθυμητά 27 τριπεπτίδια (τρία μείγματα εννέα προϊόντων) σε μόλις εννέα στάδια, ενώ η λήψη τους ξεχωριστά θα απαιτούσε σύνθεση 27 × 3 = 81 βημάτων.

"Βιολόγος. περιοδικό Αρμενία, 1 (65), 2013 ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΡΔΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΚΟΛΠΙΟ ΧΟΙΡΟΥ Γ.Σ. CHAILYAN Ινστιτούτο Βιοχημείας που πήρε το όνομά του. Bunyatyan NAS RA..."

Πειραματικά και θεωρητικά άρθρα

Πειραματικά και θεωρητικά άρθρα

Βιολόγος. περιοδικό Αρμενία, 1 (65), 2013

ΣΥΝΘΕΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΡΔΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ,

ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟ ΑΠΟ ΑΤΡΙΑ ΧΟΙΡΟΥ

Γ.Σ. ΧΑΪΛΙΑΝ

Ινστιτούτο Βιοχημείας που πήρε το όνομά του. Bunyatyan NAS RA

[email προστατευμένο].

Για να συνεχίσει την έρευνα, ακαδ. Galoyan, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων για την απομόνωση, τον καθαρισμό και τον προσδιορισμό του βιολογικού προσανατολισμού των πρόσφατα απομονωθέντων πεπτιδικών ενώσεων από τους κόλπους και τα αυτιά της καρδιάς του χοίρου. Για τη διεξαγωγή βιοδοκιμών, ήταν απαραίτητο να ληφθούν προπαρασκευαστικές ποσότητες των δειγμάτων δοκιμής. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο της σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση με την περαιτέρω τροποποίησή της. Η καθαρότητα και η ταυτότητα των συντιθέμενων φαρμάκων επαληθεύτηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και φασματική ανάλυση μάζας.

Σύνθεση στερεάς φάσης – fmoc-αμινοξέα – HPLC – φαινυλισοθειοκυανικό – ανάλυση φασματικής μάζας:

fmoc- – – Για περαιτέρω μελέτες που πραγματοποιήθηκαν από τον Galoyan, διεξήχθη μια σειρά πειραμάτων σχετικά με την απομόνωση, τον καθαρισμό και τον προσδιορισμό της βιολογικής κατεύθυνσης των πεπτιδίων που απομονώθηκαν από κόλπους χοίρων. Για την εκπλήρωση των βιοδοκιμών απαιτήθηκε η προπαρασκευαστική ποσότητα δειγμάτων. Χρησιμοποιήθηκε μια τροποποιημένη μέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς φάσης. Η καθαρότητα και η ταυτότητα του συντιθέμενου πεπτιδίου ορίστηκαν με HPLC και ανάλυση φάσματος μάζας.

Σύνθεση στερεάς φάσης – υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης – φασματομετρία μάζας – fmoc-αμινοξέα – καρδιοπεπτίδια – κόλποι Για πολλά χρόνια στο Ινστιτούτο Βιοχημείας της Εθνικής Ακαδημίας Επιστημών της Δημοκρατίας της Αρμενίας στο τμήμα βιοχημείας των νευροορμονών, Acad. Ο Galoyan και οι συνεργάτες του μελέτησαν τις ρυθμιστικές οδούς και τους μηχανισμούς δράσης των υποθαλαμικών νευροορμονών σε διάφορες διεργασίες στο σώμα.

Η επιβεβαίωση της ιδέας της διασυνδεδεμένης, αλληλοεξαρτώμενης, ολοκληρωμένης λειτουργίας ενός τέτοιου συστήματος όπως ο υποθάλαμος - υπόφυση - επινεφρίδια ήταν ένα σημείο καμπής στην ενδοκρινολογία. Αναπλήρωση αυτής της έννοιας ΣΤΕΡΕΑ ΦΑΣΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΡΔΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΑΠΟΣΤΟΛΩΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΚΟΛΠΙΟ ΧΟΙΡΟΥ της τριάδας που προτάθηκε από τον Galoyan σχετικά με την αλληλεπίδραση υποθάλαμου - υπόφυσης

– καρδιά, είναι ένα τεράστιο επιστημονικό επίτευγμα. Στη συνέχεια, ανακαλύφθηκε ένας νέος ιστός στόχος, η καρδιά, αποδείχθηκε η ικανότητα αυτού του οργάνου να ελέγχει τη λειτουργία συγκεκριμένων πεπτιδίων, καθώς και η ύπαρξη μηχανισμού ανάδρασης μεταξύ του υποθαλάμου και της καρδιάς μέσω αυτών των πεπτιδίων.

Η ανακάλυψη καρδιοενεργών ενώσεων - νευροορμόνες K, C, G και μια σειρά άλλων στον υποθάλαμο διαφόρων ζώων χρησίμευσε ως αρχή της εργασίας όχι μόνο για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών δράσης αυτών των νευροορμονών, αλλά και για την αναζήτηση παρόμοιων ενώσεων στην καρδιά. Η βάση για μια ολοκληρωμένη μελέτη των βιοχημικών και φυσικοχημικών ιδιοτήτων των καρδιοενεργών αρχών ήταν τα δεδομένα σχετικά με την παρουσία 2 καρδιοενεργών ενώσεων στον καρδιακό μυ. Διαπιστώθηκε η συμμετοχή της νευροορμόνης «C» στη ρύθμιση των γλυκολυτικών διεργασιών και του επιπέδου των κυκλικών νουκλεοτιδίων μέσω της αναστολής του PDE cAMP, της εξαρτώμενης από cAMP πρωτεϊνικής κινάσης κ.λπ. Αυτή η ένωση έχει αποδειχθεί ότι είναι χαμηλού μοριακού βάρους και ταξινομείται ως γλυκοπεπτίδιο.

Στο εργαστήριο αναλυτικής χρωματογραφίας και σύνθεσης πεπτιδίων, πραγματοποιήσαμε εργασίες για την απομόνωση και τον καθαρισμό πεπτιδικών ενώσεων από τους κόλπους και τις ωτικές ζώνες της καρδιάς του χοίρου. Κατά τον διαχωρισμό των πεπτιδικών κλασμάτων με παρασκευαστική HPLC, απομονώσαμε και καθαρίσαμε 20 ενώσεις πεπτιδικής φύσης σε ομοιογενή κατάσταση. Για να προσδιοριστεί η βιολογική κατεύθυνση, όλα τα φάρμακα δοκιμάστηκαν για αλλαγές στα συστατικά του ΗΚΓ σε αρουραίους. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι 7 ενώσεις έχουν διαφορετικές επιδράσεις σε ορισμένα συστατικά του ΗΚΓ.

Το πεπτίδιο Νο. 7 έδειξε τη μεγαλύτερη δραστηριότητα στην αλλαγή του πλάτους του συστατικού R, της διάρκειας του συμπλέγματος QRS, του πλάτους του S και άλλων παραμέτρων.

Για τη μελέτη των βιολογικών μηχανισμών δράσης αυτού του φαρμάκου, κατέστη απαραίτητο να έχουμε μεγάλο αριθμό δειγμάτων δοκιμής. Λόγω του γεγονότος ότι η διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού βιολογικών προϊόντων είναι εξαιρετικά αναποτελεσματική, έντασης εργασίας, χρονοβόρα και δεν μπορεί να προσφέρει καλή αναπαραγωγιμότητα, η χημική σύνθεση αυτού του φαρμάκου έχει καταστεί εξαιρετικά επείγουσα. Αναλύοντας την παγκόσμια βιβλιογραφία στον τομέα της χημικής σύνθεσης πεπτιδίων, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η βέλτιστη μέθοδος για εμάς είναι η μέθοδος σύνθεσης στερεάς φάσης χρησιμοποιώντας αμινοξέα προστατευμένα με fmoc. Ανακαλύφθηκε το 1984, η σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη συμβατική σύνθεση όσον αφορά την αποτελεσματικότητα, καθώς και την εύκολη επεξεργασία και καθαρισμό.

Χρησιμοποιώντας πολλές διαφορετικές μεθόδους: υδρόλυση αυτού του φαρμάκου, τροποποίηση αμινοξέων με ισοθειοκυανικό φαινύλιο, λάβαμε τη σύνθεση αμινοξέων του πεπτιδίου Νο. 7. Χρησιμοποιώντας δεδομένα από αναλύσεις φάσματος μάζας και NMR και αποικοδόμηση Edmond, μπορέσαμε να λάβουμε όχι μόνο τη σύνθεση αμινοξέων, αλλά και την αλληλουχία αμινοξέων του πεπτιδίου Νο. 7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Μια αποτελεσματική διαδικασία σύνθεσης στερεάς φάσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη σωστή επιλογή διαφόρων συνθηκών για την εφαρμογή της, όπως η επιλογή της ρητίνης, του διαλύτη και της κινητικής σύνθεσης. Αυτές οι μεταβλητές επηρεάζουν τον βαθμό διόγκωσης της ρητίνης και τη σύνδεσή της με αμινοξέα, τον αριθμό των θέσεων δέσμευσης, κάτι που τελικά επηρεάζει τη σύνθεση του πεπτιδίου στο σύνολό του. Προσαρμόσαμε τη διαδικασία σύνθεσης στερεάς φάσης στα πεπτίδια που μελετήσαμε, λαμβάνοντας υπόψη τις ιδιαιτερότητες της αλληλουχίας αμινοξέων τους.

Γ.Σ. CHAILIAN Υλικά και μέθοδοι. Όλα τα χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια, διαλύτες, ρητίνες προέρχονται από την Advanced Chem Techcompany. Χρησιμοποιήσαμε ομάδες fmoc για να προστατεύσουμε τα Ν-άκρα των αμινοξέων κατά τη σύνθεση και το διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) ως διαλύτη καθ' όλη τη διάρκεια της σύνθεσης. Ως στήριγμα χρησιμοποιήσαμε 2-χλωροτριτυλ ρητίνη ασταθή στα οξέα. Η αποπροστασία των fmoc ομάδων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα πιπεριδίνης σε DMF.

Πολύ σημαντική στη διαδικασία της σύνθεσης είναι η τοποθέτηση του πρώτου αμινοξέος στη ρητίνη. Δύο γραμμάρια ρητίνης 2Cl-Trt χύθηκαν σε σύριγγα των 10 ml. Το DMF τραβήχτηκε σε μια σύριγγα και η ρητίνη αφέθηκε να διογκωθεί για 15 λεπτά. Το DMF στη συνέχεια ξεπλύθηκε. Στη συνέχεια, ένα διάλυμα του πρώτου αμινοξέος (fmoc-Pro) και ενός ενεργοποιητή αντίδρασης (DIPEA) αναρροφήθηκε στη σύριγγα σε αναλογία 1RESIN/1,2FMOC-PRO/4DIPEA. Η αντίδραση για την προσθήκη του πρώτου αμινοξέος διήρκεσε 3 ώρες.Πολύ σημαντική προϋπόθεση για τη σύνθεση είναι η απουσία ελεύθερων συνδετήρων μετά την προσθήκη του πρώτου αμινοξέος, έτσι η ρητίνη, αφού δεσμεύτηκε με το πρώτο αμινοξύ, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα μείγμα μεθυλενίου, DIPEA (διισοπροϋλαιθυλαμίνη) και DMF σε αναλογία 80DMF/15MEOH/5DIPEA για να μπλοκάρουν πιθανώς τα εναπομείναντα ελεύθερα άκρα. Μετά από αυτό, η ρητίνη DMF πλύθηκε 5 φορές για 5 λεπτά. Κατόπιν τα αμινοξέα αποδεσμεύτηκαν με ένα διάλυμα πιπιδίνης 30% σε DMF 8 φορές για 5 λεπτά. Μετά από αυτό, η ρητίνη πλύθηκε με DMF 5 φορές για 5 λεπτά. Αυτός ο κύκλος επαναλήφθηκε καθ' όλη τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης. Μετά από κάθε βήμα προσθήκης και αποδέσμευσης αμινοξέων, η πρόοδος της αντίδρασης παρακολουθήθηκε με τη δοκιμή Kaiser, η οποία είναι η αντίδραση της νινυδρίνης με μια ελεύθερη αμινομάδα για να σχηματιστεί ένα χαρακτηριστικό σκούρο μπλε χρώμα. Χάρη σε αυτό το τεστ, έγινε δυνατή η σταδιακή παρακολούθηση των αντιδράσεων δέσμευσης και αποδέσμευσης αμινοξέων.

Ο καθαρισμός και ο έλεγχος του συντεθέντος πεπτιδίου Νο. 7 διεξήχθησαν σε ένα παρασκευαστικό σύστημα HPLC 2 συστατικών από την Waters (ΗΠΑ). Για την έγχυση του δείγματος χρησιμοποιήθηκε ένας εγχυτήρας Rheodyne με όγκο βρόχου 500 μL. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε στην περιοχή 190-360 nm. Χρησιμοποιήσαμε στήλη Symmetry Si-100 C18 (4,6x250 mm) για HPLC αντίστροφης φάσης. Ο ρυθμός ροής ήταν 50 ml/min. Χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα εκλούσεως βαθμίδωσης H2O/ACN/TFA (98/2/0.1)/(0.100.0.1). Χρόνος ανάλυσης 15 λεπτά. Πραγματοποιήθηκε επαναχρωματογραφία σε αναλυτικό σύστημα HPLC Knauer. Χρησιμοποιήθηκε στήλη XbridgeC18 (2,6x150 mm). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε στα 214 nm.

Για να επιβεβαιωθούν τα δεδομένα που ελήφθησαν, το συνθετικό φάρμακο υποβλήθηκε σε φασματική ανάλυση μάζας στο CSU "Analitycal spectrometry".

Αποτελέσματα και συζήτηση. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από το χρωματογράφημα υποδηλώνουν ότι η καθαρότητα του συντιθέμενου πεπτιδίου Νο. 7 μετά τον καθαρισμό είναι μεγαλύτερη από 99,6% (Εικ. 1).

–  –  –

Πραγματοποιήσαμε μια συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση του φυσικού πεπτιδίου Νο. 7 σε μια στήλη X-bridgeC18 υπό τις ίδιες συνθήκες με το συντιθέμενο ανάλογό του. Παρουσιάζονται τα αποτελέσματα σύγκρισης (Εικ. 2).

ΣΥΝΘΕΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΡΔΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΚΟΛΠΙΟ ΧΟΙΡΟΥ

–  –  –

Ρύζι. 4. Φασματογράμματα συντιθέμενων (Α) και φυσικών (Β) φαρμάκων.

Γ.Σ. CHAILIAN Όπως μπορεί να φανεί από μια σύγκριση χρωματογραφημάτων, το συντιθέμενο ανάλογο και το φυσικό πεπτίδιο Νο. 7 είναι πανομοιότυπα σε μάζα και χρόνο απελευθέρωσης, γεγονός που υποδεικνύει την ταυτότητα των δομών τους και την αλληλουχία αμινοξέων τους. Έτσι, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σύνθεσης πεπτιδίου στερεάς φάσης και λαμβάνοντας υπόψη τα δομικά χαρακτηριστικά του υπό μελέτη πεπτιδίου, καταφέραμε να αποκτήσουμε ένα ομοιογενές και πανομοιότυπο με το φυσικό πεπτίδιο, αποτελούμενο από 9 αμινοξέα. Στο μέλλον, έχοντας επαρκή ποσότητα του φαρμάκου, σχεδιάζουμε να πραγματοποιήσουμε μια σειρά βιοδοκιμών για να εντοπίσουμε όχι μόνο τους τρόπους με τους οποίους αυτό το πεπτίδιο ρυθμίζει την καρδιακή δραστηριότητα, αλλά και τους μηχανισμούς δράσης σε άλλα όργανα και συστήματα.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Ανίχνευση και αναγνώριση νέου 1 στην καρδιά ενός ταύρου.

καρδιοδραστικές πρωτεΐνες. Ερώτηση μέλι. Chemistry, 37, 2, p. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Απομόνωση και χαρακτηρισμός 2.

καρδιοενεργό θρυπτικό θραύσμα της πρωτεΐνης φορέα της νευροορμόνης «C». Neurochemistry, 2, 3, p. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Διαχωρισμός στεφανιαίων δραστικών ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους 3.

καρδιακού μυός χρησιμοποιώντας συνδυασμό μεθόδων διήθησης γέλης και ηλεκτροφόρησης γέλης πολυακρυλαμιδίου. Βιολόγος. περιοδικό Αρμενία, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, Α.Α. Κατανομή συμπλοκών καρδιοενεργών πρωτεϊνών στην καρδιά διαφόρων ζώων. Βιολόγος. περιοδικό Αρμενία, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Βιοχημεία Νέων Καρδιοενεργών Ορμονών και Ανοσοτροποποιητών του Λειτουργικού Συστήματος Νευροεκκριτικός Υποθάλαμος, Ενδοκρινική Καρδιά. Science Publ. Π. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Ο καθαρισμός των στεφανιαίων πρωτεϊνών που απομονώνονται από τον υποθάλαμο. Dokl. Ακαδ. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. March’s advanced organic chemistry. Έκδοση John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, σελ. 133, 2007.

–  –  –

Παρόμοιες εργασίες:

"ΕΚΔΟΤΙΚΟΣ ΟΙΚΟΣ "ΚΟΙΝΩΝΙΕΣ" "SCIENCE" Μόσχα 1979 UDC 581.55:56.017 Plotnikov V.V. Εξέλιξη της δομής των φυτικών κοινοτήτων. Μ.: Επιστήμη, σελ. 1979, 276 Για το σύγχρονο μέταλ...»

«Ειδήσεις του Ταμείου Μουσείου με το όνομα. A.A. Brauner Νο. 2 Τόμος Ι 2004 Ειδήσεις του Ταμείου Μουσείου με το όνομα. "

Η εφεύρεση αναφέρεται σε μια μέθοδο στερεάς φάσης για τη σύνθεση ενός πεπτιδίου του τύπου H-D--Nal--Thr-NH2, η οποία χρησιμοποιεί αμινοξέα αμινοξέα προστατευμένα με Boc και Fmoc και ρητίνη χλωρομεθυλιωμένης πολυστυρενίου. 10 μισθός πετώ.

Πεδίο τεχνολογίας στο οποίο αναφέρεται η εφεύρεση

Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με μια μέθοδο για την παρασκευή ενός πεπτιδίου που περιέχει τρία ή περισσότερα υπολείμματα αμινοξέος, που έχει ένα αμινοξύ Ν-τερματικό, ένα προτελευταίο αμινοξύ δίπλα στο Ν-τερματικό αμινοξύ και ένα Ο-τερματικό αμινοξύ.

Προηγούμενη τέχνη

Η σύνθεση πεπτιδίου στερεάς φάσης εισήχθη το 1963 για να ξεπεραστούν πολλά από τα προβλήματα των ενδιάμεσων σταδίων καθαρισμού που σχετίζονται με την πεπτιδική σύνθεση σε διάλυμα (Stewart et. αϊ. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). Στη σύνθεση στερεάς φάσης, τα αμινοξέα συναρμολογούνται (π.χ. συνενώνονται) σε ένα πεπτίδιο οποιασδήποτε επιθυμητής αλληλουχίας ενώ το ένα άκρο της αλυσίδας (π.χ. το C-άκρο) είναι προσαρτημένο σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα. Μόλις η επιθυμητή αλληλουχία έχει συναρμολογηθεί στο υπόστρωμα (στήριγμα), το πεπτίδιο στη συνέχεια απελευθερώνεται (δηλαδή, αποκόπτεται) από το υπόστρωμα. Δύο τυπικές προστατευτικές ομάδες για τις α-αμινο ομάδες των συνδεόμενων αμινοξέων είναι το Boc, το οποίο αφαιρείται με ένα ισχυρό οξύ και το Fmoc, το οποίο αφαιρείται με μια βάση. Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μια βολική μέθοδο για την παραγωγή πεπτιδίων χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό και των δύο αυτών α-αμινοπροστασίες σε μια μοναδική σύνθεση σε μια φθηνή ρητίνη χλωρομεθυλιωμένου πολυστυρολίου.

Όταν αναπτύσσεται σύνθεση πεπτιδίου στερεάς φάσης χρησιμοποιώντας οποιοδήποτε από τα προαναφερθέντα σχήματα προστασίας α-αμινο ομάδας, είναι σημαντικό οποιεσδήποτε αντιδραστικές «πλευρικές ομάδες» των συστατικών αμινοξέων του πεπτιδίου να προστατεύονται από ανεπιθύμητες χημικές αντιδράσεις κατά τη συναρμολόγηση της αλυσίδας. Είναι επίσης επιθυμητό οι χημικές ομάδες που επιλέγονται για την προστασία των διαφόρων πλευρικών ομάδων να μην αφαιρούνται από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την αποπροστασία των α-αμινο ομάδων. Τρίτον, είναι σημαντικό η σύνδεση της αναπτυσσόμενης πεπτιδικής αλυσίδας με το σωματίδιο ρητίνης να είναι ανθεκτική στα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία συναρμολόγησης της αλυσίδας για την αφαίρεση οποιουδήποτε τύπου προστασίας αμινομάδας. Στην περίπτωση ενός σχήματος προστασίας α-αμινο ομάδας που χρησιμοποιεί Fmoc, η προστασία πλευρικής ομάδας πρέπει να είναι ανθεκτική στα αλκαλικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση του Fmoc. Στην πράξη, αυτές οι προστατευτικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας συνήθως αφαιρούνται με ασθενώς όξινα αντιδραστήρια αφού ολοκληρωθεί η διάταξη της πεπτιδικής αλυσίδας. Εάν χρησιμοποιείται το σχήμα α-αμινο προστασίας που χρησιμοποιεί Boc, η προστασία πλευρικής ομάδας πρέπει να είναι ανθεκτική στο ασθενώς όξινο αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται για την αφαίρεση της ομάδας Boc σε κάθε κύκλο. Στην πράξη, αυτές οι προστατευτικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας στο σχήμα προστασίας α-αμινο με Boc συνήθως αφαιρούνται με άνυδρο HF μετά την ολοκλήρωση της συναρμολόγησης της πεπτιδικής αλυσίδας. Έτσι, στην πράξη, οι ομάδες που χρησιμοποιούνται συνήθως για την προστασία των πλευρικών αλυσίδων στο σχήμα προστασίας -αμινοομάδας με Fmoc είναι ασταθείς υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται για την αποπροστασία των -αμινομάδων με Boc. Επομένως, οι δύο τύποι σχημάτων για την προστασία των α-αμινο ομάδων κατά τη συναρμολόγηση της πεπτιδικής αλυσίδας στη σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης δεν συνδυάζονται. Επιπλέον, παρόλο που η φθηνότερη πολυμερής ρητίνη που χρησιμοποιείται στη σύνθεση πεπτιδίων (χλωρομεθυλιωμένο πολυστυρένιο ή "Ρητίνη Merifield") χρησιμοποιείται ευρέως μαζί με αμινοξέα που προστατεύονται από ομάδες Boc, η βιβλιογραφία καταλήγει στο συμπέρασμα ότι δεν είναι εφαρμόσιμη στην περίπτωση προστασίας α-αμινο ομάδες από ομάδες Fmoc λόγω της αστάθειάς του υπό αλκαλικές συνθήκες (βλέπε Stewart et. αϊ. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2η έκδ., 1984). Η παρούσα εφεύρεση απευθύνεται σε μια μέθοδο για το συνδυασμό αμινοξέων αμινοξέων που προστατεύονται από Boc και Fmoc σε ρητίνη Merifield κατά τη διάρκεια της σύνθεσης σε στερεά φάση ορισμένων πεπτιδίων.

Το Lanreotide®, το οποίο είναι ανάλογο της σωματοστατίνης, είναι γνωστό ότι αναστέλλει την απελευθέρωση αυξητικής ορμόνης και επίσης αναστέλλει την έκκριση ινσουλίνης, γλυκαγόνης και εξωκρινούς παγκρέατος.

Το Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 4,853,371 αποκαλύπτει και αξιώνει το Lanreotide®, μια μέθοδο για την παρασκευή του, και μια μέθοδο για την αναστολή της έκκρισης αυξητικής ορμόνης, ινσουλίνης, γλυκαγόνης και εξωκρινούς παγκρεατικής έκκρισης.

Η ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Νο. 5,147,856 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία της επαναστένωσης.

Η Ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Νο. 5,411,943 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία του ηπατώματος.

Η ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Νο. 5,073,541 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/089410, που κατατέθηκε στις 9 Ιουλίου 1993, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία του μελανώματος.

Η ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Νο. 5,504,069 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για την αναστολή της επιταχυνόμενης ανάπτυξης ενός συμπαγούς όγκου.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/854941, που κατατέθηκε στις 13 Μαΐου 1997, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για απώλεια σωματικού βάρους.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/854943, που κατατέθηκε στις 13 Μαΐου 1997, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία της αντίστασης στην ινσουλίνη και του συνδρόμου Χ.

Η ευρεσιτεχνία ΗΠΑ Νο. 5,688,418 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για την παράταση της βιωσιμότητας των παγκρεατικών κυττάρων.

Η Αίτηση PCT Αρ. PCT/US 97/14154 αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία της ίνωσης.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/855311, που κατατέθηκε στις 13 Μαΐου 1997, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία της υπερλιπιδαιμίας.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/440061, που κατατέθηκε στις 12 Μαΐου 1995, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία της υπεραμυλιναιμίας.

Η Αίτηση Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ Νο. 08/852221, που κατατέθηκε στις 7 Μαΐου 1997, αποκαλύπτει τη χρήση του Lanreotide® για τη θεραπεία υπερπρολακτιναιμίας και προλακτινωμάτων.

Η ουσία της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια μέθοδο για την παρασκευή ενός πεπτιδίου που περιέχει τρία ή περισσότερα υπολείμματα αμινοξέων, που έχει ένα Ν-τερματικό αμινοξύ, ένα προτελευταίο αμινοξύ δίπλα στο Ν-τερματικό αμινοξύ και ένα Ο-τερματικό αμινοξύ, με τη μέθοδο να περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

(α) σύνδεση ενός πρώτου αμινοξέος σε μια στερεή ρητίνη υποστήριξης με έναν εστερικό δεσμό για να σχηματιστεί ένα προϊόν πρώτης προσθήκης, το οποίο περιλαμβάνει (i) την αντίδραση ενός υδατικού διαλύματος ανθρακικού καισίου με ένα αλκοολικό διάλυμα του πρώτου αμινοξέος για να σχηματιστεί ένα άλας καισίου του πρώτου αμινοξέος, (ii) λήψη ενός άλατος καισίου χωρίς διαλύτη του πρώτου αμινοξέος, (iii) αντίδραση του υποστρώματος στερεάς ρητίνης με το άλας καισίου του πρώτου αμινοξέος σε έναν ξηρό (άνυδρο) πολικό απρωτικό διαλύτη σε σχηματίζουν ένα προϊόν πρώτης προσθήκης,

όπου το πρώτο αμινοξύ αντιστοιχεί στο C-τερματικό αμινοξύ του πεπτιδίου, η αμινομάδα της μη πλευρικής αλυσίδας (κύριας) αλυσίδας του πρώτου αμινοξέος αποκλείεται από το Boc και το πρώτο αμινοξύ δεν έχει λειτουργική ομάδα στην πλευρική αλυσίδα για την οποία απαιτείται προστασία και η ρητίνη στερεού φορέα είναι ρητίνη χλωρομεθυλιωμένου πολυστυρενίου.

(β) αποπροστασία (απεμπλοκή) Boc από το προϊόν πρώτης προσθήκης με οξύ για να σχηματιστεί ένα αποπροστατευμένο προϊόν πρώτης προσθήκης.

(γ) προαιρετικά, προσθήκη ενός επιπλέον αμινοξέος στο απελευθερωμένο προϊόν πρώτης προσθήκης, το οποίο περιλαμβάνει την αντίδραση του επόμενου αμινοξέος με το απελευθερωμένο προϊόν πρώτης προσθήκης σε έναν οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου για να παραχθεί ένα μπλοκαρισμένο (προστατευμένο) επόμενο προϊόν προσθήκης, όπου το επόμενο αμινοξύ έχει στην κύρια αλυσίδα, μια αμινομάδα αποκλεισμένη από το Boc, και εάν το ακόλουθο αμινοξύ έχει μία ή περισσότερες λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας, τότε οι λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας δεν απαιτούν προστασία ή οι λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας έχουν προστατευτικές ομάδες που είναι ανθεκτικές στα όξινα ή αλκαλικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση της προστασίας, αντίστοιχα, Boc και Fmoc.

(δ) αποπροστασία του Boc από το δεσμευμένο προϊόν της επόμενης προσθήκης, που περιλαμβάνει την αντίδραση του μπλοκαρισμένου προϊόντος επόμενης προσθήκης με ένα οξύ για να ληφθεί το αποδεσμευμένο προϊόν επόμενης προσθήκης.

(ε) προαιρετικά, επαναλαμβάνοντας τα βήματα (γ) και (δ), και σε κάθε κύκλο σχηματίζεται το απελευθερωμένο γινόμενο της (Χ+1)-ης επόμενης προσθήκης, όπου Χ είναι ο αριθμός της απαιτούμενης επανάληψης του κύκλου.

(ε) προσθήκη ενός περαιτέρω αμινοξέος στο απελευθερωμένο προϊόν πρώτης προσθήκης του σταδίου (β) ή, προαιρετικά, στο απελευθερωμένο (Χ+1)ο επόμενο προϊόν προσθήκης από το στάδιο (ε), το οποίο περιλαμβάνει την αντίδραση του επόμενου αμινοξέος με το εν λόγω προϊόν πρώτης προσθήκης ή με το εν λόγω μη δεσμευμένο (Χ+1)-ο επόμενο προϊόν προσθήκης σε οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο για την επέκταση του πεπτιδίου ώστε να παραχθεί ένα μπλοκαρισμένο (προστατευμένο) προϊόν επόμενης προσθήκης, όπου το επόμενο αμινοξύ έχει μια ραχοκοκαλιά αποκλεισμένη από Fmoc αμινομάδα, με την προϋπόθεση ότι εάν το επόμενο αμινοξύ έχει μία ή περισσότερες λειτουργικές ομάδες στην πλευρική αλυσίδα, τότε οι λειτουργικές ομάδες στην πλευρική αλυσίδα δεν απαιτούν προστασία ή οι λειτουργικές ομάδες στην πλευρική αλυσίδα έχουν προστατευτικές ομάδες που είναι ανθεκτικές στην αλκαλικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την αποπροστασία του Fmoc.

(ζ) αποπροστασία του Fmoc από το δεσμευμένο προϊόν επόμενης προσθήκης, που περιλαμβάνει την αντίδραση του δεσμευμένου προϊόντος επόμενης προσθήκης με μια πρωτοταγή ή δευτεροταγή αμίνη για τη λήψη του αποδεσμευμένου προϊόντος επόμενης προσθήκης.

(η) προαιρετικά, επαναλαμβάνοντας τα βήματα (ε) και (ζ), και σε κάθε κύκλο σχηματίζεται το αποδεσμευμένο γινόμενο της (Χ+1)-ης επόμενης προσθήκης, όπου Χ είναι ο αριθμός της απαιτούμενης επανάληψης του κύκλου, έως ότου Το προτελευταίο περιλαμβάνεται στο πεπτίδιο και το αποδεσμευμένο αμινοξύ.

(i) προσθήκη ενός Ν-τερματικού αμινοξέος στο αποδεσμευμένο προϊόν της (Χ+1)-ης επόμενης προσθήκης, που περιλαμβάνει την αντίδραση του Ν-τερματικού αμινοξέος με το αποδεσμευμένο προϊόν της (Χ+1)-ης επόμενης προσθήκης σε έναν οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου, που παράγει ένα αποκλεισμένο προϊόν ολοκλήρωσης όπου το Ν-τερματικό αμινοξύ έχει μια αμινομάδα κορμού αποκλεισμένη από Boc ή Fmoc.

(ι) αποπροστασία του καλυμμένου προσαγωγού με ένα οξύ στην περίπτωση του Boc ή μια βάση στην περίπτωση του Fmoc για να σχηματιστεί ένα ολοκληρωμένο πεπτιδικό προϊόν στη ρητίνη.

(ι) εάν το ολοκληρωμένο προϊόν πεπτιδικής ρητίνης περιέχει λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας, τότε, προαιρετικά, αποπροστασία των λειτουργικών ομάδων πλευρικής αλυσίδας του ολοκληρωμένου προϊόντος πεπτιδικής ρητίνης, που περιλαμβάνει αντίδραση του ολοκληρωμένου προϊόντος πεπτιδικής ρητίνης με κατάλληλα αντιδραστήρια αποπροστασίας για τη λήψη της ολοκληρωμένης πεπτιδικής ρητίνης προϊόν πεπτιδικό προϊόν σε αποπροστατευμένη ρητίνη. Και

(ια) διάσπαση του πεπτιδίου από το υπόστρωμα στερεάς ρητίνης εντός του ολοκληρωμένου πεπτιδικού προϊόντος ρητίνης ή του ολοκληρωμένου πεπτιδικού προϊόντος αποπροστατευμένης ρητίνης για την παραγωγή ενός πεπτιδίου, το οποίο περιλαμβάνει την αντίδραση του πεπτιδικού προϊόντος ολοκληρωμένου ρητίνης ή του ολοκληρωμένου πεπτιδικού προϊόντος αποπροστατευμένης ρητίνης με αμμωνία, πρωτοταγή αμίνη ή δευτεροταγής αμίνη έως ότου ολοκληρωθεί ουσιαστικά η διάσπαση του πεπτιδίου από τη ρητίνη.

υπό τον όρο ότι τα βήματα (ε) και (ζ) στη σύνθεση πεπτιδίων πρέπει να εκτελούνται τουλάχιστον μία φορά.

Προτιμάται η μέθοδος σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, όπου η αμμωνία, η πρωτοταγής αμίνη ή η δευτεροταγής αμίνη στο στάδιο (1) είναι σε έναν διαλύτη που περιέχει μια αλκοόλη και, προαιρετικά, έναν απρωτικό πολικό διαλύτη,

Προτιμάται η μέθοδος σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, όπου το βήμα (κ) περιλαμβάνει περαιτέρω τα ακόλουθα βήματα:

καθίζηση του διασπασμένου πεπτιδίου από τον διαλύτη.

διαχωρισμός με διήθηση του στερεού υποστρώματος ρητίνης και του καταβυθισθέντος πεπτιδίου· και

εκχύλιση του πεπτιδίου με ένα όξινο διάλυμα για την απομόνωση του πεπτιδίου.

Προτιμάται η μέθοδος σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, όπου το πρώτο αμινοξύ είναι το Boc-L-Thr.

Προτιμάται η μέθοδος της παρούσας εφεύρεσης όπου το πρώτο αμινοξύ είναι ένα άλας καισίου του Boc-L-Thr, αποδίδοντας μια ρητίνη Boc-L-Thr ως προϊόν πρώτης προσθήκης, και το αποδεσμευμένο προϊόν πρώτης προσθήκης είναι μια ρητίνη H-L-Thr. .

Προτιμάται η μέθοδος σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, όπου το οξύ που χρησιμοποιείται για την αφαίρεση της προστατευτικής ομάδας Boc στο στάδιο (i) είναι το τριφθοροξικό οξύ (TFA).

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, είναι μια μέθοδος όπου ο οργανικός διαλύτης είναι μεθυλενοχλωρίδιο, χλωροφόρμιο ή διμεθυλοφορμαμίδιο και το αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου είναι διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο, δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο ή Ν-αιθυλο-Ν"-(3-διμεθυλο-αμινοπροπύλιο )καρβοδιιμίδιο.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, είναι μια μέθοδος που περιλαμβάνει την εκτέλεση σταδίων (ε) και (ζ) έξι φορές μετά τον σχηματισμό του αποπροστατευμένου προϊόντος πρώτης προσθήκης του τύπου H-L-Thr-ρητίνη, όπου τα επόμενα αμινοξέα είναι προστέθηκε με τη σειρά: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) και Fmoc-L- Cys(Acm) για να σχηματιστεί το προϊόν H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη.

Μια προτιμώμενη μέθοδος που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο είναι μια μέθοδος που περιλαμβάνει την προσθήκη Boc-D--Nal σε H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys( Ρητίνη Acm) -Tnr σύμφωνα με το βήμα (γ) για να ληφθεί ρητίνη Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Act)-Thr.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, περιλαμβάνει την ταυτόχρονη αφαίρεση της ομάδας Boc που προστατεύει D--Nal, της ομάδας O-t-Bu που προστατεύει το Tyr και της ομάδας Boc που προστατεύει Lys στο Boc-D--Nal-Cys (Acm Ρητίνη )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr σύμφωνα με το βήμα (i), για να ληφθεί ένα πλήρες πεπτιδικό προϊόν στη ρητίνη του τύπου H-D--Nal -Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, περιλαμβάνει την αφαίρεση του πεπτιδίου H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr από τη στερεά ρητίνη με την εκτέλεση της H-D- Αντίδραση Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνες με αμμωνία σε διαλύτη που περιέχει αλκοόλη και, προαιρετικά, απρωτικό πολικό διαλύτη, μέχρι σχεδόν πλήρη απομάκρυνση για να ληφθεί H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, είναι η μέθοδος όπου η αλκοόλη είναι μεθανόλη και ο πολικός απρωτικός διαλύτης είναι το διμεθυλοφορμαμίδιο.

Η προτιμώμενη μέθοδος της αμέσως προηγούμενης μεθόδου περιλαμβάνει ταυτόχρονη απομάκρυνση των ομάδων προστασίας Cys Acm και κυκλοποίηση των προκυπτόντων αποπροστατευμένων υπολειμμάτων Cys στο προκύπτον πεπτιδικό προϊόν του τύπου H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH2 με αντίδραση H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 με διάλυμα ιωδίου σε αλκοόλ μέχρι σχεδόν πλήρη αποπροστασία και κυκλοποίηση για να ληφθεί H-D--Nal--Thr-NH2.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, είναι η μέθοδος όπου το πεπτίδιο είναι H-D--Nal--Thr-NH2.

Μια προτιμώμενη μέθοδος, που σχετίζεται με την αμέσως προηγούμενη μέθοδο, είναι η μέθοδος όπου το πεπτίδιο είναι ένα ανάλογο σωματοστατίνης.

Οι όροι που χρησιμοποιούνται στην περιγραφή της παρούσας εφεύρεσης ορίζονται ως εξής:

"πρώτο αμινοξύ": καλύπτει οποιοδήποτε αμινοξύ στο οποίο η αμινομάδα στην κύρια αλυσίδα (όχι στην πλευρική αλυσίδα) προστατεύεται από το Boc, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο ή μπορεί να συντεθεί σύμφωνα με μεθόδους γνωστές σε κάποιον συνήθους εμπειρίας τέχνη, για παράδειγμα Boc-L-Thr;

"προϊόν πρώτης προσθήκης": περιγράφει ένα προϊόν που είναι προσαρτημένο σε ένα υπόστρωμα στερεάς ρητίνης που προκύπτει από την προσθήκη ενός πρώτου αμινοξέος στο υπόστρωμα στερεάς ρητίνης, για παράδειγμα Boc-L-Thr-ρητίνη.

"αποπροστατευμένο προϊόν πρώτης προσθήκης": περιγράφει ένα προϊόν που προκύπτει από την αφαίρεση ή αφαίρεση μιας ομάδας Boc από το προϊόν πρώτης προσθήκης - για παράδειγμα, μια ρητίνη H-L-Thr, όπου το "Η" αντιπροσωπεύει το διαθέσιμο αμινο-υδρογόνο κορμού που προκύπτει από το στάδιο αποπροστασίας ;

"επόμενο αμινοξύ": περιγράφει οποιοδήποτε αμινοξύ στο οποίο η αμινομάδα στην κύρια αλυσίδα προστατεύεται από Boc ή Fmoc, το οποίο είναι εμπορικά διαθέσιμο ή μπορεί να συντεθεί σύμφωνα με μεθόδους γνωστές σε κάποιον με συνήθη εμπειρία στην τέχνη. Δεδομένου ότι το βήμα (γ) και το βήμα (ε) μπορεί να αποτελούν μέρος ενός επαναλαμβανόμενου κύκλου όπου το βήμα εκτελείται περισσότερες από μία φορές, κάθε φορά που εκτελείται το βήμα (γ) ή το βήμα (ε), το "επόμενο αμινοξύ" μπορεί να επιλεγεί ανεξάρτητα. από την ομάδα των γνωστών ή πιθανών συντιθέμενων αμινοξέων στα οποία η αμινομάδα στην κύρια αλυσίδα προστατεύεται από Boc ή Fmoc.

"(Χ+1)-ο επόμενο δεσμευμένο προϊόν προσθήκης": περιγράφει το προϊόν που είναι προσαρτημένο στη στερεή ρητίνη στήριξης που προκύπτει από το συνδυασμό του επόμενου αμινοξέος με το "απομπλοκαρισμένο προϊόν επόμενης προσθήκης". Δεδομένου ότι τα βήματα (γ) και (δ) και τα βήματα (ε) και (ζ) μπορεί να αποτελούν μέρος ενός επαναλαμβανόμενου κύκλου όπου μπορούν να προστεθούν περαιτέρω αμινοξέα, ο όρος "μπλοκαρισμένο προϊόν της (Χ+1) επόμενης προσθήκης" αναφέρεται στο προϊόν που λαμβάνεται ως αποτέλεσμα καθενός από τους προηγούμενους κύκλους προσχώρησης·

"Αποδεσμευμένο προϊόν της (Χ+1)ης επόμενης προσθήκης": περιγράφει το προϊόν που προκύπτει από την αφαίρεση της ομάδας Fmoc από το "αποκλεισμένο προϊόν της (Χ+1)ης επόμενης προσθήκης".

"ολοκληρωμένο πεπτιδικό προϊόν σε ρητίνη": περιγράφει ένα πεπτιδικό προϊόν συνδεδεμένο σε ένα στερεό υπόστρωμα ρητίνης αφού το Ν-τερματικό αμινοξύ έχει συνδεθεί στην πεπτιδική αλυσίδα και αφού η αμινομάδα ραχοκοκαλιάς του Ν-τερματικού αμινοξέος έχει αποπροστατευτεί ή αποπροστατευτεί , αλλά που εξακολουθεί να έχει οποιεσδήποτε προστατευτικές ομάδες στις λειτουργικές ομάδες των πλευρικών αλυσίδων που δεν έχουν αφαιρεθεί από την αντίδραση που αφαιρεί την προστατευτική ομάδα από την κύρια αλυσίδα του Ν-τερματικού αμινοξέος. Και

«Ολοκληρωμένο πεπτιδικό προϊόν σε αποπροστατευμένη ρητίνη»: περιγράφει ένα πεπτιδικό προϊόν συνδεδεμένο σε ένα στερεό υπόστρωμα ρητίνης όπου όλες οι λειτουργικές ομάδες της πλευρικής αλυσίδας αμινοξέων έχουν αφαιρεθεί ή αποπροστατευτεί.

Παραδείγματα οξέων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποπροστασία του Boc είναι το τριφθοροξικό οξύ (TFA), το μεθανοσουλφονικό οξύ και οργανικά διαλύματα που περιέχουν HCl.

Παραδείγματα πρωτοταγών και δευτεροταγών αμινών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποπροστασία του Fmoc είναι η 4-(αμινομεθυλ)πιπεριδίνη, η πιπεριδίνη, η διαιθυλαμίνη, η DBU και η τρις(2-αμινοαιθυλ)αμίνη.

Παραδείγματα μη πυρηνόφιλων βάσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εξουδετέρωση αλάτων TFA απελευθερωμένων αμινομάδων (RNH 3 + CF 3 COO -, αυτά τα άλατα πρέπει να μετατραπούν σε «ελεύθερες» αμίνες (NH 2) πριν ή κατά την προσθήκη του επόμενου αμινοξέος οξύ, διαφορετικά η προσθήκη δεν θα γίνει) είναι η διισοπροπυλαιθυλαμίνη (DIEA) και η τριαιθυλαμίνη (TEA).

Παραδείγματα οργανικών διαλυτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε αντιδράσεις προσθήκης αμινοξέων περιλαμβάνουν χλωριούχο μεθυλένιο, χλωροφόρμιο, διχλωροαιθάνιο, διμεθυλοφορμαμίδιο, διαιθυλακεταμίδιο, τετραϋδροφουράνιο, οξικό αιθυλεστέρα, 1-μεθυλ-2-πυρρολιδόνη, ακετονιτρίλιο ή συνδυασμό αυτών των διαλυτών.

Παραδείγματα παραγόντων επέκτασης πεπτιδίου περιλαμβάνουν υποκατεστημένα καρβοδιιμίδια όπως: διισοπροπυλ-καρβοδιιμίδιο, δικυκλοεξυλ-καρβοδιιμίδιο ή Ν-αιθυλ-Ν"-(3-διμεθυλ-αμινοπροπυλ)καρβοδιιμίδιο.

Οι καρβοξυλομάδες και οι αμινομάδες που συμμετέχουν στο σχηματισμό του πεπτιδικού αμιδικού δεσμού ονομάζονται καρβοξυλική ομάδα ή αμινομάδα «μη πλευρικής αλυσίδας», αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, οποιεσδήποτε λειτουργικές ομάδες αμινοξέων που δεν συμμετέχουν στο σχηματισμό του πεπτιδικού αμιδικού δεσμού ονομάζονται λειτουργικές ομάδες «πλευρικής αλυσίδας».

Ο όρος «ομάδα σταθερής βάσης» αναφέρεται σε προστατευτικές ομάδες που χρησιμοποιούνται για την προστασία λειτουργικών ομάδων αμινοξέων που (1) είναι σταθερά στη βάση, για παράδειγμα δεν μπορούν να αφαιρεθούν από βάσεις όπως 4-(αμινοαιθυλο)πιπεριδίνη, πιπεριδίνη ή τρις(2). -αμινοαιθυλ)αμίνη, που είναι βάσεις που χρησιμοποιούνται συνήθως για την απομάκρυνση της προστατευτικής ομάδας Fmoc, και (2) μπορεί να αφαιρεθεί με ένα οξύ όπως το τριφθοροξικό οξύ ή άλλη μέθοδο όπως η καταλυτική υδρογόνωση.

Τα σύμβολα "Fmoc" και "Boc" χρησιμοποιούνται εδώ και στον συνοδευτικό τύπο για να προσδιορίσουν το 9-φθορενυλο-μεθοξυκαρβονύλιο και το tert-βουτυλοξυκαρβονύλιο, αντίστοιχα.

Η μέθοδος που περιγράφεται παραπάνω μπορεί να εφαρμοστεί στην παρασκευή πεπτιδίων, κατά προτίμηση αναλόγων σωματοστατίνης, όπως το οκταπεπτίδιο Lanreotide®, το οποίο έχει τον ακόλουθο τύπο: H-D--Nal--Thr-NH2. Εάν πρόκειται να συντεθεί H-D--Nal--Thr-NH2, οι σταθερές στη βάση προστατευτικές ομάδες που χρησιμοποιούνται για την προστασία των λειτουργικών ομάδων πλευρικής αλυσίδας Cys, Lys και Tyr μπορεί να είναι ακεταμιδομεθύλιο (Acm), Boc και τριτ-βουτύλιο, αντίστοιχα. Το Acm προτιμάται για το Cys.

Με τον όρο ανάλογο σωματοστατίνης εννοείται ένα πεπτίδιο που παρουσιάζει βιολογική δραστικότητα παρόμοια (δηλ. αγωνιστής) ή αντίθετη (δηλ. ανταγωνιστής) με αυτή της σωματοστατίνης.

Στον τύπο H-D--Nal--Thr-NH2, καθένα από τα κοινά σύμβολα αμινοξέων τριών γραμμάτων (π.χ. Lys) αναφέρεται σε ένα δομικό υπόλειμμα του αμινοξέος. Για παράδειγμα, το σύμβολο Lys στον παραπάνω τύπο αντιπροσωπεύει -NH-CH((CH2) 4NH2)-CO-. Το σύμβολο D--Nal- αντιπροσωπεύει το υπόλειμμα αμινοξέος D-2-ναφθυλαλανυλυλ. Οι αγκύλες υποδεικνύουν έναν δισουλφιδικό δεσμό που συνδέει τις ελεύθερες θειόλες δύο υπολειμμάτων Cys στο πεπτίδιο, υποδεικνύοντας ότι τα αμινοξέα του πεπτιδίου εντός των παρενθέσεων σχηματίζουν έναν κύκλο.

Με βάση την περιγραφή που δίνεται εδώ, κάποιος έμπειρος στην τέχνη θα είναι σε θέση να κάνει πλήρη χρήση της παρούσας εφεύρεσης.

Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλοι οι τεχνικοί και επιστημονικοί όροι που χρησιμοποιούνται στο παρόν έχουν την ίδια έννοια με αυτή που είναι κοινώς κατανοητή από εκείνους με συνήθη εμπειρία στην τέχνη με την οποία αναφέρεται η παρούσα εφεύρεση. Επιπλέον, όλες οι δημοσιεύσεις, οι αιτήσεις για διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας και άλλες παραπομπές που αναφέρονται εδώ ενσωματώνονται εδώ με αναφορά.

Το πεπτίδιο μπορεί να παρασκευαστεί σύμφωνα με τη μέθοδο της παρούσας εφεύρεσης σύμφωνα με την ακόλουθη διαδικασία.

Ένα διάλυμα 0,5 μοριακών ισοδυνάμων ανθρακικού καισίου σε νερό προστίθεται αργά σε ένα διάλυμα 1 μοριακού ισοδυνάμου Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA), όπου το AA 1 αντιστοιχεί στο C-τερματικό αμινοξύ διαλυμένο σε αλκοόλη, κατά προτίμηση μεθανόλη. Το προκύπτον μίγμα αναδεύεται για περίπου 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, κατόπιν όλη η αλκοόλη και όλο το νερό απομακρύνονται υπό ελαττωμένη πίεση για να ληφθεί ξηρή σκόνη άλατος καισίου Boc-AA1. Η ρητίνη Merifield, 1,0 ισοδύναμο (χλωρομεθυλιωμένο πολυστυρένιο, 200-400 mesh, συμπερίληψη ιόντων χλωρίου 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky or Polymer Laboratories, Church Stretton, Αγγλία) πλένεται με χλωριούχο διάλυμα (κατά προτίμηση διχλωρομεθάνιο) μια αλκοόλη, κατά προτίμηση μεθανόλη, και έναν πολικό απρωτικό διαλύτη, κατά προτίμηση διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF). Το άλας καισίου Boc-AA 1 σκόνη διαλύεται σε έναν άνυδρο (ξηρό) πολικό απρωτικό διαλύτη, κατά προτίμηση DMF, και το διάλυμα συνδυάζεται με την προπλυμένη ρητίνη. Ο πολτός αναδεύεται ήπια στους περίπου 45°-65°C, κατά προτίμηση στους 50°-60°C, για περίπου 48 έως 106 ώρες, κατά προτίμηση 85 έως 90 ώρες, κάτω από μια αδρανή ατμόσφαιρα όπως το άζωτο. Η ρητίνη διαχωρίζεται με διήθηση και πλένεται επιμελώς με πολικό απρωτικό διαλύτη, κατά προτίμηση DMF, νερό και τέλος με αλκοόλη όπως MeOH. Η ρητίνη Boc-AA 1 ξηραίνεται υπό μειωμένη πίεση.

Η ρητίνη Vos-AA 1 εισάγεται σε έναν γυάλινο αντιδραστήρα με πυθμένα φίλτρου κατασκευασμένο από μεγάλο πορώδες λιωμένο γυαλί. Η ρητίνη πλένεται με χλωριωμένο διαλύτη όπως DCM, αποδεσμεύεται με οργανικό οξύ, κατά προτίμηση 25% TFA σε DCM, πλένεται σύντομα με χλωριωμένο διάλυμα όπως DCM και αλκοόλη όπως MeOH, εξουδετερώνεται με οργανική βάση, κατά προτίμηση τριαιθυλαμίνη σε DCM, και πλύθηκε ξανά με DCM και έναν πολικό απρωτικό διαλύτη όπως DMF, παράγοντας μια αποπροστατευμένη ρητίνη ΑΑ 1.

Οποιοσδήποτε επιθυμητός αριθμός αμινοξέων στη συνέχεια προστίθεται προαιρετικά στην αποπροστατευμένη ρητίνη ΑΑ 1. Εάν το επόμενο αμινοξύ έχει μια -αμινομάδα με προστασία Fmoc (Fmoc-AA x), τότε η ομάδα πλευρικής αλυσίδας είτε δεν απαιτεί προστασία (για παράδειγμα, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe ή Fmoc-Thr) ή η πλευρική αλυσίδα προστατεύει με μια ομάδα ανθεκτική στη βάση. Μια μοριακή περίσσεια Fmoc-AA x (όπου x είναι ο αριθμός θέσης αμινοξέος στο πεπτίδιο, μετρημένος από το C-άκρο) συζεύγνυται σε περίπου 60 λεπτά με την αποπροστατευμένη ρητίνη AA 1 χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου όπως το διισοπροπυλκαρβοδιιμίδιο (DIC ), σε μίγμα DCM/DMF. Η ρητίνη προσθήκης πλένεται με DMF, αλκοόλη και DCM για να ληφθεί ρητίνη Fmoc-AA x-AA 1. Η προσκόλληση μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο νινυδρίνης Kaiser. Η ρητίνη Fmoc-AA χ-ΑΑ 1 στη συνέχεια πλένεται μία φορά με DMF και στη συνέχεια αποδεσμεύεται με ένα διάλυμα βάσης σε έναν οργανικό διαλύτη όπως η πιπεριδίνη σε DMF για να ληφθεί μια ρητίνη ΑΑχ-ΑΑ1. Η ρητίνη ΑΑχ-ΑΑ 1 στη συνέχεια πλένεται με DMF, ακολουθούμενα από αρκετές πλύσεις και με αλκοόλη όπως MeOH και DCM. Η ρητίνη ΑΑχ-ΑΑ 1 στη συνέχεια πλένεται μία φορά με DMF για περίπου 3 λεπτά, τρεις φορές με ισοπροπανόλη, κατά προτίμηση κάθε φορά για περίπου 2 λεπτά, και τρεις φορές με DCM, κατά προτίμηση κάθε φορά για περίπου 2 λεπτά. Η ρητίνη είναι τότε έτοιμη για περαιτέρω προσάρτηση είτε ενός προστατευμένου Fmoc αμινοξέος όπως περιγράφεται παραπάνω είτε ενός Boc προστατευμένου αμινοξέος όπως περιγράφεται παρακάτω.

Ομοίως, εάν οποιοδήποτε επόμενο αμινοξύ που πρόκειται να συνδεθεί στην αποπροστατευμένη ρητίνη AA 1 επιλεγεί ώστε να έχει προστατευμένη Boc-amino ομάδα (Boc-AA x), τότε είτε η ομάδα πλευρικής αλυσίδας δεν απαιτεί προστασία (αυτό θα μπορούσε να είναι Boc- Gly, Boc-Ala, Boc-Phe ή Boc-Thr) ή η πλευρική αλυσίδα πρέπει να προστατεύεται από μια ομάδα που είναι ανθεκτική στην απομάκρυνση τόσο από οξύ όσο και από βάση - αυτό θα μπορούσε να είναι το Boc-Cys(Acm). Εάν επιλεγεί Boc-AA x, προστίθεται χρησιμοποιώντας τα ίδια αντιδραστήρια και διαλύτες όπως στην περίπτωση που περιγράφεται παραπάνω για τα Fmoc-αμινοξέα και η πληρότητα (ολοκλήρωση) της προσθήκης μπορεί να ελεγχθεί με τη μέθοδο Kaiser ninhydrin. Η ρητίνη Boc-AA x-AA 1 στη συνέχεια αποπροστατεύεται με ένα όξινο διάλυμα σε έναν οργανικό διαλύτη όπως το TFA σε DCM για να παραχθεί μια ρητίνη CF 3CO - H + -AA x -AA 1. Αυτή η ρητίνη στη συνέχεια πλένεται αρκετές φορές με χλωριωμένους διαλύτες όπως DCM, μια αλκοόλη όπως MeOH και εξουδετερώνεται με μια μη πυρηνόφιλη βάση όπως η τριαιθυλαμίνη σε DCM, ακολουθούμενη από πολλές άλλες πλύσεις με έναν χλωριωμένο διαλύτη όπως DCM, δίνοντας AA x -AA 1 - ρητίνη Η ρητίνη είναι τότε έτοιμη για περαιτέρω προσάρτηση του προστατευμένου αμινοξέος Boc ή Fmoc όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ανάλογα με την επιθυμητή πεπτιδική αλληλουχία και τον τύπο του α-αμινο-προστατευμένου αμινοξέος που χρησιμοποιείται (είτε με Fmoc-προστατευμένο είτε με Boc-προστατευμένο), χρησιμοποιείται ένας κατάλληλος συνδυασμός των διαδικασιών σύζευξης που περιγράφονται παραπάνω, ανάλογα με το ποιο αμινοξύ θα καταλάβει το θέση πλευρικής αλυσίδας στην πεπτιδική αλληλουχία, που έχει μια προστατευτική ομάδα που μπορεί να αφαιρεθεί είτε με μια βάση, απαραίτητη για την απομάκρυνση του Fmoc από την -αμινομάδα, είτε με ένα οξύ, απαραίτητο για την απομάκρυνση του Boc από την -αμινομάδα. Ένα τέτοιο προστατευμένο αμινοξύ μπορεί να είναι η N--Boc-N"--Fmoc-λυσίνη ή η N--Fmoc-N"--Boc-λυσίνη. Εάν συμβαίνει αυτό, όλες οι προστατευτικές ομάδες που επιλέγονται για τις α-αμινο ομάδες των επόμενων αμινοξέων, μέχρι το Ν-τερματικό αμινοξύ, πρέπει να είναι συμβατές με την πλευρική ομάδα προστασίας που έχει επιλεγεί για αυτή τη θέση. Αυτό σημαίνει ότι οι προστατευτικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας πρέπει να είναι ανθεκτικές στον αποπροστατευτικό παράγοντα που χρησιμοποιείται για την αποπροστασία των α-αμινο ομάδων των επόμενων αμινοξέων. Για ένα Ν-τερματικό αμινοξύ, είτε το Boc είτε το Fmoc μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προστασία της αμινομάδας, καθώς η αποπροστασία του αμινοτελικού αμινοξέος μπορεί ταυτόχρονα να αποπροστατεύσει ορισμένες από τις προστατευμένες πλευρικές αλυσίδες χωρίς να επηρεάσει ανεπιθύμητα τη στρατηγική σύνθεσης πεπτιδίου, καθώς δεν αμινοξέα που απομένουν προστίθενται.

Η ολοκληρωμένη πεπτιδική αλυσίδα που εξακολουθεί να είναι συνδεδεμένη με τη ρητίνη πρέπει να αποπροστατευτεί και να απελευθερωθεί. Για να αφαιρεθούν όλες οι σταθερές στη βάση προστατευτικές ομάδες και η αμινοτελική ομάδα αποκλεισμού αμινοξέων, εάν υπάρχει, το πεπτίδιο στη ρητίνη υποβάλλεται σε επεξεργασία με ένα οξύ σε έναν οργανικό διαλύτη όπως το TFA σε DCM. Για να αφαιρεθούν όλες οι σταθερές σε οξύ προστατευτικές ομάδες και η αμινοτελική ομάδα αποκλεισμού αμινοξέων, εάν υπάρχει, το πεπτίδιο στη ρητίνη υποβάλλεται σε επεξεργασία με μια οργανική βάση όπως η πιπεριδίνη σε DMF. Εναλλακτικά, οι σταθερές σε οξύ ομάδες μπορούν να διατηρηθούν μέχρι να απομακρυνθούν με επακόλουθη διάσπαση του πεπτιδίου με αμμωνία ή βάση αμίνης. Το αποπροστατευμένο πεπτίδιο στη ρητίνη στη συνέχεια πλένεται με χλωριωμένο διαλύτη όπως DCM, αλκοόλη όπως MeOH, και ξηραίνεται σε σταθερό βάρος υπό μειωμένη πίεση.

Το πεπτίδιο αποκόπτεται από τη ρητίνη και το καρβοξυτελικό άκρο μετατρέπεται σε ένα αμίδιο με εναιώρηση του πεπτιδίου στη ρητίνη σε ένα μίγμα MeOH/DMF 3:1. Το εναιώρημα ψύχεται σε θερμοκρασία κάτω από περίπου 10°C υπό ατμόσφαιρα αζώτου και άνυδρη αέρια αμμωνία εισάγεται κάτω από την επιφάνεια του διαλύτη μέχρις ότου το διάλυμα κορεσθεί με αυτό, ενώ η θερμοκρασία διατηρείται κάτω από περίπου 10°C. Ο πολτός αναδεύεται ήπια για περίπου 24 ώρες, ενώ αφήνεται η θερμοκρασία να ανέλθει στους 20°C περίπου. Ο βαθμός ολοκλήρωσης της αντίδρασης ελέγχεται με την εξαφάνιση του ενδιάμεσου μεθυλαιθέρα σε HPLC υπό κατάλληλες συνθήκες ανάλογα με τον τύπο του πεπτιδίου. Το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται και η απαιτούμενη ποσότητα άνυδρης αμμωνίας προστίθεται έως ότου η περιοχή κορυφής HPLC που αντιστοιχεί στον μεθυλεστέρα είναι μικρότερη από το 10% της επιφάνειας κορυφής του επιθυμητού προϊόντος. Ο πολτός ψύχεται σε θερμοκρασία κάτω από περίπου 10°C και η ανάδευση συνεχίζεται όλη τη νύχτα για να καταβυθιστεί το πεπτίδιο. Το ίζημα και η ρητίνη διαχωρίζονται με διήθηση και πλένονται με ψυχρό MeOH. Το ίζημα και η ρητίνη ξηραίνονται υπό ελαττωμένη πίεση και το προϊόν εκχυλίζεται από τη ρητίνη με ένα υδατικό διάλυμα οξικού οξέος.

Εάν το πεπτίδιο περιέχει προστατευμένα υπολείμματα Cys στην αλληλουχία του, οι ομάδες θειόλης μπορούν να αποπροστατευθούν και τα υπολείμματα μπορούν να κυκλοποιηθούν σύμφωνα με την ακόλουθη διαδικασία. Το πεπτίδιο που περιέχει προστατευμένες με Acm ομάδες Cys διαλύεται σε υδατικό διάλυμα οξικού οξέος σε ατμόσφαιρα αζώτου. Το διάλυμα αναμειγνύεται γρήγορα και ένα διάλυμα ιωδίου σε αλκοόλ προστίθεται σε μία δόση. Το μίγμα αναδεύεται και η πληρότητα της αποπροστασίας ελέγχεται χρησιμοποιώντας HPLC. Στη συνέχεια η αντίδραση διακόπτεται με τιτλοδότηση με διάλυμα θειοθειικού νατρίου 2% μέχρι να εξαφανιστεί το χρώμα του διαλύματος. Το ακατέργαστο μίγμα καθαρίζεται με παρασκευαστική χρωματογραφία σε φυσίγγιο C8 με βαθμίδωση ακετονιτριλίου σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 0,1, αφαλατώνεται σε φυσίγγιο C8 με βαθμίδα ακετονιτριλίου σε οξικό οξύ 0,25 Ν και λυοφιλοποιείται για να ληφθεί το πεπτίδιο στόχο.

Παράδειγμα υλοποίησης της εφεύρεσης

Το ακόλουθο παράδειγμα παρέχεται για να επεξηγήσει τη μέθοδο της παρούσας εφεύρεσης και δεν θα πρέπει να ερμηνευθεί ως περιοριστικό του πεδίου εφαρμογής της.

Παράδειγμα 1. H2-D--Nal--Thr-NH2

Α) Ρητίνη Boc-L-Thr

Ένα διάλυμα 2,58 g ανθρακικού καισίου σε 2,5 ml νερού προστέθηκε αργά σε ένα διάλυμα 3,48 g Boc-L-θρεονίνης (Bachem California, Torrance, Καλιφόρνια) διαλυμένη σε 7 ml μεθανόλης. Το προκύπτον μίγμα αναδεύτηκε για περίπου 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια όλη η μεθανόλη και όλο το νερό απομακρύνθηκαν υπό ελαττωμένη πίεση για να ληφθεί ξηρή σκόνη άλατος καισίου Boc-L-θρεονίνης. 10 g ρητίνης Merifield (χλωρομεθυλιωμένο πολυστυρένιο, 200-400 mesh, συμπερίληψη χλωρίου 1,3 mEq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) πλύθηκαν με διχλωρομεθάνιο (DCM), μεθανόλη (MeOH) και διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF 7 φορές) ml). Το άλας καισίου σκόνη Boc-L-θρεονίνης διαλύθηκε σε 60 ml ξηρού DMF και το διάλυμα συνδυάστηκε με τη ρητίνη που πλύθηκε όπως παραπάνω. Ο πολτός αναδεύτηκε ήπια σε θερμοκρασία περίπου 50°-60°C για περίπου 85 έως 90 ώρες υπό ατμόσφαιρα αζώτου. Η ρητίνη διαχωρίστηκε με διήθηση και πλύθηκε επιμελώς με DMF, απιονισμένο νερό και τέλος MeOH. Η ρητίνη Βοο-θρεονίνης ξηράνθηκε υπό μειωμένη πίεση στους περίπου 40°C. Η συμπερίληψη θρεονίνης ήταν 0,85 ± 0,15 meq/g ξηρής ρητίνης.

Β) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη

2,0 g ρητίνης Boc-θρεονίνης από το στάδιο (Α) προστέθηκαν σε έναν γυάλινο αντιδραστήρα 50 ml με έναν πυθμένα φίλτρου από τηγμένο γυαλί μεγάλου πόρου (φορτίο 1,74 mmol). Η ρητίνη πλύθηκε 2 φορές με DCM (20 ml), κάθε φορά για περίπου 5 λεπτά, αποφράχθηκε με 25% TFA σε DCM (30 ml) - την πρώτη φορά για περίπου 2 λεπτά και τη δεύτερη φορά για περίπου 25 λεπτά, πλύθηκε 3 φορές για περίπου 2 λεπτά με DCM (20 ml), ισοπροπανόλη (20 ml) και DCM (20 ml), εξουδετερώθηκε δύο φορές για περίπου 5 λεπτά με 10% τριαιθυλαμίνη σε DCM (20 ml), πλύθηκε 3 φορές για περίπου 2 λεπτά με DCM και ξεπλύθηκε μία φορά DMF (20 ml) για περίπου 5 λεπτά.

Στην αποφραγμένη ρητίνη προστέθηκαν 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ισοδ.) Fmoc-L-κυστεΐνη (Acm) (Bachem, CA) και 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ισοδ.) διισοπροπυλ-καρβοδιιμίδιο (DIC) σε 14 ml ενός μίγματος 2:1 DCM/DMF για περίπου 1 ώρα Μετά τη σύζευξη, η ρητίνη πλύθηκε 1 φορά για περίπου 3 λεπτά με DMF (20 ml), 3 φορές για περίπου 2 λεπτά με ισοπροπανόλη και 3 φορές για περίπου 2 λεπτά DXM (20 ml). Η δέσμευση δοκιμάστηκε με τη μέθοδο νιυδρίνης Kaiser.

Μετά την ένωση, η ρητίνη πλύθηκε μία φορά με DMF και στη συνέχεια αποφράχθηκε με ένα διάλυμα πιπεριδίνης σε DMF. Στη συνέχεια η αποφραγμένη ρητίνη με την προσθήκη πλύθηκε με DMF και πολλές φορές ταυτόχρονα με MeOH και DCM. Η ρητίνη προσθήκης πλύθηκε 1 φορά για περίπου 3 λεπτά με DMF (20 ml), 3 φορές για περίπου 2 λεπτά με ισοπροπανόλη (20 ml) και 3 φορές με DCM (20 ml) για περίπου 2 λεπτά κάθε φορά. Η δέσμευση δοκιμάστηκε με τη μέθοδο νινυδρίνης Kaiser.

Καθένα από τα ακόλουθα προστατευμένα αμινοξέα συζεύχθηκε με την πλυμένη ρητίνη χρησιμοποιώντας DIC σε DMF/DCM και αποπροστατεύτηκε όπως περιγράφεται παραπάνω με την ακόλουθη σειρά: Fmoc-L-βαλίνη, Fmoc-L-λυσίνη (Boc), Fmoc-D-τρυπτοφάνη, Fmoc-L-τυροσίνη (O-t-Bu) και Fmoc-L-κυστεΐνη (Acm) (όλα από την Bachem California), Boc-D-2-ναφθυλαλανίνη (Synthech, Albany, OR).

Η ολοκληρωμένη πεπτιδική αλυσίδα αποφράχθηκε και αποπροστατεύτηκε δύο φορές με 75:20:5 DCM/TFA/ανισόλη (30 ml) για περίπου 2 λεπτά και περίπου 25 λεπτά, πλύθηκε 3 φορές για περίπου 2 λεπτά κάθε φορά με DCM (20 ml), ισοπροπανόλη (10 ml) και DCM (20 ml), εξουδετερώθηκε 2 φορές για περίπου 5 λεπτά με 10% τριαιθυλαμίνη σε DCM (20 ml) και πλύθηκε 3 φορές για περίπου 2 λεπτά με DCM (20 ml) και MeOH (20 ml). Η ρητίνη ξηράνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση. Το ξηρό βάρος ήταν 3,91 g (103% της θεωρητικής απόδοσης).

Β) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2,93 g της φορτωμένης με πεπτίδιο ρητίνης από το στάδιο (Β) (1,3 mmol-eq) εναιωρήθηκαν σε 50 ml ενός μίγματος MeOH/DMF 3:1. Το εναιώρημα ψύχθηκε σε θερμοκρασία κάτω από περίπου 10°C υπό ατμόσφαιρα αζώτου και η ξηρή αέρια αμμωνία καθαρίστηκε μέχρις ότου το διάλυμα κορέστηκε με αυτό, ενώ η θερμοκρασία διατηρήθηκε κάτω από περίπου 10°C. Ο πολτός αναδεύτηκε ήπια για περίπου 24 ώρες, αφήνοντας τη θερμοκρασία να ανέλθει στους 20°C περίπου. Ο βαθμός ολοκλήρωσης της αντίδρασης ελέγχθηκε με την εξαφάνιση του ενδιάμεσου μεθυλαιθέρα χρησιμοποιώντας HPLC (ροφητικό VYDAC®, μέγεθος κόκκου 5 μm, μέγεθος πόρων 100 Α, C18, έκλουση υπό ισοκρατικές συνθήκες 26% CH 3 CN σε 0,1% TFA, ταχύτητα 1 ml/min, καταγραφή στα 220 mm· υπό αυτές τις συνθήκες, ο χρόνος επιβράδυνσης Rt είναι ~ 14 λεπτά για τον μεθυλεστέρα και ~ 9,3 λεπτά για το προϊόν αμιδίου). Το μίγμα της αντίδρασης ψύχθηκε και προστέθηκε περίσσεια άνυδρης αμμωνίας έως ότου η περιοχή κορυφής HPLC που αντιστοιχεί στον μεθυλεστέρα ήταν μικρότερη από το 10% της επιφάνειας κορυφής του επιθυμητού προϊόντος. Ο πολτός ψύχθηκε σε θερμοκρασία κάτω από περίπου 10°C, και η ανάδευση συνεχίστηκε όλη τη νύχτα για να καταβυθιστεί το πεπτίδιο. Το ίζημα και η ρητίνη διαχωρίστηκαν με διήθηση και πλύθηκαν με 15 ml ψυχρού MeOH. Το ίζημα και η ρητίνη ξηράνθηκαν υπό ελαττωμένη πίεση και το προϊόν εκχυλίστηκε από τη ρητίνη με 50% υδατικό διάλυμα οξικού οξέος (3 δόσεις των 30 ml). Η ανάλυση HPLC έδειξε την παρουσία 870 mg (0,70 mmol) του προϊόντος του τίτλου στο μίγμα (καθαρότητα 96% σε ένα σύστημα ισοκρατικής HPLC).

Δ) H-D- -Nal--Thr-NH 2

500 mg (0,40 mmol) του πεπτιδίου από το στάδιο (Β) διαλύθηκαν σε 300 ml οξικού οξέος 4% και θερμάνθηκαν στους περίπου 55°C υπό ατμόσφαιρα αζώτου. Το διάλυμα αναδεύτηκε γρήγορα και ένα 2% β/ο διάλυμα ιωδίου σε 7,7 mL MeOH (0,60 mmol) προστέθηκε σε μία δόση. Το μίγμα αναδεύτηκε για περίπου 15 λεπτά, κατόπιν η αντίδραση σταμάτησε με τιτλοδότηση με διάλυμα θειοθειικού νατρίου 2% μέχρις ότου εξαφανίστηκε το χρώμα (~ 2 ml). Το μίγμα ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και διηθήθηκε. Το μίγμα καθαρίστηκε με παρασκευαστική χρωματογραφία σε στήλη C8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) με βαθμίδωση ακετονιτριλίου σε οξικό αμμώνιο 0,1 Μ, αφαλατώθηκε σε στήλη C8 YMC με βαθμίδωση ακετονιτριλίου σε οξικό οξύ 0,25 Ν, και λυοφιλοποιήθηκε για να δώσει 350 mg πεπτιδίου στόχου με 99% καθαρότητα.

Με βάση την παραπάνω περιγραφή, κάποιος έμπειρος στην τέχνη μπορεί εύκολα να εξακριβώσει τα βασικά χαρακτηριστικά της παρούσας εφεύρεσης και, χωρίς να απομακρυνθεί από το πνεύμα και το εύρος αυτής, να κάνει διάφορες αλλαγές και τροποποιήσεις της εφεύρεσης για να την προσαρμόσει σε διάφορες εφαρμογές και συνθήκες. Έτσι, άλλες πραγματοποιήσεις της εφεύρεσης καλύπτονται επίσης από τις αξιώσεις.

ΑΠΑΙΤΗΣΗ

1. Μια μέθοδος για την παρασκευή ενός πεπτιδίου του τύπου H-D--Nal--Thr-NH2, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια:

(α) σύνδεση ενός πρώτου αμινοξέος σε μια στερεή ρητίνη στήριξης με έναν εστερικό δεσμό για να σχηματιστεί ένα «προϊόν πρώτης προσθήκης», το οποίο περιλαμβάνει (i) την αντίδραση ενός υδατικού διαλύματος ανθρακικού καισίου με ένα αλκοολικό διάλυμα του πρώτου αμινοξέος για να σχηματιστεί ένα άλας καισίου του πρώτου αμινοξέος, (ii) λήψη ενός χωρίς διαλύτη άλατος καισίου του πρώτου αμινοξέος, (iii) αντίδραση του υποστρώματος στερεάς ρητίνης με το άλας καισίου του πρώτου αμινοξέος σε έναν άνυδρο πολικό απρωτικό διαλύτη για να σχηματιστεί ένα «προϊόν πρώτης προσθήκης»,

όπου το πρώτο αμινοξύ είναι το Boc-L-Thr, το οποίο αντιστοιχεί στο Ο-τερματικό αμινοξύ του πεπτιδίου, και η στερεή ρητίνη υποστήριξης είναι μια ρητίνη χλωρομεθυλιωμένου πολυστυρολίου.

(β) αποπροστασία του Boc από το προϊόν πρώτης προσθήκης με οξύ για να σχηματιστεί ένα «αποπροστατευμένο προϊόν πρώτης προσθήκης».

(γ) προαιρετικά, η προσθήκη στο "απελευθερωμένο προϊόν πρώτης προσθήκης" ενός "επόμενου αμινοξέος", το οποίο περιλαμβάνει την αντίδραση του "επόμενου αμινοξέος" με το "απελευθερωμένο προϊόν πρώτης προσθήκης" σε έναν οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου για την παραγωγή του "μπλοκαρισμένο προϊόν της ακόλουθης προσθήκης", όπου το "επόμενο αμινοξύ" έχει μια αμινομάδα καλυμμένη με Boc στην κύρια αλυσίδα, και εάν αυτό το "επόμενο αμινοξύ" έχει μία ή περισσότερες λειτουργικές ομάδες στην πλευρική αλυσίδα, τότε η λειτουργική Οι ομάδες στην πλευρική αλυσίδα δεν απαιτούν προστασία ή αυτές οι λειτουργικές ομάδες στην πλευρική αλυσίδα έχουν προστατευτικές ομάδες που είναι σταθερές σε όξινα ή αλκαλικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για αποπροστασία, Boc και Fmoc, αντίστοιχα.

(δ) αποπροστασία του Boc του "αποκλεισμένου προϊόντος επόμενης προσθήκης" που περιλαμβάνει την αντίδραση του "προϊόντος δεσμευμένης επόμενης προσθήκης" με ένα οξύ για την παραγωγή του "απομπλοκαρισμένου προϊόντος επόμενης προσθήκης".

(ε) προαιρετικά, επανάληψη των βημάτων (γ) και (δ), με κάθε κύκλο να παράγει το "μη αποκλεισμένο γινόμενο της (Χ+1) ης επόμενης προσθήκης", όπου το Χ υποδηλώνει τον αριθμό των επιθυμητών επαναλήψεων των κύκλων.

(στ) προσθήκη του «επόμενου αμινοξέος» στο «απομπλοκαρισμένο προϊόν πρώτης προσθήκης» από το βήμα (β) ή, προαιρετικά, στο «(Χ+1)ο επόμενο προϊόν χωρίς αποκλεισμό προσθήκης» από το βήμα (ε), το οποίο περιλαμβάνει τη μεταφορά την αντίδραση " επόμενο αμινοξύ" με το εν λόγω "απομπλοκοποιημένο προϊόν πρώτης προσθήκης" ή με το εν λόγω "(Χ+1)ο επόμενο μη αποκλεισμένο προϊόν προσθήκης" σε έναν οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου για να παραχθεί ένα "επόμενο αποκλεισμένο προϊόν προσθήκης", όπου το "επόμενο αμινοξύ" έχει μια αμινομάδα κύριας αλυσίδας με κάλυψη Fmoc, με την προϋπόθεση ότι εάν αυτό το "επόμενο αμινοξύ" έχει μία ή περισσότερες λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας, τότε οι λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας δεν απαιτούν προστασία ή η λειτουργική πλευρική αλυσίδα Οι ομάδες έχουν προστατευτικές ομάδες που είναι ανθεκτικές στα αλκαλικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την αποπροστασία του Fmoc.

(ζ) αποπροστασία του Fmoc «αποφραγμένης επόμενης προσθήκης», που περιλαμβάνει την αντίδραση της «αποφραγμένης επόμενης προσθήκης» με μια πρωτοταγή ή δευτεροταγή αμίνη για να παραχθεί μια «αποφραγμένη επόμενη προσθήκη».

(η) προαιρετικά, επανάληψη των βημάτων (ε) και (ζ), με κάθε κύκλο να παράγει το «μη αποκλεισμένο γινόμενο της (Χ+1)-ης επόμενης προσθήκης», όπου Χ είναι ο επιθυμητός αριθμός επαναλήψεων του κύκλου μέχρι να ενσωματωθεί στο απελευθερώνεται το πεπτίδιο και το προτελευταίο αμινοξύ.

(i) προσθήκη ενός Ν-τερματικού αμινοξέος στο «απελευθερωμένο προϊόν της (Χ+1)-ης σύζευξης», που περιλαμβάνει την αντίδραση του Ν-τερματικού αμινοξέος με το «απελευθερωμένο προϊόν του (Χ+1)-ου σύζευξη" σε έναν οργανικό διαλύτη που περιέχει ένα αντιδραστήριο επέκτασης πεπτιδίου για την παραγωγή ενός "προϊόντος δεσμευμένης προσθήκης", όπου το "Ν-τερματικό αμινοξύ" έχει μια αμινομάδα κορμού αποκλεισμένη από Boc ή Fmoc.

(ι) αποπροστασία του καλυμμένου προϊόντος σύζευξης Boc ή Fmoc με αντίδραση του καλυμμένου προϊόντος σύζευξης με ένα οξύ στην περίπτωση του Boc ή μια βάση στην περίπτωση του Fmoc για να σχηματιστεί το καλυμμένο πεπτιδικό προϊόν στη ρητίνη.

(ια) εάν το «ολοκληρωμένο προϊόν πεπτιδικής ρητίνης» περιέχει λειτουργικές ομάδες πλευρικής αλυσίδας, τότε, προαιρετικά, αποπροστασία των λειτουργικών ομάδων πλευρικής αλυσίδας του «ολοκληρωμένου προϊόντος πεπτιδικής ρητίνης», που περιλαμβάνει αντίδραση του «ολοκληρωμένου προϊόντος πεπτιδικής ρητίνης» με κατάλληλα αντιδραστήρια αποπροστασίας για την παραγωγή ενός «πλήρους πεπτιδικού προϊόντος σε αποπροστατευμένη ρητίνη»· Και

(ια) διάσπαση ενός πεπτιδίου από ένα στερεό υπόστρωμα ρητίνης σε ένα "ολοκληρωμένο προϊόν πεπτιδικής ρητίνης" ή "ολοκληρωμένο αποπροστατευμένο προϊόν πεπτιδικής ρητίνης" για την παραγωγή ενός πεπτιδίου, το οποίο περιλαμβάνει την αντίδραση του "ολοκληρωμένου προϊόντος πεπτιδίου σε μια ρητίνη" ή "ολοκληρωμένο πεπτιδικό προϊόν αποπροστατευμένη ρητίνη με αμμωνία, πρωτοταγή αμίνη ή δευτεροταγή αμίνη μέχρις ότου το πεπτίδιο απομακρυνθεί ουσιαστικά από τη ρητίνη.

υπό τον όρο ότι τα στάδια (ε) και (ζ) στη σύνθεση του πεπτιδίου πραγματοποιούνται έξι φορές μετά τον σχηματισμό του "απομπλοκαρισμένου προϊόντος πρώτης προσθήκης" του τύπου H-L-Thr-ρητίνη, όπου τα επόμενα αμινοξέα προστίθενται στο σειρά: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) και Fmoc-L-Cys(Acm ) για να σχηματιστεί το προϊόν H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη.

2. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου η αμμωνία, η πρωτοταγής αμίνη ή η δευτεροταγής αμίνη στο στάδιο (κ) είναι σε έναν διαλύτη που περιέχει μια αλκοόλη και, προαιρετικά, έναν απρωτικό πολικό διαλύτη.

3. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου το βήμα (ια) περιλαμβάνει περαιτέρω τα ακόλουθα βήματα:

(i) καθίζηση του διασπασμένου πεπτιδίου από τον διαλύτη.

(ii) διαχωρισμός με διήθηση του υποστρώματος στερεάς ρητίνης και του καταβυθισθέντος πεπτιδίου· και

(iii) εκχύλιση του πεπτιδίου με όξινο διάλυμα για την απομόνωση του πεπτιδίου.

4. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3, όπου το πρώτο αμινοξύ είναι ένα άλας καισίου του Boc-L-Thr, που αποδίδει μια ρητίνη Boc-L-Thr ως προϊόν πρώτης προσθήκης και την «απομπλοκαρισμένη πρώτη προσθήκη προϊόν» είναι η ρητίνη H-L-Thr.

5. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 4, όπου το οξύ που χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση της προστατευτικής ομάδας Boc στο στάδιο(α) είναι το τριφθοροξικό οξύ (TFA).

6. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 5, όπου ο οργανικός διαλύτης είναι χλωριούχο μεθυλένιο, χλωροφόρμιο ή διμεθυλοφορμαμίδιο, και το αντιδραστήριο για την αύξηση του πεπτιδίου είναι διισοπροπυλο-καρβοδιιμίδιο, δικυκλοεξυλο-καρβοδιιμίδιο ή Ν-αιθυλο-Ν"-(3-διμεθυλ-αμινοπροπύλιο )καρβοδιιμίδιο.

7. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 6, συμπεριλαμβανομένης της προσθήκης Boc-D--Nal σε H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)- Thr-ρητίνη σύμφωνα με το βήμα (i) για να ληφθεί ρητίνη Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr.

8. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 7, συμπεριλαμβανομένης της ταυτόχρονης αφαίρεσης της ομάδας Boc που αναστέλλει το D--Nal, της ομάδας O-t-Bu που προστατεύει το Tyr και της ομάδας Boc που προστατεύει το Lys στο Boc-D--Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη, σύμφωνα με τα βήματα για να ληφθεί ένα πλήρες πεπτιδικό προϊόν στη ρητίνη του τύπου H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνη.

9. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 8, συμπεριλαμβανομένης της αποκοπής του πεπτιδίου H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr από τη στερεά ρητίνη διεξάγοντας την αντίδραση H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-ρητίνες με αμμωνία σε διαλύτη που περιέχει αλκοόλη και, προαιρετικά, απρωτικό πολικό διαλύτη, μέχρι ουσιαστικής πλήρους απομάκρυνσης για απόδοση H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

10. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 9, όπου η αλκοόλη είναι μεθανόλη και ο πολικός απρωτικός διαλύτης είναι το διμεθυλοφορμαμίδιο.

11. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 10, συμπεριλαμβανομένης της ταυτόχρονης απομάκρυνσης των ομάδων Acm που προστατεύουν το Cys, και της κυκλοποίησης των αποπροστατευμένων υπολειμμάτων Cys που προκύπτουν σε ένα "πλήρες προϊόν πεπτιδικής ρητίνης" του τύπου H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr -D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 με αντίδραση H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 με ένα διάλυμα ιωδίου σε αλκοόλη έως ότου ολοκληρωθεί ουσιαστικά η αποπροστασία και η κυκλοποίηση για να δώσει H-D--Nal--Thr-NH2.

Η σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση προτάθηκε από τον R. B. Merrifield από το Πανεπιστήμιο Rockefeller (Βραβείο Νόμπελ 1984). Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη συναρμολόγηση ενός πεπτιδίου σε ένα αδιάλυτο πολυμερές υπόστρωμα με διαδοχική προσθήκη υπολειμμάτων αμινοξέων με προστατευμένες α-αμινο και πλευρικές ομάδες. Το σχέδιο ήταν να συναρμολογηθεί η πεπτιδική αλυσίδα σε στάδια, με την αλυσίδα να προσαρτάται στο ένα άκρο σε ένα στερεό στήριγμα κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. Ως αποτέλεσμα, η απομόνωση και ο καθαρισμός των ενδιαμέσων και των παραγώγων πεπτιδίου στόχου ήταν απλώς θέμα φιλτραρίσματος και σχολαστικής πλύσης του στερεού πολυμερούς για να απομακρυνθούν όλα τα πλεονάζοντα αντιδραστήρια και τα υποπροϊόντα που παραμένουν στο διάλυμα.

Ο όρος στερεάς φάσης αναφέρεται μάλλον στα φυσικά χαρακτηριστικά της ουσίας στον φορέα, αφού η χημική αντίδραση στον φορέα πολυμερούς λαμβάνει χώρα σε μία φάση - σε διάλυμα. Σε κατάλληλο διαλύτη, το πολυμερές διογκώνεται, μετατρέπεται σε ένα πήκτωμα χαμηλού ιξώδους αλλά υψηλής δομής (πολυμερή με σταυροειδείς δεσμούς) ή διαλύεται (στην περίπτωση των μη διασυνδεδεμένων πολυμερών) και η διαδικασία σύνθεσης λαμβάνει χώρα σε υπερμικρογενές επίπεδο , σε ένα σχεδόν ομοιογενές σύστημα.

Η οργανική σύνθεση στερεάς φάσης απαιτεί πολυμερή βάση - ρητίνη. μικρό, στο οποίο είναι προσαρτημένος ο σύνδεσμος μεγάλο. Στο πρώτο στάδιο ένα μόριο υποστρώματος συνδέεται με τον συνδέτη ΕΝΑ.Μόριο ΕΝΑακινητοποιεί (δηλαδή παύει να είναι κινητό), αλλά διατηρεί την ικανότητα να αντιδρά με άλλο αντιδραστήριο ΣΕ(στάδιο 2).

Προϊόν ΑΒπαραμένει στη ρητίνη, επιτρέποντάς της να διαχωριστεί από την περίσσεια του αντιδραστηρίου ΣΕ(και υποπροϊόντα) με απλό πλύσιμο. (Μπορείτε να προσθέσετε όλο και περισσότερα νέα αντιδραστήρια, περιπλέκοντας διαδοχικά το αρχικό υπόστρωμα ΕΝΑ, το κυριότερο είναι ότι ο συνδετήρας παραμένει αμετάβλητος σε αυτές τις αντιδράσεις). Διλειτουργικός συνδετήρας μεγάλοεπιλέγεται έτσι ώστε η σύνδεσή του με τη ρητίνη μικρόήταν πιο ανθεκτικό από ότι με το υπόστρωμα ΕΝΑ. Στη συνέχεια, στο τελευταίο στάδιο η ένωση στόχος ΑΒμπορεί να διαχωριστεί από τη ρητίνη σπάζοντας τον δεσμό της με τον συνδέτη. Είναι σαφές ότι η σύνδεση μεγάλο-ΑΒπρέπει να σχιστεί κάτω από ήπιες συνθήκες χωρίς να καταστραφεί η ίδια η σύνδεση (συγκόλληση ΕΝΑ-ΣΕ), ούτε επαφή του συνδετήρα με τη ρητίνη (δεσμός μεγάλο-μικρό).

Έτσι, ιδανικά, με το πλύσιμο της ρητίνης μετά από κάθε βήμα και τη διάσπαση του δεσμού με τον φορέα, λαμβάνεται μια καθαρή ουσία. Είναι φυσικό να πιστεύουμε ότι η χρήση μεγάλης περίσσειας αντιδραστηρίων και ο επακόλουθος διαχωρισμός από τη ρητίνη σε πολλές περιπτώσεις καθιστά δυνατή τη μετατόπιση της χημικής ισορροπίας προς το σχηματισμό του προϊόντος στόχου και τη μείωση του χρόνου σύνθεσης. Τα μειονεκτήματα της οργανικής σύνθεσης στερεάς φάσης περιλαμβάνουν την ανάγκη χρήσης αρκετά μεγάλης περίσσειας (2-30 ισοδύναμα) αντιδραστηρίων, δυσκολίες στην αναγνώριση προϊόντων ενδιάμεσης σύνθεσης, καθώς και το σχετικά υψηλό κόστος των τροποποιημένων πολυμερών υποστηριγμάτων, το οποίο καθορίζεται από την κόστος του συνδετήρα.

Εισήχθη από το Merrifield στην πρακτική της οργανικής σύνθεσης, το χλωρομεθυλιωμένο πολυστυρένιο (διασταυρωμένο με μικρή ποσότητα διβινυλοβενζολίου), η λεγόμενη ρητίνη Merrifield, είναι ο πιο προσιτός από τους πολυμερείς φορείς.

Μεθοδολογία και κύρια στάδια σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς φάσης

Η αναφερόμενη εργασία απαιτεί την εισαγωγή ενός πολυμερούς φορέα με ένα εμβολιασμένο αμινοξύ σε μια αντίδραση με έναν ετερόκυκλο ενεργοποιημένο για υποκατάσταση. Ας εξετάσουμε λεπτομερέστερα τη μεθοδολογική πτυχή της λήψης ακινητοποιημένων αμινοξέων σε υποστηρίγματα πολυμερών.

Στάδιο1. Ακινητοποίηση Ν-προστατευμένου αμινοξέος σε φορέα πολυμερούς.

Το πρώτο βήμα του σχεδίου μας είναι η ακινητοποίηση του αμινοξέος σε έναν πολυμερή φορέα. Προκειμένου να αποφευχθούν παράπλευρες διεργασίες όπως ο σχηματισμός ολιγοπεπτιδίων, το αμινοξύ προστατεύεται. Τυπικά, χρησιμοποιούνται Ν-προστατευμένα αμινοξέα και ο προκύπτων δεσμός μεταξύ του αμινοξέος και του φορέα είναι τύπου αμιδίου ή εστέρα.

Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες προστασίες αμινομάδων στην οργανική σύνθεση στερεάς φάσης είναι προστατευτικές ομάδες καρβαμιδικού τύπου, τριτ-βουτοξυκαρβονυλ (Boc) και 9Η-φθορενυλμεθοξυκαρβονυλική προστασία (Fmoc), το Χ είναι η προστατευμένη ομάδα:

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή της προστατευτικής ομάδας καθορίζεται από τον τύπο του πολυμερούς υποστηρίγματος που χρησιμοποιείται. Οι συνθήκες για την ακινητοποίηση των προστατευμένων αμινοξέων είναι διαφορετικές για διαφορετικούς τύπους πολυμερών φορέων. Πραγματοποιείται ακινητοποίηση Boc-αμινοξέων σε ρητίνη Merrifield, η οποία είναι χλωρομεθυλιωμένη πολυστυρένιο επί τόπουμε τη μορφή αλάτων καισίου με προσθήκη εναιωρήματος ανθρακικού καισίου σε φθαλικό διμεθυλεστέρα (DMF) και καταλυτικές ποσότητες ιωδιούχου καλίου. Η περίσσεια των αντιδραστηρίων σε σχέση με την ποσότητα του φορέα επιλέγεται ξεχωριστά σε κάθε περίπτωση και ανέρχεται σε 1,5-4 ισοδύναμα.

Η ακινητοποίηση των αμινοξέων Fmoc σε ένα υποστήριγμα πολυμερούς Wang (Χ=Ο) για να σχηματιστεί ένας συνδετήρας εστέρα τύπου βενζυλίου πραγματοποιείται με τη μέθοδο καρβοδιιμιδίου χρησιμοποιώντας διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο (DIC) παρουσία 4-(διμεθυλαμινο)πυριδίνης (DMAP) ως ένας καταλύτης. Η αντίδραση ακινητοποίησης με στερικά ανεμπόδιστα αμινοξέα λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ακινητοποίηση των στερικά παρεμποδισμένων αμινοξέων απαιτεί αντίδραση στους 40-60 °C για 2 ημέρες και επαναλαμβανόμενη ακινητοποίηση (Σχήμα 1) Ακινητοποίηση Fmoc - αμινοξέα στον φορέα πολυμερούς Rink (X=NH) με το σχηματισμό ενός συνδέτη αμιδίου τύπου βενζυδρυλίου πραγματοποιείται παρουσία του αντιδραστηρίου Castro (1Η-1,2,3-βενζοτριαζολ-1-υλοξυ) τρις-Εξαφθοροφωσφορικό (διμεθυλαμινο)φωσφόνιο (ΒΟΡ), βάση διισοπροπυλαιθυλαμίνης (DIEA) και 1-υδροξυβενζοτριαζόλη (HOBt), ως καταλύτης. Η αντίδραση προχωρά σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες για στερεοχημικά μη παρεμποδισμένα αμινοξέα και 4-6 ώρες για στερεοχημικά παρεμποδισμένα αμινοξέα.

Στάδιο 2.Αποπροστασία ενός προστατευμένου αμινοξέος σε έναν φορέα πολυμερούς

Στο δεύτερο στάδιο που σχεδιάζουμε (μετά την ακινητοποίηση του προστατευμένου αμινοξέος), είναι απαραίτητο να αφαιρέσουμε την προστατευτική ομάδα για να ενεργοποιήσουμε την αμινομάδα. Οι μέθοδοι για την αφαίρεση της προστασίας Boc και Fmoc είναι διαφορετικές. Η αφαίρεση της προστασίας Boc των αμινοξέων στη ρητίνη Merrifield πραγματοποιείται με 50% τριφθοροξικό οξύ σε διχλωρομεθάνιο για μισή ώρα, υπό αυτές τις συνθήκες ο συνδέτης Merrifield παραμένει άθικτος.

Μετά την αποπροστασία, η ρητίνη πλένεται με διάλυμα τριαιθυλαμίνης για να απομακρυνθεί το τριφθοροξικό οξύ. Η αφαίρεση της προστασίας Fmoc των αμινοξέων στους φορείς Wang (Χ=Ο) και Rink (Χ=ΝΗ) πραγματοποιείται με διάλυμα πιπεριδίνης 20% σε DMF για 40-50 λεπτά.

Μια σημαντική μείωση στη μάζα της ρητίνης μετά την αφαίρεση της προστασίας Fmoc μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για τον βαρυμετρικό προσδιορισμό του βαθμού ακινητοποίησης των προστατευμένων αμινοξέων στο πρώτο στάδιο της σύνθεσης στερεάς φάσης. Συνιστάται η διαδοχική επεξεργασία της ρητίνης με διάλυμα πιπεριδίνης σε φθαλικό διμεθυλεστέρα - πρώτα για 5-10 λεπτά και στη συνέχεια για 30 λεπτά σε φρέσκο ​​διάλυμα. Μετά την αφαίρεση της προστασίας, η ρητίνη πλένεται τουλάχιστον 4 φορές με φθαλικό διμεθυλεστέρα για να αφαιρεθούν τα προϊόντα καταστροφής της προστασίας Fmoc. Η παρακολούθηση της προόδου της αντίδρασης ακυλίωσης στο στήριγμα ή η αφαίρεση της προστατευτικής λειτουργίας από την αμινομάδα είναι δυνατή χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kaiser.

Στάδιο 3.Πυρηνόφιλη υποκατάσταση σε ετερόκυκλους που περιλαμβάνουν ένα αμινοξύ ακινητοποιημένο σε έναν φορέα

Το επόμενο βήμα που έχουμε προγραμματίσει για πρακτική εφαρμογή είναι να πραγματοποιήσουμε την αντίδραση αρωματικής πυρηνόφιλης υποκατάστασης. Το εμβολιασμένο αμινοξύ χρησιμεύει ως πυρηνόφιλο και ο ενεργοποιημένος ετερόκυκλος βρίσκεται σε διάλυμα. Οι περισσότερες αντιδράσεις πυρηνόφιλης υποκατάστασης σε υποστρώματα δεν διαφέρουν στην εκτέλεση από τις αντιδράσεις στην υγρή φάση. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι η θερμοκρασία της διεργασίας δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 120 °C, πάνω από τους οποίους αρχίζει να φθείρεται η βάση πολυστυρενίου του φορέα. Υπό τις συνθήκες της αντίδρασης που διεξάγεται στο υπόστρωμα, ο συνδέτης πρέπει επίσης να διατηρηθεί.

Κατά την επιλογή κατάλληλων ενεργοποιημένων ετεροκυκλικών υποστρωμάτων, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η φύση της αποχωρούσας ομάδας στον ετερόκυκλο.

Στάδιο 4.Αφαίρεση της ένωσης στόχου από πολυμερείς φορείς

Οι περισσότεροι συνδέτες στην οργανική σύνθεση στερεάς φάσης διασπώνται σε όξινο περιβάλλον. Η αντίσταση στα οξέα των συνδετήρων μειώνεται απότομα όταν μετακινείται από τη ρητίνη Merrifield στη ρητίνη Wang and Rink. Ο συνδέτης Rink διασπάται κάτω από ηπιότερες συνθήκες (10-20% CF3COOH) από τον συνδέτη Wang (50% CF3COOH). Η ρητίνη Merrifield είναι παθητική υπό αυτές τις συνθήκες και η μετεστεροποίηση σε διάλυμα NaOMe/MeOH χρησιμοποιείται για τη διάσπασή της, οδηγώντας σε ο σχηματισμός ενός εστέρα οξέος.

Ας θυμηθούμε για άλλη μια φορά ότι η φύση του συνδετήρα καθορίζει τον τύπο της τερματικής συνάρτησης στο προκύπτον μόριο που αφαιρείται από το υπόστρωμα. Η ρητίνη του Wang παράγει οξέα και η ρητίνη του Rink παράγει αμίδια.

Πλεονεκτήματα αυτού του σχήματος πεπτιδικής σύνθεσης στερεάς φάσης:

1. Διαφορετικές μητρικές ενώσεις μπορούν να συνδεθούν σε μεμονωμένους κόκκους. Αυτά τα σφαιρίδια στη συνέχεια αναμειγνύονται έτσι ώστε όλες οι αρχικές ενώσεις να μπορούν να αντιδράσουν με το αντιδραστήριο σε ένα μόνο πείραμα. Ως αποτέλεσμα, τα προϊόντα αντίδρασης σχηματίζονται σε μεμονωμένους κόκκους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ανάμειξη των πρώτων υλών στην παραδοσιακή υγροχημεία συνήθως οδηγεί σε αστοχίες - πολυμερισμό ή ρητινοποίηση των προϊόντων. Τα πειράματα σε στερεά υποστρώματα αποκλείουν αυτές τις επιδράσεις.

2. Εφόσον τα αρχικά υλικά και τα προϊόντα είναι συνδεδεμένα στο στερεό υπόστρωμα, η περίσσεια των αντιδραστηρίων και τα προϊόντα που δεν είναι συνδεδεμένα με υποστήριξη μπορούν εύκολα να πλυθούν από το στερεό υπόστρωμα πολυμερούς.

3. Μεγάλη περίσσεια αντιδραστηρίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ολοκλήρωση της αντίδρασης (μεγαλύτερη από 99%), καθώς αυτές οι περίσσειες διαχωρίζονται εύκολα.

4. Χρησιμοποιώντας χαμηλούς όγκους φόρτωσης (λιγότερο από 0,8 mmol ανά γραμμάριο υποστρώματος), μπορούν να εξαλειφθούν οι ανεπιθύμητες παρενέργειες.

5. Τα ενδιάμεσα στο μίγμα της αντίδρασης συνδέονται με τους κόκκους και δεν χρειάζεται να καθαριστούν.

6. Μεμονωμένοι κόκκοι πολυμερούς μπορούν να διαχωριστούν στο τέλος του πειράματος και έτσι λαμβάνονται μεμονωμένα προϊόντα.

7. Το πολυμερές υπόστρωμα μπορεί να αναγεννηθεί σε περιπτώσεις που επιλέγονται οι συνθήκες θραύσης και επιλέγονται οι κατάλληλες ομάδες αγκύρωσης - συνδετήρες.

8. Είναι δυνατή η αυτοματοποίηση της σύνθεσης στερεάς φάσης.

Οι απαραίτητες προϋποθέσεις για τη διεξαγωγή της σύνθεσης στερεάς φάσης, εκτός από την παρουσία ενός αδιάλυτου πολυμερούς υποστρώματος που είναι αδρανές υπό συνθήκες αντίδρασης, είναι:

Η παρουσία άγκυρας ή συνδετήρα είναι μια χημική λειτουργία που εξασφαλίζει τη σύνδεση του υποστρώματος με την εφαρμοζόμενη ένωση. Πρέπει να είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με τη ρητίνη. Η άγκυρα πρέπει επίσης να είναι μια αντιδραστική λειτουργική ομάδα προκειμένου τα υποστρώματα να αλληλεπιδρούν μαζί της.

Ο δεσμός που σχηματίζεται μεταξύ του υποστρώματος και του συνδετήρα πρέπει να είναι σταθερός υπό τις συνθήκες αντίδρασης.

Πρέπει να υπάρχουν τρόποι να σπάσει ο δεσμός του προϊόντος ή του ενδιάμεσου με τον συνδετήρα.