سنتز فاز جامد یا فناوری فاز جامد که اغلب فناوری سرامیک نامیده می شود، رایج ترین در تولید مواد معدنی برای شاخه های مختلف علم و صنعت است. اینها عبارتند از سوخت هسته ای، مواد برای فناوری فضایی، الکترونیک رادیویی، ساخت ابزار، کاتالیزورها، دیرگدازها، ابررساناهای با دمای بالا، نیمه هادی ها، فروالکتریک ها و پیزوالکتریک ها، آهن رباها، کامپوزیت های مختلف و بسیاری دیگر.

سنتز فاز جامد بر اساس واکنش های شیمیایی است که در آن حداقل یکی از واکنش دهنده ها به شکل جامد وجود دارد. چنین واکنش هایی ناهمگن یا فاز جامد نامیده می شوند. برهمکنش فاز جامد، بر خلاف واکنش‌ها در یک محیط مایع یا گاز، از دو فرآیند اساسی تشکیل شده است: خود واکنش شیمیایی و انتقال ماده به منطقه واکنش.

واکنش های فاز جامد شامل اجزای کریستالی با تحرک محدود اتم ها یا یون های آنها و وابستگی پیچیده به عوامل بسیاری مشخص می شود. اینها شامل ساختار شیمیایی و واکنش پذیری جامدات در حال واکنش، ماهیت و غلظت عیوب، وضعیت سطح و مورفولوژی منطقه واکنش، منطقه تماس واکنشگرهای متقابل، فعال سازی مکانیکی اولیه و تعدادی از دیگران. همه موارد فوق پیچیدگی مکانیسم های واکنش های ناهمگن را تعیین می کند. مطالعه واکنش های ناهمگن بر اساس شیمی حالت جامد، فیزیک شیمیایی و شیمی فیزیکی سطح جامدات، بر اساس قوانین ترمودینامیک و سینتیک است.

اغلب مکانیسم واکنش های فاز جامد تنها بر این اساس قضاوت می شود که داده های تجربی در مورد درجه برهمکنش به عنوان تابعی از زمان به بهترین وجه توسط یک مدل جنبشی خاص و معادله جنبشی مربوطه توصیف می شوند. این رویکرد ممکن است به نتایج نادرستی منجر شود.

فرآیندهای موجود در مواد فاز جامد دارای تعدادی تفاوت مهم با فرآیندهای موجود در مایعات یا گازها هستند. این تفاوت ها، اول از همه، با نرخ انتشار به طور قابل توجهی (با چندین مرتبه بزرگی) کمتر در جامدات همراه است، که از میانگین غلظت اجزا در سیستم جلوگیری می کند و در نتیجه منجر به محلی سازی فضایی فرآیندهای در حال وقوع می شود. محلی سازی فضایی به نوبه خود منجر به این واقعیت می شود که هم سرعت خاص فرآیند (یا ضریب انتشار) و هم هندسه منطقه واکنش به سینتیک مشاهده شده فرآیندها کمک می کند. چنین ویژگی هایی از فرآیندهای فاز جامد که توسط عوامل هندسی تعیین می شوند، توپوشیمیایی نامیده می شوند. علاوه بر این، از آنجایی که دگرگونی های مورد بحث از نظر مکانی محلی هستند، نرخ آنها را می توان هم توسط خود فرآیندها در مرز فاز (کنترل واکنش) و هم با نرخ عرضه هر یک از اجزا به این مرز یا حذف محصول تعیین کرد. ث) (کنترل انتشار). این موارد برای سیستم های ساده ای که مفروضات مدل برای آنها برآورده می شود را می توان در آزمایش با نوع وابستگی زمانی درجه تبدیل شناسایی کرد. یکی دیگر از ویژگی های تبدیل فاز در جامدات با این واقعیت مرتبط است که تشکیل هسته یک فاز جدید در یک ماتریس جامد باعث ایجاد تنش های الاستیک در ماتریس دوم می شود که انرژی آن در برخی موارد باید هنگام بررسی در نظر گرفته شود. ترمودینامیک این تحولات

تعداد زیادی از عوامل موثر بر سینتیک فرآیندهای فاز جامد و ریزساختار مواد حاصل نیز تعدد انواع طبقه بندی این فرآیندها را تعیین می کند. بنابراین، هنگام در نظر گرفتن پایداری یک سیستم با توجه به نوسانات انواع مختلف، ناهمگن (در مورد سیستم هایی که پایدار به نوسانات کوچک در حجم اشغال شده و ناپایدار به سیستم های بزرگ هستند) و همگن (در مورد سیستم هایی که ناپایدار به نوسانات کوچک) فرآیندها متمایز می شوند. برای فرآیندهای ناهمگن، به عنوان مثال، می‌توان به دگرگونی‌هایی اشاره کرد که از طریق مکانیسم تشکیل و رشد هسته‌ها اتفاق می‌افتند؛ برای فرآیندهای همگن، برخی انتقال‌های نظم-اختلال و تجزیه نخاعی محلول‌های جامد را می‌توان ذکر کرد.

لازم است هسته زایی ناهمگن و همگن در مورد فرآیندهای ناهمگن از فرآیندهای ناهمگن و همگن تشخیص داده شود. هسته‌زایی ناهمگن به تشکیل هسته‌ها در نقص‌های ساختاری (از جمله نقص جابجایی نقطه و مرزهای فاز) اشاره دارد. هسته سازی همگن - تشکیل هسته ها در حجم بدون نقص فاز جامد.

با تجزیه و تحلیل محصول تبدیل فاز جامد، هسته های تک فاز و چند فازی متمایز می شوند. در مورد هسته های چند فازی، محصول فرآیند یک کلنی چند فازی با یک ریزساختار مشخص است که توسط انرژی سطحی مرز فازهای حاصل تعیین می شود. فرآیندهای این نوع متناوب نامیده می شوند، برخلاف فرآیندهای پیوسته در مورد تشکیل و رشد هسته های تک فاز.

روش دیگر طبقه بندی تبدیل های فاز جامد بر اساس مقایسه ترکیب فاز اولیه و ترکیب محصول واکنش است. اگر منطبق شوند، از فرآیندهای غیر انتشاری صحبت می کنند و اگر ترکیب تغییر کند، از فرآیندهای انتشار صحبت می کنند. علاوه بر این، از غیر انتشار، تشخیص فرآیندهای مشارکتی (به عنوان مثال، تبدیل مارتنزیتی)، که از طریق حرکت خفیف همزمان اتم ها در حجم زیادی از فاز اولیه رخ می دهد، مفید است.

تبدیل فاز بدون انتشار می تواند در نوع ویژگی های ترمودینامیکی که در طول فرآیند تغییر می کند متفاوت باشد.

تبدیل های نوع اول فرآیندهایی هستند که در آن مشتقات پتانسیل شیمیایی نسبت به دما یا فشار تغییر می کنند. این به معنای تغییر ناگهانی در طول انتقال فاز پارامترهای ترمودینامیکی مانند آنتروپی، حجم، آنتالپی و انرژی داخلی است. در طول تبدیل‌های نوع دوم، مشتقات اول پتانسیل شیمیایی با توجه به پارامترهای فشرده تغییر نمی‌کنند، اما مشتقات مرتبه‌های بالاتر (با شروع از دوم) تغییر می‌کنند. در این فرآیندها، با آنتروپی و حجم پیوسته سیستم، تغییر ناگهانی در مقادیر بیان شده از طریق مشتقات دوم انرژی گیبس وجود دارد: ظرفیت گرمایی، ضریب انبساط حرارتی، تراکم پذیری و غیره.

واکنش‌های فاز جامد بین دو فاز (تماس بین سه یا چند فاز بعید است، و فرآیندهای مربوطه را می‌توان به صورت ترکیبی از چندین واکنش دو فازی نشان داد) فرآیندهای انتشار هستند و می‌توانند ناهمگن یا همگن، با هسته‌زایی ناهمگن و همگن باشند. . فرآیندهای همگن و فرآیندهای با هسته همگن در چنین واکنش هایی ممکن است، به عنوان مثال، در مورد تشکیل یک محلول جامد ناپایدار با تجزیه بعدی آن (به اصطلاح واکنش های داخلی). نمونه ای از این فرآیندها اکسیداسیون داخلی است.

شرط تعادل ترمودینامیکی در طول تبدیل فاز جامد، مانند هر تبدیل شیمیایی دیگر، برابری پتانسیل های شیمیایی اجزاء در مواد اولیه و محصولات واکنش است. هنگامی که دو فاز جامد برهم کنش می کنند، برابری مشخص شده پتانسیل های شیمیایی را می توان به روش های مختلف تحقق بخشید: 1) توزیع مجدد اجزاء در فازهای اولیه با تشکیل محلول های جامد. 2) تشکیل فازهای جدید با ساختار کریستالی متفاوت (که در واقع معمولاً واکنش فاز جامد نامیده می شود) و از آنجایی که پتانسیل شیمیایی جزء در فازهای مختلف یک سیستم چند فازی به مقدار آن بستگی ندارد. در هر فاز، تعادل تنها با تبدیل کامل فازهای اولیه حاصل می شود. مطمئن ترین اطلاعات در مورد مکانیسم واکنش های فاز جامد از طریق استفاده پیچیده به دست می آید که امکان مشاهده همزمان چندین پارامتر سیستم واکنش دهنده از جمله ترکیب فاز، اثرات حرارتی، تغییرات جرم و موارد دیگر را فراهم می کند.

نظریه ترمودینامیکی واکنش‌های فاز جامد توسط واگنر ارائه شد و بعداً توسط Schmalzried با استفاده از مثال واکنش‌های افزودن توسعه یافت.

تا به امروز، هیچ طبقه بندی واحدی از طیف گسترده ای از واکنش های ناهمگن وجود ندارد. این به دلیل دشواری انتخاب یک معیار به عنوان مبنای چنین طبقه بندی جهانی است. با توجه به معیارهای شیمیایی، واکنش ها به واکنش های اکسیداسیون، احیا، تجزیه، ترکیب، تبادل و غیره تقسیم می شوند.

یکی از ویژگی های بارز همه واکنش های ناهمگن وجود و محلی سازی در سطح مشترک منطقه واکنش است. ناحیه واکنش، معمولاً با ضخامت کم، دو ناحیه از فضا را که توسط موادی با ترکیبات مختلف و خواص متفاوت اشغال شده است، جدا می کند. دلایل تشکیل یک ناحیه واکنش معمولاً به دو گروه تقسیم می شوند: کندی نسبی فرآیندهای انتشار و دلایل شیمیایی. آخرین گروه به دلیل واکنش پذیری بالای اتم ها یا مولکول های واقع در سطح یک معرف جامد یا در سطح مشترک بین دو فاز موجود است. مشخص است که سطح یک ماده جامد یا مایع دارای خواصی متفاوت از خواص حجمی یک نمونه فشرده است. این ویژگی های رابط فاز را خاص می کند. در اینجا است که بازسازی قابل توجهی در بسته بندی کریستالی رخ می دهد، کشش بین دو شبکه کریستالی کاهش می یابد و تغییر در ترکیب شیمیایی رخ می دهد.

از آنجایی که انتقال جرم از طریق انتشار اتفاق می‌افتد و تحرک انتشار ذرات جامد به نقص ساختار آن بستگی دارد، می‌توان انتظار تأثیر قابل توجهی از نقص‌ها بر مکانیسم و ​​سینتیک واکنش‌های فاز جامد داشت. این مرحله قبل از مرحله شیمیایی تبدیل مواد واکنش دهنده در سطح مشترک است. بنابراین، سینتیک واکنش های ناهمگن هم با ماهیت خود واکنش شیمیایی و هم با روش تحویل ماده به منطقه واکنش تعیین می شود. مطابق با ذکر شده، سرعت واکنش توسط مرحله شیمیایی (سینتیک شیمیایی) یا انتشار (سینتیک انتشار) محدود خواهد شد. این پدیده در واقعیت مشاهده می شود.

به گفته واگنر، انتشار و در نتیجه واکنش در جامدات عمدتاً به دلیل تحرک یون‌ها و الکترون‌ها، ناشی از حالت عدم تعادل شبکه انجام می‌شود. یون های شبکه مختلف با سرعت های متفاوتی از آن عبور می کنند. به ویژه، تحرک آنیون ها در اکثر موارد در مقایسه با تحرک کاتیون ها ناچیز است. بنابراین، انتشار و بر این اساس، واکنش در جامدات به دلیل حرکت کاتیون ها انجام می شود. در این حالت، انتشار کاتیون های غیرمشابه می تواند در یک جهت یا به سمت یکدیگر پیش رود. با کاتیون های بارهای مختلف، خنثی الکتریکی سیستم به دلیل حرکت الکترون ها حفظ می شود. به دلیل تفاوت در سرعت حرکت کاتیون های با بار متفاوت در سیستم، پتانسیل الکتریکی ایجاد می شود. در نتیجه سرعت حرکت یون های متحرک بیشتر کاهش می یابد و بالعکس برای یون های کمتر متحرک؟ افزایش. بنابراین، پتانسیل الکتریکی حاصل، نرخ انتشار یون ها را تنظیم می کند. دومی و نرخ کل فرآیند تبدیل فاز جامد تعیین شده توسط آن را می توان بر اساس هدایت الکترونیکی و اعداد انتقال محاسبه کرد. بدیهی است که انتشار مستقیم یونها تنها در میدان الکتریکی یا در حضور یک گرادیان غلظت در سیستم امکان پذیر است.

هنگام سنتز مواد در حالت جامد، اغلب لازم است نه تنها ترکیب شیمیایی (عنصری و فازی) محصول حاصل، بلکه سازمان ریزساختاری آن نیز کنترل شود. این به دلیل وابستگی شدید هر دو ویژگی شیمیایی (به عنوان مثال، فعالیت در واکنش های فاز جامد) و بسیاری از خواص فیزیکی (مغناطیسی، الکتریکی، نوری و غیره) به ویژگی های سازمان ساختاری یک جامد در سطوح مختلف سلسله مراتبی است. اولین مورد از این سطوح شامل ترکیب عنصری یک جامد و روش آرایش نسبی اتم های عناصر در فضا - ساختار بلوری (یا ویژگی های محیط هماهنگی فوری اتم ها در جامدات آمورف)، و همچنین ترکیب و غلظت است. از عیوب نقطه به عنوان سطح بعدی ساختار جسم جامد، می‌توانیم توزیع نقص‌های گسترده در کریستال را در نظر بگیریم که اندازه‌های مناطقی را تعیین می‌کند که در آن (تعدیل شده برای وجود نقص نقطه‌ای) تقارن انتقالی در آرایش اتم‌ها مشاهده می‌شود. چنین مناطقی را می توان میکروکریستال های کامل در نظر گرفت و به آنها مناطق پراکندگی منسجم می گویند. در مورد مناطق پراکندگی منسجم، لازم به یادآوری است که در حالت کلی آنها معادل ذرات فشرده ای نیستند که یک ماده فاز جامد را تشکیل می دهند، که می تواند تعداد قابل توجهی از عیوب گسترده و در نتیجه مناطق پراکندگی منسجم را داشته باشد. همزمانی مناطق پراکندگی منسجم با ذرات (که در این مورد تک دامنه نامیده می شوند) معمولاً فقط برای اندازه های به اندازه کافی کوچک (کمتر از 100 نانومتر) ذرات مشاهده می شود. سطوح ساختاری بعدی می تواند با توزیع شکل و اندازه ذرات تشکیل دهنده مواد پودری یا سرامیکی، تجمع آنها، تجمع سنگدانه های اولیه و غیره مرتبط باشد.

کاربردهای مختلف مواد فاز جامد الزامات متفاوت و اغلب متضادی برای ویژگی های ساختاری ذکر شده در بالا دارند و بنابراین به روش های مصنوعی متفاوتی نیاز دارند. بنابراین، صحیح تر است که در مورد روش های سنتز مواد فاز جامد، بلکه مواد فاز جامد صحبت کنیم و در هر مورد، یک روش سنتز را با در نظر گرفتن منطقه کاربرد بعدی محصول حاصل انتخاب کنید.

به طور کلی، روش های سنتز مواد فاز جامد را می توان بر اساس فاصله آنها از شرایط تعادل ترمودینامیکی برای وقوع فرآیندهای شیمیایی مورد استفاده طبقه بندی کرد. مطابق با قوانین عمومی، در شرایط مربوط به حالتی که حداکثر از حالت تعادل فاصله دارد، بیش از حد قابل توجهی از سرعت هسته‌زایی نسبت به سرعت رشد هسته‌های تشکیل‌شده مشاهده می‌شود که بدیهی است منجر به تولید پراکنده‌ترین هسته‌ها می‌شود. تولید - محصول. اگر این فرآیند نزدیک به تعادل ترمودینامیکی انجام شود، رشد هسته‌های از قبل تشکیل‌شده سریع‌تر از تشکیل هسته‌های جدید اتفاق می‌افتد، که به نوبه خود امکان به دست آوردن مواد درشت کریستالی (در حالت محدود، تک بلوری) را فراهم می‌کند. سرعت رشد کریستال تا حد زیادی توسط غلظت عیوب گسترش یافته (غیر تعادلی) در آنها تعیین می شود.

سنتز ترکیبی را می توان نه تنها در محلول (سنتز فاز مایع)، بلکه بر روی سطح یک فاز جامد و از نظر شیمیایی بی اثر نیز انجام داد. در این مورد، اولین ماده اولیه از نظر شیمیایی به گروه‌های عاملی روی سطح حامل پلیمر متصل می‌شود (اغلب از پیوند استری یا آمیدی استفاده می‌شود) و با محلول ماده اولیه دوم که به میزان قابل توجهی مصرف می‌شود، درمان می‌شود. بیش از حد به طوری که واکنش تا تکمیل ادامه یابد. راحتی خاصی در این شکل از واکنش وجود دارد، زیرا تکنیک جداسازی محصولات ساده شده است: پلیمر (معمولاً به شکل گرانول) به سادگی فیلتر می شود، کاملاً شسته می شود تا هر معرف باقی مانده حذف شود، و ترکیب مورد نظر از نظر شیمیایی از آن جدا می شود. آی تی.

در شیمی آلی یک واکنش واحد وجود ندارد که در عمل در هر صورت بازده کمی محصولات مورد نظر را ارائه دهد. تنها استثنا ظاهراً احتراق کامل مواد آلی در اکسیژن در دماهای بالا به CO 2 و H 2 O است. بنابراین، خالص سازی محصول هدف همیشه ضروری و اغلب دشوارترین و زمان برترین کار است. یک کار چالش برانگیز جداسازی محصولات سنتز پپتید است، به عنوان مثال، جداسازی مخلوط پیچیده ای از پلی پپتیدها. بنابراین، در سنتز پپتید است که روش سنتز بر روی یک تکیه گاه پلیمری جامد، که در اوایل دهه 60 قرن بیستم توسط R.B. Merifield توسعه یافت، بسیار رایج شده است.

حامل پلیمری در روش مریفیلد پلی استایرن گرانوله با پیوند متقابل حاوی گروه های کلرومتیل در هسته های بنزن است که پیوندهایی هستند که پایه را به اولین باقی مانده اسید آمینه پلی پپتید متصل می کنند. این گروه ها پلیمر را به آنالوگ عملکردی بنزیل کلرید تبدیل می کنند و به آن توانایی ایجاد پیوندهای استری را در هنگام واکنش با آنیون های کربوکسیلات می دهند. تراکم چنین رزینی با اسیدهای آمینه محافظت شده با N منجر به تشکیل استرهای بنزیل مربوطه می شود. حذف N-حفاظت یک مشتق محافظت شده با C از اولین اسید آمینه متصل به پلیمر تولید می کند. آمینواسیلاسیون گروه آمینه آزاد شده با یک مشتق محافظت شده N از یک اسید آمینه دوم و به دنبال حذف N-حفاظت منجر به یک مشتق دی پپتیدی مشابه نیز می شود که به پلیمر متصل می شود:

چنین چرخه دو مرحله‌ای (حفاظت - آمینواسیلاسیون) می‌تواند، در اصل، به تعداد دفعات مورد نیاز برای ایجاد یک زنجیره پلی پپتیدی با طول معین تکرار شود.

توسعه بیشتر ایده های مریفیلد، اول از همه، با هدف جستجو و ایجاد مواد پلیمری جدید برای بسترها، توسعه روش هایی برای جداسازی محصولات و ایجاد تاسیسات خودکار برای کل چرخه سنتز پلی پپتید بود.

اثربخشی روش مریفیلد با سنتز موفقیت آمیز تعدادی از پلی پپتیدهای طبیعی، به ویژه انسولین، نشان داده شد. مزایای آن به ویژه با استفاده از مثال سنتز آنزیم ریبونوکلئاز به وضوح نشان داده شد. به عنوان مثال، هیرشمن و 22 همکار به قیمت تلاش قابل توجه در طی چندین سال، آنزیم ریبونوکلئاز (124 باقیمانده اسید آمینه) را با استفاده از روش‌های سنتی فاز مایع سنتز کردند. تقریباً به طور همزمان، همان پروتئین با سنتز خودکار فاز جامد به دست آمد. در مورد دوم، یک سنتز شامل 11931 عملیات مختلف، از جمله 369 واکنش شیمیایی، توسط دو شرکت کننده (Gatte و Merrifield) تنها در چند ماه تکمیل شد.

ایده های مریفیلد به عنوان پایه ای برای ایجاد روش های مختلف برای سنتز ترکیبی کتابخانه های پلی پپتیدهای ساختارهای مختلف عمل کرد.

بنابراین، در سال 1982، یک استراتژی اصلی برای سنتز موازی چند مرحله ای پپتیدها در فاز جامد، به نام "روش تقسیم" ارائه شد. شکاف- تقسیم، جداسازی) یا روش "مخلوط و تقسیم" (شکل 3). ماهیت آن به شرح زیر است. بیایید بگوییم که از سه اسید آمینه (A، B و C) باید تمام ترکیبات ممکن تری پپتیدها را بدست آورید. برای انجام این کار، گرانول های حامل پلیمر جامد (P) به سه قسمت مساوی تقسیم می شوند و با محلول یکی از اسیدهای آمینه درمان می شوند. در این حالت تمام اسیدهای آمینه با یکی از گروه های عاملی خود به صورت شیمیایی به سطح پلیمر متصل می شوند. سه گرید پلیمری به دست آمده کاملاً مخلوط می شوند و مخلوط دوباره به سه قسمت تقسیم می شود. سپس هر قسمت حاوی هر سه آمینو اسید به مقدار مساوی، دوباره با یکی از همان سه آمینو اسید تیمار می شود تا 9 دی پپتید (سه مخلوط از سه محصول) تولید شود. مخلوط کردن دیگر، تقسیم به سه قسمت مساوی و پردازش با اسیدهای آمینه، 27 تری پپتید مورد نظر (سه مخلوط از 9 محصول) را تنها در 9 مرحله به دست می‌آورد، در حالی که به دست آوردن آنها به طور جداگانه نیاز به سنتز 27 × 3 = 81 مرحله دارد.

"زیست شناس. مجله ارمنستان، 1 (65)، 2013 سنتز فاز جامد پپتید قلبی فعال جدا شده از دهلیز خوک G.S. موسسه بیوشیمی CHAILYAN به نام. Bunyatyan NAS RA..."

مقالات تجربی و نظری

مقالات تجربی و نظری

زیست شناس. مجله ارمنستان، 1 (65)، 2013

سنتز فاز جامد پپتیدهای قلبی فعال،

جدا شده از دهلیز خوک

G.S. چایلیان

موسسه بیوشیمی به نام. Bunyatyan NAS RA

[ایمیل محافظت شده].

به منظور ادامه تحقیق، دانشگاهیان. Galoyan، ما مجموعه‌ای از آزمایش‌ها را برای جداسازی، خالص‌سازی و تعیین جهت بیولوژیکی ترکیبات پپتیدی تازه جدا شده از دهلیزها و بخش‌های گوش قلب خوک انجام دادیم. برای انجام آزمایش‌های زیستی، لازم بود مقادیر آماده‌سازی نمونه‌های آزمایشی به دست آید. برای این کار از روش سنتز فاز جامد پپتیدها با اصلاح بیشتر آن استفاده کردیم. خلوص و هویت داروهای سنتز شده توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و تجزیه و تحلیل طیف جرمی تأیید شد.

سنتز فاز جامد - اسیدهای آمینه fmoc - HPLC - فنیل ایزوتیوسیانات - تجزیه و تحلیل طیف جرمی:

fmoc- – – برای مطالعات بیشتر توسط Galoyan، مجموعه‌ای از آزمایش‌ها بر روی جداسازی، خالص‌سازی و تعیین جهت بیولوژیکی پپتیدهای جدا شده از دهلیز خوک‌ها انجام شد. برای انجام بیوتست ها به مقدار آماده سازی نمونه نیاز بود. روش اصلاح شده سنتز پپتید فاز جامد استفاده شد. خلوص پپتید سنتز شده و هویت با HPLC و تجزیه و تحلیل طیف جرمی تعریف شد.

سنتز فاز جامد - کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - طیف سنجی جرمی - fmoc-aminoacids - cardiopeptides - دهلیزها سالها در موسسه بیوشیمی آکادمی ملی علوم جمهوری ارمنستان در بخش بیوشیمی هورمونهای عصبی، Acad. گالویان و همکارانش مسیرهای تنظیمی و مکانیسم‌های اثر هورمون‌های عصبی هیپوتالاموس را بر روی فرآیندهای مختلف بدن مطالعه کردند.

تأیید ایده عملکرد به هم پیوسته، وابسته و یکپارچه سیستمی مانند هیپوتالاموس - غده هیپوفیز - غدد فوق کلیوی نقطه عطفی در غدد درون ریز بود. تکمیل این مفهوم سنتز فاز جامد پپتید قلبی جدا شده از دهلیز خوک سه گانه ارائه شده توسط گالویان در مورد برهمکنش هیپوتالاموس - غده هیپوفیز

- قلب، یک دستاورد علمی بزرگ است. پس از آن، بافت هدف جدیدی به نام قلب کشف شد، توانایی این اندام برای کنترل عملکرد پپتیدهای خاص و همچنین وجود مکانیسم بازخوردی بین هیپوتالاموس و قلب از طریق این پپتیدها نشان داده شد.

کشف ترکیبات قلبی فعال - هورمون های عصبی K، C، G و تعدادی دیگر در هیپوتالاموس حیوانات مختلف به عنوان آغاز کار نه تنها در مطالعه مکانیسم های مولکولی عملکرد این هورمون های عصبی، بلکه در جستجوی ترکیبات مشابه بود. در قلب. مبنای یک مطالعه جامع از خواص بیوشیمیایی و فیزیکوشیمیایی اصول قلب، داده‌های مربوط به حضور 2 ترکیب قلبی فعال در عضله قلب بود. مشارکت نوروهورمون "C" در تنظیم فرآیندهای گلیکولیتیک و سطح نوکلئوتیدهای حلقوی از طریق مهار PDE cAMP، پروتئین کیناز وابسته به cAMP و غیره ایجاد شد. این ترکیب نشان داده شده است که وزن مولکولی پایینی دارد و به عنوان گلیکوپپتید طبقه بندی می شود.

در آزمایشگاه کروماتوگرافی تحلیلی و سنتز پپتید، ما کار بر روی جداسازی و خالص سازی ترکیبات پپتیدی از دهلیزها و ناحیه گوش قلب خوک انجام دادیم. هنگام جداسازی فراکسیون‌های پپتیدی توسط HPLC آماده‌سازی، 20 ترکیب از طبیعت پپتیدی را جدا و خالص کردیم تا به حالت همگن برسند. برای تعیین جهت بیولوژیکی، تمام داروها برای تغییرات در اجزای ECG در موش‌ها مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج تجربی نشان داد که 7 ترکیب تأثیرات متنوعی بر اجزای خاص ECG دارند.

پپتید شماره 7 بیشترین فعالیت را در تغییر دامنه مولفه R، مدت زمان کمپلکس QRS، دامنه S و سایر پارامترها نشان داد.

برای بررسی مکانیسم های بیولوژیکی اثر این دارو، نیاز به تعداد زیادی نمونه آزمایشی شد. با توجه به اینکه فرآیند جداسازی و خالص سازی فرآورده های بیولوژیکی به شدت بی اثر، کار فشرده، زمان بر است و نمی تواند تکرارپذیری خوبی داشته باشد، سنتز شیمیایی این دارو بسیار ضروری شده است. با تجزیه و تحلیل ادبیات جهان در زمینه سنتز شیمیایی پپتیدها، به این نتیجه رسیدیم که بهینه ترین روش برای ما، روش سنتز فاز جامد با استفاده از اسیدهای آمینه محافظت شده با fmoc است. سنتز پپتید فاز جامد که در سال 1984 کشف شد، مزایای زیادی نسبت به سنتز معمولی از نظر کارایی، و همچنین پردازش و خالص سازی راحت دارد.

با استفاده از چند روش مختلف: هیدرولیز این دارو، اصلاح اسیدهای آمینه با فنیل ایزوتیوسیانات، ترکیب اسید آمینه پپتید شماره 7 را به دست آوردیم. با استفاده از داده های حاصل از تجزیه و تحلیل طیف جرمی و NMR و تجزیه ادموند، ما توانستیم نه تنها ترکیب اسید آمینه، بلکه توالی اسید آمینه پپتید شماره 7 را نیز بدست آوریم.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro یک فرآیند سنتز فاز جامد موثر تا حد زیادی به انتخاب صحیح شرایط مختلف برای اجرای آن بستگی دارد، مانند انتخاب رزین، حلال و سینتیک سنتز. این متغیرها بر میزان تورم رزین و ارتباط آن با اسیدهای آمینه، تعداد محل‌های اتصال تأثیر می‌گذارند که در نهایت بر سنتز پپتید به عنوان یک کل تأثیر می‌گذارد. ما فرآیند سنتز فاز جامد را با پپتیدهای مورد مطالعه خود، با در نظر گرفتن ویژگی‌های توالی اسید آمینه آنها تطبیق دادیم.

G.S. CHAILIAN مواد و روش ها. تمام معرف‌ها، حلال‌ها، رزین‌های استفاده شده از شرکت Advanced Chem Techcompany هستند. ما از گروه های fmoc برای محافظت از انتهای N اسیدهای آمینه در طول سنتز و دی متیل فرمامید (DMF) به عنوان یک حلال در طول سنتز استفاده کردیم. ما از رزین 2-کلروتریتیل حساس به اسید به عنوان پشتیبان استفاده کردیم. حفاظت از گروه‌های fmoc با استفاده از محلول پیپریدین در DMF انجام شد.

در فرآیند سنتز، قرار دادن اولین اسید آمینه روی رزین بسیار مهم است. دو گرم رزین 2Cl-Trt در یک سرنگ 10 میلی لیتری ریخته شد. DMF به داخل یک سرنگ کشیده شد و رزین به مدت 15 دقیقه متورم شد. سپس DMF شسته شد. سپس محلولی از اولین اسید آمینه (fmoc-Pro) و یک فعال کننده واکنش (DIPEA) به نسبت 1RESIN/1.2FMOC-PRO/4DIPEA به داخل سرنگ کشیده شد. واکنش برای افزودن اولین اسید آمینه 3 ساعت طول کشید.یک شرط بسیار مهم برای سنتز عدم وجود پیوندهای آزاد پس از افزودن اولین اسید آمینه است، بنابراین رزین پس از اتصال با اولین اسید آمینه، با مخلوطی درمان شد. متیلن، DIPEA (diisoproylethylamine) و DMF در نسبت 80DMF/15MEOH/5DIPEA برای مسدود کردن احتمالاً انتهای آزاد باقی مانده. پس از این، رزین DMF 5 بار به مدت 5 دقیقه شسته شد. سپس اسیدهای آمینه با محلول 30 درصد پیپدین در DMF 8 بار به مدت 5 دقیقه مسدود شدند. پس از این، رزین 5 بار با DMF به مدت 5 دقیقه شستشو شد. این چرخه در طول سنتز پپتید تکرار شد. پس از هر مرحله از افزودن اسید آمینه و رفع انسداد، پیشرفت واکنش با آزمایش کایزر، که واکنش نین هیدرین با یک گروه آمینه آزاد برای تشکیل یک رنگ آبی تیره مشخص است، بررسی شد. به لطف این آزمایش، نظارت گام به گام واکنش‌های اتصال و انسداد اسید آمینه امکان‌پذیر شد.

خالص سازی و کنترل پپتید شماره 7 سنتز شده بر روی یک سیستم HPLC آماده سازی 2 جزئی از واترز (ایالات متحده آمریکا) انجام شد. برای تزریق نمونه از یک انژکتور Rheodyne با حجم حلقه 500 میکرولیتر استفاده شد. تشخیص در محدوده 190-360 نانومتر انجام شد. ما از یک ستون Symmetry Si-100 C18 (4.6x250 میلی متر) برای HPLC فاز معکوس استفاده کردیم. سرعت جریان 50 میلی لیتر در دقیقه بود. یک سیستم شوینده گرادیان H2O/ACN/TFA (98/2/0.1)/(0.100.0.1) استفاده شد. زمان آنالیز 15 دقیقه کروماتوگرافی مجدد بر روی یک سیستم تحلیلی Knauer HPLC انجام شد. یک ستون XbridgeC18 (2.6x150 میلی متر) استفاده شد. تشخیص در 214 نانومتر انجام شد.

برای تایید داده‌های به‌دست‌آمده، داروی سنتز شده تحت آنالیز طیفی جرمی در CSU "Analitycal Spectrometry" قرار گرفت.

نتایج و بحث. داده های به دست آمده از کروماتوگرام نشان می دهد که خلوص پپتید شماره 7 سنتز شده پس از خالص سازی بیش از 99.6 درصد است (شکل 1).

–  –  –

ما یک تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی مقایسه ای از پپتید بومی شماره 7 را بر روی ستون X-bridgeC18 تحت شرایط مشابه با آنالوگ سنتز شده آن انجام دادیم. نتایج مقایسه ارائه شده است (شکل 2).

سنتز فاز جامد پپتید قلبی فعال جدا شده از دهلیز خوک

–  –  –

برنج. 4. طیف سنجی داروهای سنتز شده (A) و بومی (B).

G.S. CHAILIAN همانطور که از مقایسه کروماتوگرام ها مشاهده می شود، آنالوگ سنتز شده و پپتید بومی شماره 7 از نظر جرم و زمان انتشار یکسان هستند که نشان دهنده هویت ساختار و توالی اسید آمینه آنها است. بنابراین، با استفاده از روش سنتز پپتید فاز جامد و با در نظر گرفتن ویژگی‌های ساختاری پپتید مورد مطالعه، توانستیم پپتیدی همگن و یکسان با پپتید بومی متشکل از 9 اسید آمینه بدست آوریم. در آینده، با داشتن مقدار کافی از دارو، قصد داریم مجموعه‌ای از آزمایش‌های زیستی را انجام دهیم تا نه تنها راه‌هایی را که این پپتید فعالیت قلبی را تنظیم می‌کند، بلکه مکانیسم‌های اثر بر سایر اندام‌ها و سیستم‌ها را نیز شناسایی کنیم.

ادبیات

Popova T.V.، Srapionyan R.M.، Galoyan A.A. تشخیص و شناسایی 1 جدید در قلب گاو نر.

پروتئین های قلبی فعال سوال عسل. شیمی، 37، 2، ص. 56-58، 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. جداسازی و شخصیت پردازی 2.

قطعه تریپتیک قلبی فعال پروتئین حامل نوروهورمون "C". نوروشیمی، 2، 3، ص. 263-271، 1983.

سراپیونیان، ر.م. مصریان، س.س. جداسازی ترکیبات فعال کرونری با وزن مولکولی کم 3.

عضله قلب با استفاده از ترکیبی از فیلتراسیون ژل و روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید. زیست شناس. مجله ارمنستان، 27، 10، 102-104، 1974.

4. سراپیونیان، ر.م. پوپووا، تی.وی. گالویان، ع.الف. توزیع کمپلکس های پروتئین قلبی فعال در قلب حیوانات مختلف. زیست شناس. مجله ارمنستان، 40، 7، 588-590، 1987.

5. Galoyan A. تنظیم ترشح عصبی و هورمونهای سیستم هیپوتالامو-نوروهیپوفیزال، اتحاد جماهیر شوروی، 1963.

6. گالویان ع.ع. بیوشیمی هورمون‌های جدید قلبی و تعدیل‌کننده‌های ایمنی سیستم عملکردی هیپوتالاموس ترشحی عصبی، قلب غدد درون‌ریز. انتشارات علمی پ. 240، 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, ویرایش 3, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. گالویان ع.ا.، سراپیونیان ر.م. خالص سازی پروتئین های عروق کرونر جدا شده از هیپوتالاموس. دوکل. آکاد. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213، 1966.

10. مارس جی.، اسمیت ام. مارچ شیمی آلی پیشرفته. منتشر شده توسط John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133، 2007.

–  –  –

کارهای مشابه:

"Communities Publishing House "Science" Moscow 1979 UDC 581.55:56.017 Plotnikov V.V. تکامل ساختار جوامع گیاهی. م.: علم، ص. 1979، 276 در مورد فلز مدرن...”

«اخبار صندوق موزه به نام. A.A. Brauner شماره 2 جلد اول 2004 اخبار صندوق موزه به نام. "

این اختراع به یک روش فاز جامد برای سنتز پپتید با فرمول H-D--Nal--Thr-NH 2 مربوط می شود که از اسیدهای آمینه محافظت شده با Boc و Fmoc محافظت شده و یک رزین پلی استایرن کلرومتیله استفاده می کند. 10 حقوق پرواز.

حوزه فناوری که اختراع به آن مربوط می شود

اختراع حاضر به روشی برای تهیه یک پپتید حاوی سه یا بیشتر باقی مانده اسید آمینه، دارای یک اسید آمینه N ترمینال، یک اسید آمینه ماقبل آخر در مجاورت اسید آمینه N ترمینال و یک اسید آمینه ترمینال C مربوط می شود.

هنر قبلی

سنتز پپتید فاز جامد در سال 1963 برای غلبه بر بسیاری از مشکلات مراحل تصفیه میانی مرتبط با سنتز پپتید در محلول معرفی شد (Stewart و همکاران. سنتز پپتید فاز جامد. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). در سنتز فاز جامد، اسیدهای آمینه به یک پپتید با هر دنباله دلخواه مونتاژ می شوند (مثلاً به هم متصل می شوند) در حالی که یک انتهای زنجیره (مثلاً C-پایانه) به یک تکیه گاه نامحلول متصل است. هنگامی که توالی مورد نظر روی تکیه گاه جمع شد، پپتید از ساپورت آزاد می شود (یعنی جدا می شود). دو گروه محافظ استاندارد برای گروه های آلفا آمینو اسیدهای آمینه متصل شده، Boc هستند که با اسید قوی حذف می شود و Fmoc که با یک باز حذف می شود. اختراع حاضر به روشی مناسب برای تولید پپتیدها با استفاده از ترکیبی از هر دوی این محافظ‌های α-آمینه در یک سنتز منفرد بر روی یک رزین پلی استایرن کلرومتیله شده ارزان قیمت مربوط می‌شود.

هنگام توسعه سنتز پپتید فاز جامد با استفاده از هر یک از طرح‌های حفاظتی گروه آلفا-آمینه فوق، مهم است که هر «گروه‌های جانبی» واکنش‌پذیر اسیدهای آمینه پپتید از واکنش‌های شیمیایی ناخواسته در طول مونتاژ زنجیره محافظت شوند. همچنین مطلوب است که گروه های شیمیایی انتخاب شده برای محافظت از گروه های جانبی مختلف توسط معرف های مورد استفاده برای محافظت از گروه های α-آمینه حذف نشوند. سوم، مهم است که ارتباط زنجیره پپتیدی در حال رشد با ذره رزین در برابر معرف های مورد استفاده در فرآیند مونتاژ زنجیره برای حذف هر نوع محافظت از گروه آمینه مقاوم باشد. در مورد طرح حفاظت از گروه α-آمینو با استفاده از Fmoc، حفاظت گروه جانبی باید در برابر معرف های قلیایی مورد استفاده برای حذف Fmoc مقاوم باشد. در عمل، این گروه های محافظ زنجیره جانبی معمولاً پس از اتمام مونتاژ زنجیره پپتیدی با معرف های اسیدی ضعیف حذف می شوند. اگر از طرح حفاظتی α-آمینو با استفاده از Boc استفاده شود، حفاظت گروه جانبی باید در برابر معرف ضعیف اسیدی مورد استفاده برای حذف گروه Boc در هر چرخه مقاوم باشد. در عمل، این گروه‌های محافظ زنجیره جانبی در طرح حفاظتی α-آمینو با Boc معمولاً پس از تکمیل مونتاژ زنجیره پپتیدی با HF بی آب حذف می‌شوند. بنابراین، در عمل، گروه‌هایی که معمولاً برای محافظت از زنجیره‌های جانبی در طرح محافظت از گروه آمینو با Fmoc استفاده می‌شوند، در شرایطی که برای محافظت از گروه‌های آمینو با Boc استفاده می‌شوند، ناپایدار هستند. بنابراین، دو نوع طرح برای محافظت از گروه‌های آمینه α در طول مونتاژ زنجیره پپتیدی در سنتز پپتید فاز جامد با هم ترکیب نمی‌شوند. علاوه بر این، اگرچه ارزان ترین رزین پلیمری مورد استفاده در سنتز پپتید (پلی استایرن کلرومتیله یا "رزین مریفیلد") به طور گسترده همراه با اسیدهای آمینه محافظت شده توسط گروه های Boc مورد استفاده قرار می گیرد، ادبیات نتیجه می گیرد که در مورد محافظت از α-آمینه قابل استفاده نیست. گروه های گروه های Fmoc به دلیل ناپایداری آن در شرایط قلیایی (نگاه کنید به استوارت و همکاران. سنتز پپتید فاز جامد. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). اختراع حاضر به روشی برای ترکیب اسیدهای آمینه محافظت شده با Boc و Fmoc در رزین مریفیلد در طی سنتز فاز جامد پپتیدهای خاص است.

Lanreotide®، که یک آنالوگ سوماتوستاتین است، به مهار ترشح هورمون رشد و همچنین مهار ترشح انسولین، گلوکاگون و برون ریز پانکراس معروف است.

ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 4853371 نشان می دهد و ادعا می کند که Lanreotide®، روشی برای تهیه آن، و روشی برای مهار ترشح هورمون رشد، انسولین، گلوکاگون و ترشح برون ریز پانکراس است.

ثبت اختراع ایالات متحده شماره 5،147،856 استفاده از Lanreotide® را برای درمان تنگی مجدد آشکار می کند.

ثبت اختراع ایالات متحده شماره 5،411،943 استفاده از Lanreotide® را برای درمان هپاتوم فاش می کند.

ثبت اختراع ایالات متحده شماره 5,073,541 استفاده از Lanreotide® را برای درمان سرطان ریه افشا می کند.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/089410، ثبت شده در 9 ژوئیه 1993، استفاده از Lanreotide® را برای درمان ملانوما افشا می کند.

ثبت اختراع ایالات متحده شماره 5,504,069 استفاده از Lanreotide® را برای مهار رشد سریع تومور جامد افشا می کند.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/854941، ثبت شده در 13 مه 1997، استفاده از Lanreotide® را برای کاهش وزن نشان می دهد.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/854943، ثبت شده در 13 مه 1997، استفاده از Lanreotide® را برای درمان مقاومت به انسولین و سندرم X افشا می کند.

ثبت اختراع ایالات متحده شماره 5،688،418 استفاده از Lanreotide® را برای افزایش طول عمر سلول های پانکراس افشا می کند.

شماره برنامه PCT PCT/US 97/14154 استفاده از Lanreotide® را برای درمان فیبروز آشکار می کند.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/855311، ثبت شده در 13 مه 1997، استفاده از Lanreotide® را برای درمان هیپرلیپیدمی افشا می کند.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/440061، ثبت شده در 12 می 1995، استفاده از Lanreotide® را برای درمان هیپرآمیلینمی فاش می کند.

درخواست ثبت اختراع ایالات متحده به شماره 08/852221، ثبت شده در 7 مه 1997، استفاده از Lanreotide® را برای درمان هیپرپرولاکتینمی و پرولاکتینوما فاش می کند.

ماهیت اختراع

اختراع حاضر روشی را برای تهیه یک پپتید حاوی سه یا بیشتر باقی مانده اسید آمینه، دارای یک اسید آمینه N ترمینال، یک اسید آمینه ماقبل آخر در مجاورت اسید آمینه N ترمینال، و یک اسید آمینه ترمینال C ارائه می دهد، این روش شامل مراحل زیر:

(الف) اتصال اولین اسید آمینه به رزین پشتیبان جامد توسط یک پیوند استری برای تشکیل اولین محصول افزودنی، که شامل (i) واکنش محلول آبی کربنات سزیم با محلول الکلی اولین اسید آمینه برای تشکیل نمک سزیم است. از اولین اسید آمینه، (ب) به دست آوردن یک نمک سزیم بدون حلال از اولین اسید آمینه، (iii) واکنش پشتیبانی رزین جامد با نمک سزیم اولین اسید آمینه در یک حلال آپروتیک قطبی خشک (بی آب) اولین محصول اضافه را تشکیل دهید،

در جایی که اولین اسید آمینه مربوط به اسید آمینه C ترمینال پپتید است، گروه آمینه زنجیره غیر جانبی (اصلی) اولین اسید آمینه توسط Boc مسدود می شود و اولین اسید آمینه عملکردی ندارد. گروه در زنجیره جانبی که برای آن محافظت لازم است، و رزین حامل جامد یک رزین پلی استایرن کلرومتیله است.

(ب) محافظت (از انسداد) Boc از اولین محصول افزودنی با یک اسید برای تشکیل اولین محصول افزوده بدون محافظت.

(ج) به صورت اختیاری، افزودن یک اسید آمینه بیشتر به اولین محصول افزودنی آزاد شده، که شامل واکنش اسید آمینه بعدی با اولین محصول افزودنی آزاد شده در یک حلال آلی حاوی یک معرف گسترش پپتیدی برای تولید یک محصول افزودنی مسدود شده (محافظت شده) است. که در آن اسید آمینه بعدی در زنجیره اصلی، یک گروه آمینه مسدود شده توسط Boc دارد، و اگر اسید آمینه زیر دارای یک یا چند گروه عاملی زنجیره جانبی باشد، گروه های عاملی زنجیره جانبی نیازی به حفاظت ندارند، یا گروه های عاملی زنجیره جانبی. دارای گروه های محافظ مقاوم در برابر معرف های اسیدی یا قلیایی مورد استفاده برای حذف محافظ به ترتیب Boc و Fmoc.

(د) محافظت از Boc از محصول افزودنی بعدی مسدود شده، که شامل واکنش محصول افزودنی بعدی مسدود شده با اسید برای به دست آوردن محصول اضافه بعدی مسدود شده است.

(ه) به صورت اختیاری، تکرار مراحل (c) و (d)، و در هر چرخه حاصلضرب آزاد شده (X+1)-امین جمع بعدی تشکیل می‌شود، که در آن X تعداد تکرار مورد نیاز چرخه است.

(ه) افزودن یک اسید آمینه بیشتر به اولین محصول افزودنی آزاد شده مرحله (ب) یا، به صورت اختیاری، به محصول اضافه بعدی آزاد شده (X+1) از مرحله (e)، که شامل واکنش اسید آمینه بعدی با ذکر شده است. اولین محصول افزوده شده یا با نام بلوک نشده (X+1) - محصول افزودن بعدی در یک حلال آلی حاوی معرف برای گسترش پپتید برای تولید محصول افزودنی مسدود شده (محافظت شده) بعدی، که در آن اسید آمینه بعدی دارای یک ستون فقرات Fmoc مسدود شده است. گروه آمینه، مشروط بر اینکه اگر اسید آمینه بعدی دارای یک یا چند گروه عاملی در زنجیره جانبی باشد، گروه های عاملی در زنجیره جانبی نیازی به حفاظت ندارند یا گروه های عاملی در زنجیره جانبی دارای گروه های محافظ مقاوم در برابر هستند. معرف های قلیایی مورد استفاده برای محافظت از Fmoc.

(ز) محافظت از Fmoc از محصول افزودنی بعدی مسدود شده، که شامل واکنش محصول افزودنی بعدی مسدود شده با یک آمین اولیه یا ثانویه برای به دست آوردن محصول افزودنی بعدی مسدود شده است.

(h) به صورت اختیاری، مراحل (e) و (g) را تکرار کنید، و در هر چرخه حاصلضرب مسدود شده (X+1)-امین جمع بعدی تشکیل می شود، که در آن X تعداد تکرار مورد نیاز چرخه است، تا زمانی که ماقبل آخر در پپتید و اسید آمینه مسدود شده گنجانده شده است.

(i) افزودن یک اسید آمینه N ترمینال به محصول مسدود شده (X+1)-امین افزودن بعدی، که شامل واکنش اسید آمینه N ترمینال با محصول مسدود شده (X+1)-امین افزودن بعدی است. در یک حلال آلی حاوی یک معرف گسترش پپتیدی، تولید یک محصول تکمیل مسدود شده که در آن اسید آمینه N ترمینال دارای یک گروه آمینو ستون فقرات است که توسط Boc یا Fmoc مسدود شده است.

(j) محافظت از ادکتور درپوش دار با اسید در مورد Boc یا یک باز در مورد Fmoc برای تشکیل یک محصول پپتیدی کامل روی رزین.

(j) اگر محصول رزین پپتیدی تکمیل‌شده حاوی گروه‌های عاملی زنجیره جانبی باشد، به‌صورت اختیاری، از گروه‌های عاملی زنجیره جانبی محصول رزین پپتیدی تکمیل‌شده، که شامل واکنش محصول رزین پپتیدی تکمیل‌شده با معرف‌های ضدحفاظ‌کننده مناسب برای به دست آوردن رزین پپتیدی کامل می‌شود، محافظت می‌شود. محصول پپتید روی رزین محافظت نشده. و

(ک) جدا کردن پپتید از تکیه گاه رزین جامد در محصول پپتید رزین کامل یا محصول پپتید کامل رزین بدون محافظت برای تولید یک پپتید، که شامل واکنش محصول پپتیدی کامل رزین یا محصول پپتید کامل رزین بدون محافظت با آمونیاک، یک آمین اولیه یا یک آمین ثانویه تا زمانی که جداسازی پپتید از رزین بطور قابل ملاحظه ای کامل شود.

مشروط بر اینکه مراحل (ه) و (g) در سنتز پپتید باید حداقل یک بار انجام شود.

ترجیحاً روشی مطابق با اختراع حاضر است که در آن آمونیاک، آمین اولیه یا آمین ثانویه در مرحله (l) در حلالی حاوی الکل و در صورت تمایل، یک حلال قطبی آپروتیک است.

ترجیحاً روش مطابق با اختراع حاضر است که در آن مرحله (k) بیشتر شامل مراحل زیر است:

رسوب پپتید جدا شده از حلال.

جداسازی پشتیبان رزین جامد و پپتید رسوب شده با فیلتراسیون؛ و

استخراج پپتید با محلول اسیدی برای جداسازی پپتید.

ترجیحاً روش مطابق با اختراع حاضر است که در آن اولین اسید آمینه Boc-L-Thr است.

ترجیحاً روش اختراع حاضر است که در آن اولین اسید آمینه نمک سزیم Boc-L-Thr است که یک رزین Boc-L-Thr را به عنوان اولین محصول افزودنی تولید می کند و اولین محصول افزودنی محافظت نشده یک رزین H-L-Thr است. .

ترجیحاً روشی مطابق اختراع حاضر است که در آن اسید مورد استفاده برای حذف گروه محافظ Boc در مرحله (i) اسید تری فلورواستیک (TFA) است.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که در آن حلال آلی متیلن کلرید، کلروفرم یا دی متیل فرمامید و معرف گسترش پپتیدی دی ایزوپروپیل کربودی ایمید، دی سیکلوهگزیل کربودی ایمید یا N-ethyl-N"-(3-dimethyl-aminopropyl) است. ) کربودییمید.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که شامل انجام مراحل (e) و (g) شش بار پس از تشکیل اولین محصول افزودن انسداد شده با فرمول H-L-Thr-رزین است که در آن اسیدهای آمینه بعدی به ترتیب اضافه شد: Fmoc-L-Cys(Acm)، Fmoc-L-Val، Fmoc-L-Lys(Boc)، Fmoc-D-Trp، Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) و Fmoc-L- Cys(Acm) برای تشکیل محصول H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین.

یک روش ترجیحی مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که شامل افزودن Boc-D--Nal به H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys( رزین Acm) -Tnr مطابق مرحله (ج) برای بدست آوردن رزین Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Act)-Thr.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، شامل حذف همزمان گروه Boc محافظ D-Nal، گروه O-t-Bu محافظ Tyr، و گروه Boc محافظت کننده Lys در Boc-D-Nal-Cys (Acm) است. رزین Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr مطابق مرحله (i)، برای به دست آوردن یک محصول پپتیدی کامل روی رزین با فرمول H-D- -Nal -Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، شامل حذف پپتید H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr از رزین جامد با انجام H-D- است. واکنش Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین ها با آمونیاک در یک حلال حاوی الکل و به صورت اختیاری، یک حلال قطبی آپروتیک، تا حذف تقریباً کامل برای به دست آوردن H-D- -Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که در آن الکل متانول و حلال آپروتیک قطبی دی متیل فرمامید است.

روش ترجیحی روش بلافاصله قبل شامل حذف همزمان گروه‌های Acm محافظ Cys و چرخه‌سازی باقیمانده‌های Cys محافظت‌زدایی شده به محصول پپتیدی حاصل از فرمول H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp- است. Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH2 با واکنش H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 با محلول ید در الکل تا زمانی که تقریباً محافظت کامل و چرخه شدن کامل شود تا H-D--Nal--Thr-NH 2 به دست آید.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که در آن پپتید H-D--Nal--Thr-NH2 است.

یک روش ترجیحی، مربوط به روش بلافاصله قبل، روشی است که در آن پپتید یک آنالوگ سوماتوستاتین است.

اصطلاحات به کار رفته در توضیحات این اختراع به شرح زیر است:

"اولین اسید آمینه": هر اسید آمینه ای را پوشش می دهد که در آن گروه آمینه در زنجیره اصلی (نه در زنجیره جانبی) توسط Boc محافظت می شود که به صورت تجاری در دسترس است یا می تواند بر اساس روش های شناخته شده برای افراد دارای مهارت معمولی سنتز شود. هنر، به عنوان مثال Boc-L-Thr.

"فرست افزودن محصول": محصولی را توصیف می کند که به یک تکیه گاه رزین جامد متصل می شود که از افزودن اولین اسید آمینه به تکیه گاه رزین جامد حاصل می شود، برای مثال رزین Boc-L-Thr.

"محصول اول افزودنی محافظت نشده": محصولی را توصیف می کند که در نتیجه حذف یا حذف یک گروه Boc از اولین محصول افزودنی ایجاد می شود - به عنوان مثال، یک رزین H-L-Thr، که در آن "H" نشان دهنده آمینو هیدروژن ستون فقرات موجود است که از مرحله محافظت زدایی حاصل می شود. ;

"اسید آمینه بعدی": هر اسید آمینه ای را توصیف می کند که در آن گروه آمینه در زنجیره اصلی توسط Boc یا Fmoc محافظت می شود که به صورت تجاری در دسترس است یا می تواند بر اساس روش های شناخته شده برای افراد دارای مهارت معمولی سنتز شود. از آنجایی که مرحله (ج) و مرحله (ه) ممکن است بخشی از یک چرخه تکرار شونده است که در آن مرحله بیش از یک بار انجام می شود، هر مرحله زمانی (ج) یا مرحله (ه) انجام می شود، "اسید آمینه بعدی" ممکن است به طور مستقل انتخاب شود. از گروه آمینو اسیدهای سنتز شده شناخته شده یا ممکن که در آن گروه آمینه در زنجیره اصلی توسط Boc یا Fmoc محافظت می شود.

"(X+1)-امین محصول مسدود شده افزودن بعدی": محصول متصل به رزین پشتیبان جامد را توصیف می کند که از ترکیب اسید آمینه بعدی با "محصول افزوده بعدی رفع انسداد" حاصل می شود. از آنجایی که مراحل (c) و (d) و مراحل (e) و (g) ممکن است بخشی از یک چرخه تکرار شونده باشد که در آن اسیدهای آمینه بیشتری ممکن است اضافه شود، اصطلاح "محصول مسدود شده (X+1)امین افزودن بعدی" اشاره دارد. به محصول به دست آمده در نتیجه هر یک از چرخه های الحاق قبلی؛

«محصول مسدودشده (X+1)امین افزودن بعدی»: محصول حاصل از حذف گروه Fmoc از «محصول مسدودشده (X+1)امین اضافه بعدی» را توصیف می‌کند.

"محصول پپتیدی تکمیل شده روی رزین": محصول پپتیدی را توصیف می کند که پس از اینکه آمینو اسید انتهایی N به زنجیره پپتیدی متصل شد و پس از اینکه گروه آمینه اصلی اسید آمینه N ترمینال از بین رفت یا محافظت نشد، به یک تکیه گاه رزین جامد متصل می شود. ، اما هنوز هیچ گروه محافظی روی گروه های عاملی زنجیره های جانبی دارد که با واکنشی که گروه محافظ را از زنجیره اصلی اسید آمینه N ترمینال حذف می کند، حذف نشده است. و

"محصول پپتیدی تکمیل شده روی رزین بدون محافظت": یک محصول پپتیدی متصل به یک تکیه گاه رزین جامد را توصیف می کند که در آن تمام گروه های عاملی زنجیره جانبی اسید آمینه حذف یا از بین رفته اند.

نمونه هایی از اسیدهایی که می توانند برای محافظت از Boc استفاده شوند عبارتند از تری فلورواستیک اسید (TFA)، اسید متان سولفونیک و محلول های آلی حاوی HCl.

نمونه هایی از آمین های اولیه و ثانویه که می توانند برای محافظت از Fmoc استفاده شوند عبارتند از 4-(آمینو متیل)پیپریدین، پیپریدین، دی اتیل آمین، DBU و تریس(2-آمینواتیل) آمین.

نمونه هایی از بازهای غیر هسته دوست که می توانند برای خنثی کردن نمک های TFA گروه های آمینه آزاد شده استفاده شوند (RNH 3 + CF 3 COO -، این نمک ها باید قبل یا در طول افزودن آمینو بعدی به آمین های "آزاد" (NH 2) تبدیل شوند. اسید، در غیر این صورت افزودن انجام نخواهد شد) دی ایزوپروپیل اتیلامین (DIEA) و تری اتیلامین (TEA) هستند.

نمونه هایی از حلال های آلی که می توانند در واکنش های افزودن اسید آمینه استفاده شوند عبارتند از متیلن کلرید، کلروفرم، دی کلرواتان، دی متیل فرمامید، دی اتیل استامید، تتراهیدروفوران، اتیل استات، 1-متیل-2-پیرولیدون، استونیتریل، یا ترکیبی از این حلال ها.

نمونه هایی از عوامل گسترش پپتیدی شامل کربودی ایمیدهای جایگزین شده مانند: دی ایزوپروپیل-کاربودی ایمید، دی سیکلوهگزیل-کاربودی ایمید، یا N-اتیل-N"-(3-دی متیل-آمینوپروپیل)کاربودی ایمید است.

گروه‌های کربوکسیل و گروه‌های آمینه که در تشکیل پیوند آمیدی پپتیدی شرکت می‌کنند، به ترتیب گروه کربوکسیل یا گروه آمینه «زنجیره غیر جانبی» نامیده می‌شوند. از سوی دیگر، هر گروه عاملی اسید آمینه ای که در تشکیل پیوند آمیدی پپتیدی شرکت نمی کند، گروه های عاملی «زنجیره جانبی» نامیده می شود.

اصطلاح "گروه پایدار پایه" به گروه های محافظی اطلاق می شود که برای محافظت از گروه های عاملی اسیدهای آمینه استفاده می شود که (1) پایدار پایه هستند، برای مثال نمی توان آنها را با بازهایی مانند 4-(آمینو اتیل)پیپریدین، پیپریدین یا تریس(2) حذف کرد. -aminoethyl)amine، که بازهایی هستند که معمولاً برای حذف گروه محافظ Fmoc استفاده می شوند و (2) را می توان با اسیدی مانند تری فلورواستیک اسید یا روش دیگری مانند هیدروژناسیون کاتالیزوری حذف کرد.

نمادهای "Fmoc" و "Boc" در اینجا و در فرمول همراه به ترتیب برای تعیین 9-fluorenyl-methoxycarbonyl و tert-butyloxycarbonyl استفاده می شوند.

روش شرح داده شده در بالا را می توان برای تهیه پپتیدها، ترجیحاً آنالوگ های سوماتواستاتین، مانند Lanreotide® octapeptide، که دارای فرمول زیر است، استفاده کرد: H-D--Nal--Thr-NH2. اگر قرار است H-D--Nal--Thr-NH 2 سنتز شود، گروه‌های محافظ پایدار پایه که برای محافظت از گروه‌های عاملی زنجیره جانبی Cys، Lys و Tyr استفاده می‌شوند می‌توانند به ترتیب استامیدومتیل (Acm)، Boc و ترت‌بوتیل باشند. Acm برای Cys ترجیح داده می شود.

منظور از آنالوگ سوماتوستاتین، پپتیدی است که فعالیت بیولوژیکی مشابه (یعنی آگونیست) یا مخالف (یعنی آنتاگونیست) با سوماتوستاتین از خود نشان می دهد.

در فرمول H-D- -Nal--Thr-NH 2، هر یک از نمادهای اسید آمینه سه حرفی رایج (مثلا Lys) به باقیمانده ساختاری اسید آمینه اشاره دارد. به عنوان مثال، نماد Lys در فرمول بالا نشان دهنده -NH-CH((CH 2) 4 NH 2) -CO- است. نماد D- -Nal- نشان دهنده باقی مانده اسید آمینه D-2-naphthylalanilyl است. براکت ها یک پیوند دی سولفیدی را نشان می دهد که تیول های آزاد دو باقی مانده Cys را در پپتید به هم متصل می کند، که نشان می دهد اسیدهای آمینه پپتید درون براکت ها یک چرخه را تشکیل می دهند.

بر اساس توضیحات ارائه شده در اینجا، افراد ماهر در این هنر قادر خواهند بود از اختراع حاضر به طور کامل استفاده کنند.

همه اصطلاحات فنی و علمی به کار رفته در اینجا به جز در مواردی که به شکل دیگری تعریف شده باشد، همان معنایی را دارند که معمولاً توسط افراد دارای مهارت معمولی در هنر مربوط به اختراع حاضر درک می شود. علاوه بر این، تمام انتشارات، درخواست های ثبت اختراع، پتنت ها و سایر مراجع ذکر شده در اینجا با مرجع در اینجا گنجانده شده اند.

پپتید را می توان مطابق با روش اختراع حاضر طبق روش زیر تهیه کرد.

محلولی از 0.5 معادل مولی کربنات سزیم در آب به آرامی به محلول 1 معادل مولی Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) اضافه می شود، که در آن AA 1 مربوط به اسید آمینه C ترمینال محلول در الکل است. ترجیحا متانول مخلوط حاصل حدود 1 ساعت در دمای اتاق هم زده می شود، سپس تمام الکل و تمام آب تحت فشار کاهش یافته خارج می شود تا پودر خشک نمک سزیم Boc-AA 1 به دست آید. رزین مریفیلد، 1.0 معادل (پلی استایرن کلرومتیله، مش 200-400، گنجاندن یون کلر 1.3 meq/g، Advanced ChemTech، Louisville، Kentucky or Polymer Laboratories، Church Stretton، انگلستان) با یک محلول کلردار، ترجیحاً محلول دی کلردار C شسته می شود. یک الکل، ترجیحا متانول، و یک حلال آپروتیک قطبی، ترجیحا دی متیل فرمامید (DMF). پودر نمک سزیم Boc-AA 1 در یک حلال آپروتیک قطبی بی آب (خشک)، ترجیحا DMF حل می شود و محلول با رزین از قبل شسته شده ترکیب می شود. دوغاب به آرامی در دمای تقریباً 45-65 درجه سانتیگراد، ترجیحاً در دمای 50-60 درجه سانتیگراد، به مدت تقریباً 48 تا 106 ساعت، ترجیحاً 85 تا 90 ساعت، تحت یک اتمسفر بی اثر مانند نیتروژن به هم زده می شود. رزین با فیلتراسیون جدا شده و با یک حلال قطبی آپروتیک، ترجیحا DMF، آب و در نهایت با الکلی مانند MeOH شسته می شود. رزین Boc-AA 1 تحت فشار کاهش یافته خشک می شود.

رزین Vos-AA 1 به یک راکتور شیشه ای با یک فیلتر از شیشه ذوب شده متخلخل بزرگ وارد می شود. رزین با یک حلال کلردار مانند DCM شسته می شود، با یک اسید آلی، ترجیحا 25% TFA در DCM مسدود می شود، به طور خلاصه با یک محلول کلردار مانند DCM و الکلی مانند MeOH شسته می شود، با یک پایه آلی، ترجیحا تری اتیل آمین خنثی می شود. DCM، و دوباره با DCM و یک حلال قطبی آپروتیک مانند DMF شسته شد و یک رزین AA 1 محافظت نشده تولید کرد.

سپس هر تعداد آمینو اسید دلخواه به صورت اختیاری به رزین AA 1 محافظت نشده اضافه می شود. اگر اسید آمینه بعدی دارای یک گروه آمینه با محافظت Fmoc (Fmoc-AA x) باشد، گروه زنجیره جانبی یا نیازی به محافظت ندارد (به عنوان مثال Fmoc-Gly، Fmoc-Ala، Fmoc-Phe یا Fmoc-Thr). یا زنجیره جانبی با یک گروه مقاوم در برابر پایه محافظت می کند. مقدار اضافی مولی Fmoc-AA x (که در آن x عدد موقعیت اسید آمینه در پپتید است، که از انتهای C اندازه‌گیری می‌شود) در طی تقریباً 60 دقیقه با رزین AA 1 محافظت نشده با استفاده از یک معرف گسترش پپتید مانند دی ایزوپروپیل کاربودی‌یمید (DIC) جفت می‌شود. ، در مخلوط DCM/DMF. رزین افزودنی با DMF، الکل و DCM شسته می شود تا رزین Fmoc-AA x -AA 1 به دست آید. چسبندگی را می توان با استفاده از روش نین هیدرین کایزر آزمایش کرد. رزین Fmoc-AA x -AA 1 سپس یک بار با DMF شسته می شود و سپس با محلول پایه در یک حلال آلی مانند پیپریدین در DMF مسدود می شود تا یک رزین AA x -AA 1 به دست آید. رزین AA x -AA 1 سپس با DMF شسته می شود و سپس چندین شستشو با هر دو الکل مانند MeOH و DCM انجام می شود. سپس رزین AA x -AA 1 یک بار با DMF به مدت حدود 3 دقیقه، سه بار با ایزوپروپانول، ترجیحاً هر بار برای حدود 2 دقیقه و سه بار با DCM، ترجیحاً هر بار برای حدود 2 دقیقه شسته می شود. سپس رزین برای اتصال بیشتر یک اسید آمینه محافظت شده با Fmoc همانطور که در بالا توضیح داده شد یا یک اسید آمینه محافظت شده با Boc همانطور که در زیر توضیح داده شد آماده است.

به همین ترتیب، اگر هر اسید آمینه بعدی که باید به رزین AA 1 محافظت نشده متصل شود، برای داشتن یک گروه Boc-آمینه محافظت شده (Boc-AA x) انتخاب شود، در این صورت هیچ یک از گروه های زنجیره جانبی نیازی به محافظت ندارند (این می تواند Boc- باشد. Gly، Boc-Ala، Boc-Phe یا Boc-Thr)، یا زنجیره جانبی باید توسط گروهی محافظت شود که در برابر حذف توسط اسید و باز مقاوم باشد - این می تواند Boc-Cys (Acm) باشد. اگر Boc-AA x انتخاب شود، با استفاده از همان معرف‌ها و حلال‌هایی که در مورد اسیدهای آمینه Fmoc در بالا توضیح داده شد، اضافه می‌شود و کامل بودن (تکمیل) افزودن را می‌توان با روش نین هیدرین کایزر بررسی کرد. سپس رزین Boc-AA x -AA 1 با محلول اسید در یک حلال آلی مانند TFA در DCM محافظت می شود تا یک رزین CF 3 CO - H + -AA x -AA 1 تولید شود. این رزین سپس چندین بار با حلال های کلردار مانند DCM، الکلی مانند MeOH شسته می شود و با یک پایه غیر هسته دوست مانند تری اتیل آمین در DCM خنثی می شود، و سپس چندین بار شستشو با حلال کلردار مانند DCM انجام می شود که AA x را به دست می آورد. -AA 1 - رزین سپس رزین برای اتصال بیشتر اسید آمینه محافظت شده Boc یا Fmoc همانطور که در بالا توضیح داده شد آماده است.

بسته به دنباله پپتیدی مورد نظر و نوع اسید آمینه محافظت شده با α-آمینو مورد استفاده (چه با Fmoc محافظت شده یا با Boc محافظت شده)، بسته به اینکه کدام اسید آمینه باید اشغال شود، از ترکیب مناسبی از روش های جفت توصیف شده در بالا استفاده می شود. موقعیت زنجیره جانبی در توالی پپتیدی، دارای یک گروه محافظ است که می‌توان آن را با یک باز که برای حذف Fmoc از گروه -آمینو ضروری است، یا با یک اسید لازم برای حذف Boc از گروه -آمینو حذف کرد. چنین اسید آمینه محافظت شده ای ممکن است N- -Boc-N"- -Fmoc-lysine یا N- -Fmoc-N"- -Boc-lysine باشد. در این صورت، همه گروه‌های محافظ انتخاب شده برای گروه‌های آمینه α آمینو اسیدهای بعدی، تا آمینو اسید انتهایی N، باید با گروه جانبی محافظت‌کننده انتخاب‌شده برای آن موقعیت سازگار باشند. این بدان معناست که گروه‌های محافظ زنجیره جانبی باید در برابر عامل ضدحفاظتی که برای محافظت از گروه‌های آلفا آمینو اسیدهای آمینه بعدی استفاده می‌شود، مقاوم باشند. برای اسید آمینه N ترمینال، Boc یا Fmoc را می توان به عنوان محافظت از گروه آمینه استفاده کرد، زیرا محافظت از اسید آمینه N ترمینال می تواند به طور همزمان برخی از زنجیره های جانبی محافظت شده را بدون تأثیر نامطلوب بر استراتژی سنتز پپتید، از بین ببرد، زیرا هیچ اسیدهای آمینه باقی مانده اضافه می شوند.

زنجیره پپتیدی تکمیل شده که هنوز به رزین متصل است باید از حالت محافظت خارج شده و آزاد شود. برای حذف همه گروه‌های محافظ پایدار در پایه و گروه مسدودکننده اسید آمینه N ترمینال، در صورت امکان، پپتید روی رزین با یک اسید در یک حلال آلی مانند TFA در DCM تیمار می‌شود. برای حذف تمام گروه‌های محافظ پایدار در برابر اسید و گروه مسدودکننده اسید آمینه N ترمینال، در صورت امکان، پپتید روی رزین با یک پایه آلی مانند پیپریدین در DMF درمان می‌شود. از طرف دیگر، گروه های پایدار در برابر اسید را می توان تا زمانی که با برش بعدی پپتید با آمونیاک یا یک باز آمین حذف شوند، حفظ کرد. پپتید محافظت نشده روی رزین سپس با یک حلال کلردار مانند DCM، الکلی مانند MeOH شسته شده و تحت فشار کاهش یافته تا وزن ثابت خشک می شود.

پپتید از رزین جدا می شود و C-پایانه با تعلیق پپتید روی رزین در مخلوط 3:1 MeOH/DMF به آمید تبدیل می شود. سوسپانسیون تا دمای کمتر از 10 درجه سانتیگراد در اتمسفر نیتروژن خنک می شود و گاز آمونیاک بی آب در زیر سطح حلال وارد می شود تا زمانی که محلول با آن اشباع شود، در حالی که دما کمتر از حدود 10 درجه سانتیگراد حفظ می شود. دوغاب به مدت تقریباً 24 ساعت به آرامی هم زده می شود، در حالی که اجازه می دهد دما تا حدود 20 درجه سانتیگراد افزایش یابد. درجه تکمیل واکنش با ناپدید شدن واسطه متیل اتر بر روی HPLC تحت شرایط مناسب بسته به نوع پپتید بررسی می شود. مخلوط واکنش سرد می شود و مقدار مورد نیاز آمونیاک بی آب به آن اضافه می شود تا جایی که ناحیه پیک HPLC مربوط به متیل استر کمتر از 10 درصد سطح پیک محصول مورد نظر باشد. دوغاب تا دمای کمتر از 10 درجه سانتیگراد خنک می شود و به هم زدن در طول شب ادامه می یابد تا پپتید رسوب کند. رسوب و رزین با فیلتراسیون جدا شده و با MeOH سرد شسته می شوند. رسوب و رزین تحت فشار کاهش یافته خشک می شوند و محصول با محلول آبی اسید استیک از رزین استخراج می شود.

اگر پپتید حاوی بقایای Cys محافظت‌شده در توالی خود باشد، گروه‌های تیول را می‌توان حذف کرد و باقیمانده‌ها را می‌توان طبق روش زیر چرخه‌ای کرد. پپتید حاوی گروه های Cys محافظت شده با Acm در محلول آبی اسید استیک در اتمسفر نیتروژن حل می شود. محلول به سرعت مخلوط می شود و محلول ید در الکل در یک قسمت اضافه می شود. مخلوط به هم زده می شود و کامل بودن محافظت با استفاده از HPLC بررسی می شود. سپس واکنش با تیتراسیون با محلول تیوسولفات سدیم 2% تا زمانی که رنگ محلول از بین برود متوقف می شود. مخلوط خام با کروماتوگرافی آماده سازی بر روی یک کارتریج C8 با گرادیان استونیتریل در بافر استات آمونیوم 0.1 خالص شده، بر روی یک کارتریج C8 با گرادیان استونیتریل در اسید استیک 0.25 نیوتن نمک زدایی شده و برای به دست آوردن پپتید هدف لیوفیلیز می شود.

نمونه ای از اجرای اختراع

مثال زیر برای نشان دادن روش اختراع حاضر ارائه شده است و نباید به عنوان محدود کننده دامنه آن تلقی شود.

مثال 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2

الف) رزین Boc-L-Thr

محلولی از 2.58 گرم کربنات سزیم در 2.5 میلی لیتر آب به آرامی به محلول 3.48 گرم Boc-L-ترئونین (Bachem California، Torrance، Calif.) حل شده در 7 میلی لیتر متانول اضافه شد. مخلوط حاصل تقریباً به مدت 1 ساعت در دمای اتاق هم زده شد، سپس تمام متانول و تمام آب تحت فشار کاهش یافته حذف شدند تا پودر نمک سزیم Boc-L- ترئونین خشک به دست آید. 10 گرم از رزین مریفیلد (پلی استایرن کلرومتیله، مش 200-400، کلر 1.3 میلی اکی والان بر گرم، Advanced ChemTech، لوئیزویل، کنتاکی) با دی کلرومتان (DCM)، متانول (MeOH) و دی متیل فرمامید (DM20 بار) شسته شد. میلی لیتر). نمک سزیم پودر Boc-L-ترئونین در 60 میلی لیتر DMF خشک حل شد و محلول با رزین شسته شده به صورت فوق ترکیب شد. دوغاب به آرامی در دمای تقریبی 50-60 درجه سانتیگراد به مدت تقریبی 85 تا 90 ساعت در فضای نیتروژن به هم زده شد. رزین با فیلتراسیون جدا شد و با DMF، آب دیونیزه و در نهایت MeOH به طور کامل شسته شد. رزین Boc-threonine تحت فشار کاهش یافته در حدود 40 درجه سانتیگراد خشک شد. گنجاندن ترئونین 0.15 ± 0.85 میلی‌اکیوال‌والان بر گرم رزین خشک بود.

ب) H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین

2.0 گرم از رزین Boc-threonine از مرحله (A) به یک راکتور شیشه ای 50 میلی لیتری با کف فیلتر شیشه ای ذوب شده با منافذ بزرگ (بار 1.74 میلی مول) اضافه شد. رزین 2 بار با DCM (20 میلی لیتر) شسته شد، هر بار به مدت تقریباً 5 دقیقه، با 25٪ TFA در DCM (30 میلی لیتر) مسدود شد - بار اول تقریباً 2 دقیقه و بار دوم تقریباً 25 دقیقه، 3 شستشو شد. بار به مدت تقریبی 2 دقیقه با DCM (20 میلی لیتر)، ایزوپروپانول (20 میلی لیتر) و DCM (20 میلی لیتر)، دو بار به مدت حدود 5 دقیقه با 10 درصد تری اتیلامین در DCM (20 میلی لیتر) خنثی شد، 3 بار به مدت تقریباً 2 دقیقه با DCM شسته شد. و یک بار DMF (20 میلی لیتر) به مدت تقریباً 5 دقیقه شستشو دهید.

به رزین مسدود شده 1.8 گرم (4.35 میلی مول، 2.5 معادله) Fmoc-L-cysteine ​​(Acm) (Bachem، CA) و 683 میکرولیتر (4.35 میلی مول، 2.5 معادل) دی ایزوپروپیل-کاربودی ایمید (DIC) در 14 اضافه شد. میلی لیتر از مخلوط 2:1 DCM/DMF به مدت تقریباً 1 ساعت. پس از جفت شدن، رزین 1 بار به مدت حدود 3 دقیقه با DMF (20 میلی لیتر)، 3 بار برای حدود 2 دقیقه با ایزوپروپانول و 3 بار به مدت حدوداً شسته شد. 2 دقیقه DXM (20 میلی لیتر). اتصال با روش نیهیدرین Kaiser مورد آزمایش قرار گرفت.

پس از اتصال، رزین یک بار با DMF شسته شد و سپس با محلول پیپریدین در DMF مسدود شد. سپس رزین انسداد شده با افزودن با DMF و چندین بار به طور همزمان با MeOH و DCM شسته شد. رزین افزودنی 1 بار به مدت حدود 3 دقیقه با DMF (20 میلی لیتر)، 3 بار به مدت حدود 2 دقیقه با ایزوپروپانول (20 میلی لیتر) و 3 بار با DCM (20 میلی لیتر) هر بار حدود 2 دقیقه شسته شد. اتصال با روش نین هیدرین Kaiser مورد آزمایش قرار گرفت.

هر یک از اسیدهای آمینه محافظت شده زیر با استفاده از DIC در DMF/DCM به رزین شسته شده جفت شد و همانطور که در بالا توضیح داده شد در دنباله زیر محافظت شد: Fmoc-L-valine، Fmoc-L-lysine(Boc)، Fmoc-D-تریپتوفان، Fmoc-L-تیروزین (O-t-Bu) و Fmoc-L-سیستئین (Acm) (همه از Bachem California)، Boc-D-2-naphthylalanine (Synthech، Albany، OR).

زنجیره پپتیدی تکمیل شده دو بار با 75:20:5 DCM/TFA/آنیزول (30 میلی‌لیتر) به مدت حدود 2 دقیقه و حدود 25 دقیقه انسداد شده و محافظت شد، هر بار 3 بار به مدت حدود 2 دقیقه با DCM (20 میلی لیتر)، ایزوپروپانول شسته شد. (10 میلی لیتر) و DCM (20 میلی لیتر)، 2 بار به مدت حدود 5 دقیقه با 10٪ تری اتیلامین در DCM (20 میلی لیتر) خنثی شد و 3 بار به مدت حدود 2 دقیقه با DCM (20 میلی لیتر) و MeOH (20 میلی لیتر) شسته شد. رزین تحت فشار کاهش یافته خشک شد. وزن خشک 91/3 گرم (103 درصد عملکرد نظری) بود.

ب) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2.93 گرم از رزین بارگیری شده با پپتید از مرحله (B) (1.3 mmol-eq) در 50 میلی لیتر از مخلوط MeOH/DMF 3:1 به حالت تعلیق درآمد. سوسپانسیون تا دمای کمتر از حدود 10 درجه سانتیگراد در اتمسفر نیتروژن خنک شد و گاز آمونیاک خشک تا زمانی که محلول با آن اشباع شد، پاکسازی شد، در حالی که درجه حرارت زیر تقریباً 10 درجه سانتیگراد حفظ شد. دوغاب به مدت تقریباً 24 ساعت به آرامی هم زده شد و اجازه داد دما تا حدود 20 درجه سانتیگراد افزایش یابد. درجه تکمیل واکنش با ناپدید شدن واسطه متیل اتر با استفاده از HPLC (جاذب VYDAC®، اندازه دانه 5 میکرومتر، اندازه منافذ 100 Å، C18، شستشو در شرایط ایزوکراتیک 26٪ CH 3 CN در 0.1٪ TFA، بررسی شد. سرعت 1 میلی لیتر در دقیقه، ضبط در 220 میلی متر؛ تحت این شرایط، زمان تاخیر Rt برای متیل استر 14 دقیقه و برای محصول آمید 9.3 دقیقه است. مخلوط واکنش سرد شد و آمونیاک بی آب اضافی به آن اضافه شد تا جایی که ناحیه پیک HPLC مربوط به متیل استر کمتر از 10 درصد سطح پیک محصول مورد نظر باشد. دوغاب تا دمای کمتر از 10 درجه سانتیگراد سرد شد و به هم زدن در طول شب ادامه یافت تا پپتید رسوب کند. رسوب و رزین با فیلتراسیون جدا شده و با 15 میلی لیتر MeOH سرد شسته شدند. رسوب و رزین تحت فشار کاهش یافته خشک شدند و محصول با محلول آبی 50 درصد اسید استیک (3 قسمت 30 میلی لیتری) از رزین استخراج شد. تجزیه و تحلیل HPLC وجود 870 میلی گرم (0.70 میلی مول) از محصول عنوان را در مخلوط نشان داد (96٪ خلوص در یک سیستم HPLC ایزوکراتیک).

د) H-D- -Nal--Thr-NH 2

500 میلی گرم (0.40 میلی مول) از پپتید از مرحله (B) در 300 میلی لیتر اسید استیک 4 درصد حل شد و تا حدود 55 درجه سانتیگراد در اتمسفر نیتروژن گرم شد. محلول به سرعت هم زده شد و یک محلول 2 درصد وزنی بر حجم ید در 7.7 میلی لیتر MeOH (0.60 میلی مول) در یک قسمت اضافه شد. مخلوط به مدت تقریبی 15 دقیقه هم زده شد، سپس واکنش با تیتراسیون با محلول تیوسولفات سدیم 2% تا زمانی که رنگ ناپدید شد (~ 2 میلی لیتر) متوقف شد. مخلوط تا دمای اتاق سرد شده و فیلتر شد. مخلوط با کروماتوگرافی مقدماتی بر روی یک ستون C8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) با گرادیان استونیتریل در استات آمونیوم 0.1 مولار خالص شد، بر روی یک ستون C8 YMC با گرادیان استونیتریل در اسید استیک 0.25 نیوتن نمک زدایی شد. لیوفیلیز شده تا 350 میلی گرم پپتید هدف با خلوص 99 درصد بدست آید.

با توجه به توضیحات فوق، افراد متخصص در این فن به راحتی می توانند ویژگی های اساسی اختراع حاضر را دریابند و بدون دور شدن از روح و محدوده آن، تغییرات و اصلاحات مختلفی در اختراع به منظور تطبیق آن با کاربردها و شرایط مختلف ایجاد کنند. بنابراین، سایر تجسم های اختراع نیز توسط ادعاها پوشش داده شده است.

مطالبه

1. روشی برای تهیه پپتید با فرمول H-D--Nal--Thr-NH 2 که در آن روش مذکور شامل مراحل زیر است:

(الف) اتصال اولین اسید آمینه به یک رزین پشتیبان جامد توسط یک پیوند استری برای تشکیل یک "اولین محصول افزودنی"، که شامل (i) واکنش محلول آبی کربنات سزیم با محلول الکلی اولین اسید آمینه برای تشکیل یک اسید آمینه نمک سزیم اولین اسید آمینه، (ب) به دست آوردن نمک سزیم بدون حلال از اولین اسید آمینه، (iii) واکنش ساپورت رزین جامد با نمک سزیم اولین اسید آمینه در یک حلال آپروتیک قطبی بی آب برای تشکیل "اولین محصول اضافه شده"

که در آن اولین اسید آمینه Boc-L-Thr است که مربوط به اسید آمینه C ترمینال پپتید است و رزین پشتیبانی جامد یک رزین پلی استایرن کلرومتیله است.

(ب) محافظت از Boc از اولین محصول افزودنی با یک اسید برای تشکیل "محصول اول افزوده بدون محافظت"؛

(ج) به صورت اختیاری، افزودن یک «آمینو اسید بعدی» به «محصول اول افزودنی آزاد شده»، که شامل واکنش «آمینو اسید بعدی» با «اولین محصول افزودنی آزاد شده» در یک حلال آلی حاوی یک معرف گسترش پپتیدی برای تولید "محصول مسدود شده افزودنی زیر"، که در آن "اسید آمینه بعدی" دارای یک گروه آمینه درپوش Boc در زنجیره اصلی است، و اگر این "آمینو اسید بعدی" یک یا چند گروه عاملی در زنجیره جانبی داشته باشد، آنگاه عاملی گروه‌های موجود در زنجیره جانبی نیازی به حفاظت ندارند یا این گروه‌های عاملی در زنجیره جانبی دارای گروه‌های محافظی هستند که به ترتیب در برابر معرف‌های اسیدی یا قلیایی مورد استفاده برای محافظت‌زدایی، Boc و Fmoc پایدار هستند.

(د) محافظت از Boc از "محصول افزوده بعدی مسدود شده" که شامل واکنش "محصول افزوده بعدی مسدود شده" با اسید برای تولید "محصول افزوده بعدی مسدود شده" است.

(ه) به صورت اختیاری، تکرار مراحل (c) و (d)، با هر چرخه تولید "محصول رفع انسداد (X+1)امین جمع بعدی"، که در آن X تعداد تکرارهای مورد نظر چرخه ها را نشان می دهد.

(و) افزودن «آمینو اسید بعدی» به «اولین محصول بدون انسداد افزودنی» از مرحله (ب) یا، به صورت اختیاری، به «(X+1)امین محصول حذف شده بعدی اضافه شده» از مرحله (e)، که شامل حمل واکنش "اسید آمینه بعدی" را با "اولین محصول بدون انسداد افزوده" یا با "(X+1)امین محصول بدون انسداد افزوده بعدی" در یک حلال آلی حاوی یک معرف گسترش پپتیدی برای تولید "محصول مسدود شده بعدی" انجام دهید. که در آن "اسید آمینه بعدی" دارای یک گروه آمینه زنجیره اصلی با درپوش Fmoc است، به شرطی که اگر این "اسید آمینه بعدی" یک یا چند گروه عملکردی زنجیره جانبی داشته باشد، گروه های عاملی زنجیره جانبی نیازی به حفاظت یا عملکرد زنجیره جانبی ندارند. گروه‌ها دارای گروه‌های محافظی هستند که در برابر معرف‌های قلیایی که برای محافظت از Fmoc استفاده می‌شوند، مقاوم هستند.

(ز) محافظت از Fmoc "اضافه بعدی مسدود شده"، که شامل واکنش "افزودن بعدی مسدود شده" با یک آمین اولیه یا ثانویه برای تولید "افزودن بعدی مسدود شده" است.

(h) به صورت اختیاری، تکرار مراحل (e) و (g)، با هر چرخه تولید «محصول رفع انسداد (X+1)-امین جمع بعدی»، که در آن X تعداد مورد نظر تکرار چرخه است تا زمانی که در آن گنجانده شود. پپتید و اسید آمینه ماقبل آخر آزاد می شود.

(i) افزودن یک اسید آمینه N ترمینال به "محصول آزاد شده از جفت (X+1)-ام"، که شامل واکنش اسید آمینه N ترمینال با "محصول آزاد شده از (X+1)-ام است. جفت شدن" در یک حلال آلی حاوی یک معرف گسترش پپتیدی برای تولید "محصول افزودن مسدود شده"، که در آن "اسید آمینه ترمینال N" دارای یک گروه آمینه ستون فقرات است که توسط Boc یا Fmoc مسدود شده است.

(j) محافظت از محصول جفت درپوش دار Boc یا Fmoc با واکنش محصول کوپلینگ سرپوش دار با یک اسید در مورد Boc یا یک باز در مورد Fmoc برای تشکیل محصول پپتیدی درپوش دار روی رزین.

(ک) اگر "محصول رزین پپتیدی تکمیل شده" حاوی گروه های عاملی زنجیره جانبی باشد، به صورت اختیاری، گروه های عاملی زنجیره جانبی "محصول رزین پپتیدی کامل" که شامل واکنش "محصول رزین پپتیدی تکمیل شده" با معرف های ضدحفاظ کننده مناسب است، حذف شود. برای تولید "محصول پپتیدی کامل روی یک رزین محافظت نشده"؛ و

(ک) جدا کردن یک پپتید از یک تکیه گاه رزین جامد در یک "محصول رزین پپتیدی کامل" یا "رزین محصول پپتیدی بدون محافظت کامل" برای تولید یک پپتید، که شامل واکنش "محصول پپتیدی کامل روی یک رزین" یا "محصول پپتیدی کامل شده است". رزین را با آمونیاک، یک آمین اولیه یا یک آمین ثانویه تا زمانی که پپتید به طور قابل توجهی از رزین حذف شود، محافظت کرد.

مشروط بر اینکه مراحل (e) و (g) در سنتز پپتید شش بار پس از تشکیل "فرآورده اول افزوده شده مسدود شده" با فرمول H-L-Thr-رزین انجام شود، که در آن اسیدهای آمینه بعدی در ترتیب: Fmoc-L-Cys(Acm)، Fmoc -L-Val، Fmoc-L-Lys(Boc)، Fmoc-D-Trp، Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) و Fmoc-L-Cys(Acm ) برای تشکیل محصول H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین.

2. روش طبق ادعای 1، که در آن آمونیاک، آمین اولیه یا آمین ثانویه در مرحله (k) در یک حلال حاوی الکل و در صورت تمایل، یک حلال قطبی آپروتیک است.

3. روش طبق ادعای 1، که در آن مرحله (k) بیشتر شامل مراحل زیر است:

(i) رسوب پپتید جدا شده از حلال.

(ب) جداسازی با فیلتراسیون تکیه گاه رزین جامد و پپتید رسوب شده؛ و

(iii) استخراج پپتید با محلول اسیدی برای جداسازی پپتید.

4. روش مطابق هر یک از ادعاهای 1 تا 3، که در آن اولین اسید آمینه نمک سزیم Boc-L-Thr است که یک رزین Boc-L-Thr را به عنوان اولین محصول افزودنی تولید می کند و "اولین افزودنی مسدود شده" محصول” رزین H-L-Thr است.

5. روش طبق ادعای 4، که در آن اسید مورد استفاده برای حذف گروه محافظ Boc در مرحله(های) تری فلورواستیک اسید (TFA) است.

6. روش طبق ادعای 5، که در آن حلال آلی متیلن کلرید، کلروفرم یا دی متیل فرمامید است و معرف برای افزایش پپتید دی ایزوپروپیل-کاربودی ایمید، دی سیکلوهگزیل-کاربودی ایمید یا N-ethyl-N"-(3-dimethyl-aminopropyl است. ) کربودی ایمید.

7. روش طبق ادعای 6، شامل افزودن Boc-D- -Nal به H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)- رزین Thr مطابق مرحله (i) برای بدست آوردن رزین Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr.

8. روش طبق ادعای 7، شامل حذف همزمان گروه Boc مسدود کننده D-Nal، گروه O-t-Bu محافظ Tyr، و گروه Boc محافظت کننده Lys در Boc-D--Nal-Cys(Acm)- رزین Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-طبق مرحله(های) برای به دست آوردن یک محصول پپتیدی کامل روی رزین با فرمول H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-رزین.

9. روش طبق ادعای 8، شامل جداسازی پپتید H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr از رزین جامد با انجام واکنش رزین های H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr- همراه با آمونیاک در یک حلال حاوی الکل و، در صورت تمایل، یک حلال قطبی آپروتیک، تا زمانی که بطور قابل ملاحظه ای کامل حذف شود تا تولید شود. H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2.

10. روش طبق ادعای 9، که در آن الکل متانول و حلال آپروتیک قطبی دی متیل فرمامید است.

11. روش طبق ادعای 10، شامل حذف همزمان گروه‌های Acm که از Cys محافظت می‌کنند، و چرخه‌سازی باقی‌مانده‌های Cys محافظت‌زدایی شده در یک «محصول رزین پپتیدی کامل» با فرمول H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr. -D-Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 با واکنش H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 با محلول ید در الکل تا زمانی که بطور قابل ملاحظه ای محافظت و چرخه شدن کامل شود تا H-D--Nal--Thr-NH2 ایجاد شود.

سنتز فاز جامد پپتیدها توسط R.B. Merrifield از دانشگاه راکفلر (جایزه نوبل 1984) پیشنهاد شد. این روش مبتنی بر مونتاژ یک پپتید بر روی یک تکیه گاه پلیمری نامحلول با افزودن متوالی بقایای اسید آمینه با آلفا آمینه و گروه های جانبی محافظت شده است. طرح این بود که زنجیره پپتیدی به صورت مرحله‌ای جمع شود، به طوری که زنجیره در یک انتها به یک تکیه گاه جامد در طول سنتز متصل شود. در نتیجه، جداسازی و خالص‌سازی واسطه‌ها و مشتقات پپتید هدف صرفاً با فیلتر کردن و شستشوی کامل پلیمر جامد برای حذف تمام معرف‌ها و محصولات جانبی اضافی باقی‌مانده در محلول بود.

اصطلاح فاز جامد بیشتر به خصوصیات فیزیکی ماده روی حامل اشاره دارد، زیرا واکنش شیمیایی روی حامل پلیمری در یک فاز - در محلول رخ می دهد. در یک حلال مناسب، پلیمر متورم می شود و به یک ژل با ویسکوزیته کم اما بسیار ساختار یافته (پلیمرهای متقاطع) تبدیل می شود یا حل می شود (در مورد پلیمرهای غیر متقاطع)، و فرآیند سنتز در سطح فوق میکروتروژنیک اتفاق می افتد. ، در یک سیستم تقریباً همگن.

سنتز آلی فاز جامد به یک پایه پلیمری - رزین نیاز دارد. اس، که پیوند دهنده به آن متصل است L. در مرحله اول یک مولکول بستر به پیوند دهنده متصل است آ.مولکول آبی حرکت می شود (یعنی دیگر متحرک نیست)، اما توانایی واکنش با یک معرف دیگر را حفظ می کند. که در(مرحله 2).

تولید - محصول ABروی رزین باقی می ماند و به آن اجازه می دهد تا از معرف اضافی جدا شود که در(و محصولات جانبی) با شستشوی ساده. (شما می توانید بیشتر و بیشتر معرف های جدید اضافه کنید و به طور متوالی بستر اصلی را پیچیده کنید آ، نکته اصلی این است که پیوند دهنده در این واکنش ها بدون تغییر باقی می ماند). پیوند دهنده دو کاره Lطوری انتخاب می شود که اتصال آن با رزین باشد اسدوام بیشتری نسبت به زیرلایه داشت آ. سپس در آخرین مرحله ترکیب هدف ABرا می توان با شکستن پیوند آن با پیوند دهنده از رزین جدا کرد. واضح است که ارتباط L-ABباید در شرایط ملایم بدون آسیب رساندن به خود اتصال شکافته شود (پیوند آ-که در، و نه تماس پیوند دهنده با رزین (باند L-اس).

بنابراین، در حالت ایده آل، با شستن رزین پس از هر مرحله و جدا کردن پیوند با حامل، یک ماده خالص به دست می آید. طبیعی است که باور کنیم استفاده از مقدار زیادی از معرف ها و جداسازی متعاقب آن از رزین در بسیاری از موارد باعث می شود تا تعادل شیمیایی به سمت تشکیل محصول مورد نظر تغییر کند و زمان سنتز کاهش یابد. معایب سنتز آلی فاز جامد شامل نیاز به استفاده از مازاد نسبتاً زیاد (2 تا 30 معادل) از معرف ها، مشکلات در شناسایی محصولات سنتز میانی و همچنین هزینه نسبتاً بالای پایه های پلیمری اصلاح شده است که توسط هزینه پیوند دهنده

پلی استایرن کلرومتیله (که با مقدار کمی دی وینیل بنزن به هم پیوسته است) که توسط مریفیلد در سنتز آلی معرفی شده است، به اصطلاح رزین مریفیلد، در دسترس ترین حامل پلیمری است.

روش شناسی و مراحل اصلی سنتز پپتید فاز جامد

وظیفه بیان شده مستلزم معرفی یک حامل پلیمری با یک اسید آمینه پیوندی به واکنش با یک هتروسیکل فعال برای جایگزینی است. اجازه دهید جنبه روش شناختی بدست آوردن اسیدهای آمینه تثبیت شده بر روی پایه های پلیمری را با جزئیات بیشتری در نظر بگیریم.

صحنه1. تثبیت اسید آمینه محافظت شده با N بر روی یک حامل پلیمری.

اولین مرحله از طرح ما تثبیت اسید آمینه بر روی یک حامل پلیمری است. به منظور اجتناب از فرآیندهای جانبی مانند تشکیل الیگوپپتیدها، ابتدا اسید آمینه محافظت می شود. به طور معمول، اسیدهای آمینه محافظت شده با N استفاده می شود و پیوند حاصل بین اسید آمینه و حامل از نوع آمید یا استری است.

متداول‌ترین محافظ‌های گروه آمینه مورد استفاده در سنتز آلی فاز جامد، گروه‌های محافظ از نوع کاربامات، ترت‌بوتوکسی کربونیل (Boc) و حفاظت ۹H-فلورنیل متوکسی کربونیل (Fmoc) هستند، X گروه محافظت‌شده است:

لازم به ذکر است که انتخاب گروه محافظ با توجه به نوع تکیه گاه پلیمری مورد استفاده تعیین می شود. شرایط تثبیت اسیدهای آمینه محافظت شده برای انواع مختلف حامل های پلیمری متفاوت است. تثبیت اسیدهای آمینه Boc بر روی رزین مریفیلد، که پلی استایرن کلرومتیله است، انجام می شود. در موقعیتبه شکل نمک سزیم با افزودن سوسپانسیون کربنات سزیم در دی متیل فتالات (DMF) و مقادیر کاتالیزوری یدید پتاسیم. مازاد معرف ها نسبت به مقدار حامل در هر مورد به صورت جداگانه انتخاب می شود و به 1.5-4 معادل می رسد.

تثبیت اسیدهای آمینه Fmoc بر روی یک تکیه گاه پلیمری وانگ (X=O) برای تشکیل پیوند استری نوع بنزیل با استفاده از روش کربودی ایمید با استفاده از دی ایزوپروپیل کربودی ایمید (DIC) در حضور 4-(دی متیل آمینو) پیریدین (DMAP) انجام می شود. یک کاتالیزور واکنش بیحرکتی با اسیدهای آمینه بدون مانع در دمای اتاق رخ می دهد. بیحرکتی اسیدهای آمینه دارای مانع فضایی مستلزم واکنش در دمای 60-40 درجه سانتیگراد به مدت 2 روز و بیحرکتی مکرر است (شکل 1). - اسیدهای آمینه بر روی حامل پلیمری Rink (X=NH) با تشکیل یک پیوند آمید از نوع بنژیدریل در حضور معرف کاسترو (1H-1,2,3-benzotriazol-1-yloxy) انجام می شود. تریس-(دی متیل آمینو) فسفونیوم هگزا فلوروفسفات (BOP)، باز دی ایزوپروپیل اتیلامین (DIEA) و 1-هیدروکسی بنزوتریازول (HOBt)، به عنوان کاتالیزور. واکنش در دمای اتاق به مدت 2 ساعت برای اسیدهای آمینه بدون مانع و 4-6 ساعت برای اسیدهای آمینه دارای مانع فضایی ادامه می یابد.

مرحله 2.محافظت از یک اسید آمینه محافظت شده بر روی یک حامل پلیمری

در مرحله دوم که در حال برنامه ریزی هستیم (بعد از بی حرکت شدن آمینو اسید محافظت شده)، لازم است گروه محافظ را حذف کنیم تا گروه آمینه فعال شود. روش های حذف محافظ Boc و Fmoc متفاوت است. حذف حفاظت Boc از اسیدهای آمینه روی رزین مریفیلد با اسید تری فلوئورواستیک 50 درصد در دی کلرومتان به مدت نیم ساعت انجام می شود، در این شرایط پیوند مریفیلد دست نخورده باقی می ماند.

پس از محافظت زدایی، رزین با محلول تری اتیل آمین شسته می شود تا اسید تری فلورواستیک حذف شود. حذف حفاظت Fmoc از اسیدهای آمینه بر روی حامل های Wang (X=O) و Rink (X=NH) با محلول 20٪ پیپریدین در DMF به مدت 40-50 دقیقه انجام می شود.

کاهش قابل توجه در جرم رزین پس از حذف محافظ Fmoc می تواند به عنوان مبنایی برای تعیین وزن سنجی درجه بی حرکتی اسیدهای آمینه محافظت شده در مرحله اول سنتز فاز جامد باشد. توصیه می شود رزین را به طور متوالی با محلول پیپریدین در دی متیل فتالات درمان کنید - ابتدا به مدت 5-10 دقیقه و سپس به مدت 30 دقیقه در محلول تازه. پس از برداشتن محافظ، رزین حداقل 4 بار با دی متیل فتالات شسته می شود تا محصولات تخریب محافظ Fmoc از بین برود. نظارت بر پیشرفت واکنش اسیلاسیون روی ساپورت یا حذف عملکرد محافظ از گروه آمینو با استفاده از تست کایزر امکان پذیر است.

مرحله 3.جایگزینی نوکلئوفیل در هتروسیکل‌هایی که شامل یک اسید آمینه تثبیت شده روی یک حامل است.

گام بعدی که برای اجرای عملی برنامه ریزی کرده ایم، انجام واکنش جایگزینی هسته دوست آروماتیک است. اسید آمینه پیوند شده به عنوان هسته دوست عمل می کند و هتروسیکل فعال شده در محلول است. اکثر واکنش‌های جایگزینی هسته دوست در ساپورت‌ها از نظر اجرا با واکنش‌های فاز مایع تفاوتی ندارند. با این حال، باید در نظر داشت که دمای فرآیند نباید از 120 درجه سانتیگراد تجاوز کند، که بالاتر از آن پایه پلی استایرن حامل شروع به خراب شدن می کند. تحت شرایط واکنش انجام شده روی ساپورت، پیوند دهنده نیز باید حفظ شود.

هنگام انتخاب بسترهای هتروسیکلیک فعال شده مناسب، ماهیت گروه ترک در هتروسیکل باید در نظر گرفته شود.

مرحله 4.حذف ترکیب هدف از حامل های پلیمری

بیشتر پیوند دهنده ها در سنتز آلی فاز جامد در یک محیط اسیدی شکافته می شوند. مقاومت اسیدی لینکرها هنگام حرکت از رزین مریفیلد به رزین وانگ و رینک به شدت کاهش می یابد. پیوند دهنده Rink در شرایط ملایم تر (10-20٪ CF3COOH) نسبت به لینکر Wang (50٪ CF3COOH) شکافته می شود. رزین Merrifield در این شرایط منفعل است و ترانس استریفیکاسیون در محلول NaOMe/MeOH برای برش آن استفاده می شود که منجر به ایجاد شکاف می شود. تشکیل یک استر اسید

اجازه دهید یک بار دیگر به یاد بیاوریم که ماهیت پیوند دهنده نوع عملکرد انتهایی مولکول حاصل را که از بستر حذف می شود تعیین می کند. رزین وانگ اسید تولید می کند و رزین رینک آمید تولید می کند.

مزایای این طرح سنتز پپتید فاز جامد:

1. ترکیبات اصلی مختلف را می توان به گرانول های منفرد متصل کرد. سپس این دانه ها مخلوط می شوند تا تمام ترکیبات اولیه بتوانند در یک آزمایش با معرف واکنش دهند. در نتیجه، محصولات واکنش بر روی گرانول های منفرد تشکیل می شوند. در بیشتر موارد، اختلاط مواد اولیه در شیمی مایعات سنتی معمولاً منجر به خرابی - پلیمریزاسیون یا رزین شدن محصولات می شود. آزمایش بر روی بسترهای جامد این اثرات را حذف می کند.

2. از آنجایی که مواد اولیه و محصولات به تکیه گاه جامد متصل هستند، واکنش دهنده های اضافی و محصولات غیرمحصولی را می توان به راحتی از تکیه گاه جامد پلیمری شست.

3. از مقادیر زیاد معرف ها می توان برای تکمیل واکنش استفاده کرد (بیشتر از 99%)، زیرا این اضافه ها به راحتی جدا می شوند.

4. با استفاده از حجم های بارگذاری کم (کمتر از 0.8 میلی مول در هر گرم بستر)، واکنش های جانبی ناخواسته را می توان حذف کرد.

5. مواد واسطه موجود در مخلوط واکنش به گرانول ها متصل شده و نیازی به خالص سازی ندارند.

6. گرانول های پلیمری منفرد را می توان در پایان آزمایش جدا کرد و به این ترتیب محصولات جداگانه به دست آمد.

7. بستر پلیمری در مواردی که شرایط شکست انتخاب شده و گروه های لنگر مناسب - پیوند دهنده ها - انتخاب می شوند، قابل بازسازی است.

8. اتوماسیون سنتز فاز جامد امکان پذیر است.

شرایط لازم برای انجام سنتز فاز جامد، علاوه بر وجود یک تکیه گاه پلیمری نامحلول که در شرایط واکنش بی اثر است، عبارتند از:

وجود یک لنگر یا پیوند دهنده یک عملکرد شیمیایی است که اتصال بستر را با ترکیب اعمال شده تضمین می کند. باید به صورت کووالانسی به رزین متصل شود. لنگر همچنین باید یک گروه عملکردی واکنشی باشد تا بسترها با آن تعامل داشته باشند.

پیوند ایجاد شده بین بستر و پیوند دهنده باید در شرایط واکنش پایدار باشد.

باید راه هایی برای شکستن پیوند محصول یا واسطه به پیوند دهنده وجود داشته باشد.