Sinteza e fazës së ngurtë ose teknologjia e fazës së ngurtë, e cila shpesh quhet qeramike, është më e zakonshme në prodhimin e materialeve inorganike për degë të ndryshme të shkencës dhe industrisë. Këto përfshijnë lëndë djegëse bërthamore, materiale për teknologjinë hapësinore, radio-elektronikë, instrumente, katalizatorë, zjarrdurues, superpërçues me temperaturë të lartë, gjysmëpërçues, ferro- dhe piezoelektrikë, magnet, përbërje të ndryshme dhe shumë të tjera.

Sinteza e fazës së ngurtë bazohet në reaksionet kimike në të cilat të paktën një nga reaktantët është në formën e një të ngurtë. Reaksione të tilla quhen faza heterogjene ose e ngurtë. Ndërveprimi në fazën e ngurtë, ndryshe nga reaksionet në një mjedis të lëngët ose të gaztë, përbëhet nga dy procese themelore: nga vetë reaksioni kimik dhe transferimi i lëndës në zonën e reaksionit.

Reaksionet në gjendje të ngurtë që përfshijnë përbërës kristalorë karakterizohen nga lëvizshmëria e kufizuar e atomeve ose joneve të tyre dhe një varësi komplekse nga shumë faktorë. Këto përfshijnë të tilla si struktura kimike dhe reaktiviteti shoqërues i trupave të ngurtë që reagojnë, natyra dhe përqendrimi i defekteve, gjendja e sipërfaqes dhe morfologjia e zonës së reagimit, zona e kontaktit të reagentëve ndërveprues, aktivizimi paraprak mekanokimik dhe një sërë të tjerët. Të gjitha sa më sipër përcaktojnë kompleksitetin e mekanizmave të reaksioneve heterogjene. Studimi i reaksioneve heterogjene bazohet në kiminë e gjendjes së ngurtë, fizikën kimike dhe kiminë fizike të sipërfaqes së trupave të ngurtë, në ligjet e termodinamikës dhe kinetikës.

Shpesh, mekanizmi i reaksioneve në gjendje të ngurtë gjykohet vetëm mbi bazën që të dhënat eksperimentale mbi shkallën e ndërveprimit në funksion të kohës përshkruhen më së miri nga çdo model kinetik i veçantë dhe ekuacioni kinetik përkatës. Kjo qasje mund të çojë në përfundime të pasakta.

Proceset në materialet në gjendje të ngurtë kanë një sërë dallimesh të rëndësishme nga proceset në lëngje ose gazra. Këto dallime shoqërohen, para së gjithash, me një shkallë më të ulët të difuzionit në trupat e ngurtë dukshëm (me disa rend të madhësisë), gjë që pengon mesatarizimin e përqendrimit të përbërësve në sistem dhe, në këtë mënyrë, çon në lokalizimin hapësinor të proceseve që ndodhin. Lokalizimi hapësinor, nga ana tjetër, çon në faktin se si shpejtësia specifike e procesit (ose koeficienti i difuzionit) ashtu edhe gjeometria e zonës së reagimit kontribuojnë në kinetikën e vëzhguar të proceseve. Tipare të tilla të proceseve në fazë të ngurtë të përcaktuara nga faktorët gjeometrikë quhen topokimikë. Për më tepër, meqenëse transformimet në diskutim janë të lokalizuara në hapësirë, shkalla e tyre mund të përcaktohet si nga vetë proceset në kufirin e fazës (kontrolli i reagimit) ashtu edhe nga shkalla e furnizimit të ndonjë prej përbërësve në këtë ndërfaqe ose heqja e produktit ( s) (kontrolli i difuzionit). Këto raste për sisteme të thjeshta, për të cilat janë plotësuar supozimet e modelit, mund të identifikohen eksperimentalisht nga forma e varësisë kohore të shkallës së konvertimit. Një veçori tjetër e transformimeve fazore në trupat e ngurtë lidhet me faktin se formimi i një bërthame të re fazore në një matricë të ngurtë shkakton shfaqjen e sforcimeve elastike në këtë të fundit, energjia e të cilave në disa raste duhet të merret parasysh kur merret parasysh termodinamika. të këtyre transformimeve.

Një numër i madh faktorësh që ndikojnë në kinetikën e proceseve të fazës së ngurtë dhe në mikrostrukturën e materialeve të përftuara në këtë mënyrë përcakton gjithashtu shumëllojshmërinë e llojeve të klasifikimit të këtyre proceseve. Kështu, duke marrë parasysh stabilitetin e një sistemi në lidhje me luhatjet e llojeve të ndryshme, heterogjene (në rastin e sistemeve që janë të qëndrueshme në luhatje të vogla në vëllimin e zënë dhe të paqëndrueshme ndaj atyre të mëdha) dhe homogjene (në rastin e sistemeve që janë të paqëndrueshme tek luhatjet e vogla) dallohen proceset. Për proceset heterogjene, si shembull, mund të citohen transformimet që zhvillohen sipas mekanizmit të formimit dhe rritjes së bërthamave, për proceset homogjene, disa kalime të rendit-çrregullimit dhe zbërthimi spinodal i tretësirave të ngurta.

Është e nevojshme të dallojmë bërthamimin heterogjen dhe homogjen nga proceset heterogjene dhe homogjene në rastin e proceseve heterogjene. Bërthama heterogjene i referohet formimit të bërthamave në defekte strukturore (përfshirë defektet e pikës, dislokimet dhe kufijtë e fazës); bërthama homogjene - formimi i bërthamave në një vëllim pa defekte të fazës së ngurtë.

Duke analizuar produktin e një transformimi në fazë të ngurtë, bëhet dallimi midis bërthamave njëfazore dhe shumëfazore. Në rastin e bërthamave shumëfazore, produkti i procesit është një koloni shumëfazore me një mikrostrukturë karakteristike të përcaktuar nga energjia sipërfaqësore e kufirit të fazave të formuara; proceset e këtij lloji quhen të ndërprera, në ndryshim nga proceset e vazhdueshme në rastin e formimit dhe rritjes së bërthamave njëfazore.

Një mënyrë tjetër për të klasifikuar transformimet e fazës së ngurtë bazohet në një krahasim të përbërjes së fazës fillestare dhe përbërjes së produktit të reaksionit. Nëse përputhen, ata flasin për procese pa difuzion, dhe nëse përbërja ndryshon, ata flasin për difuzion. Për më tepër, është e dobishme të dallohen nga proceset jo-difuzione proceset bashkëpunuese (për shembull, transformimi martensitik) që ndodhin me anë të një zhvendosjeje të lehtë të njëkohshme të atomeve në një vëllim të madh të fazës fillestare.

Transformimet fazore pa difuzion mund të ndryshojnë në llojin e karakteristikave të tyre termodinamike që ndryshojnë gjatë procesit.

Transformimet e llojit të parë janë procese në të cilat ka një ndryshim në derivatet e potencialit kimik në lidhje me temperaturën ose presionin. Kjo nënkupton një ndryshim të menjëhershëm gjatë tranzicionit fazor të parametrave të tillë termodinamikë si entropia, vëllimi, entalpia dhe energjia e brendshme. Gjatë transformimeve të llojit të dytë, derivatet e parë të potencialit kimik në lidhje me parametrat intensivë nuk ndryshojnë, por ndryshojnë derivatet e rendit më të lartë (duke filluar nga i dyti). Në këto procese, me entropi dhe vëllim të vazhdueshëm të sistemit, vërehet një ndryshim i menjëhershëm i sasive të shprehura në termat e derivateve të dytë të energjisë Gibbs: kapaciteti termik, koeficienti i zgjerimit termik, ngjeshshmëria, etj.

Reaksionet e fazës së ngurtë ndërmjet dy fazave (kontaktet ndërmjet tre ose më shumë fazave nuk kanë gjasa, dhe proceset përkatëse mund të përfaqësohen si kombinime të disa reaksioneve dyfazore) janë procese difuzioni dhe mund të jenë ose heterogjene ose homogjene, me bërthama heterogjene dhe homogjene. . Proceset homogjene dhe proceset me bërthama homogjene në reaksione të tilla janë të mundshme, për shembull, në rastin e formimit të një zgjidhjeje të ngurtë metastabile me dekompozimin e saj të mëvonshëm (të ashtuquajturat reaksione të brendshme). Një shembull i proceseve të tilla mund të jetë oksidimi i brendshëm.

Kushti për ekuilibrin termodinamik në një transformim në gjendje të ngurtë, si në çdo transformim tjetër kimik, është barazia e potencialeve kimike të përbërësve në materialet fillestare dhe produktet e reaksionit. Kur ndërveprojnë dy faza të ngurta, kjo barazi potencialesh kimike mund të realizohet në mënyra të ndryshme: 1) rishpërndarja e përbërësve në fazat fillestare me formimin e tretësirave të ngurta; 2) formimi i fazave të reja me një strukturë kristalore të ndryshme (që, në fakt, zakonisht quhet reaksion në fazë të ngurtë), dhe meqenëse potenciali kimik i përbërësit në faza të ndryshme të një sistemi shumëfazor nuk varet nga sasia e çdo fazë, ekuilibri mund të arrihet vetëm me transformimin e plotë të fazave fillestare. Informacioni më i besueshëm në lidhje me mekanizmin e reaksioneve të fazës së ngurtë merret me përdorim kompleks, i cili bën të mundur vëzhgimin e njëkohshëm të disa parametrave të sistemit reagues, duke përfshirë përbërjen e fazës, efektet termike, ndryshimet në masë dhe më shumë.

Teoria termodinamike e reaksioneve në gjendje të ngurtë u propozua nga Wagner dhe u zhvillua më tej nga Schmalzried duke përdorur shembullin e reaksioneve të shtimit.

Deri më sot, nuk ka një klasifikim të unifikuar të një shumëllojshmërie të gjerë të reaksioneve heterogjene. Kjo është për shkak të vështirësisë së zgjedhjes së një kriteri si bazë për një klasifikim të tillë universal. Sipas kritereve kimike, reaksionet ndahen në reaksione oksidimi, reduktimi, zbërthimi, kombinimi, shkëmbimi etj. Krahas kriterit të treguar përdoret gjerësisht si kriteri kryesor për gjendjen fizike të reagentëve:

Një tipar karakteristik i të gjitha reaksioneve heterogjene është ekzistenca dhe lokalizimi në kufirin fazor të zonës së reagimit. Zona e reagimit, si rregull, me trashësi të vogël ndan dy zona të hapësirës të zëna nga substanca me përbërje të ndryshme dhe me veti të ndryshme. Arsyet për formimin e zonës së reaksionit zakonisht ndahen në dy grupe: ngadalësia relative e proceseve të difuzionit dhe arsyet kimike. Grupi i fundit është për shkak të reaktivitetit të lartë të atomeve ose molekulave të vendosura në sipërfaqen e një reagjenti të ngurtë ose në ndërfaqen midis dy fazave ekzistuese. Dihet se sipërfaqja e një lënde të ngurtë ose të lëngshme ka veti që ndryshojnë nga vetitë e një kampioni kompakt. Kjo i bën veçoritë e ndërfaqes specifike. Pikërisht këtu ndodh një rirregullim i rëndësishëm i paketimit të kristalit, sforcimet midis dy rrjetave kristalore ulen dhe përbërja kimike ndryshon.

Meqenëse transferimi i masës kryhet me anë të difuzionit, dhe lëvizshmëria e difuzionit të grimcave të ngurta varet nga defekti i strukturës së saj, mund të pritet një efekt domethënës i defekteve në mekanizmin dhe kinetikën e reaksioneve të fazës së ngurtë. Kjo fazë i paraprin fazës kimike të transformimit të reaktantëve në ndërfaqen ndërfaqe. Kështu, kinetika e reaksioneve heterogjene përcaktohet si nga natyra e rrjedhës së vetë reaksionit kimik, ashtu edhe nga metoda e dërgimit të substancës në zonën e reagimit. Në përputhje me sa më sipër, shpejtësia e reaksioneve do të kufizohet nga faza kimike (kinetika kimike) ose difuzioni (kinetika e difuzionit). Një fenomen i tillë vërehet në realitet.

Sipas Wagner-it, difuzioni dhe, rrjedhimisht, reaksioni në trupat e ngurtë kryhet kryesisht për shkak të lëvizshmërisë së joneve dhe elektroneve, për shkak të gjendjes jo ekuilibër të rrjetës. Jone të ndryshëm të rrjetës lëvizin në të me shpejtësi të ndryshme. Në veçanti, lëvizshmëria e anioneve në shumicën dërrmuese të rasteve është e papërfillshme në krahasim me lëvizshmërinë e kationeve. Prandaj, difuzioni dhe, në përputhje me rrethanat, reagimi në trupa të ngurtë kryhet për shkak të lëvizjes së kationeve. Në këtë rast, difuzioni i kationeve të ndryshëm mund të shkojë në të njëjtin drejtim ose drejt njëri-tjetrit. Në rastin e kationeve të ngarkuar ndryshe, elektroneutraliteti i sistemit ruhet për shkak të lëvizjes së elektroneve. Për shkak të ndryshimit në shpejtësinë e lëvizjes së kationeve të ngarkuar ndryshe, në sistem lind një potencial elektrik. Si rezultat, shkalla e lëvizjes së më shumë joneve të lëvizshëm zvogëlohet dhe, anasjelltas, për më pak të lëvizshëm? rritet. Kështu, potenciali elektrik që rezulton rregullon shpejtësinë e difuzionit të joneve. Kjo e fundit dhe shkalla e përcaktuar prej saj e të gjithë procesit të transformimit të gjendjes së ngurtë mund të llogaritet në bazë të përçueshmërisë elektronike dhe numrave të transferimit. Natyrisht, difuzioni i drejtuar i joneve është i mundur vetëm në një fushë elektrike ose në prani të një gradient përqendrimi në sistem.

Në sintezën e substancave në gjendje të ngurtë, shpesh është e nevojshme të kontrollohet jo vetëm përbërja kimike (elementare dhe fazore) e produktit që rezulton, por edhe organizimi i tij mikrostrukturor. Kjo është për shkak të varësisë së fortë të vetive kimike (për shembull, aktivitetit në reaksionet në fazën e ngurtë) dhe shumë vetive fizike (magnetike, elektrike, optike, etj.) nga karakteristikat e organizimit strukturor të një trupi të ngurtë në nivele të ndryshme hierarkike. I pari nga këto nivele përfshin përbërjen elementare të një trupi të ngurtë dhe metodën e rregullimit të ndërsjellë të atomeve të elementeve në hapësirë ​​- strukturën kristalore (ose veçoritë e mjedisit më të afërt të koordinimit të atomeve në trupat e ngurtë amorfe), si dhe përbërjen dhe përqendrimi i defekteve në pikë. Si niveli tjetër i strukturës së një trupi të ngurtë, ne mund të konsiderojmë shpërndarjen e defekteve të zgjeruara në një kristal, i cili përcakton madhësitë e rajoneve në të cilat (korrigjuar për ekzistencën e defekteve të pikës) vërehet simetria përkthimore në rregullimin e atomeve. . Rajone të tilla mund të konsiderohen si mikrokristale të përsosura dhe quhen rajone të shpërndarjes koherente. Duke folur për rajonet e shpërndarjes koherente, duhet të mbahet mend se, në rastin e përgjithshëm, ato nuk janë ekuivalente me grimcat kompakte që formojnë një material të fazës së ngurtë, i cili mund të përmbajë një numër të konsiderueshëm defektesh të zgjatura dhe, rrjedhimisht, rajone koherente. duke u shpërndarë. Koincidenca e rajoneve të shpërndarjes koherente me grimcat (të cilat në këtë rast quhen me një domen) zakonisht vërehet vetëm për madhësi mjaft të vogla (më pak se 100 nm) të kësaj të fundit. Nivelet e mëvonshme strukturore mund të shoqërohen me shpërndarjen e formës dhe madhësisë së grimcave që formojnë materialin pluhur ose qeramik, grumbullimin e tyre, grumbullimin e agregateve parësore, etj.

Aplikimet e ndryshme të materialeve të fazës së ngurtë kanë kërkesa të ndryshme, shpesh kontradiktore për karakteristikat strukturore të listuara më sipër dhe për këtë arsye kërkojnë metoda të ndryshme sintetike. Prandaj, është më e saktë të flasim për metodat e sintezës jo të substancave të fazës së ngurtë, por të materialeve të fazës së ngurtë dhe, në secilin rast, të zgjidhni një metodë sinteze duke marrë parasysh fushën e aplikimit të mëvonshëm të produktit që rezulton.

Në rastin e përgjithshëm, metodat për sintezën e materialeve në fazë të ngurtë mund të klasifikohen sipas distancës së tyre nga kushtet e ekuilibrit termodinamik për rrjedhën e proceseve kimike të përdorura. Në përputhje me ligjet e përgjithshme, në kushte që korrespondojnë me një gjendje sa më larg ekuilibrit, vërehet një tejkalim i konsiderueshëm i shkallës së bërthamimit mbi shkallën e rritjes së bërthamave të formuara, gjë që padyshim çon në marrjen e produktit më të shpërndarë. Në rastin e kryerjes së procesit pranë ekuilibrit termodinamik, rritja e bërthamave tashmë të formuara ndodh më shpejt se formimi i të rejave, gjë që bën të mundur marrjen e materialeve me kokërr të trashë (në rastin kufizues, me një kristal). Shpejtësia e rritjes së kristaleve përcaktohet gjithashtu kryesisht nga përqendrimi i defekteve të zgjatura (jo ekuilibër) në to.

Sinteza kombinuese mund të kryhet jo vetëm në tretësirë ​​(sinteza e fazës së lëngshme), por edhe në sipërfaqen e një faze të ngurtë kimikisht inerte. Në këtë rast, lënda e parë fillestare "qepet" kimikisht në grupet funksionale në sipërfaqen e bartësit të polimerit (më shpesh përdoret një lidhje esterike ose amide) dhe trajtohet me një tretësirë ​​të lëndës së dytë fillestare, e cila merret në një tepricë e konsiderueshme në mënyrë që reagimi të shkojë drejt përfundimit. Ka një lehtësi të caktuar në këtë formë reagimi, pasi teknika për izolimin e produkteve është e lehtësuar: polimeri (zakonisht në formën e kokrrizave) thjesht filtrohet, lahet tërësisht nga mbetjet e reagentit të dytë dhe përbërja e synuar është shkëputur kimikisht prej tij.

Në kiminë organike, nuk ka asnjë reagim të vetëm që në praktikë të sigurojë rendimente sasiore të produkteve të synuara në çdo rast. Përjashtimi i vetëm është, me sa duket, djegia e plotë e substancave organike në oksigjen në temperaturë të lartë deri në CO 2 dhe H 2 O. Prandaj, pastrimi i produktit të synuar është gjithmonë një detyrë e domosdoshme, dhe shpeshherë detyra më e vështirë dhe që kërkon kohë. Një detyrë veçanërisht e vështirë është izolimi i produkteve të sintezës së peptideve, për shembull, ndarja e një përzierje komplekse të polipeptideve. Prandaj, është në sintezën e peptideve që metoda e sintezës në një substrat polimer të ngurtë, e zhvilluar në fillim të viteve 1960 nga R. B. Merifield, është bërë më e përdorur.

Bartësi i polimerit në metodën Merrifield është një polistiren i grimcuar me lidhje tërthore që përmban grupe klorometil në unazat e benzenit, të cilat janë lidhës që lidhin mbështetjen me mbetjen e parë të aminoacideve të polipeptidit. Këto grupe e transformojnë polimerin në një analog funksional të klorurit të benzilit dhe i japin atij aftësinë për të formuar lehtësisht lidhje esterike gjatë reagimit me anionet karboksilate. Kondensimi i një rrëshirë të tillë me aminoacide të mbrojtura nga N çon në formimin e estereve përkatëse të benzilit. Heqja e mbrojtjes N nga jep një derivat të mbrojtur me C të aminoacidit të parë të lidhur në mënyrë kovalente me polimerin. Aminoacilimi i grupit amino të çliruar me një derivat të mbrojtur N të aminoacidit të dytë, i ndjekur nga heqja e mbrojtjes N, rezulton në një derivat të ngjashëm dipeptid të lidhur gjithashtu me polimerin:

Një cikël i tillë me dy faza (dembrojtja - aminoacilimi), në parim, mund të përsëritet aq herë sa kërkohet për të ndërtuar një zinxhir polipeptid me një gjatësi të caktuar.

Zhvillimi i mëtejshëm i ideve të Merifield u drejtua, para së gjithash, në kërkimin dhe krijimin e materialeve të reja polimerike për substrate, zhvillimin e metodave për ndarjen e produkteve dhe krijimin e instalimeve të automatizuara për të gjithë ciklin e sintezës së polipeptideve.

Efektiviteti i metodës Merifield është demonstruar nga sinteza e suksesshme e një numri polipeptidësh natyralë, në veçanti insulinës. Sidomos qartë avantazhet e tij janë demonstruar në shembullin e sintezës së enzimës ribonukleazë. Kështu, për shembull, me koston e përpjekjeve të konsiderueshme, gjatë disa viteve, Hirschman dhe 22 punonjës kryen sintezën e enzimës ribonukleazë (124 mbetje aminoacide) duke përdorur metoda tradicionale të fazës së lëngshme. Pothuajse njëkohësisht, e njëjta proteinë u përftua nga sinteza e automatizuar e fazës së ngurtë. Në rastin e dytë, sinteza, e cila përfshinte gjithsej 11.931 operacione të ndryshme, duke përfshirë 369 reaksione kimike, u krye nga dy pjesëmarrës (Gatte dhe Merrifield) në vetëm disa muaj.

Idetë e Merrifield shërbyen si bazë për krijimin e metodave të ndryshme për sintezën kombinuese të bibliotekave të polipeptideve të strukturave të ndryshme.

Kështu, në vitin 1982, u propozua një strategji origjinale për sintezën paralele me shumë faza të peptideve në fazën e ngurtë, e njohur si "metoda e ndarjes" ndarë- ndarja, ndarja) ose metoda e “përzierjes dhe ndarjes” (Fig. 3). Thelbi i saj është si më poshtë. Le të themi se nga tre aminoacide (A, B dhe C) ju duhet të merrni të gjitha kombinimet e mundshme të tripeptideve. Për ta bërë këtë, granulat e një bartësi të ngurtë polimer (P) ndahen në tre pjesë të barabarta dhe trajtohen me një zgjidhje të një prej aminoacideve. Në këtë rast, të gjitha aminoacidet janë të lidhura kimikisht në sipërfaqen e polimerit nga një prej grupeve të tyre funksionale. Polimeret e fituara të tre klasave përzihen plotësisht, dhe përzierja ndahet përsëri në tre pjesë. Pastaj secila pjesë, që përmban të tre aminoacidet në sasi të barabarta, trajtohet përsëri me një nga tre të njëjtat aminoacide dhe fitohen nëntë dipeptide (tre përzierje nga tre produkte secila). Një përzierje tjetër, ndarja në tre pjesë të barabarta dhe trajtimi me aminoacide jep 27 tripeptidet e dëshiruara (tre përzierje me nëntë produkte) në vetëm nëntë faza, ndërsa marrja e tyre veçmas do të kërkonte një sintezë prej 27 × 3 = 81 fazash.

"Biolog. revistë Armenia, 1 (65), 2013 SINTEZA E FAZËS SOLIDA TË PEPTIDEVE KARDIAKO-AKTIVE TË IZOLUARA NGA ATRIUM I DERRIT G.S. Instituti i Biokimisë CHAILYAN. Bunyatyan NAS RA..."

Artikuj eksperimentalë dhe teorikë

Artikuj eksperimentalë dhe teorikë

Biolog. revistë Armenia, 1 (65), 2013

SINTEZA NË FAZË E NGURTË E PEPTIDEVE KARDIAKE,

I IZOLUAR NGA ATRIUM I DERRIT

G.S. CHAILYAN

Instituti i Biokimisë. Bunyatyan NAS RA

[email i mbrojtur]

Për të vazhduar kërkimin e akad. Galoyan, ne kryem një sërë eksperimentesh për të izoluar, pastruar dhe përcaktuar orientimin biologjik të përbërjeve peptide të sapoizoluara nga atriumet dhe pjesët e veshit të zemrës së derrit. Për të kryer bioteste, ishte e nevojshme të merren sasitë përgatitore të mostrave të studiuara. Për ta bërë këtë, ne përdorëm metodën e sintezës së peptideve në fazë të ngurtë me modifikimin e saj të mëtejshëm. Pastërtia dhe identiteti i preparateve të sintetizuara u kontrolluan me kromatografi të lëngshme me performancë të lartë dhe analizë spektrale të masës.

Sinteza e fazës së ngurtë - fmoc-aminoacide - HPLC - fenilizotiocianate - analiza spektrale e masës:

fmoc- – – Për studime të mëtejshme të krijuara nga Galoyan, u kryen një sërë eksperimentesh mbi izolimin, pastrimin dhe përcaktimin e drejtimit biologjik të peptideve të izoluara nga atriumet e derrave. Për kryerjen e biotesteve është kërkuar sasia përgatitore e mostrave. Është përdorur një metodë e modifikuar e sintezës së peptideve të fazës së ngurtë. Pastërtia dhe identiteti i peptidit të sintetizuar u përcaktuan me HPLC dhe analiza spektrale të masës.

Sinteza e fazës së ngurtë - kromatografia e lëngshme me performancë të lartë - spektrometria e masës - fmoc-aminoacide - kardiopeptide - atria Galoyan dhe të tjerët studiuan mënyrat e rregullimit dhe mekanizmat e veprimit të neurohormoneve hipotalamike në procese të ndryshme në trup.

Konfirmimi i idesë së funksionimit të ndërlidhur, të ndërvarur, integral të një sistemi të tillë si hipotalamusi - gjëndra e hipofizës - gjëndrat mbiveshkore ishte një pikë kthese në endokrinologji. Plotësimi i këtij koncepti SINTEZA NË FAZË TË NGURTË TË NJË PEPTIDI AKTIV KARDIAK TË IZOLUAR NGA ATRIUM I DERRIT të triadës tuale të paraqitur nga Galoyan në lidhje me ndërveprimin hipotalamus - hipofizë

– zemra, është një arritje e madhe shkencore. Më pas, u zbulua një zemër e re ind-objektiv, u tregua aftësia e këtij organi për të kontrolluar funksionimin e peptideve specifike, si dhe ekzistenca e një mekanizmi reagimi midis hipotalamusit dhe zemrës përmes këtyre peptideve.

Zbulimi i komponimeve kardioaktive - neurohormon K, C, G dhe një numër të tjerëve në hipotalamusin e kafshëve të ndryshme shërbeu si fillimi i punës jo vetëm për studimin e mekanizmave molekularë të veprimit të këtyre neurohormoneve, por edhe për kërkimin. për komponime të ngjashme në zemër. Baza për një studim gjithëpërfshirës të vetive biokimike dhe fiziko-kimike të parimeve kardioaktive ishin të dhënat mbi praninë e 2 përbërjeve kardioaktive në muskulin e zemrës. Pjesëmarrja e neurohormonit “C” në rregullimin e proceseve glikolitike dhe nivelit të nukleotideve ciklike u vendos nëpërmjet frenimit të PDE cAMP, protein kinazës së varur nga cAMP, etj. Ky përbërës është treguar të jetë me peshë të ulët molekulare dhe i përket glikopeptideve.

Në Laboratorin e Kromatografisë Analitike dhe Sintezës së Peptideve, ne kryem punën për izolimin dhe pastrimin e përbërjeve peptide nga atriumet dhe zonat e veshit të zemrës së derrit. Gjatë ndarjes së fraksioneve peptide me HPLC përgatitore, ne izoluam dhe pastruam në një gjendje homogjene 20 përbërës të natyrës peptide. Për të përcaktuar fokusin biologjik, të gjitha përgatitjet u testuan për ndryshime në komponentët e EKG-së në minjtë. Rezultatet e eksperimenteve treguan se 7 komponime kanë faktorë të gjithanshëm të ndikimit në komponentë të caktuar të EKG.

Peptidi nr. 7 tregoi aktivitetin më të madh në ndryshimin e amplitudës së komponentit R, kohëzgjatjes së kompleksit QRS, amplitudës S dhe parametrave të tjerë.

Për të studiuar mekanizmat biologjikë të veprimit të këtij ilaçi, u bë e nevojshme që të kishte një sasi të madhe të mostrës së testimit. Për shkak të faktit se procesi i izolimit dhe pastrimit të produkteve biologjike është jashtëzakonisht joefikas, i mundimshëm, kërkon kohë dhe nuk mund të sigurojë riprodhueshmëri të mirë, është bërë jashtëzakonisht e rëndësishme të kryhet sinteza kimike e këtij ilaçi. Duke analizuar literaturën botërore në fushën e sintezës kimike të peptideve, arritëm në përfundimin se më optimale për ne është metoda e sintezës në fazë të ngurtë duke përdorur aminoacide të mbrojtura nga fmoc. E zbuluar në vitin 1984, sinteza e peptideve në fazën e ngurtë ka shumë përparësi ndaj sintezës konvencionale për sa i përket efikasitetit, si dhe përpunimit dhe pastrimit të përshtatshëm.

Duke përdorur disa metoda të ndryshme: hidroliza e këtij medikamenti, modifikimi i aminoacideve me fenilizotiocianat, përftuam përbërjen aminoacide të peptidit nr.7. Duke përdorur të dhënat e analizave spektrale të masës dhe NMR, degradimin e Edmonit, arritëm të merrnim jo vetëm përbërjen e aminoacideve, por edhe sekuencën aminoacide të peptidit nr. 7.

Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Një proces efikas i sintezës së fazës së ngurtë varet kryesisht nga zgjedhja e saktë e kushteve të ndryshme për zbatimin e tij, si zgjedhja e rrëshirës, ​​tretësit dhe kinetika e sintezës. Këto variabla ndikojnë në shkallën e fryrjes së rrëshirës dhe lidhjen e saj me aminoacidet, numrin e vendeve lidhëse, gjë që në fund ndikon në sintezën e peptidit në tërësi. Ne përshtatëm procesin e sintezës së fazës së ngurtë në lidhje me peptidet tona të studiuara, duke marrë parasysh veçoritë e sekuencës së tyre aminoacide.

G.S. CHAILYAN Materiali dhe metodat. Të gjithë reagentët, tretësit, rrëshirat e përdorura janë nga Advanced Chem Techcompany. Ne përdorëm grupe fmoc për të mbrojtur skajin N të aminoacideve gjatë sintezës dhe dimetilformamid (DMF) si tretës gjatë gjithë sintezës. Si substrat kemi përdorur rrëshirë 2-klorotritil të qëndrueshme ndaj acidit. Heqja e grupeve mbrojtëse fmoc u krye duke përdorur një tretësirë ​​të piperidinës në DMF.

Shumë e rëndësishme në procesin e sintezës është zbarkimi i aminoacidit të parë në rrëshirë. Dy gram rrëshirë 2Cl-Trt u hodhën në një shiringë 10 ml. DMF u hodh në shiringë, rrëshira u la të fryhej për 15 minuta. Pas kësaj, DMF u larë jashtë. Më pas, një tretësirë ​​e aminoacidit të parë (fmoc-Pro) dhe një aktivizues reaksioni (DIPEA) u hodhën në shiringë në një raport prej 1 RESIN/1.2 FMOC-PRO/4DIPEA. Reagimi i mbjelljes së aminoacidit të parë zgjati 3 orë.Kusht shumë i rëndësishëm për sintezën është mungesa e lidhësve të lirë pas mbjelljes së aminoacidit të parë, prandaj pas lidhjes me aminoacidin e parë, rrëshira u trajtua me një përzierje të metilen, DIPEA (diizopropiletilaminë) dhe DMF në raportin 80DMF/15MEOH/5DIPEA për të bllokuar ndoshta skajet e lira të mbetura. Pas kësaj, rrëshira është larë me DMF 5 herë për 5 minuta. Më pas, aminoacidet u zhbllokuan me një tretësirë ​​30% të piperidinës në DMF 8 herë për 5 minuta. Pas kësaj, rrëshira është larë me DMF 5 herë për 5 minuta. Ky cikël u përsërit gjatë gjithë sintezës së peptidit. Pas çdo hapi shtimi dhe çbllokimi të aminoacideve, ecuria e reaksionit u monitorua nga testi Kaiser, i cili është reagimi i ninhidrinës me një grup amino të lirë për të formuar një ngjyrë karakteristike blu të errët. Falë këtij testi, u bë i mundur kontrolli hap pas hapi i reagimeve të ngarkimit dhe zhbllokimit të aminoacideve.

Pastrimi dhe kontrolli i peptidit nr.7 të sintetizuar u krye në një sistem HPLC preparativ 2-komponentësh nga Waters (SHBA). Për të injektuar kampionin u përdor një injektor Rheodyne me një volum cikli prej 500 µl. Zbulimi u krye në intervalin 190-360 nm. Ne përdorëm një kolonë "Symmetry Si-100 C18" (4.6x250 mm) për HPLC me fazë të kundërt. Shpejtësia e rrjedhjes ishte 50 ml/min. Është përdorur një sistem eluenti gradient H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1). Koha e analizës 15 min. Rikromatografia u krye në një sistem analitik Knauer HPLC. Është përdorur një kolonë XbridgeC18 (2.6x150 mm). Zbulimi u krye në 214 nm.

Për të konfirmuar të dhënat e marra, preparati i sintetizuar iu nënshtrua analizës spektrale masive në CSU "Sspektrometria analitike".

Rezultate dhe diskutime. Të dhënat e marra në kromatogram sugjerojnë se pastërtia e peptidit nr. 7 të sintetizuar pas pastrimit është më shumë se 99,6% (Fig. 1).

–  –  –

Kemi kryer një analizë krahasuese kromatografike të peptidit vendas nr. 7 në një kolonë X-urë C18 në të njëjtat kushte si analogu i tij i sintetizuar. Rezultatet e krahasimit janë paraqitur (Fig. 2).

Sinteza në fazën e ngurtë të një peptidi kardioaktiv të izoluar nga Atria e derrit

–  –  –

Oriz. Fig. 4. Spektrograme të preparateve të sintetizuara (A) dhe amtare (B).

G.S. CHAILYAN Siç mund të shihet nga krahasimi i kromatogrameve, analogu i sintetizuar dhe peptidi vendas nr. 7 janë identikë në masë dhe kohë lëshimi, gjë që tregon identitetin e strukturave të tyre dhe sekuencën e aminoacideve. Kështu, duke përdorur metodën e sintezës së peptideve në fazë të ngurtë dhe duke marrë parasysh veçoritë strukturore të peptidit të studiuar, arritëm të përftojmë një peptid homogjen dhe identik me atë vendas të përbërë nga 9 aminoacide. Në të ardhmen, duke pasur një sasi të mjaftueshme të barit, ne planifikojmë të kryejmë një sërë biotestesh për të identifikuar jo vetëm mënyrat e rregullimit të aktivitetit kardiak nga ky peptid, por edhe mekanizmat e veprimit në organe dhe sisteme të tjera.

LITERATURA

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Zbulimi dhe identifikimi në zemrën e një demi të ri 1.

proteinat kardioaktive. Pyetje. mjaltë. Kimi, 37, 2, f. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Izolimi dhe karakterizimi 2.

fragment triptik kardioaktiv i proteinës bartës të neurohormonit C. Neurokimi, 2, 3, f. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Ndarja e komponimeve aktive të koronës me peshë molekulare të ulët 3.

muskujt e zemrës nga një kombinim i filtrimit të xhelit dhe elektroforezës me xhel poliakrilamid. Biolog. revistë Armenia, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Shpërndarja e komplekseve të proteinave kardioaktive në zemrën e kafshëve të ndryshme. Biolog. revistë Armenia, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. Rregullimi i neurosekretimit dhe hormoneve të sistemit hipotalamo-neurohipofizik, BRSS, 1963.

6. Galoyan A.A. Biokimia e hormoneve të reja kardioaktive dhe imunomodulatorëve të sistemit funksional të hipotalamusit neurosekretues, zemrës endokrine. Shkencë Publike. fq. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, botimi i 3-të, Springer Publishers, 500 f., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 f., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Pastrimi i proteinave koronarodiluese të izoluara nga hipotalamusi. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, f. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. Kimi organike e avancuar e March. Botuar nga John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, f. 133, 2007.

–  –  –

Punime të ngjashme:

« KOMUNITETE SHTËPIA BOTUESE "NAUKA" Moskë 1979 UDC 581.55:56.017 Parcela n i k v VV Evoluimi i strukturës së bashkësive bimore. M.: Nauka, fq. 1979, 276 Mbi metalin modern...»

“Izvestia e Fondit Muzeor. A.A. Brauner №2 Vëllimi I 2004 Procedurat e Fondit të Muzeut. A. A. Brauner Vëllimi I Nr. 2 2004 Revistë shkencore Themeluar në dhjetor 2003 Botuar 4 herë në vit Certifikata e regjistrimit shtetëror OD Nr. 913 datë 13.12.2003 Themelues dhe botues ... "

Shpikja lidhet me një metodë të fazës së ngurtë për sintezën e një peptidi të formulës H-D--Nal--Thr-NH2, e cila përdor aminoacide të mbrojtura nga Boc dhe Fmoc dhe një rrëshirë polistireni të klorometiluar. 10 z.p. f-ly.

Fusha e teknologjisë së cilës i përket shpikja

Shpikja e tanishme lidhet me një metodë për përgatitjen e një peptidi që përmban tre ose më shumë mbetje aminoacide, që ka një aminoacid N-terminal, një aminoacid të parafundit ngjitur me aminoacidin N-terminal dhe një aminoacid C-terminal.

Arti i mëparshëm

Sinteza e peptideve të fazës së ngurtë u prezantua në vitin 1963 për të kapërcyer shumë nga problemet e hapave të pastrimit të ndërmjetëm të lidhur me sintezën e solucionit të peptideve (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). Në sintezën e fazës së ngurtë, aminoacidet grumbullohen (p.sh., bashkohen) në një peptid në çdo sekuencë të dëshiruar, ndërsa një fund i zinxhirit (p.sh., C-terminus) është i lidhur me një bartës të patretshëm. Pasi sekuenca e dëshiruar të jetë montuar në bartësin (mbështetjen), peptidi më pas lirohet (dmth. shkëputet) nga transportuesi. Dy grupet standarde mbrojtëse për grupet α-amino të aminoacideve që do të lidhen janë Boc, i cili hiqet me një acid të fortë dhe Fmoc, i cili hiqet me një bazë. Shpikja e tanishme lidhet me një metodë të përshtatshme për prodhimin e peptideve duke përdorur një kombinim të të dyja këtyre mbrojtjeve për grupet α-amino në një sintezë në një rrëshirë të lirë nga polistireni i klorometiluar.

Gjatë projektimit të sintezës së peptideve të fazës së ngurtë duke përdorur ndonjë nga skemat e mësipërme të mbrojtjes α-amino, është e rëndësishme që çdo "grup anësor" reaktiv i aminoacideve që përbëjnë peptidin të mbrohen nga reaksionet kimike të padëshiruara gjatë montimit të zinxhirit. Është gjithashtu e dëshirueshme që grupet kimike të zgjedhura për të mbrojtur grupet e ndryshme anësore të mos hiqen nga reagentët që përdoren për të dembrojtur grupet .beta.-amino. Së treti, është e rëndësishme që lidhja e zinxhirit peptid në rritje me grimcën e rrëshirës të jetë rezistente ndaj reagentëve të përdorur në procesin e montimit të zinxhirit për të hequr çdo lloj mbrojtjeje α-amino. Në rastin e një skeme mbrojtjeje α-amino duke përdorur Fmoc, mbrojtja e grupit anësor duhet të jetë rezistente ndaj reagentëve alkaline të përdorur për të hequr Fmoc. Në praktikë, këto grupe mbrojtëse të zinxhirit anësor zakonisht hiqen me reagentë me aciditet të lehtë pasi të ketë përfunduar montimi i zinxhirit peptid. Nëse përdoret një skemë mbrojtëse e grupit β-amino duke përdorur Boc, mbrojtja e grupit anësor duhet të jetë rezistente ndaj reagentit me aciditet të dobët të përdorur për të hequr grupin Boc në çdo cikël. Në praktikë, këto grupe mbrojtëse të zinxhirit anësor në skemën e mbrojtjes β-amino me Boc zakonisht hiqen me HF anhydrous pasi të ketë përfunduar montimi i zinxhirit peptid. Kështu, në praktikë, grupet e mbrojtjes së zinxhirit anësor të përdorur zakonisht në skemën e mbrojtjes α-amino me Fmoc nuk janë të qëndrueshme në kushtet e përdorura për të çmbrojtur grupet α-amino me Boc. Prandaj, dy lloje të skemave të mbrojtjes për grupet α-amino nuk kombinohen gjatë montimit të zinxhirit peptid në sintezën e peptideve në fazën e ngurtë. Përveç kësaj, edhe pse rrëshira polimer më e lirë e përdorur në sintezën e peptideve (polistireni i klorometiluar ose "rrëshira Maryfield") përdoret gjerësisht së bashku me aminoacidet e mbrojtura nga grupet Boc, në literaturë është arritur në përfundimin se nuk është e zbatueshme në rastin e mbrojtjes. e grupeve α-amino me grupe Fmoc për shkak të paqëndrueshmërisë së tij në kushte alkaline (shih Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). Shpikja e tanishme ka për qëllim një metodë për bashkëpërdorimin e peptideve të caktuara në sintezën e fazës së ngurtë të aminoacideve të mbrojtura nga Boc dhe të mbrojtura nga Fmoc në një rrëshirë Merifield.

Lanreotide®, i cili është një analog i somatostatinës, njihet se frenon lirimin e hormonit të rritjes dhe gjithashtu pengon sekretimin e insulinës, glukagonit dhe ekzokrin pankreatik.

Patenta US Nr. 4,853,371 zbulon dhe pretendon Lanreotide®, një proces për përgatitjen e tij dhe një metodë për frenimin e sekretimit të hormonit të rritjes, insulinës, glukagonit dhe sekretimit ekzokrin pankreatik.

Patenta US Nr. 5147856 shpalos përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e ristenozës.

Patenta US Nr. 5411943 shpalos përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e hepatomës.

Patenta US Nr. 5073541 shpalos përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e kancerit të mushkërive.

Aplikimi për Patentën e SHBA Nr. 08/089410, i paraqitur më 9 korrik 1993, zbulon përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e melanomës.

US Pat., Nr. 5,504,069 shpalos përdorimin e Lanreotide® për të penguar rritjen e përshpejtuar të tumorit të ngurtë.

Aplikimi për Patentën e SHBA Nr. 08/854941, i paraqitur më 13 maj 1997, zbulon përdorimin e Lanreotide® për humbje peshe.

Aplikimi për Patentën e SHBA Nr. 08/854,943, i paraqitur më 13 maj 1997, zbulon përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e rezistencës ndaj insulinës dhe Sindromës X.

Patenta US Nr. 5688418 zbulon përdorimin e Lanreotide® për të zgjatur qëndrueshmërinë e qelizave pankreatike.

Aplikacioni PCT Nr. PCT/US 97/14154 shpalos përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e fibrozës.

Aplikimi për Patentën e SHBA Nr. 08/855311, i paraqitur më 13 maj 1997, zbulon përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e hiperlipidemisë.

Aplikimi për Patentën e SHBA Nr. 08/440061, i paraqitur më 12 maj 1995, zbulon përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e hiperamilinemisë.

Aplikimi për Patentën US Nr. 08/852221, i paraqitur më 7 maj 1997, zbulon përdorimin e Lanreotide® për trajtimin e hiperprolaktinemisë dhe prolaktinomave.

Thelbi i shpikjes

Shpikja e tanishme ofron një metodë për përgatitjen e një peptidi që përmban tre ose më shumë mbetje aminoacide, që ka një aminoacid N-terminal, një aminoacid të parafundit ngjitur me aminoacidin N-terminal dhe një aminoacid C-terminal, metoda në fjalë përfshin hapat e mëposhtëm:

(a) bashkimi i aminoacidit të parë me rrëshirën mbështetëse të ngurtë me anë të një lidhje eterike për të formuar produktin e parë të bashkimit, i cili përfshin (i) reagimin e një tretësire ujore të karbonatit të ceziumit me një tretësirë ​​alkoolike të aminoacidit të parë për të formuar një kripë ceziumi i aminoacidit të parë, (ii) marrja e një kripe ceziumi pa tretës të aminoacidit të parë, (iii) reaksioni i rrëshirës mbështetëse të ngurtë me kripën e ceziumit të aminoacidit të parë në një tretës aprotik polar të thatë (anhidër) për të formuar produkti i parë shtesë,

ku aminoacidi i parë korrespondon me aminoacidin C-terminal të peptidit, grupi amino i zinxhirit joanësor (kryesor) të aminoacidit të parë është i bllokuar nga Boc, dhe aminoacidi i parë nuk ka një grup funksional. në zinxhirin anësor që kërkon mbrojtje, dhe mbështetësja e ngurtë - rrëshira - është një rrëshirë e polistirenit të klorometiluar;

(b) dembrojtja (zhbllokimi) Boc nga produkti i bashkimit të parë me një acid për të formuar një produkt të debllokuar të hyrjes së parë;

(c) Opsionale, bashkimi i aminoacidit të radhës me produktin e lidhjes së parë të zhbllokuar, i cili përfshin reagimin e aminoacidit të ardhshëm me produktin e lidhjes së parë të zhbllokuar në një tretës organik që përmban një reagent të rritjes së peptideve për të marrë një produkt të ngjitjes së ardhshme të bllokuar (të mbrojtur). ku aminoacidi tjetër ka në zinxhirin kryesor një grup amino të bllokuar nga Boc, dhe nëse aminoacidi tjetër ka një ose më shumë grupe funksionale në zinxhirin anësor, atëherë grupet funksionale në zinxhirin anësor nuk kërkojnë mbrojtje ose grupet funksionale në zinxhirin anësor ka grupe mbrojtëse që janë rezistente ndaj reagentëve acidë ose alkaline që përdoren për të hequr mbrojtjen, përkatësisht, Boc dhe Fmoc;

(d) çmbrojtja e Boc nga addukti tjetër i bllokuar, i cili përfshin reagimin e aduktit të ardhshëm të bllokuar me një acid për të marrë një adukt tjetër të dembrojtur;

(e) opsionalisht, duke përsëritur hapat (c) dhe (d), me çdo cikël që gjeneron një produkt të lëshuar të (X+1)-të bashkëngjitëse të radhës, ku X është numri i përsëritjes së kërkuar të ciklit;

(f) shtimi i aminoacidit të radhës në produktin e lidhjes së parë të lëshuar nga hapi (b) ose, opsionalisht, në produktin tjetër të lidhjes së lëshuar (X+1) nga hapi (e), i cili përfshin reagimin e aminoacidit tjetër me në fjalë produkti i parë i bashkëngjitjes ose me produktin e specifikuar të debllokuar të lidhjes së ardhshme (X+1) në një tretës organik që përmban një reagjent për rritjen e peptidit për të marrë një produkt ngjitës të bllokuar (të mbrojtur) dhe aminoacidi tjetër ka një zinxhir kryesor amino grup i bllokuar nga Fmoc, me kusht që nëse aminoacidi tjetër ka një ose më shumë grupe funksionale në zinxhirin anësor, atëherë grupet funksionale në zinxhirin anësor nuk kërkojnë mbrojtje, ose grupet funksionale në zinxhirin anësor kanë grupe mbrojtëse që janë rezistent ndaj reagentëve alkaline të përdorur për të dembrojtur Fmoc;

(g) çmbrojtja e Fmoc nga addukti tjetër i bllokuar, i cili përfshin reagimin e aduktit të ardhshëm të bllokuar me një aminë parësore ose dytësore për të marrë një adukt tjetër të dembrojtur;

(h) opsionalisht, duke përsëritur hapat (e) dhe (g), me secilin cikël që gjeneron një produkt të zhbllokuar të (X+1) mbledhjes së radhës, ku X është numri i përsëritjes së nevojshme të ciklit, deri në atë të parafundit përfshihet në peptidin dhe aminoacidin e debllokuar;

(i) bashkimi i aminoacidit N-terminal me produktin e aderimit të ardhshëm të dembrojtur (X+1), i cili përfshin reagimin e aminoacidit N-terminal me produktin e dembrojtur (X+1) të hyrjes së radhës në një tretës organik që përmban një reagent për rritjen e peptideve, për të përftuar një produkt përfundimtar të bllokuar, ku aminoacidi N-terminal ka një grup amino shtyllë të bllokuar nga Boc ose Fmoc;

(j) çmbrojtja e Boc ose Fmoc nga produkti shtesë i bllokuar i përfunduar, që përfshin reagimin e produktit shtesë të përfunduar të bllokuar me një acid në rastin e Boc ose një bazë në rastin e Fmoc për të formuar produktin peptid të përfunduar në rrëshirë;

(j) nëse produkti peptid i kompletuar në rrëshirë ka grupe funksionale të zinxhirit anësor, atëherë dembrojtja opsionale e grupeve funksionale të zinxhirit anësor të produktit peptid të kompletuar në rrëshirë, e cila përfshin reagimin e produktit peptid të përfunduar në rrëshirë me reagjentë të përshtatshëm dembrojtës për të marrë produkti i përfunduar peptid i dembrojtur në rrëshirë; dhe

(k) ndarja e peptidit nga bartësi i rrëshirës së ngurtë të produktit peptid të kompletuar në rrëshirë ose produktit të përfunduar peptid mbi rrëshirën e dembrojtur për të marrë një peptid, i cili përfshin reagimin e produktit të përfunduar peptid mbi rrëshirë ose produktin peptid të përfunduar në rrëshirën e dembrojtur me amoniak , aminë primare ose aminë dytësore për përfundimin praktik të ndarjes së peptidit nga rrëshira;

me kusht që hapat (e) dhe (g) në sintezën e peptidit duhet të kryhen të paktën një herë.

I preferuar është procesi sipas shpikjes aktuale ku amoniaku, amina primare ose amina sekondare në hapin (k) është në një tretës që përmban një alkool dhe opsionalisht një tretës aprotik polar,

E preferuar është metoda sipas shpikjes aktuale, ku hapi (l) përfshin më tej hapat e mëposhtëm:

precipitimi i peptidit të shkëputur nga tretësi;

duke ndarë me filtrim suportin e rrëshirës së ngurtë dhe peptidin e precipituar, dhe

nxjerrja e peptidit me një tretësirë ​​acidike për të izoluar peptidin.

E preferuar është metoda sipas shpikjes aktuale, ku aminoacidi i parë është Boc-L-Thr.

Preferohet metoda sipas shpikjes aktuale, ku aminoacidi i parë është kripa e ceziumit e Boc-L-Thr, duke prodhuar rrëshirë Boc-L-Thr si produktin e parë të bashkimit dhe produkti i parë i bashkimit të çbllokuar është rrëshira H-L-Thr. .

I preferuar është procesi i shpikjes së tanishme ku acidi i përdorur për të hequr grupin mbrojtës Boc në hap(et) është acidi trifluoroacetik (TFA).

Metoda e preferuar, e lidhur me procesin menjëherë paraardhës, është kur tretësi organik është klorur metilen, kloroform ose dimetilformamid dhe reagjenti i rritjes së peptideve është diizopropilkarbodiimidi, diciklohekzilkarbodiimidi, ose N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil) .

Metoda e preferuar, në lidhje me metodën e mëparshme paraprake, është një metodë që përfshin kryerjen e hapave (e) dhe (g) gjashtë herë pas formimit të një produkti bashkues të parë të çbllokuar të formulës H-L-Thr-rrëshirë, ku aminoacidet pasuese janë bashkangjitur sipas rendit: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) dhe Fmoc-L- Cys(Acm) për të formuar produktin H-Cys( Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë.

Metoda e preferuar, në lidhje me metodën e mëparshme paraprake, është një metodë që përfshin shtimin e Boc-D--Nal në H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm) -Tnr-rrëshirë sipas hapit (c) për të marrë Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-rrëshirë.

Metoda e preferuar, e lidhur me metodën menjëherë paraardhëse, përfshin heqjen e njëkohshme të grupit Boc që mbron D--Nal, grupit O-t-Bu që mbron Tyr dhe grupit Boc që mbron Lys në Boc-D--Nal-Cys (Acm )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë sipas hapit (i), për të marrë një produkt peptid të kompletuar në rrëshirën e formulës H-D- - Nal-Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë.

Metoda e preferuar, e lidhur me metodën menjëherë paraardhëse, përfshin ndarjen e peptidit H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr nga rrëshira e ngurtë duke kryer reaksioni H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë me amoniak në një tretës që përmban një alkool dhe opsionalisht një tretës aprotik polar deri në eliminimin e plotë në thelb për të dhënë H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2.

Procesi i preferuar, i lidhur me procesin menjëherë paraardhës, është ku alkooli është metanol dhe tretësi aprotik polar është dimetilformamidi.

Metoda e preferuar, e lidhur me metodën menjëherë paraardhëse, përfshin heqjen e njëkohshme të grupeve Acm mbrojtëse të Cys dhe ciklimin e mbetjeve të çmbrojtura Cys që rezultojnë në produktin peptid të kompletuar të formulës H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 duke kryer reaksionin e H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr- NH 2 me një tretësirë ​​jodi në alkool deri në dembrojtje pothuajse të plotë dhe ciklizim për të dhënë H-D--Nal--Thr-NH2.

Metoda e preferuar, e lidhur me metodën menjëherë paraardhëse, është metoda ku peptidi është H-D--Nal--Thr-NH2.

Një metodë e preferuar, e lidhur me metodën menjëherë paraardhëse, është ajo ku peptidi është një analog i somatostatinës.

Termat e përdorur në përshkrimin e shpikjes aktuale përcaktohen si më poshtë:

"aminoacidi i parë": përfshin çdo aminoacid në të cilin grupi amino në zinxhirin kryesor (jo në zinxhirin anësor) mbrohet nga Boc, i cili është një produkt komercial ose mund të sintetizohet sipas metodave të njohura për një person me aftësi të zakonshme. në art, për shembull Boc-L-Thr;

"produkti i parë i bashkëngjitjes": përshkruan një produkt që është ngjitur në një rrëshirë mbajtëse të ngurtë që rezulton nga shtimi i një aminoacidi të parë në një rrëshirë mbajtëse të ngurtë, p.sh. rrëshirë Boc-L-Thr;

"produkti i parë i bashkimit të çbllokuar": përshkruan produktin që rezulton nga heqja ose heqja e grupit Boc nga produkti i parë i bashkimit - për shembull, rrëshira H-L-Thr, ku "H" është hidrogjeni i disponueshëm i grupit amino të zinxhir, që rezulton nga hapi i dembrojtjes;

"aminoacidi i ardhshëm": përshkruan çdo aminoacid në të cilin grupi amino në zinxhirin kryesor mbrohet nga Boc ose Fmoc, i cili është i disponueshëm në treg ose mund të sintetizohet sipas metodave të njohura për ata me aftësi të zakonshme në art. Meqenëse hapi (c) dhe hapi (e) mund të përfshihen në një cikël përsëritës ku hapi kryhet më shumë se një herë, çdo herë që kryhet hapi (c) ose hapi (e), "aminoacidi i ardhshëm" mund të zgjidhet në mënyrë të pavarur nga një grup i njohur ose i mundshëm për t'u sintetizuar aminoacide në të cilin grupi amino në zinxhirin kryesor është i mbrojtur nga Boc ose Fmoc;

"produkt i bllokuar i (X+1)-të aderimit të ardhshëm": përshkruan produktin e ngjitur në rrëshirën mbështetëse të ngurtë, e cila është rezultat i lidhjes së aminoacidit të ardhshëm me "produktin e zhbllokuar të aderimit të ardhshëm". Meqenëse hapat (c) dhe (d) dhe hapat (e) dhe (g) mund të përfshihen në një cikël përsëritës ku mund të bashkohen aminoacidet e mëposhtëm, termi "produkt i bllokuar i (X+1)-të lidhjes së ardhshme" i referohet produktit të marrë si rezultat i secilit prej cikleve të mëparshme të anëtarësimit;

"produkt i zhbllokuar i (X+1) aderimit të ardhshëm": përshkruan produktin që rezulton nga heqja e grupit Fmoc nga "produkti i bllokuar i aderimit të ardhshëm (X+1)";

"produkt peptid i kompletuar në rrëshirë": përshkruan një produkt peptid të bashkangjitur në një rrëshirë mbështetëse të ngurtë pasi një aminoacid N-terminal është ngjitur në zinxhirin peptid dhe pasi grupi amino i shtyllës kurrizore të aminoacideve N-terminale është dembrojtur ose debllokuar. , por që ende ka ndonjë grup mbrojtës në grupet funksionale të vargjeve anësore, të pa hequra nga reaksioni, duke kryer heqjen e grupit mbrojtës nga zinxhiri kryesor i aminoacidit N-terminal; dhe

"produkt peptid i kompletuar në një rrëshirë të dembrojtur": përshkruan një produkt peptid të bashkangjitur në një suport të ngurtë rrëshirë ku të gjitha grupet mbrojtëse janë hequr ose dembrojtur nga grupet funksionale të zinxhirëve anësor të aminoacideve.

Shembuj të acideve që mund të përdoren për të dembrojtur Boc janë acidi trifluoroacetik (TFA), acidi metansulfonik dhe tretësirat organike që përmbajnë HCl.

Shembuj të amineve primare dhe sekondare që mund të përdoren për të dembrojtur Fmoc janë 4-(aminometil)piperidina, piperidina, dietilamina, DBU dhe tris(2-aminoetil)amina.

Shembuj të bazave jo-nukleofile që mund të përdoren për të neutralizuar kripërat TFA të amino grupeve të çliruara (RNH 3 + CF 3 COO - këto kripëra duhet të shndërrohen në amina "të lira" (NH 2) përpara ose gjatë shtimit të aminoacidit të ardhshëm , përndryshe shtimi nuk do të bëhet) janë diizopropiletilamina (DIEA) dhe trietilamina (TEA).

Shembuj të tretësve organikë që mund të përdoren në reaksionet e shtimit të aminoacideve janë kloruri i metilenit, kloroformi, dikloroetani, dimetilformamidi, dietilacetamidi, tetrahidrofurani, acetati etilik, 1-metil-2-pirrolidoni, acetonitrili ose një kombinim i këtyre tretësve.

Shembujt e zgjeruesve të peptideve përfshijnë karbodiimidet e zëvendësuara si: diizopropilkarbodiimidi, diciklohekzilkarbodiimidi, ose N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimidi.

Grupet karboksil dhe grupet amino që marrin pjesë në formimin e një lidhjeje amide peptide referohen përkatësisht si një grup karboksil "zinxhiri anësor" ose grup amino. Nga ana tjetër, çdo grup funksional i aminoacideve që nuk marrin pjesë në formimin e një lidhjeje amide peptide quhen grupe funksionale të "zinxhirit anësor".

Termi "grup rezistent ndaj bazës" i referohet grupeve mbrojtëse të përdorura për të mbrojtur grupet funksionale të aminoacideve që (1) janë rezistente ndaj bazës, p.sh., nuk mund të hiqen nga baza të tilla si 4-(aminoetil)piperidina, piperidina ose tris(2). -aminoetil)aminë, të cilat janë baza që përdoren zakonisht për të hequr grupin mbrojtës Fmoc, dhe (2) mund të hiqet me një acid të tillë si acidi trifluoroacetik ose me një metodë tjetër si hidrogjenizimi katalitik.

Simbolet "Fmoc" dhe "Boc" përdoren këtu dhe në formulën shoqëruese për të treguar përkatësisht 9-fluorenilmetoksikarbonil dhe t-butiloksikarbonil.

Metoda e përshkruar më sipër mund të përdoret për të përgatitur peptide, mundësisht analoge të somatostatinës, si oktapeptidi Lanreotide®, i cili ka formulën e mëposhtme: H-D--Nal--Thr-NH2. Nëse H-D--Nal--Thr-NH 2 do të sintetizohet, grupet mbrojtëse rezistente ndaj bazës që përdoren për të mbrojtur grupet funksionale të zinxhirit anësor Cys, Lys dhe Tyr mund të jenë përkatësisht acetamidometil (Acm), Boc dhe tert-butil. Asm preferohet mbi Cys.

Me analog të somatostatinës nënkuptohet një peptid që shfaq një aktivitet biologjik të ngjashëm (d.m.th., agonist) ose të kundërt (d.m.th., antagonist) me atë të somatostatinës.

Në formulën H-D--Nal--Thr-NH2, secili nga simbolet e zakonshme të aminoacideve me tre shkronja (p.sh., Lys) i referohet një mbetjeje strukturore të aminoacideve. Për shembull, simboli Lys në formulën e mësipërme përfaqëson -NH-CH((CH 2) 4 NH 2)-CO-. Simboli D--Nal- përfaqëson mbetjen e aminoacideve D-2-naftilalanilil. Kllapat tregojnë një lidhje disulfide që lidh tiolet e lira të dy mbetjeve Cys në peptid, duke treguar se aminoacidet e peptidit brenda kllapave formojnë një cikël.

Bazuar në përshkrimin e dhënë këtu, një person i aftë në art do të jetë në gjendje të përdorë plotësisht shpikjen aktuale.

Përveç rasteve kur përcaktohet ndryshe, të gjithë termat teknikë dhe shkencorë të përdorur këtu kanë të njëjtin kuptim siç kuptohet zakonisht nga ata me aftësi të zakonshme në artin të cilit i përket shpikja aktuale. Përveç kësaj, të gjitha publikimet, aplikimet për patentë, patentat dhe referencat e tjera të cituara këtu janë përfshirë këtu duke iu referuar atyre.

Peptidi mund të përgatitet në përputhje me metodën e shpikjes aktuale sipas procedurës së mëposhtme.

Një tretësirë ​​prej 0,5 ekuivalente molare të karbonatit cezium në ujë i shtohet ngadalë një tretësire prej 1 ekuivalente molare të Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) ku AA 1 korrespondon me aminoacidin C-terminal të tretur në alkool, mundësisht. metanol. Përzierja që rezulton u trazua për rreth 1 orë në temperaturën e dhomës, më pas i gjithë alkooli dhe i gjithë uji u hoqën nën presion të reduktuar për të dhënë një pluhur të thatë të kripës së ceziumit Boc-AA 1. Rrëshira Merifield, 1.0 ekuivalente (polistireni i klor-metiluar, 200-400 rrjetë, inkorporimi i joneve të klorurit 1.3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky ose Polymer Laboratories, Church Stretton, Angli) lahet me një tretësirë ​​klorine, preferohet të lahet me klorin. ), një alkool, mundësisht metanol dhe një tretës aprotik polar, mundësisht dimetilformamid (DMF). Kripa cezium pluhur Boc-AA 1 shpërndahet në një tretës aprotik polar anhidër (të thatë), mundësisht DMF, dhe tretësira kombinohet me rrëshirën e larë më parë. Lluri përzihet lehtë në rreth 45°-65°C, mundësisht në 50°-60°C, për rreth 48 deri në 106 orë, mundësisht 85 deri në 90 orë, nën një atmosferë inerte si azoti. Rrëshira ndahet me filtrim dhe lahet tërësisht me një tretës aprotik polar, mundësisht DMF, ujë dhe në fund një alkool si MeOH. Rrëshira Boc-AA 1 thahet nën presion të reduktuar.

Rrëshira Boc-AA 1 futet në një reaktor qelqi me një fund filtri të bërë nga qelqi i shkrirë i trashë. Rrëshira lahet me një tretës të klorur si DCM, fshihet me një acid organik, mundësisht 25% TFA në DCM, lahet shkurtimisht me një tretësirë ​​të klorur si DCM dhe një alkool si MeOH, i neutralizuar me një bazë organike, mundësisht trietilaminë në DCM, dhe lahet përsëri me DCM dhe një tretës aprotik polar si DMF për të dhënë një rrëshirë AA 1 të dembrojtur.

Çdo numër i dëshiruar i aminoacideve më pas i bashkëngjitet opsionalisht rrëshirës AA 1 të dembrojtur. Nëse aminoacidi tjetër ka një grup α-amino me mbrojtje Fmoc (Fmoc-AA x), atëherë grupi i zinxhirit anësor ose nuk kërkon mbrojtje (për shembull, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe ose Fmoc- Thr) ose zinxhiri anësor bën.mbrojtur me një grup rezistent ndaj bazës. Një tepricë molare e Fmoc-AA x (ku x është numri i pozicionit të aminoacidit në peptid, i numëruar nga C-terminus) ngjitet për afërsisht 60 minuta në rrëshirën AA 1 të dembrojtur me një reagjent të rritjes së peptidit siç është diizopropilkarbodiimidi. (DIC), në një përzierje DCM/DMF. Rrëshira shtesë u la me DMF, alkool dhe DCM për të dhënë një rrëshirë Fmoc-AA x-AA 1. Lidhja mund të kontrollohet me metodën Kaiser ninhydrin. Më pas, rrëshira Fmoc-AA x-AA 1 lahet një herë me DMF dhe më pas debllokohet me një zgjidhje të një baze në një tretës organik si piperidina në DMF për të marrë një rrëshirë AA x-AA 1. Rrëshira AA x -AA 1 lahet më pas me DMF, e ndjekur nga larja disa herë me një alkool si MeOH dhe DCM. Rrëshira AA x -AA 1 lahet më pas një herë me DMF për rreth 3 minuta, tre herë me izopropanol, mundësisht për rreth 2 minuta çdo herë dhe tre herë me DCM, mundësisht për rreth 2 minuta çdo herë. Më pas rrëshira është gati për ngjitje të mëtejshme ose të një aminoacidi të mbrojtur nga Fmoc siç përshkruhet më sipër ose të një aminoacidi të mbrojtur nga Boc siç përshkruhet më poshtë.

Në mënyrë të ngjashme, nëse ndonjë aminoacid i mëpasshëm që do t'i bashkëngjitet rrëshirës së dembrojtur AA 1 zgjidhet me një grup Boc-amino të mbrojtur (Boc-AA x), atëherë ose nuk kërkohet mbrojtje për grupin e zinxhirit anësor (kjo mund të jetë Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe ose Boc-Thr), ose zinxhiri anësor duhet të mbrohet me një grup rezistent ndaj heqjes si nga acidi ashtu edhe nga baza, që mund të jetë Boc-Cys (Acm). Nëse zgjidhet Boc-AA x, ai ngjitet duke përdorur të njëjtët reagentë dhe tretës siç përshkruhet më sipër për Fmoc-aminoacidet dhe plotësia (përfundimi) i lidhjes mund të kontrollohet me metodën e ninhidrinës Kaiser. Më pas, rrëshira Boc-AA x-AA 1 është dembrojtur me një tretësirë ​​acidi në një tretës organik si TFA në DCM për të dhënë një rrëshirë CF 3 CO - H + -AA x -AA 1. Kjo rrëshirë më pas lahet disa herë me një tretës të klorur siç është DCM, një alkool si MeOH dhe neutralizohet me një bazë jo-nukleofile siç është trietilamina në DCM, dhe më pas lahet disa herë të tjera me një tretës të klorur siç është DCM për të dhënë AA x -AA 1 - rrëshirë. Më pas rrëshira është gati për ngjitjen e mëtejshme të aminoacidit të mbrojtur Boc ose Fmoc siç përshkruhet më sipër.

Në varësi të sekuencës së dëshiruar të peptidit dhe llojit të aminoacidit α-amino të mbrojtur të përdorur (qoftë i mbrojtur nga Fmoc ose i mbrojtur nga Boc), përdoret një kombinim i përshtatshëm i procedurave të ngjitjes së mësipërme, në varësi të cilit aminoacid do të ndodhë në sekuenca peptide - zinxhir anësor, që ka një grup mbrojtës që mund të hiqet ose me bazën e nevojshme për të hequr Fmoc nga grupi α-amino, ose me acidin e nevojshëm për të hequr Boc nga grupi α-amino. Një aminoacid i tillë i mbrojtur mund të jetë N-β-Boc-N″-β-Fmoc-lizina ose N-β-Fmoc-N″-β-Boc-lizina. Nëse është kështu, të gjitha grupet mbrojtëse të përzgjedhshme për grupet α-amino të aminoacideve pasuese, deri në aminoacidin N-terminal, duhet të jenë në përputhje me mbrojtjen e grupit anësor të zgjedhur për atë pozicion. Kjo do të thotë që grupet mbrojtëse të zinxhirit anësor duhet të jenë rezistente ndaj agjentit debllokues që përdoret për të dembrojtur grupet α-amino të aminoacideve pasuese. Për aminoacidin N-terminal, ose Boc ose Fmoc mund të përdoren si mbrojtje α-amino, pasi dembrojtja e aminoacidit N-terminal mund të çmbrojt njëkohësisht disa nga zinxhirët anësore të mbrojtura pa ndikuar në mënyrë të padëshirueshme në strategjinë e sintezës së peptideve, pasi nuk ka aminoacidet janë më të disponueshme, shtohen.

Zinxhiri i kompletuar peptid, i cili është ende i lidhur me rrëshirën, duhet të dembrohet dhe të lirohet. Për të hequr të gjitha grupet mbrojtëse rezistente ndaj bazës dhe grupin α-amino bllokues të aminoacidit N-terminal, nëse është e aplikueshme, peptidi në rrëshirë trajtohet me një acid në një tretës organik si TFA në DCM. Për të hequr çdo grup mbrojtës rezistent ndaj acidit dhe grupin α-amino bllokues të aminoacidit N-terminal, nëse është e aplikueshme, peptidi në rrëshirë trajtohet me një bazë organike si piperidina në DMF. Përndryshe, grupet rezistente ndaj acidit mund të mbahen derisa të hiqen pas ndarjes së mëvonshme të peptidit me amoniak ose një bazë amine. Peptidi në rrëshirën e dembrojtur më pas lahet me një tretës të klorur si DCM, një alkool si MeOH dhe thahet në peshë konstante nën presion të reduktuar.

Peptidi shkëputet nga rrëshira dhe fundi C shndërrohet në amid duke e pezulluar peptidin në rrëshirë në 3:1 MeOH/DMF. Lluri ftohet në një temperaturë nën rreth 10 ° C. nën një atmosferë azoti dhe gaz amoniak anhidrik futet nën sipërfaqen e tretësit derisa tretësira të jetë e ngopur me të, ndërsa temperatura mbahet nën rreth 10 ° C. Lluri përzihet lehtë për rreth 24 orë duke lejuar që temperatura të rritet në rreth 20°C. Shkalla e përfundimit të reaksionit kontrollohet me zhdukjen e ndërmjetësit metil ester në HPLC në kushte të përshtatshme në varësi të llojit të peptidit. Përzierja e reaksionit ftohet dhe sasia e kërkuar e amoniakut anhidrik shtohet derisa zona e pikut që korrespondon me metil esterin në HPLC të jetë më pak se 10% e sipërfaqes së pikut të produktit të dëshiruar. Slurri ftohet nën rreth 10° C. dhe përzierja vazhdon gjatë natës për të precipituar peptidin. Precipitati dhe rrëshira ndahen me filtrim dhe lahen me MeOH të ftohtë. Precipitati dhe rrëshira thahen nën presion të reduktuar, produkti nxirret nga rrëshira me një zgjidhje ujore të acidit acetik.

Nëse peptidi përmban mbetje të mbrojtura Cys në sekuencën e tij, grupet e tiolit mund të dembrojten dhe mbetjet të ciklizohen sipas procedurës së mëposhtme. Peptidi që përmban grupet e mbrojtura Asm të Cys shpërndahet në një tretësirë ​​ujore të acidit acetik nën një atmosferë azoti. Tretësira përzihet me shpejtësi dhe në një pjesë shtohet tretësira e jodit në alkool. Përzierja përzihet dhe kontrollohet me HPLC për dembrojtje të plotë. Më pas reaksioni ndërpritet me titrim me tretësirë ​​2% tiosulfat natriumi derisa të zhduket ngjyra e tretësirës. Përzierja e papërpunuar u pastrua me kromatografi përgatitore në një fishek C8 me një gradient acetonitrili në tampon 0.1 acetat amoniumi, u shkrip në një fishek C8 me një gradient acetonitrili në acid acetik 0.25 N dhe u liofilizua për të dhënë peptidin e synuar.

Një mishërim shembullor i shpikjes

Shembulli i mëposhtëm është dhënë për të ilustruar metodën e shpikjes aktuale dhe nuk duhet të interpretohet si kufizim i fushëveprimit të saj.

Shembulli 1. H2-D- -Nal--Thr-NH2

A) Boc-L-Thr-rrëshirë

Një tretësirë ​​prej 2,58 g karbonat ceziumi në 2,5 ml ujë u shtua ngadalë në një tretësirë ​​prej 3,48 g Boc-L-treonine (Bachem California, Torrance, CA) të tretur në 7 ml metanol. Përzierja që rezulton u trazua për rreth 1 orë në temperaturën e dhomës, më pas i gjithë metanoli dhe i gjithë uji u hoqën nën presion të reduktuar për të dhënë një pluhur të thatë të kripës së ceziumit Boc-L-treonine. 10 g rrëshirë Maryfield (polistiren klorometiluar, 200-400 rrjetë, inkorporim klori 1.3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) është larë me diklorometan (DCM), metanol (MeOH) dhe dimetilformamid (70 herë DMF) ml). Pluhuri i kripës së ceziumit Boc-L-threonine u tret në 60 ml DMF të thatë dhe tretësira u kombinua me rrëshirën e larë si më sipër. Lluri u trazua butësisht në një temperaturë prej afërsisht 50°-60°C për afërsisht 85 deri në 90 orë nën një atmosferë azoti. Rrëshira u nda me filtrim dhe u la mirë me DMF, ujë të dejonizuar dhe në fund me MeOH. Rrëshira Boc-threonine u tha nën presion të reduktuar në afërsisht 40°C. Përfshirja e treoninës ishte 0,85±0,15 meq/g rrëshirë e thatë.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë

2,0 g rrëshirë Boc-treonine nga hapi (A) u fut në një reaktor qelqi 50 ml me një fund filtri prej xhami të shkrirë të trashë (ngarkesa 1,74 mmol). Rrëshira u la 2 herë me DCM (20 ml), çdo herë për afërsisht 5 minuta, u zhbllokua me 25% TFA në DCM (30 ml) - herën e parë për afërsisht 2 minuta dhe herën e dytë për afërsisht 25 minuta, larë 3 herë për rreth 2 min DCM (20 ml), izopropanol (20 ml) dhe DCM (20 ml), neutralizuar dy herë për rreth 5 minuta me 10% trietilaminë në DCM (20 ml), larë 3 herë për rreth 2 min me DCM dhe lahet një herë me DMF (20 ml) për rreth 5 min.

Rrëshirës së debllokuar iu shtuan 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 eq.) Fmoc-L-cisteinë (Acm) (Bachem, CA) dhe 683 μl (4,35 mmol, 2,5 eq.) diizopropil-karbodiimide (DIC) në 14 ml DCM/DMF 2:1 për afërsisht 1 orë Pas shtimit, rrëshira u la një herë për rreth 3 minuta me DMF (20 ml), 3 herë për rreth 2 minuta me 2 min DXM (20 ml). Lidhja u kontrollua me metodën Kaiser nihydrin.

Pas ngjitjes, rrëshira u la 1 herë me DMF dhe më pas u debllokua me një tretësirë ​​të piperidinës në DMF. Rrëshira e debllokuar më pas u la me DMF dhe u la disa herë njëkohësisht me MeOH dhe DCM. Rrëshira e bashkimit u la 1 herë për rreth 3 minuta me DMF (20 ml), 3 herë për rreth 2 minuta me izopropanol (20 ml) dhe 3 herë me DCM (20 ml) për rreth 2 minuta çdo herë. Lidhja u testua me metodën e ninhidrinës Kaiser.

Secili nga aminoacidet e mëposhtëm të mbrojtur u ngjit në rrëshirën e larë duke përdorur DIC në DMF/DCM dhe u lëshua siç përshkruhet më sipër në sekuencën vijuese: Fmoc-L-valinë, Fmoc-L-lizinë (Boc), Fmoc-D-triptofan, Fmoc-L-tirozinë (O-t-Bu) dhe Fmoc-L-cisteinë (Acm) (të gjitha nga Bachem California), Boc-D-2-naftilalaninë (Synthethech, Albany, OR).

Zinxhiri peptid i përfunduar u zhbllokua dhe u mbrojt dy herë me 75:20:5 DCM/TFA/anisol (30 ml) për rreth 2 minuta dhe rreth 25 minuta, larë 3 herë për rreth 2 minuta çdo herë me DCM (20 ml), izopropanol. (10 ml) dhe DCM (20 ml), neutralizohen 2 herë për rreth 5 minuta me 10% trietilaminë në DCM (20 ml) dhe lahen 3 herë për rreth 2 minuta me DCM (20 ml) dhe MeOH (20 ml). Rrëshira u tha nën presion të reduktuar. Pesha e thatë ishte 3.91 g (103% e rendimentit teorik).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

2,93 g rrëshirë të ngarkuar me peptide nga hapi (B) (1,3 mmol-eq.) u pezullua në 50 ml të një përzierjeje 3:1 MeOH/DMF. Llushi u fto në një temperaturë nën rreth 10 ° C. nën një atmosferë azoti dhe gazi i thatë i amoniakut u pastrua derisa tretësira të ishte e ngopur me të, ndërsa temperatura u mbajt nën rreth 10 ° C. Lluri u trazua butësisht për rreth 24 orë, duke lejuar që temperatura të rritet në rreth 20°C. Shkalla e përfundimit të reaksionit u kontrollua nga zhdukja e ndërmjetësit metil ester duke përdorur HPLC (sorbent VYDAC®, madhësia e kokrrizave 5 μm, madhësia e poreve 100 Å, C18, elucioni në kushte isokratike 26% CH 3 CN në 0.1% TFA, shpejtësia 1 ml/min, duke regjistruar në 220 mm; në këto kushte, koha e vonesës Rt ~ 14 min për metil esterin dhe ~ 9,3 min për produktin amid). Përzierja e reaksionit u fto dhe një tepricë e amoniakut anhidrik u shtua derisa zona e pikut që korrespondon me metil esterin në HPLC ishte më pak se 10% e sipërfaqes së pikut të produktit të dëshiruar. Slurri u fto në një temperaturë nën rreth 10°C, përzierja vazhdoi gjatë natës për të precipituar peptidin. Precipitati dhe rrëshira u ndanë me filtrim dhe u lanë me 15 ml MeOH të ftohtë. Precipitati dhe rrëshira janë tharë nën presion të reduktuar, produkti është nxjerrë nga rrëshira me tretësirë ​​ujore 50% të acidit acetik (3 x 30 ml). Analiza HPLC tregoi 870 mg (0.70 mmol) të produktit të titullit në përzierje (96% i pastër në sistemin izokratik HPLC).

D) H-D- -Nal--Thr-NH 2

500 mg (0.40 mmol) të peptidit nga hapi (B) u shpërnda në 300 ml acid acetik 4% dhe u ngroh në rreth 55°C nën azot. Tretësira u trazua me shpejtësi dhe në një pjesë u shtua një solucion 2% w/v jodi në 7,7 ml MeOH (0,60 mmol). Përzierja u trazua për rreth 15 minuta, më pas reaksioni u ndal me titrim me tretësirë ​​2% tiosulfat natriumi derisa ngjyra të zhdukej (~2 ml). Përzierja ftohet në temperaturën e dhomës dhe filtrohet. Përzierja u pastrua me kromatografi përgatitore në një kolonë C8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) me një gradient acetonitrili në acetat amoniumi 0.1 M, i shkripëzuar në një kolonë C8 YMC me një gradient acetonitrili në acid acetik 0.25 N, dhe liofilizohet për të dhënë 350 mg peptid të synuar në pastërti 99%.

Bazuar në përshkrimin e mësipërm, një person i aftë në art mund të njohë lehtësisht tiparet thelbësore të shpikjes aktuale dhe, pa u larguar nga fryma dhe qëllimi i saj, të bëjë ndryshime dhe modifikime të ndryshme në shpikje për ta përshtatur atë me aplikime dhe kushte të ndryshme. Kështu, mishërimet e tjera të shpikjes mbulohen gjithashtu nga pretendimet.

KERKESE

1. Një metodë për përgatitjen e një peptidi të formulës H-D--Nal--Thr-NH2, metoda e përmendur që përfshin hapat e mëposhtëm:

(a) bashkimi i një aminoacidi të parë në një rrëshirë mbështetëse të ngurtë me anë të një lidhje eterike për të formuar një "produkt të parë të bashkimit", i cili përfshin (i) reagimin e një tretësire ujore të karbonatit cezium me një tretësirë ​​alkoolike të aminoacidit të parë për të formuar kripa e ceziumit e aminoacidit të parë, (ii) marrja e një kripe ceziumi pa tretës të aminoacidit të parë, (iii) reaksioni i rrëshirës mbështetëse të ngurtë me kripën e ceziumit të aminoacidit të parë në një tretës aprotik polar anhidër për të formuar një "produkti i parë shtesë",

ku aminoacidi i parë është Boc-L-Thr, i cili korrespondon me aminoacidin C-terminal të këtij peptidi dhe rrëshira e ngurtë e medias është një rrëshirë e polistirenit të klorometiluar;

(b) çmbrojtja e Boc nga produkti i parë shtesë me një acid për të formuar një "produkt shtesë të parë të dembrojtur";

(c) Opsionale, duke shtuar në "produktin e parë të bashkëngjitjes së debllokuar" "aminoacidin e ardhshëm", i cili përfshin reagimin e "aminoacidit të ardhshëm" me "produktin e parë të bashkëngjitjes së çbllokuar" në një tretës organik që përmban reagentin e rritjes së peptidit për të marrë "produkti i aminoacideve të ardhshëm të bllokuar". shtimi", dhe "aminoacidi i ardhshëm" ka një grup amino të bllokuar nga Boc në zinxhirin kryesor, dhe nëse ky "aminoacidi tjetër" ka një ose më shumë grupe funksionale në zinxhirin anësor, atëherë grupet funksionale në zinxhirin anësor nuk kërkojnë mbrojtje ose këto grupe funksionale në zinxhirin anësor kanë grupe mbrojtëse që janë të qëndrueshme ndaj agjentëve dembrojtës acidikë ose alkaline, përkatësisht Boc dhe Fmoc;

(d) çmbrojtja e Boc nga "produkti i ardhshëm i bllokuar" që përfshin reagimin e "produktit të ardhshëm të bllokuar" me një acid për të marrë një "produkt tjetër të zhbllokuar";

(e) opsionalisht, duke përsëritur hapat (c) dhe (d), me secilin cikël që prodhon një "produkt të zhbllokuar të (X+1) të bashkëngjitjes së radhës", ku X është numri i përsëritjeve të ciklit të dëshiruar;

(e) shtimi i "aminoacidit të ardhshëm" në "produktin e parë të lidhjes së zhbllokuar" nga hapi (b) ose, opsionalisht, te "produkti i zhbllokuar i lidhjes së ardhshme (X+1)" nga hapi (e), i cili përfshin kryerjen e reagimit "aminoacidi i radhës" me "produktin e zhbllokuar të lidhjes së parë" të specifikuar ose me "produktin e zhbllokuar të lidhjes së parë" të specifikuar në një tretës organik që përmban një reagent për rritjen e peptidit. për të marrë një "produkt të ngjitjes së ardhshme të bllokuar" dhe ky "aminoacidi i radhës" ka një amino grup të zinxhirit kryesor të bllokuar Fmoc, me kusht që nëse ai "aminoacidi tjetër" të ketë një ose më shumë grupe funksionale në zinxhirin anësor, atëherë grupet funksionale në zinxhirin anësor nuk kërkojnë mbrojtje, ose grupet funksionale në zinxhirin anësor kanë grupe mbrojtëse që janë rezistente ndaj reagentëve alkaline që përdoren për të dembrojtur Fmoc;

(g) çmbrojtja e "produktit të ardhshëm të bllokuar" Fmoc, i cili përfshin reagimin e "produktit të ardhshëm të bllokuar" me një aminë parësore ose dytësore për të marrë një "produkt tjetër të zhbllokuar";

(h) opsionalisht, duke përsëritur hapat (e) dhe (g), me secilin cikël që prodhon një "produkt të zhbllokuar të (X+1) të bashkëngjitjes së radhës", ku X është numri i dëshiruar i përsëritjeve të ciklit derisa ato të përfshihen në peptid dhe lirohet aminoacidi i parafundit;

(i) shtimi i një aminoacidi N-terminal në "produktin e zhbllokuar të (X+1)-të aderimit të radhës", i cili përfshin reagimin e aminoacidit N-terminal me "produktin e debllokuar të (X+1)-të të radhës aderimi" në një tretës organik që përmban një reagjent për shtrirjen e një peptidi për të formuar një "produkt të plotë të lidhjes së bllokuar" ku "aminoacidi N-terminal" ka një grup amino themelor të bllokuar nga Boc ose Fmoc;

(j) çmbrojtja e Boc ose Fmoc nga "produkti i përfunduar i bllokuar" që përfshin reagimin e "produktit të përfunduar të bllokuar" me një acid në rastin e Boc ose një bazë në rastin e Fmoc për të formuar produktin peptid të përfunduar në rrëshirë;

(j) nëse "produkti peptid i përfunduar me rrëshirë" ka grupe funksionale të zinxhirit anësor, atëherë në mënyrë opsionale dembrojtja e grupeve funksionale të zinxhirit anësor të "produktit peptid të përfunduar me rrëshirë", e cila përfshin reagimin e "produktit peptid të përfunduar me rrëshirë" me reagentët e duhur dembrojtës për të prodhuar një "produkt të plotë peptid mbi një rrëshirë të dembrojtur"; dhe

(k) ndarja e peptidit nga bartësi i rrëshirës së ngurtë të "produktit peptid të përfunduar në rrëshirë" ose "produktit peptid të finalizuar në rrëshirë të dembrojtur" për të marrë një peptid, i cili përfshin reagimin "produkt peptid të përfunduar në rrëshirë" ose "produkt peptid të përfunduar në rrëshirë"; rrëshirë e dembrojtur" me amoniak, një aminë parësore ose një aminë dytësore derisa ndarja e peptidit nga rrëshira të jetë pothuajse e plotë;

me kusht që hapat (e) dhe (g) në sintezën e peptidit të kryhen gjashtë herë pas formimit të "produktit të debllokuar të lidhjes së parë" të formulës H-L-Thr-rrëshirë, ku aminoacidet pasuese janë ngjitur në renditja: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) dhe Fmoc-L-Cys( Acm) për të formuar H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë.

2. Metoda sipas pretendimit 1, ku amoniaku, amina primare ose amina sekondare në hapin (k) është në një tretës që përmban një alkool dhe opsionalisht një tretës aprotik polar.

3. Metoda sipas pretendimit 1, ku hapi (l) përfshin më tej hapat e mëposhtëm:

(i) precipitimi i peptidit të shkëputur nga tretësi;

(ii) filtrimi i mbështetjes së rrëshirës së ngurtë dhe peptidit të precipituar, dhe

(iii) nxjerrja e peptidit me një tretësirë ​​acidike për të izoluar peptidin.

4. Metoda sipas secilit prej pretendimeve 1 deri në 3, ku aminoacidi i parë është kripa e ceziumit e Boc-L-Thr, duke prodhuar rrëshirë Boc-L-Thr si produktin e parë të bashkimit dhe "produktin e parë të bashkimit të çbllokuar "është rrëshirë H-L-Thr.

5. Metoda sipas pretendimit 4, ku acidi i përdorur për të hequr grupin mbrojtës Boc në hapin (i) është acidi trifluoroacetik (TFA).

6. Metoda sipas pretendimit 5, ku tretësi organik është klorur metilen, kloroform, ose dimetilformamid, dhe reagjenti i rritjes së peptidit është diizopropilkarbodiimid, diciklohekzilkarbodiimid, ose N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil.)karbodiimid.

7. Metoda sipas pretendimit 6, që përfshin bashkimin e Boc-D--Nal me rrëshirën H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr sipas hapit (i) për të përftuar Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë.

8. Metoda sipas pretendimit 7, që përfshin heqjen e njëkohshme të grupit Boc që bllokon D- -Nal, grupit O-t-Bu që mbron Tyr, dhe grupit Boc që mbron Lys në Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë, sipas hapit (d) për të marrë një produkt peptid të kompletuar në rrëshirën e formulës H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë.

9. Metoda sipas pretendimit 8, që përfshin ndarjen e peptidit H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr nga rrëshira e ngurtë duke kryer reaksionin H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-rrëshirë me amoniak në një tretës që përmban një alkool dhe opsionalisht një tretës aprotik polar deri në eliminimin e plotë të konsiderueshëm për të dhënë H-D--Nal -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2.

10. Procesi sipas pretendimit 9, ku alkooli është metanol dhe tretësi aprotik polar është dimetilformamid.

11. Metoda sipas pretendimit 10, që përfshin heqjen e njëkohshme të grupeve Acm që mbrojnë Cys dhe ciklimin e mbetjeve të çmbrojtura Cys që rezultojnë në "produktin e plotë peptid mbi rrëshirën" e formulës H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 duke kryer reaksionin e H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 me një tretësirë ​​jodi në alkool për të përfunduar ndjeshëm dembrojtjen dhe ciklimin për të dhënë H-D--Nal--Thr-NH2.

Sinteza e peptideve të fazës së ngurtë u propozua nga R. B. Merrifield i Universitetit Rockefeller (Çmimi Nobel 1984). Kjo metodë bazohet në montimin e një peptidi në një mbështetje polimerike të patretshme me shtimin sekuencial të mbetjeve të aminoacideve me α-amino dhe grupe anësore të mbrojtura. Plani ishte që të mblidhej zinxhiri peptid në faza, me zinxhirin që të kishte një fund të bashkangjitur në një mbështetje të fortë gjatë sintezës. Si rezultat, izolimi dhe pastrimi i derivateve peptide të ndërmjetme dhe të synuara u reduktua në një filtrim të thjeshtë dhe larje të plotë të polimerit të ngurtë për të hequr të gjithë reagentët dhe nënproduktet e tepërta të mbetura në tretësirë.

Termi fazë e ngurtë më tepër i referohet karakteristikave fizike të substancës në bartës, pasi reaksioni kimik në bartësin e polimerit vazhdon në një fazë - në tretësirë. Në një tretës të përshtatshëm, polimeri bymehet, duke u shndërruar në një xhel me viskozitet të ulët, por shumë të strukturuar (polimere të ndërlidhura), ose tretet (në rastin e polimerëve pa lidhje të kryqëzuara), dhe procesi i sintezës ndodh në një nivel ultramicerogjen, praktikisht. sistem homogjen.

Sinteza organike në fazë të ngurtë kërkon një bazë polimer - rrëshirë S të cilit lidhësi është i bashkangjitur L. Në fazën e parë një molekulë e substratit është ngjitur me lidhësin POR.Molekula POR imobilizuar (d.m.th. pushon së qeni i lëvizshëm), por ruan aftësinë për të reaguar me një reagent tjetër AT(faza 2).

Produkt AB mbetet në rrëshirë, duke e lejuar atë të ndahet nga reagenti i tepërt AT(dhe nënproduktet) me larje të thjeshtë. (Mund të shtoni të gjithë reagentët e rinj, duke komplikuar në mënyrë të njëpasnjëshme substratin origjinal POR, kryesorja është që lidhësi të mbetet i pandryshuar në këto reagime). Lidhës dyfunksional L zgjidhet në mënyrë që lidhja e saj me rrëshirën S ishte më e qëndrueshme sesa me nënshtresën POR. Pastaj në fazën e fundit përbërja e synuar AB mund të ndahet nga rrëshira, duke shkatërruar lidhjen e saj me lidhësin. Është e qartë se lidhja L-AB duhet të copëtohet në kushte të buta pa dëmtuar as vetë përbërjen (lidhja POR-AT), as kontakti i lidhësit me rrëshirën (lidhja L-S).

Kështu, në mënyrë ideale, duke larë rrëshirën pas çdo hapi dhe duke shkëputur lidhjen me bartësin, përftohet një substancë e pastër. Është e natyrshme të supozohet se përdorimi i një tepricë të madhe të reagentëve dhe ndarja e mëvonshme nga rrëshira në shumë raste bën të mundur zhvendosjen e ekuilibrit kimik drejt formimit të produktit të synuar dhe zvogëlimin e kohës së sintezës. Disavantazhet e sintezës organike në fazën e ngurtë përfshijnë nevojën për të përdorur një tepricë mjaft të madhe (2-30 ekuivalente) të reagentëve, vështirësitë në identifikimin e produkteve të sintezës së ndërmjetme dhe koston relativisht të lartë të mbështetësve polimer të modifikuar, e cila përcaktohet nga kostoja e lidhësi.

I futur nga Merrifield në praktikën e sintezës organike, klorometil polistireni (i ndërlidhur me një sasi të vogël divinilbenzene), e ashtuquajtura rrëshirë Merrifield, është më i arritshëm nga bartësit e polimerit.

Metodologjia dhe fazat kryesore të sintezës së peptideve në fazë të ngurtë

Detyra në fjalë kërkon futjen e një bartësi polimeri me një aminoacid të shartuar në një reaksion me një heterocikël të aktivizuar për zëvendësim. Le të shqyrtojmë më në detaje aspektin metodologjik të marrjes së aminoacideve të imobilizuara në transportuesit polimerë.

Fazë1. Imobilizimi i një aminoacidi të mbrojtur nga N në një bartës polimer.

Faza e parë e skemës sonë është imobilizimi i aminoacidit në një bartës polimer. Për të shmangur procese të tilla anësore si formimi i oligopeptideve, aminoacidi mbrohet paraprakisht. Në mënyrë tipike, përdoren aminoacide të mbrojtura nga N dhe lidhja që rezulton midis aminoacidit dhe transportuesit është e llojit amide ose ester.

Mbrojtjet më të përdorura të amino grupeve në sintezën organike në fazën e ngurtë janë grupet mbrojtëse të tipit karbamate tert-butoksikarbonil (Boc) dhe mbrojtja 9H-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc), X është grupi i mbrojtur:

Duhet të theksohet se zgjedhja e grupit mbrojtës përcaktohet nga lloji i bartësit të polimerit të përdorur. Kushtet për imobilizimin e aminoacideve të mbrojtura janë të ndryshme për lloje të ndryshme të bartësve polimerë. Imobilizimi i aminoacideve Boc në rrëshirën Merrifield, i cili është një polistiren i klorometiluar, kryhet. në vend si kripëra ceziumi me shtimin e një suspensioni të karbonatit të ceziumit në dimetilftalat (DMF) dhe sasive katalitike të jodur kaliumit. Teprica e reagentëve në raport me sasinë e bartësit zgjidhet në çdo rast individualisht dhe arrin në 1,5-4 ekuivalente.

Imobilizimi i Fmoc-aminoacideve në një bartës polimer Wang (X=O) për të formuar një lidhës ester të tipit benzil kryhet me metodën e karbodiimidit duke përdorur diizopropilkarbodiimid (DIC) në prani të 4-(dimetilamino)piridinës (DMAP) si katalizator. Reaksioni i imobilizimit me aminoacide sterike të papenguara vazhdon në temperaturën e dhomës. Imobilizimi i aminoacideve të penguara sterikisht kërkon kryerjen e reaksionit në 40-60°C për 2 ditë dhe përsëritjen e imobilizimit (Skema 1). Imobilizimi i Fmoc - aminoacidet në një bartës polimeri Rink (X=NH) me formimin e një lidhësi amid të tipit benzhidril kryhet në prani të një reagenti Castro (1H-1,2,3-benzotriazol-1-iloksi) tris-(dimetilamino)fosfonium heksafluorofosfat (BOP), baza diizopropiletilamine (DIEA) dhe 1-hidroksibenzotriazol (HOBt), si katalizator. Reaksioni vazhdon në temperaturën e dhomës për 2 orë për aminoacide të papenguara sterike dhe 4-6 orë për aminoacide të penguara sterikisht.

Faza 2Dembrojtja e një aminoacidi të mbrojtur në një bartës polimer

Në fazën e dytë të planifikuar nga ne (pas imobilizimit të aminoacidit të mbrojtur), kërkohet heqja e grupit mbrojtës për të aktivizuar grupin amino. Metodat për heqjen e mbrojtjes Boc- dhe Fmoc janë të ndryshme. Heqja e mbrojtjes Boc të aminoacideve në rrëshirën Merrifield kryhet me acid trifluoroacetik 50% në diklormetan për gjysmë ore, në këto kushte lidhësi Merrifield mbetet i paprekur.

Pas dembrojtjes, rrëshira lahet me një zgjidhje të trietilaminës për të hequr acidin trifluoroacetik. Heqja e mbrojtjes Fmoc të aminoacideve në transportuesit Wang (X=O) dhe Rink (X=NH) kryhet me një zgjidhje 20% të piperidinës në DMF për 40-50 min.

Një rënie e konsiderueshme e peshës së rrëshirës pas heqjes së mbrojtjes Fmoc mund të shërbejë si bazë për përcaktimin gravimetrik të shkallës së imobilizimit të aminoacideve të mbrojtura në fazën e parë të sintezës së fazës së ngurtë. Rekomandohet që në mënyrë sekuenciale të trajtohet rrëshira me një zgjidhje të piperidinës në dimetil ftalat, së pari për 5-10 minuta, pastaj 30 minuta në një zgjidhje të freskët. Pas dembrojtjes, rrëshira lahet të paktën 4 herë me dimetil ftalat për të hequr produktet e shkatërrimit të mbrojtjes Fmoc. Monitorimi i progresit të reaksionit të acilimit në bartës ose heqja e funksionit mbrojtës nga grupi amino është i mundur duke përdorur testin Kaiser.

Faza 3Zëvendësimi nukleofilik në heterocikle që përfshijnë një aminoacid të imobilizuar në një mbështetje

Faza tjetër e planifikuar nga ne për zbatim praktik është reaksioni aromatik i zëvendësimit nukleofilik; aminoacidi i shartuar shërben si nukleofil dhe heterocikli i aktivizuar është në tretësirë. Shumica e reaksioneve të zëvendësimit nukleofilik në mbështetëse nuk ndryshojnë në performancë nga reaksionet në fazën e lëngshme. Sidoqoftë, duhet të kihet parasysh se temperatura e procesit nuk duhet të kalojë 120 С, mbi të cilën baza e polistirenit të bartësit fillon të prishet. Në kushtet e reagimit të kryer në transportues, lidhësi gjithashtu duhet të ruhet.

Gjatë zgjedhjes së substrateve të përshtatshme heterociklike të aktivizuara, duhet të merret parasysh natyra e grupit të largimit në heterociklik.

Faza 4Heqja e përbërjes së synuar nga bartësit polimerë

Shumica e lidhësve në sintezën organike të fazës së ngurtë çahen në një mjedis acid. Rezistenca e lidhësve ndaj acidit bie ndjeshëm kur kalon nga rrëshira Merrifield në rrëshirën Wang dhe Rink. Lidhësi Rink çahet në kushte më të buta (10–20% CF3COOH) sesa lidhësi Wang (50% CF3COOH). Rrëshira Merrifield është pasive në këto kushte dhe transesterifikimi në tretësirën NaOMe/MeOH përdoret për ta çarë atë, duke çuar në formimin e një ester acidi.

Kujtojmë edhe një herë se natyra e lidhësit përcakton llojin e funksionit terminal në molekulën e formuar të hequr nga nënshtresa. Rrëshira e Wang ju lejon të merrni acide, dhe rrëshira e Rink - amide.

Përparësitë e kësaj skeme të sintezës së peptideve në fazë të ngurtë:

1. Komponime të ndryshme mëmë mund të shoqërohen me rruaza individuale. Këto granula më pas përzihen dhe kështu të gjitha përbërjet fillestare mund të ndërveprojnë me reagjentin në një eksperiment. Si rezultat, produktet e reagimit formohen në granula të veçanta. Në shumicën e rasteve, përzierja e lëndëve të para në kiminë tradicionale të lëngshme zakonisht çon në dështime - polimerizim ose gomim të produkteve. Eksperimentet në një substrat të ngurtë i përjashtojnë këto efekte.

2. Për shkak se lëndët e para dhe produktet janë të lidhura me suportin e ngurtë, reaktantët e tepërt dhe produktet jo-mbështetës mund të lahen lehtësisht nga mbështetësi i ngurtë polimer.

3. Tepricat e mëdha të reagentëve mund të përdoren për të çuar reaksionin drejt përfundimit (më shumë se 99%) pasi këto teprica ndahen lehtësisht.

4. Duke përdorur vëllime të ulëta të grupeve (më pak se 0,8 mmol për gram mbështetje), mund të shmangen reaksionet anësore të padëshiruara.

5. Ndërmjetësit në përzierjen e reaksionit lidhen me granula dhe nuk kanë nevojë të pastrohen.

6. Rruazat individuale të polimerit mund të ndahen në fund të eksperimentit dhe kështu fitohen produkte individuale.

7. Nënshtresa polimer mund të rigjenerohet në ato raste kur zgjidhen kushtet e thyerjes dhe zgjidhen grupet e duhura të ankorimit - lidhësit.

8. Automatizimi i sintezës së fazës së ngurtë është i mundur.

Kushtet e nevojshme për sintezën e fazës së ngurtë, përveç pranisë së një substrati polimer të patretshëm që është inert në kushtet e reaksionit, janë:

Prania e një ankorimi ose lidhësi është një funksion kimik që siguron lidhjen e substratit me përbërjen e aplikuar. Duhet të lidhet në mënyrë kovalente me rrëshirën. Spiranca duhet të jetë gjithashtu një grup funksional reaktiv në mënyrë që nënshtresat të ndërveprojnë me të.

Lidhja e formuar ndërmjet substratit dhe lidhësit duhet të jetë e qëndrueshme në kushtet e reaksionit.

Duhet të ketë mënyra për të prishur lidhjen e produktit ose të ndërmjetëm me lidhësin.