Synteza w fazie stałej lub technologia fazy stałej, zwana często ceramiką, jest najbardziej rozpowszechniona w produkcji materiałów nieorganicznych dla różnych gałęzi nauki i przemysłu. Obejmują one paliwo jądrowe, materiały dla technologii kosmicznej, radioelektronikę, oprzyrządowanie, katalizatory, materiały ogniotrwałe, nadprzewodniki wysokotemperaturowe, półprzewodniki, ferro- i piezoelektryki, magnesy, różne kompozyty i wiele innych.

Synteza w fazie stałej opiera się na reakcjach chemicznych, w których co najmniej jeden z reagentów występuje w postaci stałej. Takie reakcje nazywane są heterogenicznymi lub w fazie stałej. Oddziaływanie w fazie stałej, w przeciwieństwie do reakcji w ośrodku ciekłym lub gazowym, składa się z dwóch podstawowych procesów: od samej reakcji chemicznej i przejścia materii do strefy reakcji.

Reakcje w stanie stałym z udziałem składników krystalicznych charakteryzują się ograniczoną ruchliwością ich atomów lub jonów oraz złożoną zależnością od wielu czynników. Należą do nich takie jak budowa chemiczna i związana z nią reaktywność reagujących ciał stałych, charakter i stężenie defektów, stan powierzchni i morfologia strefy reakcji, powierzchnia kontaktu oddziałujących odczynników, wstępna aktywacja mechanochemiczna oraz szereg inni. Wszystko to determinuje złożoność mechanizmów reakcji heterogenicznych. Badanie reakcji heterogenicznych opiera się na chemii ciała stałego, fizyce chemicznej i chemii fizycznej powierzchni ciał stałych, na prawach termodynamiki i kinetyki.

Często mechanizm reakcji w stanie stałym jest oceniany tylko na podstawie tego, że dane eksperymentalne dotyczące stopnia interakcji w funkcji czasu najlepiej opisuje dowolny konkretny model kinetyczny i odpowiadające mu równanie kinetyczne. Takie podejście może prowadzić do błędnych wniosków.

Procesy w materiałach w stanie stałym mają wiele istotnych różnic w stosunku do procesów w cieczach lub gazach. Różnice te związane są przede wszystkim ze znacznie (o kilka rzędów wielkości) mniejszą szybkością dyfuzji w ciałach stałych, co uniemożliwia uśrednienie stężeń składników w układzie, a tym samym prowadzi do przestrzennej lokalizacji zachodzących procesów. Z kolei lokalizacja przestrzenna powoduje, że zarówno szybkość właściwa procesu (lub współczynnik dyfuzji), jak i geometria strefy reakcji składają się na obserwowaną kinetykę procesów. Takie cechy procesów w fazie stałej określone czynnikami geometrycznymi nazywane są topochemicznymi. Ponadto, ponieważ omawiane przemiany są zlokalizowane przestrzennie, ich szybkość może być determinowana zarówno przez same procesy na granicy faz (sterowanie reakcją), jak i przez szybkość dostarczania dowolnego składnika do tej granicy lub usuwania produktu ( s) (kontrola dyfuzji). Te przypadki dla układów prostych, dla których spełnione są założenia modelu, można zidentyfikować eksperymentalnie w postaci zależności stopnia konwersji od czasu. Inna cecha przemian fazowych w ciałach stałych związana jest z faktem, że tworzenie się nowego jądra fazowego w osnowie stałej powoduje pojawienie się w niej naprężeń sprężystych, których energia w niektórych przypadkach musi być uwzględniona przy rozważaniu termodynamiki z tych przemian.

Duża liczba czynników wpływających na kinetykę procesów w fazie stałej oraz mikrostrukturę otrzymanych w ten sposób materiałów determinuje również wielość rodzajów klasyfikacji tych procesów. Tak więc, biorąc pod uwagę stabilność układu względem fluktuacji różnego typu, heterogenicznych (w przypadku układów stabilnych do małych wahań zajmowanej objętości i niestabilnych do dużych wahań) i jednorodnych (w przypadku układów niestabilnych do niewielkich fluktuacji) wyróżnia się procesy. Dla procesów heterogenicznych jako przykład można podać przemiany przebiegające zgodnie z mechanizmem powstawania i wzrostu jąder, dla procesów jednorodnych niektóre przejścia porządek-nieuporządkowanie oraz rozkład spinodalny roztworów stałych.

Konieczne jest rozróżnienie zarodkowania heterogenicznego i jednorodnego od procesów heterogenicznych i jednorodnych w przypadku procesów heterogenicznych. Zarodkowanie heterogeniczne odnosi się do tworzenia się jąder na defektach strukturalnych (w tym defektach punktowych, dyslokacjach i granicach faz); zarodkowanie jednorodne - powstawanie zarodków w wolnej od defektów objętości fazy stałej.

Analizując produkt przemiany w fazie stałej, rozróżnia się jądra jednofazowe i wielofazowe. W przypadku jąder wielofazowych produktem procesu jest wielofazowa kolonia o charakterystycznej mikrostrukturze określonej przez energię powierzchniową granicy powstających faz; procesy tego typu nazywane są nieciągłymi, w przeciwieństwie do procesów ciągłych w przypadku powstawania i wzrostu jąder jednofazowych.

Inny sposób klasyfikacji przemian w fazie stałej opiera się na porównaniu składu fazy początkowej i składu produktu reakcji. Jeśli się pokrywają, mówią o procesach wolnych od dyfuzji, a jeśli zmienia się skład, mówią o dyfuzji. Ponadto warto odróżnić od procesów niedyfuzyjnych procesy kooperacyjne (np. przemianę martenzytyczną), które zachodzą poprzez jednoczesne niewielkie przemieszczanie się atomów w dużej objętości fazy początkowej.

Bezdyfuzyjne przemiany fazowe mogą różnić się rodzajem zmieniających się w trakcie procesu właściwości termodynamicznych.

Przemiany pierwszego rodzaju to procesy, w których następuje zmiana pochodnych potencjału chemicznego względem temperatury lub ciśnienia. Oznacza to nagłą zmianę podczas przejścia fazowego takich parametrów termodynamicznych, jak entropia, objętość, entalpia i energia wewnętrzna. Podczas przemian drugiego rodzaju nie zmieniają się pierwsze pochodne potencjału chemicznego względem parametrów intensywnych, natomiast zmieniają się pochodne wyższych rzędów (począwszy od drugiego). W procesach tych, przy ciągłej entropii i objętości układu, następuje gwałtowna zmiana wielkości wyrażonych drugimi pochodnymi energii Gibbsa: pojemności cieplnej, współczynnika rozszerzalności cieplnej, ściśliwości itp.

Reakcje w fazie stałej między dwiema fazami (kontakty między trzema lub więcej fazami są mało prawdopodobne, a odpowiadające im procesy można przedstawić jako kombinację kilku reakcji dwufazowych) są procesami dyfuzji i mogą być heterogeniczne lub jednorodne, z zarodkowaniem zarówno heterogenicznym, jak i jednorodnym . Procesy jednorodne i procesy z jednorodnym zarodkowaniem w takich reakcjach są możliwe na przykład w przypadku tworzenia metastabilnego roztworu stałego z jego późniejszym rozkładem (tzw. Reakcje wewnętrzne). Przykładem takich procesów może być utlenianie wewnętrzne.

Warunkiem równowagi termodynamicznej w przemianie w stanie stałym, jak w każdej innej przemianie chemicznej, jest równość potencjałów chemicznych składników w materiałach wyjściowych i produktach reakcji. Kiedy dwie fazy stałe oddziałują na siebie, tę równość potencjałów chemicznych można zrealizować na różne sposoby: 1) redystrybucja składników w początkowych fazach z tworzeniem roztworów stałych; 2) tworzenie się nowych faz o odmiennej strukturze krystalicznej (co w rzeczywistości nazywa się zwykle reakcją w fazie stałej), a ponieważ potencjał chemiczny składnika w różnych fazach układu wielofazowego nie zależy od ilości każdej fazie równowagę można osiągnąć tylko przy całkowitym przekształceniu faz początkowych. Najbardziej wiarygodne informacje o mechanizmie reakcji w fazie stałej uzyskuje się przy użyciu kompleksowego zastosowania, które umożliwia jednoczesną obserwację kilku parametrów układu reagującego, w tym składu fazowego, efektów termicznych, zmian masy i innych.

Termodynamiczna teoria reakcji w stanie stałym została zaproponowana przez Wagnera i rozwinięta przez Schmalzrieda na przykładzie reakcji addycji.

Do tej pory nie ma jednolitej klasyfikacji szerokiej gamy reakcji heterogenicznych. Wynika to z trudności w doborze kryterium jako podstawy takiej uniwersalnej klasyfikacji. Według kryteriów chemicznych reakcje dzieli się na reakcje utleniania, redukcji, rozkładu, łączenia, wymiany itp. Wraz ze wskazanym kryterium jest ono szeroko stosowane jako główne kryterium stanu fizycznego odczynników:

Cechą charakterystyczną wszystkich reakcji heterogenicznych jest istnienie i lokalizacja na granicy faz strefy reakcji. Strefa reakcji z reguły o małej grubości oddziela dwa obszary przestrzeni zajmowane przez substancje o różnym składzie io różnych właściwościach. Przyczyny powstawania strefy reakcji dzieli się zazwyczaj na dwie grupy: względna powolność procesów dyfuzyjnych oraz przyczyny chemiczne. Ostatnia grupa wynika z dużej reaktywności atomów lub cząsteczek znajdujących się na powierzchni stałego odczynnika lub na granicy między dwiema istniejącymi fazami. Wiadomo, że powierzchnia substancji stałej lub ciekłej ma właściwości różniące się od właściwości objętościowych zwartej próbki. Dzięki temu właściwości interfejsu są specyficzne. To tutaj następuje znaczące przegrupowanie upakowania kryształów, zmniejszają się naprężenia między dwiema sieciami krystalicznymi i zmienia się skład chemiczny.

Ponieważ przenoszenie masy odbywa się na drodze dyfuzji, a ruchliwość dyfuzyjna cząstek stałych zależy od defektowości ich struktury, można spodziewać się istotnego wpływu defektów na mechanizm i kinetykę reakcji w fazie stałej. Ten etap poprzedza chemiczny etap transformacji reagentów na granicy faz. Zatem o kinetyce reakcji heterogenicznych decyduje zarówno charakter przebiegu samej reakcji chemicznej, jak i sposób dostarczania substancji do strefy reakcji. Zgodnie z powyższym szybkość reakcji będzie ograniczona stopniem chemicznym (kinetyka chemiczna) lub dyfuzją (kinetyka dyfuzji). Takie zjawisko obserwuje się w rzeczywistości.

Według Wagnera dyfuzja, a co za tym idzie, reakcja w ciałach stałych odbywa się głównie dzięki ruchliwości jonów i elektronów, ze względu na stan nierównowagi sieci. Różne jony sieci poruszają się w niej z różnymi prędkościami. W szczególności ruchliwość anionów w zdecydowanej większości przypadków jest znikoma w porównaniu z ruchliwością kationów. Dlatego dyfuzja i odpowiednio reakcja w ciałach stałych odbywa się z powodu ruchu kationów. W tym przypadku dyfuzja różnych kationów może przebiegać w tym samym kierunku lub ku sobie. W przypadku kationów o różnym ładunku elektroobojętność układu jest zachowana dzięki ruchowi elektronów. Ze względu na różnicę szybkości ruchu kationów o różnym ładunku, w układzie powstaje potencjał elektryczny. W rezultacie zmniejsza się szybkość ruchu bardziej mobilnych jonów i odwrotnie, dla mniej mobilnych? wzrasta. W ten sposób powstały potencjał elektryczny reguluje szybkość dyfuzji jonów. Ta ostatnia i określona przez nią szybkość całego procesu przemiany w stan stały może być obliczona na podstawie przewodności elektronowej i liczb przejścia. Oczywiście ukierunkowana dyfuzja jonów jest możliwa tylko w polu elektrycznym lub przy obecności gradientu stężeń w układzie.

W syntezie substancji w stanie stałym często konieczna jest kontrola nie tylko składu chemicznego (pierwiastkowego i fazowego) powstającego produktu, ale również jego organizacji mikrostrukturalnej. Wynika to z silnej zależności zarówno właściwości chemicznych (na przykład aktywność w reakcjach w fazie stałej), jak i wielu właściwości fizycznych (magnetycznych, elektrycznych, optycznych itp.) od charakterystyk organizacji strukturalnej ciała stałego na różnych poziomach hierarchii. Pierwszy z tych poziomów obejmuje skład pierwiastkowy ciała stałego oraz sposób wzajemnego rozmieszczenia atomów pierwiastków w przestrzeni – strukturę krystaliczną (czyli cechy najbliższego otoczenia koordynacyjnego atomów w ciałach amorficznych), a także skład i koncentracja defektów punktowych. Jako kolejny poziom struktury ciała stałego możemy rozważyć rozkład defektów rozciągłych w krysztale, który określa rozmiary obszarów, w których (skorygowana o istnienie defektów punktowych) obserwuje się translacyjną symetrię w rozmieszczeniu atomów . Takie obszary można uznać za doskonałe mikrokryształy i nazywane są obszarami spójnego rozpraszania. Mówiąc o obszarach rozpraszania koherentnego, należy pamiętać, że w ogólnym przypadku nie są one równoważne cząstkom zwartym tworzącym materiał fazy stałej, który może zawierać znaczną liczbę rozszerzonych defektów, a co za tym idzie, obszarów spójnego rozpraszanie. Koincydencja obszarów spójnego rozpraszania z cząstkami (które w tym przypadku nazywane są jednodomenowymi) jest zwykle obserwowana tylko dla wystarczająco małych (poniżej 100 nm) rozmiarów tych ostatnich. Kolejne poziomy strukturalne można wiązać z kształtem i rozkładem wielkości cząstek tworzących proszek lub materiał ceramiczny, ich agregacją, agregacją agregatów pierwotnych itp.

Różne zastosowania materiałów w fazie stałej mają różne, często sprzeczne wymagania dotyczące wymienionych powyżej właściwości strukturalnych, a zatem wymagają różnych metod syntezy. Dlatego bardziej poprawne jest mówienie o metodach syntezy nie substancji w fazie stałej, ale materiałów w fazie stałej iw każdym przypadku wybór metody syntezy uwzględniający dziedzinę późniejszego zastosowania powstałego produktu.

W ogólnym przypadku metody syntezy materiałów w fazie stałej można sklasyfikować według ich odległości od warunków równowagi termodynamicznej dla przebiegu stosowanych procesów chemicznych. Zgodnie z ogólnymi prawami, w warunkach odpowiadających stanowi możliwie najdalej od równowagi obserwuje się znaczną nadwyżkę szybkości zarodkowania nad szybkością wzrostu utworzonych zarodków, co w oczywisty sposób prowadzi do uzyskania produktu najbardziej rozproszonego. W przypadku prowadzenia procesu w pobliżu równowagi termodynamicznej wzrost już utworzonych jąder następuje szybciej niż tworzenie się nowych, co z kolei umożliwia uzyskanie materiałów gruboziarnistych (w skrajnym przypadku monokryształów). Szybkość wzrostu kryształów jest również w dużej mierze zdeterminowana przez koncentrację w nich rozszerzonych (nierównowagowych) defektów.

Syntezę kombinatoryczną można prowadzić nie tylko w roztworze (synteza w fazie ciekłej), ale także na powierzchni fazy stałej obojętnej chemicznie. W tym przypadku pierwszy materiał wyjściowy jest chemicznie „przyszywany” do grup funkcyjnych na powierzchni nośnika polimerowego (najczęściej stosuje się wiązanie estrowe lub amidowe) i traktowany roztworem drugiego materiału wyjściowego, który jest pobierany w znaczny nadmiar, aby reakcja przebiegła do końca. Taka forma reakcji ma pewne udogodnienie, ponieważ ułatwia technikę izolowania produktów: polimer (zwykle w postaci granulek) po prostu odsącza się, dokładnie wypłukuje z pozostałości drugiego odczynnika, a docelowy związek odcinane od niego chemicznie.

W chemii organicznej nie ma ani jednej reakcji, która w praktyce zapewniałaby w każdym przypadku ilościowe wydajności docelowych produktów. Jedynym wyjątkiem jest, jak się wydaje, całkowite spalenie substancji organicznych w tlenie w wysokiej temperaturze do CO 2 i H 2 O. Dlatego oczyszczanie docelowego produktu jest zawsze niezbędnym, często najtrudniejszym i najbardziej czasochłonnym zadaniem. Szczególnie trudnym zadaniem jest izolowanie produktów syntezy peptydów, na przykład rozdzielanie złożonej mieszaniny polipeptydów. Dlatego właśnie w syntezie peptydów najszerzej stosowana stała się metoda syntezy na stałym podłożu polimerowym, opracowana na początku lat 60. XX wieku przez R. B. Merifielda.

Nośnikiem polimerowym w metodzie Merrifielda jest granulowany usieciowany polistyren zawierający grupy chlorometylowe w pierścieniach benzenowych, które są łącznikami wiążącymi nośnik z pierwszą resztą aminokwasową polipeptydu. Grupy te przekształcają polimer w funkcjonalny analog chlorku benzylu i nadają mu zdolność łatwego tworzenia wiązań estrowych w reakcji z anionami karboksylanowymi. Kondensacja takiej żywicy z N-zabezpieczonymi aminokwasami prowadzi do powstania odpowiednich estrów benzylowych. Usunięcie N-zabezpieczenia daje C-zabezpieczoną pochodną pierwszego aminokwasu kowalencyjnie związanego z polimerem. Aminoacylowanie uwolnionej grupy aminowej N-zabezpieczoną pochodną drugiego aminokwasu, a następnie usunięcie N-zabezpieczenia, daje w wyniku podobną pochodną dipeptydu, również związaną z polimerem:

Taki dwuetapowy cykl (odbezpieczanie - aminoacylowanie) można w zasadzie powtarzać tyle razy, ile potrzeba do zbudowania łańcucha polipeptydowego o określonej długości.

Dalszy rozwój idei Merifielda skierowany był przede wszystkim na poszukiwanie i tworzenie nowych materiałów polimerowych na podłoża, opracowywanie metod rozdzielania produktów oraz tworzenie zautomatyzowanych instalacji do całego cyklu syntezy polipeptydów.

Skuteczność metody Merifielda została potwierdzona udaną syntezą wielu naturalnych polipeptydów, w szczególności insuliny. Szczególnie wyraźnie jego zalety wykazano na przykładzie syntezy enzymu rybonukleazy. I tak na przykład, kosztem znacznych wysiłków, Hirschman i 22 pracowników przez kilka lat przeprowadzali syntezę enzymu rybonukleazy (124 reszt aminokwasowych) tradycyjnymi metodami w fazie ciekłej. Niemal jednocześnie otrzymano to samo białko za pomocą zautomatyzowanej syntezy na fazie stałej. W drugim przypadku synteza, która obejmowała łącznie 11 931 różnych operacji, w tym 369 reakcji chemicznych, została przeprowadzona przez dwóch uczestników (Gatte i Merrifield) w ciągu zaledwie kilku miesięcy.

Pomysły Merrifielda posłużyły za podstawę do stworzenia różnych metod kombinatorycznej syntezy bibliotek polipeptydów o różnej budowie.

Tak więc w 1982 roku zaproponowano oryginalną strategię wieloetapowej, równoległej syntezy peptydów na fazie stałej, znaną jako „metoda podziału” (ang. rozdzielać- rozłupywanie, separacja) lub metodą „mix and split” (ryc. 3). Jego istota jest następująca. Powiedzmy, że z trzech aminokwasów (A, B i C) trzeba uzyskać wszystkie możliwe kombinacje tripeptydów. W tym celu granulki stałego nośnika polimerowego (P) dzieli się na trzy równe części i traktuje roztworem jednego z aminokwasów. W tym przypadku wszystkie aminokwasy są chemicznie związane z powierzchnią polimeru przez jedną z ich grup funkcyjnych. Otrzymane polimery trzech klas dokładnie miesza się, a mieszaninę ponownie dzieli się na trzy części. Następnie każdą część, zawierającą wszystkie trzy aminokwasy w równych ilościach, ponownie traktuje się jednym z tych samych trzech aminokwasów i otrzymuje się dziewięć dipeptydów (trzy mieszaniny po trzy produkty każda). Kolejne mieszanie, podział na trzy równe części i traktowanie aminokwasami daje pożądane 27 tripeptydów (trzy mieszaniny dziewięciu produktów) w zaledwie dziewięciu etapach, podczas gdy ich uzyskanie osobno wymagałoby syntezy 27 × 3 = 81 etapów.

"Biolog. czasopismo Armenia, 1 (65), 2013 SYNTEZA W FAZIE STAŁEJ PEPTYDU AKTYWNEGO NA SERCE IZOLOWANE Z PIG ATRIUM G.S. CHAILYAN Instytut Biochemii. Bunyatyan NAS RA..."

Artykuły eksperymentalne i teoretyczne

Artykuły eksperymentalne i teoretyczne

Biolog. czasopismo Armenia, 1 (65), 2013

SYNTEZA W FAZIE STAŁEJ PEPTYDU SERCA,

IZOLOWANE Z ATRIUM ŚWINI

GS CHAILYAN

Instytut Biochemii. Bunyatyan NAS RA

[e-mail chroniony]

W celu kontynuowania badań acad. Galoyan, przeprowadziliśmy serię eksperymentów w celu wyizolowania, oczyszczenia i określenia orientacji biologicznej nowo wyizolowanych związków peptydowych z przedsionków i części uszu serca świni. Do przeprowadzenia biotestów konieczne było uzyskanie preparatywnych ilości badanych próbek. W tym celu wykorzystaliśmy metodę syntezy peptydów w fazie stałej z jej dalszą modyfikacją. Czystość i tożsamość zsyntetyzowanych preparatów sprawdzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i analizy widma masowego.

Synteza na fazie stałej - fmoc-aminokwasy - HPLC - fenyloizotiocyjanian - analiza widma masowego:

fmoc- – – W celu dalszych badań założonych przez Galoyana przeprowadzono serię eksperymentów dotyczących izolacji, oczyszczania i określenia kierunku biologicznego peptydów wyizolowanych z przedsionków świni. Do wykonania biotestów wymagana była preparatywna ilość próbek. Zastosowano zmodyfikowaną metodę syntezy peptydów na fazie stałej. Czystość i tożsamość zsyntetyzowanego peptydu określono za pomocą HPLC i analizy widma masowego.

Synteza na fazie stałej – wysokosprawna chromatografia cieczowa – spektrometria mas – fmoc-aminokwasy – kardiopeptydy – przedsionki Galoyan i wsp. badali sposoby regulacji i mechanizmy działania neurohormonów podwzgórza na różne procesy zachodzące w organizmie.

Potwierdzenie idei wzajemnie połączonego, współzależnego, integralnego funkcjonowania takiego układu jak podwzgórze – przysadka – nadnercza było punktem zwrotnym w endokrynologii. Uzupełnienie tej koncepcji SYNTEZA W FAZIE STAŁEJ AKTYWNEGO PEPTYDU SERCOWEGO IZOLOWANEGO Z PRZEDSIĘBIORNIKA ŚWIŃSKIEGO z tualnej triady zaproponowanej przez Galoyana dotyczącej interakcji podwzgórze - przysadka mózgowa

– serce, jest ogromnym osiągnięciem naukowym. Następnie odkryto nową tkankę-cel-serce, wykazano zdolność tego narządu do kontrolowania funkcjonowania określonych peptydów, a także istnienie mechanizmu sprzężenia zwrotnego między podwzgórzem a sercem poprzez te peptydy.

Odkrycie związków kardioaktywnych - neurohormonu K, C, G i szeregu innych w podwzgórzu różnych zwierząt, stało się początkiem prac nie tylko nad badaniem molekularnych mechanizmów działania tych neurohormonów, ale także nad poszukiwaniem dla podobnych związków w sercu. Podstawą kompleksowego badania właściwości biochemicznych i fizykochemicznych pierwiastków kardioaktywnych były dane dotyczące obecności 2 związków kardioaktywnych w mięśniu sercowym. Ustalono udział neurohormonu „C” w regulacji procesów glikolitycznych i poziomu cyklicznych nukleotydów poprzez hamowanie PDE cAMP, kinazy białkowej zależnej od cAMP itp. Wykazano, że związek ten ma niską masę cząsteczkową i należy do glikopeptydów.

W Pracowni Chromatografii Analitycznej i Syntezy Peptydów prowadziliśmy prace nad izolacją i oczyszczaniem związków peptydowych z okolic przedsionków i uszu serca świni. Podczas rozdzielania frakcji peptydowych metodą preparatywnej HPLC wyizolowano i oczyszczono do stanu jednorodnego 20 związków o charakterze peptydowym. W celu określenia ogniska biologicznego wszystkie preparaty badano pod kątem zmian składowych EKG u szczurów. Wyniki eksperymentów wykazały, że 7 związków ma wszechstronne czynniki wpływu na niektóre składowe EKG.

Peptyd nr 7 wykazywał największą aktywność w zmianie amplitudy składowej R, czasu trwania zespołu QRS, amplitudy S i innych parametrów.

Aby zbadać biologiczne mechanizmy działania tego leku, konieczne stało się posiadanie dużej ilości badanej próbki. Ze względu na to, że proces izolacji i oczyszczania produktów biologicznych jest niezwykle nieefektywny, pracochłonny, czasochłonny i nie może zapewnić dobrej powtarzalności, niezwykle ważne stało się przeprowadzenie syntezy chemicznej tego leku. Analizując światową literaturę z zakresu chemicznej syntezy peptydów, doszliśmy do wniosku, że najbardziej optymalna dla nas jest metoda syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem aminokwasów zabezpieczonych fmoc. Odkryta w 1984 roku synteza peptydów w fazie stałej ma wiele zalet w porównaniu z syntezą konwencjonalną pod względem wydajności, a także wygodnego przetwarzania i oczyszczania.

Stosując kilka różnych metod: hydrolizę tego leku, modyfikację aminokwasów izotiocyjanianem fenylu otrzymaliśmy skład aminokwasowy peptydu nr 7. Wykorzystując dane z analiz widm masowych i NMR, degradacji Edmona, udało nam się uzyskać nie tylko skład aminokwasowy, ale także sekwencję aminokwasową peptydu nr 7.

Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Efektywny proces syntezy w fazie stałej w dużej mierze zależy od właściwego doboru różnych warunków jego realizacji, takich jak dobór żywicy, rozpuszczalnika oraz kinetyki syntezy. Zmienne te wpływają na stopień pęcznienia żywicy i jej asocjację z aminokwasami, liczbę miejsc wiązania, co ostatecznie wpływa na syntezę peptydu jako całości. Dostosowaliśmy proces syntezy w fazie stałej w odniesieniu do naszych badanych peptydów, biorąc pod uwagę specyfikę ich sekwencji aminokwasowej.

GS CHAILYAN Materiał i metody. Wszystkie użyte odczynniki, rozpuszczalniki, żywice pochodzą z firmy Advanced Chem Techcompany. Użyliśmy grup fmoc do ochrony N-końca aminokwasów podczas syntezy oraz dimetyloformamidu (DMF) jako rozpuszczalnika podczas całej syntezy. Jako substrat użyliśmy kwasoodpornej żywicy 2-chlorotritylowej. Usuwanie ochronnych grup fmoc przeprowadzono stosując roztwór piperydyny w DMF.

Bardzo ważne w procesie syntezy jest lądowanie pierwszego aminokwasu na żywicy. Dwa gramy żywicy 2Cl-Trt wlano do 10 ml strzykawki. Do strzykawki wciągnięto DMF, żywicę pozostawiono do spęcznienia przez 15 minut. Następnie DMF wypłukano. Następnie do strzykawki wciągnięto roztwór pierwszego aminokwasu (fmoc-Pro) i aktywatora reakcji (DIPEA) w stosunku 1 RESIN/1,2 FMOC-PRO/4DIPEA. Reakcja osadzania pierwszego aminokwasu trwała 3 h. Bardzo ważnym warunkiem syntezy jest brak wolnych łączników po zasadzeniu pierwszego aminokwasu, dlatego po związaniu z pierwszym aminokwasem żywicę potraktowano mieszaniną metylen, DIPEA (diizopropyloetyloamina) i DMF w stosunku 80DMF/15MEOH/5DIPEA w celu zablokowania ewentualnie pozostałych wolnych końców. Następnie żywicę przemyto DMF 5 razy przez 5 minut. Następnie aminokwasy odblokowano 30% roztworem piperydyny w DMF 8 razy przez 5 minut. Następnie żywicę przemyto DMF 5 razy przez 5 minut. Cykl ten powtarzano przez całą syntezę peptydu. Po każdym etapie dodawania aminokwasów i odblokowywania postęp reakcji monitorowano za pomocą testu Kaisera, który jest reakcją ninhydryny z wolną grupą aminową z utworzeniem charakterystycznego ciemnoniebieskiego koloru. Dzięki temu testowi możliwe stało się stopniowe kontrolowanie reakcji ładowania i odblokowywania aminokwasów.

Oczyszczanie i kontrolę zsyntetyzowanego peptydu nr 7 przeprowadzono na dwuskładnikowym układzie preparatywnej HPLC firmy Waters (USA). Do wstrzyknięcia próbki użyto iniektora Rheodyne o objętości pętli 500 µl. Detekcję prowadzono w zakresie 190–360 nm. Użyliśmy kolumny „Symmetry Si-100 C18” (4,6 x 250 mm) do HPLC w układzie faz odwróconych. Szybkość przepływu wynosiła 50 ml/min. Stosowano gradientowy układ eluentów H2O/ACN/TFA (98/2/0,1) / (0,100,0,1). Czas analizy 15 min. Rechromatografię przeprowadzono na systemie analitycznym Knauer HPLC. Zastosowano kolumnę XbridgeC18 (2,6x150 mm). Detekcję prowadzono przy 214 nm.

W celu potwierdzenia uzyskanych danych zsyntetyzowany preparat poddano analizie widma masowego na CSU „Analitycal spectrometry”.

Wyniki i dyskusja. Dane uzyskane na chromatogramie sugerują, że czystość zsyntetyzowanego peptydu nr 7 po oczyszczeniu wynosi ponad 99,6% (ryc. 1).

–  –  –

Przeprowadziliśmy porównawczą analizę chromatograficzną natywnego peptydu nr 7 na kolumnie X-bridgeC18 w tych samych warunkach, co jego syntetyzowany analog. Przedstawiono wyniki porównania (ryc. 2).

Synteza w fazie stałej kardioaktywnego peptydu wyizolowanego z przedsionków świni

–  –  –

Ryż. Ryc. 4. Spektrogramy preparatów zsyntetyzowanych (A) i natywnych (B).

GS CHAILYAN Jak widać z porównania chromatogramów, zsyntetyzowany analog i natywny peptyd nr 7 są identyczne pod względem masy i czasu uwalniania, co wskazuje na identyczność ich struktur i sekwencji aminokwasów. Tym samym, stosując metodę syntezy peptydów w fazie stałej i biorąc pod uwagę cechy strukturalne badanego peptydu, udało się uzyskać jednorodny i identyczny z natywnym peptyd składający się z 9 aminokwasów. W przyszłości, mając wystarczającą ilość leku, planujemy przeprowadzić serię biotestów, aby poznać nie tylko sposoby regulacji czynności serca przez ten peptyd, ale także mechanizmy działania na inne narządy i układy.

LITERATURA

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Wykrywanie i identyfikacja w sercu byka nowy 1.

białka kardioaktywne. Pytanie. miód. Chemia, 37, 2, s. 56-58, 1991.

Srapionyan RM, Sahakyan SA, Sahakyan FM, Galoyan AA Izolacja i charakterystyka 2.

kardioaktywny trypsynowy fragment białka nośnikowego neurohormonu C. Neurochemia, 2, 3, s. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Separacja związków koronoaktywnych o małej masie cząsteczkowej 3.

mięśnia sercowego przez połączenie filtracji żelowej i elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Biolog. czasopismo Armenia, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, AA Dystrybucja kardioaktywnych kompleksów białkowych w sercu różnych zwierząt. Biolog. czasopismo Armenia, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. Regulacja neurosekrecji i hormonów układu podwzgórzowo-neuroprzysadkowego, ZSRR, 1963.

6. Galoyan AA Biochemia nowych hormonów kardioaktywnych i immunomodulatorów układu funkcjonalnego Neurosekrecyjnego podwzgórza, układu hormonalnego serca. Publikacja naukowa. p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, wydanie 3, Springer Publishers, 500 str., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 str., 2004.

9. Galoyan AA, Srapionyan R.M. Oczyszczanie białek wieńcowych izolowanych z podwzgórza. Dokł. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, s. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. Zaawansowana chemia organiczna Marcha. Opublikowane przez John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, str. 133, 2007.

–  –  –

Podobne prace:

« WYDAWNICTWO SPOŁECZNOŚCIOWE "NAUKA" Moskwa 1979 UDC 581.55:56.017 Działka n i k v VV Ewolucja struktury zbiorowisk roślinnych. M.: Nauka, s. 1979, 276 O nowoczesnym metalu...»

„Izwiestia Funduszu Muzealnego. AA Brauner №2 Tom I 2004 Obrady Funduszu Muzealnego. A. A. Brauner Tom I nr 2 2004 Czasopismo naukowe Założona w grudniu 2003 r. Wydawane 4 razy w roku Świadectwo rejestracji państwowej OD nr 913 z dnia 13.12.2003 r. Założyciel i wydawca ... "

[0001] Wynalazek dotyczy sposobu syntezy na fazie stałej peptydu o wzorze H-D-Nal-Thr-NH2, który wykorzystuje zarówno aminokwasy zabezpieczone Boc, jak i zabezpieczone Fmoc oraz chlorometylowaną żywicę polistyrenową. 10 zł latać.

Dziedzina technologii, do której należy wynalazek

[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania peptydu zawierającego trzy lub więcej reszt aminokwasowych, zawierającego N-końcowy aminokwas, przedostatni aminokwas sąsiadujący z N-końcowym aminokwasem i C-końcowy aminokwas.

Stan techniki

Syntezę peptydów w fazie stałej wprowadzono w 1963 r. w celu przezwyciężenia wielu problemów pośrednich etapów oczyszczania związanych z syntezą peptydów w roztworze (Stewart i wsp. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., wyd. 2, 1984). W syntezie na fazie stałej aminokwasy są składane (np. łączone) w peptyd w dowolnej pożądanej sekwencji, podczas gdy jeden koniec łańcucha (np. C-koniec) jest przyłączony do nierozpuszczalnego nośnika. Po złożeniu pożądanej sekwencji na nośniku (nośniku), peptyd jest następnie uwalniany (tj. odcinany) od nośnika. Dwie standardowe grupy zabezpieczające dla grup α-aminowych aminokwasów, które mają być połączone, to Boc, którą usuwa się mocnym kwasem, oraz Fmoc, którą usuwa się zasadą. Niniejszy wynalazek dotyczy dogodnego sposobu wytwarzania peptydów przy użyciu kombinacji obu tych zabezpieczeń dla grup α-aminowych w jednej syntezie na niedrogiej żywicy z chlorometylowanego polistyrenu.

Podczas projektowania syntezy peptydów w fazie stałej przy użyciu dowolnego z powyższych schematów ochrony α-aminowej ważne jest, aby wszelkie reaktywne „grupy boczne” aminokwasów tworzących peptyd były chronione przed niepożądanymi reakcjami chemicznymi podczas składania łańcucha. Pożądane jest również, aby grupy chemiczne wybrane do zabezpieczania różnych grup bocznych nie były usuwane przez reagenty stosowane do odbezpieczania grup β-aminowych. Po trzecie, ważne jest, aby wiązanie rosnącego łańcucha peptydowego z cząstką żywicy było odporne na odczynniki stosowane w procesie składania łańcucha w celu usunięcia wszelkiego rodzaju zabezpieczenia α-aminowego. W przypadku schematu zabezpieczania grupy α-aminowej z użyciem Fmoc, grupa boczna zabezpieczająca musi być odporna na odczynniki alkaliczne stosowane do usuwania Fmoc. W praktyce te grupy zabezpieczające łańcuchy boczne są zwykle usuwane za pomocą łagodnie kwaśnych odczynników po zakończeniu składania łańcucha peptydowego. Jeżeli stosuje się schemat zabezpieczania grupy β-aminowej z użyciem Boc, zabezpieczenie grupy bocznej musi być odporne na słabo kwaśny odczynnik stosowany do usuwania grupy Boc w każdym cyklu. W praktyce te grupy zabezpieczające łańcuchy boczne w schemacie ochrony β-aminowej z Boc są zwykle usuwane bezwodnym HF po zakończeniu składania łańcucha peptydowego. Tak więc, w praktyce, powszechnie stosowane grupy zabezpieczające łańcuchy boczne w schemacie zabezpieczania α-amin z Fmoc nie są trwałe w warunkach stosowanych do odbezpieczania grup α-aminowych z Boc. Dlatego dwa rodzaje schematów ochrony grup α-aminowych nie są łączone podczas składania łańcucha peptydowego w syntezie peptydów w fazie stałej. Ponadto, chociaż najtańsza żywica polimerowa stosowana w syntezie peptydów (chlorometylowany polistyren lub „żywica Maryfielda”) jest szeroko stosowana wraz z aminokwasami zabezpieczonymi grupami Boc, w literaturze stwierdzono, że nie ma ona zastosowania w przypadku ochrony grup α-aminowych z grupami Fmoc ze względu na ich niestabilność w warunkach alkalicznych (patrz Stewart i in. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., wyd. 2, 1984). Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu współwykorzystywania pewnych peptydów w syntezie na fazie stałej zarówno Boc-zabezpieczonych jak i Fmoc-zabezpieczonych aminokwasów na żywicy Merifielda.

Wiadomo, że Lanreotyd®, który jest analogiem somatostatyny, hamuje uwalnianie hormonu wzrostu, a także insulinę, glukagon i wydzielanie zewnątrzwydzielnicze trzustki.

Patent USA nr 4 853 371 ujawnia i zastrzega Lanreotide®, sposób jego wytwarzania oraz sposób hamowania wydzielania hormonu wzrostu, insuliny, glukagonu i wydzielania zewnątrzwydzielniczego trzustki.

W patencie USA nr 5147856 ujawniono zastosowanie Lanreotide® do leczenia restenozy.

Patent US nr 5411943 ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia wątrobiaka.

Patent USA nr 5073541 ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia raka płuc.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 08/089410, złożone 9 lipca 1993, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia czerniaka.

W patencie USA nr 5,504,069 ujawniono zastosowanie Lanreotide® do hamowania przyspieszonego wzrostu guza litego.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 08/854941, złożone 13 maja 1997, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do utraty wagi.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 08/854,943, złożone 13 maja 1997, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia insulinooporności i zespołu X.

W patencie USA nr 5688418 ujawniono zastosowanie Lanreotydu® do przedłużania żywotności komórek trzustki.

Zgłoszenie PCT nr PCT/US 97/14154 ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia zwłóknienia.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 08/855311, złożone 13 maja 1997, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia hiperlipidemii.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 08/440061, złożone 12 maja 1995, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia hiperamylinemii.

Zgłoszenie patentowe USA nr 08/852221, złożone 7 maja 1997, ujawnia zastosowanie Lanreotide® do leczenia hiperprolaktynemii i prolaktynoma.

Istota wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza sposób wytwarzania peptydu zawierającego trzy lub więcej reszt aminokwasowych, mającego N-końcowy aminokwas, przedostatni aminokwas sąsiadujący z N-końcowym aminokwasem i C-końcowy aminokwas, przy czym wspomniany sposób obejmuje następujące kroki:

(a) przyłączenie pierwszego aminokwasu do stałej żywicy nośnikowej za pomocą wiązania eterowego w celu utworzenia pierwszego produktu sprzęgania, co obejmuje (i) poddanie reakcji wodnego roztworu węglanu cezu z alkoholowym roztworem pierwszego aminokwasu w celu utworzenia soli cezu pierwszego aminokwasu, (ii) otrzymanie wolnej od rozpuszczalnika soli cezowej pierwszego aminokwasu, (iii) poddanie reakcji stałej żywicy nośnikowej z solą cezu pierwszego aminokwasu w suchym (bezwodnym) polarnym rozpuszczalniku aprotonowym z wytworzeniem pierwszy produkt addycyjny,

gdzie pierwszy aminokwas odpowiada C-końcowemu aminokwasowi peptydu, grupa aminowa łańcucha niebocznego (głównego) pierwszego aminokwasu jest blokowana przez Boc, a pierwszy aminokwas nie ma grupy funkcyjnej w łańcuchu bocznym wymagającym ochrony, a stałym nośnikiem - żywicą - jest żywica z polistyrenu chlorometylowanego;

(b) odbezpieczenie (odblokowanie) Boc z produktu z pierwszego przystąpienia kwasem z utworzeniem odblokowanego produktu z pierwszego przystąpienia;

(c) Opcjonalnie przyłączenie następnego aminokwasu do odblokowanego pierwszego produktu przyłączania, co obejmuje reakcję następnego aminokwasu z odblokowanym pierwszym produktem przyłączania w rozpuszczalniku organicznym zawierającym peptydowy odczynnik wzrostu w celu uzyskania zablokowanego (zabezpieczonego) następnego produktu przyłączania, przy czym następny aminokwas ma w łańcuchu głównym grupę aminową zablokowaną przez Boc, a jeśli następny aminokwas ma jedną lub więcej grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym, to grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym nie wymagają zabezpieczenia lub grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym mają grupy zabezpieczające, które są odporne na odczynniki kwasowe lub zasadowe stosowane do usunięcia zabezpieczenia, odpowiednio, Boc i Fmoc;

(d) odbezpieczenie Boc od zablokowanego następnego adduktu, co obejmuje reakcję zablokowanego następnego adduktu z kwasem w celu otrzymania odbezpieczonego następnego adduktu;

(e) opcjonalnie powtarzanie etapów (c) i (d), przy czym każdy cykl generuje uwolniony produkt (X+1)-tego przyłączenia, gdzie X jest numerem wymaganego powtórzenia cyklu;

(f) dodanie następnego aminokwasu do uwolnionego pierwszego produktu przyłączania z etapu (b) lub, opcjonalnie, do uwolnionego (X+1) następnego produktu przyłączania z etapu (e), co obejmuje reakcję następnego aminokwasu z wymienionym pierwszy produkt przyłączenia lub z określonym odblokowanym produktem (X+1)-tego przyłączenia w rozpuszczalniku organicznym zawierającym odczynnik do hodowli peptydu w celu uzyskania zablokowanego (zabezpieczonego) kolejnego produktu przyłączenia, a następny aminokwas ma łańcuch główny grupę aminową zablokowaną przez Fmoc, pod warunkiem, że jeśli kolejny aminokwas ma w łańcuchu bocznym jedną lub więcej grup funkcyjnych, to grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym nie wymagają zabezpieczenia lub grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym mają grupy zabezpieczające, które są odporne na alkaliczne odczynniki stosowane do odbezpieczania Fmoc;

(g) odbezpieczenie Fmoc od zablokowanego następnego adduktu, co obejmuje reakcję zablokowanego następnego adduktu z pierwszorzędową lub drugorzędową aminą w celu otrzymania odbezpieczonego następnego adduktu;

(h) opcjonalnie powtarzając kroki (e) i (g), przy czym każdy cykl generuje odblokowany iloczyn (X+1)-tego dodawania, gdzie X jest liczbą koniecznych powtórzeń cyklu, aż do przedostatniego jest zawarty w peptydzie i odblokowanym aminokwasie;

(i) przyłączenie N-końcowego aminokwasu do odbezpieczonego (X+1)-tego produktu przystąpienia, co obejmuje reakcję N-końcowego aminokwasu z odbezpieczonym (X+1)-tym produktem przystąpienia w rozpuszczalniku organicznym zawierającym odczynnik do wzrostu peptydów, w celu uzyskania zablokowanego produktu końcowego, w którym N-końcowy aminokwas ma szkieletową grupę aminową zablokowaną przez Boc lub Fmoc;

(j) odbezpieczanie Boc lub Fmoc z zablokowanego produktu zakończonej addycji, obejmujące poddanie reakcji zablokowanego produktu zakończonej addycji z kwasem w przypadku Boc lub zasadą w przypadku Fmoc z wytworzeniem na żywicy produktu zakończonego peptydu;

(j) jeśli gotowy produkt peptydowy na żywicy ma grupy funkcyjne łańcucha bocznego, wówczas ewentualnie odbezpieczenie grup funkcyjnych łańcucha bocznego gotowego produktu peptydowego na żywicy, co obejmuje poddanie reakcji gotowego produktu peptydowego na żywicy z odpowiednimi odczynnikami odbezpieczającymi w celu uzyskania gotowy odbezpieczony produkt peptydowy na żywicy; oraz

(k) odszczepianie peptydu od stałego nośnika z żywicy gotowego produktu peptydowego na żywicy lub gotowego produktu peptydowego na odbezpieczonej żywicy w celu uzyskania peptydu, które obejmuje reakcję gotowego produktu peptydowego na żywicy lub gotowego produktu peptydowego na odbezpieczonej żywicy z amoniakiem , aminy pierwszorzędowej lub aminy drugorzędowej do praktycznego zakończenia odszczepienia peptydu z żywicy;

z zastrzeżeniem, że etapy (e) i (g) syntezy peptydu muszą być przeprowadzone co najmniej raz.

Korzystny jest sposób według niniejszego wynalazku, w którym amoniak, amina pierwszorzędowa lub amina drugorzędowa w etapie (k) znajduje się w rozpuszczalniku zawierającym alkohol i ewentualnie polarny rozpuszczalnik aprotonowy,

Korzystny jest sposób według niniejszego wynalazku, w którym etap (l) obejmuje ponadto następujące etapy:

wytrącanie rozszczepionego peptydu z rozpuszczalnika;

oddzielenie przez filtrację stałego nośnika żywicy i wytrąconego peptydu, oraz

ekstrakcję peptydu kwaśnym roztworem w celu wyizolowania peptydu.

Korzystny jest sposób według niniejszego wynalazku, w którym pierwszym aminokwasem jest Boc-L-Thr.

Korzystny jest sposób według niniejszego wynalazku, w którym pierwszym aminokwasem jest sól cezowa Boc-L-Thr, dająca żywicę Boc-L-Thr jako pierwszy produkt sprzęgania, a odblokowanym pierwszym produktem sprzęgania jest żywica H-L-Thr .

Korzystny jest sposób według niniejszego wynalazku, w którym kwasem stosowanym do usuwania grupy zabezpieczającej Boc w etapie (etapach) jest kwas trifluorooctowy (TFA).

Preferowaną metodą związaną z bezpośrednio poprzedzającym procesem jest sytuacja, w której rozpuszczalnikiem organicznym jest chlorek metylenu, chloroform lub dimetyloformamid, a odczynnikiem do wzrostu peptydów jest diizopropylokarbodiimid, dicykloheksylokarbodiimid lub N-etylo-N"-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid .

Preferowanym sposobem, odnoszącym się do sposobu bezpośrednio poprzedzającego, jest sposób obejmujący przeprowadzanie etapów (e) i (g) sześć razy po utworzeniu odblokowanego pierwszego produktu sprzęgania o wzorze H-L-Thr-żywica, gdzie kolejne aminokwasy są dołączone w kolejności: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc-L- Cys(Acm) z wytworzeniem produktu H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica.

Preferowanym sposobem, odnoszącym się do sposobu bezpośrednio poprzedzającego, jest sposób obejmujący dodanie Boc-D-Nal do H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm)-Tnr-żywica zgodnie z etapem (c) w celu otrzymania Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-żywica.

Preferowana metoda, powiązana z metodą bezpośrednio poprzedzającą, obejmuje jednoczesne usunięcie grupy Boc chroniącej D-Nal, grupy O-t-Bu chroniącej Tyr i grupy Boc chroniącej Lys w Boc-D-Nal-Cys(Acm )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-resin zgodnie z etapem (i), aby otrzymać gotowy produkt peptydowy na żywicy o wzorze H-D- - Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica.

Korzystny sposób, powiązany z bezpośrednio poprzedzającym sposobem, obejmuje rozszczepienie peptydu H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr ze stałej żywicy przez przeprowadzenie reakcja H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica z amoniakiem w rozpuszczalniku zawierającym alkohol i opcjonalnie aprotonowy rozpuszczalnik polarny do zasadniczo całkowitej eliminacji z wytworzeniem H-D --Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Korzystny sposób, powiązany z procesem bezpośrednio poprzedzającym, to taki, w którym alkoholem jest metanol, a polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym jest dimetyloformamid.

Preferowana metoda, powiązana z metodą bezpośrednio poprzedzającą, polega na jednoczesnym usunięciu grup Cys zabezpieczających Acm i cyklizacji powstałych odbezpieczonych reszt Cys w ​​gotowym produkcie peptydowym o wzorze H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 przeprowadzając reakcję H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 roztworem jodu w alkoholu do prawie całkowitego odbezpieczenia i cyklizacji z wytworzeniem H-D-Nal-Thr-NH2.

Korzystną metodą, związaną z bezpośrednio poprzedzającą metodą, jest metoda, w której peptydem jest H-D-Nal-Thr-NH2.

Korzystny sposób, powiązany z bezpośrednio poprzedzającym sposobem, to taki, w którym peptydem jest analog somatostatyny.

Terminy stosowane w opisie niniejszego wynalazku są zdefiniowane w następujący sposób:

„pierwszy aminokwas”: obejmuje dowolny aminokwas, w którym grupa aminowa w głównym łańcuchu (nie w łańcuchu bocznym) jest chroniona przez Boc, który jest produktem handlowym lub może być zsyntetyzowany zgodnie ze sposobami znanymi osobie o zwykłych umiejętnościach w stanie techniki, na przykład Boc-L-Thr;

„pierwszy produkt przyłączania”: opisuje produkt, który jest przyłączony do stałej żywicy nośnikowej, który powstaje w wyniku dodania pierwszego aminokwasu do stałej żywicy nośnikowej, np. żywicy Boc-L-Thr;

„odblokowany pierwszy produkt sprzęgania”: opisuje produkt powstały w wyniku usunięcia lub usunięcia grupy Boc z pierwszego produktu sprzęgania – na przykład H-L-Thr-żywica, gdzie „H” oznacza dostępny wodór grupy aminowej głównego łańcuch, powstały w etapie odbezpieczania;

„następny aminokwas”: opisuje dowolny aminokwas, w którym grupa aminowa w głównym łańcuchu jest chroniona przez Boc lub Fmoc, który jest dostępny w handlu lub może być zsyntetyzowany zgodnie ze sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie. Ponieważ etap (c) i etap (e) mogą być zawarte w powtarzalnym cyklu, w którym etap jest wykonywany więcej niż jeden raz, za każdym razem, gdy przeprowadzany jest etap (c) lub etap (e), „następny aminokwas” może być niezależnie wybrany spośród grupa aminokwasów znana lub prawdopodobnie zsyntetyzowana, w której grupa aminowa w głównym łańcuchu jest chroniona przez Boc lub Fmoc;

„zablokowany produkt (X+1)-tej następnej akcesji”: opisuje produkt przyłączony do stałej żywicy nośnej, który jest wynikiem połączenia następnego aminokwasu z „odblokowanym produktem następnej akcesji”. Ponieważ etapy (c) i (d) oraz etapy (e) i (g) mogą być włączone do powtarzającego się cyklu, w którym mogą być przyłączane następujące aminokwasy, określenie „zablokowany produkt następnego przyłączenia (X+1)” odnosi się do produktu uzyskanego w wyniku każdego z poprzednich cykli akcesji;

„odblokowany produkt (X+1)-tej następnej akcesji”: opisuje produkt powstały w wyniku usunięcia grupy Fmoc z „zablokowanego produktu (X+1)-tej następnej akcesji”;

„kompletny produkt peptydowy na żywicy”: opisuje produkt peptydowy przyłączony do stałej żywicy nośnej po przyłączeniu N-końcowego aminokwasu do łańcucha peptydowego i po odblokowaniu lub odblokowaniu grupy aminowej szkieletu N-końcowego aminokwasu , ale który nadal ma jakiekolwiek grupy zabezpieczające na grupach funkcyjnych łańcuchów bocznych, nieusunięte w reakcji, przeprowadzającej usunięcie grupy zabezpieczającej z głównego łańcucha N-końcowego aminokwasu; oraz

„kompletny produkt peptydowy na odbezpieczonej żywicy”: opisuje produkt peptydowy przyłączony do stałego nośnika z żywicy, gdzie wszystkie grupy zabezpieczające zostały usunięte lub odblokowane z grup funkcyjnych łańcuchów bocznych aminokwasów.

Przykładami kwasów, które można zastosować do odbezpieczenia Boc, są kwas trifluorooctowy (TFA), kwas metanosulfonowy i roztwory organiczne zawierające HCl.

Przykładami amin pierwszorzędowych i drugorzędowych, które można zastosować do odbezpieczenia Fmoc, są 4-(aminometylo)piperydyna, piperydyna, dietyloamina, DBU i tris(2-aminoetylo)amina.

Przykłady zasad nienukleofilowych, które można wykorzystać do zobojętnienia soli TFA z uwolnionymi grupami aminowymi (RNH 3 + CF 3 COO – sole te muszą zostać przekształcone w „wolne” aminy (NH 2) przed lub w trakcie dodawania kolejnego aminokwasu , inaczej dodanie nie nastąpi) to diizopropyloetyloamina (DIEA) i trietyloamina (TEA).

Przykładami rozpuszczalników organicznych, które można stosować w reakcjach addycji aminokwasów, są chlorek metylenu, chloroform, dichloroetan, dimetyloformamid, dietyloacetamid, tetrahydrofuran, octan etylu, 1-metylo-2-pirolidon, acetonitryl lub kombinacja tych rozpuszczalników.

Przykłady przedłużaczy peptydowych obejmują podstawione karbodiimidy, takie jak: diizopropylokarbodiimid, dicykloheksylokarbodiimid lub N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid.

Grupy karboksylowe i grupy aminowe, które uczestniczą w tworzeniu wiązania peptydoamidowego, określa się odpowiednio jako grupę karboksylową lub grupę aminową „łańcucha bocznego”. Z drugiej strony, wszelkie grupy funkcyjne aminokwasów, które nie uczestniczą w tworzeniu wiązania peptydoamidowego, określa się jako grupy funkcyjne „łańcucha bocznego”.

Określenie „grupa odporna na zasadę” odnosi się do grup zabezpieczających stosowanych do zabezpieczania grup funkcyjnych aminokwasów, które (1) są odporne na zasadę, np. -aminoetylo)aminy, które są zasadami powszechnie stosowanymi do usuwania grupy zabezpieczającej Fmoc, i (2) można usunąć kwasem, takim jak kwas trifluorooctowy lub inną metodą, taką jak katalityczne uwodornienie.

Symbole „Fmoc” i „Boc” stosuje się tutaj iw załączonym wzorze do oznaczenia odpowiednio 9-fluorenylometoksykarbonylu i t-butyloksykarbonylu.

Sposób opisany powyżej można stosować do wytwarzania peptydów, korzystnie analogów somatostatyny, takich jak oktapeptyd Lanreotide®, który ma następujący wzór: H-D-Nal-Thr-NH2. Jeśli ma być syntetyzowany H-D-Nal--Thr-NH2, odpornymi na zasadę grupami zabezpieczającymi stosowanymi do zabezpieczania grup funkcyjnych łańcucha bocznego Cys, Lys i Tyr mogą być odpowiednio acetamidometyl (Acm), Boc i tert-butyl. Asm jest preferowany w stosunku do Cys.

Przez analog somatostatyny rozumie się peptyd, który wykazuje aktywność biologiczną podobną (tj. agonistę) lub przeciwną (tj. antagonistę) do aktywności somatostatyny.

We wzorze H-D-Nal-Thr-NH2 każdy ze zwykłych trzyliterowych symboli aminokwasów (np. Lys) odnosi się do strukturalnej reszty aminokwasowej. Na przykład symbol Lys w powyższym wzorze oznacza -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Symbol D- -Nal- oznacza resztę aminokwasową D-2-naftyloalanililową. Nawiasy oznaczają wiązanie dwusiarczkowe łączące wolne grupy tiolowe dwóch reszt Cys w ​​peptydzie, co wskazuje, że aminokwasy peptydu wewnątrz nawiasów tworzą cykl.

W oparciu o podany tutaj opis, specjalista w tej dziedzinie będzie w stanie najpełniej wykorzystać niniejszy wynalazek.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie, jak powszechnie rozumiane przez osoby o zwykłych umiejętnościach w dziedzinie, do której odnosi się niniejszy wynalazek. Ponadto wszystkie cytowane tu publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne odnośniki są włączone przez odniesienie do nich.

Peptyd można wytworzyć zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku zgodnie z następującą procedurą.

Roztwór 0,5 równoważnika molowego węglanu cezu w wodzie dodaje się powoli do roztworu 1 równoważnika molowego Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA), gdzie AA 1 odpowiada C-końcowemu aminokwasowi rozpuszczonemu w alkoholu, korzystnie metanol. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie cały alkohol i całą wodę usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując suchy proszek soli cezu Boc-AA1. Żywicę Merifielda, 1,0 równoważnika (chlorometylowany polistyren, 200-400 mesh, zawartość jonów chlorkowych 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky lub Polymer Laboratories, Church Stretton, Anglia) przemywa się chlorowanym rozpuszczalnikiem, korzystnie dichlorometanem (DCM ), alkoholu, korzystnie metanolu i polarnego rozpuszczalnika aprotonowego, korzystnie dimetyloformamidu (DMF). Proszek soli cezu Boc-AA 1 rozpuszcza się w bezwodnym (suchym) polarnym rozpuszczalniku aprotonowym, korzystnie DMF, i roztwór łączy się z uprzednio przemytą żywicą. Zawiesinę delikatnie miesza się w temperaturze około 45-65°C, korzystnie w temperaturze 50-60°C, przez około 48 do 106 godzin, korzystnie 85 do 90 godzin, w obojętnej atmosferze, takiej jak azot. Żywicę oddziela się przez filtrację i dokładnie przemywa polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym, korzystnie DMF, wodą i na koniec alkoholem, takim jak MeOH. Żywicę Boc-AA 1 suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem.

Żywicę Boc-AA 1 wprowadza się do szklanego reaktora z dnem filtra wykonanym z grubego topionego szkła. Żywicę przemywa się chlorowanym rozpuszczalnikiem, takim jak DCM, odblokowuje kwasem organicznym, najlepiej 25% TFA w DCM, krótko przemywa chlorowanym roztworem, takim jak DCM i alkoholem, takim jak MeOH, zobojętnia się zasadą organiczną, korzystnie trietyloaminą w DCM i ponownie przemyto DCM i polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym, takim jak DMF, otrzymując odbezpieczoną żywicę AA1.

Dowolna pożądana liczba aminokwasów jest następnie ewentualnie przyłączana do odblokowanej żywicy AA1. Jeśli następny aminokwas ma grupę α-aminową z zabezpieczeniem Fmoc (Fmoc-AA x), wówczas grupa łańcucha bocznego albo nie wymaga zabezpieczenia (na przykład Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe lub Fmoc- Thr) lub łańcuch boczny chroni grupę odporną na zasady. Nadmiar molowy Fmoc-AA x (gdzie x to numer pozycji aminokwasu w peptydzie, liczony od C-końca) jest przyłączany na około 60 minut do odbezpieczonej żywicy AA 1 za pomocą odczynnika do wzrostu peptydów, takiego jak diizopropylokarbodiimid (DIC), w mieszaninie DCM/DMF. Żywicę addycyjną przemyto DMF, alkoholem i DCM, otrzymując żywicę Fmoc-AAx-AA1. Przyczepność można sprawdzić metodą ninhydrynową Kaisera. Następnie żywicę Fmoc-AAx-AA1 przemywa się jeden raz DMF, a następnie odblokowuje się roztworem zasady w rozpuszczalniku organicznym, takim jak piperydyna w DMF, otrzymując żywicę AAx-AA1. Następnie żywicę AAx-AA1 przemywa się DMF, po czym przemywa się kilka razy alkoholem, takim jak MeOH i DCM. Następnie żywicę AAx-AA1 przemywa się jeden raz DMF przez około 3 minuty, trzy razy izopropanolem, korzystnie za każdym razem przez około 2 minuty, i trzy razy DCM, korzystnie za każdym razem przez około 2 minuty. Żywica jest wtedy gotowa do dalszego przyłączenia albo aminokwasu zabezpieczonego Fmoc, jak opisano powyżej, albo aminokwasu zabezpieczonego Boc, jak opisano poniżej.

Podobnie, jeśli jakikolwiek kolejny aminokwas, który ma być przyłączony do odbezpieczonej żywicy AA 1 jest wybrany z zabezpieczoną grupą Boc-aminową (Boc-AA x), to albo nie jest wymagane żadne zabezpieczenie dla grupy łańcucha bocznego (może to być Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe lub Boc-Thr) lub łańcuch boczny musi być zabezpieczony grupą odporną na usuwanie zarówno przez kwas, jak i zasadę, którą może być Boc-Cys(Acm). Jeśli wybrano Boc-AAx, jest on przyłączany przy użyciu tych samych odczynników i rozpuszczalników, jak opisano powyżej dla Fmoc-aminokwasów, a kompletność (kompletność) przyłączenia można sprawdzić metodą Kaisera z ninhydryną. Następnie żywicę Boc-AAx-AA1 odbezpiecza się roztworem kwasu w rozpuszczalniku organicznym, takim jak TFA w DCM, otrzymując żywicę CF3CO-H+-AAx-AA1. Żywicę tę następnie przemywa się kilka razy chlorowanym rozpuszczalnikiem, takim jak DCM, alkoholem, takim jak MeOH, i neutralizuje zasadą nienukleofilową, taką jak trietyloamina w DCM, a następnie przemywa się jeszcze kilka razy chlorowanym rozpuszczalnikiem, takim jak DCM, otrzymując AA x -AA 1 - żywica. Żywica jest wtedy gotowa do dalszego przyłączania zabezpieczonego aminokwasu Boc lub Fmoc, jak opisano powyżej.

W zależności od pożądanej sekwencji peptydu i rodzaju zastosowanego aminokwasu zabezpieczonego α-amino (zabezpieczony Fmoc lub Boc), stosuje się odpowiednią kombinację powyższych procedur przyłączania, w zależności od tego, który aminokwas ma zająć miejsce w sekwencja peptydu - łańcuch boczny, posiadający grupę zabezpieczającą, którą można usunąć zasadą konieczną do usunięcia Fmoc z grupy α-aminowej lub kwasem niezbędnym do usunięcia Boc z grupy α-aminowej. Takim zabezpieczonym aminokwasem może być N-β-Boc-N″-β-Fmoc-lizyna lub N-β-Fmoc-N″-β-Boc-lizyna. Jeśli tak jest, wszystkie wybieralne grupy zabezpieczające dla grup α-aminowych kolejnych aminokwasów, aż do N-końcowego aminokwasu, muszą być zgodne z zabezpieczającą grupą boczną wybraną dla tej pozycji. Oznacza to, że grupy zabezpieczające łańcuchy boczne muszą być odporne na środek odblokowujący stosowany do odbezpieczania grup α-aminowych kolejnych aminokwasów. W przypadku N-końcowego aminokwasu Boc lub Fmoc można zastosować jako zabezpieczenie α-aminowe, ponieważ odbezpieczenie N-końcowego aminokwasu może jednocześnie odbezpieczyć niektóre z zabezpieczonych łańcuchów bocznych bez niepożądanego wpływu na strategię syntezy peptydów, ponieważ nie aminokwasy są już dostępne.

Ukończony łańcuch peptydowy, który nadal jest przyłączony do żywicy, musi zostać odbezpieczony i uwolniony. W celu usunięcia wszystkich odpornych na działanie zasad grup ochronnych i α-aminowej grupy blokującej N-końcowego aminokwasu, jeśli ma to zastosowanie, peptyd na żywicy traktuje się kwasem w rozpuszczalniku organicznym, takim jak TFA w DCM. W celu usunięcia wszelkich odpornych na kwas grup ochronnych i grupy blokującej grupę a-aminową N-końcowego aminokwasu, jeśli ma to zastosowanie, peptyd na żywicy traktuje się zasadą organiczną, taką jak piperydyna w DMF. Alternatywnie, kwasoodporne grupy mogą być zachowane aż do ich usunięcia po kolejnym rozszczepieniu peptydu amoniakiem lub zasadą aminową. Peptyd na odbezpieczonej żywicy przemywa się następnie chlorowanym rozpuszczalnikiem, takim jak DCM, alkoholem, takim jak MeOH i suszy do stałej wagi pod zmniejszonym ciśnieniem.

Peptyd odszczepia się od żywicy i C-koniec przekształca się w amid przez zawieszenie peptydu na żywicy w 3:1 MeOH/DMF. Zawiesinę schładza się do temperatury poniżej około 10°C w atmosferze azotu i pod powierzchnię rozpuszczalnika wprowadza się bezwodny gazowy amoniak aż do nasycenia nim roztworu, utrzymując temperaturę poniżej około 10°C. Zawiesinę delikatnie miesza się przez około 24 godziny, pozwalając na wzrost temperatury do około 20°C. Stopień zakończenia reakcji sprawdza się przez zanikanie pośredniego estru metylowego w HPLC w odpowiednich warunkach w zależności od typu peptydu. Mieszaninę reakcyjną ochładza się i dodaje wymaganą ilość bezwodnego amoniaku, aż powierzchnia piku odpowiadająca estrowi metylowemu na HPLC będzie mniejsza niż 10% powierzchni piku pożądanego produktu. Zawiesinę ochłodzono do temperatury poniżej około 10°C i mieszanie kontynuowano przez noc w celu wytrącenia peptydu. Osad i żywicę oddziela się przez filtrację i przemywa zimnym MeOH. Osad i żywicę suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem, produkt ekstrahuje się z żywicy wodnym roztworem kwasu octowego.

Jeśli peptyd zawiera w swojej sekwencji zabezpieczone reszty Cys, grupy tiolowe można odbezpieczyć i reszty cyklizować zgodnie z następującą procedurą. Peptyd zawierający zabezpieczone grupy Asm Cys rozpuszcza się w wodnym roztworze kwasu octowego w atmosferze azotu. Roztwór szybko miesza się i dodaje w jednej porcji roztwór jodu w alkoholu. Mieszaninę miesza się i sprawdza metodą HPLC na całkowite odbezpieczenie. Następnie reakcję zatrzymuje się przez miareczkowanie 2% roztworem tiosiarczanu sodu do zaniku barwy roztworu. Surową mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii preparatywnej na wkładzie C8 z gradientem acetonitrylu w 0,1 buforze octanu amonu, odsolono na wkładzie C8 z gradientem acetonitrylu w 0,25 N kwasie octowym i liofilizowano, otrzymując docelowy peptyd.

Przykład wykonania wynalazku

Poniższy przykład ma na celu zilustrowanie sposobu według niniejszego wynalazku i nie powinien być interpretowany jako ograniczający jego zakres.

Przykład 1. H2-D--Nal-Thr-NH2

A) Żywica Boc-L-Thr

Roztwór 2,58 g węglanu cezu w 2,5 ml wody powoli dodano do roztworu 3,48 g Boc-L-treoniny (Bachem California, Torrance, CA) rozpuszczonej w 7 ml metanolu. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie cały metanol i całą wodę usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując suchy proszek soli cezowej Boc-L-treoniny. 10 g żywicy Maryfield (chlorometylowany polistyren, 200-400 mesh, zawartość chloru 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) przemyto dichlorometanem (DCM), metanolem (MeOH) i dimetyloformamidem (DMF) (każdy 2 razy 70 ml). Proszek soli cezowej Boc-L-treoniny rozpuszczono w 60 ml suchego DMF i roztwór połączono z żywicą przemytą jak powyżej. Zawiesinę delikatnie mieszano w temperaturze około 50-60°C przez około 85 do 90 godzin w atmosferze azotu. Żywicę odsączono i dokładnie przemyto DMF, wodą dejonizowaną i na koniec MeOH. Żywicę Boc-treoninę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w około 40°C. Zawartość treoniny wynosiła 0,85 ± 0,15 meq/g suchej żywicy.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica

2,0 g żywicy Boc-treoniny z etapu (A) wprowadzono do 50 ml szklanego reaktora z dnem filtra z grubego topionego szkła (obciążenie 1,74 mmol). Żywicę przemyto 2 razy DCM (20 ml), każdorazowo po około 5 minut, odblokowano 25% TFA w DCM (30 ml) - pierwszy raz przez około 2 minuty i drugi raz przez około 25 minut, przemyto 3 razy przez ok. 2 min DCM (20 ml), izopropanol (20 ml) i DCM (20 ml), zneutralizowano dwukrotnie po ok. 5 min 10% trietyloaminą w DCM (20 ml), przemyto 3 razy po ok. 2 min DCM i przemyto raz DMF (20 ml) przez około 5 min.

Do odblokowanej żywicy dodano 1,8 g (4,35 mmola, 2,5 równ.) Fmoc-L-cysteiny (Acm) (Bachem, CA) i 683 μl (4,35 mmola, 2,5 równ.) diizopropylokarbodiimidu (DIC) w 14 ml 2:1 DCM/DMF przez około 1 h. Po dodaniu żywicę przemyto raz przez około 3 minuty DMF (20 ml), 3 razy przez około 2 minuty 2 min DXM (20 ml). Wiązanie sprawdzono metodą Kaiser nihydrin.

Po związaniu żywicę przemyto 1 raz DMF, a następnie odblokowano roztworem piperydyny w DMF. Odblokowaną żywicę następnie przemyto DMF i przemyto kilka razy jednocześnie MeOH i DCM. Żywicę sprzęgającą przemyto 1 raz przez około 3 minuty DMF (20 ml), 3 razy przez około 2 minuty izopropanolem (20 ml) i 3 razy DCM (20 ml) za każdym razem po około 2 minuty. Wiązanie badano metodą ninhydrynową Kaisera.

Każdy z następujących zabezpieczonych aminokwasów został przyłączony do przemytej żywicy przy użyciu DIC w DMF/DCM i uwolniony jak opisano powyżej w następującej kolejności: Fmoc-L-walina, Fmoc-L-lizyna (Boc), Fmoc-D-tryptofan, Fmoc-L-tyrozyna (O-t-Bu) i Fmoc-L-cysteina (Acm) (wszystkie z Bachem California), Boc-D-2-naftyloalanina (Synthethech, Albany, OR).

Ukończony łańcuch peptydowy odblokowano i dwukrotnie zabezpieczono 75:20:5 DCM/TFA/anizol (30 ml) przez około 2 minuty i około 25 minut, przemyto 3 razy po około 2 minuty za każdym razem DCM (20 ml), izopropanolem (10 ml) i DCM (20 ml), zobojętniono 2 razy przez około 5 minut 10% trietyloaminą w DCM (20 ml) i przemyto 3 razy przez około 2 minuty DCM (20 ml) i MeOH (20 ml). Żywicę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Sucha masa wynosiła 3,91 g (103% wydajności teoretycznej).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2,93 g żywicy obciążonej peptydem z etapu (B) (1,3 mmol-równ.) zawieszono w 50 ml mieszaniny 3:1 MeOH/DMF. Zawiesinę ochłodzono do temperatury poniżej około 10°C w atmosferze azotu i usunięto suchy gazowy amoniak aż do nasycenia nim roztworu, utrzymując temperaturę poniżej około 10°C. Zawiesinę delikatnie mieszano przez około 24 godziny, pozwalając na wzrost temperatury do około 20°C. Stopień zakończenia reakcji sprawdzono za pomocą HPLC (sorbent VYDAC®, wielkość ziarna 5 µm, wielkość porów 100 Å, C18, elucja w warunkach izokratycznych 26% CH 3CN w 0,1% TFA, sprawdzono zanik pośredniego estru metylowego) prędkość 1 ml/min, zapis przy 220 mm; w tych warunkach czas opóźnienia Rt ~ 14 min dla estru metylowego i ~ 9,3 min dla produktu amidowego). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono i dodano nadmiar bezwodnego amoniaku, aż powierzchnia piku odpowiadająca estrowi metylowemu na HPLC była mniejsza niż 10% powierzchni piku pożądanego produktu. Zawiesinę ochłodzono do temperatury poniżej około 10°C, mieszanie kontynuowano przez noc w celu wytrącenia peptydu. Osad i żywicę oddzielono przez odsączenie i przemyto 15 ml zimnego MeOH. Osad i żywicę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, produkt ekstrahowano z żywicy 50% wodnym roztworem kwasu octowego (3 x 30 ml). Analiza HPLC wykazała 870 mg (0,70 mmol) tytułowego produktu w mieszaninie (czystość 96% w izokratycznym układzie HPLC).

D) H-D--Nal--Thr-NH 2

500 mg (0,40 mmola) peptydu z etapu (B) rozpuszczono w 300 ml 4% kwasu octowego i ogrzewano do około 55°C w atmosferze azotu. Roztwór szybko mieszano iw jednej porcji dodano 2% wag./obj. roztwór jodu w 7,7 ml MeOH (0,60 mmol). Mieszaninę mieszano przez około 15 minut, następnie reakcję zatrzymano przez miareczkowanie 2% roztworem tiosiarczanu sodu do zaniku koloru (~2 ml). Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i przesączono. Mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii preparatywnej na kolumnie C8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) z gradientem acetonitrylu w 0,1 M octanie amonu, odsolono na kolumnie C8 YMC z gradientem acetonitrylu w 0,25 N kwasie octowym i liofilizowano uzyskując 350 mg docelowego peptydu o czystości 99%.

W oparciu o powyższy opis specjalista w tej dziedzinie może z łatwością rozpoznać zasadnicze cechy niniejszego wynalazku i bez odchodzenia od jego ducha i zakresu dokonać różnych zmian i modyfikacji wynalazku, aby dostosować go do różnych zastosowań i warunków. A zatem inne przykłady wykonania wynalazku są również objęte zastrzeżeniami.

PRAWO

1. Sposób wytwarzania peptydu o wzorze H-D--Nal--Thr-NH2, który to sposób obejmuje następujące etapy:

(a) przyłączenie pierwszego aminokwasu do stałej żywicy nośnikowej za pomocą wiązania eterowego w celu utworzenia „pierwszego produktu sprzęgania”, co obejmuje (i) poddanie reakcji wodnego roztworu węglanu cezu z alkoholowym roztworem pierwszego aminokwasu w celu utworzenia sól cezu pierwszego aminokwasu, (ii) otrzymanie wolnej od rozpuszczalnika soli cezu pierwszego aminokwasu, (iii) poddanie reakcji żywicy stałego nośnika z solą cezu pierwszego aminokwasu w bezwodnym polarnym rozpuszczalniku aprotonowym w celu utworzenia „produkt pierwszego dodatku”,

gdzie pierwszym aminokwasem jest Boc-L-Thr, co odpowiada C-końcowemu aminokwasowi tego peptydu, a żywicą ośrodka stałego jest żywica z polistyrenu chlorometylowanego;

(b) odbezpieczenie Boc z produktu pierwszej addycji kwasem z wytworzeniem „odbezpieczonego produktu pierwszej addycji”;

(c) Ewentualnie dodanie do „odblokowanego pierwszego produktu przyłączania” „następnego aminokwasu”, co obejmuje reakcję „następnego aminokwasu” z „odblokowanym pierwszym produktem przyłączania” w rozpuszczalniku organicznym zawierającym odczynnik do wzrostu peptydów w celu uzyskania „zablokowany następny produkt aminokwasowy”. dodatek”, a „następny aminokwas” ma grupę aminową zablokowaną przez Boc w łańcuchu głównym, a jeśli ten „następny aminokwas” ma jedną lub więcej grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym, to grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym nie wymagają zabezpieczenia lub te grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym mają grupy zabezpieczające, które są trwałe wobec odpowiednio kwasowych lub zasadowych środków odbezpieczających, Boc i Fmoc;

(d) odbezpieczanie Boc od „zablokowanego następnego produktu”, które obejmuje reakcję „zablokowanego następnego produktu” z kwasem w celu uzyskania „odblokowanego następnego produktu”;

(e) opcjonalnie, powtarzając etapy (c) i (d), przy czym każdy cykl wytwarza „odblokowany produkt (X+1)-tego następnego przyłączenia”, gdzie X jest liczbą żądanych powtórzeń cyklu;

(e) dodanie „następnego aminokwasu” do „odblokowanego produktu pierwszego wiązania” z etapu (b) lub, opcjonalnie, do „odblokowanego produktu (X+1)-tego następnego wiązania” z etapu (e), co obejmuje przeprowadzenie reakcji „następnego aminokwasu” z określonym „odblokowanym produktem pierwszego przyłączenia” lub z określonym „odblokowanym produktem następnego przyłączenia (X + 1)” w rozpuszczalniku organicznym zawierającym odczynnik do wzrostu peptydu aby otrzymać „zablokowany następny produkt przyłączania”, a ten „następny aminokwas” ma grupę aminową głównego łańcucha zablokowaną przez Fmoc, pod warunkiem, że jeśli ten „następny aminokwas” ma jedną lub więcej grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym, to grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym nie wymagają zabezpieczenia lub grupy funkcyjne w łańcuchu bocznym mają grupy zabezpieczające, które są odporne na odczynniki alkaliczne stosowane do odbezpieczenia Fmoc;

(g) odblokowanie „zablokowanego następnego produktu” Fmoc, które obejmuje reakcję „zablokowanego następnego produktu” z pierwszorzędową lub drugorzędową aminą w celu otrzymania „odblokowanego następnego produktu”;

(h) opcjonalnie powtarzając etapy (e) i (g), przy czym każdy cykl wytwarza „odblokowany produkt (X+1)-tego następnego przyłącza”, gdzie X jest pożądaną liczbą powtórzeń cyklu, dopóki nie zostaną one uwzględnione w uwalniany jest peptyd i przedostatni aminokwas;

(i) dodanie N-końcowego aminokwasu do „odblokowanego produktu (X+1)-tego następnego przystąpienia”, co obejmuje reakcję N-końcowego aminokwasu z „odblokowanym produktem (X+1)-tego następnego przyłączenie” w rozpuszczalniku organicznym zawierającym odczynnik do wydłużania peptydu z wytworzeniem „zablokowanego kompletnego produktu przyłączania”, w którym „aminokwas N-końcowy” ma szkieletową grupę aminową zablokowaną przez Boc lub Fmoc;

(j) odbezpieczanie Boc lub Fmoc z „zablokowanego gotowego produktu” obejmującego reakcję „zablokowanego gotowego produktu” z kwasem w przypadku Boc lub zasadą w przypadku Fmoc z wytworzeniem gotowego produktu peptydowego na żywicy;

(j) jeśli „produkt peptydowy zakończony żywicą” ma grupy funkcyjne łańcucha bocznego, wówczas ewentualnie odbezpieczenie grup funkcyjnych łańcucha bocznego „produktu peptydowego zakończonego żywicą”, co obejmuje reakcję „produktu peptydowego zakończonego żywicą” z odpowiednimi odczynnikami odbezpieczającymi do wytworzenia „kompletnego produktu peptydowego na odbezpieczonej żywicy”; oraz

(k) odszczepianie peptydu od nośnika w postaci stałej żywicy „gotowego produktu peptydowego na żywicy” lub „sfinalizowanego produktu peptydowego na odblokowanej żywicy” w celu uzyskania peptydu, które obejmuje reakcję „gotowego produktu peptydowego na żywicy” lub „gotowego produktu peptydowego na żywicy” żywica"; żywica odbezpieczona" amoniakiem, aminą pierwszorzędową lub aminą drugorzędową aż do prawie całkowitego odszczepienia peptydu z żywicy;

pod warunkiem, że etapy (e) i (g) w syntezie peptydu przeprowadza się sześć razy po utworzeniu „odblokowanego produktu pierwszego przyłączenia” o wzorze H-L-Thr-żywica, gdzie kolejne aminokwasy są przyłączone w kolejność: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc-L-Cys( Acm) z wytworzeniem H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym amoniak, amina pierwszorzędowa lub amina drugorzędowa w etapie (k) jest w rozpuszczalniku zawierającym alkohol i ewentualnie polarny rozpuszczalnik aprotonowy.

3. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym etap (l) obejmuje ponadto następujące etapy:

(i) wytrącenie rozszczepionego peptydu z rozpuszczalnika;

(ii) odsączenie stałego nośnika z żywicy i wytrąconego peptydu, oraz

(iii) ekstrakcji peptydu kwaśnym roztworem w celu wyizolowania peptydu.

4. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym pierwszym aminokwasem jest sól cezowa Boc-L-Thr, dająca żywicę Boc-L-Thr jako pierwszy produkt sprzęgania i „odblokowany pierwszy produkt sprzęgania " to żywica H-L-Thr.

5. Sposób według zastrzeżenia 4, w którym kwasem stosowanym do usunięcia grupy zabezpieczającej Boc w etapie (i) jest kwas trifluorooctowy (TFA).

6. Sposób według zastrzeżenia 5, w którym rozpuszczalnikiem organicznym jest chlorek metylenu, chloroform lub dimetyloformamid, a odczynnikiem do wzrostu peptydów jest diizopropylokarbodiimid, dicykloheksylokarbodiimid lub N-etylo-N"-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid.

7. Sposób według zastrzeżenia 6, obejmujący przyłączenie Boc-D--Nal do H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica zgodnie z etapem (i) z wytworzeniem Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica.

8. Sposób według zastrzeżenia 7, obejmujący jednoczesne usunięcie grupy Boc blokującej D--Nal, grupy O-t-Bu zabezpieczającej Tyr i grupy Boc zabezpieczającej Lys w Boc-D-Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica, zgodnie z etapem (d), aby otrzymać gotowy produkt peptydowy na żywicy o wzorze H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica.

9. Sposób według zastrzeżenia 8, obejmujący odszczepienie peptydu H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr ze stałej żywicy przez przeprowadzenie reakcji H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-żywica z amoniakiem w rozpuszczalniku zawierającym alkohol i opcjonalnie aprotonowy rozpuszczalnik polarny aż do zasadniczo całkowitej eliminacji z wytworzeniem H-D-Nal -Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

10. Sposób według zastrzeżenia 9, w którym alkoholem jest metanol, a polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym jest dimetyloformamid.

11. Sposób według zastrzeżenia 10, obejmujący jednoczesne usuwanie grup Acm zabezpieczających Cys i cyklizowanie otrzymanych odbezpieczonych reszt Cys w ​​„kompletnym produkcie peptydowym na żywicy” o wzorze H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 przez przeprowadzenie reakcji H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 roztworem jodu w alkoholu do zasadniczo całkowitego odbezpieczenia i cyklizacji z wytworzeniem H-D-Nal-Thr-NH2.

Syntezę peptydów w fazie stałej zaproponował R. B. Merrifield z Rockefeller University (Nagroda Nobla 1984). Metoda ta opiera się na składaniu peptydu na nierozpuszczalnym nośniku polimerowym przez sekwencyjne dodawanie reszt aminokwasowych z zabezpieczonymi grupami α-aminowymi i bocznymi. Plan zakładał składanie łańcucha peptydowego etapami, przy czym łańcuch miał jeden koniec przymocowany do stałego podłoża podczas syntezy. W rezultacie izolowanie i oczyszczanie pośrednich i docelowych pochodnych peptydów zostało ograniczone do prostej filtracji i dokładnego przemywania stałego polimeru w celu usunięcia nadmiaru reagentów i produktów ubocznych pozostających w roztworze.

Termin faza stała odnosi się raczej do właściwości fizycznych substancji na nośniku, ponieważ reakcja chemiczna na nośniku polimerowym przebiega w jednej fazie - w roztworze. W odpowiednim rozpuszczalniku polimer pęcznieje, przechodząc w żel o niskiej lepkości, ale o dużej strukturze (polimery usieciowane) lub rozpuszcza się (w przypadku polimerów nieusieciowanych), a proces syntezy zachodzi na poziomie ultramikroheterogenicznym, w praktycznie układ jednorodny.

Synteza organiczna w fazie stałej wymaga podłoża polimerowego - żywicy S do którego linker jest dołączony Ł. Na pierwszym etapie cząsteczka substratu jest przyłączona do łącznika ALE.Cząsteczka ALE unieruchomiony (tj. przestaje być mobilny), ale zachowuje zdolność reagowania z innym odczynnikiem W(etap 2).

Produkt AB pozostaje na żywicy, umożliwiając jej oddzielenie od nadmiaru odczynnika W(i produktów ubocznych) przez proste mycie. (Możesz dodawać wszystkie nowe odczynniki, sukcesywnie komplikując oryginalny substrat ALE, najważniejsze jest to, że łącznik pozostaje niezmieniony w tych reakcjach). Łącznik dwufunkcyjny Ł jest dobrany tak, aby jego połączenie z żywicą S był trwalszy niż z podłożem ALE. Następnie na ostatnim etapie związek docelowy AB można oddzielić od żywicy, niszcząc jej połączenie z łącznikiem. Wiadomo, że połączenie Ł-AB muszą być rozszczepiane w łagodnych warunkach bez uszkadzania samego związku (wiązanie ALE-W), ani kontaktu łącznika z żywicą (wiązanie Ł-S).

Tak więc, w idealnym przypadku, przemywając żywicę po każdym etapie i rozszczepiając wiązanie z nośnikiem, otrzymuje się czystą substancję. Naturalnym jest założenie, że zastosowanie dużego nadmiaru reagentów i późniejsze oddzielenie od żywicy w wielu przypadkach umożliwia przesunięcie równowagi chemicznej w kierunku powstania docelowego produktu i skrócenie czasu syntezy. Do wad syntezy organicznej w fazie stałej należy zaliczyć konieczność stosowania odpowiednio dużego nadmiaru (2–30 równoważników) reagentów, trudności w identyfikacji pośrednich produktów syntezy oraz stosunkowo wysoki koszt modyfikowanych nośników polimerowych, o którym decyduje koszt linker.

Wprowadzony przez Merrifielda do praktyki syntezy organicznej chlorometylopolistyren (usieciowany niewielką ilością diwinylobenzenu), tzw. żywica Merrifielda, jest najbardziej dostępnym z nośników polimerowych.

Metodyka i główne etapy syntezy peptydów w fazie stałej

Zadanie polega na wprowadzeniu nośnika polimerowego ze szczepionym aminokwasem do reakcji z heterocyklem aktywowanym do podstawienia. Rozważmy bardziej szczegółowo metodologiczny aspekt otrzymywania unieruchomionych aminokwasów na nośnikach polimerowych.

Etap1. Immobilizacja N-zabezpieczonego aminokwasu na nośniku polimerowym.

Pierwszym etapem naszego schematu jest immobilizacja aminokwasu na nośniku polimerowym. Aby uniknąć takich procesów ubocznych jak tworzenie się oligopeptydów, aminokwas jest wstępnie zabezpieczany. Zazwyczaj stosuje się N-zabezpieczone aminokwasy, a powstające wiązanie między aminokwasem a nośnikiem jest typu amidu lub estru.

Najczęściej stosowanymi zabezpieczeniami grup aminowych w syntezie organicznej w fazie stałej są grupy zabezpieczające typu karbaminianowego tert-butoksykarbonyl (Boc) i 9H-fluorenylometoksykarbonyl (Fmoc), X to grupa zabezpieczona:

Należy zauważyć, że o wyborze grupy zabezpieczającej decyduje rodzaj zastosowanego nośnika polimerowego. Warunki immobilizacji zabezpieczonych aminokwasów są różne dla różnych rodzajów nośników polimerowych. Przeprowadza się immobilizację Boc-aminokwasów na żywicy Merrifielda, którą jest chlorometylowany polistyren na miejscu w postaci soli cezu z dodatkiem zawiesiny węglanu cezu we ftalanie dimetylu (DMF) oraz katalitycznych ilości jodku potasu. Nadmiar reagentów w stosunku do ilości nośnika dobierany jest każdorazowo indywidualnie i wynosi 1,5-4 równoważników.

Immobilizację Fmoc-aminokwasów na nośniku polimerowym Wang (X=O) w celu utworzenia łącznika estrowego typu benzylowego przeprowadza się metodą karbodiimidową z użyciem diizopropylokarbodiimidu (DIC) w obecności 4-(dimetyloamino)pirydyny (DMAP) jako katalizator. Reakcja immobilizacji z aminokwasami bez przeszkód przestrzennych przebiega w temperaturze pokojowej. Immobilizacja aminokwasów z zawadą przestrzenną wymaga prowadzenia reakcji w temperaturze 40–60°C przez 2 dni i powtórzenia immobilizacji (Schemat 1). - aminokwasów na nośniku polimerowym Rinka (X=NH) z utworzeniem łącznika amidowego typu benzhydrylowego w obecności odczynnika Castro (1H-1,2,3-benzotriazol-1-yloksy) tris-(dimetyloamino)heksafluorofosforan fosfoniowy (BOP), zasada diizopropyloetyloaminowa (DIEA) i 1-hydroksybenzotriazol (HOBt), jako katalizator. Reakcja przebiega w temperaturze pokojowej przez 2 godziny dla aminokwasów bez zawady przestrzennej i 4-6 godzin dla aminokwasów z zawadą przestrzenną.

Etap 2Odbezpieczanie chronionego aminokwasu na nośniku polimerowym

W drugim planowanym przez nas etapie (po unieruchomieniu chronionego aminokwasu) wymagane jest usunięcie grupy zabezpieczającej w celu aktywacji grupy aminowej. Sposoby usuwania zabezpieczenia Boc i Fmoc są różne. Usunięcie zabezpieczenia Boc aminokwasów na żywicy Merrifielda przeprowadza się za pomocą 50% kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie przez pół godziny, w tych warunkach łącznik Merrifielda pozostaje nienaruszony.

Po odbezpieczeniu żywicę przemywa się roztworem trietyloaminy w celu usunięcia kwasu trifluorooctowego. Usuwanie zabezpieczenia Fmoc aminokwasów na nośnikach Wang (X=O) i Rink (X=NH) przeprowadza się za pomocą 20% roztworu piperydyny w DMF przez 40-50 min.

Znaczny spadek masy żywicy po usunięciu zabezpieczenia Fmoc może posłużyć jako podstawa do grawimetrycznego określenia stopnia immobilizacji zabezpieczonych aminokwasów na pierwszym etapie syntezy w fazie stałej. Zaleca się sekwencyjne traktowanie żywicy roztworem piperydyny we ftalanie dimetylu, najpierw przez 5–10 minut, a następnie 30 minut w świeżym roztworze. Po odbezpieczeniu żywicę przemywa się co najmniej 4 razy ftalanem dimetylu w celu usunięcia produktów zniszczenia zabezpieczenia Fmoc. Monitorowanie przebiegu reakcji acylowania na nośniku lub usuwanie funkcji ochronnej z grupy aminowej jest możliwe za pomocą testu Kaisera.

Etap 3Substytucja nukleofilowa w heterocyklach z udziałem aminokwasu immobilizowanego na nośniku

Kolejnym planowanym przez nas etapem do praktycznej realizacji jest reakcja aromatycznej podstawienia nukleofilowego; szczepiony aminokwas służy jako nukleofil, a aktywowany heterocykl jest w roztworze. Większość reakcji podstawienia nukleofilowego w nośnikach nie różni się przebiegiem od reakcji w fazie ciekłej. Należy jednak pamiętać, że temperatura procesu nie powinna przekraczać 120 С, powyżej której styropianowe podłoże nośnika zaczyna się rozkładać. W warunkach reakcji prowadzonej na nośniku, łącznik również musi być zachowany.

Przy wyborze odpowiednich aktywowanych substratów heterocyklicznych należy wziąć pod uwagę charakter grupy opuszczającej w heterocyklu.

Etap 4Usuwanie docelowego związku z nośników polimerowych

Większość łączników w syntezie organicznej w fazie stałej ulega rozszczepieniu w środowisku kwaśnym. Odporność łączników na kwas gwałtownie spada, gdy przechodzi się z żywicy Merrifielda na żywicę Wanga i Rink. Łącznik Rink rozszczepia się w łagodniejszych warunkach (10–20% CF3COOH) niż łącznik Wanga (50% CF3COOH).Żywica Merrifielda jest w tych warunkach pasywna, a do jej rozszczepienia stosuje się transestryfikację w roztworze NaOMe/MeOH, co prowadzi do powstania kwasowy ester.

Przypomnijmy jeszcze raz, że natura łącznika determinuje rodzaj funkcji końcowej w utworzonej cząsteczce usuniętej z podłoża. Żywica Wanga pozwala uzyskać kwasy, a żywica Rinka - amidy.

Zalety tego schematu syntezy peptydów w fazie stałej:

1. Różne związki macierzyste mogą być związane z poszczególnymi kulkami. Te granulki są następnie mieszane, dzięki czemu wszystkie związki wyjściowe mogą oddziaływać z odczynnikiem w jednym eksperymencie. W rezultacie produkty reakcji tworzą się na oddzielnych granulkach. W większości przypadków mieszanie surowców w tradycyjnej chemii cieczy zazwyczaj prowadzi do niepowodzeń – polimeryzacji lub gumowania produktów. Eksperymenty na stałym podłożu wykluczają te efekty.

2. Ponieważ surowce i produkty są związane ze stałym nośnikiem, nadmiar reagentów i produktów nienośnych można łatwo zmyć z polimerowego stałego nośnika.

3. Duże nadmiary odczynników mogą być użyte do doprowadzenia reakcji do końca (powyżej 99%), ponieważ nadmiary te można łatwo oddzielić.

4. Używając małych objętości wsadu (mniej niż 0,8 mmol na gram nośnika), można uniknąć niepożądanych reakcji ubocznych.

5. Półprodukty w mieszaninie reakcyjnej są związane z granulkami i nie wymagają oczyszczania.

6. Pojedyncze kulki polimeru można oddzielić na końcu eksperymentu iw ten sposób otrzymać pojedyncze produkty.

7. Podłoże polimerowe można regenerować w tych przypadkach, gdy dobrane zostaną warunki rozrywania i dobrane zostaną odpowiednie grupy kotwiczące - łączniki.

8. Możliwa jest automatyzacja syntezy w fazie stałej.

Niezbędnymi warunkami syntezy w fazie stałej, oprócz obecności nierozpuszczalnego substratu polimerowego, który jest obojętny w warunkach reakcji, są:

Obecność kotwicy lub łącznika jest funkcją chemiczną zapewniającą połączenie podłoża z aplikowaną masą. Musi być kowalencyjnie związany z żywicą. Kotwica musi być również reaktywną grupą funkcyjną, aby substraty mogły z nią oddziaływać.

Wiązanie utworzone między substratem a łącznikiem musi być stabilne w warunkach reakcji.

Muszą istnieć sposoby na zerwanie połączenia produktu lub produktu pośredniego z łącznikiem.