Separation av proteiner från föroreningar med låg molekylvikt
Membransiktningsmetod (dialys)
Ett dialysmembran används som är en polymer och har porer av en viss storlek. Små molekyler (föroreningar med låg molekylvikt) passerar genom porerna i membranet och stora molekyler (proteiner) hålls kvar. På så sätt tvättas proteinerna bort från föroreningar.
Separation av proteiner efter molekylvikt
Gelkromatografi
Den kromatografiska kolonnen är fylld med gelgranulat (Sephadex), som har porer av en viss storlek. En blandning av proteiner tillsätts till kolonnen. Proteiner vars storlek är mindre än storleken på Sephadex-porerna hålls kvar i kolonnen, eftersom de "fastnar" i porerna, medan resten fritt lämnar kolonnen. Storleken på ett protein beror på dess molekylvikt.
Ultracentrifugering
Denna metod är baserad på olika sedimenteringshastigheter (utfällning) av proteinmolekyler i lösningar med olika densitetsgradienter (sackarosbuffert eller cesiumklorid).
Elektrofores
Denna metod är baserad på olika migrationshastigheter av proteiner och peptider i ett elektriskt fält beroende på laddningen.
Geler, cellulosaacetat och agar kan fungera som bärare för elektrofores. Molekylerna som separeras rör sig i gelén beroende på deras storlek: de som är stora kommer att försenas när de passerar genom geléns porer. Mindre molekyler kommer att stöta på mindre motstånd och rör sig därför snabbare. Som ett resultat, efter elektrofores, kommer stora molekyler att vara närmare starten än mindre.
Elektrofores kan användas för att separera proteiner efter molekylvikt. För att göra detta används PAGE-elektrofores i närvaro av natriumdodecylsulfat (SDS-Na).
DDS-Na är en difil substans och innehåller en laddad grupp och en hydrofob. Proteiner binder till SDS-Na med sina hydrofoba radikaler och blir i processen denaturerad. På detta sätt är proteinerna inriktade i form och laddning. Efter detta beror proteinets rörlighet under elektrofores endast på dess molekylvikt.
salta ut: utfällning med salter av alkali, alkaliska jordartsmetaller (natriumklorid, magnesiumsulfat), ammoniumsulfat; proteinets primära struktur är inte störd;
deposition: användning av vattenavlägsnande ämnen: alkohol eller aceton vid låga temperaturer (cirka –20 С).
När man använder dessa metoder förlorar proteiner sitt hydratiseringsskal och faller ut i lösning.
Denaturering- brott mot den rumsliga strukturen hos proteiner (molekylens primära struktur bevaras). Den kan vara reversibel (proteinstrukturen återställs efter att det denaturerande medlet avlägsnats) eller irreversibel (molekylens rumsliga struktur återställs inte, till exempel när proteiner fälls ut med koncentrerade mineralsyror, salter av tungmetaller).
Metoder för proteinseparation Separation av proteiner från lågmolekylära föroreningar
Dialys
Ett speciellt polymermembran används, som har porer av en viss storlek. Små molekyler (föroreningar med låg molekylvikt) passerar genom porerna i membranet och stora molekyler (proteiner) hålls kvar. Således tvättas proteiner bort från föroreningar.
Separation av proteiner efter molekylvikt
Gelkromatografi
Den kromatografiska kolonnen är fylld med gelgranulat (Sephadex), som har porer av en viss storlek. En blandning av proteiner tillsätts till kolonnen. Proteiner vars storlek är mindre än storleken på Sephadex-porerna hålls kvar i kolonnen, eftersom de "fastnar" i porerna, medan resten fritt lämnar kolonnen (Fig. 2.1). Storleken på ett protein beror på dess molekylvikt.
Ris. 2.1. Proteinseparation genom gelfiltrering
Ultracentrifugering
Denna metod är baserad på olika sedimenteringshastigheter (fällning) av proteinmolekyler i lösningar med olika densitetsgradienter (sackarosbuffert eller cesiumklorid) (Fig. 2.2).
Ris. 2.2. Separation av proteiner genom ultracentrifugering
Elektrofores
Denna metod är baserad på olika migrationshastigheter av proteiner och peptider i ett elektriskt fält beroende på laddningen.
Geler, cellulosaacetat och agar kan fungera som bärare för elektrofores. Separerade molekyler rör sig i gelén beroende på deras storlek: de som är större kommer att försenas när de passerar genom geléns porer. Mindre molekyler kommer att stöta på mindre motstånd och rör sig därför snabbare. Som ett resultat, efter elektrofores, kommer större molekyler att vara närmare starten än mindre (Fig. 2.3).
Ris. 2.3. Proteinseparation genom gelelektrofores
Elektrofores kan också användas för att separera proteiner efter molekylvikt. För detta använder de PAGE-elektrofores i närvaro av natriumdodecylsulfat (SDS-Na).
Isolering av enskilda proteiner
Affinitetskromatografi
Metoden bygger på proteiners förmåga att binda starkt till olika molekyler genom icke-kovalenta bindningar. Används för isolering och rening av enzymer, immunglobuliner och receptorproteiner.
Molekyler av ämnen (ligander), till vilka vissa proteiner specifikt binder, kombineras kovalent med partiklar av ett inert ämne. Proteinblandningen tillsätts till kolonnen och det önskade proteinet fästs stadigt till liganden. De återstående proteinerna lämnar kolonnen fritt. Det kvarhållna proteinet kan sedan tvättas ut från kolonnen med användning av en buffertlösning innehållande den fria liganden. Denna mycket känsliga metod gör att mycket små mängder protein kan isoleras i ren form från ett cellextrakt som innehåller hundratals andra proteiner.
Isoelektrisk fokusering
Metoden är baserad på olika IET-värden av proteiner. Proteiner separeras genom elektrofores på en platta med amfolin (detta är ett ämne i vilket en pH-gradient i intervallet från 3 till 10 är förbildad). Under elektrofores separeras proteiner enligt deras IET-värde (i IET kommer laddningen av proteinet att vara noll, och det kommer inte att röra sig i det elektriska fältet).
2D elektrofores
Det är en kombination av isoelektrisk fokusering och elektrofores med SDS-Na. Elektrofores utförs först i horisontell riktning på en platta med amfolin. Proteiner separeras enligt laddning (IET). Därefter behandlas plattan med en SDS-Na-lösning och elektrofores utförs i vertikal riktning. Proteiner separeras baserat på molekylvikt.
Immunelektrofores (Western blot)
En analysmetod som används för att identifiera specifika proteiner i ett prov (Figur 2.4).
Isolering av proteiner från biologiskt material.
Separation av proteiner efter molekylvikt genom elektrofores i PAGE med SDS-Na.
Överföring av proteiner från gelén till en polymerplatta för att underlätta vidare arbete.
Behandling av plattan med en lösning av ospecifikt protein för att fylla de återstående porerna.
Sålunda, efter detta steg, erhålls en platta, vars porer innehåller separerade proteiner, och utrymmet mellan dem är fyllt med ett ospecifikt protein. Nu måste vi avgöra om det bland proteinerna finns det vi letar efter som är ansvarigt för någon sjukdom. Antikroppsbehandling används för detektion. Primära antikroppar är antikroppar mot proteinet av intresse. Sekundära antikroppar betyder antikroppar mot primära antikroppar. En extra speciell märkning (den så kallade molekylära proben) läggs till de sekundära antikropparna så att resultaten sedan kan visualiseras. Ett radioaktivt fosfat eller enzym som är tätt bundet till en sekundär antikropp används som märkning. Att binda först till primära och sedan till sekundära antikroppar har två syften: standardisering av metoden och förbättring av resultat.
Behandling med en lösning av primära antikroppar bindning sker på den plats av plattan där antigenet (det önskade proteinet) finns.
Avlägsnande av obundna antikroppar (tvättning).
Behandling med en lösning av märkta sekundära antikroppar för efterföljande utveckling.
Avlägsnande av obundna sekundära antikroppar (tvättning).
Ris. 2.4. Immunelektrofores (Western blot)
Om det önskade proteinet finns i det biologiska materialet, visas ett band på plattan, vilket indikerar bindningen av detta protein till motsvarande antikroppar.
Studiet av fysikalisk-kemiska egenskaper, kemisk sammansättning och struktur är endast möjligt genom att studera ett renat proteinpreparat. För att isolera och fraktionera enskilda proteiner används följande: utsaltning, utfällning med organiska lösningsmedel, gelfiltrering, elektrofores, jonbyteskromatografi, affinitetskromatografi.
Salta ut proteiner baserat på proteinlöslighetens beroende av mediets egenskaper. Proteiner är mindre lösliga i destillerat vatten än i svaga saltlösningar, eftersom låga jonkoncentrationer bibehåller sina hydratiseringsskal. Men vid höga saltkoncentrationer förlorar proteinmolekyler sina hydratiseringsskal, aggregerar och en fällning bildas. Efter att saltet har avlägsnats återgår proteinerna till lösning, och bibehåller sina naturliga egenskaper och konformation.
Förändringar i löslighet vid olika saltkoncentrationer och pH används för att isolera enskilda proteiner. Oftast används lösningar av ammoniumsulfat i olika koncentrationer för att salta ut proteiner.
Utfällning av proteiner från lösning utan deras denaturering utförs med dehydreringsmedel - organiska lösningsmedel (etanol, aceton).
Gelfiltrering baserat på separation av proteiner enligt molekylens storlek och form. Separationen utförs i kromatografiska kolonner fyllda med porösa gelgranuler (Sephadex, agaros) i en buffertlösning med ett visst pH-värde. Gelgranulat är genomträngligt för proteiner tack vare interna kanaler (porer) med en viss medeldiameter, vars storlek beror på typen av gel (Sephadex G-25, G-200, etc.). Proteinblandningen tillsätts till kolonnen och tvättas sedan ut (elueras) med en buffertlösning med ett visst pH-värde. Stora proteinmolekyler tränger inte in i geléns porer och rör sig med hög hastighet tillsammans med lösningsmedlet. Små molekyler av en lågmolekylär förorening (salt) eller annat protein hålls kvar av gelgranulerna och tvättas ut ur kolonnen långsammare (fig. 1.29). Vid kolonnutloppet samlas lösningen (eluatet) upp i form av separata fraktioner.
Ris. 1,29. Proteinseparation genom gelfiltrering
Elektrofores bygger på egenskapen hos laddade proteinmolekyler att röra sig i ett elektriskt fält med en hastighet som är proportionell mot deras totala laddning. Proteiner som har en total negativ laddning vid ett givet pH-värde rör sig mot anoden, och en positiv laddning rör sig mot katoden. Elektrofores utförs på olika medier: papper, stärkelsegel, polyakrylamidgel etc. Rörelsehastigheten beror på proteinmolekylernas laddning, massa och form. Efter avslutad elektrofores färgas proteinzonerna på bäraren med speciella färgämnen (Fig. 1.30, A).
Upplösningen av elektrofores i en gel är högre än på papper, så när man elektroforerar blodserumproteiner på papper, isoleras 5 fraktioner (albumin, α 1 -, α 2 -, β-, γ-globuliner) och i en polyakrylamidgel - upp till 18 fraktioner (Fig. 1.30, B).
Ris. 1.30. Elektroferogram av blodserumproteiner från en frisk person
A- elektroferogram av blodserumproteiner på papper;
B- mängden plasmaproteiner av olika fraktioner.
I - y-globuliner; II - p-globuliner; III - a2-globuliner;
IV - ai-globuliner; V - albuminer
Jonbyteskromatografi baserat på separationen av proteiner som skiljer sig i total laddning. En proteinlösning med ett visst pH-värde förs genom en kromatografisk kolonn fylld med en fast porös sorbent, medan en del av proteinerna hålls kvar som ett resultat av elektrostatisk interaktion. Jonbytarämnen används som sorbenter: anjonbytare (innehållande katjoniska grupper) för att isolera sura proteiner; katjonbytare (innehållande anjoniska grupper) för att isolera essentiella proteiner.
När ett protein passerar genom en kolonn beror styrkan på dess bindning till jonbytaren på storleken på laddningen motsatt laddningen av sorbenten. Proteiner adsorberade på en jonbytarsorbent elueras med buffertlösningar med olika saltkoncentrationer och pH, vilket ger olika proteinfraktioner.
Affinitetskromatografi baseras på bindningsspecificiteten för proteinet till liganden fäst vid det fasta underlaget. Enzymsubstrat, protesgrupper av holoproteiner, antigener etc. används som ligander. När en blandning av proteiner passerar genom kolonnen, fäster endast det komplementära proteinet till liganden (Fig. 1.31, A), alla andra kommer ut tillsammans med lösningen. Det adsorberade proteinet elueras med en lösning med ett annat pH-värde (Fig. 1.31, B). Denna metod är mycket specifik och gör att man kan erhålla högt renade proteinberedningar.
Proteinisolering och rening sker vanligtvis i flera steg med olika metoder. Sekvensen av steg väljs empiriskt och kan variera för olika proteiner. En hög grad av proteinrening är mycket viktig både när man använder dem som läkemedel (hormonet insulin etc.) och vid diagnostisering av olika sjukdomar genom att ändra proteinsammansättningen i vävnader, blod, saliv etc.
Uppsättningen av proteiner i cellerna i olika organ hos en vuxen är individuell och hålls relativt konstant under hela livet. Specialiserade vävnader kan innehålla specifika proteiner, såsom hemoglobin i röda blodkroppar, aktin och myosin i muskler, rhodopsin i näthinnan och olika typer av kollagen i ben och bindväv. Vissa proteiner finns i många vävnader, men i olika mängder. Valda kompositionsändringar
Ris. 1,31. Separation av proteiner genom affinitetskromatografi
A- bindning av det isolerade proteinet till en specifik ligand fäst till en neutral bärare; B- erhållande av en lösning av individuellt protein
proteiner av vävnader och blod är möjliga och är främst förknippade med diet, matsammansättning och fysisk aktivitet hos en person.
Vid sjukdomar kan proteinsammansättningen i blod- och vävnadsceller förändras avsevärt; brist på något protein eller en minskning av dess aktivitet utvecklas ofta - proteinopati. Därför används bestämningen av uttalade förändringar i proteinsammansättningen av blod och vävnader för att diagnostisera olika sjukdomar i kliniska studier.
Efter att ha extraherat en blandning av proteiner från biologiskt material separeras den i individuella proteinfraktioner. Flera proteinfraktioneringsmetoder har utvecklats, baserade på olika fysikalisk-kemiska egenskaper hos proteiner.
– utfällning av proteiner vid den isoelektriska punkten – Metoden bygger på proteiners egenskap att fällas ut vid den isoelektriska punkten på grund av neutralisering av proteinmolekylens laddning. För varje protein är värdet på den isoelektriska punkten strikt individuellt, så denna metod gör det möjligt att isolera enskilda proteiner (för mer information om metoden, se laboratoriearbete nr 3 i kursen "Biokemi").
– proteinfraktionering genom utsaltningsmetoder – baserat på proteiners olika löslighet i koncentrerade lösningar av neutrala salter, beroende på molekylvikten (för mer information om metoden, se laboration nr 3 i kursen "Biokemi").
– elektroforetisk separationsmetod proteiner till fraktioner - beskrivs i avsnittet fysikalisk-kemiska egenskaper hos proteiner.
Förutom metoderna som presenteras ovan används de i stor utsträckning för att separera proteiner i fraktioner. kromatografiska metoder . Kolonnkromatografi används oftast.
Det speciella med denna metod är att en blandning av molekyler av olika proteiner och peptider passerar genom en kolonn som innehåller ett fast poröst material (matris). Som ett resultat av interaktion med matrisen passerar olika proteiner genom kolonnen med olika hastigheter. Efter att proteinerna når botten av kolonnen i en viss sekvens, samlas de upp i separata fraktioner i provrör.
Markera tre huvudtyper kolonnkromatografi:
– jonbytare – för proteinkromatografi används jonbytare baserade på cellulosa eller andra hydrofila polymerer, till exempel dietylaminoetylcellulosa (DEAE-cellulosa), innehållande katjoniska grupper (negativ laddning) eller innehållande karboximetylcellulosa (CM-cellulosa), innehållande amingrupper (positiv laddning) :
Ju starkare bindningen av proteiner till DEAE-cellulosa är, desto högre är antalet karboxylgrupper i proteinmolekylen. Proteiner adsorberade till DEAE-cellulosa kan tvättas (elueras) från kolonnen med lösningar med ökande koncentrationer av natriumklorid. Löst bundna proteiner elueras först, och när saltkoncentrationen ökar, elueras andra proteiner, i ordningsföljd för ökande affinitet för DEAE-cellulosa.
CM-cellulosa används på liknande sätt, men proteiners affinitet för det är direkt proportionell mot antalet aminogrupper i proteinmolekylen.
För att avlägsna bundet protein ändras även elueringsmedlets pH.
– gelfiltreringskromatografi – har det andra namnet "molekylsiktsmetod". Sephadex (polysackariddextran behandlad med epikloridhydrin) används som siktar. Sephadex-korn sväller i vatten och bildar en gel. De svullna granulerna har porer med en viss diameter.
Separationen baseras på att Sephadex-korn (granulernas porer) är ogenomträngliga eller begränsat permeabla för ämnen med stor molekylvikt, och små molekyler diffunderar (tränger) fritt in i kornens porer.
En gelliknande massa av svullen Sephadex placeras i en glaskolonn (rör), ett lager av proteinlösning appliceras på gelens yta (Fig. 12, a) och sedan passerar en buffertlösning (elueringsvätska) genom kolumnen. Proteiner passerar längs kolonnen mellan granulerna ju långsammare desto lägre molekylvikt, eftersom proteinmolekyler med ännu lägre molekylvikt diffunderar lättare in i granulerna (in i porerna) (Fig. 12).
Ris. 12. Proteinfraktionering genom gelfiltrering
Proteiner tvättas ut (elueras) från kolonnen i fallande ordning för molekylvikt. Följaktligen elueras först stora proteinmolekyler (fig. 12, b), som inte diffunderar in i kornen, sedan små molekyler och slutligen lågmolekylära föroreningar.
Denna metod används inte bara för att fraktionera proteiner efter molekylvikt, utan också för att rena dem från föroreningar med låg molekylvikt.
– affinitetskromatografi – eller affinitetskromatografi. Principen för metoden är att selektiv interaktion av proteiner sker med specifika substanser - ligander fästa på bärare (Fig. 13).
Cyanogenbromid-aktiverad Sepharose används som bärare. Ligander av olika ursprung är fästa till Sepharose - ett substrat, eller ett antigen, eller en receptor, som kommer att binda endast ett protein från blandningen:
– substrat → enzym;
– antigen → antikropp;
– hormon → receptor för ett givet hormon.
Andra proteiner som inte är bundna till liganden avlägsnas genom att tvätta kolonnen.
Ris. 13. Mekanism för affinitetskromatografi
Avlägsnande av affinitetsbundet protein från kolonnen utförs med användning av en buffertlösning (eluent). En detergent införs i bufferten, vilket försvagar bindningarna mellan proteinet och liganden, eller så leds en lösning med en hög koncentration av fri ligand genom kolonnen. I detta fall binder proteinet lättare till den fria liganden och tvättas ut (elueras) från kolonnen.
Laboratoriearbete nr 8
ELEKTROFORETISK SEPARATION AV PROTEINER
Metoden bygger på att proteinmolekyler har en elektrisk laddning, vars storlek och tecken bestäms av proteinets aminosyrasammansättning, pH och jonstyrka i miljön. Under påverkan av ett yttre elektriskt fält rör sig laddade molekyler i lösningen mot den motsatt laddade polen. Rörelsehastigheten för proteinpartiklar är proportionell mot storleken på deras laddning och omvänt proportionell mot storleken på partiklarna och graden av deras hydratisering.
Den så kallade "zonelektroforesen" är för närvarande utbredd - elektrofores på en fast bärare (på pappersremsor, agar, stärkelse, akrylamid) impregnerad med en buffertlösning med önskat pH-värde. Placeringen av proteiner på papper eller gel bestäms genom att fixera och sedan färga dem med ett eller annat färgämne (vanligtvis bromfenolblått, amidsvart eller Coomassieblått). Mängden protein i varje fraktion kan ungefärligen bestämmas av färgintensiteten hos det associerade färgämnet. Denna definition ger inte ett strikt kvantitativt förhållande mellan proteinfraktioner, eftersom mängden färgämne bundet av olika proteiner inte är densamma.
ELEKTROFORES HA PAPPER
Separationen av den analyserade blandningen sker på vissa typer av kromatografiskt papper impregnerat med en buffertlösning i elektroforesanordningar. Proteiner separeras vid spänningar upp till 500 V.
Elektroforeskammaren består av ett plexiglasbad och ett lock monterat på det (1). Badet har 2 elektrodfack (2), som vart och ett är uppdelat av en längsgående skiljevägg (3) i två fack som kommunicerar med varandra. Bo de inre facken av facken sänker elektroderna, och ändarna av pappersremsorna i de yttre facken (4), vars huvuddel är placerad på en horisontell platta med spikar (5), belägen i den centrala delen av kammaren. Det finns pinnar mellan den horisontella plattan och det yttre facket på elektrodfacken (6),
Fig.2. Enhetsdiagram för lågspänningselektrofores
genom vilka pappersremsor kastas och som tjänar till att stödja dem. Under kammarens övre lock finns en platta av plexiglas med stora runda hål (7), på vilka ark av filterpapper indränkta i destillerat vatten och vikta 4-5 gånger placeras ovanpå. Dessa ark hjälper till att öka tätheten i kammaren och, som ett resultat, minska avdunstning av vätska från elektroferogram under elektrofores.
Med hjälp av papperselektrofores ombeds eleverna att separera blodserumproteiner. Med denna metod kan blodserum delas upp i 5 - 9 fraktioner och det relativa proteininnehållet i var och en av dem kan bestämmas. Separationen utförs i en buffertlösning (pH 8,6 - 8,9) med en potentialgradient på 3 - 5 V/cm (120 - 350 V för remsor 40 - 45 cm långa) vid rumstemperatur. Strömmen bör inte överstiga 0,1 - 0,3 mA för varje centimeter av pappersremsans tvärsnitt. Att öka strömstyrkan med mer än 2 gånger är oacceptabelt, eftersom detta kommer att resultera i överdriven uppvärmning, en betydande ökning av avdunstning och V slutligen - bränning av papper
Reagenser:
1. Buffertlösning. Kan användas:
a) veronal-medinal buffert (pH 8,6): lös 10,32 g medinal (natriumsalt av veronal) i 300 ml destillerat vatten, tillsätt 1,84 gveronal, värm under omrörning i ett vattenbad tills det löst sig och tillsätt vatten till 1 liter;
b) veronalacetatbuffert (pH 8,6): 4,3 veronal, 0,95 natriumhydroxid och 3,24 natriumacetat löses i 300 ml destillerat vatten. Tillsätt 30 ml 0,1 M HCl-lösning till lösningen och tillsätt vatten till 1 liter;
c) Tris-buffert (pH 8,9): 60,5 g Tris, 6 etylendiamintetraättiksyra och 4,6 gborsyra löses i 1 destillerat vatten.
2. Lösningar för färgning av elektroferogram:
a) surt blå-svart färgämne (liknande amidsvart 10 B) -0,2 g blandning: ättiksyra (is) - 100 ml + metylalkohol - 900 ml;
b) bromfenolblått -0,5 g, kvicksilverklorid -10 g, ättiksyra (is) - 20 ml, destillerat vatten - 980 ml;
c) bromfenolblått - 0,1 g, ZnSO4 7H2O -50 g, ättiksyra (is) 50 ml, destillerat vatten - 900 ml.
3. Lösningar för att tvätta elektroferogram från färgämne som inte är bundet till proteinet och fixering av färgämnet på proteinet:
a) ättiksyra - 2% lösning;
b) natriumacetat - 2% lösning framställd med en 10% lösning av ättiksyra.
4. Lösningar för eluering av färgade produkter från elektroferogram:
a) att extrahera bromfenolblått -0,01 M NaOH-lösning;
b) för att extrahera det sura blåsvarta färgämnet -0,1 M NaOH-lösning.
Utrustning: provrör; kyvetter, spektrofotometer, elektroforesanordning, kromatografiskt papper: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM, etc.
Skaffa blodserum. 2 - 3 ml blod sugs upp i ett torrt centrifugrör och lämnas i 1/2 - 1 timme. Använd en tunn glasstav, cirkla försiktigt runt väggarna på röret för att separera koagel från dem, centrifugera och häll serumet i en rent rör.
Förbereder kameran. Elektrodfacken är fyllda med buffertlösning till samma nivå (för att undvika buffertspill), cirka 800 ml i varje fack. De inre delarna av elektrodfacken sänker ner elektroderna. På ett ark kromatografiskt papper (18x45 cm) (när du använder tunna papperstyper är det bättre att applicera prover på separata remsor 4-5 cm breda) på ett avstånd av 15 cm från en av dess smala sidor, använd en enkel mjuk penna (grafit förhindrar spridning av vätska) för att beskriva platserna för applicering av prover. De är rektanglar (2 x 0,3 cm), vars stora sidor är vinkelräta mot pappersremsans längd. Avståndet mellan startzonerna och elektroferogrammets kanter är 2 cm. Elektroferogrammet är impregnerat med bufferten i vilken elektrofores ska ske. För att göra detta dras den genom en kyvett med en buffertlösning. Ändarna på pappersremsorna (6-8 cm) är inte blöta. Överskottsbuffert avlägsnas genom att remsorna torkas mellan två eller tre ark filterpapper. Det våta elektroferogrammet placeras i kammaren på den centrala horisontella plattan (5), och ändarna sänks ner i de yttre facken av elektrodfacken.Anordningen är tätt tillsluten med ett lock, under vilket det finns ark av filterpapper fuktade med vatten.
Utför elektrofores. Efter att pappersremsorna är helt mättade med buffertlösningen appliceras prover på 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg protein) serum på de markerade områdena med en 0,1 ml pipett. Kammaren stängs med ett lock och strömmen slås på. Varaktigheten av elektrofores är 22 - 24 timmar vid en spänning på 200 - 300 V
Fixering och färgning av elektroferogram. Vid slutet av elektroforesen, stäng av strömmen och ta omedelbart bort elektroferogrammen från enheten. De placeras på ett speciellt stativ och torkas i luft under drag, sedan i en ugn vid 105 ºC i 20 minuter för att fixera proteinerna på papper, varefter de placeras i en emaljkyvett, fylls med färg och lämnas i 2-3 timmar eller mer. Färgen dräneras och elektroferogrammen tvättas från dess överskott genom att hälla 3-4 gånger med en 2% lösning av ättiksyra, varje gång i 5-10 minuter. Ytor av papper som inte innehåller protein måste vara helt fria från färgämne. För att fixera de färgade produkterna fylls elektroferogram med en 2% lösning av natriumacetat i 2 minuter och torkas i luft under sug.
Bestämning av förhållandet mellan enskilda proteinfraktioner. Vid pH 8,6 är serumproteiner negativt laddade och rör sig i det elektriska fältet mot anoden. Den fraktion som rör sig snabbast till anoden är albumin, följt av α 1 -, α 2 -, β- och γ-globuliner (se fig. 3) . Sektioner av papperstejper på vilka proteinfläckar har uppstått delas med tvärgående linjer med en enkel penna i remsor 3-5 mm breda och skärs längs dessa linjer. Varje remsa krossas och placeras i ett separat numrerat provrör, fyllt med 3 ml 0,01 M NaOH-lösning, lämnas i en timme för att avlägsna färgen från papperet, och sedan hittas det optiska densitetsvärdet för varje lösning på en fotokolorimeter ( spektrofotometer) vid 612 nm.
Ris. 3. Elektroferogram av humant blodserum och distributionskurva för proteinfraktioner
Ett kontrollprov bearbetas parallellt. För det skärs en remsa ut från de ofärgade områdena i elektroferogrammet.
Baserat på erhållna data ritas en fördelningskurva av färgade produkter på elektroferogrammet, numren på rören är markerade på abskissaxeln, och motsvarande optiska densitetsvärde är markerat på ordinataaxeln (se fig. 3). . Procentandelen proteinfraktioner i blodserum beräknas. För att göra detta delas den ritade kurvan enligt minimivärdena i ett antal sektioner som motsvarar enskilda fraktioner. Storleken på området för varje sektion är proportionell mot mängden färg i kombination med proteinet i en given fraktion. Förhållandet mellan dessa ytor beräknas efter vikt (vikten av papperssektioner är proportionell mot deras yta), hela arean tas som 100%. Om du har en densitometer kan förhållandet mellan proteinfraktioner i blodserum bestämmas från ett densitogram.
Efter att tidigare ha bestämt proteinhalten i vasslan, beräknas dess mängd för varje fraktion.
