Διαχωρισμός πρωτεϊνών από ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους
Μέθοδος μεμβρανικού κόσκινου (αιμοκάθαρση)
Χρησιμοποιείται μεμβράνη αιμοκάθαρσης, η οποία είναι πολυμερές και έχει πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Μικρά μόρια (ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους) περνούν μέσα από τους πόρους της μεμβράνης και μεγάλα μόρια (πρωτεΐνες) διατηρούνται. Με αυτόν τον τρόπο, οι πρωτεΐνες ξεπλένονται από τις ακαθαρσίες.
Διαχωρισμός πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος
Χρωματογραφία γέλης
Η χρωματογραφική στήλη γεμίζεται με κόκκους γέλης (Sephadex), οι οποίοι έχουν πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Ένα μείγμα πρωτεϊνών προστίθεται στη στήλη. Οι πρωτεΐνες των οποίων το μέγεθος είναι μικρότερο από το μέγεθος των πόρων Sephadex διατηρούνται στη στήλη, καθώς είναι «κολλημένες» στους πόρους, ενώ οι υπόλοιπες εξέρχονται ελεύθερα από τη στήλη. Το μέγεθος μιας πρωτεΐνης εξαρτάται από το μοριακό της βάρος.
Υπερφυγοκέντρηση
Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε διαφορετικούς ρυθμούς καθίζησης (καθίζησης) πρωτεϊνικών μορίων σε διαλύματα με διαφορετικές βαθμίδες πυκνότητας (ρυθμιστικό διάλυμα σακχαρόζης ή χλωριούχο καίσιο).
Ηλεκτροφόρηση
Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε διαφορετικούς ρυθμούς μετανάστευσης πρωτεϊνών και πεπτιδίων σε ένα ηλεκτρικό πεδίο ανάλογα με το φορτίο.
Γέλη, οξική κυτταρίνη και άγαρ μπορούν να χρησιμεύσουν ως φορείς για ηλεκτροφόρηση. Τα μόρια που διαχωρίζονται κινούνται στο πήκτωμα ανάλογα με το μέγεθός τους: αυτά που είναι μεγάλα θα καθυστερήσουν καθώς περνούν μέσα από τους πόρους του τζελ. Τα μικρότερα μόρια θα συναντήσουν λιγότερη αντίσταση και ως εκ τούτου θα κινηθούν πιο γρήγορα. Ως αποτέλεσμα, μετά την ηλεκτροφόρηση, τα μεγάλα μόρια θα είναι πιο κοντά στην αρχή από τα μικρότερα.
Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση PAGE παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-Na).
Το DDS-Na είναι μια δίφιλη ουσία και περιέχει μια φορτισμένη ομάδα και μια υδρόφοβη. Οι πρωτεΐνες συνδέονται με το SDS-Na με τις υδρόφοβες ρίζες τους και στη διαδικασία μετουσιώνονται. Με αυτόν τον τρόπο, οι πρωτεΐνες ευθυγραμμίζονται σε σχήμα και φορτίο. Μετά από αυτό, η κινητικότητα της πρωτεΐνης κατά την ηλεκτροφόρηση εξαρτάται μόνο από το μοριακό της βάρος.
αλάτισμα έξω: καθίζηση με άλατα αλκαλίων, μετάλλων αλκαλικών γαιών (χλωριούχο νάτριο, θειικό μαγνήσιο), θειικό αμμώνιο. η πρωτογενής δομή της πρωτεΐνης δεν διαταράσσεται.
κατάθεση: χρήση ουσιών που απομακρύνουν το νερό: αλκοόλη ή ακετόνη σε χαμηλές θερμοκρασίες (περίπου –20 С).
Όταν χρησιμοποιούνται αυτές οι μέθοδοι, οι πρωτεΐνες χάνουν το κέλυφος ενυδάτωσης τους και καθιζάνουν στο διάλυμα.
Μετουσίωσης- παραβίαση της χωρικής δομής των πρωτεϊνών (η πρωταρχική δομή του μορίου διατηρείται). Μπορεί να είναι αναστρέψιμη (η δομή της πρωτεΐνης αποκαθίσταται μετά την αφαίρεση του παράγοντα μετουσίωσης) ή μη αναστρέψιμη (η χωρική δομή του μορίου δεν αποκαθίσταται, για παράδειγμα, όταν οι πρωτεΐνες καταβυθίζονται με συμπυκνωμένα ορυκτά οξέα, άλατα βαρέων μετάλλων).
Μέθοδοι διαχωρισμού πρωτεϊνών Διαχωρισμός πρωτεϊνών από ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους
Διάλυση
Χρησιμοποιείται ειδική μεμβράνη πολυμερούς, η οποία έχει πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Μικρά μόρια (ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους) περνούν μέσα από τους πόρους της μεμβράνης και μεγάλα μόρια (πρωτεΐνες) διατηρούνται. Έτσι, οι πρωτεΐνες ξεπλένονται από τις ακαθαρσίες.
Διαχωρισμός πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος
Χρωματογραφία γέλης
Η χρωματογραφική στήλη γεμίζεται με κόκκους γέλης (Sephadex), οι οποίοι έχουν πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Ένα μείγμα πρωτεϊνών προστίθεται στη στήλη. Οι πρωτεΐνες των οποίων το μέγεθος είναι μικρότερο από το μέγεθος των πόρων Sephadex διατηρούνται στη στήλη, καθώς είναι «κολλημένες» στους πόρους, ενώ οι υπόλοιπες εξέρχονται ελεύθερα από τη στήλη (Εικ. 2.1). Το μέγεθος μιας πρωτεΐνης εξαρτάται από το μοριακό της βάρος.
Ρύζι. 2.1.Διαχωρισμός πρωτεϊνών με διήθηση γέλης
Υπερφυγοκέντρηση
Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε διαφορετικούς ρυθμούς καθίζησης (καθίζησης) πρωτεϊνικών μορίων σε διαλύματα με διαφορετικές βαθμίδες πυκνότητας (ρυθμιστικό διάλυμα σακχαρόζης ή χλωριούχο καίσιο) (Εικ. 2.2).
Ρύζι. 2.2.Διαχωρισμός πρωτεϊνών με υπερφυγοκέντρηση
Ηλεκτροφόρηση
Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε διαφορετικούς ρυθμούς μετανάστευσης πρωτεϊνών και πεπτιδίων σε ένα ηλεκτρικό πεδίο ανάλογα με το φορτίο.
Γέλη, οξική κυτταρίνη και άγαρ μπορούν να χρησιμεύσουν ως φορείς για ηλεκτροφόρηση. Τα διαχωρισμένα μόρια κινούνται στο πήκτωμα ανάλογα με το μέγεθός τους: αυτά που είναι μεγαλύτερα θα καθυστερήσουν καθώς περνούν μέσα από τους πόρους του τζελ. Τα μικρότερα μόρια θα συναντήσουν λιγότερη αντίσταση και ως εκ τούτου θα κινηθούν πιο γρήγορα. Ως αποτέλεσμα, μετά την ηλεκτροφόρηση, μεγαλύτερα μόρια θα είναι πιο κοντά στην αρχή από τα μικρότερα (Εικ. 2.3).
Ρύζι. 2.3. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση γέλης
Η ηλεκτροφόρηση μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος.Για αυτό χρησιμοποιούν Ηλεκτροφόρηση PAGE παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-Na).
Απομόνωση μεμονωμένων πρωτεϊνών
Χρωματογραφία συγγένειας
Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των πρωτεϊνών να συνδέονται ισχυρά με διάφορα μόρια μέσω μη ομοιοπολικών δεσμών. Χρησιμοποιείται για την απομόνωση και τον καθαρισμό ενζύμων, ανοσοσφαιρινών και πρωτεϊνών υποδοχέα.
Μόρια ουσιών (προσδέματα), με τα οποία δεσμεύονται ειδικά ορισμένες πρωτεΐνες, συνδυάζονται ομοιοπολικά με σωματίδια μιας αδρανούς ουσίας. Το μίγμα πρωτεϊνών προστίθεται στη στήλη και η επιθυμητή πρωτεΐνη συνδέεται σταθερά με το πρόσδεμα. Οι υπόλοιπες πρωτεΐνες φεύγουν ελεύθερα από τη στήλη. Η κατακρατούμενη πρωτεΐνη μπορεί στη συνέχεια να ξεπλυθεί από τη στήλη χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει τον ελεύθερο συνδέτη. Αυτή η εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος επιτρέπει την απομόνωση πολύ μικρών ποσοτήτων πρωτεΐνης σε καθαρή μορφή από ένα κυτταρικό εκχύλισμα που περιέχει εκατοντάδες άλλες πρωτεΐνες.
Ισοηλεκτρική εστίαση
Η μέθοδος βασίζεται σε διαφορετικές τιμές IET πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε μια πλάκα με αμφολίνη (πρόκειται για μια ουσία στην οποία έχει προδιαμορφωθεί μια βαθμίδα pH στην περιοχή από 3 έως 10). Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σύμφωνα με την τιμή IET τους (στο IET, το φορτίο της πρωτεΐνης θα είναι μηδέν και δεν θα κινείται στο ηλεκτρικό πεδίο).
2D ηλεκτροφόρηση
Είναι ένας συνδυασμός ισοηλεκτρικής εστίασης και ηλεκτροφόρησης με SDS-Na. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται αρχικά σε οριζόντια κατεύθυνση σε πλάκα με αμφολίνη. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται ανάλογα με το φορτίο (IET). Στη συνέχεια η πλάκα επεξεργάζεται με διάλυμα SDS-Na και πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση στην κατακόρυφη κατεύθυνση. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το μοριακό βάρος.
Ανοσοηλεκτροφόρηση (Western blot)
Μια αναλυτική μέθοδος που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε ένα δείγμα (Εικόνα 2.4).
Απομόνωση πρωτεϊνών από βιολογικό υλικό.
Διαχωρισμός πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος με ηλεκτροφόρηση σε PAGE με SDS-Na.
Μεταφορά πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε πολυμερή πλάκα για διευκόλυνση της περαιτέρω εργασίας.
Επεξεργασία της πλάκας με διάλυμα μη ειδικής πρωτεΐνης για την πλήρωση των υπόλοιπων πόρων.
Έτσι, μετά από αυτό το στάδιο, λαμβάνεται μια πλάκα, οι πόροι της οποίας περιέχουν διαχωρισμένες πρωτεΐνες και ο χώρος μεταξύ τους γεμίζει με μια μη ειδική πρωτεΐνη. Τώρα πρέπει να προσδιορίσουμε εάν μεταξύ των πρωτεϊνών υπάρχει αυτή που αναζητούμε και είναι υπεύθυνη για κάποια ασθένεια. Η θεραπεία με αντισώματα χρησιμοποιείται για ανίχνευση. Τα πρωτογενή αντισώματα είναι αντισώματα κατά της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος. Δευτερεύοντα αντισώματα σημαίνει αντισώματα έναντι πρωτογενών αντισωμάτων. Μια πρόσθετη ειδική ετικέτα (ο λεγόμενος μοριακός ανιχνευτής) προστίθεται στα δευτερεύοντα αντισώματα, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να μπορούν στη συνέχεια να οραματιστούν. Ένα ραδιενεργό φωσφορικό άλας ή ένζυμο στενά συνδεδεμένο με ένα δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιείται ως σήμα. Η σύνδεση πρώτα με πρωτογενή και στη συνέχεια με δευτερογενή αντισώματα έχει δύο σκοπούς: τυποποίηση της μεθόδου και βελτίωση των αποτελεσμάτων.
Θεραπεία με διάλυμα πρωτογενών αντισωμάτων η δέσμευση γίνεται στη θέση της πλάκας όπου βρίσκεται το αντιγόνο (η επιθυμητή πρωτεΐνη).
Αφαίρεση μη δεσμευμένων αντισωμάτων (πλύση).
Θεραπεία με διάλυμα επισημασμένων δευτερογενών αντισωμάτων για μετέπειτα ανάπτυξη.
Αφαίρεση μη δεσμευμένων δευτερογενών αντισωμάτων (πλύση).
Ρύζι. 2.4. Ανοσοηλεκτροφόρηση (Western blot)
Εάν η επιθυμητή πρωτεΐνη υπάρχει στο βιολογικό υλικό, εμφανίζεται μια ταινία στο πιάτο, που υποδεικνύει τη σύνδεση αυτής της πρωτεΐνης με τα αντίστοιχα αντισώματα.
Η μελέτη των φυσικοχημικών ιδιοτήτων, της χημικής σύνθεσης και της δομής είναι δυνατή μόνο με τη μελέτη ενός σκευάσματος καθαρισμένης πρωτεΐνης. Για την απομόνωση και την κλασματοποίηση μεμονωμένων πρωτεϊνών, χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα: αλάτισμα, καθίζηση με οργανικούς διαλύτες, διήθηση γέλης, ηλεκτροφόρηση, χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων, χρωματογραφία συγγένειας.
Αλάτισμα πρωτεϊνώνμε βάση την εξάρτηση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης από τις ιδιότητες του μέσου. Οι πρωτεΐνες είναι λιγότερο διαλυτές στο απεσταγμένο νερό από ότι σε διαλύματα ασθενούς αλατιού, καθώς οι χαμηλές συγκεντρώσεις ιόντων διατηρούν το κέλυφος ενυδάτωσης τους. Αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος, τα μόρια πρωτεΐνης χάνουν το κέλυφος ενυδάτωσης τους, συσσωματώνονται και σχηματίζεται ένα ίζημα. Αφού αφαιρεθεί το άλας, οι πρωτεΐνες επιστρέφουν στο διάλυμα, διατηρώντας τις φυσικές τους ιδιότητες και διαμόρφωση.
Οι αλλαγές στη διαλυτότητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος και pH χρησιμοποιούνται για την απομόνωση μεμονωμένων πρωτεϊνών. Τις περισσότερες φορές, διαλύματα θειικού αμμωνίου διαφορετικών συγκεντρώσεων χρησιμοποιούνται για την εξάλειψη των πρωτεϊνών.
Η καθίζηση των πρωτεϊνών από το διάλυμα χωρίς τη μετουσίωση τους πραγματοποιείται με τη χρήση αφυδρογονωτικών παραγόντων - οργανικών διαλυτών (αιθανόλη, ακετόνη).
Διήθηση γέληςμε βάση τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το μέγεθος και το σχήμα του μορίου. Ο διαχωρισμός πραγματοποιείται σε χρωματογραφικές στήλες γεμάτες με πορώδεις κόκκους γέλης (Sephadex, αγαρόζη) σε ρυθμιστικό διάλυμα με συγκεκριμένη τιμή pH. Οι κόκκοι γέλης είναι διαπερατοί στις πρωτεΐνες χάρη σε εσωτερικά κανάλια (πόρους) με μια ορισμένη μέση διάμετρο, το μέγεθος των οποίων εξαρτάται από τον τύπο της γέλης (Sephadex G-25, G-200 κ.λπ.). Το μίγμα πρωτεΐνης προστίθεται στη στήλη και στη συνέχεια ξεπλένεται (εκλούεται) με ένα ρυθμιστικό διάλυμα με μια ορισμένη τιμή pH. Τα μεγάλα μόρια πρωτεΐνης δεν διεισδύουν στους πόρους της γέλης και κινούνται με μεγάλη ταχύτητα μαζί με τον διαλύτη. Μικρά μόρια μιας ακαθαρσίας χαμηλού μοριακού βάρους (άλας) ή άλλης πρωτεΐνης συγκρατούνται από τους κόκκους γέλης και ξεπλένονται πιο αργά από τη στήλη (Εικ. 1.29). Στην έξοδο της στήλης, το διάλυμα (έκλουσμα) συλλέγεται με τη μορφή χωριστών κλασμάτων.
Ρύζι. 1.29. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με διήθηση γέλης
Ηλεκτροφόρησηβασίζεται στην ιδιότητα των φορτισμένων πρωτεϊνικών μορίων να κινούνται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο με ταχύτητα ανάλογη του συνολικού τους φορτίου. Οι πρωτεΐνες που έχουν συνολικό αρνητικό φορτίο σε μια δεδομένη τιμή pH κινούνται προς την άνοδο και ένα θετικό φορτίο κινείται προς την κάθοδο. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε διαφορετικά μέσα: χαρτί, γέλη αμύλου, γέλη πολυακρυλαμιδίου κ.λπ. Η ταχύτητα κίνησης εξαρτάται από το φορτίο, τη μάζα και το σχήμα των μορίων πρωτεΐνης. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεϊνικές ζώνες στον φορέα βάφονται με ειδικές βαφές (Εικ. 1.30, Α).
Η ανάλυση της ηλεκτροφόρησης σε ένα πήκτωμα είναι υψηλότερη από ό,τι στο χαρτί, επομένως κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού αίματος σε χαρτί, απομονώνονται 5 κλάσματα (λευκωματίνη, α 1 -, α 2 -, β-, γ-σφαιρίνες) και σε γέλη πολυακρυλαμιδίου - έως 18 κλάσματα (Εικ. 1.30, Β).
Ρύζι. 1.30. Ηλεκτροφερόγραμμα πρωτεϊνών ορού αίματος υγιούς ατόμου
ΕΝΑ- ηλεκτροφερόγραμμα πρωτεϊνών ορού αίματος σε χαρτί.
σι- την ποσότητα των πρωτεϊνών του πλάσματος διαφορετικών κλασμάτων.
Ι - γ-σφαιρίνες; II - β-σφαιρίνες; III - a 2-σφαιρίνες;
IV - a 1 -σφαιρίνες. V - λευκωματίνες
Χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντωνμε βάση τον διαχωρισμό πρωτεϊνών που διαφέρουν ως προς το συνολικό φορτίο. Ένα διάλυμα πρωτεΐνης με μια ορισμένη τιμή pH διέρχεται μέσω μιας χρωματογραφικής στήλης γεμάτη με ένα στερεό πορώδες ροφητικό, ενώ ορισμένες από τις πρωτεΐνες διατηρούνται ως αποτέλεσμα ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης. Οι ουσίες ανταλλαγής ιόντων χρησιμοποιούνται ως ροφητές: ανιονανταλλάκτες (που περιέχουν κατιονικές ομάδες) για την απομόνωση όξινων πρωτεϊνών. κατιονανταλλάκτες (που περιέχουν ανιονικές ομάδες) για την απομόνωση βασικών πρωτεϊνών.
Κατά τη διέλευση μιας πρωτεΐνης μέσω μιας στήλης, η ισχύς της δέσμευσής της στον ιονανταλλάκτη εξαρτάται από το μέγεθος του φορτίου που είναι αντίθετο από το φορτίο του ροφητή. Οι πρωτεΐνες που έχουν προσροφηθεί σε ένα ιοντοανταλλακτική ροφητή εκλούονται με ρυθμιστικά διαλύματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος και pH, λαμβάνοντας διαφορετικά κλάσματα πρωτεΐνης.
Χρωματογραφία συγγένειαςβασίζεται στην εξειδίκευση δέσμευσης της πρωτεΐνης με τον συνδέτη που είναι συνδεδεμένος στο στερεό υπόστρωμα. Ως συνδέτες χρησιμοποιούνται ενζυμικά υποστρώματα, προσθετικές ομάδες ολοπρωτεϊνών, αντιγόνα κ.λπ. Όταν περνάμε ένα μείγμα πρωτεϊνών μέσω της στήλης, μόνο η συμπληρωματική πρωτεΐνη προσκολλάται στον συνδέτη (Εικ. 1.31, Α), όλες οι άλλες βγαίνουν μαζί με το διάλυμα. Η προσροφημένη πρωτεΐνη εκλούεται με ένα διάλυμα με διαφορετική τιμή ρΗ (Εικ. 1.31, Β). Αυτή η μέθοδος είναι εξαιρετικά ειδική και επιτρέπει σε κάποιον να αποκτήσει παρασκευάσματα πρωτεΐνης υψηλής καθαρότητας.
Η απομόνωση και ο καθαρισμός της πρωτεΐνης συνήθως πραγματοποιείται σε διάφορα στάδια χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους. Η αλληλουχία των βημάτων επιλέγεται εμπειρικά και μπορεί να διαφέρει για διαφορετικές πρωτεΐνες. Ο υψηλός βαθμός καθαρισμού πρωτεϊνών είναι πολύ σημαντικός τόσο κατά τη χρήση τους ως φάρμακα (η ορμόνη ινσουλίνη κ.λπ.) όσο και κατά τη διάγνωση διαφόρων ασθενειών με αλλαγή της πρωτεϊνικής σύστασης των ιστών, του αίματος, του σάλιου κ.λπ.
Το σύνολο των πρωτεϊνών στα κύτταρα διαφόρων οργάνων ενός ενήλικα είναι ατομικό και διατηρείται σχετικά σταθερό σε όλη τη ζωή. Οι εξειδικευμένοι ιστοί μπορεί να περιέχουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες, όπως αιμοσφαιρίνη στα ερυθρά αιμοσφαίρια, ακτίνη και μυοσίνη στους μύες, ροδοψίνη στον αμφιβληστροειδή και διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου στα οστά και τους συνδετικούς ιστούς. Ορισμένες πρωτεΐνες βρίσκονται σε πολλούς ιστούς, αλλά σε διαφορετικές ποσότητες. Η επιλεγμένη σύνθεση αλλάζει
Ρύζι. 1.31. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας
ΕΝΑ- δέσμευση της απομονωμένης πρωτεΐνης σε ειδικό συνδετήρα συνδεδεμένο σε ουδέτερο φορέα. σι- λήψη ενός διαλύματος μεμονωμένης πρωτεΐνης
Οι πρωτεΐνες των ιστών και του αίματος είναι δυνατές και σχετίζονται κυρίως με τη διατροφή, τη σύνθεση των τροφίμων και τη φυσική δραστηριότητα ενός ατόμου.
Σε ασθένειες, η πρωτεϊνική σύνθεση των κυττάρων του αίματος και των ιστών μπορεί να αλλάξει σημαντικά· συχνά αναπτύσσεται ανεπάρκεια οποιασδήποτε πρωτεΐνης ή μείωση της δραστηριότητάς της - πρωτεϊνοπάθεια.Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός έντονων αλλαγών στη σύνθεση πρωτεϊνών του αίματος και των ιστών χρησιμοποιείται για τη διάγνωση διαφόρων ασθενειών σε κλινικές μελέτες.
Μετά την εκχύλιση ενός μείγματος πρωτεϊνών από βιολογικό υλικό, διαχωρίζεται σε μεμονωμένα πρωτεϊνικά κλάσματα. Έχουν αναπτυχθεί αρκετές μέθοδοι κλασματοποίησης πρωτεϊνών, βασισμένες σε διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες των πρωτεϊνών.
– καθίζηση πρωτεϊνών στο ισοηλεκτρικό σημείο – η μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να καθιζάνουν στο ισοηλεκτρικό σημείο λόγω εξουδετέρωσης του φορτίου του μορίου της πρωτεΐνης. Για κάθε πρωτεΐνη, η τιμή του ισοηλεκτρικού σημείου είναι αυστηρά ατομική, επομένως αυτή η μέθοδος καθιστά δυνατή την απομόνωση μεμονωμένων πρωτεϊνών (για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη μέθοδο, βλ. εργαστηριακή εργασία Νο. 3 στο μάθημα «Βιοχημεία»).
– κλασματοποίηση πρωτεϊνών με μέθοδο αλατοποίησης – με βάση τη διαφορετική διαλυτότητα των πρωτεϊνών σε συμπυκνωμένα διαλύματα ουδέτερων αλάτων, ανάλογα με το μοριακό βάρος (για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη μέθοδο, βλ. εργαστηριακή εργασία Νο. 3 στο μάθημα «Βιοχημεία»).
– μέθοδος ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού πρωτεΐνες σε κλάσματα - περιγράφονται στην ενότητα φυσικοχημικές ιδιότητες των πρωτεϊνών.
Εκτός από τις μεθόδους που παρουσιάζονται παραπάνω, χρησιμοποιούνται ευρέως για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών σε κλάσματα. χρωματογραφικές μεθόδους . Η χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται συχνότερα.
Η ιδιαιτερότητα αυτής της μεθόδου είναι ότι ένα μείγμα μορίων διαφόρων πρωτεϊνών και πεπτιδίων διέρχεται από μια στήλη που περιέχει ένα στερεό πορώδες υλικό (μήτρα). Ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης με τη μήτρα, διαφορετικές πρωτεΐνες διέρχονται από τη στήλη με διαφορετικούς ρυθμούς. Αφού οι πρωτεΐνες φτάσουν στον πυθμένα της στήλης με μια συγκεκριμένη αλληλουχία, συλλέγονται σε ξεχωριστά κλάσματα σε δοκιμαστικούς σωλήνες.
Αποκορύφωμα τρεις κύριοι τύποιχρωματογραφία στήλης:
– ανταλλαγή ιόντων – για χρωματογραφία πρωτεϊνών, χρησιμοποιούνται ιονανταλλάκτες με βάση την κυτταρίνη ή άλλα υδρόφιλα πολυμερή, για παράδειγμα, διαιθυλαμινοαιθυλοκυτταρίνη (DEAE-κυτταρίνη), που περιέχει κατιονικές ομάδες (αρνητικό φορτίο) ή περιέχει καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη (CM-κυτταρίνη), που περιέχει ομάδες αμίνης (θετικό φορτίο) :
Όσο ισχυρότερη είναι η σύνδεση των πρωτεϊνών με την DEAE-κυτταρίνη, τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των καρβοξυλομάδων στο μόριο της πρωτεΐνης. Οι πρωτεΐνες που έχουν προσροφηθεί στην κυτταρίνη DEAE μπορούν να πλυθούν (εκλούονται) από τη στήλη με διαλύματα αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωριούχου νατρίου. Οι χαλαρά δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούονται πρώτα, και καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του άλατος, εκλούονται άλλες πρωτεΐνες, προκειμένου να αυξηθεί η συγγένεια για την DEAE-κυτταρίνη.
Η CM κυτταρίνη χρησιμοποιείται με παρόμοιο τρόπο, αλλά η συγγένεια των πρωτεϊνών για αυτήν είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των αμινομάδων στο μόριο της πρωτεΐνης.
Για την απομάκρυνση της δεσμευμένης πρωτεΐνης, το pH του διαλύματος έκλουσης αλλάζει επίσης.
– χρωματογραφία διήθησης γέλης – έχει το δεύτερο όνομα «μέθοδος μοριακού κόσκινου». Το Sephadex (πολυσακχαρίτης δεξτράνη επεξεργασμένη με επιχλωριούχο υδρίνη) χρησιμοποιείται ως κόσκινα. Οι κόκκοι Sephadex διογκώνονται σε νερό και σχηματίζουν ένα πήκτωμα. Οι διογκωμένοι κόκκοι έχουν πόρους ορισμένης διαμέτρου.
Ο διαχωρισμός βασίζεται στο γεγονός ότι οι κόκκοι Sephadex (οι πόροι των κόκκων) είναι αδιαπέρατοι ή περιορισμένα διαπερατοί σε ουσίες με μεγάλο μοριακό βάρος και μικρά μόρια διαχέονται ελεύθερα (διεισδύουν) στους πόρους των κόκκων.
Μια μάζα που μοιάζει με γέλη από διογκωμένο Sephadex τοποθετείται σε μια γυάλινη στήλη (σωλήνας), μια στρώση διαλύματος πρωτεΐνης εφαρμόζεται στην επιφάνεια της γέλης (Εικ. 12, α) και στη συνέχεια διοχετεύεται ένα ρυθμιστικό διάλυμα (υγρό έκλουσης). η στήλη. Οι πρωτεΐνες περνούν κατά μήκος της στήλης μεταξύ των κόκκων όσο πιο αργά, τόσο χαμηλότερο είναι το μοριακό τους βάρος, αφού τα μόρια πρωτεΐνης με ακόμη χαμηλότερο μοριακό βάρος διαχέονται πιο εύκολα στους κόκκους (στους πόρους) (Εικ. 12).
Ρύζι. 12. Κλασματοποίηση πρωτεΐνης με διήθηση γέλης
Οι πρωτεΐνες ξεπλένονται (εκλούονται) από τη στήλη με φθίνουσα σειρά μοριακού βάρους. Κατά συνέπεια, εκλούονται πρώτα μεγάλα μόρια πρωτεΐνης (Εικ. 12, β), τα οποία δεν διαχέονται στους κόκκους, μετά μικρά μόρια και, τέλος, ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους.
Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται όχι μόνο για την κλασματοποίηση πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος, αλλά και για τον καθαρισμό τους από ακαθαρσίες χαμηλού μοριακού βάρους.
– χρωματογραφία συγγένειας – ή χρωματογραφία συγγένειας. Η αρχή της μεθόδου είναι ότι λαμβάνει χώρα εκλεκτική αλληλεπίδραση πρωτεϊνών με συγκεκριμένες ουσίες - συνδέτες που συνδέονται με φορείς (Εικ. 13).
Η Sepharose ενεργοποιημένη με κυανογόνο βρωμιούχο χρησιμοποιείται ως φορέας. Συνδέματα διαφόρων προελεύσεων συνδέονται με το Sepharose - ένα υπόστρωμα, ένα αντιγόνο ή έναν υποδοχέα, ο οποίος θα δεσμεύσει με συγγένεια μόνο μία πρωτεΐνη από το μείγμα:
– υπόστρωμα → ένζυμο;
– αντιγόνο → αντίσωμα;
– ορμόνη → υποδοχέας για μια δεδομένη ορμόνη.
Άλλες πρωτεΐνες που δεν συνδέονται με το πρόσδεμα αφαιρούνται με πλύσιμο της στήλης.
Ρύζι. 13. Μηχανισμός χρωματογραφίας συγγένειας
Η απομάκρυνση της δεσμευμένης σε συγγένεια πρωτεΐνης από τη στήλη πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα (διαλύτης έκλουσης). Ένα απορρυπαντικό εισάγεται στο ρυθμιστικό διάλυμα, το οποίο αποδυναμώνει τους δεσμούς μεταξύ της πρωτεΐνης και του συνδέτη, ή ένα διάλυμα με υψηλή συγκέντρωση ελεύθερου συνδετήρα διέρχεται μέσω της στήλης. Σε αυτή την περίπτωση, η πρωτεΐνη συνδέεται πιο εύκολα με τον ελεύθερο συνδέτη και ξεπλένεται (εκλούεται) από τη στήλη.
Εργαστηριακή εργασία Νο 8
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΕΤΙΚΟΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
Η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι τα μόρια πρωτεΐνης έχουν ηλεκτρικό φορτίο, το μέγεθος και το πρόσημο του οποίου καθορίζονται από τη σύνθεση αμινοξέων της πρωτεΐνης, το pH και την ιοντική ισχύ του περιβάλλοντος. Υπό την επίδραση ενός εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου, φορτισμένα μόρια κινούνται στο διάλυμα προς τον αντίθετα φορτισμένο πόλο. Η ταχύτητα κίνησης των σωματιδίων πρωτεΐνης είναι ανάλογη με το μέγεθος του φορτίου τους και αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος των σωματιδίων και τον βαθμό ενυδάτωσής τους.
Η λεγόμενη «ζωνική ηλεκτροφόρηση» είναι σήμερα ευρέως διαδεδομένη - ηλεκτροφόρηση σε στερεό φορέα (σε λωρίδες χαρτιού, άγαρ, άμυλο, ακρυλαμίδιο) εμποτισμένο με ρυθμιστικό διάλυμα με την επιθυμητή τιμή pH. Η θέση των πρωτεϊνών σε χαρτί ή τζελ προσδιορίζεται με τη στερέωση και στη συνέχεια χρώση τους με τη μία ή την άλλη βαφή (συνήθως μπλε βρωμοφαινόλης, μαύρο αμιδίου ή μπλε Coomassie). Η ποσότητα πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα μπορεί να προσδιοριστεί κατά προσέγγιση από την ένταση χρώματος της σχετικής βαφής. Αυτός ο ορισμός δεν δίνει μια αυστηρά ποσοτική αναλογία πρωτεϊνικών κλασμάτων, καθώς η ποσότητα της χρωστικής που δεσμεύεται από διαφορετικές πρωτεΐνες δεν είναι η ίδια.
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ HA ΧΑΡΤΙ
Ο διαχωρισμός του αναλυόμενου μίγματος γίνεται σε ορισμένους τύπους χρωματογραφικού χαρτιού εμποτισμένου με ρυθμιστικό διάλυμα σε συσκευές ηλεκτροφόρησης. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε τάσεις έως 500 V.
Ο θάλαμος ηλεκτροφόρησης αποτελείται από ένα λουτρό από πλεξιγκλάς και ένα καπάκι προσαρμοσμένο σε αυτό (1). Το λουτρό έχει 2 διαμερίσματα ηλεκτροδίων (2), καθένα από τα οποία χωρίζεται από ένα διαμήκη χώρισμα (3) σε δύο διαμερίσματα που επικοινωνούν μεταξύ τους. Bo τα εσωτερικά διαμερίσματα των διαμερισμάτων χαμηλώνουν τα ηλεκτρόδια και τα άκρα των λωρίδων χαρτιού στα εξωτερικά διαμερίσματα (4), το κύριο μέρος του οποίου τοποθετείται σε οριζόντια πλάκα με ακίδες (5), που βρίσκεται στο κεντρικό τμήμα του θαλάμου. Υπάρχουν μπαστούνια μεταξύ της οριζόντιας πλάκας και του εξωτερικού διαμερίσματος των διαμερισμάτων ηλεκτροδίων (6),
Εικ.2. Διάγραμμα συσκευής για ηλεκτροφόρηση χαμηλής τάσης
μέσα από τα οποία ρίχνονται χάρτινες λωρίδες και που χρησιμεύουν για τη στήριξή τους. Κάτω από το επάνω κάλυμμα του θαλάμου υπάρχει μια πλάκα από πλεξιγκλάς με μεγάλες στρογγυλές τρύπες (7), στην οποία τοποθετούνται από πάνω φύλλα διηθητικού χαρτιού εμποτισμένα σε απεσταγμένο νερό και διπλωμένα 4-5 φορές. Αυτά τα φύλλα βοηθούν στην αύξηση της στεγανότητας του θαλάμου και, ως αποτέλεσμα, στη μείωση της εξάτμισης του υγρού από τα ηλεκτροφερογράμματα κατά την ηλεκτροφόρηση.
Χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση χαρτιού, οι μαθητές καλούνται να διαχωρίσουν τις πρωτεΐνες του ορού του αίματος. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, ο ορός αίματος μπορεί να χωριστεί σε 5 - 9 κλάσματα και να προσδιοριστεί η σχετική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε καθένα από αυτά. Ο διαχωρισμός πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 8,6 - 8,9) με βαθμίδα δυναμικού 3 - 5 V/cm (120 - 350 V για λωρίδες μήκους 40 - 45 cm) σε θερμοκρασία δωματίου. Το ρεύμα δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,1 - 0,3 mA για κάθε εκατοστό της διατομής της λωρίδας χαρτιού. Η αύξηση της ισχύος ρεύματος κατά περισσότερες από 2 φορές είναι απαράδεκτη, καθώς αυτό θα οδηγήσει σε υπερβολική θέρμανση, σημαντική αύξηση της εξάτμισης και Vτελικά - κάψιμο χαρτιού
Αντιδραστήρια:
1. Ρυθμιστικό διάλυμα. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί:
α) ρυθμιστικό διάλυμα veronal-medinal (pH 8,6): διαλύουμε 10,32 gmedinal (άλας νατρίου βερονάλης) σε 300 ml απεσταγμένου νερού, προσθέτουμε 1,84 gveronal, θερμαίνουμε με ανάδευση σε λουτρό νερού μέχρι να διαλυθεί και προσθέτουμε νερό σε 1 λίτρο.
β) ρυθμιστικό διάλυμα οξικής βερονάλης (ρΗ 8,6): 4,3 βερονάλη, 0,95 υδροξείδιο του νατρίου και 3,24 οξικό νάτριο διαλύονται σε 300 ml απεσταγμένου νερού. Προσθέστε 30 ml διαλύματος HCl 0,1 M στο διάλυμα και προσθέστε νερό σε 1 λίτρο.
γ) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris (ρΗ 8,9): 60,5 g Tris, 6 αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό και 4,6 gβορικό οξύ διαλύονται σε 1 απεσταγμένο νερό.
2. Λύσεις για χρωματισμό ηλεκτροφερογραμμάτων:
α) όξινη μπλε-μαύρη βαφή (παρόμοια με την αμιδική μαύρη 10 Β) -0,2 g μείγματος: οξικό οξύ (παγόμορφο) - 100 ml + μεθυλική αλκοόλη - 900 ml.
β) μπλε βρωμοφαινόλης -0,5 g, χλωριούχος υδράργυρος -10 g, οξικό οξύ (παγόμορφο) - 20 ml, απεσταγμένο νερό - 980 ml.
γ) μπλε βρωμοφαινόλης - 0,1 g, ZnSO 4 7H 2 O -50 g, οξικό οξύ (παγόμορφο) 50 ml, απεσταγμένο νερό - 900 ml.
3. Διαλύματα για την πλύση ηλεκτροφερογραμμάτων από βαφή που δεν είναι συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη και τη στερέωση της βαφής στην πρωτεΐνη:
α) οξικό οξύ - διάλυμα 2%.
β) οξικό νάτριο - διάλυμα 2% παρασκευασμένο με διάλυμα οξικού οξέος 10%.
4. Διαλύματα για την έκλουση έγχρωμων προϊόντων από ηλεκτροφερογράμματα:
α) για εκχύλιση μπλε βρωμοφαινόλης -0,01 Μ διάλυμα NaOH.
β) να εκχυλιστεί η όξινη μπλε-μαύρη χρωστική -0,1 Μ διάλυμα NaOH.
Εξοπλισμός: δοκιμαστικοι ΣΩΛΗΝΕΣ; κυβέτες, φασματοφωτόμετρο, συσκευή ηλεκτροφόρησης, χρωματογραφικό χαρτί: FN4, FN5, Whatman 3, Whatman 3MM, κ.λπ.
Λήψη ορού αίματος. 2 - 3 ml αίματος αναρροφάται σε στεγνό σωλήνα φυγοκέντρησης και αφήνεται για 1/2 - 1 ώρα Χρησιμοποιώντας μια λεπτή γυάλινη ράβδο, κυκλώνετε προσεκτικά τα τοιχώματα του σωλήνα για να διαχωρίσετε τον θρόμβο από αυτά, φυγοκεντρήστε και χύστε τον ορό σε καθαρός σωλήνας.
Προετοιμασία της κάμερας.Τα διαμερίσματα των ηλεκτροδίων γεμίζονται με ρυθμιστικό διάλυμα στο ίδιο επίπεδο (για να αποφευχθεί η υπερχείλιση του ρυθμιστικού διαλύματος), περίπου 800 ml σε κάθε διαμέρισμα. Bo τα εσωτερικά μέρη των διαμερισμάτων ηλεκτροδίων βυθίζουν τα ηλεκτρόδια. Σε ένα φύλλο χρωματογραφικού χαρτιού (18x45 cm) (όταν χρησιμοποιείτε λεπτούς τύπους χαρτιού, είναι προτιμότερο να εφαρμόζετε δείγματα σε ξεχωριστές λωρίδες πλάτους 4-5 cm) σε απόσταση 15 cm από μια από τις στενές πλευρές του, χρησιμοποιήστε ένα απλό μαλακό μολύβι (ο γραφίτης εμποδίζει την εξάπλωση του υγρού) για να περιγράψει τα σημεία για την εφαρμογή των δειγμάτων. Είναι ορθογώνια (2 x 0,3 cm), των οποίων οι μεγάλες πλευρές είναι κάθετες στο μήκος της λωρίδας χαρτιού. Η απόσταση μεταξύ των ζωνών εκκίνησης και των άκρων του ηλεκτροφερογράμματος είναι 2 εκ. Το ηλεκτροφερόγραμμα εμποτίζεται με το buffer στο οποίο θα γίνει η ηλεκτροφόρηση. Για να γίνει αυτό, τραβιέται μέσα από μια κυψελίδα με ρυθμιστικό διάλυμα. Τα άκρα των λωρίδων χαρτιού (6-8 cm) δεν βρέχονται. Η περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος αφαιρείται με στύπωμα των λωρίδων μεταξύ δύο ή τριών φύλλων διηθητικού χαρτιού. Το υγρό ηλεκτροφερόγραμμα τοποθετείται στο θάλαμο της κεντρικής οριζόντιας πλάκας (5) και τα άκρα κατεβαίνουν στα εξωτερικά διαμερίσματα των διαμερισμάτων ηλεκτροδίων.Η συσκευή κλείνει καλά με ένα καπάκι, κάτω από το οποίο υπάρχουν φύλλα διηθητικού χαρτιού βρεγμένα με νερό.
Διενέργεια ηλεκτροφόρησης.Αφού οι λωρίδες χαρτιού κορεστούν πλήρως με το ρυθμιστικό διάλυμα, δείγματα 0,01 - 0,02 ml (1 - 2 mg πρωτεΐνης) ορού εφαρμόζονται στις σημειωμένες περιοχές χρησιμοποιώντας μια πιπέτα 0,1 ml. Ο θάλαμος κλείνει με καπάκι και το ρεύμα είναι ενεργοποιημένο. Η διάρκεια της ηλεκτροφόρησης είναι 22 - 24 ώρες σε τάση 200 - 300 V
Στερέωση και χρώση ηλεκτροφερογραμμάτων.Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης, απενεργοποιήστε το ρεύμα και αφαιρέστε αμέσως τα ηλεκτροφερογράμματα από τη συσκευή. Τοποθετούνται σε ειδική βάση και στεγνώνουν στον αέρα κάτω από βύθισμα, στη συνέχεια σε φούρνο στους 105 ºC για 20 λεπτά για να σταθεροποιηθούν οι πρωτεΐνες σε χαρτί, στη συνέχεια τοποθετούνται σε μια κυψελίδα εμαγιέ, γεμίζουν με βαφή και αφήνονται για 2 - 3 ώρες ή περισσότερες. Η βαφή στραγγίζεται και τα ηλεκτροφερογράμματα πλένονται από την περίσσεια της με έκχυση 3-4 φορές με διάλυμα οξικού οξέος 2%, κάθε φορά για 5-10 λεπτά. Οι περιοχές χαρτιού που δεν περιέχουν πρωτεΐνη πρέπει να είναι εντελώς απαλλαγμένες από βαφή. Για τη στερέωση των έγχρωμων προϊόντων, τα ηλεκτροφερογράμματα γεμίζονται με διάλυμα 2% οξικού νατρίου για 2 λεπτά και ξηραίνονται στον αέρα υπό αναρρόφηση.
Προσδιορισμός της αναλογίας μεμονωμένων πρωτεϊνικών κλασμάτων.Σε pH 8,6, οι πρωτεΐνες του ορού φορτίζονται αρνητικά και κινούνται στο ηλεκτρικό πεδίο προς την άνοδο. Το κλάσμα που κινείται πιο γρήγορα προς την άνοδο είναι η αλβουμίνη, ακολουθούμενη από α 1 -, α 2 -, β- και γ-σφαιρίνες (βλ. Εικ. 3). . Τα τμήματα των χαρτοταινιών στα οποία έχουν εμφανιστεί λεκέδες πρωτεΐνης χωρίζονται με εγκάρσιες γραμμές με απλό μολύβι σε λωρίδες πλάτους 3-5 mm και κόβονται κατά μήκος αυτών των γραμμών. Κάθε λωρίδα συνθλίβεται και τοποθετείται σε ξεχωριστό αριθμημένο δοκιμαστικό σωλήνα, γεμάτο με 3 ml διαλύματος NaOH 0,01 M, αφήνεται για μία ώρα για να αφαιρεθεί η βαφή από το χαρτί και στη συνέχεια βρίσκεται η τιμή οπτικής πυκνότητας για κάθε διάλυμα σε ένα φωτοχρωματόμετρο ( φασματοφωτόμετρο) στα 612 nm.
Ρύζι. 3. Ηλεκτροφερόγραμμα ορού ανθρώπινου αίματος και καμπύλη κατανομής πρωτεϊνικών κλασμάτων
Ένα δείγμα ελέγχου επεξεργάζεται παράλληλα. Για αυτό, κόβεται μια λωρίδα από τις μη χρωματισμένες περιοχές του ηλεκτροφερογράμματος.
Με βάση τα δεδομένα που ελήφθησαν, σχεδιάζεται μια καμπύλη κατανομής έγχρωμων προϊόντων στο ηλεκτροφερόγραμμα.Οι αριθμοί των σωλήνων σημειώνονται στον άξονα της τετμημένης και η αντίστοιχη τιμή οπτικής πυκνότητας σημειώνεται στον άξονα τεταγμένων (βλ. Εικ. 3). . Υπολογίζεται το ποσοστό των πρωτεϊνικών κλασμάτων στον ορό του αίματος. Για να γίνει αυτό, η σχεδιασμένη καμπύλη χωρίζεται σύμφωνα με τα ελάχιστα σε έναν αριθμό τμημάτων που αντιστοιχούν σε μεμονωμένα κλάσματα. Το μέγεθος της επιφάνειας κάθε τμήματος είναι ανάλογο με την ποσότητα του χρώματος που συνδυάζεται με την πρωτεΐνη ενός δεδομένου κλάσματος. Η αναλογία μεταξύ αυτών των περιοχών υπολογίζεται κατά βάρος (το βάρος των τμημάτων χαρτιού είναι ανάλογο με το εμβαδόν τους), ολόκληρη η περιοχή λαμβάνεται ως 100%. Εάν διαθέτετε πυκνόμετρο, η αναλογία των πρωτεϊνικών κλασμάτων στον ορό του αίματος μπορεί να προσδιοριστεί από ένα πυκνόγραμμα.
Έχοντας προηγουμένως προσδιοριστεί η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στον ορό γάλακτος, η ποσότητα του υπολογίζεται για κάθε κλάσμα.
