Hochleistungschromatographie. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von natürlichen und Abwasserverunreinigungen

(hauptsächlich intermolekular) an der Grenzfläche. Als Analysemethode gehört die HPLC zu einer Gruppe von Methoden, die aufgrund der Komplexität der zu untersuchenden Objekte die vorläufige Trennung des anfänglich komplexen Gemisches in relativ einfache einschließt. Die erhaltenen einfachen Mischungen werden dann mit herkömmlichen physikalisch-chemischen Methoden oder mit speziellen für die Chromatographie entwickelten Methoden analysiert.

Die HPLC-Methode wird häufig in Bereichen wie Chemie, Petrochemie, Biologie, Biotechnologie, Medizin, Lebensmittelverarbeitung, Umweltschutz, Arzneimittelherstellung und vielen anderen eingesetzt.

Entsprechend dem Trennmechanismus der analysierten oder getrennten Substanzen wird die HPLC in Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Ausschluss, Ligandenaustausch und andere unterteilt.

Dabei ist zu beachten, dass die Trennung in der Praxis oft nicht durch einen, sondern durch mehrere Mechanismen gleichzeitig erfolgt. Daher kann die Ausschlusstrennung durch Adsorptionseffekte, Adsorptionsverteilung und umgekehrt erschwert werden. Je größer der Unterschied der Substanzen in der Probe in Bezug auf Ionisationsgrad, Basizität oder Acidität, in Bezug auf Molekulargewicht, Polarisierbarkeit und andere Parameter ist, desto wahrscheinlicher ist es gleichzeitig, dass ein unterschiedlicher Trennmechanismus auftritt für solche Stoffe.

Normalphasen-HPLC

Die stationäre Phase ist polarer als die mobile Phase, daher überwiegt das unpolare Lösungsmittel in der Zusammensetzung des Eluenten:

• Hexan:Isopropanol = 95:5 (für schwach polare Substanzen)
• Chloroform:Methanol = 95:5 (für mittelpolare Substanzen)
• Chloroform:Methanol = 80:20 (für stark polare Substanzen)

Umkehrphasen-HPLC

Die stationäre Phase ist weniger polar als die mobile Phase, daher ist fast immer Wasser im Eluenten vorhanden. In diesem Fall ist es immer möglich, eine vollständige Auflösung des BAS in der mobilen Phase sicherzustellen, es ist fast immer möglich, eine UV-Detektion zu verwenden, fast alle mobilen Phasen sind miteinander mischbar, es kann eine Gradientenelution verwendet werden, die Säule kann schnell reaktiviert werden -äquilibriert, kann die Säule regeneriert werden.

Gängige Eluenten für die Umkehrphasen-HPLC sind:

• Acetonitril: Wasser
• Methanol: Wasser
• Isopropanol: Wasser

Matrizen für HPLC

In der HPLC verwendete Matrizen sind anorganische Verbindungen wie Silica (Kieselgel) oder Aluminiumoxid oder organische Polymere wie Polystyrol (vernetzt mit Divinylbenzol) oder Polymethacrylat. Kieselgel ist natürlich mittlerweile allgemein akzeptiert.

Die Hauptmerkmale der Matrix:

• Partikelgröße (µm);
• Interne Porengröße (Å, nm).

Gewinnung von Kieselgel für HPLC:

1. Bildung von Mikrokügelchen aus Polykieselsäure;
2. Trocknen von Kieselgelpartikeln;
3. Lufttrennung.

Sorbenspartikel:

• Regulär (kugelförmig): höhere Druckfestigkeit, höhere Kosten;
• Nicht kugelförmig: geringere Druckfestigkeit.

Die Porengröße in der HPLC ist einer der wichtigsten Parameter. Je kleiner die Porengröße ist, desto schlechter ist ihre Durchlässigkeit für die Moleküle der eluierten Substanzen. Und folglich umso schlechter die Sorptionskapazität von Sorbentien. Je größer die Poren sind, desto geringer ist erstens die mechanische Stabilität der Sorbenspartikel, und desto kleiner ist zweitens die Sorptionsoberfläche und damit desto schlechter der Wirkungsgrad.

Transplantate in stationärer Phase

Normalphasen-HPLC:

• Stationäre Phase gepfropft mit Propylnitril (Nitril);
• Stationäre Phase mit Propylaminpfropfung (Amin).

Umkehrphasen-HPLC:

• Stationäre Phase mit Alkylpfropfung;
• Stationäre Phase mit Alkylsilyl-Pfropf.

Endcapping – Schutz von nicht gepfropften Bereichen des Sorbens durch zusätzliche Pfropfung mit „kleinen“ Molekülen. Hydrophobes Endcapping (C1, C2): höhere Selektivität, schlechtere Benetzbarkeit; hydrophiles Endcapping (Diol): geringere Selektivität, höhere Benetzbarkeit.

HPLC-Detektoren

• UV
• Diodenarray
• Fluoreszierend
• Elektrochemisch
• Refraktometrisch
• massenselektiv

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Flüssigkeitschromatographie, um die Effizienz der Trennung zu erhöhen, wird das Lösungsmittel (Elutionsmittel) unter Druck (mehr als 3x107 Pa) durch Säulen gepumpt, die mit einem Sorbens mit Partikeln mit kleinem Durchmesser (bis zu 1 μm) gefüllt sind, und Perfusion ... ...

Eine Art der Chromatographie, bei der die Flüssigkeit (Elutionsmittel) als mobile Phase und als stationäre Phase dient. Sorptionsmittel, Fernseher. ein Träger, auf dessen Oberfläche eine Flüssigkeit oder ein Gel aufgebracht ist. Durchgeführt in einer mit einem Sorptionsmittel gefüllten Säule (Säulenchromatographie), auf einem flachen ... ... Naturwissenschaft. Enzyklopädisches Wörterbuch

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Flüssigkeitschromatographie basierend auf Zersetzung. die Fähigkeit der getrennten Ionen zum Ionenaustausch mit fest. Sorbens-Ionen, die als Ergebnis der Dissoziation der ionogenen Gruppen der letzteren gebildet werden. Kationenaustauscher dienen der Trennung von Kationen, für ... ... Chemische Enzyklopädie

HPLC- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ... Wörterbuch der Abkürzungen der russischen Sprache

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine der effektivsten Methoden zur Trennung komplexer Stoffgemische, die sowohl in der analytischen Chemie als auch in der chemischen Technologie weit verbreitet ist. Die Grundlage der chromatographischen Trennung ist die Teilnahme ... Wikipedia

Bücher

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Flüssigkeits-Chromatographie Hierbei handelt es sich um eine Methode zur Trennung und Analyse komplexer Stoffgemische, bei denen Flüssigkeit die mobile Phase ist. Es ist auf die Trennung eines breiteren Bereichs von Substanzen als das Gaschromatographieverfahren anwendbar. Dies liegt daran, dass die meisten Stoffe nicht flüchtig sind, viele von ihnen bei hohen Temperaturen instabil sind (insbesondere hochmolekulare Verbindungen) und sich beim Übergang in den gasförmigen Zustand zersetzen. Die flüssigkeitschromatographische Stofftrennung wird meist bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Merkmale aller Arten der Flüssigkeitschromatographie sind darauf zurückzuführen, dass die mobile Phase darin eine Flüssigkeit ist und die Sorption von Komponenten aus einem gasförmigen und flüssigen Elutionsmittel unterschiedlich verläuft. Wenn in der Gaschromatographie das Trägergas nur eine Transportfunktion erfüllt und nicht von der stationären Phase sorbiert wird, dann ist die flüssige mobile Phase in der Flüssigchromatographie ein aktiver Eluent, dessen Moleküle von der stationären Phase sorbiert werden können. Beim Durchgang durch die Säule müssen die Moleküle der Komponenten des analysierten Gemisches, die sich im Elutionsmittel befinden, die Moleküle des Elutionsmittels von der Oberflächenschicht des Sorptionsmittels verdrängen, was zu einer Verringerung der Wechselwirkungsenergie zwischen den Molekülen des Elutionsmittels führt analysierte Substanz und die Oberfläche des Sorptionsmittels. Daher die Werte der zurückbehaltenen Volumina v R, proportional zur Änderung der freien Energie des Systems, ist bei der Flüssigkeitschromatographie kleiner als bei der Gaschromatographie, und der Bereich der Linearität der Sorptionsisotherme bei der Flüssigkeitschromatographie ist breiter.

Durch die Verwendung verschiedener Eluenten können die Retentionsparameter und die Selektivität des chromatographischen Systems verändert werden. Die Selektivität in der Flüssigkeitschromatographie wird im Gegensatz zur Gaschromatographie nicht von einem, sondern von zwei Faktoren bestimmt - der Art der mobilen (Elutionsmittel) und der stationären Phase.

Die flüssige mobile Phase hat eine höhere Dichte und Viskosität als die gasförmige Phase, Diffusionskoeffizienten D und 3–4 Größenordnungen niedriger als bei Gas. Dies führt zu einer Verlangsamung des Stofftransports in der Flüssigkeitschromatographie im Vergleich zur Gaschromatographie. Die Van-Deemter-Gleichung aufgrund der Tatsache, dass der Begriff BEI spielt in der Flüssigkeitschromatographie keine Rolle ( D und  D G), ändert sich auch die grafische Abhängigkeit des Wirkungsgrades H auf der linearen Geschwindigkeit des Flusses der mobilen Phase hat die in Abb. 1 gezeigte Form. 1.9.

Bei der klassischen Variante der Säulenflüssigkeitschromatographie wird eine 1–2 m hohe Glassäule, gefüllt mit einem Sorbens mit einer Partikelgröße von 100 μm und Eluent, mit der im Eluenten gelösten analysierten Probe injiziert und der Eluent durchgeleitet , wobei Teile des Eluats am Ausgang der Säule entnommen werden. Diese Variante der Flüssigchromatographie wird in der Laborpraxis zwar noch eingesetzt, aber da der Eluentenfluss unter Schwerkrafteinwirkung gering ist, ist die Analyse langwierig.

Eine moderne Version der Flüssigkeitschromatographie, die sogenannte Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-HPLC, verwendet volumetrische und oberflächenporöse Sorbentien mit einer Partikelgröße von 5–10 µm, Druckpumpen, die einen Druck im System von bis zu 400 atm und mehr liefern empfindliche Detektoren. Schneller Stofftransport und hohe Trennleistung ermöglichen den Einsatz der HPLC zur Trennung von Molekülen (Flüssig-Adsorptions- und Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie), zur Trennung von Ionen (Ionenaustausch-, Ionen-, Ionenpaar-Chromatographie), zur Trennung von Makromolekülen (Größenausschlusschromatographie).

1.3. LÖSUNGSMITTELHALT UND STÄRKE

Damit die Analyten wie oben erwähnt auf der Säule getrennt werden können, muss der Kapazitätsfaktor k" größer 0 sein, d. h. die Substanzen müssen von der stationären Phase, dem Sorbens, zurückgehalten werden. Der Kapazitätsfaktor sollte jedoch nicht zu groß sein groß sein, um eine akzeptable Elutionszeit zu erhalten Wird für ein gegebenes Stoffgemisch eine stationäre Phase gewählt, die diese hält, dann besteht die weitere Arbeit an der Entwicklung eines Analyseverfahrens darin, ein Lösungsmittel zu wählen, das im Idealfall andere liefern würde für alle Komponenten, aber akzeptabel nicht sehr groß k. Dies wird durch Veränderung der Elutionsstärke des Lösungsmittels erreicht.

Bei der Adsorptionschromatographie an Kieselgel oder Aluminiumoxid wird in der Regel die Stärke eines Zweikomponenten-Lösungsmittels (z. B. Hexan mit Zusatz von Isopropanol) erhöht, indem der Gehalt an der polaren Komponente (Isopropanol) darin erhöht wird , oder durch Verringerung des Gehalts an Isopropanol verringert werden. Wenn der Gehalt der polaren Komponente zu niedrig wird (weniger als 0,1 %), sollte sie durch eine schwächere Elutionsstärke ersetzt werden. Dasselbe wird gemacht, indem entweder die polare oder nicht-polare Komponente durch andere ersetzt wird, selbst wenn dieses System nicht die gewünschte Selektivität in Bezug auf die interessierenden Mischungskomponenten bereitstellt. Bei der Auswahl von Lösungsmittelsystemen werden sowohl die Löslichkeiten der Mischungskomponenten als auch die von verschiedenen Autoren zusammengestellten eluotropen Reihen von Lösungsmitteln berücksichtigt.

In etwa gleicher Weise wird die Stärke des Lösungsmittels bei Verwendung gepfropfter polarer Phasen (Nitril, Amino, Diol, Nitro etc.) unter Berücksichtigung möglicher chemischer Reaktionen und Ausschluss von für die Phase gefährlichen Lösungsmitteln (z , Aldehyde und Ketone für die Aminophase).

Bei der Umkehrphasenchromatographie wird die Stärke des Lösungsmittels durch Erhöhung des Anteils der organischen Komponente (Methanol, Acetonitril oder THF) im Elutionsmittel erhöht und durch Zugabe von mehr Wasser verringert. Kann die gewünschte Selektivität nicht erreicht werden, wird eine andere organische Komponente verwendet oder versucht, diese mit Hilfe verschiedener Zusätze (Säuren, Ionenpaarreagenzien etc.) zu verändern.

Bei Trennungen durch Ionenaustauschchromatographie wird die Stärke des Lösungsmittels durch Erhöhen oder Verringern der Konzentration der Pufferlösung oder durch Ändern des pH-Werts verändert, in einigen Fällen wird eine Modifizierung mit organischen Substanzen verwendet.

Allerdings ist es gerade bei komplexen natürlichen und biologischen Gemischen oft nicht möglich, die Lösungsmittelstärke so zu wählen, dass alle Probenbestandteile in akzeptabler Zeit eluiert werden. Dann muss man auf Gradientenelution zurückgreifen, d.h. Verwenden Sie ein Lösungsmittel, dessen Elutionsstärke sich während der Analyse ändert, so dass sie nach einem vorgegebenen Programm ständig zunimmt. Mit dieser Technik ist es möglich, in relativ kurzer Zeit alle Komponenten komplexer Gemische zu eluieren und in Form schmaler Peaks in Komponenten aufzutrennen.

1.6.1. Adsorptionsflüssigkeitschromatographie. Die Adsorptionsflüssigkeitschromatographie wird je nach Polarität der stationären und mobilen Phase in Normalphasen- (NPC) und Umkehrphasen- (RPC) Chromatographie unterteilt. Bei NPC werden ein polares Adsorptionsmittel und unpolare mobile Phasen verwendet; bei OFC werden ein unpolares Adsorptionsmittel und polare mobile Phasen verwendet, aber in beiden Fällen ist die Wahl der mobilen Phase oft wichtiger als die Wahl der stationäre. Die stationäre Phase muss die zu trennenden Substanzen enthalten. Die mobile Phase, also das Lösungsmittel, muss unterschiedliche Säulenkapazitäten und effiziente Trennungen in angemessener Zeit bereitstellen.

Als stationäre Phase in der Adsorptionsflüssigkeitschromatographie werden polare und unpolare feindisperse poröse Materialien mit einer spezifischen Oberfläche von mehr als 50 m 2 /g verwendet. Polare Adsorptionsmittel (SiO 2 , Al 2 O 3 , Florisil usw.) haben schwach saure Gruppen auf der Oberfläche, die Substanzen mit basischen Eigenschaften zurückhalten können. Diese Adsorptionsmittel werden hauptsächlich zur Trennung von unpolaren und mittelpolaren Verbindungen verwendet. Ihr Nachteil ist die hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Wassergehalt der verwendeten Eluenten. Um diesen Nachteil zu beseitigen, werden polare Sorbentien mit Aminen, Diolen und anderen Reagenzien behandelt, was zu einer Oberflächenpfropfung dieser Reagenzien, einer Oberflächenmodifikation und einer Änderung der Selektivität in Bezug auf die Analyten führt.

Unpolare Adsorptionsmittel (graphitierter Ruß, Kieselgur, Kieselgur) sind unselektiv gegenüber polaren Molekülen. Um unpolare Adsorbentien zu erhalten, werden häufig unpolare Gruppen auf die Oberfläche beispielsweise von Kieselgel gepfropft, beispielsweise Alkylsilyl - SiR 3, wobei R - Alkylgruppen C 2 - C 22 sind.

Die mobile Phase sollte die analysierte Probe vollständig lösen, eine niedrige Viskosität haben (damit die Diffusionskoeffizienten groß genug sind), es ist wünschenswert, dass die getrennten Komponenten davon getrennt werden können. Es muss gegenüber den Materialien aller Teile des Chromatographen inert, sicher, billig und für den Detektor geeignet sein.

Die in der Flüssigkeitschromatographie verwendeten mobilen Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsstärke. Das Elutionsvermögen eines Lösungsmittels gibt an, um wie viel Mal die Sorptionsenergie eines bestimmten Elutionsmittels auf einem bestimmten Adsorbens größer ist als die Sorptionsenergie des als Standard gewählten Elutionsmittels, beispielsweise n-Heptan. Schwache Lösungsmittel werden von der stationären Phase schlecht adsorbiert, daher sind die Verteilungskoeffizienten der sorbierten Substanzen (Sorbat) hoch. Umgekehrt adsorbieren starke Lösungsmittel gut, sodass die Sorbat-Verteilungskoeffizienten niedrig sind. Je stärker das Lösungsmittel, desto höher die Löslichkeit der analysierten Probe darin, desto stärker die Lösungsmittel-Sorbat-Wechselwirkung.

Um eine hohe Trennleistung auf der Säule zu gewährleisten, ist es notwendig, eine mobile Phase auszuwählen, die die optimale Polarität für das zu trennende Gemisch unter den gewählten Trennbedingungen aufweist. Typischerweise wird zuerst die stationäre Phase ausgewählt, die eine Polarität aufweist, die der der zu trennenden Komponenten nahe kommt. Dann wird die mobile Phase ausgewählt, um sicherzustellen, dass der Kapazitätskoeffizient k" lag im Bereich von 2 bis 5. Wenn die Polarität der mobilen Phase zu nahe an der Polarität der stationären Phase liegt, wird die Retentionszeit der Komponenten zu kurz, und wenn die Polaritäten von mobiler und stationärer Phase sehr unterschiedlich sind viel, die Aufbewahrungszeit wird zu lang.

Bei der Auswahl mobiler Phasen orientieren sie sich an der sogenannten eluotropen Reihe, basierend auf der Verwendung von Polaritätsindizes Schnüffler R", die alle Lösungsmittel in stark (polar) und schwach (schwach polar und unpolar) unterteilt. Die Polaritätsskala basiert auf der Löslichkeit der als Laufmittel verwendeten Substanzen in Dioxan, Nitromethan und Ethanol.

Tabelle 1.2 zeigt die Werte des Polaritätsindex und der Elutionsstärke (in Bezug auf SiO 2 ) einer Reihe von Lösungsmitteln, die am häufigsten in der Flüssigkeitschromatographie als mobile Phasen verwendet werden. Auch die kurzwelligen Transparenzgrenzen dieser Lösungsmittel sind hier angegeben, was die Auswahl der Bedingungen zum Nachweis von Mischungskomponenten erleichtert.

Tabelle 1.2

Eigenschaften von Lösungsmitteln, die in der Flüssigkeitschromatographie verwendet werden

Lösungsmittel	Polaritätsindex	Elutionsleistung (SiO 2)	Kurzwellen-Transparenzgrenze
Fluoralkan
Cyclohexan
n-Hexan
Tetrachlorkohlenstoff
Diisopropylether
Diethylether
Dichlormethan
Tetrahydrofuran
Chloroform
Essigsäure
Acetonitril
Nitromethan

Bei der Flüssigkeitschromatographie werden häufig nicht einzelne Lösungsmittel, sondern deren Gemische verwendet. Häufig erhöhen geringfügige Zugaben eines anderen Lösungsmittels, insbesondere Wasser, die Elutionsstärke des Elutionsmittels erheblich.

Bei der Trennung von Mehrkomponentengemischen kann es vorkommen, dass eine mobile Phase als Eluent nicht alle Probenkomponenten in angemessener Zeit trennt. Dabei wird ein schrittweises oder Gradienten-Elutionsverfahren verwendet, bei dem während der Chromatographie sequentiell immer stärkere Eluenten verwendet werden, was es ermöglicht, stark zurückgehaltene Substanzen in kürzerer Zeit zu eluieren.

In der Flüssigkeitschromatographie gibt es einige empirisch Regeln, die bei der Auswahl eines Eluenten sehr hilfreich sind:

 Die Sorption einer Verbindung nimmt in der Regel mit zunehmender Anzahl von Doppelbindungen und OH-Gruppen in ihr zu;

 Abnahme der Sorption bei einer Reihe organischer Verbindungen: SäurenAlkoholeAldehydeKetoneEsterungesättigte Kohlenwasserstoffegesättigte Kohlenwasserstoffe;

 zur Trennung von Substanzen unterschiedlicher Polarität und Trennung von Substanzen verschiedener Klassen wird die Normalphasenchromatographie verwendet: Die analysierte Probe wird gelöst und mit einem unpolaren Eluenten eluiert, Verbindungen verschiedener Klassen verlassen die Säule mit einem polaren Adsorbens für unterschiedliche Zeiten, während die Retentionszeit von Verbindungen mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen beim Übergang von unpolaren Verbindungen zu schwach polaren zunimmt. Bei sehr polaren Molekülen sind die Retentionszeiten so lang, dass eine Analyse mit einem unpolaren Eluenten nicht möglich ist. Um die Retentionszeit polarer Komponenten zu verringern, geht man zu polaren Eluenten über;

 bei der Reversed-Phase-Variante adsorbiert die stationäre Phase (unpolares Adsorbens) die unpolare Komponente stärker von polaren Eluenten, z. B. von Wasser;

 Durch Verringerung der Polarität des Eluenten durch Zugabe eines weniger polaren Lösungsmittels kann die Retention der Komponenten reduziert werden.

1.6.2. Verteilungsflüssigkeitschromatographie. Bei der Partitions- oder Flüssig-Flüssig-Chromatographie beruht die Trennung der Bestandteile der analysierten Probe auf Unterschieden in den Koeffizienten ihrer Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen, die sich nicht miteinander vermischen, von denen eine stationär ist und sich an der Oberfläche befindet oder in den Poren eines festen unbeweglichen Trägers, und der zweite mobil ist.

Hinsichtlich der Art der Wechselwirkungskräfte, die die unterschiedliche Verteilung von Stoffen unterschiedlicher chemischer Struktur zwischen den beiden Phasen bestimmen, ähnelt die Verteilungschromatographie der Adsorptionschromatographie, d.h. auch hier beruht die Trennung auf der Differenz der Kräfte von intermolekulare Wechselwirkung zwischen den Komponenten der analysierten Probe mit der stationären und mobilen flüssigen Phase.

Je nach Ausführungstechnik kann die Verteilungschromatographie wie die Adsorptionschromatographie säulen- oder planar (Papier- oder Dünnschichtchromatographie) sein.

Als feste Träger werden Substanzen verwendet, die gegenüber dem Laufmittel und den Bestandteilen der analysierten Probe indifferent sind, aber in der Lage sind, die stationäre Phase an der Oberfläche und in den Poren festzuhalten. Als Trägerstoffe werden meist polare Substanzen (Cellulose, Kieselgel, Stärke) verwendet. Sie werden auf die stationäre Phase aufgetragen - ein polares Lösungsmittel, meistens Wasser oder Alkohol. Als mobile Phasen werden dabei weniger polare oder unpolare Substanzen (Alkohole, Amine, Ketone, Kohlenwasserstoffe etc.) verwendet. Diese Art der Verteilungschromatographie wird genannt Normalphase. Es wird verwendet, um polare Substanzen zu trennen.

Die zweite Variante der Verteilungschromatographie unterscheidet sich dadurch, dass unpolare Träger (Gummi, Fluoroplast, hydrophobiertes Kieselgel) als stationäre feste Phase, unpolare Lösungsmittel (Kohlenwasserstoffe) als stationäre flüssige Phase und polare Lösungsmittel (Alkohole, Aldehyde) verwendet werden ) als mobile flüssige Phase. , Ketone usw., oft Wasser). Diese Variante wird als Verteilungschromatographie bezeichnet Umkehrphase und dient der Trennung von unpolaren Stoffen.

Um eine optimale Trennung der Bestandteile der analysierten Probe zu erreichen, ist die Auswahl der mobilen Phase sehr wichtig. Lösungsmittel (mobile und stationäre flüssige Phase) sollten so gewählt werden, dass sich die Verteilungskoeffizienten der Mischungskomponenten signifikant unterscheiden. Die flüssigen Phasen unterliegen dem Folgenden Bedarf:

1) die verwendeten Lösungsmittel sollten die zu trennenden Substanzen gut lösen, und ihre Löslichkeit in der stationären Phase sollte größer sein als in der mobilen;

2) die als mobile und stationäre Phase verwendeten Lösungsmittel müssen gegenseitig gesättigt sein, d.h. die Zusammensetzung des Lösungsmittels muss beim Durchgang durch die Säule konstant sein;

3) die Wechselwirkung von Lösungsmitteln, die als mobile Phase verwendet werden, mit der stationären Phase sollte minimal sein.

Meistens werden in der Verteilungsflüssigkeitschromatographie nicht einzelne Substanzen als mobile Flüssigphasen verwendet, sondern deren Mischungen in verschiedenen Verhältnissen. Dadurch können Sie die Polarität der mobilen Phase steuern, das Verhältnis der Polaritäten von mobiler und stationärer Phase ändern und optimale Bedingungen für die Trennung der Komponenten einer bestimmten zu analysierenden Mischung erzielen.

Ein wesentlicher Nachteil dieser chromatographischen Methode ist das recht schnelle Abwaschen der abgeschiedenen stationären flüssigen Phase vom Träger. Um sie zu eliminieren, wird das als mobile Phase verwendete Lösungsmittel mit der als stationäre flüssige Phase verwendeten Substanz gesättigt oder die stationäre flüssige Phase durch Pfropfen auf einen Träger stabilisiert.

Eine Variation der Verteilungsflüssigkeitschromatographie ist das weit verbreitete HPLC-Verfahren.

Die gängigsten chromatographischen Systeme sind Systeme, die nach dem Baukastenprinzip aufgebaut sind. Pumpen, Entgaser, Detektoren, Autosampler, Säulenöfen, Fraktionssammler, Chromatographiesystemsteuerungen und Schreiber sind als separate Module erhältlich. Eine große Auswahl an Modulen ermöglicht es Ihnen, verschiedene analytische Probleme flexibel zu lösen und die Systemkonfiguration bei Bedarf schnell und mit minimalen Kosten zu ändern. Gleichzeitig werden auch monomodulare (integrierte) LCs hergestellt, deren Hauptvorteil in der Miniaturisierung einzelner Blöcke und der Kompaktheit des Geräts besteht.

Abhängig von der Elutionsmethode werden Flüssigkeitschromatographen in isokratische und Gradientenchromatographen unterteilt.

Diagramm eines isokratischen Chromatographen

Die mobile Phase aus dem Behälter (1) durch den Einlassfilter (9) wird durch eine Hochdruck-Präzisionspumpe (2) dem Probeneingabesystem (3) zugeführt – einem manuellen Injektor oder einem Autosampler, wo auch die Probe injiziert wird . Weiter gelangt die Probe durch den Inline-Filter (8) mit dem Strom der mobilen Phase in das (die) Trennelement(e) (4) - durch die Vorsäule in die Trennsäule. Anschließend gelangt das Eluat in den Detektor (5) und wird in den Ablaufbehälter (7) abgeführt. Beim Durchströmen des Eluats durch den Messkreis des Detektors wird das Chromatogramm registriert und die Daten an einen Analogschreiber (Recorder) (6) oder ein anderes System zur Erfassung und Verarbeitung chromatographischer Daten (Integrator oder Computer) übertragen. Abhängig von der Gestaltung der Funktionsmodule kann das System von der Tastatur des Steuermoduls (normalerweise einer Pumpen- oder Systemsteuerung), von den Tastaturen jedes der Systemmodule oder von einem Steuerprogramm von einem Personalcomputer aus gesteuert werden.

Bei der Gradientenelution kommen zwei grundsätzlich unterschiedliche Arten von Flüssigkeitschromatographen zum Einsatz. Sie unterscheiden sich im Bildungspunkt des Zusammensetzungsgradienten der mobilen Phase.

Schema eines Gradientenchromatographen mit Bildung eines Gradienten der Zusammensetzung der mobilen Phase auf der Niederdruckleitung.

Die mobile Phase aus den Tanks (1) durch die Einlassfilter (9) und den Gradientenprogrammierer (10) wird durch eine Hochdruck-Präzisionspumpe (2) dem Probeninjektionssystem (3) zugeführt – einem manuellen Injektor oder einem Autosampler , wo auch die Probe eingespritzt wird. Der Betrieb der Gradienten-Programmierventile wird entweder durch das Systemsteuermodul (Pumpe oder Controller) oder durch ein PC-Steuerprogramm gesteuert. Systeme dieser Art bilden einen binären, dreidimensionalen und vierdimensionalen Gradienten. Die Form der Gradientenverarbeitungsfunktion hängt von dem spezifischen Steuermodul oder Steuerprogramm sowie der Funktionalität der Steuer- und Steuermodule ab. Weiter gelangt die Probe durch den Inline-Filter (8) mit dem Strom der mobilen Phase in das (die) Trennelement(e) (4) - durch die Vorsäule in die Trennsäule. Dann tritt das Eluat in den Detektor (5) ein und wird in den Ablauftank (7) abgeführt. Beim Durchströmen des Eluats durch den Messkreis des Detektors wird das Chromatogramm registriert und die Daten an einen Analogschreiber (Recorder) (6) oder ein anderes System zur Erfassung und Verarbeitung chromatographischer Daten (Integrator oder Computer) übertragen. Abhängig von der Gestaltung der Funktionsmodule kann das System über die Tastatur des Steuermoduls (normalerweise eine Pumpen- oder Systemsteuerung) oder durch ein Steuerprogramm von einem Personalcomputer gesteuert werden. Im Falle der Steuerung des Steuermoduls ist es möglich, den Detektor unabhängig von seiner eigenen Tastatur zu steuern.

Trotz der scheinbaren Attraktivität solcher Systeme (sie verwenden nur eine Hochdruck-Präzisionspumpe) haben diese Systeme eine Reihe von Nachteilen, von denen der wichtigste vielleicht die dringende Notwendigkeit einer gründlichen Entgasung der Komponenten der mobilen Phase sogar vor dem ist Niederdruckmischer (Gradientenprogrammierkammer). Sie wird mit Hilfe spezieller Strömungsentgaser durchgeführt. Aufgrund dieser Tatsache werden ihre Kosten vergleichbar mit einem anderen Typ von Gradientensystemen - Systemen mit der Bildung einer Gradientenzusammensetzung der mobilen Phase auf der Hochdruckleitung.

Der grundlegende Unterschied zwischen Systemen mit der Bildung einer Gradientenzusammensetzung der mobilen Phase in der Hochdruckleitung ist das Mischen von Komponenten in der Hochdruckleitung, natürlich wird bei diesem Ansatz die Anzahl der Präzisionspumpen durch die Anzahl der Tanks zum Mischen bestimmt die mobile Phase. Mit diesem Ansatz werden die Anforderungen an die Gründlichkeit der Entgasung der Bauteile deutlich reduziert.

Schema eines Gradientenchromatographen mit Bildung eines Gradienten der Zusammensetzung der mobilen Phase auf der Hochdruckleitung.

Die mobile Phase aus den Tanks (1) durch die Einlassfilter (9) wird von Hochdruck-Präzisionspumpen (2 und 11) durch einen statischen oder dynamischen Durchflussmischer (10) zum Probeninjektionssystem (3) geliefert - ein Handbuch Injektor oder Autosampler, wo auch die Probe injiziert wird. Der Betrieb der gesteuerten Pumpen wird entweder vom Steuermodul des Systems (Hauptpumpe oder Controller) oder von einem PC-Steuerprogramm gesteuert. In diesem Fall werden alle Pumpen angesteuert. Systeme dieser Art bilden einen binären oder dreidimensionalen Gradienten. Die Form der Gradientenverarbeitungsfunktion hängt von dem spezifischen Steuermodul oder Steuerprogramm sowie der Funktionalität der Steuer- und Steuermodule ab. Weiter gelangt die Probe durch den Inline-Filter (8) mit dem Strom der mobilen Phase in das (die) Trennelement(e) (4) - durch die Vorsäule in die Trennsäule. Anschließend gelangt das Eluat in den Detektor (5) und wird in den Ablaufbehälter (7) abgeführt. Beim Durchströmen des Eluats durch den Messkreis des Detektors wird das Chromatogramm registriert und die Daten an einen Analogschreiber (Recorder) (6) oder ein anderes System zur Erfassung und Verarbeitung chromatographischer Daten (Integrator oder Computer) übertragen. Abhängig von der Gestaltung der Funktionsmodule kann das System über die Tastatur des Steuermoduls (normalerweise eine Pumpen- oder Systemsteuerung) oder durch ein Steuerprogramm von einem Personalcomputer gesteuert werden. Im Falle der Steuerung des Steuermoduls ist es möglich, den Detektor unabhängig von seiner eigenen Tastatur zu steuern.

Die vorgeschlagenen Schemata sind eher vereinfacht. Die Systeme können zusätzliche Geräte umfassen – einen Säulenthermostat, Nachsäulenderivatisierungssysteme, Probenvorbereitungs- und Konzentrationssysteme, einen Lösungsmittelrecycler, Membransysteme zur Unterdrückung der elektrischen Hintergrundleitfähigkeit (für die Ionenchromatographie), zusätzliche Schutzsysteme (Filter, Säulen) usw . Auch in den Diagrammen sind die manometrischen Module nicht gesondert dargestellt. In der Regel werden diese Geräte in Pumpenaggregate eingebaut. Diese Einheiten können mehrere Pumpen, eine Pumpe mit einem Gradientenprogrammierer und eine gemeinsame Systemsteuerung kombinieren. Der Aufbau des Systems hängt von seiner Konfiguration und dem jeweiligen Hersteller ab.

Eine solch radikale Verkomplizierung der technischen Unterstützung des chromatographischen Prozesses führt zu einer Reihe von Anforderungen an die Eigenschaften der mobilen Phase, die in der klassischen Säulen- und Planarchromatographie fehlen. Die flüssige Phase muss für die Detektion geeignet sein (in einem bestimmten Bereich des Spektrums transparent sein oder einen niedrigen Brechungsindex, eine bestimmte elektrische Leitfähigkeit oder Dielektrizitätskonstante usw. haben), inert gegenüber den Materialien der Teile des chromatographischen Abschnitts sein, nicht bilden Gasblasen in den Pumpenventilen und der Detektorzelle, keine mechanischen Verunreinigungen aufweisen.

In der Flüssigkeitschromatographie Es werden viele Arten von Pumpen verwendet. Niederdruck-LC verwendet häufig peristaltische Pumpen (Abbildung 1).

Abb.1 MasterFlex programmierbare peristaltische Pumpe.

In der HPLC werden Hochdruckpumpen verwendet, um den Fluss der mobilen Phase durch die Säule mit den angegebenen Parametern sicherzustellen.

Die wichtigsten technischen Eigenschaften von HPLC-Pumpen sind: Flussbereich; maximaler Arbeitsdruck; Reproduzierbarkeit des Flusses; Pulsationsbereich der Lösungsmittelzufuhr.

Aufgrund der Art der Lösungsmittelzufuhr können Pumpen eine konstante Zufuhr (Durchfluss) und einen konstanten Druck aufweisen. Grundsätzlich wird bei analytischen Arbeiten ein konstanter Durchflussmodus verwendet, beim Füllen von Säulen wird ein konstanter Druckmodus verwendet.

Nach dem Funktionsprinzip werden HPLC-Pumpen unterteilt in Spritze und weiter Kolben hin und her .

Spritzenpumpen

Das Hauptunterscheidungsmerkmal dieser Pumpen ist ihr zyklischer Betrieb, und daher unterscheiden sich die Chromatographen, in denen diese Pumpen verwendet werden, auch im zyklischen Betrieb.

Reis. 2. Prinzipieller Aufbau einer Spritzenpumpe für HPLC.

Reis. 2A. Spritzenpumpe.

Die Steuereinheit BU versorgt den Motor D mit Spannung, der die Geschwindigkeit und Richtung seiner Drehung bestimmt. Die Rotation des Motors wird mit Hilfe des Getriebes P in die Bewegung des Kolbens P im Zylinder D umgewandelt. Die Pumpe wird in 2 Zyklen betrieben. Im Füllzyklus ist Ventil K2 geschlossen, K1 geöffnet, das Lösungsmittel fließt aus dem Vorratsbehälter in Zylinder C. Im Versorgungsmodus ist Ventil K1 geschlossen und durch Ventil K2 gelangt die mobile Phase in das Dosiergerät.

Pumpen dieses Typs zeichnen sich durch die nahezu vollständige Pulsationsfreiheit in der Strömung der mobilen Phase während des Betriebs aus.

Nachteile der Pumpe:

a) hoher Zeit- und Lösungsmittelverbrauch zum Waschen beim Wechseln des Lösungsmittels;

b) das durch das Volumen der Spritze begrenzte PF-Volumen und daher die begrenzte Trennzeit;

c) Aufhebung der Entmischung beim Füllen der Pumpe;

d) große Abmessungen und Gewicht bei gleichzeitig hohem Durchfluss und Druck (Sie benötigen einen leistungsstarken Motor und eine große Kolbenkraft mit seiner großen Fläche).

Kolbenkolbenpumpen.

Reis. 3. Hauptgerät einer Plungerpumpe.

Funktionsprinzip.

Der Motor D durch das Getriebe R bewegt den Kolben P hin und her und bewegt sich im Arbeitskopf der Pumpe. Die Ventile K1 und K2 öffnen, wenn sich die Pumpe in der Saug- bzw. Förderphase befindet. Die Menge des volumetrischen Vorschubs wird durch drei Parameter bestimmt: Kolbendurchmesser (normalerweise 3,13; 5,0; 7,0 mm), seine Amplitude (12-18 mm) und Frequenz (die von der Drehzahl von Motor und Getriebe abhängt).

Pumpen dieser Art liefern über lange Zeit einen konstanten Volumenstrom der mobilen Phase. Maximaler Arbeitsdruck 300-500 atm, Durchflussrate 0,01-10 ml/min. Wiederholbarkeit der Volumenzufuhr -0,5 %. Der Hauptnachteil besteht darin, dass das Lösungsmittel dem System in Form einer Reihe aufeinanderfolgender Pulse zugeführt wird, sodass es zu Druck- und Flusspulsationen kommt (Abb. 4). Dies ist der Hauptgrund für das erhöhte Rauschen und die Desensibilisierung fast aller in der LC verwendeten Detektoren, insbesondere der elektrochemischen.

Abb.4. Pulsieren der Kolbenpumpe.

Möglichkeiten, mit Pulsationen umzugehen.

1. Anwendung von Dämpfungsvorrichtungen.

Dies sind Spiralschläuche mit einem speziellen Profil aus Edelstahl, die in Reihe oder parallel in das System zwischen Pumpe und Spender eingebunden werden.

Reis. 5. Spiraldämpfer.

Der Dämpfer wird mit einem Druckanstieg in ihm aufgedreht (Beschleunigung der Pumpe). Wenn der Druck abfällt, verdreht es sich, sein Volumen nimmt ab, es drückt einen Teil des Lösungsmittels heraus, hält eine konstante Durchflussrate aufrecht und reduziert Pulsationen. Ein solcher Dämpfer funktioniert gut bei einem Druck von 50 atm und darüber.

Bei einem Druck von 5-30 atm glättet es Pulsationen besser Luftdämpfer, aus einer Säule (Abb. 6.). Die Luft in der verschlossenen Säule (6 x 200 mm) wird komprimiert und die Pulsationen werden gelöscht. Die darin enthaltene Luft löst sich innerhalb von 24 Stunden auf.

Reis. 6. Luftklappe.

2. Die Verwendung elektronischer Geräte.

Bei Verwendung eines elektronischen Druckwandlers können die Messwerte des Wandlers verwendet werden, um den Betrieb der Pumpe zu steuern. Wenn der Druck abfällt, erhöht sich die Motordrehzahl und gleicht den Druckabfall aus. Es ist auch möglich, Lecks in den Ventilen und teilweise in den Manschetten auszugleichen. Die Verwendung eines elektronischen Dämpfers (BPZh-80, KhPZh-1 usw.) ermöglicht es, Druckpulsationen bei einem Druck von 100-150 kgf/cm2 auf 1 atm zu reduzieren.

1.6.3. Ionenaustausch, Ionen, Ionenpaar-Chromatographie. Die Methoden der Ionenaustausch-, Ionen- und Ionenpaar-Chromatographie basieren auf dem dynamischen Prozess des Austauschs von Ionen, die mit der stationären Phase assoziiert sind, durch Eluent-Ionen, die in die Säule eintreten. Das Hauptziel des chromatographischen Prozesses ist die Trennung von anorganischen oder organischen Ionen gleichen Vorzeichens. Die Retention bei diesen Arten von Chromatographie wird durch die Änderung der freien Energie der Ionenaustauschreaktion bestimmt. Das Verhältnis der Konzentrationen von Austauschionen in der Lösung und in der Sorbensphase ist durch das Ionenaustauschgleichgewicht gekennzeichnet. Der Ionenaustausch besteht darin, dass einige Substanzen (Ionenaustauscher) beim Eintauchen in eine Elektrolytlösung Kationen oder Anionen daraus absorbieren und eine äquivalente Menge anderer Ionen mit einer Ladung des gleichen Vorzeichens in die Lösung abgeben. Zwischen Kationenaustauscher und Lösung findet ein Kationenaustausch, zwischen Anionenaustauscher und Lösung ein Anionenaustausch statt.

Kationenaustauscher sind meistens speziell synthetisierte unlösliche polymere Substanzen, die in ihrer Struktur saure ionogene Gruppen enthalten: -SO 3 H; –COOH; -OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Die chemischen Formeln von Kationenaustauschern lassen sich schematisch darstellen als R-SO 3 H; R-SO 3 Na. Im ersten Fall liegt der Kationenaustauscher in der H-Form vor, im zweiten in der Na-Form. R ist eine Polymermatrix.

Kationenaustauschreaktionen werden als gewöhnliche heterogene chemische Reaktionen geschrieben:

RN + Na + R Na + H +

Anionenaustauscher enthalten basische ionogene Gruppen in ihrer Struktur: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + usw. Ihre chemischen Formeln können als RNH 3 OH und RNH 3 Cl oder ROH, RCl dargestellt werden. Im ersten Fall liegt der Anionenaustauscher in der OH-Form vor, im zweiten in der Cl-Form. Die Anionenaustauschreaktion kann wie folgt geschrieben werden:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Es sind amphotere Ionenaustauscher bekannt, die in ihrer Struktur sowohl saure als auch basische Gruppen enthalten. Ionenaustauscher, die in ihrer Zusammensetzung gleichartige (z. B. SO 3 H) saure (basische) Gruppen aufweisen, werden als monofunktionell bezeichnet; Ionenaustauscher mit heterogenen (z. B. - SO 3 H, - OH) sauren (basischen) Gruppen - polyfunktionell.

Monofunktionelle Ionenaustauscher werden durch eine Polymerisationsreaktion erhalten. Die Polykondensationsreaktion ermöglicht es, polyfunktionelle Ionenaustauscher zu erhalten. Damit die resultierenden Ionenaustauscher ausreichend hohe Leistungseigenschaften aufweisen, müssen sie in dem entsprechenden Lösungsmittel unlöslich, aber quellbar sein und eine ausreichend große Anzahl an ionogenen Gruppen aufweisen, die in der Lage sind, sich mit den ionogenen Gruppen der analysierten Probe auszutauschen. Dies kann erreicht werden, wenn die resultierenden Polymerketten ausreichend verzweigt und durch „Vernetzungsbrücken“ miteinander verbunden sind. Beispielsweise wird bei der Herstellung von Kationenaustauschern vom Polymerisationstyp auf der Basis von Styrol am häufigsten Divinylbenzol als Vernetzungsmittel verwendet, dessen Einführung in einer Menge von bis zu 16 % die Herstellung von Ionenaustauschern mit verschiedenen Quellgraden sicherstellt und, daher erlaubt es einem, die Porosität des Ionenaustauschers zu steuern. Der Quellungsgrad des Ionenaustauschers, ausgedrückt in Milliliter/Gramm, ist das Volumen von 1 g lufttrockenem Ionenaustauscher, der in die Säule gepackt wird.

Der Ionenaustauscher absorbiert in der Regel eines der Gegenionen - Ionen in der mobilen Phase, d.h. er weist eine gewisse Selektivität auf. Reihen von Affinitäten oder Selektivitäten von Ionen in Bezug auf Ionenaustauscher verschiedener Typen wurden experimentell ermittelt. Beispielsweise werden bei niedrigen Lösungskonzentrationen an stark sauren Kationenaustauschern Ionen gleicher Ladung in folgender Reihenfolge sorbiert:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Für Ionen mit unterschiedlichen Ladungen steigt die Sorptionsfähigkeit mit zunehmender Ladung:

Na+Ca2+

Eine Änderung der Bedingungen zur Durchführung der Ionenaustauschreaktion kann jedoch zu einer Reiheninversion führen. Auch für Anionenaustauscher haben sich Affinitätsreihen etabliert. Beispielsweise steigt die Sorbierbarkeit von Anionen an stark basischen Anionenaustauschern in der Reihe:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 - .

Ionenaustauscher, die stark saure oder stark basische Gruppen in ihrer Struktur enthalten, gehen Ionenaustauschreaktionen mit beliebigen Ionen in Lösung ein, die Ladungen mit demselben Vorzeichen wie das Vorzeichen des Gegenions haben. Solche Ionenaustauscher werden als universell bezeichnet.

Der Prozess des Ionenaustauschs zwischen dem Analyten und dem Ionenaustauscher kann auf drei Arten durchgeführt werden: statisch, dynamisch (Ionenaustausch-Filtermethode) und chromatographisch.

Statische Methode Beim Ionenaustausch wird eine Probe des Ionenaustauschers mit einem bestimmten Volumen der Lösung in Kontakt gebracht und für eine bestimmte Zeit gerührt oder geschüttelt, bis sich ein Gleichgewicht eingestellt hat. Dies ist eine schnelle und einfache Methode des Ionenaustauschs, die verwendet wird, um Ionen aus verdünnten Lösungen zu konzentrieren und unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen, aber es bietet keine vollständige Absorption von Ionen, da der Ionenaustausch ein Nichtgleichgewichtsprozess ist und daher keine vollständige Trennung garantiert von Ionen.

Bei der Durchführung eines Ionenaustauschs auf dynamische Weise eine Lösung wird durch die Säule mit einem Ionenaustauscher geleitet, der, während er sich entlang der Säule bewegt, mit neuen Körnern des Ionenaustauschers in Kontakt kommt. Dieses Verfahren bietet einen vollständigeren Austausch als das statische Verfahren, da die Austauschprodukte durch den Lösungsstrom entfernt werden. Sie können Ionen aus verdünnten Lösungen aufkonzentrieren und Ionen mit stark unterschiedlichen Eigenschaften trennen, beispielsweise unterschiedlich geladene Ionen (Kationen von Anionen trennen), aber die Trennung von Ionen mit gleichem Ladungszeichen ist fast unmöglich. Eine quantitative Trennung solcher Ionen ist nur durch wiederholte Wiederholung von Sorptions-Desorptions-Elementarvorgängen unter dynamischen Bedingungen möglich, d.h. chromatographische Methode . Beim Arbeiten mit diesem Verfahren werden hohe Ionenaustauscherschichten verwendet, und das zu trennende Gemisch wird in diese Schicht in einer Menge eingeführt, die viel geringer ist als die Kapazität der Säule, wodurch eine wiederholte Wiederholung von elementaren Ionenaustauschvorgängen gewährleistet ist .

Die Ionenaustausch-Chromatographie ähnelt der Analysetechnik entsprechend der Molekularchromatographie und kann je nach Eluent (Entwicklung), Frontal- und Verdrängungsoptionen durchgeführt werden. Der Unterschied zwischen Molekular- und Ionenaustauschchromatographie besteht darin, dass bei der Molekularchromatographie die getrennten Bestandteile des Gemisches mit einem reinen Laufmittel von der Säule eluiert werden, während bei der Ionenaustauschchromatographie eine Elektrolytlösung als Laufmittel verwendet wird. In diesem Fall sollte das ausgetauschte Ion des Elutionsmittels weniger selektiv sorbiert werden als alle Ionen des zu trennenden Gemischs.

Bei der am häufigsten angewandten Entwicklungs-Ionenaustausch-Chromatographie wird eine mit einem Ionenaustauscher gefüllte Säule zunächst mit einer Elektrolytlösung gewaschen, bis der Ionenaustauscher alle seine Ionen vollständig durch die im Laufmittel enthaltenen Ionen ersetzt. Dann wird ein kleines Volumen der Analytlösung in die Säule eingebracht, die abtrennbare Ionen in einer Menge von etwa 1 % der Kapazität des Ionenaustauschers enthält. Als nächstes wird die Säule mit einer Elutionslösung gewaschen, wobei Fraktionen des Eluats entnommen und analysiert werden.

Ein Gemisch aus Cl – , Br – , J – -Ionen kann auf einem stark basischen Anionenaustauscherharz (vernetztes Polystyrol, das Gruppen von quartären Ammoniumbasen N (CH 3) 3 + enthält), z. B. AB-17, getrennt werden. die einen Selektivitätsbereich (Selektivität) aufweist: NO 3 - Cl – Br – J – . Als Elutionsmittel wird daher eine NaNO 3 -Lösung verwendet. Diese Lösung wird zunächst durch den Ionenaustauscher geleitet, bis sie vollständig mit NO 3 - -Ionen gesättigt ist. Wenn das zu trennende Gemisch in die Säule eingeführt wird, werden die Ionen Cl – , Br – , J – vom Anionenaustauscher absorbiert, wodurch NO 3 – -Ionen verdrängt werden. Beim anschließenden Waschen der Säule mit NaNO 3 -Lösung werden die Ionen Cl – , Br – , J – in den oberen Schichten des Anionenaustauschers nach und nach wieder durch NO 3 – -Ionen ersetzt. Cl - Ionen werden am schnellsten verdrängt, J - Ionen bleiben am längsten in der Säule. Der Unterschied in der Selektivität des Ionenaustauschers zu den Ionen der Mischung führt dazu, dass in der Säule getrennte Zonen von adsorbierten Ionen Cl – , Br – und J – gebildet werden, die sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule bewegen. Wenn Sie sich entlang der Säule bewegen, vergrößert sich der Abstand zwischen den Zonen. In jeder Zone befindet sich nur eines der Anionen des zu trennenden Gemisches und das Anion des Elutionsmittels, im Intervall zwischen den Zonen befindet sich nur ein Anion des Elutionsmittels. Somit erscheinen Fraktionen, die einzelne Komponenten des zu trennenden Gemisches enthalten, im Elutionsmittel am Säulenausgang.

Um praktische Probleme zu lösen, werden die Bedingungen für die Ionentrennung durch Auswahl einer geeigneten mobilen Phase (Zusammensetzung, Konzentration, pH-Wert, Ionenstärke) oder durch Veränderung der Porosität der Polymermatrix des Ionenaustauschers, d. h. der Anzahl der Bindungen zwischen den Ketten, variiert der Matrix, und Schaffung von Ionenaustauschsieben, die für einige Ionen durchlässig und zu ihrem Austausch fähig und für andere undurchdringlich sind. Es ist auch möglich, die Natur und die gegenseitige Anordnung ionogener Gruppen zu ändern sowie Sorbentien zu erhalten, die aufgrund von Komplexbildung zu selektiven chemischen Reaktionen befähigt sind. Eine hohe Selektivität besitzen beispielsweise komplexierende Ionenaustauscher, die in ihrer Struktur chelatisierende Gruppen organischer Reagenzien wie Dimethylglyoxim, Dithizon, 8-Hydroxychinolin usw. sowie Kronenether enthalten.

Die größte Anwendung in der Ionenaustausch-, Ionen- und Ionenpaar-Chromatographie finden sich in synthetischen organischen Makro- und Mikronetz-Ionenaustauschern mit großer Austauschkapazität (3–7 mmol/g) sowie anorganischen Ionenaustauschermaterialien. Mikromaschen-Ionenaustauscher sind in der Lage, Ionen nur im gequollenen Zustand auszutauschen, während Makromaschen-Ionenaustauscher in der Lage sind, Ionen im gequollenen und ungequollenen Zustand auszutauschen. Eine andere Bauart von Ionenaustauschern sind Oberflächenfilm-Ionenaustauscher, deren fester Kern aus einem nichtporösen Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol, Glas oder Kieselgel besteht und von einem dünnen Film des Ionenaustauschers umgeben ist. Der Gesamtdurchmesser eines solchen Teilchens beträgt etwa 40 µm, und die Dicke des Ionenaustauscherfilms beträgt 1 µm. Der Nachteil solcher Ionenaustauscher ist der relativ große Partikeldurchmesser und die geringe Austauschkapazität aufgrund der geringen spezifischen Oberfläche, wodurch mit kleinen Proben gearbeitet und dementsprechend hochempfindliche Detektoren eingesetzt werden müssen. Außerdem vergiften solche Ionenaustauscher schnell und sind nicht regenerierbar.

Im Hochleistungs-Ionenaustausch und in der Ionenchromatographie werden raumporöse Polystyrol-Ionenaustauscher, volumenporöse Kieselsäuren mit einem Korndurchmesser von etwa 10 µm und praktisch nicht quellende oberflächenporöse und oberflächenmodifizierte Copolymere aus Styrol und Divinylbenzol mit ionogene Sulfo- und Aminogruppen verwendet werden.

In der Ionenpaarchromatographie werden "Bürsten" -Sorbentien verwendet - Kieselgele mit gepfropften Umkehrphasen C 2, C 8, C 18, die bei Absorption von ionischen Tensiden aus der mobilen Phase, beispielsweise Alkyl, leicht in einen Kationenaustauscher umgewandelt werden Sulfate oder Salze von quartären Ammoniumbasen.

Bei der chromatographischen Trennung mit Ionenaustauschern werden meist wässrige Lösungen von Salzen als mobile Phase verwendet. Dies liegt daran, dass Wasser hervorragende Auflösungs- und Ionisierungseigenschaften hat, wodurch die Moleküle der analysierten Probe sofort in Ionen dissoziieren, die Ionenaustauschergruppen des Ionenaustauschers hydratisiert werden und auch in eine vollständig oder teilweise dissoziierte Form übergehen. Dies gewährleistet einen schnellen Austausch von Gegenionen. Die Elutionsstärke der mobilen Phase wird hauptsächlich durch den pH-Wert, die Ionenstärke, die Art der Pufferlösung, den Gehalt an organischem Lösungsmittel oder Tensid (Ionenpaarchromatographie) beeinflusst.

Der pH-Wert wird in Abhängigkeit von der Art der ionogenen Gruppen, der abzutrennenden Ionen und der Matrix gewählt. Mit stark sauren und stark basischen Ionenaustauschern kann bei pH = 2–12, mit schwach sauren bei pH = 5–12 und mit schwach basischen bei pH = 2–6 gearbeitet werden. Sorbentien auf Kieselsäurebasis können bei pH 9 nicht verwendet werden. Die Ionenstärke der mobilen Phase beeinflusst die Kapazität des Ionenaustauschers. Mit zunehmender Ionenstärke nimmt in der Regel die Sorption von Ionen ab, da die Elutionsstärke der mobilen Phase zunimmt. Daher sollte die mobile Phase zu Beginn der Trennung eine niedrige Ionenstärke (0,05–0,1) aufweisen und der Endwert dieser Eigenschaft sollte 2 nicht überschreiten. Bei der Gradientenelution werden häufig Puffer mit steigender Ionenstärke verwendet.

Zur selektiven Elution der vom Ionenaustauscher aufgenommenen Ionen können Wasser, Pufferlösungen (Phosphat, Acetat, Borat, Hydrogencarbonat etc.) mit einem bestimmten pH-Wert und Ionenstärke, Lösungen von Mineralien (Salz-, Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor-) und organische (Phenol-, Zitronen-, Milch-, Wein-, Oxal-, EDTA) Säuren. Die Auswahl des Laufmittels wird dadurch erleichtert, dass die Grenzverteilungskoeffizienten der meisten Elemente zwischen wässrigen (wasserorganischen) Lösungen vieler Komplexbildner und handelsüblichen Ionenaustauschern ermittelt und tabellarisch dargestellt werden.

1.6.4. Größenausschlusschromatographie. Die Größenausschlusschromatographie ist eine Art der Flüssigkeitschromatographie, bei der die Trennung von Komponenten auf der Verteilung von Molekülen entsprechend ihrer Größe zwischen dem Lösungsmittel in den Poren des Sorbens und dem zwischen seinen Partikeln fließenden Lösungsmittel basiert. Bei der Trennung gelangen kleine Moleküle in das Polymernetzwerk, in dessen Poren das Lösungsmittel als stationäre Phase dient, und werden dort festgehalten. Große Moleküle können das Polymernetzwerk nicht durchdringen und werden durch die mobile Phase aus der Säule gespült. Die größten Moleküle werden zuerst eluiert, dann die mittleren und schließlich die kleinen.

Die Größenausschlusschromatographie wird in Gelpermeation und Gelfiltration unterteilt. Bei der Gelpermeationschromatographie erfolgt die Trennung an Polymeren, die in organischen Lösungsmitteln quellen. Die Gelfiltrationsversion der Größenausschlusschromatographie beinhaltet die Verwendung von wasserquellbaren Polymeren als stationäre Phasen.

Die Verweildauer der Bestandteile der analysierten Probe in der Größenausschlusssäule hängt von der Größe ihrer Moleküle und der Diffusion in die Poren des Sorbens sowie von der Größe der Poren der stationären Phase ab.

Bei dieser Art der Flüssigkeitschromatographie ist der Verteilungskoeffizient D für die kleinsten Moleküle der analysierten Probe, die sich in der Chromatographiesäule mit der geringsten Geschwindigkeit bewegen und in das Gitter der stationären Phase eindringen, ist er gleich 1, da die mobile Phase und das Lösungsmittel in den Poren der stationären Phase sind die gleiche Zusammensetzung. In diesem Fall nimmt die Hauptgleichung der Säulenchromatographie die Form an

Große Moleküle, die nicht in die Poren der stationären Phase eindringen, werden zusammen mit der mobilen Phase von der Säule eluiert. Für Sie D= 0, ein v R =v m. Ein solcher Bereich von Verteilungskoeffizientenwerten (von 0 bis 1) ist nur für die Größenausschlusschromatographie typisch.

Alle Moleküle der analysierten Mehrkomponentensubstanz sollten aus der Säule ausgewaschen werden, indem ein kleines Volumen Lösungsmittel ausgeleitet wird v m Vor v m +v s und die Trennung ist abgeschlossen, bevor der Lösungsmittelpeak austritt. Daher ist es bei dieser Art der Chromatographie erforderlich, ausreichend lange Säulen mit einem großen freien Volumen zu verwenden. v m und eine große Anzahl von Poren im Sorptionsmittel.

Die Auflösung chromatographischer Peaks bei Größenausschlusstrennungen kann durch Gradientenelution mit gemischten Lösungsmitteln verbessert werden.

Jedes in der Größenausschlusschromatographie verwendete Sorbens zeichnet sich durch ein bestimmtes Porenvolumen aus und hat daher einen bestimmten Bereich an trennbaren Molekulargewichten und eine bestimmte Eichkurve. Die die Abhängigkeit des Retentionsvolumens vom Molekulargewicht bzw. der Größe der Moleküle charakterisierende Eichkurve hat dabei in der Regel eine komplexe Form.

Stationäre Phasen in der Größenausschlusschromatographie werden basierend auf spezifischen analytischen Aufgaben ausgewählt. Zunächst wird festgelegt, welches Lösungsmittelsystem für die Analyse verwendet werden kann (wässrig oder wässrig-organisch). Abhängig davon wird die Art des Sorptionsmittels bestimmt. Sollen wasserlösliche Proben getrennt werden, werden beispielsweise wasserquellbare vernetzte Dextrane (Sephadex) oder Polyacrylamide (Biogel P) als stationäre Phasen verwendet. Die Trennung von in organischen Lösungsmitteln löslichen Stoffen kann an Polystyrolen unterschiedlicher Vernetzungsgrade durchgeführt werden, die in organischen Lösungsmitteln quellen (Styrogel, Poragel, Biobid C). Solche gequollenen Gele sind im Allgemeinen nicht druckstabil und erlauben sehr niedrige Flussraten der mobilen Phase, was die Analysezeit verlängert. Um eine hocheffiziente Variante der Größenausschlusschromatographie zu realisieren, ist es notwendig, stationäre Phasen mit starren Matrizen – Kieselgele – zu verwenden, deren Nachteil – hohe Adsorptionsaktivität – durch Oberflächensilanisierung oder Auswahl eines Elutionsmittels mit geeigneter Polarität beseitigt wird .

Substanzen, die als mobile Phasen in der Größenausschlusschromatographie verwendet werden können, sind:

 die analysierte Probe vollständig auflösen;

 das Sorptionsmittel gut anfeuchten;

 der Adsorption von Probenbestandteilen am Sorbens entgegenwirken;

 haben eine niedrige Viskosität und Toxizität.

1.6.5. Planare Chromatographie. Die Planarchromatographie umfasst die Dünnschicht- und die Papierchromatographie. Diese Arten der Flüssigkeitschromatographie sind technisch einfach, erfordern keine teure Ausrüstung, was ihr unbestreitbarer Vorteil ist.

Die Auftrennung eines Stoffgemisches nach diesen Methoden kann mit verschiedenen chromatographischen Systemen erfolgen. Daher werden Adsorption, Verteilung, Normal- und Umkehrphase, Ionenaustausch etc., Papier- und Dünnschichtchromatographie unterschieden. Derzeit ist die Dünnschichtchromatographie am weitesten verbreitet.

Papier- und Dünnschichtchromatographie sind in der Technik ähnlich. Zellulose-Papierfaser wird als stationäre Phase in der Papierchromatographie verwendet und verschiedene Sorbentien (Al 2 O 3 , Kieselgel usw.) werden in einer gleichmäßig dünnen (100–300 μm) Schicht auf einem Glas-, Metall- oder Kunststoffsubstrat (Träger) aufgebracht ) in der Dünnschichtchromatographie . Die Adsorptionsmittelschicht auf dem Träger kann fixiert sein oder nicht.

Die chromatographische Trennung bei planaren Verfahren sowie auf einer Säule beruht auf dem entsprechend den Verteilungskoeffizienten der zu trennenden Substanzen unterschiedlich schnellen Transfer der Bestandteile des Analyten durch die mobile Phase entlang der Schicht der stationären Phase . In beiden Fällen werden Flüssig-Fest-Sorbens-Chromatographiesysteme (Adsorptions-Trennmechanismus), Flüssig-Flüssig-Fest-Träger (Verteilung, Ionenaustausch und andere Mechanismen) verwendet.

Als mobile Phasen werden verschiedene Lösungsmittel oder deren Mischungen, organische oder anorganische Säuren verwendet.

Das praktische Erhalten planarer Chromatogramme besteht im Folgenden.

Auf einem Streifen Chromatographiepapier oder auf einer dünnen Schicht Sorptionsmittel wird mit einem Bleistift im Abstand von 1 cm von der Unterkante des Streifens oder der Platte eine Startlinie markiert. Mit einer Mikropipette wird eine Probe in Form eines Flecks mit einem Durchmesser von nicht mehr als 2–3 mm auf die Startlinie aufgetragen. Dann wird der Rand des Streifens oder der Platte in das Gefäß mit der mobilen Phase abgesenkt, das sich in einer abgedichteten Kammer befindet. Wenn die mobile Phase entlang des Streifens oder der Platte aufsteigt und die in der Chromatographie üblichen mehrfachen elementaren Vorgänge der Sorption-Desorption, Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen, Ionenaustausch usw. stattfinden, werden die Komponenten des analysierten Gemisches getrennt. Der Prozess wird normalerweise fortgesetzt, bis das Lösungsmittel die Startlinie 10 cm passiert hat, danach wird der Streifen oder die Platte aus der Kammer entfernt und getrocknet. Sind die Bestandteile des Analyten gefärbt, ergeben sie auf dem Chromatogramm die entsprechenden Farbflecken. Um ungefärbte Bestandteile des Analyten nachzuweisen, muss das Chromatogramm entwickelt werden. Die Entwicklung eines Chromatogramms und der Nachweis von Probenbestandteilen kann mit verschiedenen Methoden erfolgen und hängt von der Zusammensetzung der analysierten Gemische ab. Die Manifestation kann erfolgen:

-Mit UV-Licht. Das Verfahren ist anwendbar zum Nachweis von Substanzen, die unter Einwirkung von UV-Strahlung eigene Strahlung (Lumineszenz) im sichtbaren Wellenlängenbereich emittieren können;

 mittels Reagenz-Entwickler. Beispielsweise kann das Vorhandensein von Aminosäuren in der analysierten Mischung unter Verwendung von Ninhydrin nachgewiesen werden. Das getrocknete Chromatogramm wird in eine 0,2%ige Lösung von Ninhydrin in Aceton eingetaucht und dann getrocknet. Die den verschiedenen Komponenten der Mischung entsprechenden Flecken erhalten eine sichtbare und in der Regel für jede Substanz spezifische Farbe;

- mit Jod. Dabei wird das detektierte Chromatogramm in ein Gefäß eingebracht, an dessen Boden sich Jodkristalle befinden. Joddämpfe werden stärker an den Flecken adsorbiert, wodurch die Flecken sichtbar werden. Jod ist ein unspezifisches Entwicklerreagenz. Mit speziellen Reagenzien ist es möglich, nicht nur die Anzahl der Komponenten einer Mischung zu bestimmen, sondern auch die getrennten Substanzen anhand der Farbe der Flecken zu identifizieren.

Die Papier- und Dünnschichtchromatographie wird am häufigsten in der oben beschriebenen sogenannten aufsteigenden Variante durchgeführt. Um die Qualität von Chromatogrammen zu verbessern, müssen häufig komplexere Varianten der Planarchromatographie verwendet werden, z. B. top-down, kreisförmig, zweidimensional. Bei der Papier- oder Dünnschicht-Down-Chromatographie wird der Analyt oben auf die Startlinie der Platte oder des Papierstreifens aufgetragen und der Eluent von oben statt von unten zugeführt. Der positive Effekt einer verbesserten Trennung beruht auf dem Beitrag der Schwerkraft der Komponenten zum Trennungsprozess.

Sowohl Upstream- als auch Downstream-Chromatographie können in ein- und zweidimensionaler Ausführung durchgeführt werden. Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen eindimensionalen Flachbett-Trennverfahren wird bei der zweidimensionalen chromatographischen Trennung die Trennung der analysierten Probe zuerst in einem Lösungsmittel durchgeführt, dann wird die Trennung in der Richtung senkrecht zu dem ersten unter Verwendung durchgeführt ein anderes Lösungsmittel, Drehen des ersten Chromatogramms um 90°C.

Bei der Zirkularchromatographie wird der Analyt als Tropfen in die Mitte einer Platte oder eines Blattes Chromatographiepapier aufgetragen. Auch hier werden ein oder mehrere Lösungsmittel zugetropft. Dies führt dazu, dass das resultierende Chromatogramm eine Reihe von radialen Flecken ist.

Die Position der Flecken (Zonen), die die getrennten Komponenten des Analyten auf einem flachen Chromatogramm bilden, wird durch die Werte der relativen Bewegungsgeschwindigkeit der Komponenten in einer dünnen Schicht charakterisiert R fi. Experimenteller Wert R fi definiert als das Verhältnis der Entfernung L ich, bestanden ich-te Komponente, zum Abstand L durch das Lösungsmittel von der Startlinie zur Frontlinie geführt (Abb. 1.10):

Wert R fi hängt jedoch immer von der Art der relevanten Komponente der analysierten Probe, der Art der stationären Phase, ihrer Dicke, der Art und Qualität der mobilen Phase, der Methode des Auftragens der Probe und anderen Faktoren ab R fi 1.

Wert R fi ist eigentlich identisch mit der Retentionszeit einer Substanz bzw. ihrem Retentionsvolumen, das die Durchgangsgeschwindigkeit einer Substanz durch eine Chromatographiesäule charakterisiert und zur qualitativen Identifizierung der Bestandteile der analysierten Probe herangezogen werden kann, und der Spotdurchmesser ist identisch auf die Höhe oder Fläche des chromatographischen Peaks und spiegelt daher in gewissem Maße den quantitativen Inhalt der Substanz wider.

Die quantitative Bestimmung der Zusammensetzung der analysierten Probe kann im einfachsten Fall visuell durch die Intensität der Eigenfarbe der Spots oder die Intensität des fluoreszierenden Leuchtens der entstehenden Spots bei der UV-Detektion beurteilt werden. Für diese Zwecke wird die Elution von chromatographischen Spots weithin verwendet. In diesem Fall wird der auf dem Chromatogramm erhaltene Fleck vorsichtig ausgeschnitten oder abgekratzt, mit einem geeigneten Lösungsmittel behandelt und die resultierende Lösung mit der entsprechenden physikalisch-chemischen Methode untersucht. Sie können auch die gravimetrische Methode anwenden, bei der der entsprechende Fleck aus dem Chromatogramm ausgeschnitten und gewogen wird. Die Substanzmenge wird durch die Differenz der Gewichte von sauberem Papier derselben Fläche und Papier mit der Substanz bestimmt.

Papier (BH ) und Dünnschichtchromatographie (TLC ) nach dem Trennmechanismus gehören Verteilungschromatographie . Beim HD-Verfahren ist der Träger eine Besonderheit chromatographisches Papier mit bestimmten Eigenschaften. Stationäre Phase ist wasseradsorbiert auf der Oberfläche und den Poren von Papier (bis zu 20%), mobil - organisches Lösungsmittel, mischbar oder nicht mischbar mit Wasser, Wasser oder Elektrolytlösungen.

Mechanismus Auf dem Papier ziemlich kompliziert. In der stationären Phase kann die Substanz nicht nur durch Auflösung in dem vom Papier adsorbierten Wasser zurückgehalten werden, sondern auch adsorbiert werden Zellulose direkt. Auf Papier gezeichnet gemeinsame Komponenten in die mobile Phase gelangen und sich entsprechend unterschiedlich schnell durch die Kapillaren des Papiers bewegen Grenzflächenverteilungskoeffizient jeder von ihnen. Am Anfang Chromatographie ein Teil der Substanz aus dem Papier geht hinein Mobile Phase und fahre fort. Wenn das organische Lösungsmittel den Bereich des Papiers erreicht, der den gelösten Stoff nicht enthält, Umverteilung : aus der organischen Phase geht die Substanz in die wässrige Phase über, sorbiert auf Papier. Da die Komponenten unterschiedlich sind Affinität zum Sorbens , wenn sich der Eluent bewegt, kommt es zu einer Trennung: Einige Substanzen werden am Anfang des Weges verzögert, andere bewegen sich weiter. Hier werden kombiniert thermodynamisch (Einstellen einer Gleichgewichtsverteilung von Stoffen zwischen den Phasen) und kinetisch (bewegte Bauteile mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten) Trennaspekte. Dadurch konzentriert sich jede Komponente auf einen bestimmten Bereich des Papierbogens: Zonen einzelner Komponenten an Chromatogramm . Die Anwendung der Chromatographie auf Papier hat eine Reihe von erheblichen Nachteilen: Der Trennprozess hängt von der Zusammensetzung und den Eigenschaften des Papiers ab, die Änderung des Wassergehalts in den Poren des Papiers bei Änderungen der Lagerbedingungen, eine sehr geringe Chromatographiegeschwindigkeit ( bis zu mehreren Tagen) und geringe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Diese Mängel wirken sich ernsthaft auf die Verbreitung der Papierchromatographie als chromatographisches Verfahren aus.

BEI TLC-Verfahren der prozess der trennung eines stoffgemisches erfolgt in einer dünnen schicht Sorptionsmittel auf einem inerten festen Substrat abgeschieden und durch die Bewegung bereitgestellt Mobile Phase (Lösungsmittel) durch das Sorptionsmittel unter Einwirkung von Kapillarkräfte . VonTrennmechanismus unterscheiden Verteilungs-, Adsorptions- und Ionenaustauschchromatographie . Die Trennung der Komponenten erfolgt in diesen Fällen entweder aufgrund ihres unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden flüssigen Phasen ( Verteilungschromatographie ) oder aufgrund unterschiedlicher Adsorbierbarkeit von Verbindungen durch das Sorptionsmittel ( Adsorptionschromatographie ). Das Adsorptionsverfahren basiert auf unterschiedlichen Sorptions-Desorptionsgraden der getrennten Komponenten an der stationären Phase. Adsorption auf Kosten durchgeführt Van-der-Waals-Kräfte , das ist die Grundlage physikalische Adsorption , polymolekular (Bildung mehrerer Adsorbatschichten auf der Oberfläche des Adsorbens) und Chemisorption (chemische Wechselwirkung von Adsorbens und Adsorbat).

Im Falle der Verwendung solcher Sorbentien für DC wie z Aluminiumoxid oder Kieselgel spielen eine Rolle bei der Trennung Verteilung , so und Adsorption auf der entwickelten aktiven Oberfläche des Sorbens (150–750 m2/g). Verteilung Komponenten der Mischung zwischen Wasser auf der Oberfläche des Trägers (wie z Adsorptionsmittel , Wie Aluminiumoxid , Stärke , Zellulose , Kieselgur - und Wasser bilden stationäre Phase ) und das Lösungsmittel, das sich durch diese stationäre Phase bewegt ( Mobile Phase ). Die in Wasser leichter lösliche Komponente der Mischung bewegt sich langsamer als die in der mobilen Phase besser lösliche.

Adsorption manifestiert sich darin, dass zwischen Träger B. Aluminiumoxid, und die Mischungskomponenten eingestellt Adsorptionsgleichgewichte - für jede Komponente ein eigenes, dessen Ergebnis ist unterschiedliche Reisegeschwindigkeit Mischungsbestandteile. Es lassen sich zwei Extremfälle unterscheiden:

a) die Konzentration des Stoffes auf dem Adsorptionsmittel ist Null. Die Substanz löst sich vollständig in der mobilen Phase auf und wird von dieser mitgerissen (bewegt sich mit Lösungsmittelfront ).

b) die Substanz wird vollständig adsorbiert, geht keine Wechselwirkung mit dem Lösungsmittel ein und verbleibt am Start.

In der Praxis mit der geschickten Auswahl von Lösungs- und Adsorbens Verteilung Verbindungen liegen zwischen diesen Extremfällen, und die Substanz allmählich überführt von einer Sorbensschicht zur anderen aufgrund gleichzeitig ablaufender Prozesse Sorption und Desorption .

Das durch das Sorptionsmittel hindurchtretende Lösungsmittel wird genannt Elutionsmittel , der Vorgang des Zusammenbewegens einer Substanz mit einem Elutionsmittel  Elution . Bei der Bewegung der Flüssigkeit auf der Platte trennt sich das Stoffgemisch durch Krafteinwirkung Adsorption , Verteilung , Ionenaustausch oder eine Kombination all dieser Faktoren. Infolgedessen trennen chromatographische Zonen Mischungsbestandteile, d.h. es stellt sich heraus Chromatogramm .

Richtige Auswahl Sorptionsmittel und Elutionsmittel bestimmt die Effizienz der Gemischtrennung. Die Mobilität der Testsubstanz hängt von ihrer Affinität zum Sorbens ab und Elutionskraft (Polarität) des Eluenten. Mit zunehmender Polarität der Verbindung steigt auch ihre Affinität zum polaren Sorbens. Durch Erhöhung des Adsorptionsgrades Kieselgel organische Verbindungen sind in einer Reihe angeordnet: Kohlenwasserstoffe<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь für Kieselgel Eluenten können in aufsteigender Reihenfolge nach "Polarität" angeordnet werden ( Elutionsleistung ) und bilden eine Reihe von Lösungsmitteln ( eluotrope Reihe ) in Übereinstimmung mit experimentellen Daten: Alkane> Benzol> Chloroform> Diethylether> Ethylacetat> Alkohole С 2 -С 4> Wasser> Aceton> Essigsäure> Methanol. So wird eine polare Verbindung, Alkohol, ziemlich stark an Kieselgel adsorbiert und bewegt sich daher schwach unter der Wirkung eines solchen unpolaren Lösungsmittels wie Hexan und bleibt in der Nähe der Startlinie. Der unpolare aromatische Kohlenwasserstoff Biphenyl wiederum ist in Hexan merklich beweglicher, aber auch hier zu erreichen R f etwa 0,5, wird ein polareres aprotisches Elutionsmittel, Methylenchlorid, benötigt. Eluentenstärke mit Lösungsmittelgemischen regulieren - Nachbarn in eluotrope Reihe mit unterschiedlicher Polarität.

Derzeit verwendet TLC hauptsächlich Folgendes Sorptionsmittel : zur Trennung lipophile Substanzen  Kieselgel , Aluminiumoxid , Acetylierte Zellulose , Polyamide ; zu trennen hydrophile Substanzen  Zellulose , Zellulose-Ionenaustauscher , Kieselgur , Polyamide . Die wichtigste Eigenschaft eines Sorptionsmittels ist seine Aktivität , d.h. Fähigkeit absorbieren (halten) die Bestandteile des zu trennenden Gemisches. Im Ausland produzieren eine Reihe von Firmen Kieselgel , Kieselgur und Aluminiumoxid mit Zusatz von 5 % Gips, der zur Fixierung der Sorbensschicht bei der Eigenherstellung von Platten verwendet wird.

Das gebräuchlichste Sorbens ist Kieselgel - hydratisierte Kieselsäure, gebildet durch Einwirkung von Mineralsäuren auf Na 2 SiO 3 und Trocknung des resultierenden Sols. Nach dem Mahlen des Sols wird eine Fraktion einer bestimmten Korngröße verwendet (auf dem Schild angegeben, normalerweise 5-20 Mikron). Kieselgel ist ein polares Sorbens mit OH-Gruppen als aktive Zentren. Es sorbiert leicht Wasser an der Oberfläche und bildet Wasserstoffbrückenbindungen.

Tonerde ist ein schwach basisches Adsorbens und wird hauptsächlich zur Trennung von schwach basischen und neutralen Verbindungen eingesetzt. Der Nachteil von Platten auf Aluminiumoxid ist die obligatorische Aktivierung der Oberfläche vor der Verwendung in einem Trockenschrank bei hoher Temperatur (100-150 o C) und die geringe Adsorptionskapazität der Schicht im Vergleich zu Kieselgel.

Kieselgur - aus natürlichen Mineralien gewonnenes Adsorptionsmittel - Kieselgur. Das Sorptionsmittel hat im Vergleich zu Kieselgel hydrophile Eigenschaften und eine geringere Adsorptionskapazität der Schicht.

Zellulose: Zellulosebeschichtete Dünnschichtplatten sind sehr effektiv bei der Trennung komplexer organischer Moleküle. Das Adsorptionsmittel sind hauptsächlich Zellulosekügelchen mit einem Durchmesser von bis zu 50 Mikron, die mit Stärke auf dem Träger fixiert sind. Wie bei der Papierchromatographie ist der Anstieg der Lösungsmittelfront sehr langsam.

Chromatographische Analyse wird auf Industrieplatten tschechischer Produktion durchgeführt " Silufol » (« Silufol "") aus Aluminiumfolie, manchmal mit Pappe verstärkt, und " Siluplast » aus Kunststoff, beschichtet mit einer Sorptionsmittelschicht - Kieselgel LS 5-40 mit Stärke oder Gips als Bindemittel (bis 10 %) oder Aluminiumoxid mit oder ohne fluoreszierende Indikatoren. Aufzeichnungen " Silufol » haben eine hohe Elutionsrate, zeichnen sich jedoch durch geringe Trennleistung und geringe Empfindlichkeit aus. Während der Lagerung sind sie empfindlich gegenüber Umgebungsbedingungen (Feuchtigkeit, Temperatur, aggressive Medien etc.). Einzelne Firmen liefern chromatographische Platten mit einer Sorptionsmittelschicht unterschiedlicher (meist bis 0,25 mm), aber streng konstanter Dicke (Kieselgel, Zellulose, Ionenaustauscherharz), auf Glas und Substraten aus Aluminiumfolie, Kunststoff, imprägniertem Fiberglas.

Platten " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) werden in Russland auf Polymerbasis (Polyethylenterephthalat, Klasse P) oder Aluminiumsubstrat (Klasse AF) mit aufgebrachter Arbeitsschicht hergestellt mikrofraktioniertes Kieselgel-Sorbens Sorten STX-1A und STX-1VE (hergestellt in der UdSSR als fraktioniertes Kieselgel KSKG) mit einer Dicke von 90-120 Mikrometer (bis zu 200 Mikrometer), fixiert mit einem speziellen Bindemittel - Kieselsol . Bei Verwendung von Kieselsäure (Silicazol)-Sol als Bindemittel, das sich nach dem Erhitzen in Kieselgel umwandelt, bestehen die resultierenden DC-Platten aus zwei Komponenten: einer Kieselgelschicht und einem Substrat. Die Dickengleichmäßigkeit der Sorbensschicht auf einer Platte beträgt ±5 µm. Bezeichnungsbeispiel: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UF (10x10)" - Hochleistungs-TLC-Platten auf einem Aluminiumsubstrat, mit einem Leuchtstoff, 10x10 cm.

Wenn ein Glassubstrat (Klasse C) verwendet wird, dann sind solche Platten wiederverwendbar und chemisch beständig. Ihre chemische Beständigkeit wird durch die chemische Beständigkeit von Kieselgel bestimmt. Dadurch können TLC-Platten wiederholt mit aggressiven Reagenzien behandelt werden, beispielsweise mit einer heißen Chrommischung, wodurch die Beschränkungen für die Verwendung korrelierender Reagenzien für den Spot-Nachweis und die Sorbensmodifikation aufgehoben werden und ein mehrfaches (bis zu 30-maliges oder mehr) Plattenregeneration mit einer Chrommischung. Glasplatten können auf die gewünschte Größe zugeschnitten werden. Die mechanische Festigkeit der Sorbensschicht kann gesteuert werden, was einerseits den Transport und die mehrfache Bearbeitung der Platten ermöglicht und andererseits die Möglichkeit bietet, Adsorptionsschichten mit getrennten Stoffen zum anschließenden Auswaschen einzelner Verbindungen aus den Platten zu extrahieren Sorbens und ihre weitere Untersuchung durch instrumentelle Methoden (IR- und UV-Spektrometrie. , Röntgenbeugungsmethoden, NMR usw.).

Die Platten unterscheiden sich in der Größe der Fraktionen (Partikelverteilung) des Kieselgels, aus dem die Schicht besteht. Auf analytischen Platten (Grad A) beträgt die Fraktion 5-17 Mikrometer, auf hocheffizienten (Grad B) - 8-12 Mikrometer. Eine engere Verteilung erhöht die Effizienz der Platten, d.h. die Spots der zu trennenden Substanzen werden kompakter (kleiner) und damit besser getrennt, wenn die Eluentenfront eine kürzere Strecke passiert. Auf russischen Wafern unterscheiden sich Analyse- und Hochleistungsschichten nicht sehr, im Gegensatz zu Wafern von Merck (Deutschland). Hochleistungsplatten sollten verwendet werden, wenn Substanzen nicht auf analytischen Platten getrennt werden können. Platten aller Modifikationen werden mit einem Leuchtstoff (UV-Qualität) mit 254 nm Anregung hergestellt. Die Haltbarkeit ist nicht begrenzt, die Platten " Sorbfil » Weitgehend getestet in der Analyse von Aminosäurederivaten, Pestiziden, Lipiden, Antibiotika.

Es wird das TLC-Verfahren durchgeführt qualitative Identifikation Komponenten. Quantifizierung für DC ist ebenfalls möglich, dies erfordert das Aufbringen der genauen Substanzmenge und zusätzliche densitometrische Studien mit einer klaren Fixierung der Intensität der Flecken. Am häufigsten ist halbquantitative Methode . Es basiert auf visueller Vergleich die Größe und Intensität des Flecks einer Komponente mit den entsprechenden Eigenschaften einer Reihe von Flecken des gleichen Stoffes unterschiedlicher Konzentration ( Standard-Referenzlösungen ). Bei Verwendung einer Probe in einer Menge von 1–5 μg bietet eine solche einfache Methode eine Genauigkeit der Bestimmung des Komponentengehalts von etwa 5–10%. Um die Komponenten in einer Probe zu bestimmen, ist es oft notwendig, eine Probenvorbereitung durchzuführen, um eine Mischung zu erhalten, die die analysierten Verbindungen enthält. Die Probenvorbereitung basiert auf der Extraktion von Drogen aus der Probe mit organischen Lösungsmitteln ( n-Hexan, Petrolether, Diethylether, Chloroform), Reinigung des Extraktes und anschließende Chromatographie in einer dünnen Schicht Aluminiumoxid oder Kieselgel.

Es gibt mehrere Varianten von TLC und BC, die sich in der Art und Weise unterscheiden Lösungsmittelversorgung . Je nach Bewegungsrichtung der mobilen Phase gibt es:

a)aufsteigende Chromatographie  die mobile Phase wird auf den Boden der Trennkammer gegossen, das Papier (Platte) senkrecht gestellt;

b)absteigende Chromatographie  die mobile Phase wird von oben zugeführt und bewegt sich entlang der Sorbensschicht der Platte oder des Papiers nach unten;

in)radiale Chromatographie  horizontaler Vorschub der Lösungsmittelfront: Die mobile Phase wird in die Mitte der Papierscheibe (Platte) gebracht, wo sich das zu trennende Gemisch ablagert.

Am häufigsten ist Elution nach oben (Chromatographie). Vorderseite Elutionsmittel beim Bewegen von unten nach oben. Die Wahl des Lösungsmittels (Laufmittel) richtet sich nach der Art des Sorptionsmittels und den Eigenschaften der zu trennenden Stoffe.

Chromatographische Trennung BC- und TLC-Verfahren werden in durchgeführt Trennkammer mit Schraubdeckel. Ein quantitatives Maß für die Transferrate einer Substanz unter Verwendung eines bestimmten Adsorbens und Lösungsmittels ist R-Wert f (aus dem Englischen. Zurückbehaltung Faktor – Verzögerungskoeffizient, dieser Parameter ist analog zur Retentionszeit). Position Zonen der chromatographierten Komponente auf Größe einstellen Koeffizient R f gleich dem Verhältnis der Geschwindigkeit seiner Zone zur Geschwindigkeit der Lösungsmittelfront. Wert R f ist immer kleiner als Eins und hängt nicht von der Länge des Chromatogramms ab. Nach der Menge R f von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Bei niedrigen Temperaturen bewegen sich Substanzen also langsamer; Lösungsmittelverunreinigung, Adsorptionsmittelinhomogenität, Fremdionen in der analysierten Lösung können den Wert verändern R f bis zu 10%. Im ausgewählten System müssen die Analyten unterschiedliche Werte haben R f und über die gesamte Länge des Chromatogramms verteilt. Es ist wünschenswert, dass die Werte R f lag im Bereich von 0,05-0,85.

In der Praxis der Wert R f berechnet als Verhältnis der Entfernung l von der Substanz in die Ferne gereist L durch das Lösungsmittel geleitet:

R f = ll (6.1 )

Normalerweise für die Berechnung wählen Punkt Zentrum (Abb. 1). Wert R f hängt von vielen Faktoren ab, wie z chromatographisches Papier (seine Porosität, Dichte, Dicke, Hydratationsgrad) und Sorptionsmittel (Korngröße, Art der Gruppen auf der Oberfläche, Schichtdicke, Feuchtigkeitsgehalt, Art der Substanz, Zusammensetzung der mobilen Phase), Versuchsbedingungen (Temperatur, Chromatographiezeit etc.). Bei Konstanz aller Chromatographieparameter wird der Wert R f nur durch die individuellen Eigenschaften der einzelnen Komponenten bestimmt.

Reis. 1. Bestimmung der Werte auf dem Chromatogramm Rf für Bauteile UND und BEI,

ihren Trennungsgrad Rs und die Zahl der theoretischen Böden N .

Die Effizienz von BC und TLC hängt auch davon ab Selektivität und Empfindlichkeit Reaktionen zum Nachweis der Bestandteile des analysierten Gemisches. Üblicherweise werden Reagenzien verwendet, die mit den zu bestimmenden Komponenten farbige Verbindungen bilden - Entwickler. Für eine zuverlässigere Identifizierung von gemeinsam genutzten Komponenten anwenden " Zeugen » -Lösungen Standardsubstanzen (in demselben Lösungsmittel wie die Probe), die voraussichtlich in der Probe vorhanden sind. Standardsubstanz auf die Startlinie neben der analysierten Probe aufgetragen und unter den gleichen Bedingungen chromatographiert. In der Praxis wird oft ein relativer Wert verwendet:

R f rel = R f x / R f Stand (6.2)

wo R f Stand ebenfalls nach Formel (6.1) berechnet. Effizienz chromatographische Trennung charakterisieren Anzahl äquivalenter theoretischer Trennstufen und sie Höhe . So ist bei der DC-Methode die Zahl der äquivalenten theoretischen Trennstufen N UND für Komponente UND das zu trennende Gemisch errechnet sich nach der Formel:

N EIN = 16 (l OA / a (EIN )) 2 (6.3)

Werte l OA und a (UND ) bestimmt wie in Abb. 6.1. Dann die Höhe des äquivalenten theoretischen Bodens H UND ist:

H EIN = l OA /N = a (EIN ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Eine Trennung ist praktisch möglich, wenn R f (UND)  R f (BEI)  0,1 .

Zur Charakterisierung der Trennung zweier Komponenten UND und BEI verwenden Grad (Kriterium) der Teilung Rs :

Rs =  l / (a (EIN) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (EIN) + a (B)) (6.5)

wo  l  Abstand zwischen den Mittelpunkten der Komponentenpunkte UND und BEI;

a (UND) und a (BEI)  Punktdurchmesser UND und BEI auf dem Chromatogramm (Abb. 6.1). Je mehr Rs , desto deutlicher sind die Spots der Komponenten getrennt UND und BEI auf dem Chromatogramm. Bedingungen Chromatographie sind so gewählt, dass der Wert Rs anders als null und eins, der optimale Wert Rs ist 0,3  0,7. Zum Preis Trennselektivität zwei Komponenten UND und BEI verwenden Trennfaktor α :

α = l B / l EIN (6.6)

Wenn α = 1, dann die Komponenten UND und BEI sind nicht getrennt.

(hauptsächlich intermolekular) an der Grenzfläche. Als Analysemethode gehört die HPLC zu einer Gruppe von Methoden, die aufgrund der Komplexität der zu untersuchenden Objekte die vorläufige Trennung des anfänglich komplexen Gemisches in relativ einfache einschließt. Die erhaltenen einfachen Mischungen werden dann mit herkömmlichen physikalisch-chemischen Methoden oder mit speziellen für die Chromatographie entwickelten Methoden analysiert.

Die HPLC-Methode wird häufig in Bereichen wie Chemie, Petrochemie, Biologie, Biotechnologie, Medizin, Lebensmittelverarbeitung, Umweltschutz, Arzneimittelherstellung und vielen anderen eingesetzt.

Entsprechend dem Trennmechanismus der analysierten oder getrennten Substanzen wird die HPLC in Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Ausschluss, Ligandenaustausch und andere unterteilt.

Dabei ist zu beachten, dass die Trennung in der Praxis oft nicht durch einen, sondern durch mehrere Mechanismen gleichzeitig erfolgt. Daher kann die Ausschlusstrennung durch Adsorptionseffekte, Adsorptionsverteilung und umgekehrt erschwert werden. Je größer der Unterschied der Substanzen in der Probe in Bezug auf Ionisationsgrad, Basizität oder Acidität, in Bezug auf Molekulargewicht, Polarisierbarkeit und andere Parameter ist, desto wahrscheinlicher ist es gleichzeitig, dass ein unterschiedlicher Trennmechanismus auftritt für solche Stoffe.

Normalphasen-HPLC

Die stationäre Phase ist polarer als die mobile Phase, daher überwiegt das unpolare Lösungsmittel in der Zusammensetzung des Eluenten:

• Hexan:Isopropanol = 95:5 (für schwach polare Substanzen)
• Chloroform:Methanol = 95:5 (für mittelpolare Substanzen)
• Chloroform:Methanol = 80:20 (für stark polare Substanzen)

Umkehrphasen-HPLC

Die stationäre Phase ist weniger polar als die mobile Phase, daher ist fast immer Wasser im Eluenten vorhanden. In diesem Fall ist es immer möglich, eine vollständige Auflösung des BAS in der mobilen Phase sicherzustellen, es ist fast immer möglich, eine UV-Detektion zu verwenden, fast alle mobilen Phasen sind miteinander mischbar, es kann eine Gradientenelution verwendet werden, die Säule kann schnell reaktiviert werden -äquilibriert, kann die Säule regeneriert werden.

Gängige Eluenten für die Umkehrphasen-HPLC sind:

• Acetonitril: Wasser
• Methanol: Wasser
• Isopropanol: Wasser

Matrizen für HPLC

In der HPLC verwendete Matrizen sind anorganische Verbindungen wie Silica (Kieselgel) oder Aluminiumoxid oder organische Polymere wie Polystyrol (vernetzt mit Divinylbenzol) oder Polymethacrylat. Kieselgel ist natürlich mittlerweile allgemein akzeptiert.

Die Hauptmerkmale der Matrix:

• Partikelgröße (µm);
• Interne Porengröße (Å, nm).

Gewinnung von Kieselgel für HPLC:

1. Bildung von Mikrokügelchen aus Polykieselsäure;
2. Trocknen von Kieselgelpartikeln;
3. Lufttrennung.

Sorbenspartikel:

• Regulär (kugelförmig): höhere Druckfestigkeit, höhere Kosten;
• Nicht kugelförmig: geringere Druckfestigkeit.

Die Porengröße in der HPLC ist einer der wichtigsten Parameter. Je kleiner die Porengröße ist, desto schlechter ist ihre Durchlässigkeit für die Moleküle der eluierten Substanzen. Und folglich umso schlechter die Sorptionskapazität von Sorbentien. Je größer die Poren sind, desto geringer ist erstens die mechanische Stabilität der Sorbenspartikel, und desto kleiner ist zweitens die Sorptionsoberfläche und damit desto schlechter der Wirkungsgrad.

Transplantate in stationärer Phase

Normalphasen-HPLC:

• Stationäre Phase gepfropft mit Propylnitril (Nitril);
• Stationäre Phase mit Propylaminpfropfung (Amin).

Umkehrphasen-HPLC:

• Stationäre Phase mit Alkylpfropfung;
• Stationäre Phase mit Alkylsilyl-Pfropf.

Endcapping – Schutz von nicht gepfropften Bereichen des Sorbens durch zusätzliche Pfropfung mit „kleinen“ Molekülen. Hydrophobes Endcapping (C1, C2): höhere Selektivität, schlechtere Benetzbarkeit; hydrophiles Endcapping (Diol): geringere Selektivität, höhere Benetzbarkeit.

HPLC-Detektoren

• UV
• Diodenarray
• Fluoreszierend
• Elektrochemisch
• Refraktometrisch
• massenselektiv

Verknüpfungen

Wikimedia-Stiftung. 2010 .

• Chromatographie
• Verteilungschromatographie

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Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist die Art der in der Chromatographiesäule ablaufenden Prozesse im Allgemeinen identisch mit den Prozessen in der Gaschromatographie. Der Unterschied besteht lediglich in der Verwendung einer Flüssigkeit als stationäre Phase. Aufgrund der hohen Dichte flüssiger mobiler Phasen und des hohen Widerstands der Säulen unterscheiden sich Gas- und Flüssigkeitschromatographie stark in der Instrumentierung.

Als mobile Phasen werden in der HPLC meist reine Lösungsmittel oder deren Gemische verwendet.

Zur Erzeugung eines Stroms aus reinem Lösungsmittel (oder Lösungsmittelgemischen), der in der Flüssigkeitschromatographie als Elutionsmittel bezeichnet wird, werden Pumpen verwendet, die Teil des Hydrauliksystems des Chromatographen sind.

Die Adsorptionschromatographie erfolgt durch die Wechselwirkung einer Substanz mit Adsorptionsmitteln wie Kieselgel oder Aluminiumoxid, die an der Oberfläche aktive Zentren aufweisen. Der Unterschied in der Fähigkeit, mit den Adsorptionszentren verschiedener Probenmoleküle zu interagieren, führt zu ihrer Aufteilung in Zonen, während sie sich mit der mobilen Phase durch die Säule bewegen. Die dabei erreichte Aufteilung der Komponentenzonen hängt von der Wechselwirkung sowohl mit dem Lösungsmittel als auch mit dem Adsorbens ab.

Kieselgel-Adsorptionsmittel mit unterschiedlichen Volumina, Oberflächen und Porendurchmessern finden die größte Anwendung in der HPLC. Aluminiumoxid und andere Adsorptionsmittel werden viel seltener verwendet. Der Hauptgrund dafür:

Unzureichende mechanische Festigkeit, die eine Verpackung und Verwendung bei erhöhten Drücken, die für HPLC typisch sind, nicht zulässt;

Kieselgel hat im Vergleich zu Aluminiumoxid einen größeren Bereich an Porosität, Oberfläche und Porendurchmesser; eine deutlich höhere katalytische Aktivität von Aluminiumoxid führt zu einer Verfälschung der Analysenergebnisse durch die Zersetzung der Probenbestandteile bzw. deren irreversibler Chemisorption.

HPLC-Detektoren

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wird verwendet, um polare, nichtflüchtige Substanzen nachzuweisen, die aus irgendeinem Grund nicht in eine für die Gaschromatographie geeignete Form umgewandelt werden können, selbst in Form von Derivaten. Zu solchen Substanzen gehören insbesondere Sulfonsäuren, wasserlösliche Farbstoffe und einige Pestizide, wie Phenylharnstoffderivate.

Detektoren:

UV - Diodenarray-Detektor. Die "Matrix" aus Fotodioden (es gibt mehr als zweihundert) registriert ständig Signale im UV- und sichtbaren Bereich des Spektrums und gewährleistet so die Aufnahme von UV-B-Spektren im Scanning-Modus. Dadurch ist es möglich, mit hoher Empfindlichkeit kontinuierlich unverzerrte Spektren von Komponenten aufzunehmen, die eine spezielle Zelle schnell durchlaufen.

Im Vergleich zur Einzelwellenlängendetektion, die keine Aussage über die "Reinheit" des Peaks liefert, liefert die Möglichkeit, die vollen Spektren des Diodenarrays zu vergleichen, ein Identifikationsergebnis mit einem viel größeren Maß an Sicherheit.

Fluoreszenzdetektor. Die große Beliebtheit von Fluoreszenzdetektoren liegt an der sehr hohen Selektivität und Empfindlichkeit und daran, dass viele Umweltschadstoffe fluoreszieren (z. B. polyaromatische Kohlenwasserstoffe).

Ein elektrochemischer Detektor dient zum Nachweis von Substanzen, die leicht oxidiert oder reduziert werden: Phenole, Mercaptane, Amine, aromatische Nitro- und Halogenderivate, Aldehyde, Ketone, Benzidine.

Die chromatographische Trennung des Gemisches auf der Säule dauert aufgrund des langsamen Vordringens des PF lange. Zur Beschleunigung des Prozesses wird unter Druck chromatographiert. Dieses Verfahren wird als Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bezeichnet.

Die Modernisierung der Geräte der klassischen Flüssigsäulenchromatographie hat sie zu einer der zukunftsträchtigen und modernen Analysemethoden gemacht. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist ein bequemes Verfahren zum Trennen, präparativen Isolieren und Durchführen einer qualitativen und quantitativen Analyse von nichtflüchtigen thermolabilen Verbindungen sowohl mit niedrigem als auch mit hohem Molekulargewicht.

Je nach Art des verwendeten Sorbens kommen bei dieser Methode 2 Varianten der Chromatographie zum Einsatz: auf einem polaren Sorbens mit einem unpolaren Eluenten (Direktphasenoption) und auf einem unpolaren Sorbens mit einem polaren Eluenten – der sogenannten Reverse -Phasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RPHLC).

Beim Übergang des Eluenten zum Eluenten stellt sich das Gleichgewicht unter RPHLC-Bedingungen um ein Vielfaches schneller ein als unter den Bedingungen polarer Sorbentien und nichtwässriger PFs. Dadurch und durch die Bequemlichkeit, mit Wasser und Wasser-Alkohol-Eluenten zu arbeiten, hat die RPHLC inzwischen große Popularität erlangt. Die meisten HPLC-Analysen werden mit dieser Methode durchgeführt.

Detektoren. Die Registrierung der Ausgabe von der Säule einer separaten Komponente wird unter Verwendung eines Detektors durchgeführt. Zur Registrierung können Sie die Änderung eines beliebigen analytischen Signals verwenden, das von der mobilen Phase stammt und sich auf Art und Menge der Mischungskomponente bezieht. Die Flüssigkeitschromatographie verwendet analytische Signale wie Lichtabsorption oder Lichtemission der austretenden Lösung (photometrische und fluorimetrische Detektoren), Brechungsindex (refraktometrische Detektoren), Potential und elektrische Leitfähigkeit (elektrochemische Detektoren) usw.

Das kontinuierlich detektierte Signal wird vom Recorder aufgezeichnet. Das Chromatogramm ist eine auf dem Aufzeichnungsband aufgezeichnete Folge von Detektorsignalen, die erzeugt wird, wenn einzelne Komponenten der Mischung die Säule verlassen. Bei Auftrennung des Gemisches sind auf dem externen Chromatogramm einzelne Peaks sichtbar. Die Position des Peaks auf dem Chromatogramm dient der Identifizierung der Substanz, die Höhe oder Fläche des Peaks - der quantitativen Bestimmung.

Anwendung

Die breiteste Anwendung findet die HPLC in folgenden Bereichen der chemischen Analytik (es werden Untersuchungsobjekte identifiziert, bei denen die HPLC praktisch konkurrenzlos ist):

· Lebensmittelqualitätskontrolle - Tonika- und Geschmackszusätze, Aldehyde, Ketone, Vitamine, Zucker, Farbstoffe, Konservierungsmittel, Hormone, Antibiotika, Triazine, Carbamate und andere Pestizide, Mykotoxine, Nitrosoamine, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe usw.

· Umweltschutz – Phenole, organische Nitroverbindungen, mono- und polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, eine Reihe von Pestiziden, wichtige Anionen und Kationen.

· Kriminalistik – Drogen, organische Sprengstoffe und Farbstoffe, hochwirksame Pharmazeutika.

· Pharmazeutische Industrie – Steroidhormone, praktisch alle Produkte der organischen Synthese, Antibiotika, Polymerpräparate, Vitamine, Proteinpräparate.

Medizin - die aufgeführten biochemischen und medizinischen Substanzen und ihre Metaboliten in biologischen Flüssigkeiten (Aminosäuren, Purine und Pyrimidine, Steroidhormone, Lipide) bei der Diagnose von Krankheiten, Bestimmung der Ausscheidungsrate von Arzneimitteln aus dem Körper zum Zweck ihrer individuellen Dosierung .

· Landwirtschaft - Bestimmung von Nitrat und Phosphat in Böden zur Bestimmung der erforderlichen Düngemittelmenge, Bestimmung des Nährwerts von Futtermitteln (Aminosäuren und Vitamine), Analyse von Pestiziden in Boden, Wasser und landwirtschaftlichen Produkten.

Biochemie, bioorganische Chemie, Gentechnik, Biotechnologie - Zucker, Lipide, Steroide, Proteine, Aminosäuren, Nukleoside und ihre Derivate, Vitamine, Peptide, Oligonukleotide, Porphyrine usw.

· Organische Chemie - alle stabilen Produkte der organischen Synthese, Farbstoffe, thermolabile Verbindungen, nichtflüchtige Verbindungen; Anorganische Chemie (praktisch alle löslichen Verbindungen in Form von Ionen und Komplexverbindungen).

· Qualitätskontrolle und Sicherheit von Lebensmitteln, alkoholischen und alkoholfreien Getränken, Trinkwasser, Haushaltschemikalien, Parfums in allen Phasen ihrer Herstellung;

Bestimmung der Art der Verschmutzung am Ort einer von Menschen verursachten Katastrophe oder eines Notfalls;

Nachweis und Analyse von narkotischen, potenten, giftigen und explosiven Substanzen;

Bestimmung des Vorhandenseins von Schadstoffen (polyzyklische und andere aromatische Kohlenwasserstoffe, Phenole, Pestizide, organische Farbstoffe, Ionen von Schwer-, Alkali- und Erdalkalimetallen) in flüssigen Abwässern, Luftemissionen und festen Abfällen von Unternehmen und in lebenden Organismen;

· Überwachung von Prozessen der organischen Synthese, Öl- und Kohleverarbeitung, biochemischen und mikrobiologischen Produktionen;

Analyse der Bodenqualität für die Düngung, des Vorhandenseins von Pestiziden und Herbiziden in Boden, Wasser und Produkten sowie des Nährwerts von Futtermitteln; komplexe forschungsanalytische Aufgaben; Erhalten einer Mikromenge einer hochreinen Substanz.



Flüssigkeits-Chromatographie

Flüssigkeits-Chromatographie ist eine Art Chromatographie, bei der Mobile Phase, Elutionsmittel genannt, ist flüssig. Stationäre Phase kann sein festes Sorptionsmittel, ein fester Träger mit einer auf seiner Oberfläche abgeschiedenen Flüssigkeit oder Gel.

Unterscheiden säulenförmig und dünne Schicht Flüssigkeits-Chromatographie. Bei der Säulenversion wird ein Teil des zu trennenden Stoffgemisches in einem unter Druck oder Schwerkraft bewegten Eluentenstrom durch eine mit stationärer Phase gefüllte Säule geleitet. Bei der Dünnschichtchromatographie bewegt sich der Eluent unter Einwirkung von Kapillarkräften entlang einer flachen Schicht eines auf einer Glasplatte oder Metallfolie abgeschiedenen Sorbens, entlang eines porösen Polymerfilms oder entlang eines Streifens aus speziellem Chromatographiepapier. Es wurde auch ein Verfahren der Dünnschicht-Flüssigkeitschromatographie unter Druck entwickelt, bei dem der Eluent durch eine zwischen den Platten angeordnete Sorbensschicht gepumpt wird.

Es gibt verschiedene Arten der Flüssigkeitschromatographie, wie z analytisch(zur Analyse von Stoffgemischen) und vorbereitend(um reine Komponenten zu isolieren).

Unterscheiden Flüssigkeits-Chromatographie (LC) in seiner klassischen Version durchgeführt bei Luftdruck, und schnelle Geschwindigkeit) durchgeführt bei Bluthochdruck. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet Säulen mit einem Durchmesser von bis zu 5 mm, die dicht mit einem Sorbens mit kleinen Partikeln (3-10 µm) gepackt sind. Es wird ein Druck von bis zu 3,107 Pa verwendet, um den Eluenten durch die Säule zu pumpen. Diese Art der Chromatographie wird als Hochdruck-Chromatographie. Das Durchleiten des Eluenten durch die Säule unter hohem Druck ermöglicht es, die Analysengeschwindigkeit stark zu erhöhen und die Effizienz der Trennung durch die Verwendung eines fein dispergierten Sorbens deutlich zu steigern.

HPLC-Optionen sind Mikrosäulenchromatographie auf mit Sorbens gefüllten Säulen mit kleinem Durchmesser und Kapillarchromatographie auf hohlen und mit Sorbens gefüllten Kapillarsäulen. Das HPLC-Verfahren ermöglicht es derzeit, komplexe Mischungen organischer Verbindungen zu isolieren, quantitativ und qualitativ zu analysieren.

Die Flüssigkeitschromatographie ist die wichtigste physikalische und chemische Forschungsmethode in Chemie, Biologie, Biochemie, Medizin und Biotechnologie. Es wird genutzt für:

Untersuchung von Stoffwechselprozessen in lebenden Organismen von Arzneimitteln;

Diagnostik in der Medizin;

· Analyse von Produkten der chemischen und petrochemischen Synthese, Halberzeugnisse, Farbstoffe, Kraftstoffe, Schmiermittel, Öl, Abwasser;

· Studium der Isothermen der Sorption aus Lösung, Kinetik und Selektivität chemischer Prozesse;

Auswahl

Analyse und Trennung von Mischungen, deren Reinigung und Isolierung vieler biologischer Substanzen, wie Aminosäuren, Proteine, Enzyme, Viren, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone.

In der Chemie makromolekularer Verbindungen und bei der Herstellung von Polymeren wird die Flüssigkeitschromatographie verwendet, um die Qualität von Monomeren zu analysieren, die Molekulargewichtsverteilung und die Verteilung nach Art der Funktionalität von Oligomeren und Polymeren zu untersuchen, was für die Produktkontrolle erforderlich ist.

Die Flüssigkeitschromatographie wird auch in der Parfümerie, der Lebensmittelindustrie, zur Analyse von Umweltverschmutzung und in der Forensik eingesetzt.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde Mitte der 1970er Jahre entwickelt und eingeführt. Dann erschienen die ersten Flüssigkeitschromatographen.

Flüssigkeitschromatographie ist die optimale Methode zur Analyse von chemisch und thermisch instabilen Molekülen, makromolekularen Substanzen mit verringerter Flüchtigkeit. Dies lässt sich durch die besondere Rolle der mobilen Phase in der LC im Gegensatz zur Gaschromatographie erklären: Der Eluent übernimmt nicht nur die Transportfunktion.

2. Grundlegende Konzepte und Klassifizierung von Flüssigchromatographiemethoden.

Von der Mechanismus der Retention getrennter Substanzen durch die stationäre Phase LC unterscheiden:

Sedimentchromatographie, basierend auf der unterschiedlichen Löslichkeit von Niederschlägen, die bei der Wechselwirkung der Komponenten des analysierten Gemisches mit dem Fällungsmittel gebildet werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass die entstehenden Zonen entlang des Sorptionsmittels scharf begrenzt sind, Sedimente nur einer Substanz enthalten und oft durch Zonen mit reinem Sorptionsmittel getrennt sind. Diese Methode hat jedoch noch keine weite Verbreitung gefunden.

· Adsorptionschromatographie , bei dem die Trennung als Ergebnis der Wechselwirkung des getrennten Stoffes mit durchgeführt wird Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid oder Kieselgel, an der Oberfläche haben aktive Polarzentren. Lösungsmittel(Laufmittel) - unpolare Flüssigkeit.

Reis. Schema zur Trennung eines Stoffgemisches durch Adsorptionschromatographie

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Der Mechanismus der Sorption besteht in einer spezifischen Wechselwirkung zwischen der polaren Oberfläche des Sorbens und den polaren (oder polarisierbaren) Bereichen der Moleküle der analysierten Komponente (Abb.). Die Wechselwirkung erfolgt aufgrund der Donor-Akzeptor-Wechselwirkung oder der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen.

Reis. Schema der Adsorptionsflüssigkeitschromatographie

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Reis. . Verteilungschromatographie mit gebundener Phase (Normalphasenvariante).

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Bei Normalphase Bei der Variante der Verteilungsflüssigkeitschromatographie werden substituierte Alkylchlorsilane mit polaren Gruppen wie Nitril, Amino etc. als Kieselgel-Oberflächenmodifizierungsmittel (gebundene Phasen) verwendet (Abb.). Durch die Verwendung gebundener Phasen lassen sich die Sorptionseigenschaften der Oberfläche der stationären Phase fein steuern und eine hohe Trennleistung erzielen.

umgekehrte Phase Die Flüssigkeitschromatographie basiert auf der Verteilung der Mischungskomponenten zwischen dem polaren Eluenten und unpolaren Gruppen (lange Alkylketten), die auf die Oberfläche des Sorbens gepfropft sind (Abb.). Weniger häufig wird eine Variante der Supported Phase Liquid Chromatographie verwendet, bei der eine flüssige stationäre Phase auf einen stationären Träger aufgebracht wird.

Reis. . Verteilungschromatographie mit gebundener Phase (Umkehrphasenversion). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Verteilungsflüssigkeitschromatographie umfasst Extraktionsflüssigkeit Chromatographie, bei dem die stationäre Phase ein auf einem festen Träger abgeschiedenes organisches Extraktionsmittel und die mobile Phase eine wässrige Lösung der zu trennenden Verbindungen ist. Geeignete Extraktionsmittel sind beispielsweise Phenole, Trialkylphosphate, Amine, quartäre Ammoniumbasen und schwefelhaltige Organophosphorverbindungen. Die Extraktionsflüssigkeitschromatographie wird verwendet, um anorganische Verbindungen wie Alkalimetallionen, Aktinide und andere ähnliche Elemente bei der Verarbeitung von abgebranntem Kernbrennstoff zu trennen und zu konzentrieren.

Ionenaustauschchromatographie, die auf dem reversiblen stöchiometrischen Austausch von in der analysierten Lösung enthaltenen Ionen gegen bewegliche Ionen, die Bestandteil davon sind, beruht Ionenaustauscher. Je nach Vorzeichen der Ladung ionisierender Gruppen werden Ionenaustauscher eingeteilt Kationenaustauscher und Anionenaustauscher. Es gibt auch amphotere Ionenaustauscher –Ampholyte, die gleichzeitig sowohl Kationen als auch Anionen austauschen kann. Die Ionenaustauschchromatographie wird nur zur Trennung geladener Teilchen verwendet. Die Trennung basiert auf der Fähigkeit eines Ionenaustauscherharzes, verschiedene Ionen mit unterschiedlicher Stärke zu halten. Ionit besteht aus einer Polymermatrix und damit verbundenen aktiven Gruppen, die zum Austausch von Ionen befähigt sind. Kationenaustauscher besitzt saure oder schwach saure Eigenschaften, da es Gruppen enthält: - SO3H, -CH2SO3H, -COOH, -PO3H2 und andere, in denen Wasserstoffionen beweglich sind. Anionenaustauscher haben basische oder schwach basische Eigenschaften und enthalten Gruppen: = NH2, -NH2, -NR3+, -OH und andere. Die Trennung von Ionen wird durch die Auswahl der optimalen pH-Werte des Eluenten und seiner Ionenstärke gesteuert. Schematisch lässt sich der Ionenaustausch durch die Reaktionen darstellen:

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (Kationenaustausch)

R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (Anionenaustausch)

Ionenaustauscher müssen folgende Anforderungen erfüllen: chemisch stabil in verschiedenen Umgebungen, mechanisch stark im trockenen und insbesondere im gequollenen Zustand, hohe Aufnahmekapazität und gute Regenerationsfähigkeit.

Bei der Ionenaustausch-(Ionen)-Chromatographie werden getrennte Anionen (Kationen) als Säuren (entsprechende Basen) durch einen hochempfindlichen konduktometrischen Detektor nachgewiesen, wobei Hochleistungssäulen mit einem oberflächenaktiven Ionenaustauscher mit geringer Kapazität gefüllt sind.

Ionenpaarchromatographie, die als Kombination von Adsorptions- und Ionenaustauschchromatographie angesehen werden kann. Das Verfahren basiert auf der Extraktion ionischer Substanzen – deren Übertragung aus der wässrigen Phase in die organische Phase in Form von Ionenpaaren. Dazu wird der mobilen Phase ein Gegenion zugesetzt, das in der Lage ist, selektiv mit den analysierten Komponenten zu reagieren und diese unter Bildung eines Ionenpaars in komplexe Verbindungen umzuwandeln. Die Hauptvorteile dieser Option liegen darin, dass saure, basische und neutrale Substanzen gleichzeitig analysiert werden können.

Ligandenaustauschchromatographie bezogen auf unterschiedliche Fähigkeit getrennter Verbindungen, Komplexe mit Übergangsmetallkationen zu bilden– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 usw. - und Fixiergruppen (Liganden) der stationären Phase. Ein Teil der Koordinationssphäre von Metallionen wird von Wassermolekülen oder anderen schwachen Liganden besetzt, die durch Moleküle der zu trennenden Verbindungen verdrängt werden können. Diese Art der Chromatographie wird verwendet, um optische Isomere zu trennen.

Größenausschlusschromatographie(Sieb, Gel-Penetration, Gel-Filtration), auf dem die Trennung beruht Unterschiede in der Molekülgröße.

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Reis. Schema der Gelpermeationschromatographie

Affinitätschromatographie(biospezifisch), basierend auf der Tatsache, dass viele biologisch aktive Makromoleküle, beispielsweise Enzyme, spezifisch an ein bestimmtes Reagenz binden können. Das Reagenz wird auf einem Träger (häufig Agarose) fixiert und dann mit der zu analysierenden Mischung gewaschen. Nur das gewünschte Makromolekül bleibt auf dem Polymer zurück (Abb.).

Reis. Schema der Affinitätschromatographie

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Dann wird es durch Durchleiten einer Lösung einer Verbindung, die eine noch größere Affinität für das Makromolekül hat, aus dem Polymer entfernt. Eine solche Chromatographie ist besonders effektiv in der Biotechnologie und Biomedizin zur Isolierung von Enzymen, Proteinen und Hormonen.

Abhängig von auf der Art und Weise, wie sich die Substanz bewegt Es gibt folgende Arten der Flüssigkeitschromatographie: aufschlussreich, frontal und verdrängen.
Am häufigsten verwendet demonstrativ eine Variante, bei der ein Teil des zu trennenden Gemisches im Eluentenstrom in die Säule eingebracht wird. Der Ausgang der Mischungskomponenten aus der Säule wird auf dem Chromatogramm als Peaks aufgezeichnet. (Reis.)

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Reis. Schema der sich entwickelnden Variante der Chromatographie

Höhe oder Spitzenbereich charakterisiert Konzentration der Komponenten, a gehaltenen Bände – hochwertige Zusammensetzung der Mischung. Die Identifizierung von Komponenten erfolgt in der Regel durch Koinzidenz von Retentionszeiten mit Standardsubstanzen, auch chemische oder physikalisch-chemische Methoden kommen zum Einsatz.

Bei frontal Variante (Abb.) wird ein zu trennendes Stoffgemisch kontinuierlich durch die Säule geleitet, die die Rolle einer mobilen Phase spielt. Dadurch kann nur die Substanz in reiner Form gewonnen werden, die am wenigsten in der Säule adsorbiert wird.

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Reis. Schema der vorderen Variante der Chromatographie

Das Chromatogramm ist in diesem Fall eine Stufe, deren Höhen proportional zu den Konzentrationen der Komponenten sind; Retentionsvolumina werden aus den Retentionszeiten der Komponenten bestimmt. Beim Differenzieren eines solchen Chromatogramms erhält man ein ähnliches Bild wie bei der Entwicklungsvariante.

BEI Verschiebung Variante werden die in die Säule eingebrachten Komponenten des Gemisches durch das Elutionsmittel verdrängt, das stärker als jede Komponente adsorbiert wird. Als Ergebnis erhält man aneinandergrenzende Fraktionen getrennter Substanzen, deren Reihenfolge durch die Kraft ihrer Wechselwirkung mit der Sorbensoberfläche bestimmt wird (Abb.).

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Reis. Schema der Verdrängungschromatographie

3. Grundlegende chromatographische Größen und ihre Bestimmung.

Bei der Stofftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie können, wie oben erwähnt, Entwicklungs-, Frontal- und Verdrängungsoptionen verwendet werden. Am häufigsten wird eine Entwicklungsvariante verwendet, bei der ein Teil des zu trennenden Gemisches im Eluentenstrom in die Säule eingebracht wird. Der Ausgang der Mischungskomponenten aus der Säule wird auf dem Chromatogramm als Peaks aufgezeichnet. Aus dem Chromatogramm (Abb.) bestimmen:

Retentionszeiten von nicht sorbierenden (t0), getrennten Komponenten (tR1, tR2, tR3 usw.); Spitzenbasisbreite (tw1, tw2 usw.).

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b) korrigiertes Komponentenretentionsvolumen ,

wo t "R- korrigierte Verweilzeit der Komponente;

c) Spaltenkapazitätsverhältnis in Bezug auf eine gegebene Komponente ;

d) Säuleneffizienz charakterisiert Anzahl äquivalenter theoretischer Trennstufen

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f) Genehmigung https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Kapazitätsfaktor k" hat einen erheblichen Einfluss auf den Wert R S: beim Wechseln k"von 0 bis 10 (optimale Grenzen) R S nimmt stark zu. Bedeutung k" wird durch die doppelte Oberfläche des Sorbens und dessen Menge in der Säule sowie durch die Ad(Henry-Konstante) bestimmt.

Selektivitätsfaktor α wird durch die Differenz der Adsder beiden getrennten Komponenten bestimmt. Wenn α zunimmt (von 1 auf ~5) R S steigt stark an, bei einem weiteren Anstieg von α - ändert sich wenig. Die Selektivität einer Säule hängt unter anderem von der chemischen Struktur der Sorbensoberfläche, der Zusammensetzung des Eluenten, der Temperatur der Säule und der Struktur der zu trennenden Verbindungen ab. Da die Sorption von chromatographierten Substanzen in der Flüssigkeitschromatographie durch das paarweise Zusammenspiel der drei Hauptkomponenten des Systems bestimmt wird – dem Sorbens, den zu trennenden Substanzen und dem Eluenten, ist die Änderung der Zusammensetzung des Eluenten eine bequeme Möglichkeit, die zu optimieren Trennungsprozess.

Säuleneffizienz hängt von der Partikelgröße und Porenstruktur des Adsorptionsmittels, von der Gleichmäßigkeit der Säulenpackung, der Viskosität des Elutionsmittels und der Stoffübergangsgeschwindigkeit ab. Eine Verlängerung der Säule führt nicht immer zu einer Verbesserung der Trennung, da der Säulenwiderstand zunimmt, der Eluentendruck am Einlass und die Zeit des Experiments zunehmen, die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse aufgrund der Peakverbreiterung abnimmt die analysierte Komponente. Wenn , dann sind die Peaks der beiden Substanzen auf dem Chromatogramm fast vollständig getrennt. Mit Wachstum R S verlängert die Trennzeit. Bei R S < 1 - unbefriedigende Trennung. Bei der präparativen Chromatographie arbeitet die Säule aufgrund des Eintrags größerer Mengen trennbarer Substanzen mit Überlast. In diesem Fall nimmt der Kapazitätskoeffizient ab, die Höhe, die der theoretischen Schüssel entspricht, nimmt zu, was zu einer Abnahme der Auflösung führt.

4. Adsorptionsmittel

Eine chromatographische Auftrennung des Gemisches gelingt bei richtiger Auswahl von Adsorbens und Lösungsmittel (Elutionsmittel).

Das Adsorbens darf weder chemisch mit den zu trennenden Komponenten wechselwirken noch eine katalytische Wirkung auf das Lösungsmittel ausüben. Es ist auch notwendig, dass das Adsorbens eine Selektivität in Bezug auf die Komponenten der Mischung aufweist. Ein richtig ausgewähltes Adsorptionsmittel sollte eine maximale Absorptionskapazität haben.

Unterscheiden polar (hydrophil) und unpolare (hydrophobe) Adsorptionsmittel. Es sollte beachtet werden, dass die Adsorptionsaffinität polarer Substanzen für polare Sorbentien viel höher ist als die von unpolaren.

Als Adsorptionsmittel werden Aluminiumoxid, Aktivkohle, Kieselgel, Zeolithe, Zellulose und einige Mineralien verwendet.

Aluminium OxidAl2O3 – amphoteres Adsorbens.(Abb.) Darauf Mischungen getrennt werden können Substanzen in polar, so und in unpolaren Lösungsmitteln. Neutrales Aluminiumoxid wird normalerweise für die Chromatographie aus nichtwässrigen Lösungen von gesättigten Kohlenwasserstoffen, Aldehyden, Alkoholen, Phenolen, Ketonen und Ethern verwendet.

Reis. Aluminiumoxid für die Chromatographie

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Die Aktivität von Al2O3 hängt vom Feuchtigkeitsgehalt darin ab. Wasserfreies Aluminiumoxid hat die höchste Aktivität. Es wird bedingt als Einheit genommen. Bei Bedarf können Sie Tonerde mit unterschiedlichem Feuchtigkeitsgehalt herstellen, indem Sie frisch hergestellte Tonerde mit Wasser mischen (Brockmann-Skala).

Die Abhängigkeit der Aktivität von Aluminiumoxid vom Feuchtigkeitsgehalt

Beispielsweise wird Al2O3 mit einer Aktivität von 1,5-2 zur Trennung von Kohlenwasserstoffen verwendet; für die Trennung von Alkoholen und Ketonen - 2-3,5.

Die spezifische Oberfläche von Aluminiumoxid beträgt 230-380 m2/g.

Kieselgel(hydroxyliert oder chemisch modifiziert) ist getrocknetes gallertartiges Siliciumdioxid, das aus übersättigten Lösungen von Kieselsäuren ( n SiO2 m H2O) bei pH > 5-6. (Abb.) Festes hydrophiles Sorbens.

Reis. Kieselgel

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Die Partikelgröße von Kieselgel in analytischen Säulen beträgt 3-10 µm, in präparativen Säulen 20-70 µm. Die kleine Partikelgröße erhöht die Massentransferrate und verbessert die Säuleneffizienz. Moderne Analysesäulen sind 10–25 cm lang. Sie sind mit Kieselgel mit einer Partikelgröße von 5 Mikron gefüllt und ermöglichen die Trennung komplexer Gemische aus 20-30 Komponenten. Wenn die Partikelgröße auf 3–5 µm abnimmt, steigt die Effizienz der Säule, aber auch ihr Widerstand. Um eine Eluentenflussrate von 0,5–2,0 ml/min zu erreichen, ist daher ein Druck von (1–3)·107 Pa erforderlich. Kieselgel hält einem solchen Druckabfall stand, während Polymer-Sorbens-Granulate elastischer sind und sich verformen. In jüngster Zeit wurden mechanisch belastbare Polymersorbentien mit einer makroporösen Struktur mit dichtem Netzwerk entwickelt, die hinsichtlich ihrer Effizienz Silicagelen nahe kommen. Die Form der Sorbenspartikel von 10 µm und größer hat keinen großen Einfluss auf die Effizienz der Säule, jedoch werden Sorbentien mit kugelförmiger Form bevorzugt, die eine durchlässigere Packung ergeben (Abb.).

Reis. Sphärisches Kieselgel

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Die innere Struktur eines Kieselgelpartikels ist ein System kommunizierender Kanäle. Für die Flüssigkeitschromatographie werden Sorbentien mit einem Porendurchmesser von 6–25 nm verwendet. Die Trennung in der Flüssigkeitschromatographie erfolgt hauptsächlich an Kieselgelen, die durch die Reaktion von Alkyl- und Arylchlorsilanen oder Alkylethoxysilanen mit Silanol-Oberflächengruppen modifiziert wurden. Mit Hilfe solcher Reaktionen werden C8H17-, C18H37- oder C6H5-Gruppen (um Sorbentien mit hydrophobierter Oberfläche zu erhalten), Nitril-, Hydroxylgruppen etc. aufgepfropft (Abb.)

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Reis. Struktur von modifiziertem Kieselgel

Kieselgele in der Chromatographie verwendet zum Trennen von Mischungen von Mineralölprodukten, höher Fettsäuren, ihre Ester, aromatische Amine, Nitroderivate organische Verbindungen. Kieselgel – hydrophiles Sorbens, leicht mit Wasser benetzt. Daher kann es nicht zur Sorption aus wässrigen Lösungen verwendet werden. Die Aktivität von Kieselgel hängt vom Wassergehalt ab: Je weniger Wasser es enthält, desto größer ist die Aktivität (Brockmann-Skala).

Abhängigkeit der Kieselgelaktivität vom Feuchtigkeitsgehalt

Die spezifische Oberfläche von Kieselgelen beträgt 500-600 m2/g.

Aktivkohle sind eine Form von Kohlenstoff, die während der Verarbeitung extrem porös wird und eine sehr große Oberfläche für Adsorption oder chemische Reaktionen zur Verfügung stellt (Abb.) Sie haben eine spezifische Oberfläche von 1300-1700 m2/g.

Reis. Aktivkohle

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Den Haupteinfluss auf die Porenstruktur von Aktivkohlen haben die Ausgangsstoffe für ihre Herstellung. Aktivkohlen auf Basis von Kokosnussschalen zeichnen sich durch einen größeren Anteil an Mikroporen (bis 2 nm), auf Kohlebasis durch einen größeren Anteil an Mesoporen (2-50 nm) aus. Typisch für Aktivkohlen auf Holzbasis ist ein hoher Anteil an Makroporen (mehr als 50 nm). Mikroporen eignen sich besonders gut für die Adsorption kleiner Moleküle und Mesoporen für die Adsorption größerer organischer Moleküle.

Zeolithe (Molekularsiebe)– poröse kristalline Alumosilikate von Alkali- und Erdalkalimetallen natürlichen und synthetischen Ursprungs. (Reis.)

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Reis. Zeolithe

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Es gibt vier Arten von Zeolithen (A, X, Y, M) mit unterschiedlichen Kristallstrukturen. Je nach Kation werden Zeolithe wie folgt bezeichnet: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Merkmal von Zeolithen ist das Poren von Kristallen haben Abmessungen in der Größenordnung von 0,4–1 nm, entsprechend der Größe von Molekülen viele flüssige oder gasförmige Stoffe. Können die Moleküle eines Stoffes in diese Poren eindringen, kommt es zur Adsorption in den Poren von Zeolithkristallen. Größere Moleküle der Substanz werden nicht adsorbiert. Durch die Auswahl von Zeolithen mit unterschiedlichen Porengrößen lassen sich Gemische unterschiedlicher Substanzen eindeutig trennen.

Die spezifische Oberfläche von Zeolithen beträgt 750-800 m2/g.

Bei der Auswahl eines Adsorptionsmittels müssen die Struktur der Substanzen und ihre Löslichkeit berücksichtigt werden. Beispielsweise werden gesättigte Kohlenwasserstoffe schlecht adsorbiert, während ungesättigte Kohlenwasserstoffe (mit Doppelbindungen) besser sind. Funktionelle Gruppen verbessern die Adsorptionsfähigkeit einer Substanz.

5. Elutionsmittel

Bei der Auswahl eines Lösungsmittels (Elutionsmittel) müssen die Art des Adsorptionsmittels und die Eigenschaften der zu trennenden Stoffe im Gemisch berücksichtigt werden. Elutionsmittel sollten alle Komponenten des chromatographierten Gemisches gut lösen, eine niedrige Viskosität aufweisen, das erforderliche Maß an Selektivität aufweisen, billig, ungiftig, inert und mit Nachweismethoden kompatibel sein (Benzol kann beispielsweise nicht als Elutionsmittel mit einem UV-Detektor verwendet werden).

Die Normalphasen-Chromatographie verwendet normalerweise Kohlenwasserstoffe (Hexan, Heptan, Isooctan, Cyclohexan) unter Zugabe geringer Mengen CHCl3, Chloroform, Iso-C3H7OH, Isopropanol, Diisopropylether; in der Umkehrphasenchromatographie - eine Mischung aus Wasser mit Acetonitril CH3CN, Methanol CH3OH, Ethanol C2H5OH, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid. Um die einzelnen Bestandteile eines bei der Chromatographie getrennten Gemisches zu isolieren, werden diese oft sequentiell ausgewaschen (Elution). Dazu werden Lösungsmittel mit unterschiedlicher Desorptionskapazität verwendet. Lösungsmittel sind in absteigender Reihenfolge der Desorptionskapazität in polaren Adsorbentien angeordnet - Trappes eluotrope Reihe. Wenn die zu trennenden Komponenten des Gemisches ähnliche Werte haben k" ( Säulenkapazitätskoeffizient in Bezug auf diese Komponente), dann mit einem Eluenten chromatographieren. Wenn die einzelnen Komponenten der Mischung vom Sorbens stark zurückgehalten werden, verwenden Sie eine Reihe von Eluenten mit zunehmender Stärke.

Eluotroper Bereich von Lösungsmitteln

6. Ausrüstung für Flüssigkeitschromatographie

In der modernen Flüssigkeitschromatographie werden Geräte unterschiedlicher Komplexität eingesetzt - von einfachsten Systemen bis hin zu High-End-Chromatographen.
Zu einem modernen Flüssigkeitschromatographen gehören: Behälter für Eluenten, Hochdruckpumpen, ein Dispenser, eine Chromatographiesäule, ein Detektor, ein Aufzeichnungsgerät, ein Steuersystem und die mathematische Verarbeitung der Ergebnisse.

Auf Abb. Es wird ein Blockdiagramm eines Flüssigkeitschromatographen dargestellt, das die minimal erforderlichen Komponenten in der einen oder anderen Form enthält, die in jedem chromatographischen System vorhanden sind.

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Reis. Schema eines Flüssigkeitschromatographen: 1 - Reservoir für die mobile Phase, 2 - Pumpe, 3 - Injektor, 4 - Säule, 5 - Thermostat, 6 - Detektoren, 7 - Aufzeichnungssystem, 8 - Computer.

Lagertank für die mobile Phase, muss eine ausreichende Analysekapazität haben und Lösungsmittelentgasungsvorrichtung Bläschenbildung von im Eluenten gelösten Gasen in Säule und Detektor zu verhindern.

Pumpe beabsichtigt um einen konstanten Lösungsmittelfluss zu erzeugen. Seine Auslegung wird in erster Linie durch den Betriebsdruck im System bestimmt. Für den Betrieb im Bereich von 10–500 MPa werden Plunger-(Spritzen-)Pumpen verwendet. Ihr Nachteil ist die Notwendigkeit periodischer Stopps zum Befüllen mit Eluent. Für einfache Systeme mit niedrigen Betriebsdrücken von 1-5 MPa werden preiswerte Peristaltikpumpen eingesetzt. Die Eluenten gelangen durch einen Filter, der Staubpartikel (größer als 0,2 µm) zurückhält, in die Pumpe. Manchmal wird ein kleiner Heliumstrom durch die Eluenten geleitet, um gelöste Luft zu entfernen und die Bildung von Blasen im Detektor zu verhindern (insbesondere bei wässrigen und polaren Eluenten). In analytischen Chromatographen wird der Eluent der Säule durch Kolbenpumpen mit Rückkopplungssystem zugeführt, die es ermöglichen, die Flusspulsation innerhalb von 1–2 % zu glätten und volumetrische Geschwindigkeiten von 0,1 bis 25 ml/min bei Drücken bis zu ~3,107 bereitzustellen Pa. Bei der Mikrosäulenchromatographie sind die volumetrischen Flussraten des Eluenten viel geringer – 10–1000 µl/min. Bei der Gradientenelution werden mehrere Pumpen verwendet, die von einem Programmierer gesteuert werden und 2-3 Eluentenkomponenten in die Mischkammer zuführen, wobei die Gesamtflussrate konstant bleibt. Um eine Probe unter hohem Druck in eine Säule einzuführen, ohne den Fluss zu stoppen, werden spezielle Mikrodosierventile verwendet, die mit einer Schleife mit bekanntem Volumen für die Testlösungsprobe verbunden sind. Es wurden Dosiersysteme mit automatischer Probenahme und Injektion von Proben unter Verwendung von Mikrodosierhähnen oder Spritzen entwickelt.

Injektor bietet Probeninjektion mischen trennbaren Komponenten in die Säule mit ausreichend hoher Reproduzierbarkeit. Einfache "Stop-Flow"-Probeninjektionssysteme erfordern das Anhalten der Pumpe und sind daher weniger praktisch als Reodyne's Loop-Pipetten.

Lautsprecher für HPLC werden meistens aus einem polierten Edelstahlrohr mit einer Länge von 10–25 cm und einem Innendurchmesser von 3–5 mm hergestellt.

Reis. Chromatographiesäulen für die Flüssigkeitschromatographie

Auch benutzt Säulen aus Glas in einem Metallgehäuse untergebracht; in der Mikrosäulenchromatographie - bedruckte Metallsäulen mit einem Innendurchmesser von 1,0-1,5 mm, gepackte Mikrosäulen aus Glas mit einem Durchmesser von 70-150 µm und hohle Kapillarsäulen Durchmesser 10–100 Mikrometer; in der präparativen Chromatographie - Säulen mit einem Durchmesser von 2 bis 10 cm oder mehr. Zur gleichmäßigen und dichten Befüllung von Säulen mit einem Sorbens wird ein Suspensionspackungsverfahren verwendet. Die Suspension wird aus einem Sorptionsmittel und einer geeigneten organischen Flüssigkeit hergestellt, die unter einem Druck von bis zu 5 107 Pa in die Säule eingespeist wird. Zur Bestimmung der getrennten Komponenten, die die Säule verlassen verwenden Detektoren. Temperaturkonstanz gewährleistet Thermostat.

Detektoren für die Flüssigkeitschromatographie verfügen über eine Durchflusszelle, in der jede Eigenschaft des fließenden Eluenten kontinuierlich gemessen wird. Sie müssen sehr sensibel sein. Um die Empfindlichkeit des Detektors zu erhöhen, wird manchmal eine Derivatisierung der Komponenten der Mischung nach der Säule verwendet. Dazu werden mit dem Eluentenstrom solche Reagenzien eingebracht, die in Wechselwirkung mit den aufgetrennten Substanzen Derivate mit ausgeprägteren Eigenschaften bilden, beispielsweise im UV- oder sichtbaren Spektralbereich stärker absorbieren oder eine größere Fluoreszenzfähigkeit besitzen . Manchmal wird die Derivatisierung vor der chromatographischen Analyse durchgeführt und die Derivate getrennt, nicht die Ausgangsmaterialien. Die beliebtesten Typen Detektoren allgemeinen Zweck sind Refraktometer, Messen Brechungsindex, und spektrophotometrische Detektoren definieren Optische Dichte des Lösungsmittels bei einer festen Wellenlänge (normalerweise im ultravioletten Bereich). Zu Vorteile von Refraktometern(und Nachteile von Spektralfotometern) zuzuordnen sind geringe Empfindlichkeit gegenüber der Art von Verbindungen, die Chromophorgruppen enthalten können oder nicht. Andererseits ist der Einsatz von Refraktometern auf isokratische Systeme (mit konstanter Laufmittelzusammensetzung) beschränkt, so dass die Verwendung eines Lösungsmittelgradienten hier nicht möglich ist.

Differential" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">Differenzverstärker und Recorder. Es ist auch wünschenswert, es zu haben Integrator, was es ermöglicht, die relativen Flächen der resultierenden Peaks zu berechnen. In komplexen chromatographischen Systemen Schnittstellenblock, Verbinden des Chromatographen mit persönlicher Computer, das nicht nur die Erfassung und Verarbeitung von Informationen durchführt, sondern auch das Gerät steuert, berechnet die quantitativen Eigenschaften und in einigen Fällen die qualitative Zusammensetzung der Mischungen. Mikroprozessor bietet automatische Probeninjektion, ändern durch vorgegebenes Programm der Eluentenzusammensetzung mit Gradientenelution, Aufrechterhaltung Säulentemperatur.

Bruker". Reis. Flüssigkeitschromatograph Jasco

Fragen zur Selbstprüfung

Was ist Flüssigkeitschromatographie? Nennen Sie seine Typen, Anwendungsbereiche. Liste über Grundlegende chromatographische Größen und ihre Definition Welche Arten der Flüssigkeitschromatographie gibt es in Abhängigkeit vom Mechanismus der Retention getrennter Substanzen durch die stationäre Phase von LC? Welche Arten der Chromatographie gibt es abhängig von der Art der Bewegung einer Substanz? Welche Stoffe werden als Adsorptionsmittel verwendet? Was ist der Unterschied? Was ist die flüssige mobile Phase - Eluent? Anforderungen an Lösungsmittel. Was ist der Unterschied zwischen Verteilungschromatographie und Adsorptionschromatographie? Nennen Sie die Hauptteile des Flüssigkeitschromatographen-Schaltkreises und ihren Zweck.

Verzeichnis der verwendeten Literatur

1 „Flüssigchromatographie in der Medizin“

http://journal. issep. RSSI. de/artikel/pdf/0011_035.pdf

2 „Einführung in die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie“

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 "Flüssigkeitschromatographie"

http://E-Science. en/index/?id=1540

4 "Chromatographie"

http://belchem. Menschen. de/chromatographie1.html