Высокоэффективная хроматография. Высокоэффективная жидкостная хроматография загрязнителей природных и сточных вод

(преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии .

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия , нефтехимия , биология , биотехнология , медицина , пищевая промышленность , охрана окружающей среды , производство лекарственных препаратов и во многих других.

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную , распределительную , ионообменную , эксклюзионную , лигандообменную и другие.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное - распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации , основности или кислотности , по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Нормально-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

• Гексан:изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обращённо-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

Обычными элюентами для обращенно-фазовой ВЭЖХ являются:

• Ацетонитрил:вода
• Метанол:вода
• Изопропанол:вода

Матрицы для ВЭЖХ

В качестве матриц в ВЭЖХ используются неорганические соединения, такие как оксид кремния (силикагель) или оксид алюминия , либо органические полимеры, такие как полистирол (сшитый дивинилбензолом) или полиметакрилат. Силикагель, конечно, в настоящее время общепризнан.

Основные характеристики матрицы:

• Размер частиц (мкм);
• Размер внутренних пор (Å, нм).

Получение силикагеля для ВЭЖХ:

1. Формование микросфер поликремневой кислоты;
2. Сушка частиц силикагеля;
3. Воздушное сепарирование.

Частицы сорбента:

• Регулярные (сферические): выше устойчивость к давлению, выше стоимость;
• Несферические: ниже устойчивость к давлению.

Размер пор в ВЭЖХ - один из наиболее важных параметров. Чем меньше размер пор, тем хуже их проницаемость для молекул элюируемых веществ. А следовательно, тем хуже сорбционная емкость сорбентов. Чем крупнее поры, тем, во-первых, меньше механическая устойчивость частиц сорбента, а, во-вторых, тем меньше сорбционная поверхность, следовательно, хуже эффективность.

Прививки неподвижной фазы

Нормально-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с пропилнитрильной прививкой (нитрильной);
• Неподвижная фаза с пропиламинной прививкой (аминной).

Обращенно-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с алкильной прививкой;
• Неподвижная фаза с алкилсилильной прививкой.

Энд-кэппирование - защита непривитых участков сорбента дополнительной прививкой «маленькими» молекулами. Гидрофобный энд-кэппинг (С1, С2): выше селективность, хуже смачиваемость; гидрофильный энд-кэппинг (диол): ниже селективность, выше смачиваемость.

Детекторы для ВЭЖХ

• Ультрафиолетовый
• Диодно-матричный
• Флуоресцентный
• Электрохимический
• Рефрактометрический
• Масс-селективный

Ссылки

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Высокоэффективная жидкостная хроматография" в других словарях:

высокоэффективная жидкостная хроматография - — [А.С.Гольдберг. Англо русский энергетический словарь. 2006 г.] Тематики энергетика в целом EN high performance liquid chromatographyHPLC … Справочник технического переводчика

Термин высокоэффективная жидкостная хроматография Термин на английском high performance liquid chromatography Синонимы Аббревиатуры ВЭЖХ, HPLC Связанные термины адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фуллерен, эндоэдральный, хроматография… …

Жидкостная хроматография, в к рой для повышения эффективности разделения р ритель (элюент) под давлением (более 3х107 Па) прокачивают через колонки, заполненные сорбентом с частицами малого диаметра (до 1 мкм), а также используют перфузионные… …

Вид хрома тографии, в к рой подвижной фазой служитжидкость (элюент), а неподвижной та. сорбент, тв. носитель с нанесённой на его поверхность жидкостью или гель. Осуществляют в колонке, заполненной сорбентом (колоночная хроматография), на плоской… … Естествознание. Энциклопедический словарь

- [κρώμα (υрома) цвет] процесс, основанный на неодинаковой способности отдельных компонентов смеси (жидкой или газообразной) удерживаться на поверхности адсорбента как при поглощении их из потока носителя, так и при… … Геологическая энциклопедия

- (от др. греч … Википедия

Термин хроматография Термин на английском chromatography Синонимы Аббревиатуры Связанные термины высокоэффективная жидкостная хроматография, клатрат, лаборатория на чипе, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, фермент, фуллерен, эндоэдральный… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Жидкостная хроматография, основанная на разл. способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксир. ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. Для разделения катионов используют катиониты, для… … Химическая энциклопедия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография … Словарь сокращений русского языка

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие … Википедия

Книги

• Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография , Вероника Р. Майер. Представляем читателю 5-е издание книги, которое расширено за счет современных методов и оборудования. В книге многое доработано и добавлено большое количество ссылок. Те места в тексте, где…

Жидкостная хроматография это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Он применим для разделения более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии. Это связано с тем, что большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переводе в газообразное состояние. Разделение веществ жидкостной хроматографией чаще всего производится при комнатной температуре.

Особенности всех видов жидкостной хроматографии обусловлены тем, что подвижной фазой в ней является жидкость, а сорбция компонентов из газообразного и жидкого элюента протекает по-разному. Если в газовой хроматографии газ-носитель выполняет только транспортную функцию и неподвижной фазой не сорбируется, то жидкая подвижная фаза в жидкостной хроматографии является активным элюентом, его молекулы могут сорбироваться неподвижной фазой. При прохождении через колонку молекулы компонентов анализируемой смеси, находящиеся в элюенте, должны вытеснить молекулы элюента из поверхностного слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул анализируемого вещества с поверхностью сорбента. Поэтому величины удерживаемых объемов V R , пропорциональные изменению свободной энергии системы, в жидкостной хроматографии меньше, чем в газовой, а диапазон линейности изотермы сорбции в жидкостной хроматографии шире.

Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Селективность в жидкостной хроматографии в отличие от газовой определяется не одним, а двумя факторами природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз.

Жидкая подвижная фаза имеет большую плотность и вязкость, чем газообразная, коэффициенты диффузии D ж на 34 порядка ниже, чем в газе. Это приводит к замедлению массообмена в жидкостной хроматографии по сравнению с газовой. Уравнение Ван-Деемтера в связи с тем, что членВ в жидкостной хроматографии роли не играет (D ж D г ), видоизменяется и графическая зависимость эффективностиН от линейной скорости потока подвижной фазы имеет вид, представленный на рис. 1.9.

В классическом варианте колоночной жидкостной хроматографии в стеклянную колонку высотой 1–2 м, заполненную сорбентом с размером частиц 100 мкм и элюентом, вводят анализируемую пробу, растворенную в элюенте, и пропускают элюент, отбирая на выходе из колонки порции элюата. Этот вариант жидкостной хроматографии до настоящего времени применяют в лабораторной практике, но так как скорость прохождения элюента под действием силы тяжести мала, анализ продолжителен.

Современный вариант жидкостной хроматографии так называемая высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХиспользует объемно- и поверхностно-пористые сорбенты с размером частиц 5–10 мкм, нагнетательные насосы, обеспечивающие давление в системе до 400 атм., высокочувствительные детекторы. Быстрый массоперенос и высокая эффективность разделения позволяют использовать ВЭЖХ для разделения молекул (жидкостно-адсорбционная и жидкость-жидкостная распределительная хроматографии), для разделения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзионная хроматографии).

1.3. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на колонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k" должен быть больше 0, т.е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости недолжен быть и слишком большим, чтобы получить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень большие k". Этого добиваются, меняя элюирующую силу растворителя.

В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увеличивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изопропанола. Если содержание полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более слабым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на другие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том случае, если данная система не обеспечивает желаемой селективности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропные ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так же подбирают силу растворителя в случае использования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и исключая опасные для фазы растворители (например, альдегиды и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и уменьшают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, используют другую органическую составляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях методом ионообменной хроматографии силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и биологических смесей, зачастую не удается подобрать силу растворителя таким образом, чтобы все компоненты пробы элюировались за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т.е. использовать растворитель, элюирующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонентов сложных смесей за относительно короткий промежуток времени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.

1.6.1. Адсорбционная жидкостная хроматография . Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз подразделяется на нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографии. В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФХнеполярный адсорбент и полярные подвижные фазы, но в обоих вариантах выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, т. е. растворитель, должна обеспечивать различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время.

В качестве неподвижной фазы в адсорбционной жидкостной хроматографии применяют полярные и неполярные тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м 2 /г. Полярные адсорбенты (SiO 2 ,Al 2 O 3 , флорисил и др.) имеют на поверхности слабокислотные группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты используют главным образом для разделения неполярных и среднеполярных соединений. Их недостатоквысокая чувствительность к содержанию воды в применяемых элюентах. Для устранения этого недостатка полярные сорбенты обрабатывают аминами, диолами и другими реагентами, в результате чего происходит поверхностная прививка этих реагентов, модифицирование поверхности и изменение селективности по отношению к анализируемым веществам.

Неполярные адсорбенты (графитированные сажи, диатомит, кизельгур) неселективны к полярным молекулам. Для получения неполярных адсорбентов часто на поверхность, например, силикагеля прививают неполярные группы, например, алкилсилильные SiR 3 , гдеRалкильные группы С 2 С 22 .

Подвижная фаза должна полностью растворять анализируемую пробу, обладать невысокой вязкостью (чтобы коэффициенты диффузии были достаточно большими), желательно, чтобы из нее было возможно выделить разделенные компоненты. Она должна быть инертной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, дешевой, подходящей для детектора.

Подвижные фазы, применяемые в жидкостной хроматографии, различаются по своей элюирующей силе. Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента на данном адсорбенте больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например н-гептана. Слабые растворители плохо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Наоборот, сильные растворители адсорбируются хорошо, поэтому коэффициенты распределения сорбата низкие. Растворитель тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель – сорбат.

Для обеспечения высокой эффективности разделения на колонке необходимо подобрать такую подвижную фазу, которая имеет полярность, оптимальную для разделяемой смеси в выбранных условиях разделения. Обычно сначала выбирают неподвижную фазу, которая имеет полярность, близкую к полярности разделяемых компонентов. Затем подбирают подвижную фазу, добиваясь того, чтобы коэффициент емкости k " оказался в интервале от 2 до 5. Если полярность подвижной фазы слишком близка к полярности неподвижной, время удерживания компонентов будет слишком малым, а если полярности подвижной и неподвижной фаз различаются очень сильно, время удерживания становится слишком большим.

При подборе подвижных фаз ориентируются на так называемые элюотропные ряды, основанные на применении индексов полярности Снайдера Р" , который подразделяет все растворители на сильные (полярные) и слабые (слабополярные и неполярные). В основе шкалы полярности лежит растворимость веществ, используемых в качестве подвижных фаз, в диоксане, нитрометане и этаноле.

В таблице 1.2 приведены значения индексов полярности и элюирующей силы (по отношению к SiO 2) ряда растворителей, наиболее часто применяемых в жидкостной хроматографии в качестве подвижных фаз. Здесь же указаны коротковолновые границы прозрачности этих растворителей, что облегчает подбор условий детектирования компонентов смеси.

Таблица 1.2

Характеристики растворителей, используемых в жидкостной хроматографии

Растворитель	Индекс полярности	Элюирующая сила (SiO 2)	Коротковолновая граница прозрачности
Фторалкан
Циклогексан
н -Гексан
Тетрахлорметан
Диизопропиловый эфир
Диэтиловый эфир
Дихлорметан
Тетрагидрофуран
Хлороформ
Уксусная кислота
Ацетонитрил
Нитрометан

В жидкостной хроматографии часто используют не индивидуальные растворители, а их смеси. Часто незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элюента.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за приемлемое время. В этом случае применяют метод ступенчатого, или градиентного, элюирования, при котором в процессе хроматографирования последовательно используют все более сильные элюенты, что позволяет элюировать сильноудерживаемые вещества за меньшее время.

В жидкостной хроматографии существуют некоторые эмпирические правила, которые очень полезны при выборе элюента:

 сорбция соединения, как правило, увеличивается с ростом в нем количества двойных связей и ОН-групп;

 сорбция уменьшается в ряду органических соединений: кислоты спиртыальдегидыкетонысложные эфирыненасыщенные углеводородынасыщенные углеводороды;

 для разделения веществ разной полярности и разделения веществ разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: анализируемая проба растворяется и элюируется неполярным элюентом, соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время, при этом время удерживания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным. Для очень полярных молекул значения времени удерживания так велики, что при использовании неполярного элюента анализ невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных компонентов переходят к полярным элюентам;

 в обращенно-фазовом варианте неподвижная фаза (неполярный адсорбент) сильнее адсорбирует неполярный компонент из полярных элюентов, например из воды;

 снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя, можно уменьшить удерживание компонентов.

1.6.2. Распределительная жидкостная хроматография. В распределительной или жидкость-жидкостной хроматографии разделение компонентов анализируемой пробы обусловлено различиями в коэффициентах их распределения между двумя не смешивающимися между собой жидкими фазами, одна из которых неподвижная и находится на поверхности или в порах твердого неподвижного носителя, а втораяподвижная.

По характеру сил взаимодействия, обусловливающих различное распределение между двумя фазами веществ, отличающихся своим химическим строением, распределительная хроматография подобна адсорбционной, т. е. и здесь разделение основано на различии в силах межмолекулярного взаимодействия компонентов анализируемой пробы с неподвижной и подвижной жидкими фазами.

В зависимости от техники выполнения распределительная хроматография, как и адсорбционная, может быть колоночной или плоскостной (бумажной или тонкослойной).

В качестве твердых носителей используют вещества, индифферентные по отношению к подвижному растворителю и компонентам анализируемой пробы, но способные удерживать на поверхности и в порах неподвижную фазу. Чаще всего в качестве носителей применяют полярные вещества (целлюлозу, силикагель, крахмал). На них наносят неподвижную фазу полярный растворитель, чаще всего воду или спирт. В качестве подвижных фаз в этом случае используют менее полярные или неполярные вещества (спирты, амины, кетоны, углеводороды и др.). Такой вариант распределительной хроматографии называетсянормально-фазовым . Он применяется для разделения полярных веществ.

Второй вариант распределительной хроматографии отличается тем, что в качестве неподвижной твердой фазы используют неполярные носители (резину, фторопласт, гидрофобизированный силикагель), в качестве неподвижной жидкой фазы неполярные растворители (углеводороды), а в качестве подвижной жидкой фазыполярные растворители (спирты, альдегиды, кетоны и др., часто вода). Этот вариант распределительной хроматографии называетсяобращенно-фазовой и используется для разделения неполярных веществ.

Для достижения оптимального разделения компонентов анализируемой пробы очень важное значение имеет подбор подвижной фазы. Растворители (подвижные и неподвижные жидкие фазы) должны подбираться так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси различались достаточно существенно. К жидким фазам предъявляются следующие требования :

1) используемые растворители должны хорошо растворять разделяемые вещества, причем их растворимость в неподвижной фазе должна быть больше, чем в подвижной;

2) растворители, используемые в качестве подвижной и неподвижной фаз, должны быть взаимонасыщаемы, т. е. состав растворителя должен быть постоянным во время прохождения через колонку;

3) взаимодействие растворителей, используемых в качестве подвижной фазы, с неподвижной фазой должно быть минимальным.

Чаще всего в распределительной жидкостной хроматографии в качестве подвижных жидких фаз применяют не индивидуальные вещества, а их смеси в различных соотношениях. Это позволяет регулировать полярность подвижной фазы, изменять соотношение полярностей подвижной и неподвижной фаз и добиваться оптимальных условий разделения компонентов конкретной анализируемой смеси.

Существенным недостатком этого хроматографического метода является достаточно быстрое смывание нанесённой неподвижной жидкой фазы с носителя. Для его устранения растворитель, используемый в качестве подвижной фазы, насыщают веществом, применяемым в качестве неподвижной жидкой фазы, или стабилизируют неподвижную жидкую фазу прививкой ее к носителю.

Разновидностью распределительной жидкостной хроматографии является широко используемый метод ВЭЖХ.

Самыми распространенными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей. Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные) ЖХ, главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

Схема изократического хроматографа

Подвижная фазаиз емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводитсяпроба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает вдетектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фазадолжна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

В жидкостной хроматографии используют множество типов насосов. ПриЖХнизкого давления зачастую используют перистальтические насосы (Рис.1).

Рис.1 Програмируемый перистальтический насос MasterFlex.

При ВЭЖХдля обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ВЭЖХотносятся: диапа­зон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульса­ций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоян­ного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы для ВЭЖХ делятся на шприцевые и наплунжерные возвратно-поступательные .

Шприцевые насосы

Основной отличительной особенностью данных насосов является цикличность их работы, в связи с чем хроматографы, в которых применяются данные насосы, также отличаются цикличностью работы.

Рис. 2. Принципиальное устройство шприцевого насоса дляВЭЖХ.

Рис. 2А. Шприцевой насос.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в пе­ремещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фазапоступает в дози­рующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя;

б) ограниченный объемом шприца объем ПФ, а следовательно ограниченное время разделения;

в) приостановка разделения во время заполнения насоса;

г) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

Рис. 3. Принципиальное устройство плунжерного насоса.

Принцип действия.

Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плун­жер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда на­сос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи опре­деляется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давле­ния и потока (Рис.4). Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствитель­ности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.

Рис.4. Пульсации плунжерного насоса.

Способы борьбы с пульсациями.

1. Применение демпфирующих устройств .

Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором.

Рис. 5. Спиральный демпфер.

Демпферраскручивается при увеличении давления в нем (ускорение хода насоса). При спаде давления он скручивается, его объем уменьшается, он выдавливает из себя часть растворителя, поддерживая постоянным расход и уменьшая пульсации. Такой демпфер хо­рошо работает при давлении 50 атм и выше.

При давления 5-30 атм лучше сглаживает пуль­сации воздушный демпфер , изготовленный из колонки (рис. 6.). Воздух в заглушенной ко­лонке (6х200 мм) сжимается и пульсации гасятся. Воздух в нем растворяется за 24 часа.

Рис. 6. Воздушный демпфер.

2. Применение электронных устройств.

При использовании электронного датчика давления можно использовать показания датчика для управления работой насоса. При спаде давления увеличивается скорость враще­ния двигателя и компенсирует уменьшение давления. Также можно скомпенсировать утечки в клапанах и частично в манжетах. Применение электронного демпфера(БПЖ-80, ХПЖ-1 и т.д.) позволяет снизить пульсации давления до 1 атм при давлении 100-150 кгс/см2.

1.6.3. Ионообменная, ионная, ион-парная хроматография. В основе методов ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающими в колонку. Основная цель хроматографического процесса  разделение неорганических или органических ионов одного и того же знака. Удерживание в этих видах хроматографии определяется изменением свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций обменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента характеризуются ионообменным равновесием. Ионный обмен заключается в том, что некоторые вещества (ионообменники) при погружении в раствор электролита поглощают из него катионы или анионы, выделяя в раствор эквивалентное количество других ионов с зарядом того же знака. Между катионообменником и раствором происходит обмен катионами, между анионообменником и раствором – обмен анионами.

Катионообменники представляют собой чаще всего специально синтезированные нерастворимые полимерные вещества, содержащие в своей структуре ионогенные группы кислотного характера: –SO 3 H; –COOH; –OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Химические формулы катионообменников схематически можно изобразить как R-SO 3 H; R-SO 3 Na. В первом случае катионообменник находится в Н-форме, во второмв Na-форме. R – полимерная матрица.

Катионообменные реакции записывают как обычные гетерогенные химические реакции:

RН +Na + RNa+H +

Анионообменники содержат в своей структуре ионогенные группы основного характера: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + и др. Их химические формулы могут быть изображены как RNH 3 OH и RNH 3 Cl или ROH, RCl. В первом случае анионообменник находится в ОН-форме, во втором – в Сl-форме. Анионообменную реакцию можно записать следующим образом:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Известны амфотерные ионообменники, содержащие в своей структуре и кислотные, и основные группы. Ионообменники, имеющие в своем составе однотипные (например, SO 3 H) кислотные (основные) группы, называют монофункциональными; ионообменники, содержащие разнотипные (например,SO 3 H,ОН) кислотные (основные) группыполифункциональными.

Монофункциональные ионообменники получают реакцией полимеризации. Реакция поликонденсации позволяет получать полифункциональные ионообменники. Для того, чтобы полученные ионообменники имели достаточно высокие эксплуатационные характеристики, они должны быть нерастворимыми, но набухающими в соответствующем растворителе и иметь достаточно большое количество ионогенных групп, способных к обмену с ионогенными группами анализируемой пробы. Это может быть достигнуто, если полученные полимерные цепи достаточно разветвлены и связаны друг с другом «сшивающими мостиками». Например, при получении катионообменников полимеризационного типа на основе стирола в качестве сшивающего агента чаще всего используется дивинилбензол, введение которого в количестве до 16% обеспечивает получение ионообменников с различной степенью набухания и, следовательно, позволяет регулировать пористость ионообменника. Степенью набухания ионита, выражаемой в миллилитр/грамм, называют объем упакованного в колонку 1 г воздушно-сухого ионообменника.

Ионообменник поглощает, как правило, один из противоионов ионов, находящихся в подвижной фазе, т. е. проявляет определенную селективность. Экспериментально установлены ряды сродства, или селективности, ионов по отношению к ионообменникам разных типов. Например, при низких концентрациях раствора на сильнокислотных катионообменниках ионы с одинаковым зарядом сорбируются в такой последовательности:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Для ионов с разными зарядами сорбируемость увеличивается с увеличением заряда:

Na + Ca 2+

Однако изменение условий проведения реакции ионного обмена может привести к обращению ряда. Ряды сродства установлены и для анионообменников. Например, сорбируемость анионов на сильноосновных анионитах увеличивается в ряду:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Ионообменики, содержащие в своей структуре сильнокислотные или сильноосновные группы, вступают в реакции ионного обмена с любыми ионами, находящимися в растворе обладающими зарядами того же знака, что и знак противоиона. Такие ионообменники называют универсальными.

Процесс ионного обмена между анализируемым веществом и ионообменником может быть осуществлен одним из трех способов: статическим, динамическим (способ ионообменного фильтра) и хроматографическим.

Статический метод ионного обмена заключается в том, что навеску ионита приводят в контакт с определенным объемом раствора и перемешивают или встряхивают определенное время до установления равновесия. Это быстрый и простой способ ионного обмена, применяющийся для концентрирования ионов из разбавленных растворов, удаления ненужных примесей, но он не обеспечивает полного поглощения ионов, так как ионный обменэто неравновесный процесс, и вследствие этого не гарантирует полного разделения ионов.

При проведении ионного обмена динамическим способом через колонку с ионитом пропускают раствор, который по мере перемещения по колонке контактирует с новыми гранулами ионита. Этот процесс обеспечивает более полный обмен, чем статический метод, так как продукты обмена удаляются потоком раствора. Им можно концентрировать ионы из разбавленных растворов и разделять ионы, сильно различающиеся по свойствам, например, разнозарядные ионы (отделять катионы от анионов), но разделение ионов одного знака заряда практически невозможно. Количественное разделение таких ионов возможно только при многократном повторении сорбционно-десорбционных элементарных актов в динамических условиях, т. е.хроматографическим методом . При работе этим методом применяют высокие слои ионита и в этот слой вводят разделяемую смесь в количестве, значительно меньшем емкости колонки, благодаря чему и обеспечивается многократное повторение элементарных актов ионного обмена.

По технике проведения анализа ионообменная хроматография сходна с молекулярной и может осуществляться по элюентному (проявительному), фронтальному и вытеснительному вариантам. Отличие между молекулярной и ионообменной хроматографией состоит в том, что в молекулярной хроматографии разделенные компоненты смеси элюируются из колонки чистым элюентом, а в ионообменной в качестве элюента используют раствор электролита. При этом обмениваемый ион элюента должен сорбироваться менее селективно, чем любой из ионов разделяемой смеси.

При проведении проявительной ионообменной хроматографии, которая применяется наиболее часто, колонку, заполненную ионитом, сначала промывают раствором электролита до тех пор, пока в ионите не произойдет полное замещение всех его ионов на ионы, содержащиеся в элюенте. Затем в колонку вводят небольшой объем раствора анализируемого вещества, имеющего в своем составе разделяемые ионы в количестве около 1% от емкости ионита. Далее колонку промывают раствором элюента, отбирая фракции элюата и анализируя их.

Смесь ионов Cl – , Br – , J – можно разделить на высокоосновном анионите (сшитый полистирол, содержащий группы четвертичных аммониевых основанийN (CH 3) 3 +), например, AB-17, имеющем ряд избирательности (селективности): NO 3 – Cl – Br – J – . Вследствие этого в качестве элюента используется раствор NaNO 3 . Вначале через ионит пропускается этот раствор до полного насыщения ионами NO 3 – . При введении в колонку разделяемой смеси ионы Cl – , Br – , J – поглощаются анионитом, вытеснив ионы NO 3 – . При последующем промывании колонки раствором NaNO 3 ионы Cl – , Br – , J – в верхних слоях анионита постепенно вновь замещаются ионами NO 3 – . Быстрее всех будут вытесняться ионы Cl – , дольше всех в колонку задержатся ионы J – . Различие в селективности ионита к ионам смеси приводит к тому, что в колонке образуются отдельные зоны сорбированных ионов Cl – , Br – и J – , перемещающиеся по колонке с различной скоростью. По мере перемещения по колонке расстояние между зонами увеличивается. В каждой зоне находится лишь один из анионов разделяемой смеси и анион элюента, в промежутке между зонами лишь анион элюента. Таким образом, в элюенте на выходе из колонки будут появляться фракции, в которых содержатся отдельные компоненты разделяемой смеси.

Для решения практических задач варьируют условия разделения ионов, подбирая подходящую подвижную фазу (состав, концентрация, рН, ионная сила) или изменяя пористость полимерной матрицы ионита, т. е. число межцепных связей в матрице, и создавая ионитовые сита, проницаемые для одних ионов и способные к их обмену и непроницаемые для других. Можно также изменять природу и взаимное расположение ионогенных групп, а также получать сорбенты, способные к селективным химическим реакциям за счет комплексообразования. Высокой селективностью обладают, например, комплексообразующие ионообменники, содержащие в своей структуре хелатообразующие группы органических реагентов диметилглиоксима, дитизона, 8-оксихинолина и др., а также краун-эфиры.

Наибольшее применение в ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии находят синтетические макро- и микросетчатые органические ионообменники, имеющие большую обменную емкость (3–7 ммоль/г), а также неорганические ионообменные материалы. Микросетчатые ионообменники способны к обмену ионов только в набухшем состоянии, макросетчатые – в набухшем и ненабухшем состояниях. Другим структурным типом ионообменников являются поверхностно-пленочные иониты, твердая сердцевина которых изготовлена из непористого сополимера стирола и дивинилбензола, стекла или силикагеля и окружена тонкой пленкой ионообменника. Общий диаметр такой частицы составляет около 40 мкм, толщина пленки ионита – 1 мкм. Недостаток таких ионообменников – сравнительно большой диаметр частиц и малая обменная емкость из-за низкой удельной поверхности, вследствие чего приходится работать с малыми пробами и, соответственно, использовать высокочувствительные детекторы. Кроме того, такие ионообменники достаточно быстро отравляются и не способны к регенерации.

В высокоэффективной ионообменной и ионной хроматографии применяют объемно-пористые полистирольные ионообменники, объемно-пористые кремнеземы с диаметром гранул около 10 мкм, а также практически не набухающие поверхностно-пористые и поверхностно-модифицированные сополимеры стирола и дивинилбензола с ионогенными сульфо- и аминогруппами.

В ион-парной хроматографии используют «щеточные» сорбенты – силикагели с привитыми обращенными фазами С 2 , С 8 ,С 18 , которые легко превращаются в катионообменник при поглощении из подвижной фазы ионогенных поверхностно-активных веществ, например алкилсульфатов или солей четвертичных аммониевых оснований.

При проведении хроматографического разделения с применениием ионообменников в качестве подвижной фазы чаще всего используют водные растворы солей. Это связано с тем, что вода обладает прекрасными растворяющими и ионизирующими свойствами, благодаря чему молекулы анализируемой пробы мгновенно диссоциируют на ионы, ионообменные группы ионообменника гидратируются и также переходят в полностью или частично диссоциированную форму. Это обеспечивает быстрый обмен противоионов. На элюирующую силу подвижной фазы основное влияние оказывает рН, ионная сила, природа буферного раствора, содержание органического растворителя или поверхностно-активного вещества (ион-парная хроматография).

Значение рН выбирают в зависимости от природы ионогенных групп, разделяемых ионов и матрицы. С сильнокислотными и сильноосновными ионообменниками можно работать при рН = 2–12, со слабокислотными при рН = 5–12, со слабоосновными при рН = 2–6. Сорбенты на основе кремнезема при рН 9 использовать нельзя. Ионная сила подвижной фазы влияет на емкость ионообменника. С увеличением ионной силы сорбция ионов обычно уменьшается, так как растет элюирующая сила подвижной фазы. Поэтому в начале разделения подвижная фаза должна иметь малое значение ионной силы (0,05–0,1), а конечное значение этой характеристики не должно превышать 2. При градиентном элюировании часто используют буферы с увеличивающейся ионной силой.

Для селективного элюирования ионов, поглощенных ионообменником, можно применять воду, буферные растворы (фосфатный, ацетатный, боратный, гидрокарбонатный и др.) с определенным значением рН и ионной силы, растворы минеральных (соляная, азотная, серная, фосфорная) и органических (фенол, лимонная, молочная, винная, щавелевая, ЭДТА) кислот. Выбор элюента облегчается тем, что предельные коэффициенты распределения большинства элементов между водными (водно-органическими) растворами многих комплексантов и ионообменниками стандартного типа определены и представлены в таблицах.

1.6.4. Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионная хроматографияэто разновидность жидкостной хроматографии, в которой разделение компонентов основано на распределении молекул в соответствии с их размером между растворителем, находящимся в порах сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами. В процессе разделения небольшие молекулы попадают в сетку полимера, в порах которой растворитель служит неподвижной фазой, и удерживаются там. Большие молекулы не могут проникнуть в полимерную сетку и вымываются из колонки подвижной фазой. Вначале элюируются самые большие, затем средние и, наконец, небольшие молекулы.

Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-про-никающую и гель-фильтрационную. В гель-проникающей хроматографии разделение происходит на полимерах, набухающих в органических растворителях. Гель-фильтрационный вариант эксклюзионной хроматографии предполагает использование в качестве неподвижных фаз полимеров, набухающих в воде.

Продолжительность удерживания компонентов анализируемой пробы в эксклюзионной колонке зависит от размеров их молекул и диффузии в поры сорбента, а также от размеров пор неподвижной фазы.

В этом виде жидкостной хроматографии коэффициент распределения D для самых маленьких молекул анализируемой пробы, которые движутся в хроматографической колонке с наименьшей скоростью, проникая в сетку неподвижной фазы, равен 1, так как подвижная фаза и растворитель, находящийся в порах неподвижной фазы, имеют один и тот же состав. При этом основное уравнение колоночной хроматографии приобретает вид

Молекулы большого размера, не попадающие в поры неподвижной фазы, элюируют из колонки вместе с подвижной фазой. Для них D = 0, aV R =V m . Такой диапазон значений коэффициента распределения (от 0 до 1) характерен только для эксклюзионной хроматографии.

Все молекулы анализируемого многокомпонентного вещества должны вымываться из колонки при пропускании небольшого объема растворителя от V m доV m +V s и разделение заканчивается до выхода пика растворителя. Поэтому в этом виде хроматографии необходимо использовать достаточно длинные колонки с большим свободным объемомV m и большим числом пор в сорбенте.

Разрешение хроматографических пиков при эксклюзионном разделении может быть улучшено при использовании градиентного элюирования смешанными растворителями.

Каждый сорбент, применяемый в эксклюзионной хроматографии, характеризуется определенным объемом пор и, следовательно, обладает определенной областью разделяемых молекулярных масс и определенным градуировочным графиком. При этом градуировочный график, характеризующий зависимость удерживаемого объема от молекулярной массы или размера молекул, имеет, как правило, сложный вид.

Неподвижные фазы в эксклюзионной хроматографии выбирают исходя из конкретных аналитических задач. Первоначально устанавливают, какая система растворителей может быть использована для анализа (водная или водно-органическая). В зависимости от этого определяют тип сорбента. Если необходимо провести разделение водорастворимых проб, в качестве неподвижных фаз применяют, например, набухающие в воде сшитые декстраны (сефадексы) или полиакриламиды (биогель Р). Разделение веществ, растворимых в органических растворителях, можно проводить на полистиролах с различной степенью сшивки, набухающих в органических растворителях (стирогель, порагель, биобид С). Такие набухшие гели, как правило, неустойчивы к давлению, при их использовании допускаются очень низкие скорости потока подвижной фазы, что увеличивает время анализа. Чтобы осуществить высокоэффективный вариант эксклюзионной хроматографии, необходимо применять неподвижные фазы с жесткими матрицами силикагели, недостаток которыхвысокая адсорбционная активность – устраняется силанизацией поверхности или подбором соответствующего по полярности элюента.

В качестве подвижных фаз в эксклюзионной хроматографии могут использоваться вещества, которые:

 полностью растворяют анализируемый образец;

 хорошо смачивают сорбент;

 противодействуют адсорбции компонентов пробы на сорбенте;

 имеют низкую вязкость и токсичность.

1.6.5. Плоскостная хроматография . К плоскостной хроматографии относятся тонкослойная и бумажная хроматографии. Эти виды жидкостной хроматографии просты по технике выполнения, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования, что является их неоспоримым достоинством.

Разделение смеси веществ этими методами может быть выполнено с использованием различных хроматографических систем. Поэтому выделяют адсорбционную, распределительную, нормально- и обращенно-фазовую, ионообменную и т. п. бумажную и тонкослойную хроматографии. В настоящее время наибольшее распространение получила тонкослойная хроматография.

Бумажная и тонкослойная хроматографии сходны по технике выполнения. В качестве неподвижной фазы в бумажной хроматографии применяется целлюлозное волокно бумаги, в тонкослойной хроматографии различные сорбенты (Al 2 O 3 , силикагель и др.), нанесенные равномерным тонким (100300 мкм) слоем на стеклянную, металлическую или пластиковую подложку (носитель). Слой адсорбента на носителе может быть закреплен или не закреплен.

Хроматографическое разделение в плоскостных методах, как и на колонке, обусловлено переносом компонентов анализируемого вещества подвижной фазой вдоль слоя неподвижной фазы с различными скоростями в соответствии с коэффициентами распределения разделяемых веществ. В обоих случаях используются хроматографические системы жидкость твердый сорбент (адсорбционный механизм разделения), жидкостьжидкостьтвердый носитель (распределительный, ионообменный и другие механизмы).

В качестве подвижных фаз применяют различные растворители или их смеси, органические или неорганические кислоты.

Практическое получение плоскостных хроматограмм состоит в следующем.

На полоске хроматографической бумаги или на тонком слое сорбента карандашом отмечают стартовую линию на расстоянии 1 см от нижнего края полоски или пластинки. Микропипеткой наносят пробу на линию старта в виде пятна диаметром не более 23 мм. Затем край полоски или пластинки опускают в сосуд с подвижной фазой, находящийся в герметичной камере. По мере подъема подвижной фазы по полоске или пластинке и протекания обычных в хроматографии многократных элементарных актов сорбции-десорбции, распределения между двумя жидкими фазами, ионного обмена и др. происходит разделение компонентов анализируемой смеси. Процесс обычно продолжают до тех пор, пока растворитель не пройдет от линии старта10 см. После этого полоску или пластинку извлекают из камеры и высушивают. Если компоненты анализируемого вещества окрашены, они дают на хроматограмме соответствующие цветные пятна. Для обнаружения неокрашенных компонентов анализируемого вещества хроматограмму необходимо проявить. Проявление хроматограммы и детектирование компонентов пробы может быть проведено различными методами и зависит от состава анализируемых смесей. Проявление может быть осуществлено:

 с помощью УФ-освещения. Метод применим для обнаружения веществ, способных под действием УФ-излучения испускать собственное излучение (люминесцировать) видимого диапазона длин волн;

 посредством реагентов-проявителей. Например, присутствие в анализируемой смеси аминокислот может быть обнаружено с помощью нингидрина. Высушенную хроматограмму погружают в 0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне, затем высушивают ее. Пятна, соответствующие различным компонентам смеси, приобретают визуальную и, как правило, специфичную для каждого вещества окраску;

 с использованием иода. При этом детектируемую хроматограмму вносят в сосуд, на дне которого находятся кристаллы иода. Пары иода адсорбируются на пятнах сильнее, благодаря чему пятна визуализируются. Иод это неспецифический реагент-проявитель. Используя специфические реагенты, можно не только определить количество компонентов смеси, но и идентифицировать разделенные вещества по цвету пятен.

Бумажную и тонкослойную хроматографии чаще всего осуществляют в так называемом восходящем варианте, описанном выше. Достаточно часто для улучшения качества хроматограмм приходится использовать и более сложные варианты плоскостной хроматографии, например, нисходящую, круговую, двухмерную. При проведении нисходящей бумажной или тонкослойной хроматографии анализируемое вещество наносится на стартовую линию пластинки или бумажной полоски, находящейся сверху, и элюент подается не снизу, а сверху. Положительный эффект, заключающийся в улучшении разделения, обусловлен вкладом в процесс разделения сил тяжести компонентов.

Как восходящая, так и нисходящая хроматографии могут быть осуществлены в одно и двухмерном вариантах. В отличие от описанного выше одномерного процесса разделения в плоском слое при двухмерном хроматографическом разделении разделение анализируемой пробы сначала проводят в одном растворителе, затем осуществляют разделение в направлении, перпендикулярном первому, с использованием другого растворителя, повернув первую хроматограмму на 90 о С.

При проведении круговой хроматографии анализируемое вещество наносится в виде капли в середину пластинки или листа хроматографической бумаги. Сюда же каплями подается один или несколько растворителей. Это приводит к тому, что получаемая хроматограмма представляет собой набор радиальных пятен.

Положение пятен (зон), которые образуют разделенные компоненты анализируемого вещества на плоской хроматограмме, характеризуется величинами относительной скорости перемещения компонентов в тонком слое R fi . Экспериментально величинуR fi определяют как отношение расстоянияL i , пройденногоi -м компонентом, к расстояниюL , пройденному растворителем от стартовой линии до линии фронта (рис. 1.10):

Величина R fi зависит от природы соответствующего компонента анализируемой пробы, природы неподвижной фазы, ее толщины, природы и качества подвижной фазы, способа нанесения пробы и других факторов, но всегдаR fi 1.

Величина R fi фактически тождественна времени удерживания вещества или его удерживаемому объему, характеризующим скорость прохождения вещества через хроматографическую колонку, и может быть использована для качественной идентификации компонентов анализируемой пробы, а диаметр пятна тождественен высоте или площади хроматографического пика и, следовательно, в некоторой степени отражает количественное содержание вещества.

Количественное определение состава анализируемой пробы в простейшем случае может быть оценено визуально по интенсивности собственной окраски пятен или интенсивности флуоресцентного свечения полученных пятен при УФ-детектировании. Для этих целей достаточно широко применяется элюирование хроматографических пятен. При этом пятно, полученное на хроматограмме, аккуратно вырезают или соскребают, обрабатывают подходящим растворителем и полученный раствор исследуют соответствующим физико-химичес-ким методом. Можно использовать и весовой метод, при котором соответствующее пятно вырезают из хроматограммы и взвешивают. Количество вещества определяют по разности весов чистой бумаги такой же площади и бумаги с веществом.

Бумажная (БХ ) и тонкослойная хроматография (ТСХ ) по механизму разделения относятся к распределительной хроматографии . В методе БХ носителем является специальная хроматографическая бумага с определенными свойствами. Неподвижной фазой служит вода, адсорбированная на поверхности и порах бумаги (до 20%), подвижной  органический растворитель, смешивающийся или несмешивающийся с водой, вода или растворы электролитов.

Механизм на бумаге довольно сложен. В неподвижной фазе вещество может удерживаться не только вследствие растворения в адсорбированной бумагой воде, но и адсорбироваться непосредственно целлюлозой. Нанесенные на бумагу разделяемые компоненты переходят в подвижную фазу и по капиллярам бумаги перемещаются с различными скоростями в соответствии с коэффициентом межфазного распределения каждого из них. В начале хроматографирования некоторая часть вещества из бумаги переходит в подвижную фазу и перемещаются далее. Когда органический растворитель достигает участка бумаги, не содержащего растворенное вещество, снова происходит перераспределение : из органической фазы вещество переходит в водную, сорбированную на бумаге. Поскольку компоненты обладают различным сродством к сорбенту , при перемещении элюента происходит разделение: одни вещества задерживаются в начале пути, другие продвигаются далее. Здесь сочетаются термодинамический (установления равновесного распределения веществ между фазами) и кинетический (движение компонентов с различной скоростью) аспекты разделения. В результате каждый компонент концентрируется на определенном участке бумажного листа: образуются зоны отдельных компонентов на хроматограмме . Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.

В методе ТСХ процесс разделения смеси веществ осуществляется в тонком слое сорбента , нанесенного на инертную твердую подложку, и обеспечивается движением подвижной фазы (растворителя) через сорбент под действием капиллярных сил . По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную и ионообменную хроматографию . Разделение компонентов происходит в этих случаях либо в результате их различного коэффициента распределения между двумя жидкими фазами (распределительная хроматография ), либо вследствие различной адсорбируемости соединений сорбентом (адсорбционная хроматография ). Адсорбционный метод основан на разной степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-ваальсовских сил , являющейся основой физической адсорбции , полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).

В случае использования для ТСХ таких сорбентов, как окись алюминия или силикагель в разделении играют роль как распределение , так и адсорбция на развитой активной поверхности сорбента (150 750 м 2 /г). Распределение компонентов смеси происходит между водой на поверхности носителя (такие адсорбенты , как окись алюминия , крахмал , целлюлоза , кизельгур – и вода образуют неподвижную фазу ), и перемещающимся через эту неподвижную фазу растворителем (подвижная фаза ). Компонент смеси, легче растворимый в воде, перемещается медленнее, чем тот, который легче растворим в подвижной фазе.

Адсорбция проявляется в том, что между носителем , например, окисью алюминия, и компонентами смеси устанавливаются адсорбционные равновесия – для каждого компонента свое, результатом чего является разная скорость перемещения компонентов смеси. Можно выделить два крайних случая:

а) концентрация вещества на адсорбенте равна нулю. Вещество полностью растворяется в подвижной фазе и увлекается ею (перемещается вместе с фронтом растворителя ).

б) вещество адсорбируется полностью, с растворителем не взаимодействует и остается на старте.

На практике при умелом подборе растворителя и адсорбента распределение соединения располагается между этими крайними случаями, и вещество постепенно переносится от одного слоя сорбента к другому за счет одновременно происходящих процессов сорбции и десорбции .

Растворитель, проходящий через сорбент, называют элюентом , процесс перемещения вещества вместе с элюентом  элюированием . По мере продвижения жидкости на пластинке происходит разделение смеси веществ благодаря действию сил адсорбции , распределения , ионного обмена или совокупности действия всех перечисленных факторов. В результате образуются отдельные хроматографические зоны компонентов смеси, т.е. получается хроматограмма .

Правильный подбор сорбента и элюента определяет эффективность разделения смеси. Подвижность исследуемого вещества зависит от его сродства к сорбенту и элюирующей силы (полярности) элюента. С увеличение полярности соединения растет и его сродство к полярному сорбенту. По увеличению степени адсорбции силикагелем органические соединения располагаются в ряд: углеводороды <алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь для силикагеля элюенты можно расположить в порядке возрастания «полярности» (элюирующей способности ) и сформировать серию растворителей (элюотропный ряд ) в соответствии с экспериментальными данными: алканы>бензол>хлороформ>диэтиловый эфир> этилацетат>спирты С 2 -С 4 >вода>ацетон>уксусная кислота>метанол. Таким образом, полярное соединение – спирт достаточно сильно адсорбируется на силикагеле и поэтому слабо перемещается под действием такого неполярного растворителя, как гексан, и остается около линии старта. В свою очередь неполярный ароматический углеводород бифенил заметно более подвижен в гексане, но даже здесь для достижения R f около 0,5 необходим более полярный апротонный элюент – хлористый метилен. Силу элюента регулируют, используя смеси растворителей – соседей по элюотропному ряду с разной полярностью.

В настоящее время в ТСХ применяют главным образом следующие сорбенты : для разделения липофильных веществ  силикагель , окись алюминия , ацетилированную целлюлозу , полиамиды ; для разделения гидрофильных веществ  целлюлозу , целлюлозные ионообменники , кизельгур , полиамиды . Важнейшей характеристикой сорбента является его активность , т.е. способность сорбировать (удерживать) компоненты разделяемой смеси. За рубежом ряд фирм производит силикагель , кизельгур и окись алюминия с добавкой 5% гипса, который используется для закрепления слоя сорбента при самостоятельном изготовлении пластин.

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на Na 2 SiO 3 и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом c группами ОН в качестве активных центров. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия является слабоосновным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100150 о С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур  адсорбент, полученный из природных минералов  диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами и более низкой адсорбционной емкостью слоя в сравнении с силикагелем.

Целлюлоза: тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

Хроматографический анализ выполняется на промышленных пластинах чешского производства «Силуфол » («Silufol ») из алюминиевой фольги, иногда укрепленной картоном, и «Силупласт » из пластмассы, покрытых слоем сорбентов – силикагеля LS 5-40 с крахмалом или гипсом в качестве связующего (до 10%), или оксида алюминия с добавлением и без флуоресцентных индикаторов. Пластинки «Силуфол » имеют высокую скорость элюирования, однако при этом характеризуются низкой разделяющей способностью и невысокой чувствительностью. При хранении чувствительны к условиям (влажность, температура, агрессивные среды и т.п.). Отдельные фирмы поставляют хроматографические пластинки со слоем сорбента различной (обычно до 0,25 мм), но строго постоянной толщины (силикагель, целлюлоза, ионообменная смола), на стекле и подложках из алюминиевой фольги, пластмассы, пропитанного стекловолокна.

Пластины «Sorbfil » (ТУ 26-11-17-89) выпускаются в России на полимерной основе (полиэтилентерефталат, марка П) или алюминиевой подложке (марка АФ) с нанесенным рабочим слоем микрофракционированного сорбента силикагеля марки СТХ-1А и СТХ-1ВЭ (выпускался в СССР как фракционированный силикагель КСКГ) толщиной 90-120 мкм (до 200 мкм), закрепленным специальным связующим - силиказолем . При использовании в качестве связующего золя кремневой кислоты (силиказоля), который после нагревания переходит в силикагель, полученные ТСХ-пластины состоят из двух компонентов: слоя силикагеля и подложки. Равномерность по толщины слоя сорбента на одной пластине составляет ±5 мкм. Пример обозначения: "Сорбфил-ПТСХ-АФ-В-УФ (10х10)" - пластинки для ТСХ высокоэффективные на алюминиевой подложке, с люминофором, 10х10 см.

Если применять стеклянную подложку (марка С), то такие пластины являются многоразовыми и химически прочными. Их химическая устойчивость определяется химической стойкостью силикагеля. В результате ТСХ-пластины могут многократно обрабатываться агрессивными реагентами, например, горячей хромовой смесью, что снимает ограничения в использовании коррелирующих реагентов для детектирования пятен и модификации сорбента, и позволяет проводить многократную (до 30 раз и более) регенерацию пластин хромовой смесью. Стеклянные пластинки могут быть нарезаны по необходимым размерам. Механическая прочность слоя сорбента может регулироваться, обеспечивая, с одной стороны, транспортировку и многократность обработки пластин и, с другой стороны, возможность экстракции слоев адсорбента с разделившимися веществами для последующего вымывания индивидуальных соединений из сорбента и их дальнейшего исследования инструментальными методами (ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д.).

Пластины различаются величиной фракций (распределения частиц) силикагеля, из которого состоит слой. На аналитических пластинах (марка А) фракция 5-17 мкм, на высокоэффективных (марка В) - 8-12 мкм. Более узкое распределение повышает эффективность пластин, т.е. пятна разделяемых веществ становятся более компактными (меньшими по размерам) и поэтому лучше разделяются при прохождении фронта элюента на более короткое расстояние. На российских пластинах аналитические и высокоэффективные слои различаются не очень сильно, в отличие от пластин фирмы Merck (Германия). Применять высокоэффективные пластины нужно, если вещества не разделяются на аналитических пластинах. Выпускаются пластины всех модификаций с люминофором (марка УФ) с возбуждением 254 нм. Срок хранения не ограничен, пластины «Sorbfil » широко испытаны в анализе производных аминокислот, пестицидов, липидов, антибиотиков.

Методом ТСХ осуществляется качественная идентификация компонентов. Количественное определение для ТСХ также возможно, для этого требуется нанесение точного количества вещества и дополнительные денситометрические исследования с четким фиксированием интенсивности пятен. Наиболее распространенным является полуколичественный метод . Он основан на визуальном сравнении размера и интенсивности пятна компонента с соответствующими характеристиками серии пятен этого же вещества различной концентрации (стандартные растворы сравнения ). При использовании пробы в количестве 1-5 мкг таким простым методом обеспечивается точность определения содержания компонента около 5-10%. Нередко для определения компонентов в образце необходимо провести пробоподготовку для получения смеси, содержащей анализируемые соединения. Пробоподготовка основана на извлечении препаратов из образца органическими растворителями (н -гексан, петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлороформ), очистке экстракта и последующем хроматографировании в тонком слое окиси алюминия или силикагеля.

Существует несколько вариантов ТСХ и БХ, различающихся способом подачи растворителя . В зависимости от направления движения подвижной фазы различают:

а) восходящую хроматографию  подвижную фазу наливают на дно разделительной камеры, бумага (пластинка) ставится вертикально;

б) нисходящую хроматографию  подвижная фаза подаётся сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластины или бумаги;

в) радиальную хроматографию  горизонтальное продвижение фронта растворителя: подвижная фаза подводится к центру бумажного диска (пластины), куда нанесена разделяемая смесь.

Наиболее распространенным является восходящее элюирование (хроматографирование). Фронт элюента при этом перемещается снизу вверх. Выбор растворителя (подвижной фазы) определяется природой сорбента и свойствами разделяемых веществ.

Хроматографическое разделение методами БХ и ТСХ проводят в разделительной камере с притёртой крышкой. Количественной мерой скорости переноса вещества при использовании определенного адсорбента и растворителя является величина R f (от англ. retention factor – коэффициент задержки, этот параметр является аналогией времени удерживания). Положение зоны хроматографируемого компонента устанавливают по величине коэффициента R f , равной отношению скорости движения его зоны к скорости движения фронта растворителя. Величина R f всегда меньше единицы и не зависит от длины хроматограммы. На величину R f оказывают влияние различные факторы. Так, при низкой температуре вещества перемещаются медленнее; загрязнения растворителей, негомогенность адсорбента, посторонние ионы в анализируемом растворе могут изменять величину R f до 10%. В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения R f и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения R f лежало в пределах 0,05-0,85.

На практике величину R f рассчитывают как отношение расстояния l , пройденного веществом, к расстоянию L , пройденному растворителем:

R f = l / L (6.1 )

Обычно для расчета выбирают центр пятна (рис. 1). Величина R f зависит от многих факторов: типа хроматографической бумаги (ее пористости, плотности, толщины, степени гидратации) и сорбента (размера зерен, природы групп на поверхности, толщины слоя, его влажности, природы вещества, состава подвижной фазы), условий эксперимента (температуры, времени хроматографирования и т.п.). При постоянстве всех параметров хроматографирования значение R f определяется только индивидуальными свойствами каждого компонента.

Рис. 1. Определение на хроматограмме величин Rf для компонентовА иВ ,

степени их разделения Rs и числа теоретических тарелокN .

Эффективность БХ и ТСХ также зависит от селективности и чувствительности реакций, используемых для обнаружения компонентов анализируемой смеси. Обычно используют реагенты, образующие с определяемыми компонентами окрашенные соединения  проявители. Для более надёжной идентификации разделяемых компонентов применяют «свидетели » растворы стандартных веществ (в том же растворителе, что и проба), наличие которых предполагается в образце. Стандартное вещество наносят на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и хроматографируют в одинаковых условиях. На практике часто используют относительную величину:

R f rel = R f x / R f stand (6.2)

где R f stand также рассчитывают по формуле (6.1). Эффективность хроматографического разделения характеризуют числом эквивалентных теоретических тарелок и их высотой . Так, в методе ТСХ число эквивалентных теоретических тарелок N А для компонента А разделяемой смеси рассчитывают по формуле:

N A = 16 (l OA / a (A )) 2 (6.3)

Значения l OA и а (А ) определяют, как показано на рис. 6.1. Тогда высота эквивалентной теоретической тарелки Н А составляет:

H A = l OA / N = a (A ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Разделение практически возможно, если R f (А)  R f (В)  0,1 .

Для характеристики разделения двух компонентов А и В используют степень (критерий) разделения Rs :

Rs =  l / (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (A) + a (B)) (6.5)

где  l  расстояние между центрами пятен компонентов А и В ;

а (А) и а (В)  диаметры пятен А и В на хроматограмме (рис. 6.1). Чем больше Rs , тем чётче разделены пятна компонентов А и В на хроматограмме. Условия хроматографирования подбирают так, чтобы величина Rs отличалась от нуля и единицы, оптимальное значение Rs составляет 0,3 0,7. Для оценки селективности разделения двух компонентов А и В используют коэффициент разделения α :

α = l B / l A (6.6)

Если α = 1, то компоненты А и В не разделяются.

(преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии .

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия , нефтехимия , биология , биотехнология , медицина , пищевая промышленность , охрана окружающей среды , производство лекарственных препаратов и во многих других.

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную , распределительную , ионообменную , эксклюзионную , лигандообменную и другие.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное - распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации , основности или кислотности , по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Нормально-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

• Гексан:изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обращённо-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

Обычными элюентами для обращенно-фазовой ВЭЖХ являются:

• Ацетонитрил:вода
• Метанол:вода
• Изопропанол:вода

Матрицы для ВЭЖХ

В качестве матриц в ВЭЖХ используются неорганические соединения, такие как оксид кремния (силикагель) или оксид алюминия , либо органические полимеры, такие как полистирол (сшитый дивинилбензолом) или полиметакрилат. Силикагель, конечно, в настоящее время общепризнан.

Основные характеристики матрицы:

• Размер частиц (мкм);
• Размер внутренних пор (Å, нм).

Получение силикагеля для ВЭЖХ:

1. Формование микросфер поликремневой кислоты;
2. Сушка частиц силикагеля;
3. Воздушное сепарирование.

Частицы сорбента:

• Регулярные (сферические): выше устойчивость к давлению, выше стоимость;
• Несферические: ниже устойчивость к давлению.

Размер пор в ВЭЖХ - один из наиболее важных параметров. Чем меньше размер пор, тем хуже их проницаемость для молекул элюируемых веществ. А следовательно, тем хуже сорбционная емкость сорбентов. Чем крупнее поры, тем, во-первых, меньше механическая устойчивость частиц сорбента, а, во-вторых, тем меньше сорбционная поверхность, следовательно, хуже эффективность.

Прививки неподвижной фазы

Нормально-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с пропилнитрильной прививкой (нитрильной);
• Неподвижная фаза с пропиламинной прививкой (аминной).

Обращенно-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с алкильной прививкой;
• Неподвижная фаза с алкилсилильной прививкой.

Энд-кэппирование - защита непривитых участков сорбента дополнительной прививкой «маленькими» молекулами. Гидрофобный энд-кэппинг (С1, С2): выше селективность, хуже смачиваемость; гидрофильный энд-кэппинг (диол): ниже селективность, выше смачиваемость.

Детекторы для ВЭЖХ

• Ультрафиолетовый
• Диодно-матричный
• Флуоресцентный
• Электрохимический
• Рефрактометрический
• Масс-селективный

Ссылки

Wikimedia Foundation . 2010 .

• Хроматография
• Распределительная хроматография

Смотреть что такое "" в других словарях:

высокоэффективная жидкостная хроматография - — [А.С.Гольдберг. Англо русский энергетический словарь. 2006 г.] Тематики энергетика в целом EN high performance liquid chromatographyHPLC … Справочник технического переводчика

высокоэффективная жидкостная хроматография - Термин высокоэффективная жидкостная хроматография Термин на английском high performance liquid chromatography Синонимы Аббревиатуры ВЭЖХ, HPLC Связанные термины адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фуллерен, эндоэдральный, хроматография… …

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ - жидкостная хроматография, в к рой для повышения эффективности разделения р ритель (элюент) под давлением (более 3х107 Па) прокачивают через колонки, заполненные сорбентом с частицами малого диаметра (до 1 мкм), а также используют перфузионные… …

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ - вид хрома тографии, в к рой подвижной фазой служитжидкость (элюент), а неподвижной та. сорбент, тв. носитель с нанесённой на его поверхность жидкостью или гель. Осуществляют в колонке, заполненной сорбентом (колоночная хроматография), на плоской… … Естествознание. Энциклопедический словарь

Хроматография - [κρώμα (υрома) цвет] процесс, основанный на неодинаковой способности отдельных компонентов смеси (жидкой или газообразной) удерживаться на поверхности адсорбента как при поглощении их из потока носителя, так и при… … Геологическая энциклопедия

Хроматография - (от др. греч … Википедия

хроматография - Термин хроматография Термин на английском chromatography Синонимы Аббревиатуры Связанные термины высокоэффективная жидкостная хроматография, клатрат, лаборатория на чипе, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, фермент, фуллерен, эндоэдральный… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ - жидкостная хроматография, основанная на разл. способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксир. ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. Для разделения катионов используют катиониты, для… … Химическая энциклопедия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография … Словарь сокращений русского языка

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие … Википедия

Книги

• Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография , Вероника Р. Майер. Представляем читателю 5-е издание книги, которое расширено за счет современных методов и оборудования. В книге многое доработано и добавлено большое количество ссылок. Те места в тексте, где…

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

Недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен-ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы-сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре-менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про-ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола-бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по-следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко-лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш-ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Применение

Наиболее широкое применение ВЭЖХ находит в следующих областях химического анализа (выделены объекты анализа, где ВЭЖХ практически не имеет конкуренции):

· Контроль качества продуктов питания - тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

· Охрана окружающей среды - фенолы, органические нитросоединения, моно- и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

· Криминалистика - наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

· Фармацевтическая промышленность - стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

· Медицина - перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

· Сельское хозяйство - определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

· Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология - сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

· Органическая химия - все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений).

· контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

· определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

· обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

· определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

· мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

анализ качества почв для внесения удобрений, наличия пестицидов и гербицидов в почве, воде и в продукции, а также питательной ценности кормов; сложные исследовательские аналитические задачи; получение микроколичества сверхчистого вещества.



Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография - это вид хроматографии, в котором подвижной фазой , называемой элюентом, является жидкость . Неподвижной фазой может быть твердый сорбент , твердый носитель с нанесенной на его поверхность жидкостью или гель .

Различают колоночную и тонкослойную жидкостную хроматографию. В колоночном варианте через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента, который движется под давлением или под действием силы тяжести. В тонкослойной хроматографии элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу, вдоль пористой полимерной пленки или по полоске специальной хроматографической бумаги. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хроматографии под давлением, когда элюент прокачивают через слой сорбента, зажатого между пластинами.

Существуют такие виды жидкостной хроматографии, как аналитическая (для анализа смесей веществ) и препаративная (для выделения чистых компонентов).

Различают жидкостную хроматографию (ЖХ) в ее классическом варианте, проводимую при атмосферном давлении , и высокоскоростную ), осуществляемую при повышенном давлении . В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм). Для прокачивания элюента через колонку применяют давление до 3.107 Па. Такой вид хроматографии называют хроматографией высокого давления . Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволяет резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента.

Вариантами ВЭЖХ являются микроколоночная хроматография на наполненных сорбентом колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

Жидкостная хроматография - это важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии , медицине, биотехнологии. Ее используют для:

· изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов;

· диагностики в медицине;

· анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефти, сточных вод;

· изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов;

· выделения

· анализа и разделения смесей, их очистки и выделения из них многих биологических веществ, таких как аминокислоты, белки, ферменты, вирусы , нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, гормоны.

В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции.

Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности , для анализа загрязнений окружающей среды , в криминалистике.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был разработан и внедрен в середине 70-х годов XX века. Тогда появились первые жидкостные хроматографы.

Жидкостная хроматография является оптимальным методом анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью. Это можно объяснить особой ролью подвижной фазы в ЖХ в отличие от газовой хроматографии: элюент выполняет не только транспортную функцию.

2. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии.

По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ различают:

осадочную хроматографию , основанную на различной растворимости осадков, которые образуются при взаимодействии компонентов анализируемой смеси с осадителем. Преимуществом метода является то, что получающиеся вдоль сорбента зоны имеют резкие границы, содержат осадки только одного вещества и часто разделены зонами чистого сорбента. Однако этот метод пока не нашел широкого распространения.

· адсорбционную хроматографию, в которой разделение осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом , таким как, оксид алюминия или силикагель, имеющим на поверхности активные полярные центры . Растворитель (элюент) - неполярная жидкость .

Рис. Схема разделения смеси веществ методом адсорбционной хроматографии

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис.). Взаимодействие происходит за счет донорно-акцепторного взаимодействия или образования водородных связей.

Рис. Схема адсорбционной жидкостной хроматографии

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

При нормально-фазном варианте распределительной жидкостной хроматографии в качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используют замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис.). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Обращённо-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис.). Реже используют вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Рис. . Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

К распределительной жидкостной хроматографии относится и экстракционная жидкостная хроматография , в которой неподвижной фазой служит органический экстрагент, нанесенный на твердый носитель, а подвижной - водный раствор разделяемых соединений. В качестве экстрагентов используют, например, фенолы, триалкилфосфаты, амины, четвертичные аммониевые основания, а также серосодержащие фосфорорганические соединения. Экстракционная жидкостная хроматография применяется для разделения и концентрирования неорганических соединений, например, ионов щелочных металлов, актиноидов и др. близких по свойствам элементов, в процессах переработки отработанного ядерного горючего.

ионообменную хроматографию, которая основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, содержащихся в анализируемом растворе, на подвижные ионы, входящие в состав ионитов. В зависимости от знака заряда ионизирующих групп иониты подразделяют на катиониты и аниониты. Существуют также амфотерные иониты – амфолиты , которые могут одновременно обменивать как катионы, так и анионы. Ионообменная хроматография применяется только для разделения заряженных частиц. В основе разделения лежит способность ионообменной смолы удерживать разные ионы с разной силой. Ионит состоит из полимерной матрицы и связанных с ней активных групп, которые способны к обмену ионов. Катионит обладает кислыми или слабокислыми свойствами, так как в его состав входят группы: - SO3H, –CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 и другие, в которых подвижными являются ионы водорода. Аниониты обладают основными или слабоосновными свойствами и содержат группы: = NH2, - NH2, –NR3+,-OH и другие. Разделение ионов регулируют подбором оптимальных значений рН элюента и его ионной силы. Схематично ионный обмен можно представить реакциями:

R-H + Na+ + Cl - → R-Na + H+ + Cl - (катионный обмен)

R-OH + Na+ + Сl - → R-Сl + Na+ + OH - (анионный обмен)

Иониты должны удовлетворять следующим требованиям: быть химически устойчивыми в различных средах, механически прочными в сухом и особенно в набухшем состоянии, обладать большой поглотительной способностью и способностью хорошо регенерироваться.

В ионообменной (ионной) хроматографии, разделенные анионы (катионы) детектируют в виде кислот (соответствующих оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, где высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью.

ион-парную хроматографию , которую можно рассматривать как комбинацию адсорбционной и ионообменной хроматографии. В основу метода положена экстракция ионных веществ – перенос их из водной фазы в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляют противоион, который способен избирательно реагировать с анализируемыми компонентами, превращая их в комплексные соединения с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.

лигандообменную хроматографию , основанную на различной способности разделяемых соединений образовывать комплексы с катионами переходных металлов – Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 и др. - и фиксирующими группами (лигандами) неподвижной фазы. Часть координационной сферы ионов металла занята молекулами воды или другими слабыми лигандами, которые могут вытесняться молекулами разделяемых соединений. Такой вид хроматографии используют для разделения оптических изомеров.

эксклюзионную хроматографию (ситовую, гель-проникающую, гель-фильтрационную), в которой разделение основано на различиях в размерах молекул .

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Рис. Схема проведения гель-проникающей хроматографии

аффинную хроматографию (биоспецифическую), основанную на том, что многие биологически активные макромолекулы, например, ферменты могут специфически связываться с определённым реагентом. Реагент закрепляется на носителе (часто агарозе), затем промывается анализируемой смесью. На полимере задерживается только нужная макромолекула (рис.).

Рис. Схема аффинной хроматографии

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Затем её удаляют с полимера, пропусканием раствора соединения, обладающего ещё большим сродством к макромолекуле. Особенно эффективна такая хроматография в биотехнологии и биомедицине для выделения ферментов, белков, гормонов.

В зависимости от способа перемещения вещества различают следующие варианты жидкостной хроматографии: проявительный, фронтальный и вытеснительный.
Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Рис. Схема проявительного варианта хроматографии

Высота или площадь пиков характеризует концентрацию компонентов , а удерживаемые объемы – качественный состав смеси . Идентификацию компонентов обычно проводят по совпадению времен удерживания со стандартными веществами, также используют химические или физико-химические методы.

При фронтальном варианте (рис.) через колонку непрерывно пропускают смесь разделяемых веществ, которая играет роль подвижной фазы. В итоге можно получить в чистом виде только вещество, которое менее всего сорбируется в колонке.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Рис. Схема фронтального варианта хроматографии

Хроматограмма в этом случае представляет собой ступени, высоты которых пропорциональны концентрациям компонентов; удерживаемые объемы определяют по времени удерживания компонентов. При дифференцировании такой хроматограммы получают картину, аналогичную той, которую получают в проявительном варианте.

В вытеснительном варианте компоненты смеси, введенной в колонку, вытесняются элюентом, который адсорбируется сильнее любого компонента. В итоге получают примыкающие друг к другу фракции разделяемых веществ Порядок выхода компонентов определяется силой взаимодействия их с поверхностью сорбента (рис.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Рис. Схема вытеснительного варианта хроматографии

3. Основные хроматографические величины и их определение.

При разделении веществ с помощью жидкостной хроматографии могут быть использованы, как указано выше, проявительный, фронтальный и вытеснительный варианты. Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков. Из хроматограммы (рис.) определяют:

времена удерживания несорбирующегося (t0), разделенных компонентов (tR1 , tR2, tR3 и т. д.) ; ширину оснований пиков (tw1, tw2 и т. д.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) исправленный удерживаемый объем компонента ,

где t"R - исправленное время удерживания компонента;

c) коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту ;

d) эффективность колонки характеризуется числом эквивалентных теоретических тарелок

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) разрешение https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Коэффициент емкости k" оказывает существенное влияние на величину R S: при изменении k " от 0 до 10 (оптимальные пределы) R S сильно возрастает. Значение k" определяется удвоенной поверхностью сорбента и его количеством в колонке, а также константой адсорбционного равновесия (константой Генри).

Коэффициент селективности α определяется различием констант адсорбционного равновесия двух разделяемых компонентов. При увеличении α (от 1 до ~ 5) R S резко возрастает, при дальнейшем увеличении α - меняется мало. Селективность колонки зависит от таких факторов, как химическая структура поверхности сорбента, состав элюента, температура колонки и строение разделяемых соединений. Так как сорбция хроматографируемых веществ в жидкостной хроматографии определяется попарным взаимодействием трех основных компонентов системы - сорбента, разделяемых веществ и элюента, то изменение состава элюента – это удобный способ оптимизации процесса разделения.

Эффективность колонки зависит от размера частиц и структуры пор адсорбента, от равномерности набивки колонки, вязкости элюента и скорости массообмена. Удлинение колонки не всегда приводит к улучшению разделения, так как возрастает сопротивление колонки, увеличивается давление элюента на входе и время проведения опыта, снижается чувствительность и точность анализа из-за уширения пика анализируемого компонента. Если , то пики двух веществ на хроматограмме разделяются практически полностью. С ростом R S увеличивается время разделения. При R S < 1 - разделение неудовлетворительное. В препаративной хроматографии в связи с введением сравнительно больших количеств разделяемых веществ колонка работает с перегрузкой. При этом снижается коэффициент емкости, возрастает высота, эквивалентная теоретической тарелке, что приводит к уменьшению разрешения.

4. Адсорбенты

Хроматографическое разделение смеси будет эффективным, если правильно подобраны адсорбент и растворитель (элюент).

Адсорбент не должен химически взаимодействовать с разделяемыми компонентами, проявлять каталитическое воздействие на растворитель. Также необходимо, чтобы адсорбент обладал избирательностью по отношению к компонентам смеси. Правильно подобранный адсорбент должен иметь максимальную поглотительную способность.

Различают полярные (гидрофильные) и неполярные (гидрофобные) адсорбенты . Следует помнить о том, что адсорбционное сродство полярных веществ к полярным сорбентам значительно выше, чем неполярных.

В качестве адсорбентов применяют оксид алюминия, активированные угли, силикагель, цеолиты, целлюлозу и некоторые минералы.

Оксид алюминия Al2 O3 – амфотерный адсорбент .(рис.) На нем можно разделять смеси веществ в полярных , так и в неполярных растворителях . Нейтральный оксид алюминия используют обычно для хроматографирования из неводных растворов предельных углеводородов, альдегидов, спиртов, фенолов, кетонов и эфиров.

Рис. Оксид алюминия для хроматографии

http://images. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активность Al2O3 зависит от содержания в нем влаги. Самую высокую активность имеет безводный оксид алюминия. Её условно принимают за единицу. При необходимости можно приготовить оксид алюминия с различным содержанием влаги путем смешения свежеприготовленного оксида алюминия с водой (шкала Брокмана).

Зависимость активности оксида алюминия от содержания влаги

Например, для разделения углеводородов применяют Al2O3 с активностью 1,5-2; для разделения спиртов и кетонов – 2-3,5.

Удельная поверхность оксида алюминия 230-380 м2/г.

Силикагель (гидроксилированный или химически модифицированный) – это высушенный желатинообразный диоксид кремния, который получают из пересыщенных растворов кремниевых кислот (n SiO2·m H2O) при pH > 5-6. (рис.) Твёрдый гидрофильный сорбент.

Рис. Силикагель

http://www. silicagel. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Размер частиц силикагеля в аналитических колонках 3-10 мкм, в препаративных - 20-70 мкм. Малый размер частиц увеличивает скорость массообмена и повышает эффективность колонки. Современные аналитические колонки имеют длину 10-25см. Они заполнены силикагелем с размером частиц 5 мкм и позволяют разделить сложные смеси из 20-30 компонентов. При уменьшении размера частиц до 3-5 мкм возрастает эффективность колонки, но и растет ее сопротивление. Так для достижения скорости потока элюента 0,5-2,0 мл/мин требуется давление (1-3)·107Па. Силикагель выдерживает такой перепад давления, гранулы же полимерных сорбентов более эластичны и деформируются. В последнее время разработаны механически прочные полимерные сорбенты макропористой структуры с густой сеткой, которые по своей эффективности приближаются к силикагелям. Форма частиц сорбента размером 10 мкм и выше не оказывает большого влияния на эффективность колонки, однако предпочитают сорбенты сферической формы, которые дают более проницаемую упаковку.(рис.)

Рис. Силикагель сферической формы

http://images. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Внутренняя структура частицы силикагеля представляет собой систему сообщающихся каналов. Для жидкостной хроматографии используют сорбенты с диаметром пор 6-25 нм. Разделение жидкостной хроматографии в проводят, в основном, на силикагелях, модифицированных реакцией алкил - и арилхлорсиланов или алкилэтоксисиланов с силанольными группами поверхности. С помощью таких реакций прививают группы С8Н17-, С18Н37- или С6Н5- (для получения сорбентов с гидрофобизированной поверхностью), нитрильные, гидроксильные группы и др. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Рис. Структура модифицированного силикагеля

Силикагели используют в хроматографии для разделения смесей нефтепродуктов, высших жирных кислот, их сложных эфиров, ароматических аминов, нитропроизводных органических соединений . Силикагель – гидрофильный сорбент , легко смачивается водой. Поэтому его нельзя использовать для сорбции из водных растворов. Активность силикагеля зависит от содержания в нем воды: чем меньше в нем воды, тем больше активность (шкала Брокмана).

Зависимость активности силикагеля от содержания влаги

Удельная поверхность силикагелей равна 500-600 м2/г.

Активированные угли являются формой углерода, который в процессе обработки становится чрезвычайно пористым и приобретает очень большую площадь поверхности, предназначенную для адсорбции или химических реакций.(рис.) Они имеют удельную поверхность 1300-1700 м2/г.

Рис. Активированный уголь

http://e-catalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Основное влияние на структуру пор активированных углей оказывают исходные материалы для их получения. Активированные угли на основе скорлупы кокосов характеризуются большей долей микропор (до 2 нм), на основе каменного угля - большей долей мезопор (2-50 нм). Большая доля макропор характерна для активированных углей на основе древесины (более 50 нм). Микропоры особенно хорошо подходят для адсорбции молекул небольшого размера, а мезопоры - для адсорбции более крупных органических молекул.

Цеолиты (молекулярные сита) – пористые кристаллические алюмосиликаты щелочных и щелочноземельных металлов природного и синтетического происхождения. (рис.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Рис. Цеолиты

http://www. zeolite. spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/thumb. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Известны четыре типа цеолитов (A, X, Y, M), имеющие различную кристаллическую структуру. В зависимости от катиона цеолиты обозначают следующим образом: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Особенностью цеолитов является то, что поры кристаллов имеют размеры порядка 0,4-1 нм, соизмеримые с размерами молекул многих жидких или газообразных веществ. Если молекулы вещества способны проникать в эти поры, то происходит адсорбция в порах кристаллов цеолитов. Более крупные молекулы вещества не адсорбируются. Подбирая цеолиты с разными размерами пор, можно четко разделить смеси различных веществ.

Удельная поверхность цеолитов 750-800 м2/г.

При выборе адсорбента необходимо учитывать строение веществ и их растворимость. Например, предельные углеводороды адсорбируются плохо, а непредельные (имеют двойные связи) – лучше. Функциональные группы усиливают способность вещества к адсорбции.

5. Элюенты

При выборе растворителя (элюента) нужно учитывать природу адсорбента и свойства веществ в разделяемой смеси. Элюенты должны хорошо растворять все компоненты хроматографируемой смеси, обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевыми, нетоксичными, инертными, совместимыми с методами детектирования (например, с УФ детектором нельзя использовать в качестве элюента бензол).

В нормально-фазной хроматографии обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств хлороформа СНСl3, изо-пропанола изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира; в обращенно-фазной хроматографии - смесь воды с ацетонитрилом CH3CN, метанолом СН3ОН, этанолом С2Н5ОН, диоксаном, тетрагидрофуран, диметилформамид. Для выделения отдельных компонентов смеси, разделившихся при хроматографировании, часто проводят их последовательное вымывание (элюирование). С этой целью применяют растворители с различной десорбционной способностью. Растворители располагают в порядке убывания десорбирующей способности в полярных адсорбентах – элюотропный ряд Траппе . Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k" (коэффициент емкости колонки по отношению к данному компоненту), то хроматографируют одним элюентом. Если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы.

Элюотропный ряд растворителей

6. Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем до хроматографов высокого класса.
Современный жидкостной хроматограф включает: емкости для элюентов, насосы высокого давления, дозатор, хроматографическую колонку, детектор, регистрирующий прибор, систему управления и математические обработки результатов.

На рис. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Рис. Схема жидкостного хроматографа: 1- резервуар для подвижной фазы, 2- насос, 3- инжектор, 4- колонка, 5- термостат, 6- детекторы, 7- регистрирующая система,8- компьютер.

Резервуар для подвижной фазы, должен иметь достаточную для проведения анализа вместимость и устройство для дегазации растворителя , чтобы исключить образование в колонке и детекторе пузырьков растворенных в элюенте газов.

Насос предназначен для создания постоянного потока растворителя . Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используют насосы плунжерного (шприцевого) типа. Недостатком их является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа применяют недорогие перистальтические насосы. Элюенты поступают в насос через фильтр, задерживающий пылевые частицы (больше 0,2 мкм). Иногда через элюенты пропускают небольшой ток гелия для удаления растворенного воздуха и предотвращения образования пузырьков в детекторе (особенно в случае водных и полярных элюентов). В аналитических хроматографах для подачи элюента в колонку используют поршневые насосы с системой обратной связи, позволяющие сглаживать пульсацию потока в пределах 1-2% и обеспечивать объемные скорости от 0,1 до 25 мл/мин при давлении до ~ 3.107 Па. В микроколоночной хроматографии объемные скорости потока элюента значительно ниже - 10-1000 мкл/мин. В случае градиентного элюирования используют несколько насосов, которые управляются программатором и подают в камеру смешения 2-3 компонента элюента, оставляя постоянной общую скорость потока. Для введения пробы в колонку, находящуюся под большим давлением, без остановки потока используют специальные микродозирующие краны, связанные с петлей известного объема для исследуемой пробы раствора. Разработаны дозировочные системы с автоматическим отбором и вводом пробы с помощью микродозирующих кранов или шприцов.

Инжектор обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки для ВЭЖХ изготовляют чаще всего из нержавеющей стальной полированной трубки длиной 10-25см и внутренним диаметром 3-5мм.

Рис. Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии

Используют также стеклянные колонки , помещенные в металлический кожух; в микроколоночной хроматографии - набивные металлические колонки с внутренним диаметром 1,0-1,5мм, набивные стеклянные микроколонки диаметром 70-150 мкм и полые капиллярные колонки диаметром 10-100 мкм; в препаративной хроматографии - колонки диаметром от 2 до 10см и более. Для равномерного и плотного заполнения колонок сорбентом используют суспензионный метод набивки. Суспензию готовят из сорбента и подходящей органической жидкости, которая подается под давлением до 5·107 Па в колонку. Для определения выходящих из колонки разделенных компонентов используют детекторы . Постоянство температуры обеспечивается термостатом .

Детекторы для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Они должны быть очень чувствительными. Для увеличения чувствительности детектора иногда применяют дериватизацию компонентов смеси после колонки. Для этого с потоком элюента вводят такие реагенты, которые, взаимодействуя с разделенными веществами, образуют производные с более выраженными свойствами, например, сильнее поглощают в УФ или видимой области спектра или обладают большей флуоресцирующей способностью. Иногда дериватизацию проводят до хроматографического анализа и разделяют производные, а не исходные вещества. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры , измеряющие показатель преломления , и спектрофотометрические детекторы , определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров ) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения , которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Дифференциал" href="/text/category/differentcial/" rel="bookmark">дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора , позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса , соединяющий хроматограф с персональным компьютером , который осуществляет не только сбор и обработку информации , но и управляет прибором, рассчитывает количественные характеристики и, в некоторых случаях, качественный состав смесей. Микропроцессор обеспечивает автоматический ввод пробы , изменение по заданной программе состава элюента при градиентном элюировании, поддержание температуры колонки .

Bruker". Рис. Жидкостный хроматограф Jasco

Вопросы для самопроверки

Что такое жидкостная хроматография? Назовите её виды, области применения. Перечислите о сновные хроматографические величины и их определение Какие виды жидкостной хроматографии существуют в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ? Какие виды хроматографии существуют в зависимости от способа перемещения вещества? Какие вещества используют в качестве адсорбентов? Чем они отличаются? Что служит жидкой подвижной фазой - элюентом? Требования к растворителям. В чем отличие распределительной хроматографии от адсорбционной хроматографии? Перечислите основные части схемы жидкостного хроматографа, их назначение.

Список использованной литературы

1 « Жидкостная хроматография в медицине »

Http://journal. issep. rssi. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 « Ознакомление с методами высокоэффективной жидкостной хроматографии »

Http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 « Жидкостная хроматография »

Http://e-science. ru/index/?id=1540

4 « Хроматография »

Http://belchem. narod. ru/chromatography1.html