Твердофазный синтез или твердофазная технология, которую часто называют керамической, являются наиболее распространенными при получении неорганических материалов для различных отраслей науки и промышленности. К ним относятся ядерное топливо, материалы для космической техники, радиоэлектроники, приборостроения, катализаторы, огнеупоры, высокотемпературные сверхпроводники, полупроводники, сегнето- и пьезоэлектрики, магнетики, различные композиты и многие другие .

В основе твердофазного синтеза лежат химические реакции, в которых, по крайней мере, хотя бы один из реагентов находится в виде твердого вещества. Такие реакции называются гетерогенными или твердофазными. Твердофазное взаимодействие, в отличие от реакций в жидкой или газовой среде, складывается из двух фундаментальных процессов: из самой химической реакции и переноса вещества к реакционной зоне.

Твердофазные реакции с участием кристаллических компонентов характеризуются ограниченной подвижностью их атомов или ионов и сложной зависимостью от многих факторов. К ним относятся такие, как химическая структура и связанная с ней реакционная способность реагирующих твердых веществ, природа и концентрация дефектов, состояние поверхности и морфология реакционной зоны, площадь контакта взаимодействующих реагентов, предварительная механохимическая активация и ряд других. Все отмеченное обусловливает сложность механизмов гетерогенных реакций. Изучение гетерогенных реакций основывается на химии твердого тела, химической физике и физической химии поверхности твердых тел, на законах термодинамики и кинетики .

Нередко о механизме твердофазных реакций судят лишь на основании того, что экспериментальные данные о степени взаимодействия как функции времени описываются лучше всего какой - либо конкретной кинетической моделью и соответствующим уравнением кинетики. Такой подход может привести к неверным выводам.

Процессы в твердофазных материалах имеют ряд важных отличий от процессов в жидкостях или газах. Эти отличия связаны, прежде всего, с существенно (на несколько порядков) более низкой скоростью диффузии в твердых телах, что препятствует усреднению концентрации компонентов в системе и, таким образом, приводит к пространственной локализации протекающих процессов. Пространственная локализация в свою очередь приводит к тому, что в наблюдаемую кинетику процессов вносит вклад как удельная скорость процесса (или коэффициент диффузии), так и геометрия реакционной зоны. Такие определяемые геометрическими факторами особенности твердофазных процессов называют топохимическими. Кроме того, поскольку обсуждаемые превращения пространственно локализованы, их скорость может определяться как собственно процессами на границе раздела фаз (реакционный контроль), так и скоростью подвода к этой границе какого-либо из компонентов или отвода продукта(ов) (диффузионный контроль). Эти случаи для простых систем, для которых выполняются модельные предположения, могут быть идентифицированы в эксперименте по виду временной зависимости степени превращения. Еще одна особенность фазовых превращений в твердых телах связана с тем, что образование зародыша новой фазы в твердой матрице вызывает появление в последней упругих напряжений, энергия которых в ряде случаев должна учитываться при рассмотрении термодинамики этих превращений.

Большое число факторов, влияющих на кинетику твердофазных процессов и микроструктуру получаемых при этом материалов, определяет и множественность типов классификации этих процессов. Так, рассматривая устойчивость системы по отношению к флуктуациям различного типа, выделяют гетерогенные (в случае систем, устойчивых к малым по занимаемому объему флуктуациям и неустойчивых к большим) и гомогенные (в случае систем, неустойчивых к малым флуктуациям) процессы. Для гетерогенных процессов в качестве примера можно привести превращения, идущие по механизму образования и роста зародышей, для гомогенных -- некоторые переходы порядок--беспорядок и спинодальный распад твердых растворов.

От гетерогенных и гомогенных процессов необходимо отличать гетерогенное и гомогенное зародышеобразование в случае гетерогенных процессов. Гетерогенным зародышеобразованием называют образование зародышей на дефектах структуры (включая точечные дефекты дислокации и границы раздела фаз); гомогенным зародышеобразованием -- образование зародышей в бездефектном объеме твердой фазы.

Анализируя продукт твердофазного превращения, различают однофазные и многофазные зародыши. В случае многофазных зародышей продуктом процесса оказывается многофазная колония с характерной микроструктурой, определяемой поверхностной энергией границы образующихся фаз; процессы данного типа называют прерывистыми в отличие от непрерывных в случае образования и роста однофазных зародышей.

Еще один способ классификации твердофазных превращений основан на сопоставлении состава исходной фазы и состава продукта реакции. В случае их совпадения говорят о бездиффузионных процессах, а при изменении состава -- о диффузионных. Причем из бездиффузионных полезно выделить кооперативные процессы (например, мартенситное превращение), происходящие путем одновременного незначительного перемещения атомов в большом объеме исходной фазы.

Бездиффузионные фазовые превращения могут различаться по типу изменяющихся в ходе процесса их термодинамических характеристик.

Превращениями первого рода называют процессы, при которых происходит изменение производных химического потенциала по температуре или давлению. Отсюда следует скачкообразное изменение при фазовом переходе таких термодинамических параметров, как энтропия, объем, энтальпия, внутренняя энергия. При превращениях второго рода первые производные химического потенциала по интенсивным параметрам не меняются, но изменяются производные более высоких порядков (начиная со второго). В этих процессах при непрерывных энтропии и объеме системы происходит скачкообразное изменение величин, выражаемых через вторые производные энергии Гиббса: теплоемкости, коэффициента теплового расширения, сжимаемости и т.д.

Твердофазные реакции между двумя фазами (контакты между тремя или более фазами маловероятны, а соответствующие процессы могут быть представлены как комбинации нескольких двухфазных реакций) относятся к диффузионным процессам и могут быть как гетерогенными, так и гомогенными, как с гетерогенным, так и с гомогенным зародышеобразованием. Гомогенные процессы и процессы с гомогенным зародышеобразованием при таких реакциях возможны, например, в случае образования метастабильного твердого раствора с последующим его распадом (так называемые внутренние реакции). Примером таких процессов может быть внутреннее окисление.

Условием термодинамического равновесия при твердофазном превращении, как и при любом другом химическом превращении, является равенство химических потенциалов компонентов в исходных веществах и продуктах реакции. При взаимодействии двух твердых фаз указанное равенство химических потенциалов может реализовываться разными способами: 1) перераспределение компонентов в исходных фазах с образованием твердых растворов; 2) образование новых фаз с другой кристаллической структурой (что, собственно, обычно и называют твердофазной реакцией), причем поскольку химический потенциал компонента в различных фазах многофазной системы не зависит от количества каждой фазы, равновесие может быть достигнуто только при полном превращении исходных фаз . Наиболее достоверные сведения о механизме твердофазных реакций получают при комплексном использовании, позволяющим одновременно наблюдать несколько параметров реагирующей системы, включая фазовый состав, тепловые эффекты, изменение массы и другое.

Термодинамическая теория твердофазных реакций была предложена Вагнером, а в дальнейшем развита Шмальцридом на примере реакций присоединения.

К настоящему времени нет единой классификации большого разнообразия гетерогенных реакций. Связано это с трудностью выбора критерия в качестве основы такой универсальной классификации. По химическим критериям реакции подразделяются на реакции окисления, восстановления, разложения, соединения, обмена и т. д. Наряду с указанным критерием широко используется в качестве основного критерий физического состояния реагентов :

Характерной чертой всех гетерогенных реакций является существование и локализация на границе раздела фаз реакционной зоны. Реакционная зона, как правило, малой толщины разделяет две области пространства, занятые веществами различного состава и с различными свойствами. Причины образования реакционной зоны обычно делятся на две группы: относительная медленность процессов диффузии и химические причины. Последняя группа обусловлена большой реакционной способностью находящихся на поверхности твердого реагента или на поверхности раздела двух имеющихся фаз атомов или молекул. Известно, что поверхность твердого или жидкого вещества обладает свойствами, отличными от объемных свойств компактного образца. Это делает свойства поверхности раздела фаз специфичными. Именно здесь происходит существенная перестройка кристаллической упаковки, снижаются напряжения между двумя кристаллическими решетками, происходит изменение химического состава.

Так как массоперенос осуществляется путем диффузии, а диффузионная подвижность частиц твердого тела зависит от дефектности его структуры, можно ожидать существенного влияния дефектов на механизм и кинетику твердофазных реакций. Эта стадия предшествует химической стадии превращения реагирующих веществ на межфазной поверхности раздела. Таким образом, кинетика гетерогенных реакций определяется как характером протекания самой химической реакции, так и способом доставки вещества в реакционную зону. В соответствии с отмеченным скорость реакций будет лимитироваться химической стадией (химическая кинетика) или диффузией (диффузионная кинетика). Такое явление и наблюдается в действительности.

По Вагнеру диффузия и, следовательно, реакция в твердых телах осуществляется главным образом за счет подвижности ионов и электронов, обусловленной неравновесным состоянием решетки. Различные ионы решетки перемещаются в ней с разной скоростью. В частности, подвижность анионов в подавляющем большинстве случаев ничтожно мала по сравнению с подвижностью катионов. Поэтому диффузия и соответственно реакция в твердых телах осуществляется за счет перемещения катионов. При этом диффузия разноименных катионов может идти в одном направлении или навстречу друг другу. При разнозарядных катионах электронейтральность системы сохраняется за счет движения электронов. За счет различия в скоростях перемещения разнозарядных катионов в системе возникает электрический потенциал. В результате скорость перемещения более подвижных ионов уменьшается и, наоборот, для менее подвижных? увеличивается. Таким образом, возникающий электрический потенциал регулирует скорости диффузии ионов. Последняя и определяемая ею скорость всего процесса твердофазного превращения может быть рассчитана на основе электронной проводимости и чисел переноса. Очевидно, что направленная диффузия ионов возможна лишь в электрическом поле или при наличии градиента концентрации в системе.

При синтезе веществ в твердом состоянии часто оказывается необходимым контролировать не только химический (элементный и фазовый) состав получаемого продукта, но и его микроструктурную организацию. Это связано с сильной зависимостью как химических (например, активности в твердофазных реакциях), так и многих физических (магнитных, электрических, оптических и т.д.) свойств от характеристик структурной организации твердого тела на различных иерархических уровнях. К первому из таких уровней можно отнести элементный состав твердого тела и способ взаимного расположения атомов элементов в пространстве - кристаллическую структуру (или особенности ближайшего координационного окружения атомов в аморфных твердых телах), а также состав и концентрацию точечных дефектов. В качестве следующего уровня структуры твердого тела может быть рассмотрено распределение в кристалле протяженных дефектов, определяющее размеры областей, в которых (с поправкой на существование точечных дефектов) наблюдается трансляционная симметрия в расположении атомов. Такие области могут считаться совершенными микрокристаллами и называются областями когерентного рассеяния. Говоря об областях когерентного рассеяния, необходимо помнить, что в общем случае они не эквивалентны образующим твердофазный материал компактным частицам, которые могут содержать значительное количество протяженных дефектов, а следовательно, и областей когерентного рассеяния. Совпадение областей когерентного рассеяния с частицами (которые в этом случае называют однодоменными) обычно наблюдается лишь для достаточно малых (менее 100 нм) размеров последних. Последующие структурные уровни могут быть связаны с формой и распределением по размерам образующих порошкообразный или керамический материал частиц, их агрегацией, агрегацией первичных агрегатов и т.д.

Различные области применения твердофазных материалов предъявляют разные, часто противоположные требования к перечисленным выше структурным характеристикам и, следовательно, требуют применения разных синтетических методов . Поэтому правильнее говорить о методах синтеза не твердофазных веществ, а твердофазных материалов и в каждом случае выбирать метод синтеза с учетом области последующего применения получаемого продукта.

В общем случае методы синтеза твердофазных материалов могут быть классифицированы по удалению от термодинамически равновесных условий протекания используемых химических процессов. В соответствии с общими закономерностями, при условиях, отвечающих состоянию, максимально удаленному от равновесного, наблюдается значительное превышение скорости зародышеобразования над скоростью роста образовавшихся зародышей, что, очевидно, приводит к получению максимально дисперсного продукта. В случае же проведения процесса вблизи термодинамического равновесия рост уже образовавшихся зародышей происходит быстрее образования новых, что в свою очередь позволяет получать крупнокристаллические (в предельном случае -- монокристаллические) материалы. Скоростью роста кристаллов в значительной степени определяется и концентрация в них протяженных (неравновесных) дефектов.

Комбинаторный синтез можно проводить не только в растворе (жидкофазный синтез), но и на поверхности твёрдой химически инертной фазы. В этом случае первое исходное вещество химически „пришивают“ к функциональным группам на поверхности полимерного носителя (чаще всего используют сложноэфирную или амидную связь) и обрабатывают раствором второго исходного вещества, которое берётся в значительном избытке, чтобы реакция прошла до конца. В такой форме реакции есть определённое удобство, поскольку облегчается техника выделения продуктов: полимер (обычно в виде гранул) просто отфильтровывают, тщательно промывают от остатков второго реагента и химически отщепляют от него целевое соединение.

В органической химии нет ни одной реакции, обеспечивающей на практике количественные выходы целевых продуктов в любом случае. Единственное исключение составляет, по-видимому, полное сжигание органических веществ в кислороде при высокой температуре до СО 2 и Н 2 О. Поэтому очистка целевого продукта всегда является непременной, а часто самой сложной и трудоемкой задачей. Особенно сложной задачей является выделение продуктов пептидного синтеза, например, разделение сложной смеси полипептидов. Поэтому именно в пептидном синтезе наибольшее распространение получил метод синтеза на твердой полимерной подложке, разработанный в начале 60-х годов ХХ века Р.Б.Мерифилдом.

Полимерный носитель в методе Меррифилда – это гранулированный сшитый полистирол, содержащий хлорметильные группы в бензольных ядрах, которые являются линкерами, связывающими подложку с первым аминокислотным остатком полипептида. Эти группы превращают полимер в функциональный аналог бензилхлорида и сообщают ему способность легко образовывать сложноэфирные связи при реакции с карбоксилат-анионами. Конденсация такой смолы с N-защищенными аминокислотами ведет к образованию соответствующих бензиловых эфиров. Удаление N-защиты из дает С-защищенное производное первой аминокислоты, ковалентно связанное с полимером. Аминоацилирование освобожденной аминогруппы N-защищенным производным второй аминокислоты с последующим удалением N-защиты приводит к аналогичному производному дипептида также привязанному к полимеру:

Такой двухстадийный цикл (удаление защиты - аминоацилирование) может быть, в принципе, повторен столько раз, сколько требуется для наращивания полипептидной цепи заданной длины.

Дальнейшее развитие идей Мерифильда было направлено, прежде всего, на поиск и создание новых полимерных материалов для подложек, разработку методов разделения продуктов и создания автоматизированных установок для всего цикла полипептидного синтеза

Эффективность метода Мерифилда была продемонстрирована успешным синтезом целого ряда природных полипептидов, в частности инсулина. Особенно наглядно его преимущества были продемонстрированы на примере синтеза фермента рибонуклеазы. Так, например, ценой значительных усилий, в течение нескольких лет, Хиршмен с 22 сотрудниками выполнили синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помощью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза. Во втором случае синтез, включающий всего 11 931 различных операций, в том числе и 369 химических реакций, был выполнен двумя участниками (Гатте и Меррифильдом) всего за несколько месяцев.

Идеи Меррифильда послужили основой для создания различных методов комбинаторного синтеза библиотек полипептидов различного строения.

Так в 1982 году была предложена оригинальная стратегия многостадийного параллельного синтеза пептидов на твёрдой фазе известная как „сплит-метод“ (split - расщепление, разделение) или метод “смешай и раздели” (рис. 3). Суть ее состоит в следующем. Допустим, что из трёх аминокислот (А, В и С) нужно получить все возможные комбинации трипептидов. Для этого гранулы твёрдого полимерного носителя (Р) разделяют на три равные порции и обрабатывают их раствором одной из аминокислот. При этом все аминокислоты химически связываются с поверхностью полимера одной из своих функциональных групп. Полученные полимеры трёх сортов тщательно смешивают, и смесь опять разделяют на три части. Затем каждую часть, содержащую все три аминокислоты в одинаковых количествах, вновь обрабатывают одной из тех же трёх аминокислот и получают девять дипептидов (три смеси по три продукта). Ещё одно смешение, разделение на три равные части и обработка аминокислотами дают искомые 27 трипептидов (три смеси по девять продуктов) всего через девять стадий, тогда как получение их по отдельности потребовало бы синтеза из 27×3 = 81 стадий.

«Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013 ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ Г.С. ЧАИЛЯН Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА...»

Экспериментальные и теоретические статьи

Experimental and theoretical articles

Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА,

ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

Г.С. ЧАИЛЯН

Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА

[email protected].

В целях продолжения исследований акад. Галояна, нами был проведен ряд экспериментов по выделению, очистке и определению биологической направленности нововыделенных соединений пептидной природы из предсердий и ушковых частей сердца свиньи. Для проведения биотестов требовалось получить препаративные количества исследуемых образцов. Для этого мы воспользовались методикой твердофазного синтеза пептидов с ее дальнейшей модификацией. Чистота и идентичность синтезированных препаратов проверялись методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрального анализа.

Твердофазный синтез – fmoc-аминокислоты – ВЭЖХ – фенилизотиоцианат – масс-спектральный анализ:

fmoc- – – For further studies established by Galoyan, a series of experiments on the isolation, purification and determination of biological direction of peptides isolated from pigs atria were carried out. For fulfilling the biotests the preparative amount of samples was required. A modified method of solid phase peptide synthesis was used. The synthesized peptide purity and identity were defined by HPLC and mass-spectral analysis.

Solid phase synthesis – high performance liquid chromatography – mass spectrometry – fmoc-aminoacids – cardiopeptides – atria В течение многих лет в Институте биохимии НАН РА в отделе биохимии нейрогормонов акад. Галояном с сотрудниками изучались пути регуляции и механизмы действия гипоталамических нейрогормонов на различные процессы в организме .

Подтверждение идеи о взаимосвязанном, взаимообусловленном, цельном функционировании такой системы, как гипоталамус – гипофиз – надпочечники, явилось переломным моментом в эндокринологии. Пополнение же этой концепТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ туальной триады, выдвинутой Галояном относительно взаимодействия гипоталамус - гипофиз

– сердце, является огромным научным достижением. Впоследствии была обнаружена новая ткань-мишень-сердце, показана способность этого органа управлять функционированием специфических пептидов, а также существование механизма обратной связи между гипоталамусом и сердцем посредством этих пептидов.

Обнаружение кардиоактивных соединений – нейрогормона К, С, G и ряд других в гипоталамусе различных животных послужило началом работ не только по изучению молекулярных механизмов действия этих нейрогормонов, но и по поиску подобных соединений в сердце . Основанием для всестороннего исследования биохимических и физико-химических свойств кардиоактивных начал послужили данные о наличии 2-х кардиоактивных соединений в сердечной мышце . Было установлено участие нейрогормона “С” в регуляции гликолитических процессов и уровня циклических нуклеотидов посредством ингибирования ФДЭ цАМР, цАМФ- зависимой протеинкиназы и т.д. Было показано, что это соединение является низкомолекулярным и относится к гликопептидам .

Нами в лаборатории аналитической хроматографии и пептидного синтеза была проведена работа по выделению и очистке соединений пептидной природы из предсердий и ушковых зон сердца свиньи . При разделении пептидных фракций препаративной ВЭЖХ, нами были выделены и очищены до гомогенного состояния 20 соединений пептидной природы . Для определения биологической направленности все препараты были тестированы на изменения компонентов ЭКГ у крыс . Результаты экспериментов показали, что 7 соединений имеют разносторонние факторы влияния на определенные компоненты ЭКГ.

Пептид №7 показал наибольшую активность на изменение амплитуды компонента R, длительности комплекса QRS, амплитуды S и других параметров.

Для изучения биологических механизмов действия данного препарата стало необходимо наличие большого количества исследуемого образца. Ввиду того, что процесс выделения и очистки биопрепаратов является крайне неэффективным, трудоемким, времязатратным и не может обеспечивать хорошей воспроизводимости, стало крайне актуальным проведение химического синтеза данного препарата. Анализируя мировую литературу в области химического синтеза пептидов, мы пришли к выводу, что наиболее оптимальным для нас является методика твердофазного синтеза с использованием fmoc-защищенных аминокислот. Открытый в 1984 году твердофазный синтез пептидов (Solid phase peptide synthesis) имеет много преимуществ по сравнению с обычным синтезом с точки зрения эффективности, а также удобной обработки и очистки .

С использованием несколько различных методик: гидролиза данного препарата, модифицирования аминокислот фенилизотиоцианатом, нами был получен аминокислотный состав пептида №7. Используя данные масс-спектрального и ЯМР-анализов, эдмоновской деградации, нам удалось получить не только аминокислотный состав, но также аминокислотную последовательность пептида №7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Эффективный процесс твердофазного синтеза во многом зависит от правильного выбора различных условий его проведения, таких как выбор смолы, растворителя и кинетики проведения синтеза . Эти переменные влияют на степень набухания смолы и связи ее с аминокислотами, количеству связывающих сайтов, что в конечном итоге влияет на синтез пептида в целом. Мы приспособи-ли процесс твердофазного синтеза по отношению к нашим исследуемым пептидам с учетом особенностей их аминокислотной последовательности.

Г.С. ЧАИЛЯН Материал и методика. Все использованные реактивы, растворители, смолы фирмы “Advanced Chem Techcompany”. Мы использовали fmoc-группы для защиты N-концов аминокислот в процессе синтеза и диметилформамид (DMF) как растворитель в процессе всего синтеза. В качестве подложки мы использовали кислотолабильную 2-хлортритильную смолу. Снятие защитных fmoc-групп проводилось с помощью раствора пиперидина в DMF.

Очень важным в процессе синтеза является посадка первой аминокислоты на смолу. Два грамма 2Cl-Trt-й смолы насыпали в шприц объемом 10 мл. Набирали DMF в шприц, давали набухнуть смоле в течение 15 мин. После этого DMF вымывался. Затем в шприц набирался раствор первой аминокислоты (fmoc-Pro) и активатор реакции (DIPEA) в соотношении 1СМОЛА/1,2FMOC-PRO/4DIPEA. Реакция посадки первой аминокислоты шла 3 ч. Очень важным условием проведения синтеза является отсутствие свободных линкеров после посадки первой аминокислоты, поэтому смолу после связывания с первой аминокислотой обрабатывали смесью метилена, DIPEA (диизопроилэтиламин) и DMF в соотношении 80DMF/15MEOH/5DIPEA для блокирования возможно оставшихся свободных концов. После этого промывали смолу DMF 5 раз по 5 мин. Затем проводили деблокирование аминокислот 30%-ным раствором пипередина в DMF 8 раз по 5 мин. После этого смолу промывали DMF 5 раз по 5 мин. Этот цикл повторялся в течение всего синтеза пептида. После каждого шага присоединения и деблокирования аминокислот контроль хода реакции проверялся Кайзер тестом, что представляет собой реакцию нингидрина со свободной аминогруппой с образованием характерного темно-синего цвета. Благодаря этому тесту, стал возможным пошаговый контроль реакций посадки и деблокирования аминокислот.

Очистка и контроль синтезированного пептида № 7 были проведены на 2-х компонентной препаративной системе ВЭЖХ фирмы Waters (USA). Для ввода образца использовался инжектор Rheodyne с объемом петли 500 мкл. Детектирование проводилось в диапазоне 190-360 нм. Мы использовали колонку “Symmetry Si-100 C18” (4,6х250 mm) для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Скорость потока была 50 мл/мин. Использовалась градиентная система элюента H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1). Время анализа 15 мин. Рехроматографию проводили на аналитической системе Knauer HPLC. Использовалась колонка XbridgeC18 (2.6x150 mm). Детектирование проводили при 214 нм.

Для подтверждения полученных данных синтезированный препарат был подвергнут массспектральному анализу на CSU "Analitycal spectrometry”.

Результаты и обсуждение. Данные, полученные на хроматограмме, позволяют утверждать, что чистота синтезированного пептида №7 после очистки составляет более 99,6% (pис.1).

–  –  –

Нами был проведен сравнительный хроматографический анализ нативного пептида №7 на колонке X-bridgeC18 в тех же условиях, что и его синтезированный аналог. Результаты сравнения представлены (pис. 2).

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

–  –  –

Рис. 4. Спектрограммы синтезированного (А) и нативного (В) препаратов.

Г.С. ЧАИЛЯН Как видно из сравнения хроматограмм, синтезированный аналог и нативный пептид № 7 одинаковы по массе и времени выхода, что говорит об идентичности их структур и аминокислотной последовательности. Таким образом, используя метод твердофазного синтеза пептидов и учитывая особенности строения исследуемого пептида, нам удалось получить гомогенный и идентичный нативному пептид, состоящий из 9 аминокислот. В дальнейшем, имея достаточное количество препарата, мы планируем провести ряд биотестов по выявлению не только путей регуляции сердечной деятельности этим пептидом, но также механизмов действия на другие органы и системы.

ЛИТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапионян Р.М., Галоян А.А. Обнаружение и идентификация в сердце быка новых 1.

кардиоактивных белков. Вопр. мед. химии, 37, 2, с. 56-58, 1991.

Срапионян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Выделение и характеристика 2.

кардиоактивного триптического фрагмента белка-носителя нейрогормона “С”. Нейрохимия, 2, 3, с. 263-271, 1983.

Срапионян, Р.М. Мисирян, С.С. Разделение низкомолекулярных коронароактивных соединений 3.

сердечной мышцы сочетанием методов гелевой фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле. Биолог. журн. Армении, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапионян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Распределение кардиоактивных белковых комплексов в сердце различных животных. Биолог. журн. Армении, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biochemistry of Novel Cardioactive Hormones and Immunomodulators of the Functional System Neurosecretory Hypothalamus, Endocrine Heart. Nauka Publ. p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. The purification of coronarodilatory proteins isolated from the hypothalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J.,Smith M. March’s advanced organic chemistry. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133, 2007.

–  –  –

Похожие работы:

« СООБЩЕСТВ ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА» Москва 1979 УДК 581.55:56.017 Плот н и к о·в В. В. Эволюция структуры растительных сообществ. М.: Наука, с. 1979, 276 На современной мет...»

«Известия Музейного Фонда им. А.А.Браунера №2 Том I 2004 Известия Музейного Фонда им. А. А. Браунера Том I № 2 2004 Научный журнал Основан в декабре 2003 г. Выходит 4 раза в год Свидетельство о государственной регистрации ОД № 913 от 13.12.2003 г. Учредитель и изда...»

Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D- -Nal--Thr-NH 2 , в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола. 10 з.п. ф-лы.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу приготовления пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту.

Предшествующий уровень техники

Твердофазный синтез пептидов был введен в 1963 г. с целью преодолеть многие из проблем промежуточных стадий очистки, связанных с синтезом пептидов в растворе (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). При твердофазном синтезе аминокислоты собираются (например, соединяются) в пептид любой необходимой последовательности, в то время как один конец цепи (например, С-конец) закреплен на нерастворимом носителе. Как только на носителе (подложке) собрана нужная последовательность, пептид после этого деблокируют (то есть отщепляют) с носителя. Двумя стандартными защитными группами для -аминогрупп соединяемых аминокислот являются Вос, которую удаляют сильной кислотой, и Fmoc, которую удаляют основанием. Настоящее изобретение относится к удобному способу производства пептидов с использованием комбинации обеих этих защит для -аминогрупп в одном синтезе на недорогой смоле из хлорметилированного полистирола.

При разработке синтеза пептидов твердофазным способом с использованием любой из указанных выше схем защиты -аминогрупп важно, чтобы любые реакционно-способные «боковые группы» составляющих пептид аминокислот были в ходе сборки цепи защищены от нежелательных химических реакций. Желательно также, чтобы выбранные для защиты различных боковых групп химические группы не удалялись реагентами, используемыми для снятия защиты с -аминогрупп. В-третьих, важно, чтобы связь растущей пептидной цепи с частицей смолы была устойчива к действию реагентов, используемых в процессе сборки цепи для удаления любых типов защиты -аминогрупп. В случае схемы защиты -аминогрупп с использованием Fmoc, защита боковых групп должна быть устойчива в действию щелочных реагентов, используемых для удаления Fmoc. На практике эти защитные группы для боковых цепей обычно удаляют слабо кислотными реагентами после завершения сборки пептидной цепи. Если используется схема защиты -аминогрупп с использованием Вос, защита боковых групп должна быть устойчива в действию слабо кислотного реагента, используемого для снятия группы Вос в каждом цикле. На практике эти защитные группы для боковых цепей в схеме защиты -аминогрупп с помощью Вос обычно удаляют безводным HF после завершения сборки пептидной цепи. Таким образом, на практике повсеместно используемые для защиты боковых цепей группы в схеме с защитой -аминогрупп с помощью Fmoc нестабильны в условиях, используемых для снятия с -аминогрупп защитных групп Вос. Поэтому два типа схем защиты -аминогрупп при сборке пептидной цепи в твердофазном синтезе пептидов не объединяют. Кроме того, хотя применяемую в пептидном синтезе наиболее дешевую полимерную смолу (хлорметилированный полистирол или «смола Мерифилда») широко используют вместе с аминокислотами, защищенными группами Вос, в литературе сделан вывод, что она неприменима в случае защиты -аминогрупп группами Fmoc из-за ее нестабильности в щелочных условиях (см. Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2 nd ed., 1984). Настоящее изобретение нацелено на способ совместного использования в ходе твердофазного синтеза некоторых пептидов и Вос-защищенных, и Fmoc-защищенных аминокислот на смоле Мерифилда.

Известно, что Lanreotide®, который является аналогом соматостатина, ингибирует высвобождение гормона роста, а также ингибирует секрецию инсулина, глюкагона и экзокринную панкреатическую секрецию.

Патент США № 4853371 раскрывает и заявляет Lanreotide®, способ его получения и способ ингибирования секреции гормона роста, инсулина, глюкагона и экзокринной панкреатической секреции.

Патент США № 5147856 раскрывает применение Lanreotide® для лечения рестеноза.

Патент США № 5411943 раскрывает применение Lanreotide® для лечения гепатомы.

Патент США № 5073541 раскрывает применение Lanreotide® для лечения рака легких.

Заявка на патент США № 08/089410, зарегистрированная 9 июля 1993 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения меланомы.

Патент США № 5504069 раскрывает применение Lanreotide® для ингибирования ускоренного роста твердой опухоли.

Заявка на патент США № 08/854941, зарегистрированная 13 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для снижения веса тела.

Заявка на патент США № 08/854943, зарегистрированная 13 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения устойчивости к инсулину и синдрома X.

Патент США № 5688418 раскрывает применение Lanreotide® для продления жизнеспособности панкреатических клеток.

Заявка РСТ № PCT/US 97/14154 раскрывает применение Lanreotide® для лечения фиброза.

Заявка на патент США № 08/855311, зарегистрированная 13 мая 1997 г, раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперлипидемии.

Заявка на патент США № 08/440061, зарегистрированная 12 мая 1995 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперамилинемии.

Заявка на патент США № 08/852221, зарегистрированная 7 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперпролактинемии и пролактином.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ приготовления пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту, причем указанный способ включает следующие этапы:

(а) прикрепление первой аминокислоты к твердому носителю - смоле - эфирной связью с образованием продукта первого присоединения, что включает (i) проведение реакции водного раствора карбоната цезия со спиртовым раствором первой аминокислоты с образованием цезиевой соли первой аминокислоты, (ii) получение свободной от растворителя цезиевой соли первой аминокислоты, (iii) проведение реакции твердого носителя смолы с цезиевой солью первой аминокислоты в сухом (безводном) полярном апротонном растворителе с образованием продукта первого присоединения,

где первая аминокислота соответствует С-концевой аминокислоте пептида, аминогруппа небоковой (основной) цепи первой аминокислоты блокирована Воc, и первая аминокислота не имеет в боковой цепи функциональной группы, для которой требуется защита, и твердый носитель - смола - представляет собой смолу из хлорметилированного полистирола;

(б) снятие защиты (деблокирование) Воc с продукта первого присоединения кислотой с образованием деблокированного продукта первого присоединения;

(в) по усмотрению, присоединение к деблокированному продукту первого присоединения следующей аминокислоты, что включает проведение реакции следующей аминокислоты с деблокированным продуктом первого присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением блокированного (защищенного) продукта следующего присоединения, причем следующая аминокислота имеет в основной цепи аминогруппу, блокированную Воc, и если следующая аминокислота имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к кислотным или щелочным реагентам, используемым для снятия защиты соответственно Воc и Fmoc;

(г) снятие защиты Воc с блокированного продукта следующего присоединения, что включает проведение реакции блокированного продукта следующего присоединения с кислотой с получением деблокированного продукта следующего присоединения;

(д) по усмотрению, повторение этапов (в) и (г), причем в каждом цикле образуется деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения, где Х - номер необходимого повторения цикла;

(е) присоединение следующей аминокислоты к деблокированному продукту первого присоединения из этапа (б) или, по усмотрению, к деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения из этапа (д), что включает проведение реакции следующей аминокислоты с указанным продуктом первого присоединения или с указанным деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида с получением блокированного (защищенного) продукта следующего присоединения, причем следующая аминокислота имеет блокированную Fmoc аминогруппу основной цепи, при условии, что если следующая аминокислота имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к щелочным реагентам, используемым для снятия защиты Fmoc;

(ж) снятие защиты Fmoc с блокированного продукта следующего присоединения, что включает проведение реакции блокированного продукта следующего присоединения с первичным или вторичным амином, чтобы получить деблокированный продукт следующего присоединения;

(з) по усмотрению, повторение этапов (е) и (ж), причем в каждом цикле образуется деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения, где Х - номер необходимого повторения цикла, пока не будет включена в пептид и деблокирована предпоследняя аминокислота;

(и) присоединение N-концевой аминокислоты к деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения, что включает проведение реакции N-концевой аминокислоты с деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением блокированного продукта завершенного присоединения, где N-концевая аминокислота имеет аминогруппу основной цепи, блокированную Вос или Fmoc;

(й) снятие защитных групп Воc или Fmoc с блокированного продукта завершенного присоединения, включающее проведение реакции блокированного продукта завершенного присоединения с кислотой в случае Вос или с основанием в случае Fmoc, с образованием завершенного пептидного продукта на смоле;

(к) если на завершенном пептидном продукте на смоле имеются функциональные группы боковых цепей, тогда, по усмотрению, снятие защиты функциональных групп боковых цепей завершенного пептидного продукта на смоле, что включает проведение реакции завершенного пептидного продукта на смоле с подходящими снимающими защиту реагентами с получением завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой; и

(л) отщепление пептида от твердого носителя смолы в составе завершенного пептидного продукта на смоле или завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой с получением пептида, что включает проведение реакции завершенного пептидного продукта на смоле или завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой с аммиаком, первичным амином или вторичным амином до практического завершения отщепления пептида от смолы;

при условии, что этапы (е) и (ж) в синтезе пептида должны быть осуществлены по меньшей мере один раз.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где аммиак, первичный амин или вторичный амин в этапе (л) находятся в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель,

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где этап (л) дополнительно включает следующие этапы:

осаждение отщепленного пептида из растворителя;

отделение фильтрованием твердого носителя смолы и осажденного пептида и

экстрагирование пептида кислотным раствором для выделения пептида.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где первая аминокислота представляет собой Boc-L-Thr.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где первая аминокислота представляет собой цезиевую соль Boc-L-Thr, дающую в качестве продукта первого присоединения Boc-L-Thr-смолу, а деблокированным продуктом первого присоединения является H-L-Thr-смола.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где кислотой, используемой для удаления защитной группы Воc в этапе (й), является трифторуксусная кислота (ТФУ).

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где органическим растворителем является метилен-хлорид, хлороформ или диметилформамид, а реагентом для наращивания пептида является диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N"-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, включающий проведение этапов (е) и (ж) шесть раз после образования деблокированного продукта первого присоединения формулы H-L-Thr-смола, где последующие аминокислоты присоединяются в порядке: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm) с образованием продукта Н-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, включающий присоединение Boc-D- -Nal к H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Tnr-смоле согласно этапу (в) с получением Boc-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Сys(Аст)-Thr-смолы.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает одновременное снятие группы Воc, защищающей D- -Nal, группы O-t-Bu, защищающей Тyr, и группы Воc, защищающей Lys в Boc-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Тhr-смоле согласно этапу (и), с получением завершенного пептидного продукта на смоле формулы H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает отщепление пептида H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твердой смолы путем проведения реакции H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы с аммиаком в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель, до практически полного отщепления с получением H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где спиртом является метанол, а полярный апротонный растворитель - это диметилформамид.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает одновременное удаление групп Асm, защищающих Сys, и циклизацию получающихся остатков Cys со снятой защитой в завершенном пептидном продукте формулы H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Сys(Асm)-Тhr-NH 2 путем проведения реакции H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 с раствором йода в спирте до практически полных снятия защиты и циклизации с получением H-D- -Nal--Thr-NH 2 .

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где пептид представляет собой H-D- -Nal--Thr-NH 2 .

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где пептид является аналогом соматостатина.

Термины, использованные в описании настоящего изобретения, определяются следующим образом:

«первая аминокислота»: охватывает любую аминокислоту, у которой в основной цепи (не в боковой) аминогруппа защищена Воc, которая является коммерческим продуктом или может быть синтезирована согласно методам, известным специалисту с обычным опытом в данной области, например Boc-L-Тhr;

«продукт первого присоединения»: описывает продукт, который прикреплен к твердому - носителю - смоле, что является результатом присоединения первой аминокислоты к твердому носителю - смоле, например Boc-L-Thr-смола;

«деблокированный продукт первого присоединения»: описывает продукт, являющийся результатом удаления или снятия группы Воc с продукта первого присоединения - например, H-L-Тhr-смола, где «Н» представляет собой доступный водород аминогруппы основной цепи, появляющийся в результате этапа деблокирования;

«следующая аминокислота»: описывает любую аминокислоту, у которой в основной цепи аминогруппа защищена Воc или Fmoc, которая является коммерческим продуктом или может быть синтезирована согласно методам, известным специалисту с обычным опытом в данной области. Поскольку этап (в) и этап (е) могут входить в повторяющийся цикл, где этап осуществляется более одного раза, каждый раз при осуществлении этапа (в) или этапа (е) «следующая аминокислота» может быть независимо выбрана из группы известных или могущих быть синтезированными аминокислот, у которых в основной цепи аминогруппа защищена Воc или Fmoc;

«блокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения»: описывает продукт, присоединенный к твердому носителю смоле, который является результатом соединения следующей аминокислоты со «деблокированным продуктом следующего присоединения». Поскольку этапы (в) и (г) и этапы (е) и (ж) могут входить в повторяющийся цикл, где могут быть присоединены следующие аминокислоты, термин «блокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения» относится к продукту, получаемому в результате каждого из предшествующих циклов присоединения;

«деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения»: описывает продукт, являющийся результатом снятия группы Fmoc с «блокированного продукта (Х+1)-го следующего присоединения»;

«завершенный пептидный продукт на смоле»: описывает пептидный продукт, прикрепленный к твердому носителю смоле после того, как к пептидной цепи была присоединена N-концевая аминокислота, и после того, как снята или деблокирована защита с аминогруппы основной цепи N-концевой аминокислоты, но который еще имеет любые защитные группы на функциональных группах боковых цепей, не удаленные реакцией, осуществляющей снятие защитной группы с основной цепи N-концевой аминокислоты; и

«завершенный пептидный продукт на смоле со снятой защитой»: описывает пептидный продукт, прикрепленный к твердому носителю - смоле, где были удалены или сняты все защитные группы с функциональных групп боковых цепей аминокислот.

Примерами кислот, которые можно использовать для снятия защиты Воc, являются трифторуксусная кислота (ТФУ), метансульфоновая кислота и органические растворы, содержащие НСl.

Примерами первичных и вторичных аминов, которые могут быть использованы для снятия защиты Fmoc, являются 4-(аминометил)пиперидин, пиперидин, диэтиламин, DBU и трис(2-аминоэтил)амин.

Примерами ненуклеофильных оснований, которые можно использовать для нейтрализации солей ТФУ освобожденных аминогрупп (RNH 3 + CF 3 COO - , эти соли должны быть превращены в «свободные» амины (NH 2) до или в ходе присоединения следующей аминокислоты, иначе присоединение не осуществится) являются диизопропилэтиламин (ДИЭА) и триэтиламин (ТЭА).

Примерами органических растворителей, которые могут быть использованы в реакциях присоединения аминокислот, являются метилен-хлорид, хлороформ, дихлорэтан, диметилформамид, диэтилацетамид, тетрагидрофуран, этилацетат, 1-метил-2-пирролидон, ацетонитрил или комбинация этих растворителей.

Примеры агентов для наращивания пептидов включают замещенные карбодиимиды, такие как: диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N"-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

Карбоксильные группы и аминогруппы, которые участвуют в образовании пептидной амидной связи, называют соответственно карбоксильной группой или аминогруппой «небоковой (основной) цепи». С другой стороны, любые функциональные группы аминокислоты, которые не участвуют в образовании пептидной амидной связи, называют функциональными группами «боковой цепи».

Термин «устойчивая к действию оснований группа» относится к защитным группам, используемым для защиты функциональных групп аминокислот, которые (1) устойчивы к действию оснований, например не могут быть удалены основаниями, такими как 4-(аминоэтил)пиперидин, пиперидин или трис(2-аминоэтил)амин, которые являются основаниями, обычно используемыми для удаления защитной группы Fmoc, и (2) могут быть удалены кислотой, такой как трифторуксусная кислота, или другим способом, таким как каталитическая гидрогенизация.

Символы «Fmoc» и «Воc» использованы здесь и в прилагаемой формуле для обозначения соответственно 9-флуоренил-метоксикарбонила и трет-бутил-оксикарбонила.

Описанный выше способ может быть применен для приготовления пептидов, предпочтительно аналогов соматостатина, таких как октапептид Lanreotide®, который имеет следующую формулу: H-D- -Nal--Thr-NH 2 . Если нужно синтезировать H-D- -Nal--Тhr-NH 2 , устойчивыми к действию оснований защитными группами, используемыми для защиты функциональных групп боковых цепей Cys, Lys и Тyr, могут быть соответственно ацетамидометил (Асm), Воc и трет-бутил. Асm предпочтителен для Cys.

Под аналогом соматостатина подразумевается пептид, который проявляет биологическую активность, подобную (то есть агонист) или противоположную (то есть антагонист) активности соматостатина.

В формуле H-D- -Nal--Thr-NH 2 каждый из обычных трехбуквенных символов аминокислот (например, Lys) относится к структурному остатку аминокислоты. Например, символ Lys в приведенной выше формуле представляет -NН-СН((СН 2) 4 NН 2)-СО-. Символ D- -Nal- представляет аминокислотный остаток D-2-нафтилаланилил. Скобки обозначают дисульфидную связь, соединяющую свободные тиолы двух остатков Cys в пептиде, это указывает на то, что аминокислоты пептида внутри скобок образуют цикл.

На основании приведенного здесь описания специалист в данной области сможет в наиболее полной степени использовать настоящее изобретение.

Если не определено иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, какое обычно понимают специалисты с обычным уровнем подготовки в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, все публикации, патентные заявки, патенты и другие приведенные здесь ссыпки включены сюда ссылкой на них.

Пептид может быть приготовлен в соответствии со способом настоящего изобретения согласно следующей процедуре.

Раствор 0,5 молярных эквивалентов карбоната цезия в воде медленно добавляют к раствору 1 молярного эквивалента Вос-АА 1 (Bachem California, Torrance, СА), где АА 1 соответствует С-концевой аминокислоте, растворенной в спирте, предпочтительно метаноле. Полученную смесь перемешивают в течение около 1 ч при комнатной температуре, затем весь спирт и всю воду удаляют при пониженном давлении, получая сухой порошок цезиевой соли Вос-АА 1 . Смолу Мерифилда, 1,0 эквивалент (хлор-метилированный полистирол, 200-400 меш, включение ионов хлора 1,3 мэкв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky или Polymer Laboratories, Church Stretton, England) промывают хлорированным растворителем, предпочтительно дихлорметаном (ДХМ), спиртом, предпочтительно метанолом, и полярным апротонным растворителем, предпочтительно диметилформамидом (ДМФ). Порошок цезиевой соли Вос-АА 1 растворяют в безводном (сухом) полярном апротонном растворителе, предпочтительно ДМФ, и раствор объединяют с предварительно промытой смолой. Кашицу аккуратно перемешивают при приблизительно 45°-65°С, предпочтительно при 50°-60°С, в течение приблизительно от 48 до 106 ч, предпочтительно от 85 до 90 ч, в инертной атмосфере - такой как азот. Смолу отделяют фильтрованием и тщательно промывают полярным апротонным растворителем, предпочтительно ДМФ, водой и окончательно спиртом - таким как МеОН. Вос-АА 1 -смолу сушат при пониженном давлении.

Вос-АА 1 -смолу вносят в стеклянный реактор с фильтрующим дном из крупнопористого сплавленного стекла. Смолу промывают хлорированным растворителем - таким как ДХМ, деблокируют органической кислотой, предпочтительно 25% ТФУ в ДХМ, кратковременно промывают хлорированным раствором - таким как ДХМ, и спиртом - таким как МеОН, нейтрализуют органическим основанием, предпочтительно триэтиламином в ДХМ, и снова промывают ДХМ и полярным апротонным растворителем - таким как ДМФ, получая AA 1 -смолу со снятой защитой.

Затем к АА 1 -смоле со снятой защитой по усмотрению присоединяют любое необходимое число аминокислот. Если следующая аминокислота имеет -аминогруппу с защитой Fmoc (Fmoc-AA x), тогда группе боковой цепи либо не требуется защита (это, например, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe или Fmoc-Thr), либо боковую цепь необходимо защитить группой, устойчивой к действию основания. Молярный избыток Fmoc-AA x (где х - номер положения аминокислоты в пептиде, отсчитываемый от С-конца) присоединяют в течение приблизительно 60 мин к АА 1 -смоле со снятой защитой с помощью реагента для наращивания пептида - такого как диизопропилкарбодиимид (ДИК), в смеси ДХМ/ДМФ. Смолу с присоединением промывают ДМФ, спиртом и ДХМ, получая Fmoc-АА x -АА 1 -смолу. Прикрепление можно проверить нингидриновым методом Кайзера. Затем Fmoc-AA x -АА 1 -смолу промывают один раз ДМФ и после этого деблокируют раствором основания в органическом растворителе, таком как пиперидин в ДМФ, получая АА x -АА 1 -смолу. Затем AA x -АА 1 -смолу промывают ДМФ, после чего несколько раз промывают и спиртом, таким как МеОН, и ДХМ. После этого AA x -АА 1 -смолу промывают один раз ДМФ в течение приблизительно 3 мин, три раза изопропанолом, предпочтительно каждый раз в течение приблизительно 2 мин, и три раза ДХМ, предпочтительно каждый раз в течение приблизительно 2 мин. После этого смола готова для дальнейшего присоединения либо аминокислоты, защищенной Fmoc, как описано выше, либо аминокислоты, защищенной Воc, как описано далее.

Подобным же образом, если любая подлежащая присоединению к АА 1 -смоле со снятой защитой последующая аминокислота выбрана с защищенной Воc -аминогруппой (Вос-АА x), тогда либо для группы боковой цепи не требуется защита (это могут быть Boc-Gly, Boc-Ala, Boc-Phe или Boc-Thr), либо боковая цепь должна быть защищена группой, устойчивой к удалению и кислотой, и основанием, - это может быть Boc-Cys(Acm). Если выбрана Вос-АА x , ее присоединяют с помощью таких же реагентов и растворителей, как в описанном выше случае для Fmoc-аминокислот, и полноту (завершение) присоединения можно проверить нингидриновым методом Кайзера. После этого с Вос-АА x -АА 1 -смолы снимают защиту раствором кислоты в органическом растворителе - таким как ТФУ в ДХМ, получая CF 3 CO - H + -AA x -АА 1 -смолу. Затем эту смолу несколько раз промывают хлорированными растворителями, такими как ДХМ, спиртом, таким как МеОН, и нейтрализуют ненуклеофильным основанием, таким как триэтиламин в ДХМ, после чего промывают еще несколько раз хлорированным растворителем, таким как ДХМ, получая АА x -АА 1 -смолу. После этого смола готова для дальнейшего присоединения защищенной Воc или Fmoc аминокислоты, как описано выше.

В зависимости от требуемой последовательности пептида и типа использованной аминокислоты с защищенной -аминогруппой (либо с защитой Fmoc, либо с защитой Воc) используют подходящую комбинацию описанных выше процедур присоединения, в зависимости от того, какая аминокислота должна занять место в пептидной последовательности - с боковой цепью, имеющей защитную группу, которую можно удалить либо основанием, необходимым для снятия Fmoc с -аминогруппы, либо кислотой, необходимой для снятия Воc с -аминогруппы. Такой защищенной аминокислотой может быть N- -Boc-N"- -Fmoc-лизин или N- -Fmoc-N"- -Вос-лизин. Если это имеет место, все выбираемые защитные группы для -аминогрупп последующих аминокислот, вплоть до N-концевой аминокислоты, должны быть совместимыми с выбранной для этого положения защитой боковой группы. Это означает, что защитные группы боковых цепей должны быть устойчивы к деблокирующему агенту, используемому для снятия защиты с -аминогрупп последующих аминокислот. Для N-концевой аминокислоты в качестве защиты -аминогруппы можно использовать либо Воc, либо Fmoc, так как снятие защиты с N-концевой аминокислоты может одновременно снять защиту с некоторых из защищенных боковых цепей без нежелательного воздействия на стратегию синтеза пептида, поскольку никакие аминокислоты больше не добавляются.

С завершенной пептидной цепи, которая еще прикреплена к смоле, должна быть снята защита и она должна быть деблокирована. Чтобы удалить все устойчивые к действию оснований защитные группы и группу, блокирующую -аминогруппу N-концевой аминокислоты, если они применимы, пептид на смоле обрабатывают кислотой в органическом растворителе - такой как ТФУ в ДХМ. Чтобы удалить все устойчивые к действию кислоты защитные группы и группу, блокирующую -аминогруппу N-концевой аминокислоты, если они применимы, пептид на смоле обрабатывают органическим основанием - таким как пиперидин в ДМФ. Или же устойчивые к кислоте группы можно оставить впредь до удаления при последующем отщеплении пептида аммиаком или аминным основанием. Затем пептид на смоле со снятой защитой промывают хлорированным растворителем - таким как ДХМ, спиртом - таким как МеОН, и сушат до постоянного веса при пониженном давлении.

Пептид отщепляют от смолы и С-конец переводят в амид, суспендируя пептид на смоле в смеси 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензию охлаждают до температуры приблизительно ниже 10°С в атмосфере азота и под поверхность растворителя вводят безводный газообразный аммиак до насыщения им раствора, при этом температуру поддерживают ниже приблизительно 10°С. Кашицу аккуратно перемешивают в течение приблизительно 24 ч, позволяя при этом температуре повыситься до приблизительно 20°С. Степень завершения реакции проверяют по исчезновению метил-эфирного промежуточного соединения в ВЭЖХ при подходящих условиях, зависящих от типа пептида. Реакционную смесь охлаждают и добавляют необходимое количество безводного аммиака, пока при ВЭЖХ площадь пика, соответствующего метиловому эфиру, не станет меньше 10% площади пика целевого продукта. Кашицу охлаждают до температуры ниже приблизительно 10°С и продолжают перемешивание в течение ночи для осаждения пептида. Осадок и смолу отделяют фильтрованием и промывают холодным МеОН. Осадок и смолу сушат при пониженном давлении, продукт экстрагируют из смолы водным раствором уксусной кислоты.

Если пептид в своей последовательности содержит защищенные остатки Сys, защиту с тиольных групп можно снять и циклизовать остатки согласно следующей процедуре. Содержащий защищенные Асm группы Cys пептид растворяют в водном растворе уксусной кислоты в атмосфере азота. Раствор быстро перемешивают и добавляют в одной порции раствор йода в спирте. Смесь перемешивают и проверяют с помощью ВЭЖХ полноту снятия защиты. Затем реакцию останавливают титрованием 2% раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски раствора. Неочищенную смесь подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии на патроне С8 с градиентом ацетонитрила в 0,1 буфере ацетата аммония, обессоливают на патроне С8 с градиентом ацетонитрила в 0,25 н уксусной кислоте и лиофилизуют, получая целевой пептид.

Пример осуществления изобретения

Следующий пример приведен для того, чтобы проиллюстрировать способ согласно настоящему изобретению, и он не должен рассматриваться как ограничение его охвата.

Пример 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2

А) Boc-L-Thr-смола

Раствор 2,58 г карбоната цезия в 2,5 мл воды медленно добавляли к раствору 3,48 г Boc-L-треонина (Bachem California, Torrance, СА), растворенного в 7 мл метанола. Полученную смесь перемешивали в течение приблизительно 1 ч при комнатной температуре, затем удаляли весь метанол и всю воду при пониженном давлении, получая сухой порошок цезиевой соли Boc-L-треонина. 10 г смолы Мерифилда (хлорметилированный полистирол, 200-400 меш, включение хлора 1,3 мэкв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) промыли дихлорметаном (ДХМ), метанолом (МеОН) и диметилформамидом (ДМФ) (каждым 2 раза по 70 мл). Порошок цезиевой соли Boc-L-треонина растворили в 60 мл сухого ДМФ и объединили раствор с промытой, как указано выше, смолой. Кашицу аккуратно перемешивали при температуре приблизительно 50°-60°С в течение приблизительно от 85 до 90 ч в атмосфере азота. Смолу отделили фильтрованием и тщательно промыли ДМФ, деионизованной водой и напоследок МеОН. Смолу с Вос-треонином сушили при пониженном давлении при приблизительно 40°С. Включение треонина составило 0,85±0,15 мэкв/г сухой смолы.

Б) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола

2,0 г смолы с Вос-треонином из этапа (А) внесли в стеклянный реактор объемом 50 мл с дном-фильтром из крупнопористого сплавленного стекла (загрузка 1,74 ммоль). Смолу промыли 2 раза ДХМ (20 мл), каждый раз в течение приблизительно 5 мин, деблокировали 25% ТФУ в ДХМ (30 мл) - первый раз в течение приблизительно 2 мин и второй раз в течение приблизительно 25 мин, промыли 3 раза в течение приблизительно 2 мин ДХМ (20 мл), изопропанолом (20 мл) и ДХМ (20 мл), нейтрализовали дважды в течение около 5 мин 10% раствором триэтиламина в ДХМ (20 мл), промыли 3 раза в течение приблизительно 2 мин ДХМ и промыли один раз ДМФ (20 мл) в течение приблизительно 5 мин.

К деблокированной смоле добавили 1,8 г (4,35 ммоль, 2,5 экв.) Fmoc-L-цистеина(Асm) (Bachem, СА) и 683 мкл (4,35 ммоль, 2,5 экв.) диизопропил-карбодиимида (ДИК) в 14 мл смеси 2:1 ДХМ/ДМФ приблизительно на 1 ч. После присоединения смолу промыли 1 раз в течение около 3 мин ДМФ (20 мл), 3 раза в течение около 2 мин изопропанолом и 3 раза в течение около 2 мин ДХМ (20 мл). Связывание проверили нигидриновым методом Кайзера.

После присоединения смолу промыли 1 раз ДМФ и затем деблокировали раствором пиперидина в ДМФ. Затем деблокированную смолу с присоединением промыли ДМФ и несколько раз одновременно МеОН и ДХМ. Смолу с присоединением промыли 1 раз в течение около 3 мин ДМФ (20 мл), 3 раза в течение около 2 мин изопропанолом (20 мл) и 3 раза ДХМ (20 мл) в течение около 2 мин каждый раз. Связывание проверили нингидриновым методом Кайзера.

Каждую из следующих защищенных аминокислот присоединяли к промытой смоле, используя ДИК в смеси ДМФ/ДХМ, и деблокировали, как описано выше, в следующей последовательности: Fmoc-L-валин, Fmос-L-лизин(Вос), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин(О-t-Bu) и Fmос-L-цистеин(Асm) (все от фирмы Bachem California), Boc-D-2-нафтилаланин (Synthethech, Albany, OR).

С завершенной пептидной цепи снимали блокировку и защиту дважды смесью 75:20:5 ДХМ/ТФУ/анизол (30 мл) в течение около 2 мин и около 25 мин, промыли 3 раза в течение около 2 мин каждый раз ДХМ (20 мл), изопропанолом (10 мл) и ДХМ (20 мл), нейтрализовали 2 раза в течение около 5 мин 10% раствором триэтиламина в ДХМ (20 мл) и промыли 3 раза в течение около 2 мин ДХМ (20 мл) и МеОН (20 мл). Смолу сушили при пониженном давлении. Сухой вес был равен 3,91 г (103% от теоретического выхода).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2

2,93 г нагруженной пептидом смолы из этапа (Б) (1,3 ммоль-экв.) суспендировали в 50 мл смеси 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензию охладили до температуры приблизительно ниже 10°С в атмосфере азота и продували сухой газообразный аммиак до насыщения им раствора, при этом температуру поддерживали ниже приблизительно 10°С. Кашицу аккуратно перемешивали в течение приблизительно 24 ч, позволяя температуре повыситься до приблизительно 20°С. Степень завершения реакции проверяли по исчезновению метил-эфирного промежуточного соединения с помощью ВЭЖХ (сорбент VYDAC®, размер зерен 5 мкм, размер пор 100 Å, С18, элюирование в изократических условиях 26% CH 3 CN в 0,1% ТФУ, скорость 1 мл/мин, регистрация при 220 мм; в этих условиях время ретардации Rt ~ 14 мин для метилового эфира и ~ 9,3 мин для амидного продукта). Реакционную смесь охлаждали и добавляли избыток безводного аммиака, пока при ВЭЖХ площадь пика, соответствующего метиловому эфиру, не стала меньше 10% площади пика целевого продукта. Кашицу охладили до температуры приблизительно ниже 10°С, перемешивание продолжали в течение ночи для осаждения пептида. Осадок и смолу отделили фильтрованием и промыли 15 мл холодного МеОН. Осадок и смолу высушили при пониженном давлении, продукт экстрагировали из смолы 50% водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 30 мл). Анализ методом ВЭЖХ показал наличие в смеси 870 мг (0,70 ммоль) титульного продукта (96% чистота в изократической системе ВЭЖХ).

Г) H-D- -Nal--Thr-NH 2

500 мг (0,40 ммоль) пептида из этапа (В) растворили в 300 мл 4% уксусной кислоты и нагрели до приблизительно 55°С в атмосфере азота. Раствор быстро перемешали и добавили одной порцией 2% раствор (вес к объему) йода в 7,7 мл МеОН (0,60 ммоль). Смесь перемешивали в течение приблизительно 15 мин, затем реакцию остановили титрованием 2% раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски (~ 2 мл). Смесь охладили до комнатной температуры и профильтровали. Смесь подвергли очистке с помощью препаративной хроматографии на колонке С8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) с градиентом ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония, обессолили на колонке С8 YMC с градиентом ацетонитрила в 0,25 н уксусной кислоте и лиофилизовали, получив 350 мг целевого пептида с чистотой 99%.

На основании приведенного выше описания специалист данной области может легко выяснить существенные характеристики настоящего изобретения и без выхода за пределы его идеи и области охвата сделать различные изменения и модификации изобретения для приспособления его к различным применениям и условиям. Таким образом, другие варианты осуществления изобретения также охватываются формулой изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ приготовления пептида формулы H-D- -Nal--Thr-NH 2 , причем указанный способ включает следующие этапы:

(а) прикрепление первой аминокислоты к твердому носителю смоле эфирной связью с образованием «продукта первого присоединения», что включает (i) проведение реакции водного раствора карбоната цезия со спиртовым раствором первой аминокислоты с образованием цезиевой соли первой аминокислоты, (ii) получение свободной от растворителя цезиевой соли первой аминокислоты, (iii) проведение реакции твердого носителя смолы с цезиевой солью первой аминокислоты в безводном полярном апротонном растворителе с образованием «продукта первого присоединения»,

где первая аминокислота представляет собой Boc-L-Thr, что соответствует С-концевой аминокислоте этого пептида, а твердый носитель смола представляет собой смолу из хлорметилированного полистирола;

(б) снятие защиты Вос с продукта первого присоединения кислотой с образованием «деблокированного продукта первого присоединения»;

(в) по усмотрению, присоединение к «деблокированному продукту первого присоединения» «следующей аминокислоты», что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с «деблокированным продуктом первого присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем «следующая аминокислота» имеет в основной цепи аминогруппу, блокированную Вос, и если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или эти функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые стабильны к кислотным или щелочным реагентам, используемым для снятия защиты соответственно Вос и Fmoc;

(г) снятие защиты Вос с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции этого «блокированного продукта следующего присоединения» с кислотой с получением «деблокированного продукта следующего присоединения»;

(д) по усмотрению, повторение этапов (в) и (г), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х обозначает число желаемых повторений циклов;

(е) присоединение «следующей аминокислоты» к «деблокированному продукту первого присоединения» из этапа (б) или, по усмотрению, к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения» из этапа (д), что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с указанным «деблокированным продуктом первого присоединения» или с указанным «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем эта «следующая аминокислота» имеет блокированную Fmoc аминогруппу основной цепи, при условии, что если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к щелочным реагентам, используемым для снятия защиты Fmoc;

(ж) снятие защиты Fmoc с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции «блокированного продукта следующего присоединения» с первичным или вторичным амином, чтобы получить «деблокированный продукт следующего присоединения»;

(з) по усмотрению, повторение этапов (е) и (ж), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х - желаемое число повторений цикла, пока не будут включена в пептид и деблокирована предпоследняя аминокислота;

(и) присоединение N-концевой аминокислоты к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения», что включает проведение реакции N-концевой аминокислоты с «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта завершенного присоединения», где «N-концевая аминокислота» имеет аминогруппу основной цепи, блокированную Вос или Fmoc;

(й) снятие защитных групп Вос или Fmoc с «блокированного продукта завершенного присоединения», включающее проведение реакции «блокированного продукта завершенного присоединения» с кислотой в случае Вос или с основанием в случае Fmoc, с образованием завершенного пептидного продукта на смоле;

(к) если на «завершенном пептидном продукте на смоле» имеются функциональные группы боковых цепей, тогда, по усмотрению, снятие защиты функциональных групп боковых цепей «завершенного пептидного продукта на смоле», что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» с подходящими снимающими защиту реагентами с получением «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой»; и

(л) отщепление пептида от твердого носителя смолы в составе «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с получением пептида, что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с аммиаком, первичным амином или вторичным амином до практического завершения отщепления пептида от смолы;

при условии, что этапы (е) и (ж) в синтезе пептида осуществляют шесть раз после образования «деблокированного продукта первого присоединения» формулы H-L-Thr-смола, где последующие аминокислоты присоединяются в порядке: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm) с образованием продукта H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

2. Способ согласно п.1, где аммиак, первичный амин или вторичный амин в этапе (л) находятся в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель.

3. Способ согласно п.1, где этап (л) дополнительно включает следующие стадии:

(i) осаждение отщепленного пептида из растворителя;

(ii) отделение фильтрованием твердого носителя смолы и осажденного пептида и

(iii) экстрагирование пептида кислотным раствором для выделения пептида.

4. Способ согласно любому из пп.1-3, где первая аминокислота представляет собой цезиевую соль Boc-L-Thr, дающую в качестве продукта первого присоединения Boc-L-Thr-смолу, а «деблокированным продуктом первого присоединения» является H-L-Thr-смола.

5. Способ согласно п.4, где кислотой, используемой для удаления защитной группы Вос в этапе (й), является трифторуксусная кислота (ТФУ).

6. Способ согласно п.5, где органическим растворителем является метилен-хлорид, хлороформ или диметилформамид, а реагентом для наращивания пептида является диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N"-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

7. Способ согласно п.6, включающий присоединение Boc-D- -Nal к H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле согласно этапу (и) с получением Boc-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы.

8. Способ согласно п.7, включающий одновременное снятие группы Вос, блокирующей D- -Nal, группы O-t-Bu, защищающей Тyr, и группы Воc, защищающей Lys в Boc-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле, согласно этапу (й) с получением завершенного пептидного продукта на смоле формулы H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

9. Способ согласно п.8, включающий отщепление пептида H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твердой смолы путем проведения реакции H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы с аммиаком в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель, до в основном полного отщепления с получением H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .

10. Способ согласно п.9, где спиртом является метанол, а полярный апротонный растворитель - это диметилформамид.

11. Способ согласно п.10, включающий одновременное удаление групп Асm, защищающих Cys, и циклизацию получающихся остатков Cys со снятой защитой в «завершенном пептидном продукте на смоле» формулы H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 путем проведения реакции H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 с раствором йода в спирте до в основном полных снятия защиты и циклизации с получением H-D- -Nal--Thr-NH 2 .

Твердофазный синтез пептидов предложен Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.). Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α -амино- и боковыми группами. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе.

Термин твердофазный (solid-phase) относится скорее к физическим характеристикам вещества на носителе, так как химическая реакция на полимерном носителе протекает в одной фазе — в растворе. В подходящем растворителе полимер набухает, превращаясь в мало вязкий, но сильно структурированный гель (сшитые полимеры), или же растворяется (в случае не сшитых полимеров), и процесс синтеза происходит на ультрамикрогетерогенном уровне, в практически гомогенной системе.

Для твердофазного органического синтеза требуется полимерная основа — смола S , к которой прикреплен линкер L . На первой стадии к линкеру присоединяют молекулу субстрата А .Молекула А иммобилизуется (т.е. перестает быть мобильной), но сохраняет способность реагировать с другим реагентом В (стадия 2).

Продукт АВ остается на смоле, что позволяет отделить его от избытка реагента В (и побочных продуктов) простым промыванием. (Можно добавлять все новые реагенты, последовательно усложняя исходный субстрат А , главное чтобы линкер в этих реакциях оставался неизменным). Бифункциональный линкер L подбирается так, чтобы его связь со смолой S была более прочна, чем с субстратом А . Тогда на последней стадии целевое соединение AB можно отделить от смолы, разрушив его связь с линкером. Понятно, что связь L -AB должна расщепляться в мягких условиях, не повреждая ни само соединение (связь А -В ), ни контакт линкера со смолой (связь L -S ).

Таким образом, в идеальном случае, промывая смолу после каждой стадии и расщепляя связь с носителем, получают чистое вещество. Естественно полагать, что применение большого избытка реагентов и последующее отделение от смолы во многих случаях позволяют сдвигать химическое равновесие в сторону образования целевого продукта и сократить время синтеза. К недостаткам твердофазного органического синтеза можно отнести необходимость использования достаточно большого избытка (2—30 эквивалентов) реагентов, сложности при идентификации промежуточных продуктов синтеза, а также сравнительно высокую стоимость модифицированных полимерных носителей, которая определяется стоимостью линкера.

Введенный Меррифильдом в практику органического синтеза хлорметилированный полистирол (сшитый небольшим количеством дивинилбензола), так называемая смола Меррифильда, является самым доступным из полимерных носителей.

Методология и основные стадии твердофазного пептидного синтеза

Поставленная задача требует введения полимерного носителя с привитой аминокислотой в реакцию с активированным к замещению гетероциклом. Рассмотрим подробнее методологический аспект получения иммобилизированных аминокислот на полимерных носителях.

Стадия 1. Иммобилизация N-защищенной аминокислоты на полимерный носитель.

Первой стадией нашей схемы является иммобилизация аминокислоты на полимерный носитель. Для того чтобы избежать таких побочных процессов, как образование олигопептидов, аминокислоту предварительно защищают. Как правило, используют N-защищенные аминокислоты, и образующаяся связь между аминокислотой и носителем является связью амидного или сложноэфирного типа.

Наиболее часто применяемыми защитами аминогруппы в твердофазном органическом синтезе являются защитные группы карбаматного типа трет-бутоксикарбонильная (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc), X — защищаемая группа:

Необходимо отметить, что выбор защитной группы определяется используемым типом полимерного носителя. Условия иммобилизации защищенных аминокислот различны для различных типов полимерных носителей. Иммобилизация Boc-аминокислот на смолу Меррифильда, представляющую собой хлорметилированный полистирол, проводится in situ в виде цезиевых солей при добавлении суспензии карбоната цезия в диметилфталате (DMF) и каталитических количеств йодида калия. Избыток реагентов по отношению к количеству носителя выбирается в каждом случае индивидуально и составляет 1,5—4 эквивалента.

Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ванга (X=O) с образованием сложноэфирноголинкера бензильного типа осуществляется карбодиимидным методом при помощи диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) в качестве катализатора. Реакция иммобилизации со стерически незатрудненными аминокислотами протекает при комнатной температуре. Иммобилизация стерически затрудненных аминокислот требует проведения реакции при 40—60 °С в течение 2-х дней и повторного проведения иммобилизации (схема 1).Иммобилизация Fmoc- аминокислот на полимерный носитель Ринка (X=NH) с образованием амидного линкера бензгидрильного типа осуществляется в присутствии реагента Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)трис -(диметиламино)фосфония гексафторфосфата (BOP), основания диизопропилэтиламина (DIEA) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt), в качестве катализатора. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 2 ч для стерически незатрудненных и 4—6 ч в случае стерически затрудненных аминокислот.

Стадия 2. Деблокирование защищенной аминокислоты на полимерном носителе

На второй планируемой нами стадии (после иммобилизации защищенной аминокислоты) требуется снять защитную группу для активации аминогруппы. Способы снятия Boc- и Fmoc-защиты различны. Удаление Boc-защиты аминокислот на смоле Меррифильда проводится 50%-ной трифторуксусной кислотой в дихлорметане в течение получаса, в этих условияхлинкер Меррифильда остается неповрежденным.

После снятия защиты смолу промывают раствором триэтиламина для удаления трифторуксусной кислоты. Удаление Fmoc-защиты аминокислот на носителях Ванга (X=O) и Ринка (X=NH) проводится 20%-ным раствором пиперидина в DMF течение 40—50 мин.

Значительное уменьшение массы смолы после снятия Fmoc-защиты может служить основой для гравиметрического определения степени иммобилизации защищенных аминокислот на первой стадии твердофазного синтеза. Рекомендуется проводить последовательную обработку смолы раствором пиперидина в диметилфталате— сначала в течение 5—10 мин, затем 30 мин в свежем растворе. После снятия защиты смолу промывают не менее 4-х раз диметилфталатом для отмывки от продуктов разрушения Fmoc-защиты. Контроль за протеканием реакции ацилирования на носителе или удаление защитной функции с аминогруппы возможен с помощью теста Кайзера.

Стадия 3. Нуклеофильное замещение в гетероциклах с участием иммобилизованной на носителе аминокислоты

Следующим этапом, запланированным нами для практической реализации, является проведение реакции ароматического нуклеофильного замещения; нуклеофилом служит привитая аминокислота, а активированный гетероцикл находится в растворе. Большинство реакций нуклеофильного замещения наносителях по выполнению не отличаются от реакций в жидкой фазе. Следует, однако, иметь ввиду, что температура процесса не должна превышать 120 С, выше которой начинает разрушаться полистирольная основа носителя. В условиях проводимой на носителе реакции линкер также должен сохраняться.

Выбирая подходящие активированные гетероциклические субстраты, следует учитывать природу уходящей группы в гетероцикле.

Стадия 4. Снятие целевого соединения с полимерных носителей

Большинство линкеров при твердофазном органическом синтезе расщепляются в кислой среде. Устойчивость линкеров к кислоте резко понижается при переходе от смолы Меррифильда к смоле Ванга и Ринка. Линкер Ринка расщепляется в более мягких условиях (10—20% CF3COOH), чем линкер Ванга (50% CF3COOH).Смола Меррифильда в этих условиях пассивна, и для ее расщепления используют переэтерификацию в растворе NaOMe/MeOH, приводящую к образованию эфира кислоты.

Еще раз напомним, что природа линкера определяет тип терминальной функции в образующейся молекуле, удаляемой с подложки. Смола Ванга позволяет получать кислоты, а смола Ринка — амиды.

Преимущества указанной схемы твердофазного пептидного синтеза:

1. Различные исходные соединения могут быть связаны с отдельными гранулами. Затем эти гранулы смешиваются и, таким образом, все исходные соединения могут взаимодействовать с реагентом в одном эксперименте. В результате продукты реакции образуются на отдельных гранулах. В большинстве случаев, смешивание исходных в традиционной жидкой химии приводит обычно к неудачам - полимеризации или осмолению продуктов. Эксперименты на твердой подложке исключают эти эффекты.

2. Поскольку исходные материалы и продукты связаны с твердой подложной, то избыток реагентов и не связанных с подложкой продуктов можно легко отмыть от полимерной твердой подложки.

3. Можно использовать большие избытки реагентов, для того чтобы провести реакцию до конца (больше, чем 99%), поскольку эти избытки легко отделяются.

4. В случае использования низких объемов загрузок (менее 0,8 ммоль на грамм подложки) можно исключить нежелательные побочные реакции.

5. Интермедиаты в реакционной смеси связаны с гранулами и их нет необходимости очищать.

6. Индивидуальные гранулы полимера могут быть разделены в конце эксперимента и таким образом получаются индивидуальные продукты.

7. Полимерная подложка может быть регенерирована в тех случаях, когда подобраны условия разрыва и выбраны соответствующие якорные группы - линкеры.

8. Возможна автоматизация твердофазного синтеза.

Необходимыми условиями проведения твердофазного синтеза, кроме наличия нерастворимой полимерной подложки, инертной в реакционных условиях, являются:

Присутствие якоря или линкера - химической функции, обеспечивающей связь подложки с наносимым соединением. Он должен быть ковалентно связан со смолой. Якорь также должен являться реакционно-способной функциональной группой для того, чтобы субстраты могли взаимодействовать с ним.

Связь, образующаяся между субстратом и линкером должна быть стабильна в условиях реакции.

Должны существовать способы разрыва связи продукта или интермедиата с линкером.