روش های جداسازی پروتئین ها و اسیدهای آمینه جداسازی پروتئین (فرکشناسیون) روشهای جداسازی پروتئین

جداسازی پروتئین ها از ناخالصی های کم وزن مولکولی

روش غربال غشایی (دیالیز)

از غشای دیالیز استفاده می شود که پلیمری است و دارای منافذ با اندازه مشخص است. مولکول های کوچک (ناخالصی های با وزن مولکولی کم) از منافذ غشاء عبور می کنند و مولکول های بزرگ (پروتئین ها) حفظ می شوند. به این ترتیب پروتئین ها از ناخالصی ها شسته می شوند.

جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی

کروماتوگرافی ژل

ستون کروماتوگرافی با گرانول های ژل (سفادکس) پر شده است که دارای منافذ با اندازه مشخص است. مخلوطی از پروتئین ها به ستون اضافه می شود. پروتئین هایی که اندازه آنها کوچکتر از اندازه منافذ سفادکس است، در ستون حفظ می شوند، زیرا در منافذ "گیر" می کنند، در حالی که بقیه آزادانه از ستون خارج می شوند. اندازه یک پروتئین به وزن مولکولی آن بستگی دارد.

اولتراسانتریفیوژ

این روش بر اساس نرخ های مختلف ته نشینی (رسوب) مولکول های پروتئین در محلول هایی با گرادیان چگالی متفاوت (بافر ساکارز یا کلرید سزیم) است.

الکتروفورز

این روش بر اساس نرخ‌های مختلف مهاجرت پروتئین‌ها و پپتیدها در یک میدان الکتریکی بسته به بار است.

ژل ها، استات سلولز و آگار می توانند به عنوان حامل برای الکتروفورز عمل کنند. مولکول های جدا شده بسته به اندازه آنها در ژل حرکت می کنند: مولکول هایی که بزرگ هستند با عبور از منافذ ژل به تاخیر می افتند. مولکول های کوچکتر با مقاومت کمتری مواجه می شوند و بنابراین سریعتر حرکت می کنند. در نتیجه، پس از الکتروفورز، مولکول های بزرگ نسبت به مولکول های کوچکتر به شروع نزدیک تر خواهند بود.

از الکتروفورز می توان برای جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی استفاده کرد. برای این کار از الکتروفورز PAGE در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS-Na) استفاده می شود.

DDS-Na یک ماده دودوست و حاوی یک گروه باردار و یک گروه آبگریز است. پروتئین ها با رادیکال های آبگریز خود به SDS-Na متصل می شوند و در این فرآیند دناتوره می شوند. به این ترتیب پروتئین ها از نظر شکل و بار در یک راستا قرار می گیرند. پس از این، تحرک پروتئین در طول الکتروفورز فقط به وزن مولکولی آن بستگی دارد.

نمک زدن: رسوب با نمک های قلیایی، فلزات قلیایی خاکی (کلرید سدیم، سولفات منیزیم)، سولفات آمونیوم. ساختار اولیه پروتئین مختل نمی شود.

گواهی: استفاده از مواد حذف کننده آب: الکل یا استون در دمای پایین (حدود -20 С).

هنگام استفاده از این روش ها، پروتئین ها پوسته هیدراتاسیون خود را از دست می دهند و در محلول رسوب می کنند.

دناتوره سازی- نقض ساختار فضایی پروتئین ها (ساختار اولیه مولکول حفظ می شود). این می تواند برگشت پذیر باشد (ساختار پروتئین پس از حذف عامل دناتوره ترمیم می شود) یا غیرقابل برگشت (ساختار فضایی مولکول ترمیم نمی شود، به عنوان مثال، هنگامی که پروتئین ها با اسیدهای معدنی غلیظ، نمک های فلزات سنگین رسوب می کنند).

روش های جداسازی پروتئین جداسازی پروتئین ها از ناخالصی های کم وزن مولکولی

دیالیز

از یک غشای پلیمری مخصوص استفاده می شود که دارای منافذ با اندازه مشخص است. مولکول های کوچک (ناخالصی های با وزن مولکولی کم) از منافذ غشاء عبور می کنند و مولکول های بزرگ (پروتئین ها) حفظ می شوند. بنابراین، پروتئین ها از ناخالصی ها شسته می شوند.

جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی

کروماتوگرافی ژل

ستون کروماتوگرافی با گرانول های ژل (سفادکس) پر شده است که دارای منافذ با اندازه مشخص است. مخلوطی از پروتئین ها به ستون اضافه می شود. پروتئین هایی که اندازه آنها کوچکتر از اندازه منافذ سفادکس است در ستون حفظ می شوند، زیرا در منافذ "گیر" می کنند، در حالی که بقیه آزادانه از ستون خارج می شوند (شکل 2.1). اندازه یک پروتئین به وزن مولکولی آن بستگی دارد.

برنج. 2.1.جداسازی پروتئین با فیلتراسیون ژل

اولتراسانتریفیوژ

این روش بر اساس نرخ های مختلف ته نشینی (رسوب) مولکول های پروتئین در محلول هایی با شیب چگالی متفاوت (بافر ساکارز یا کلرید سزیم) است (شکل 2.2).

برنج. 2.2.جداسازی پروتئین ها با اولتراسانتریفیوژ

الکتروفورز

این روش بر اساس نرخ‌های مختلف مهاجرت پروتئین‌ها و پپتیدها در یک میدان الکتریکی بسته به بار است.

ژل ها، استات سلولز و آگار می توانند به عنوان حامل برای الکتروفورز عمل کنند. مولکول های جدا شده بسته به اندازه آنها در ژل حرکت می کنند: مولکول هایی که بزرگتر هستند با عبور از منافذ ژل به تاخیر می افتند. مولکول های کوچکتر با مقاومت کمتری مواجه می شوند و بنابراین سریعتر حرکت می کنند. در نتیجه، پس از الکتروفورز، مولکول‌های بزرگ‌تر نسبت به مولکول‌های کوچک‌تر به شروع نزدیک‌تر خواهند بود (شکل 2.3).

برنج. 2.3. جداسازی پروتئین توسط ژل الکتروفورز

همچنین می توان از الکتروفورز برای جداسازی پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی استفاده کرد.برای این استفاده می کنند الکتروفورز PAGE در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS-Na).

جداسازی پروتئین های فردی

کروماتوگرافی میل ترکیبی

این روش مبتنی بر توانایی پروتئین ها برای اتصال قوی به مولکول های مختلف از طریق پیوندهای غیر کووالانسی است. برای جداسازی و خالص سازی آنزیم ها، ایمونوگلوبولین ها و پروتئین های گیرنده استفاده می شود.

مولکول های مواد (لیگاندها) که پروتئین های خاصی به طور خاص به آنها متصل می شوند، به طور کووالانسی با ذرات یک ماده بی اثر ترکیب می شوند. مخلوط پروتئین به ستون اضافه می شود و پروتئین مورد نظر محکم به لیگاند متصل می شود. پروتئین های باقی مانده از ستون آزادانه خارج می شوند. سپس پروتئین باقی مانده را می توان با استفاده از محلول بافر حاوی لیگاند آزاد از ستون شست. این روش بسیار حساس اجازه می دهد تا مقادیر بسیار کمی از پروتئین به شکل خالص از عصاره سلولی حاوی صدها پروتئین دیگر جدا شود.

فوکوس ایزوالکتریک

این روش بر اساس مقادیر مختلف IET پروتئین ها است. پروتئین ها با الکتروفورز روی صفحه ای با آمفولین جدا می شوند (این ماده ای است که در آن یک گرادیان pH در محدوده 3 تا 10 از قبل تشکیل می شود). در طول الکتروفورز، پروتئین ها بر اساس مقدار IET جدا می شوند (در IET، بار پروتئین صفر خواهد بود و در میدان الکتریکی حرکت نمی کند).

الکتروفورز دو بعدی

این ترکیبی از فوکوس ایزوالکتریک و الکتروفورز با SDS-Na است. الکتروفورز ابتدا در جهت افقی روی صفحه با آمفولین انجام می شود. پروتئین ها بر اساس شارژ (IET) جدا می شوند. سپس صفحه با محلول SDS-Na درمان می شود و الکتروفورز در جهت عمودی انجام می شود. پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی جدا می شوند.

ایمونوالکتروفورز (Western blot)

یک روش تحلیلی که برای شناسایی پروتئین های خاص در یک نمونه استفاده می شود (شکل 2.4).

جداسازی پروتئین ها از مواد بیولوژیکی

جداسازی پروتئین ها با وزن مولکولی با الکتروفورز در PAGE با SDS-Na.

انتقال پروتئین از ژل به صفحه پلیمری برای تسهیل کار بیشتر.

درمان صفحه با محلول پروتئین غیر اختصاصی برای پر کردن منافذ باقی مانده.

بدین ترتیب پس از این مرحله صفحه ای به دست می آید که منافذ آن حاوی پروتئین های جدا شده است و فضای بین آنها با پروتئین غیر اختصاصی پر می شود. اکنون باید مشخص کنیم که آیا در بین پروتئین هایی که به دنبال آن هستیم، وجود دارد که مسئول برخی بیماری ها باشد یا خیر. درمان آنتی بادی برای تشخیص استفاده می شود. آنتی بادی های اولیه آنتی بادی هایی در برابر پروتئین مورد نظر هستند. منظور از آنتی بادی های ثانویه آنتی بادی ها در برابر آنتی بادی های اولیه است. یک برچسب ویژه اضافی (به اصطلاح کاوشگر مولکولی) به آنتی بادی های ثانویه اضافه می شود تا بتوان نتایج را مشاهده کرد. یک فسفات رادیواکتیو یا آنزیمی که محکم به یک آنتی بادی ثانویه متصل است به عنوان برچسب استفاده می شود. اتصال ابتدا به آنتی بادی های اولیه و سپس به آنتی بادی های ثانویه دو هدف دارد: استانداردسازی روش و بهبود نتایج.

درمان با محلول آنتی بادی های اولیه  اتصال در محل صفحه ای که آنتی ژن (پروتئین مورد نظر) در آن قرار دارد رخ می دهد.

حذف آنتی بادی های غیر متصل (شستشو).

درمان با محلولی از آنتی بادی های ثانویه نشاندار برای توسعه بعدی.

حذف آنتی بادی های ثانویه غیر متصل (شستشو).

برنج. 2.4. ایمونوالکتروفورز (Western blot)

اگر پروتئین مورد نظر در ماده بیولوژیکی وجود داشته باشد، نواری روی صفحه ظاهر می شود که نشان دهنده اتصال این پروتئین به آنتی بادی های مربوطه است.

مطالعه خواص فیزیکوشیمیایی، ترکیب شیمیایی و ساختار تنها با مطالعه یک آماده سازی پروتئین خالص امکان پذیر است. برای جداسازی و تکه تکه کردن پروتئین های منفرد، از موارد زیر استفاده می شود: نمک زدایی، رسوب با حلال های آلی، فیلتراسیون ژل، الکتروفورز، کروماتوگرافی تبادل یونی، کروماتوگرافی میل ترکیبی.

نمک زدن پروتئین هابر اساس وابستگی حلالیت پروتئین به خواص محیط. پروتئین‌ها در آب مقطر کمتر از محلول‌های نمکی ضعیف حل می‌شوند، زیرا غلظت‌های کم یون پوسته هیدراتاسیون خود را حفظ می‌کنند. اما در غلظت‌های بالای نمک، مولکول‌های پروتئین پوسته هیدراتاسیون خود را از دست می‌دهند، تجمع می‌یابند و رسوب تشکیل می‌شود. پس از حذف نمک، پروتئین ها به محلول برمی گردند و خواص و ترکیب اصلی خود را حفظ می کنند.

تغییر در حلالیت در غلظت های مختلف نمک و pH برای جداسازی پروتئین های منفرد استفاده می شود. اغلب از محلول های سولفات آمونیوم با غلظت های مختلف برای نمک زدن پروتئین ها استفاده می شود.

رسوب پروتئین ها از محلول بدون دناتوره شدن آنها با استفاده از عوامل هیدروژنه - حلال های آلی (اتانول، استون) انجام می شود.

فیلتراسیون ژلبر اساس جداسازی پروتئین ها با توجه به اندازه و شکل مولکول. جداسازی در ستون های کروماتوگرافی پر از گرانول های ژل متخلخل (سفادکس، آگارز) در محلول بافر با مقدار pH مشخص انجام می شود. گرانول های ژل به لطف کانال های داخلی (منافذ) با قطر متوسط ​​معینی که اندازه آنها بستگی به نوع ژل دارد (سفادکس G-25، G-200 و غیره) به پروتئین ها نفوذ می کنند. مخلوط پروتئین به ستون اضافه می شود و سپس با یک محلول بافر با مقدار pH معین شسته می شود. مولکول های پروتئینی بزرگ به منافذ ژل نفوذ نمی کنند و همراه با حلال با سرعت بالا حرکت می کنند. مولکول های کوچک ناخالصی با وزن مولکولی کم (نمک) یا سایر پروتئین ها توسط گرانول های ژل حفظ می شوند و آهسته تر از ستون شسته می شوند (شکل 1.29). در خروجی ستون، محلول (شوینده) به شکل کسرهای جداگانه جمع آوری می شود.

برنج. 1.29. جداسازی پروتئین با فیلتراسیون ژل

الکتروفورزبر اساس ویژگی مولکول های پروتئین باردار برای حرکت در یک میدان الکتریکی با سرعتی متناسب با بار کل آنها است. پروتئین هایی که دارای بار منفی کل در یک مقدار pH معین هستند به سمت آند حرکت می کنند و بار مثبت به سمت کاتد حرکت می کند. الکتروفورز بر روی محیط های مختلف انجام می شود: کاغذ، ژل نشاسته، ژل پلی آکریل آمید و غیره. سرعت حرکت به بار، جرم و شکل مولکول های پروتئین بستگی دارد. پس از اتمام الکتروفورز، نواحی پروتئینی روی حامل با رنگ های مخصوص رنگ آمیزی می شوند (شکل 1.30، A).

وضوح الکتروفورز در ژل بیشتر از روی کاغذ است، بنابراین هنگام الکتروفورز پروتئین های سرم خون روی کاغذ، 5 فراکسیون (آلبومین، α 1 -، α 2 -، β-، γ-گلوبولین ها) و در یک ژل پلی آکریل آمید جدا می شوند. - تا 18 کسر (شکل 1.30، B).

برنج. 1.30. الکتروفروگرام پروتئین های سرم خون یک فرد سالم

آ- الکتروفروگرام پروتئین های سرم خون روی کاغذ؛

ب- مقدار پروتئین های پلاسما در بخش های مختلف.

I - γ-گلوبولین ها؛ II - β-گلوبولین ها؛ III - a 2 -گلوبولین.

IV - a 1 -گلوبولین. V - آلبومین

کروماتوگرافی تبادل یونیبر اساس جداسازی پروتئین هایی که در بار کلی متفاوت هستند. محلول پروتئینی با مقدار pH معین از یک ستون کروماتوگرافی پر از جاذب متخلخل جامد عبور داده می شود، در حالی که برخی از پروتئین ها در نتیجه برهمکنش الکترواستاتیکی باقی می مانند. مواد تبادل یونی به عنوان جاذب استفاده می شوند: مبدل های آنیونی (حاوی گروه های کاتیونی) برای جداسازی پروتئین های اسیدی. مبدل های کاتیونی (حاوی گروه های آنیونی) برای جداسازی پروتئین های ضروری.

هنگام عبور پروتئین از یک ستون، قدرت اتصال آن به مبدل یونی به مقدار بار مخالف بار جاذب بستگی دارد. پروتئین های جذب شده روی یک جاذب تبادل یونی با محلول های بافر با غلظت های مختلف نمک و pH شسته می شوند و بخش های پروتئینی متفاوتی به دست می آیند.

کروماتوگرافی میل ترکیبیبر اساس ویژگی اتصال پروتئین به لیگاند متصل به تکیه گاه جامد است. سوبستراهای آنزیمی، گروه های پروتزی هولوپروتئین ها، آنتی ژن ها و غیره به عنوان لیگاند استفاده می شوند. هنگام عبور مخلوطی از پروتئین ها از ستون، فقط پروتئین مکمل به لیگاند متصل می شود (شکل 1.31، A)، بقیه به همراه محلول خارج می شوند. پروتئین جذب شده با محلولی با مقدار pH متفاوت شسته می شود (شکل 1.31، B). این روش بسیار اختصاصی است و به فرد اجازه می دهد تا آماده سازی های پروتئینی بسیار خالص شده را بدست آورد.

جداسازی و خالص سازی پروتئین معمولاً در چند مرحله با استفاده از روش های مختلف انجام می شود. توالی مراحل به صورت تجربی انتخاب می شود و ممکن است برای پروتئین های مختلف متفاوت باشد. درجه بالایی از تصفیه پروتئین هم هنگام استفاده از آنها به عنوان دارو (هورمون انسولین و غیره) و هم هنگام تشخیص بیماری های مختلف با تغییر ترکیب پروتئین بافت ها، خون، بزاق و غیره بسیار مهم است.

مجموعه ای از پروتئین ها در سلول های اندام های مختلف یک فرد بالغ فردی است و در طول زندگی نسبتاً ثابت نگه داشته می شود. بافت های تخصصی ممکن است حاوی پروتئین های خاصی مانند هموگلوبین در گلبول های قرمز، اکتین و میوزین در عضلات، رودوپسین در شبکیه و انواع مختلف کلاژن در استخوان و بافت های همبند باشند. برخی از پروتئین ها در بسیاری از بافت ها یافت می شوند، اما در مقادیر متفاوت. ترکیب انتخابی تغییر می کند

برنج. 1.31. جداسازی پروتئین ها با کروماتوگرافی میل ترکیبی

آ- اتصال پروتئین جدا شده به یک لیگاند خاص متصل به یک حامل خنثی. ب- به دست آوردن محلولی از پروتئین فردی

پروتئین های بافت ها و خون ممکن است و در درجه اول با رژیم غذایی، ترکیب غذا و فعالیت بدنی فرد مرتبط است.

در بیماری ها، ترکیب پروتئین سلول های خون و بافت می تواند به طور قابل توجهی تغییر کند؛ کمبود هر پروتئین یا کاهش فعالیت آن اغلب ایجاد می شود - پروتئینوپاتیبنابراین، تعیین تغییرات بارز در ترکیب پروتئین خون و بافت ها برای تشخیص بیماری های مختلف در مطالعات بالینی استفاده می شود.

پس از استخراج مخلوطی از پروتئین ها از مواد بیولوژیکی، آن را به بخش های پروتئینی جداگانه جدا می کنند. چندین روش شکنش پروتئین بر اساس خواص فیزیکی و شیمیایی مختلف پروتئین ها توسعه یافته است.

– رسوب پروتئین ها در نقطه ایزوالکتریک - روش بر اساس خاصیت پروتئین ها برای رسوب در نقطه ایزوالکتریک به دلیل خنثی سازی بار مولکول پروتئین است. برای هر پروتئین، مقدار نقطه ایزوالکتریک کاملاً فردی است، بنابراین این روش امکان جداسازی تک تک پروتئین ها را فراهم می کند (برای اطلاعات بیشتر در مورد روش، به کار آزمایشگاهی شماره 3 در درس "بیوشیمی" مراجعه کنید).

– شکنش پروتئین با روش نمک زدایی – بر اساس حلالیت متفاوت پروتئین ها در محلول های غلیظ نمک های خنثی، بسته به وزن مولکولی (برای اطلاعات بیشتر در مورد روش، به کار آزمایشگاهی شماره 3 در درس «بیوشیمی» مراجعه کنید).

– روش جداسازی الکتروفورتیک پروتئین ها به کسری - در بخش خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئین ها توضیح داده شده است.

علاوه بر روش های ارائه شده در بالا، آنها به طور گسترده ای برای جدا کردن پروتئین ها به بخش ها استفاده می شوند. روش های کروماتوگرافی . کروماتوگرافی ستونی بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد.

ویژگی این روش این است که مخلوطی از مولکول های پروتئین ها و پپتیدهای مختلف از یک ستون حاوی ماده متخلخل جامد (ماتریکس) عبور داده می شود. در نتیجه برهمکنش با ماتریس، پروتئین های مختلف با سرعت های متفاوتی از ستون عبور می کنند. پس از اینکه پروتئین ها در یک توالی مشخص به انتهای ستون رسیدند، در بخش های جداگانه در لوله های آزمایش جمع آوری می شوند.

برجسته سه نوع اصلیکروماتوگرافی ستونی:

– تبادل یونی - برای کروماتوگرافی پروتئینی، از مبدل های یونی مبتنی بر سلولز یا سایر پلیمرهای آبدوست استفاده می شود، به عنوان مثال، دی اتیل آمینو اتیل سلولز (DEAE-cellulose)، حاوی گروه های کاتیونی (بار منفی) یا حاوی کربوکسی متیل سلولز (CM-cellulose)، حاوی گروه های آمین (بار مثبت) :

هر چه اتصال پروتئین ها به سلولز DEAE قوی تر باشد، تعداد گروه های کربوکسیل در مولکول پروتئین بیشتر می شود. پروتئین های جذب شده به سلولز DEAE را می توان از ستون با محلول هایی با غلظت فزاینده کلرید سدیم شست و شو داد. ابتدا پروتئین هایی که به صورت آزاد متصل هستند شسته می شوند و با افزایش غلظت نمک، سایر پروتئین ها به منظور افزایش میل ترکیبی برای DEAE-سلولز شسته می شوند.

سلولز CM به طور مشابه مورد استفاده قرار می گیرد، اما میل ترکیبی پروتئین ها به آن با تعداد گروه های آمینه در مولکول پروتئین نسبت مستقیم دارد.

برای حذف پروتئین متصل، pH مایع شوینده نیز تغییر می کند.

– کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون - نام دوم "روش غربال مولکولی" را دارد. Sephadex (پلی ساکارید دکستران تیمار شده با اپی کلرید هیدرین) به عنوان غربال استفاده می شود. دانه های سفادکس در آب متورم می شوند و به شکل ژل در می آیند. دانه های متورم دارای منافذ با قطر معین هستند.

جداسازی بر اساس این واقعیت است که دانه‌های سفادکس (منافذ دانه‌ها) نسبت به موادی با وزن مولکولی زیاد غیرقابل نفوذ یا به طور محدود قابل نفوذ هستند و مولکول‌های کوچک آزادانه در منافذ دانه‌ها پخش می‌شوند (نفوذ می‌کنند).

یک توده ژل مانند از سفادکس متورم در یک ستون شیشه ای (لوله) قرار می گیرد، یک لایه محلول پروتئین روی سطح ژل اعمال می شود (شکل 12، a) و سپس یک محلول بافر (مایع شستشو) از آن عبور می کند. ستون. پروتئین ها در امتداد ستون بین گرانول ها آهسته تر عبور می کنند، وزن مولکولی آنها کمتر می شود، زیرا مولکول های پروتئینی با وزن مولکولی حتی پایین تر به راحتی در گرانول ها (در منافذ) پخش می شوند (شکل 12).

برنج. 12. تکه تکه شدن پروتئین با فیلتراسیون ژل

پروتئین ها به ترتیب نزولی وزن مولکولی از ستون شسته می شوند. در نتیجه، ابتدا مولکول های پروتئین بزرگ شسته می شوند (شکل 12، ب)، که در دانه ها منتشر نمی شوند، سپس مولکول های کوچک و در نهایت، ناخالصی های کم مولکولی.

این روش نه تنها برای تکه تکه کردن پروتئین ها با وزن مولکولی، بلکه برای خالص سازی آنها از ناخالصی های با وزن مولکولی کم نیز استفاده می شود.

– کروماتوگرافی میل ترکیبی - یا کروماتوگرافی میل ترکیبی. اصل روش این است که برهمکنش انتخابی پروتئین ها با مواد خاص - لیگاندهای متصل به حامل ها رخ می دهد (شکل 13).

سفاروز فعال شده با سیانوژن برومید به عنوان یک حامل استفاده می شود. لیگاندهایی با منشأهای مختلف به سفاروز متصل می شوند - یک سوبسترا، یک آنتی ژن، یا یک گیرنده، که میل ترکیبی تنها یک پروتئین را از مخلوط متصل می کند:

– سوبسترا → آنزیم؛

– آنتی ژن → آنتی بادی؛

– هورمون ← گیرنده برای یک هورمون معین.

سایر پروتئین هایی که به لیگاند متصل نیستند با شستن ستون حذف می شوند.

برنج. 13. مکانیسم کروماتوگرافی میل ترکیبی

حذف پروتئین متصل به میل ترکیبی از ستون با استفاده از محلول بافر (شوینده) انجام می شود. یک ماده شوینده به بافر وارد می شود که پیوند بین پروتئین و لیگاند را ضعیف می کند یا محلولی با غلظت بالایی از لیگاند آزاد از ستون عبور می کند. در این حالت، پروتئین راحت‌تر به لیگاند آزاد متصل می‌شود و از ستون شسته می‌شود.

کار آزمایشگاهی شماره 8

جداسازی الکتروفورتیکی پروتئین ها

این روش مبتنی بر این واقعیت است که مولکول های پروتئین دارای بار الکتریکی هستند که مقدار و علامت آن توسط ترکیب اسید آمینه پروتئین، pH و قدرت یونی محیط تعیین می شود. تحت تأثیر یک میدان الکتریکی خارجی، مولکول های باردار در محلول به سمت قطب مخالف حرکت می کنند. سرعت حرکت ذرات پروتئین متناسب با مقدار بار آنها و با اندازه ذرات و درجه هیدراتاسیون آنها نسبت معکوس دارد.

به اصطلاح "الکتروفورز منطقه ای" در حال حاضر گسترده است - الکتروفورز بر روی یک حامل جامد (روی نوارهای کاغذی، آگار، نشاسته، آکریل آمید) آغشته به محلول بافر با مقدار pH مورد نظر. موقعیت پروتئین ها روی کاغذ یا ژل با تثبیت و سپس رنگ آمیزی آنها با یک یا آن رنگ دیگر (معمولاً آبی بروموفنول، سیاه آمید یا آبی کوماسی) تعیین می شود. مقدار پروتئین در هر بخش را می توان تقریباً با شدت رنگ رنگ مرتبط تعیین کرد. این تعریف نسبت کمی از فراکسیون های پروتئینی را ارائه نمی دهد، زیرا مقدار رنگ محدود شده توسط پروتئین های مختلف یکسان نیست.

الکتروفورز کاغذ HA

جداسازی مخلوط آنالیز شده روی انواع خاصی از کاغذ کروماتوگرافی آغشته به محلول بافر در دستگاه های الکتروفورز انجام می شود. پروتئین ها در ولتاژ تا 500 ولت جدا می شوند.

محفظه الکتروفورز از یک حمام پلکسی گلاس و یک درب نصب شده بر روی آن تشکیل شده است (1). حمام دارای 2 محفظه الکترود (2) است که هر کدام توسط یک پارتیشن طولی تقسیم می شوند (3) به دو بخش در ارتباط با یکدیگر. محفظه‌های داخلی محفظه‌ها الکترودها را پایین می‌آورند و انتهای کاغذ به داخل محفظه‌های بیرونی می‌رود. (4), که قسمت اصلی آن بر روی صفحه افقی با سنبله (5) واقع در قسمت مرکزی اتاق قرار می گیرد. بین صفحه افقی و محفظه بیرونی محفظه های الکترود میله هایی وجود دارد (6),

شکل 2. نمودار دستگاه برای الکتروفورز ولتاژ پایین

که از طریق آن نوارهای کاغذی پرتاب می شود و برای حمایت از آنها استفاده می شود. در زیر پوشش بالایی محفظه صفحه ای از پلکسی با سوراخ های گرد بزرگ (7) وجود دارد که روی آن ورقه های کاغذ صافی آغشته به آب مقطر و 4 تا 5 بار تا شده روی آن قرار می گیرد. این ورق ها به افزایش سفتی محفظه و در نتیجه کاهش تبخیر مایع از الکتروفروگرام ها در حین الکتروفورز کمک می کنند.

با استفاده از الکتروفورز کاغذی، از دانش آموزان خواسته می شود تا پروتئین های سرم خون را جدا کنند. با استفاده از این روش می توان سرم خون را به 5 تا 9 بخش تقسیم کرد و میزان پروتئین نسبی را در هر یک از آنها تعیین کرد. جداسازی در یک محلول بافر (pH 8.6 - 8.9) با گرادیان پتانسیل 3 - 5 V/cm (120 - 350 V برای نوارهای 40 - 45 سانتی‌متر) در دمای اتاق انجام می‌شود. جریان نباید از 0.1 - 0.3 میلی آمپر برای هر سانتی متر از مقطع نوار کاغذ تجاوز کند. افزایش بیش از 2 برابر قدرت جریان غیرقابل قبول است، زیرا این امر منجر به گرم شدن بیش از حد، افزایش قابل توجهی در تبخیر و Vدر نهایت - سوزاندن کاغذ

معرف ها:

1. محلول بافر. می تواند به کار رود:

الف) بافر ورونال-مدینال (PH 8.6): 10.32 گرم مدینال (نمک سدیم ورونال) را در 300 میلی لیتر آب مقطر حل کنید، 1.84 گورونال اضافه کنید، با هم زدن در حمام آب حرارت دهید تا حل شود و آب را به 1 لیتر اضافه کنید.

ب) بافر ورونال استات (pH 8.6): 4.3 ورونال، 0.95 سدیم هیدروکسید و 3.24 استات سدیم در 300 میلی لیتر آب مقطر حل می شود. 30 میلی لیتر محلول HCl 0.1 مولار را به محلول اضافه کنید و آب را به 1 لیتر اضافه کنید.

ج) بافر تریس (pH 8.9): 60.5 گرم تریس، 6 اتیلن دی آمین تتراستیک و 4.6 gboric اسید در 1 آب مقطر حل می شود.

2. راه حل برای رنگ آمیزی الکتروفروگرام:

الف) رنگ آبی سیاه اسیدی (مشابه آمید سیاه 10 B) -0.2 گرم مخلوط: اسید استیک (یخچال) - 100 میلی لیتر + متیل الکل - 900 میلی لیتر؛

ب) بروموفنل آبی -0.5 گرم، کلرید جیوه -10 گرم، اسید استیک (یخچال) - 20 میلی لیتر، آب مقطر - 980 میلی لیتر؛

ج) برموفنول آبی - 0.1 گرم، ZnSO 4 7H 2 O -50 گرم، اسید استیک (یخچال) 50 میلی لیتر، آب مقطر - 900 میلی لیتر.

3. محلول های شستشوی الکتروفروگرام از رنگ غیر متصل به پروتئین و تثبیت رنگ روی پروتئین:

الف) اسید استیک - محلول 2٪؛

ب) استات سدیم - محلول 2% تهیه شده با محلول 10% اسید استیک.

4. محلول هایی برای شستشوی محصولات رنگی از الکتروفروگرام ها:

الف) برای استخراج محلول برموفنل بلو -0.01 مولار NaOH.

ب) برای استخراج رنگ اسیدی آبی سیاه - 0.1 M محلول NaOH.

تجهیزات: لوله های آزمایش؛ کووت، اسپکتروفتومتر، دستگاه الکتروفورز، کاغذ کروماتوگرافی: FN4، FN5، Whatman 3، Whatman 3MM و غیره.

دریافت سرم خون 2 - 3 میلی لیتر خون داخل لوله خشک سانتریفیوژ کشیده می شود و 1/2 - 1 ساعت باقی می ماند و با استفاده از یک میله شیشه ای نازک دیواره های لوله را به دقت دور می زنیم تا لخته از آنها جدا شود، سانتریفیوژ کرده و سرم را در داخل لوله بریزید. لوله تمیز

آماده سازی دوربینمحفظه های الکترود با محلول بافر تا همان سطح پر می شوند (برای جلوگیری از سرریز شدن بافر)، تقریباً 800 میلی لیتر در هر محفظه. بو قسمت های داخلی محفظه های الکترود الکترودها را غوطه ور می کند. روی یک ورق کاغذ کروماتوگرافی (18x45 سانتی متر) (هنگام استفاده از انواع کاغذهای نازک، بهتر است نمونه ها را روی نوارهای جداگانه به عرض 4-5 سانتی متر قرار دهید) به فاصله 15 سانتی متر از یکی از اضلاع باریک آن، از یک نرم ساده استفاده کنید. مداد (گرافیت از پخش شدن مایع جلوگیری می کند) تا مکان های استفاده از نمونه ها را مشخص کند. آنها مستطیل هایی هستند (2 در 0.3 سانتی متر) که اضلاع بزرگ آن عمود بر طول نوار کاغذ است. فاصله بین مناطق شروع و لبه های الکتروفروگرام 2 سانتی متر است. برای انجام این کار، آن را از طریق یک کووت با محلول بافر کشیده می شود. انتهای نوارهای کاغذی (6-8 سانتی متر) خیس نمی شود. بافر اضافی با لکه کردن نوارها بین دو یا سه ورق کاغذ صافی حذف می شود. الکتروفروگرام مرطوب در محفظه روی صفحه افقی مرکزی (5) قرار می گیرد و انتهای آن به محفظه های بیرونی محفظه های الکترود پایین می آید.دستگاه با یک درب محکم بسته می شود که زیر آن ورقه های کاغذ صافی مرطوب شده با آن وجود دارد. اب.

انجام الکتروفورزپس از اشباع کامل نوارهای کاغذی با محلول بافر، نمونه‌های 0.01 - 0.02 میلی‌لیتری (1 تا 2 میلی‌گرم پروتئین) سرم با استفاده از پیپت 0.1 میلی‌لیتری روی نواحی مشخص‌شده اعمال می‌شود. محفظه با یک درب بسته می شود و جریان روشن می شود. مدت زمان الکتروفورز 22 - 24 ساعت در ولتاژ 200 - 300 ولت است.

تثبیت و رنگ آمیزی الکتروفروگرام ها.در پایان الکتروفورز جریان را قطع کرده و بلافاصله الکتروفروگرام ها را از دستگاه خارج کنید. آنها را روی پایه مخصوص قرار می دهند و در هوا زیر آبکش خشک می کنند، سپس در فر با دمای 105 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه روی کاغذ ثابت می شوند، سپس آنها را در یک کووت لعابی قرار می دهند و با رنگ پر می کنند و 2 تا 3 دقیقه می گذارند. ساعت یا بیشتر رنگ را تخلیه کرده و الکتروفروگرام ها را با ریختن 3-4 بار با محلول 2% اسید استیک هر بار به مدت 5-10 دقیقه از مازاد آن شستشو می دهند. قسمت هایی از کاغذ که حاوی پروتئین نیستند باید کاملاً عاری از رنگ باشند. برای تثبیت محصولات رنگی، الکتروفروگرام ها با محلول 2% استات سدیم به مدت 2 دقیقه پر شده و در هوا تحت مکش خشک می شوند.

تعیین نسبت فراکسیون های پروتئینی فردی.در pH 8.6، پروتئین های سرم بار منفی دارند و در میدان الکتریکی به سمت آند حرکت می کنند. کسری که سریعترین حرکت به سمت آند را دارد آلبومین است و به دنبال آن α1-، α2-، β- و γ-گلوبولین ها قرار می گیرند (شکل 3 را ببینید). . بخش هایی از نوارهای کاغذی که روی آنها لکه های پروتئینی ظاهر شده است با خطوط عرضی با یک مداد ساده به نوارهایی به عرض 3-5 میلی متر تقسیم می شوند و در امتداد این خطوط برش می شوند. هر نوار خرد شده و در یک لوله آزمایش شماره گذاری شده جداگانه قرار داده می شود و با 3 میلی لیتر محلول NaOH 0.01 مولار پر شده و به مدت یک ساعت باقی می ماند تا رنگ از روی کاغذ پاک شود و سپس مقدار چگالی نوری برای هر محلول بر روی یک فتوکالریمتر پیدا می شود. اسپکتروفتومتر) در 612 نانومتر.

برنج. 3. الکتروفروگرام سرم خون انسان و منحنی توزیع فراکسیون های پروتئینی

یک نمونه کنترل به صورت موازی پردازش می شود. برای آن، یک نوار از نواحی رنگ نشده الکتروفروگرام بریده می شود.

بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده، منحنی توزیع محصولات رنگی بر روی الکتروفروگرام رسم می‌شود. اعداد لوله‌ها بر روی محور آبسیسا و مقدار چگالی نوری مربوطه بر روی محور ارتین مشخص شده‌اند (شکل 3 را ببینید). . درصد فراکسیون پروتئین در سرم خون محاسبه می شود. برای انجام این کار، منحنی ترسیم شده با توجه به حداقل ها به تعدادی بخش مربوط به کسرهای جداگانه تقسیم می شود. اندازه مساحت هر بخش متناسب با مقدار رنگ ترکیب شده با پروتئین یک بخش معین است. نسبت بین این مناطق با وزن محاسبه می شود (وزن مقاطع کاغذ متناسب با مساحت آنها است)، کل مساحت 100٪ در نظر گرفته می شود. اگر یک چگالی سنج دارید، نسبت فراکسیون پروتئین در سرم خون را می توان از چگالی سنج تعیین کرد.

پس از تعیین مقدار پروتئین موجود در آب پنیر، مقدار آن برای هر بخش محاسبه می شود.